KR102671432B1 - 고실내 투여용 약물 전달체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

고실내 투여용 약물 전달체 및 이를 이용한 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다.
일 양상에 따른 고실내 투여용 약물 전달체 및 이를 이용한 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법에 따르면, 한쪽 귀의 약물 투여만으로 반대쪽 귀의 중이 및 내이로 약물을 전달할 수 있어, 한쪽 귀의 고실내 약물 주입만으로 양쪽 귀 내부에 치료 효과를 기대할 수 있고, 외이도 폐색증과 같은 고실 내 약물 주입이 어려운 귀 치료에 있어 반대쪽 정상 귀로 약물을 주입하여 치료할 수 있는 바, 내이 및 중이 질환을 효과적으로 치료하는 데 이용할 수 있다.

Description

고실내 투여용 약물 전달체 및 이의 용도 {Drug delivery system for intratympanic administration and use thereof}
고실내 투여용 약물 전달체 및 이를 이용한 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다.
대다수의 사람들이 알고 있듯이 하나의 약을 개발하기 위해서는 많은 비용과 시간이 필요하다. 그렇기 때문에 기존에 개발된 약물을 기반으로 하여 약의 안전성과 효율성을 향상시키기 위한 다양한 방법들이 연구되고 있는데 약물전달시스템(drug delivery system: DDS) 연구 분야가 그 중 한 가지이다. 상기 DDS는 약물을 원하는 표적에 효율성 있게 전달하여 약으로 인한 부작용을 줄임과 동시에 효능을 최대치로 끌어 올리는 목적을 가지고 있다.
약물 전달은 크게 두 가지 개념으로 나뉘게 된다. 첫 번째는 전구약물 (prodrug) 이라는 개념으로서, 전구약물은 체외에서는 약효가 없는데 체내에 들어왔을 때 대사효소에 의해 대사가 되면 약효를 나타내는 약이다. 즉, 이는 약물의 화학 구조적인 변화를 통해 원하는 표적에 물질이 효과를 보이게 하는 것이다. 두 번째 개념은 약물전달시스템을 기반하여 약물을 표적 부위에 직접적으로 전달하는 것이다.
약물전달시스템은 투여경로, 전달기술의 형태 및 약물의 종류에 따라 분류할 수 있다. 투여 경로에 따른 분류로는 일반적으로 경구형, 주사형, 폐흡입형, 경피형, 삽입형 등으로 분류되며, 전달기술의 형태에 따른 분류로는 흡수촉진형, 약효지속형, 표적부위집중형 등으로 분류할 수 있다. 상기와 같은 약물전달시스템에서 약물을 전달하기 위한 전달체로는 미립자(Microparticles) 또는 미립구(Microsphere) 등이 사용될 수 있으며, 이러한 약물 전달체는 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로써 약물의 부작용을 줄이고 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며 약물의 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형 및 투여 방법을 설계하는 것이 중요하다.
한편, 내이질환의 치료에 있어서 혈액와우장벽(blood-cochlear barrier)의 존재는 전신적인 약물치료만으로 약물이 충분하게 와우내로 전달되지 못하게 하여 내이질환의 치료를 어렵게 만든다. 이를 극복하고자 많은 연구자들에 의하여 고실내 약물 주입술이 고안되었고, 현재까지 여러 내이질환의 치료에 이용되고 있다. 고실내 주입술은 전신사용에 비해 약물에 의한 전신 부작용이 적고, 약물이 내이로 빠르고 높은 농도로 전달되는 장점이 있어 고실내 주입술을 이용한 내이질환의 치료는 1990년대 이후 급격한 증가세를 보이고 있다. 다만, 외이도 폐색증과 같이 고실내로 물질 주입이 가능하지 않은 귀를 치료에서는 상기 고실내주입술을 이용할 수 없다는 단점이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 귀 질환, 특히 내이질환 및 중이질환을 보다 효과적으로 치료하기 위한 방법을 제시하기 위해 노력한 결과, 적절한 크기 및 표면 전하를 갖는 약물전달체가 유스카티오관을 통해 반대쪽 귀의 중이 및 내이로 이동할 수 있음을 발견하고, 이를 통해 효과적으로 귀 질환을 치료할 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 나노입자 및 약물을 포함하는 고실내 투여용 약물 전달체로서, 상기 약물 전달체의 크기는 1000 nm 이하인 것인, 약물 전달체를 제공한다.
다른 양상은 상기 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 약물 전달체를 인간을 제외한 개체의 한쪽 귀의 고실내로 투여하는 단계를 포함하는, 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
일 양상은 나노입자 및 약물을 포함하는 고실내 투여용 약물 전달체로서, 상기 약물 전달체의 크기는 1000 nm 이하인 것인, 약물 전달체를 제공하는 것이다.
상기 고실내 투여는 고막을 통해 귀의 내부로서 고막의 안쪽 공간에 약물 등의 물질을 주사 및 주입하는 투여 방법으로서, 귀의 내이 및 중이에 약물을 효과적으로 전달하는 방법으로 알려져 있으며, 고실내 주입, 고막내 투여 또는 경고막 투여와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 약물 전달체는 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하기 위한 것으로서, 한쪽 귀의 고실내로 투여된 경우, 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 것일 수 있으며, 구체적으로 고실내로 투여된 약물 전달체가 유스타키오관을 경유하여 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 것일 수 있다. 일 예로, 오른쪽 귀의 고실내로 투여된 경우 왼쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달될 수 있으며, 또는 왼쪽 귀의 고실내로 투여된 경우 오른쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달될 수 있다. 또한, 상기 약물 전달체는 반대쪽 귀의 내이의 달팽이관으로 전달되는 것일 수 있으며, 구체적으로 달팽이관의 기저 회전부, 중간 회전부 및/또는 첨단 회전부로 전달되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 기저 회전부 및 중간 회전부에 전달되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "내이"는 귀 내부로서 달팽이관, 와우각 및 전정 미로, 및 와우각을 중이와 연결시키는 원형창을 포함하며, "중이"는 귀 중간부로서 실강, 이소골 및 중이를 내이와 연결시키는 난원창을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "나노입자”는 나노미터(nm)의 크기를 갖는 구조 또는 물질을 의미한다. 나노미터의 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.
상기 약물 전달체의 크기는 직경(지름)이 1000 nm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로 1000 nm 이하, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 400 nm 이하, 200 nm 이하, 1 내지 1000 nm, 1 내지 800 nm, 1 내지 600 nm, 1 내지 400 nm, 1 내지 200 nm, 10 내지 1000 nm, 10 내지 800 nm, 10 내지 600 nm, 10 내지 400 nm, 10 내지 200 nm, 20 내지 1000 nm, 20 내지 800 nm, 20 내지 600 nm, 20 내지 400 nm, 또는 20 내지 200 nm일 수 있다. 상기 약물 전달체의 크기는 반대쪽 귀의 내이 또는 중이로 전달하고자 하는 약물 전달체의 양을 고려하여 설정할 수 있다.
상기 약물 전달체의 크기는 나노 입자 및 이에 접합된 약물의 크기에 의해 결정될 수 있으며, 나노 입자의 종류 및 약물의 종류를 적절히 조절하여 목적하는 크기를 갖는 약물 전달체를 제조할 수 있다.
상기 약물은 약학적 활성 물질로서 기관내, 조직내 또는 세포내로 전달되어 기관, 조직 또는 세포의 활성을 조절하는 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 유효성분 또는 생리활성물질로서, 일 예로서, 화합물, 단백질, 핵산 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 전하를 띤 고분자 화합물, 형광화합물 등의 화합물; 효소, 리간드, 항체 등의 단백질; siRNA, 플라스미드, 유전자 등의 핵산, 유전물질, 지방, 탄수화물, 염료, 광과민제, 항암제, 항생제, 화학적 화합물, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 하나 이상 포함할 수 있다.
상기 약물은 귀 질환 치료용 약물인 것일 수 있다. 상기 귀 질환은 고실 내부에서 발병하는 질환으로서 내이질환 및/또는 중이질환일 수 있으며, 구체적으로 이명, 내이 기형, 미로염, 외상성 난청, 소음성 난청, 이독성 난청, 돌발성 난청, 메니에르병, 청신경 종양, 만성 중이염, 급성 중이염, 삼출성중이염, 진주종성중이염, 이소골 탈구, 이소골 고정, 및 중이공간 종양 중 하나 이상일 수 있다.
상기 귀 질환 치료용 약물은 내이질환 및/또는 중이질환을 치료하거나 개선할 수 있는 약물로서, 구체적으로 젠타마이신, 덱사메타손, 스트렙토마이신, 리도카인, 스테로이드, 항산화제, 아미노글리코시드, 메틸프레드니솔론, 및 카로베린 중 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는, 상기 약물의 투여에 의해 귀 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 약물은 약학적으로 유효한 양으로 약물 전달체에 포함될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약물전달체에 포함되는 약물의 양은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 약물의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 포함되어 투여될 수 있다.
상기 약물은 약물 전달체의 내부에 탑재 또는 봉입되거나, 나노입자의 표면에 접합된 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 약물은 나노입자의 표면에 공유 결합되어 접합된 것일 수 있다.
상기 나노입자는 자성 나노입자일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “자성 나노입자(hydrophilic amine-coated magnetic nanoparticle)"는 자성을 띄는 나노미터 크기의 구조 또는 물질을 의미한다. 상기 용어 "자성"은 "물질이 나타내는 자기적인 성질을 의미한다. 모든 물질은 자기장(magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생된다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체, 상자성체, 반자성체, 페리자성체 등으로 구분된다.
상기 자성 나노입자는 철, 코발트, 니켈, 그의 산화물 및 그들의 합금으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으며, 구체적으로 철로 구성된 것으로서, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7, Fe13O19, 및 Fe25O32　중에서 선택된 산화철 및 CoFe2O4, 및 MnFe2O4중에서 선택된 페라이트(ferrite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 Fe3O4(산화철) 일 수 있다.
상기 나노입자는 형광 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 형광 프로브는 란탄계 금속으로서 유로퓸(III)(Eu3+) 이온, CdSe, FeSe 및 Si 이온을 포함하는 양자점 이온 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 나노입자는 실리카(이산화 규소, SiO2) 코팅된 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 나노입자 또는 자성 나노입자는 실리카 코팅 후 형광 프로브가 코팅된 것일 수 있으며, 상기 실리카 코팅 층은 형광 프로브와 자성 나노입자의 표면 사이에 스페이서 역할을 함으로서 산화철에 의한 형광 프로브의 소광을 방지할 수 있다.
상기 약물 전달체의 표면 전하는 -10mV 내지 10 mV일 수 있으며, 구체적으로, -10mV 내지 10 mV, -10mV 내지 8 mV, -10mV 내지 6 mV, -10mV 내지 4 mV, -10mV 내지 2 mV, -10mV 내지 0 mV, -8 mV 내지 10 mV, -8 mV 내지 8 mV, -8 mV 내지 6 mV, -8 mV 내지 4 mV, -8 mV 내지 2 mV, -8 mV 내지 0 mV, -5 mV 내지 10 mV, -5 mV 내지 8 mV, -5 mV 내지 6 mV, -5 mV 내지 4 mV, -5 mV 내지 2 mV, -5 mV 내지 0 mV, -2 mV 내지 10 mV, -2 mV 내지 8 mV, -2 mV 내지 6 mV, -2 mV 내지 4 mV, -2 mV 내지 2 mV, 또는 -2 mV 내지 0 mV일 수 있다.
상기 약물 전달체의 표면 전하는 나노 입자 및 이에 접합된 약물의 전하에 의해 결정될 수 있으며, 나노 입자의 종류 및 약물의 종류를 적절히 조절하여 목적하는 표면 전하를 갖는 약물 전달체를 제조할 수 있다.
상기 약물 전달체는 크기(직경) 및/또는 표면 전하에 의해 반대측 귀의 중이 및/또는 내이로 전달되는 양을 조절할 수 있으며, 구체적으로 약물 전달체의 크기가 작을수록 또는 표면 전하가 양전하일수록 반대측 귀로 전달되는 양을 증가시킬 수 있다.
다른 양상은 본 발명의 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 조성물은 고실내 투여하기 위한 약물 전달용 조성물일 수 있으며, 구체적으로 한쪽 귀의 고실내 투여하여, 반대쪽 귀의 내이 및/또는 중이로 전달하기 위한 조성물일 수 있다.
또 다른 양상은 본 발명의 약물 전달체를 인간을 제외한 개체의 한쪽 귀의 고실내로 투여하는 단계를 포함하는, 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 귀 관련 질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 포유동물, 예를 들면, 인간, 마우스, 토끼, 래트, 기니피그, 소, 말, 돼지, 원숭이, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 방법은 한쪽 귀의 고실 내로 투여된 약물 전달체가 유스타키오관을 통해 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 것일 수 있다.
상기 방법은 한쪽 귀에서 반대쪽 귀 방향으로 상기 약물 전달체에 힘을 가하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 가하는 힘은 중력 및/또는 자기력 등에 의해 유도된 힘일 수 있다. 또한, 상기 방법은 약물 전달체에 가하는 힘의 정도에 따라 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 약물 전달체의 양을 조절할 수 있다.
상기 방법은 약물 전달체를 한쪽 귀에 투여 후 약물 전달체가 투여된 귀는 위쪽에 위치시키고, 반대쪽 귀는 아래쪽에 위치시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이와 같이 반대쪽 귀를 아래쪽에 위치시킴으로서, 약물 전달체가 투여된 귀에서 반대쪽 귀의 방향으로 중력이 가해지게 되며, 이를 이용하여 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 약물 전달체의 양을 조절할 수 있다.
상기 방법은 상기 약물 전달체의 크기(직경) 및 표면 전하를 조절하고, 약물 전달체에 가해지는 힘을 조절하여 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 약물 전달체의 양을 조절할 수 있으며, 구체적으로 반대쪽 귀의 방향으로 가해지는 힘이 증가하거나, 약물 전달체의 크기가 작아질수록 및/또는 표면 전하의 양전하가 커질수록 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 약물 전달체의 양이 증가하는 바, 약물 전달체가 투여된 귀에 잔류시키고자 하는 약물의 양 및 반대쪽 귀의 내부로 전달하고자 하는 약물의 양을 고려하여 약물 전달체의 크기, 표면 전하 및 가해지는 힘을 조절할 수 있다.
일 양상에 따른 고실내 투여용 약물 전달체 및 이를 이용한 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법에 따르면, 한쪽 귀의 약물 투여만으로 반대쪽 귀의 중이 및 내이로 약물을 전달할 수 있어, 한쪽 귀의 고실내 약물 주입만으로 양쪽 귀 내부에 치료 효과를 기대할 수 있고, 외이도 폐색증과 같은 고실 내 약물 주입이 어려운 귀 치료에 있어 반대쪽 정상 귀로 약물을 주입하여 치료할 수 있는 바, 내이 및 중이 질환을 효과적으로 치료하는 데 이용할 수 있다.
도 1은 F-MNP 나노입자를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 Eu-도핑된 SiO2 쉘 층이 코팅되기 전 나노입자(NP) 및 코팅 후 나노입자(F-MNP)를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 3은 다양한 나노입자(MNP, F-MNP 및 F-MNP@GM)의 유체 역학적 직경 및 제타 포텐셜을 나타낸 도면이다.
도 4는 가시광선 및 UV 하에서의 나노입자 분말 및 분산액을 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5는 F-MNP의 1D 정렬에 대한 명시야 및 광루미네선스 현미경 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 F-MNP의 여기 및 방출 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 7은 F-MNP의 유체역학적 직경 및 제타 포텐셜 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 젠타마이신을 로딩하는 과정동안의 F-MNP의 FT-IR 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 반대측 귀의 고막으로 확산되는 고막내 주사된 F-MNP(A) 또는 F-MNP@GM(B)의 시간적 시각화 이미지를 나타내는 도면이다. 도면의 노란색 점선 원은 각각 축 및 관상 스캔을 나타내는 동일한 순서에서 반대측 귀의 고막의 신호 강도 관련 F-MNP 또는 또는 F-MNP@GM를 나타낸다.
도 10은 전체 T2-강조 시퀀시에서 반대측 귀의 중이로 확산되는 고막내 주사된 F-MNP의 시간적 시각화 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11은 전체 T2-강조 시퀀시에서 반대측 귀의 중이로 확산되는 고막내 주사된 F-MNP@GM의 시간적 시각화 이미지를 나타낸 도면이다.
도 12는 F-MNP(A) 또는 F-MNP@GM(B)의 고막 내 주사 후 동측 및 반대측 달팽이관 유모 세포의 각 회전의 면역염색 결과를 나타낸 도면이다. B에서 반대쪽 달팽이관의 정단 회전에서는 F-MNP@GM 관련 형광이 나타나지 않았다.
도 13의 A는 래트의 유스타키오관의 해부학적 구조를 나타낸 도면이고, B는 시뮬레이션 기하학적 구조를 위한 유스타키오관 모델을 나타낸 도면이다.
도 14는 외부 힘의 방향에 따른 유스타키오관에서의 입자 확산 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면으로서, A는 시간 흐름에 따른 입자 분산 시뮬레이션 결과를 나타내고, B는 시간에 따라 유스타키오관의 반대쪽에 도달한 입자의 수를 그래프화한 도면이다.
도 15는 입자 크기에 따른 유스타키오관에서의 입자 확산 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면으로서, A는 시간 흐름에 따른 입자 분산 시뮬레이션 결과를 나타내고, B는 시간에 따라 유스타키오관의 반대쪽에 도달한 입자의 수를 그래프화한 도면이다.
도 16은 입자 표면 전하에 따른 유스타키오관에서의 입자 확산 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면으로서, A는 시간 흐름에 따른 입자 분산 시뮬레이션 결과를 나타내고, B는 시간에 따라 유스타키오관의 반대쪽에 도달한 입자의 수를 그래프화한 도면이다.
도 17은 고실 내 투여된 약물전달체가 반대쪽 귀의 내이 또는 중이로 전달되는 과정을 나타내는 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 설계
실험 동물의 관리 및 실험 절차는 분당 서울대학교병원 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 (IACUC # 14-2017-003), 국제적으로 인정된 지침에 따라 수행되었다. 고막내 주사는 일반적으로 알려진 과정으로 수행하였다.
본 발명의 실시예에서, 반대측 귀는 아래쪽에 위치하였고, 주입하는 동안 내이로 흡수될 수 있도록 일정 시간(예: 20-30분)을 주었으며, 이를 이용하여 인간의 임상 상황을 재현할 수 있었다. 또한, 모든 실험 동물은 MRI 평가를 통해 3시간 동안 엎드린 자세로 배치하여, 왼쪽 또는 오른쪽으로 기울어지는 위치 효과를 방지했다. 고막 내 주사 투여 후, 1시간, 2시간 및 3시간 후 관심 영역에 해당하는 전체 T2-강조 MRI 시퀀스(T2-weighted MRI sequences)을 취하여 달팽이관의 각 부분(turn)의 면역 염색 결과와 함께 평가했다. 이미지 획득 후, 각 쥐를 즉시 안락사시켜 양쪽 귀에서 달팽이관의 막미로(membranous labyrinth)를 수득했다.
실시예 2: FMNP 접합된 젠타마이신(F-MNP@GM) 제조
형광과 자성 특성을 동시에 나타내는 다기능성 나노입자(NP)는 생체 내 약물 추적자로서 유용하게 사용될 수 있다. 형광 자철석 나노입자(Fluorescent magnetite nanoparticles, F-MNPs)는 전자기장 상황에서 컨트롤이 가능한 강한 자성을 띄는 자성 나노입자에 실리카(SiO2) 쉘을 코팅하고, 형광 프로브의 역할을 하는 유로퓸(III)(Eu3+) 이온을 입혀 제작되었다.
상기 F-MNP에 젠타마이신을 접합시키기 위해, 먼저 F-MNP를 헹구고 수용액에 5mg/Ml 농도로 분산시켰다. EDC/NHS 커플링 반응을 수행하기 위해, F-MNP (100 μL)를 0.5 mL의 MES 완충액 (pH 5.5)에서 20 mg의 EDC [에틸-3-(3-(디메틸아미노) -프로필)카르보디이미드] 및 20 mg의 NHS (N-히드록시숙신이미드)와 혼합하고, 27 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. F-MNP를 MES 완충액 (pH 5.5)으로 세척하고, 0.01 M PBS 완충액 (pH 7.4)에서 젠타마이신 설페이트(5 mg)와 혼합한 후, 혼합물을 27 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, F-MNP는 0.01% 트윈 20이 포함된 PBS로 세척하여 미 반응 분자를 제거하고, 사용하기 전까지 4 ℃에 보관했다.
실시예 3: FMNP 및 F-MNP@GM의 특성 확인
상기 실시예 2에서 제조된 FMNP 및 F-MNP@GM의 특성을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 나노입자들은 고해상도 투과전자현미경 (HR-TEM; JEM-2100F, JEOL, Tokyo, Japan)에 의해 특정되었다. 광루미네선스 (Photoluminescence, PL) 측정은 형광분광기(fluorescence spectroscopy) (F-7000; Hitachi, Tokyo, Japan)로 측정되었다. 입자 크기 분포 및 표면 전위는 동적 광산란 분석(dynamic light scattering, DLS) (Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK)으로 측정되었다. 표면 특성은 FT-IR 분광법 (FT-IR6300; JASCO, Tokyo, Japan)으로 모니터링했다.
먼저, 상기 나노입자들을 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과, 코어-쉘 NP가 ~ 320 nm의 균일한 크기를 가지고, Eu-도핑된 SiO2 쉘 층은 TEM의 낮은 대비로 인해 코어와 구별될 수 있음을 확인하였다(도 1). 또한, DLS에서 코어 자철석 NP의 유체 역학 직경은 265.2 ± 2.3 nm이었고, 형광 쉘로 코팅한 후에는 338.5 ± 4.7 nm로 증가하였으며, SiO2 쉘의 두께가 약 36.7 nm임을 알 수 있다 (도 2 및 도 3). 상기 SiO2 층은 Eu 이온과 자철석 입자 표면 사이의 스페이서 역할을 하여 산화철 표면에 의한 형광 소광을 효과적으로 방지할 수 있다.
다음으로, 입자의 분말과 분산은 가시 광선에서 갈색으로 보였지만, UV 조사에서는 밝은 적색 방출이 관찰되었다 (도 4). 또한, 높은 자기(magnetic) 응답성으로 인해 F-MNP의 움직임은 자기장에 의해 쉽게 제어될 수 있으며, 상기 특성은 UV 광 하에서 외부 자기장을 따른 F-MNP 분리 또는 1D 나노 체인 정렬을 나타내는 도 5를 통해 입자의 자기 및 형광 특성을 확인하였다.
F-MNP의 광루미네선스 스펙트럼은 도 6에서 확인하였다. 구체적으로, 상기 입자는 각각 355 nm 및 615 nm에서 강한 여기 및 방출 피크를 나타냈으며, 이는 둘 다 순수한 Eu 킬레이트에 가까우며, 실리카 쉘에 성공적으로 매립되었음을 의미한다.
F-MNP-접합 젠타마이신(F-MNP-conjugated gentamicin, F-MNP@GM)은 EDC/NHS 커플링 반응을 통해 젠타마이신 설페이트 분자가 F-MNP에 공유 결합되어 형성되었다. F-MNP@GM의 직경은 434.3±15.9로 증가하였고, F-MNP@GM의 음 표면 전하는 젠타마이신 설페이트 접합 후 -22.5±0.7에서 -7.2±0.5 mV로 감소했으며, 이는 NP 표면에서 양전하를 띤 약물 분자의 강력한 결합에 의한 것으로 판단된다 (도 7).
다음으로, 푸리에-변환 적외 분광분석법 (Fourier-transform infrared, FT-IR)을 통해 F-MNP@GM의 형성을 확인하였으며, 구체적으로 도 8에서 젠타마이신과 F-MNP의 특징적인 밴드가 모두 관찰되었다. 상기 젠타마이신의 스펙트럼에서 1630 cm-1의 피크는 N-H기의 굽힘과 관련이 있으며, 3250 cm-1에서의 밴드는 -NH2 결합 신축과 관련되어 있고, 1096cm-1에서 C-O 신축 진동 밴드가 관찰되었다. F-MNP 표면의 카르복실기 및 SiO2기는 FT-IR 스펙트럼에서 확인되었다. 구체적으로, 1072cm-1에서 강한 밴드는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane, APTES)의 Si-O-Si 밴드에 해당하고, 1220 cm-1의 밴드는 C-N 결합의 형성과 관련되어 있다. 또한, C-H 진동 밴드는 1395 cm-1에서 나타났고, 3320 cm-1에서 넓은 흡수 밴드는 O-H 신축 진동 또는 흡수된 물과 관련되어 있다. 한편, 1096cm-1의 피크가 Si-O-Si 밴드의 피크와 겹쳤지만, F-MNPs@GM의 스펙트럼은 1630 및 3250 cm-1에서 젠타마이신의 특징적인 밴드를 보였으며, 이는 젠타마이신 설페이트가 F-MNP의 표면에 성공적으로 로딩되었음을 나타낸다.
실시예 4: 고막 내 주사된 나노입자의 MRI를 통한 생체 내 분포 확인
상기 실시예에서 제조하고 특성을 확인한 F-MNP 및 F-MNP@GM의 고막내 주사 후 생체 분포를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 총 8 마리의 Sprague-Dawley 쥐(무게 범위 279-336g)가 실험에 사용되었으며, 주입되는 입자와 재료와 편측성(laterality)을 기준으로 다음과 같이 세 그룹으로 나누었다(표 1).
- 제1그룹: 오른쪽 귀에 F-MNP를 주사하고, 왼쪽 귀에 주사하지 않음 (n = 4).
- 제2그룹: 오른쪽 귀에 F-MNP@GM를 주사하고, 왼쪽 귀에 주사하지 않음 (n = 2).
- 제3그룹: 대조군, 양쪽 귀에 주사하지 않음 (n = 2).
실험군 편측성 주입물질 접합 주사방식 용량
(cc) 		NP 농도
(mg/mL)
(주입용량 μL)
제1그룹
래트
(n=4)		 오른쪽 F-MNP - 고막내
주사		 0.05 1 mg/mL
(700 μL)
왼쪽 -
제2그룹
래트
(n=2)		 오른쪽 F-MNP@GM 공유결합
(EDC/NHS)		 고막내
주사		 0.05
-0.06		 5 mg/mL
(500 μL)
왼쪽 -
제3그룹
래트
(n=2)		 오른쪽 - -
왼쪽 -
상기의 실험군에서의 나노입자 생체 분포는 MRI을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 9.4-T 동물 MRI 스캐너를 볼륨 코일 (9.4 T/160AS; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)과 함께 사용하였다. MRI 촬영 전, 실험 동물인 래트는 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취시키고, 자석 내부에 엎드린 자세로 배치하였다. MRI 동안 호흡 속도와 체온을 모니터링하였다. 스카우트 이미지 획득 후, 2D T2-강조 축 및 관상 이미지는 고막 내 주사 1시간 후에 순차적으로 획득했다 (fast spin-echo; repetition time, 3000 ms; effective echo time, 24 ms; flip angle, 90°/180°; echo train length, 4; field of view, 30 Х 30 mm2; slice thickness, 0.3 mm; number of slices, 50 (axial) and 40 (coronal); matrix size, 256 Х 256; bandwidth, 100 kHz; number of signal averages, 8). SPION은 T2-강조 이미지에서 신호 강도 ("역상 대비") 손실을 유발한다. MRI에서 비인두(Nasopharynx)를 시각화하기 위해, 중이와 내이를 포함하는 관심 영역과 관련된 전체 이미지 시퀀스를 얻고, M-view 시스템 (마로시스, 서울)을 이용하여 분석했다.
상기 실험 결과, 실험군(제1그룹, 제2그룹)에서 중이 또는 내이의 T2-강조 MRI에서 NP의 신호 강도 (역상 대비) 또는 저강도 대비의 손실이 없었다. 제1그룹에서 음전하로 하전된 F-MNP를 고막 내 주사하고 1시간 후에 획득한 영상에서 동측 중이에서 이질적인 향상이 관찰되었으며, 투여 2시간 후에는 동측 중이의 이종 신호 강도가 반대측 중이에서 검출되었다. 순차적인 T2-강조 영상에서 이질적인 신호 강도의 정도는 반대쪽 귀에서 증가하고 동측 귀에서 시간이 지남에 따라 감소했다 (도 9A).
다음으로, 제2그룹에서도 상기 제1그룹과 같이 고막 내 주사하고 1시간 후에 획득한 T2-강조 영상에서 반대쪽 귀 중이에서 F-MNP@GM에 의한 신호 향상이 관찰되었고, 2시간 후에 획득한 영상에서는 양측 중이에서 F-MNP@GM가 점차적으로 사라지는 것이 관찰되었다(도 9B). 또한, 추가적인 전체 T2-강조 시퀸싱 이미지를 통해 반대측 귀의 고막에서 F-MNP 또는 F-MNP@GM과 관련된 신호 강도를 확인하였다(도 10 및 도 11).
또한, 제1그룹 및 제2그룹의 6 마리 중 4 마리에서 F-MNP 또는 F-MNP@GM의 고막내 주사 후 반대측 귀로의 확산이 관찰되었으며, 제3그룹(음성 대조군)에서는 반대측 귀의 중이에서 신호 강도가 확인되지 않았다.
실시예 5: 고막 내 주사된 나노입자의 면역염색법을 통한 생체 내 분포 확인
상기 실시예 4에서 F-MNP 및 F-MNP@GM의 고막내 주사하여 MRI 이미지를 수득한 후, 달팽이관의 각 영역을 면역염색하여 관찰하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 쥐에서 수득한 조직을 면역염색하여 관찰하기 위해, 실험 동물을 마취하고 목을 베어 단두한 후, 양쪽 귀의 달팽이관을 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4)로 고정시켰다. 표면 처리를 통해, 막미로를 현미경을 통해 절개하고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 달팽이관의 온조직표본고정 (wholemount)는 하기 과정을 통해 진행하였다: (1) 조직을 0.3% 트리톤 X-100 블락킹 용액에 1시간 동안 담근다; (2) 고정된 조직을 Alexa 488-접합된 팔로이딘으로 1시간 동안 표지하고, 세척 후 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다; (3) 조직을 페이드 방지(anti-fade) 형광 마운크 매지 (Vector Laboratories)를 사용하여 슬라이드에 장착했다. 면역표지된 샘플은 63X 배율에서 Zeiss 710 공초점 현미경 (Carl Zeiss MicroImaging, Oberkochen, Germany)을 사용하여 이미지화하였다. NP 여기(excitation)에는 647 nm의 파장이 사용되었다.
먼저, 팔로이딘(phalloidin)을 사용하여 달팽이관에 대해 전체-마운트 면역염색을 수행한 결과, 달팽이관의 첨단 회전부 (apical turn), 기저 회전부(basal turn) 및 중간 회전부(middle turn)의 대부분의 외부 유모 세포 (outer hair cells, OHC)는 손상되지 않고 조직화된 구성을 이루는 것을 확인하였다.
다음으로, 제1그룹을 면역염색한 후 공초점 현미경으로 확인한 결과, 동측 및 반대측 귀의 달팽이관, 특히 기저 회전부의 OHC에서 음전하 F-MNP의 세포 내 위치를 나타냈다 (도 12A).
F-MNP@GM으로 처리한 제2그룹의 경우에도 상기와 동일한 결과를 나타냈으며, F-MNP@GM의 분포는 반대측 귀의 기저 회전부에서 두드러지게 나타나는 것이 관찰되었다(도 12B). 또한, 예상한 대로 제3그룹에서는 NP-관련 형광 신호가 관찰되지 않았다.
실시예 6: 컴퓨터 시뮬레이션을 통한 나노입자의 생체 내 분포 확인
상기 실시예 4 및 5의 나노입자 분포 결과를 보다 심층적으로 분석하기 위해, 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하였다.
구체적으로, FEM(finite element method) 시뮬레이션(COMSOL Multiphysics 5.2a, Boston, US)은 입자 확산을 추정하기 위해 사용하였다. 크기에 따른 계산을 위해, 입자의 상이한 반경, 질량, 충돌 단면을 입자 크기 분석에 이용하였다 (표 2).
크기 (nm) 반지름 (m) 질량 (kg) 충돌 단면적 (m 2 )
20 1E-8 2.17E-20 1.26E-15
200 1E-7 2.17E-17 1.26E-13
2000 1E-6 2.17E-14 1.26E-11
전하 및 외력에 따른 계산을 위해, 나노 입자의 크기는 200nm로 고정하고, 하전 입자의 정전기 입자 간 상호 작용을 고려하기 위해 확산에 추가하여 쿨롱 상호 작용을 계산했다. 또한, 유스타키오 관을 모델링하고, 양쪽은 쥐의 해부학적 구조를 기하학적으로 모방한 중앙 공동(비인두)과 연결시켰다. 모델링된 유스타키오 관의 길이는 1.5mm, 반경은 0.05mm이었으며, 비인두는 한 변의 길이가 1mm인 입방체로 모델링되었다 (도 13A 및 B).
먼저, 적용된 알짜 힘 하에서 입자의 확산 속도와 방향을 설명하기 위해, 320 nm 크기의 입자를 이용하여 외부 힘 효과에 의한 시뮬레이션을 수행했다 (도 14A 및 B). 상기 실험 결과, 동 측면에 로딩된 나노 입자가 유스타키오관의 반대측으로 확산되는 것이 확인되었다(도 14A). 반대쪽 튜브의 끝에 도달한 입자의 수는 다른 힘 방향으로 계산되었다 (도 14B). 상기 시뮬레이션 결과, 초기에 로딩된 나노 입자의 22.6%가 로딩 180분 후에 외부 힘없이 반대쪽 측면의 튜브에 도달한 것으로 관찰되었다. 또한, 정방향 힘 (+ X방향)을 반대쪽 방향으로 가할 경우, 반대쪽 유스타키오 관에 도달하는 나노 입자의 수가 최대 70.0%까지 증가하였다. 반대로, 반대쪽 방향에 역력(- X 방향)을 가하면 반대쪽 튜브에 도달하는 나노 입자의 수가 0.2%로 감소되었다.
일반적인 인간의 임상 상황에서 고막 내 주사 프로토콜에 따르면, 반대측 귀는 아래쪽에 위치하고, 주사하는 동안 일정 시간(약 20-30분)이 주어지기 때문에, 상기 컴퓨터 시뮬레이션은 쥐 모델에서 고막 내 주사 후 중력에 의해 입자가 반대쪽 귀로 확산될 수 있다는 것을 뒷받침할 수 있다. 또한, 상기 시뮬레이션 결과를 통해 경고막 접근-기반의 약물 전달시 추가적으로 유도된 외부 힘(예를 들어, 자기 구배력)에 의해 효율적으로 제어될 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 외부 힘의 방향 또는 강도를 조절함으로서 약물 전달을 제어할 수 있다.
또한, 상기 실시예에서 사용한 입자의 고유한 특성으로 인한 확산 현상을 시뮬레이션을 통해 확인하였다. 구체적으로, 입자 크기에 따른 확산 효과를 확인하기 위해, 3가지 크기의 입자(20 nm, 200 nm, 및 2000 nm)에 대해 모델링하였다 (도 15). 그 결과, 입자 로딩 180분 후 초기 로딩된 입자의 84.9 % (20nm), 24.2 % (200nm) 및 0.0 % (2000nm)가 유스타키오관의 반대편에 도달한 것을 확인하였는 바, 입자의 크기와 확산 속도는 반비례한다는 것을 알 수 있다.
다음으로, 입자의 표면 전하에 따른 확산 효과를 확인하기 위해, 320 nm 크기의 입자에 표면전하를 다양하게 하여(0, 0.1 및 1) 확산 효과를 확인한 결과, 표면 전하는 입자의 이동성에 영향을 미치며, 추가적인 정전기적 반발에 의해 확산 속도가 증가될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 입자의 표면 전하가 0.1일 때 입자의 35.9 %가 유스타키오관 끝에 도달했으며, 1의 전하에서 입자의 82.0%가 반대쪽에 도달하는 것을 확인하였다 (도 16). 상기 결과를 토대로, 중력, 자기력 등과 같은 외부에서 유도된 힘이 입자의 반대측으로의 확산을 향상시킬 수 있으며, 이를 이용하여 특정 방향으로 약물 전달을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
상기 결과를 종합해보면, 입자의 이동성 및 입자간 충돌은 자연적 확산에서 중요한 요소이며, 고막내 주사 후 내이의 반대쪽으로의 확산 속도는 입자의 크기 및 표면 전하를 조절함으로서 제어할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 약물 전달체를 이용한 고실 내 투여 방법을 이용하면 반대측 귀의 내부로 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 바(도 17), 한쪽 귀로의 약물 투여로 양쪽 귀의 치료를 가능하게 할 수 있으며, 외이도 폐색증과 같은 고실 내 약물 주입이 어려운 귀의 치료에 있어 반대쪽 정상 귀로 약물을 주입함으로서 병변이 발생한 귀의 치료를 진행할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 나노입자 및 약물을 포함하는 고실내 투여용 약물 전달체로서, 상기 약물 전달체의 크기는 400 nm 이하인 것인, 약물 전달체로서,
    상기 약물 전달체는 한쪽 귀의 고실내 투여된 경우, 유스타키오관을 통해 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 것인, 약물 전달체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 나노입자의 표면에 접합된 것인, 약물 전달체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 귀 질환 치료용 약물인 것인, 약물 전달체.
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 자성 나노입자인 것인, 약물 전달체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 형광 프로브를 추가로 포함하는 것인, 약물 전달체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 실리카 코팅된 것인, 약물 전달체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 약물 전달체의 표면 전하는 -10mV 내지 10 mV인 것인, 약물 전달체.
  9. 청구항 1 내지 3 및 5 내지 8 중 어느 한 항의 약물 전달체를 인간을 제외한 개체의 한쪽 귀의 고실내로 투여하는 단계를 포함하는, 반대쪽 귀의 내부로 약물을 전달하는 방법으로서,
    상기 방법은 한쪽 귀에서 반대쪽 귀 방향으로 상기 약물 전달체에 힘을 가하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 한쪽 귀의 고실 내로 투여된 약물 전달체가 유스타키오관을 통해 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 것인, 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은 약물 전달체를 한쪽 귀에 투여 후 약물 전달체가 투여된 귀는 위쪽에 위치시키고, 반대쪽 귀는 아래쪽에 위치시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은 상기 약물 전달체의 크기, 표면 전하 및 약물 전달체에 가해지는 힘을 조절하여 반대쪽 귀의 중이 또는 내이로 전달되는 약물 전달체의 양을 조절할 수 있는 것인, 방법.
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