WO2001072140A2 - Biopolymere und ihre herstellung mit koppelproduktgewinnung - Google Patents

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WO2001072140A2
WO2001072140A2 PCT/EP2001/003024 EP0103024W WO0172140A2 WO 2001072140 A2 WO2001072140 A2 WO 2001072140A2 EP 0103024 W EP0103024 W EP 0103024W WO 0172140 A2 WO0172140 A2 WO 0172140A2
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calcium
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proteases
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Albrecht Weiss
Kerstin Kuhlmann
Peter Horlacher
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Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Definitions

  • the invention is in the field of biopolymers and relates to biopolymers with a protein content of at most 1% m / m and a calcium content of at most 1% m / m and a process for their production from chitin-containing starting materials in the presence of biodegradable complexing agents and proteases.
  • the by-products can be used as valuable protein, color pigment and calcium in animal feed.
  • Chitin (poly ß- (1-4) -N-acetyl-D-glucosamine) is the most common natural biopolymer worldwide after cellulose. It represents the main part of the scaffold of marine crustaceans, insects and fungi and has gained considerable importance as a precursor to chitosan, its deacetylated form, in the past two decades. Since the use of chitosan and its derivatives in cosmetic, medical applications, in the paper industry, biotechnology, in the food sector, for wastewater treatment or seed processing, there has been a need for large-scale, environmentally friendly and profitable production methods. In addition to the good ecological compatibility of new processes, the focus is on better utilization of the by-products that are created.
  • the oldest and most common method of chitine extraction involves crushing crustacean waste, demineralization with hydrochloric acid, deproteinization with sodium hydroxide solution and subsequent washing steps [Rigby G.W .; U.S. Patent 1,040,879].
  • the pure chitin is then converted to chitosan by deacetylation with concentrated sodium hydroxide solution.
  • Joensen, JO describes the treatment of chitin-containing in patent application WO8606082 A1.
  • Astaxanthin is isolated by subsequent extraction with oils.
  • This method isolates chitin as well as astaxanthin and protein hydrolyzate as the only method described.
  • it has the disadvantages that calcium precipitates as insoluble sulfate and has to be separated off, protein hydrolyzate and astaxanthin are present in separate phases and the acidic conditions lead to partial hydrolysis of chitin.
  • the object of the present invention was therefore to provide biopolymers of high purity which are suitable for further processing to high-molecular chitosan with good film-forming properties.
  • this should be made possible by an environmentally friendly manufacturing process that enables the main and by-products to be used.
  • the process should allow the separation of protein or degraded protein from the insoluble chitin and the solubilization and isolation of the pigment from the crab shells without any noteworthy destruction.
  • Better conversion of the by-products is also said to be achieved by converting mineral-insoluble lime into soluble, biologically usable calcium. Nevertheless, the quality of the chitin obtained should not suffer from the ecological point of view.
  • the invention relates to biopolymers with a protein content of at most 1% m / m and a calcium content of at most 1% m / m, obtainable by demineralizing and deproteinizing starting materials containing chitin in the presence of biodegradable complexing agents and proteases.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of biopolymers with a protein content of at most 1% m / m and a calcium content of at most 1% m / m, in which chitin-containing starting materials are demineralized and deproteinized in the presence of biodegradable complexing agents and proteases separates the product of value from the by-product containing calcium and protein hydrolyzate.
  • the invention likewise relates to the use of the biopolymers for the production of chitosan and / or chitosan derivatives, and to the use of the by-products obtained in the process as animal feed.
  • the protein removal with proteases enables a residual protein content of maximum 1% m / m.
  • Calcium removal is almost completely possible with the selected complexing agent from ground shells, with whole shells residual calcium contents of a maximum of 1% m / m remain.
  • the complexing agent used in chitine extraction can be used as a feed additive. It does not need to be separated in the process and increases the nutritional value of the feed additive.
  • the red dye astaxanthin can be isolated approximately quantitatively under the above neutral to alkaline conditions.
  • Another advantage of the method according to the invention is the fact that calcium is present in soluble form as citrate after chitin extraction and as animal feed, for example in fish, can positively support the bone structure (salmon) and shell structure (shrimp) of rapidly growing breeding animals.
  • the protein hydrolyzate obtained as a by-product together with calcium citrate and astaxanthin also serves as a food source.
  • waste is saved by recycling all shell products and the complexing agent with the method according to the invention.
  • the method described is to be used primarily in the production of chitin from crustaceans, but this should not restrict the use with other starting materials such as insects or fungi.
  • the chitin-containing starting material is mixed with the biodegradable complexing agent and a protease and stirred for several hours at defined temperatures and adjusted pH.
  • the supernatant consisting of protein hydrolyzate, dissolved calcium, complexing agent and astaxanthin is then decanted off, the solid residue (the dishes) washed with water and again mixed with complexing agent and protease.
  • the process can be repeated any number of times until the desired purity of the biopolymer is achieved.
  • the method according to the invention can also be combined with conventional methods.
  • a subsequent treatment with mineral acids and alkali solutions such as hydrochloric acid and sodium hydroxide solution after the enzymatic reaction is conceivable. Thanks to the mixed enzymatic-chemical process, well over 99% of both the protein and the calcium can be removed from the crustacean waste despite a reduction in the environmental impact.
  • Complexing agents that are biodegradable and have a high environmental impact are used to demineralize the starting material. They can therefore even be used as a feed component without prior separation. Citrates, especially sodium citrate, are the preferred agents for demineralization.
  • the complexing agents can be prepared directly in situ by using acids and alkalis, in the highlighted case citric acid and caustic soda. Concentrations of 25 to 500 mM, preferably 50 to 200 mM sodium citrate based on the total volume are used.
  • Proteases should be used for the enzymatic deproteinization which have their optimum in the neutral to alkaline range. They enable the chitin to be treated gently, avoiding hydrolytic cleavage, so that a high-molecular biopolymer is available as a starting substance for high-molecular chitosan with good film-forming properties.
  • proteases are chymotrypsin, trypsin, chymopapain, papain, thermolysin, alcalase, Nagarse, proteinase A, proteinase K, metalloendopeptidase, endoproteinase, kalikrein, ficin, elastase, collagenase, clostripain, calpain or proteases isolated from bacteria with a pH -Optimum in the neutral to basic range.
  • Protease cocktails ie mixtures of several types of proteases with different pH optima, can also be used for deproteinization.
  • proteases of the subtilisin type are particularly preferred because of their good performance / use ratio.
  • the enzymes are used in an enzyme / shell weight ratio of 0.1: 100 to 5: 100.
  • Subtilisin is used in the enzyme / shell weight ratio of 0.1: 100 to 3: 100, preferably 0.2: 100 to 0.5: 100.
  • the pH at which the deproteinization takes place must be adjusted to the optimum reaction of the respective enzyme.
  • the pH range of the reaction should be adjusted to pH values from pH 7 to 11, preferably pH 9.0 to 10.
  • the reaction temperature must also be adjusted to the optimum temperature of the enzyme in the first step. The entire process takes place at temperatures in the range from 20 to 100 ° C., temperatures of 20 to 50 ° C. being preferred for the first step, while further steps, such as washing steps, in turn, can take place at higher temperatures.
  • subtilisin solution 0.5 ml of 5% by weight subtilisin solution was added.
  • the mixture was stirred at 45 ° C. for 16 h, the supernatant was decanted off and the
  • the dishes were incubated again, adjusted to pH 9.1 with 500 ml of 100 mM Na citrate. (Solution was prepared in situ from citric acid and NaOH)
  • subtilisin solution 0.25 ml of 5% by weight subtilisin solution was added.
  • the chitin was freeze-dried
  • the mixture was stirred at 50 ° C. for 4 h, the supernatant was decanted off and the dishes were washed thoroughly with water and once with 100 mM HCl.
  • the mixture was stirred at room temperature for 14 h, the supernatant was decanted off, and the dishes were washed thoroughly with water.
  • the chitin was freeze-dried
  • the alkaline protease of the subtilisin type is well suited for deproteinizing shrimp peeling waste.
  • the mixture was stirred at 45 ° C. for 14 h, the supernatant was decanted off, and the
  • Crude chitin was mixed with 100 ml of 3% by weight HCl, the mixture was stirred for 3 h at room temperature, the supernatant was decanted off, and the dishes were washed thoroughly once with water at 80 ° C. for 1 h. The chitin was freeze-dried.
  • the mixture was stirred at 45 ° C. for 14 h, the supernatant was decanted off. The supernatant was completely freeze-dried.
  • the supernatant was decanted and the chitosan washed until the wash water became neutral.
  • the supernatant was decanted and the chitosan washed until the wash water became neutral.
  • the supernatant was decanted and the chitosan washed until the wash water became neutral.
  • Washed water The crude chitin was mixed with 350 ml of 4.5% NaOH. The mixture was stirred at 80 ° C. for 2 hours, the supernatant was decanted off and the dishes were washed thoroughly with water.
  • the crude chitin was mixed with 350 ml of 2% HCl and the mixture was stirred for 3 h at room temperature. The supernatant was decanted off and the dishes were washed thoroughly with water at 80 ° C for 1 h. The chitin was freeze-dried.
  • the chitin produced by this method offers a high-quality precursor for the production of high molecular weight chitosan with good film-forming properties.
  • the chitosan is used for the production of cosmetic and / or pharmaceutical agents, such as, for example, skin or hair care products, skin repairs and wound healing agents, in which they are used in amounts of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 1.5 % By weight, based on the composition, may be present.
  • cosmetic and / or pharmaceutical agents such as, for example, skin or hair care products, skin repairs and wound healing agents, in which they are used in amounts of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 1.5 % By weight, based on the composition, may be present.
  • the protein hydrolyzate which is also obtained in the production of chitin, is used as astaxanthin and dissolved calcium as a feed additive, in particular as fish feed.

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Abstract

Vorgeschlagen werden Biopolymere mit einem Proteingehalt von maximal 1 % m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1 % m/m, die dadurch erhältlich sind, dass man chitinhaltige Ausgangsstoffe in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildern und Proteasen demineralisiert und deproteiniert und ein Verfahren zu deren Herstellung. Das Verfahren zeichnet sich durch Abfalleinsparung über Verwertung aller Schalenprodukte und des Komplexbildners aus.

Description

Biopolymere und ihre Herstellung mit Koppelproduktgewinnung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Biopolymere und betrifft Biopolymere mit einem Proteingehalt von maximal 1% m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1% m/m und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus chitinhaltigen Ausgangsstoffen in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildnern und Proteasen. Die dabei anfallenden Beiprodukte können als Wertstoffe Protein, Farbpigment und Calcium in Tierfutter weiterverwendet werden.
Stand der Technik
Chitin (Poly ß-(1-4)-N-acetyl-D-glucosamine) ist das nach Cellulose weltweit am häufigsten vorkommende natürliche Biopolymer. Es stellt den Hauptanteil der Gerüstsubstanz von marinen Krustentieren, Insekten und Pilzen dar und hat als Vorprodukt von Chitosan, seiner deacetylierten Form, in den letzten zwei Jahrzehnten beachtlich an Bedeutung gewonnen. Seit dem Einsatz von Chitosan und seinen Derivaten in kosmetischen, medizinischen Anwendungen, in der Papierindustrie, Biotechnologie, im Lebensmittelbereich, zur Abwasserreinigung oder auch Saatgutveredlung besteht Bedarf an großtechnischen, umweltschonenden und rentablen Herstellungsmethoden. Neben der guten ökologischen Verträglichkeit neuer Verfahren steht eine bessere Ausnutzung der entstehenden Beiprodukte im Vordergrund. Die älteste und häufigste Methode der Chitingewinnung beinhaltet die Zerkleinerung von Crustaceen-Abfällen, Deminerali- sierung durch Salzsäure, Deproteinierung durch Natronlauge und anschließende Waschschritte [Rigby G.W.; US-Patentschrift 1 040 879]. Das reine Chitin wird dann durch Deacetylierung mit konzentrierter Natronlauge zu Chitosan umgesetzt.
Durch die beschriebenen Verfahren der Chitinherstellung sind die Abwässer der Prozesse hoch mit Salz und organischen, sauerstoffzehrenden Substanzen belastet. Wertvolle Beiprodukte der Chitinherstellung wie Proteinhydrolysat und Astaxanthin, der rote Farbstoff der Crustaceen, wurden nicht weiterverarbeitet. Der Wertstoff „Farbpigment" in den Krabbenschalen wird durch die übliche Aufarbeitung stark abgebaut oder kann unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten nicht mehr isoliert werden.
Schonendere Wege der Deproteinierung bei der Chitinherstellung wurden durch den Einsatz von proteolytischen Enzymen besch ritten.
Joensen, J.O. beschreibt in der Patentanmeldung WO8606082 A1 die Behandlung von chitinhaltigen. Ausgangsmaterial mit sauren Proteasen aus Fischinnereien. Dabei findet die Deproteinierung durch die Proteasen der Innereien und die Demineralisierung durch den Zusatz einer anorganischen Säure statt. Astaxanthin wird isoliert durch anschließende Extraktion mit Ölen. Dieses Verfahren isoliert als einziges beschriebenes Verfahren sowohl Chitin, als auch Astaxanthin und Proteinhydrolysat. Es hat allerdings die Nachteile, daß Calcium als unlösliches Sulfat ausfällt und abgetrennt werden muß, Proteinhydrolysat und Astaxanthin in getrennten Phasen vorliegen und die sauren Bedingungen zu einer partiellen Hydrolyse von Chitin führen.
Diesen Nachteil zu umgehen, wurden in einem anderen Verfahren neutrale Proteasen (Actinase) zur Deproteinierung eingesetzt. Zur Demineralisierung diente in diesem Beispiel EDTA [Santoso et al., Tokyo Nogyo Daigaku Nogaku Shuho 1993]. Diese Methode erlaubte jedoch keine Isolierung von Proteinhydrolysat oder Astaxanthin, das gelöste Calcium wird nicht genutzt, da EDTA weder als Futterzusatz verwendbar noch biologisch abbaubar ist.
Die bessere ökologische Verträglichkeit versuchten Bustos und Healy [Chitin World 1994, S. 15 - 25] durch den Einsatz von proteinabbauenden Bakterienkulturen zu erreichen. Dazu zählten zum einen Proteaseexkretierende Stämme, zum anderen wurden Milchsäurebakterien eingesetzt [ Rao et al. in Adv. in Chitin Science, 1997], Häufig fand jedoch eine Proteinentfernung durch diese Methoden nur partiell statt, oder die sauren Bedingungen führten zu einer teilweisen Chitin-Polymerspaltung. Die nachträgliche notwendige Abtrennung der Mikroorganismen stellte ein neues Problem dar. Eine Isolierung von löslichem Calcium und Astaxanthin wurde nicht beschrieben.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat somit darin bestanden, Biopolymere von hoher Reinheit zur Verfügung zu stellen, die sich für die Weiterverarbeitung zu hochmolekularen Chitosan mit guten filmbildenden Eigenschaften eignen. Dieses soll jedoch durch einen umweltschonenden Herstellungsprozess ermöglicht werden, der die Nutzung der anfallenden Haupt- und Beiprodukte ermöglicht. Der Prozess soll neben der ausreichenden Aufreinigung des Rohchitins die Abtrennung von Protein oder abgebautem Protein von dem unlöslichen Chitin und die Solubilisierung und Isolierung des Pigments aus den Krabbenschalen ohne nennenswerte Zerstörung erlauben. Eine bessere Verwertung der Beiprodukte soll auch durch die Überführung von mineralischem unlöslichem Kalk in lösliches biologisch verwertbares Calcium gegeben sein. Trotzdem soll die Qualität des gewonnenen Chitins nicht unter den ökologischen Gesichtspunkten leiden. Es galt also, eine wirtschaftliche Balance zu finden zwischen der ausreichenden Reinigung des Rohchitins, der Minimierung der Säure, Auswahl einer biologisch verwertbaren Säure , des Reinigungsmittels und einer integrierten Ausarbeitung der weiteren Wertstoffe Protein, Calcium, und Pigment. Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind Biopolymere mit einem Proteingehalt von maximal 1% m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1% m/m, dadurch erhältlich, daß man chitinhaltige Ausgangsstoffe in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildnern und Proteasen demineralisiert und deproteiniert. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit einem Proteingehalt von maximal 1 % m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1% m/m, bei dem man chitinhaltige Ausgangsstoffe in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildnern und Proteasen demineralisiert und deproteiniert und das Wertprodukt von dem Calcium und Proteinhydrolysat enthaltenden Beiprodukt abtrennt. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Biopolymere zur Herstellung von Chitosan und/oder Chitosanderi- vaten, sowie die Verwendung der in dem Verfahren anfallenden Beiprodukte als Tierfutter.
In dem erfmdungsgemäßen Verfahren gelang es, alle Parameter zu kombinieren, so daß unter ökonomischen Gesichtspunkten weniger Rohstoffe zur Reinigung eingesetzt werden als im derzeit technischen Prozeß, der mit den Chemikalien Salzsäure und Natronlauge gefahren wird. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Deproteinierung und Demineralisation unter neutralen bis alkalischen Bedingungen die Chitinspaltung vermeidet, so daß aus diesem Vorprodukt hochmolekulares Chitosan mit guten filmbildenden Eigenschaften durch Deacetylierung hergestellt werden kann. Die nach dem Verfahren aus chitinhaltigem Ausgangsmaterial hergestellten Biopolymere weisen in Bezug auf den Restgehalt an Calcium und Proteinen neben der geringen hydrolytischen Zersetzung eine hohe Reinheit auf. Die Proteinentfernung mit Proteasen ermöglicht einen Proteinrestgehalt von maximal 1 % m/m. Die Calciumentfemung ist mit dem ausgewählten Komplexbildner aus gemahlenen Schalen annähernd vollständig möglich, mit ganzen Schalen bleiben Rest-Calciumgehalte von maximal 1 % m/m.
Der bei der Chitingewinnung eingesetzte Komplexbildner ist im Gegensatz zu anderen Komplexbildnern (z.B. EDTA) als Futtermitteladditiv einsetzbar. Er braucht im Prozeß nicht abgetrennt zu werden und erhöht den Nährwert des Futtermitteladditivs. Der rote Farbstoff Astaxanthin kann unter obigen neutralen bis alkalischen Bedingungen annähernd quantitativ isoliert werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, daß Calcium nach der Chitingewinnung in löslicher Form als Citrat vorliegt und als Tierfuttermittel zum Beispiel bei Fischen den Knochenaufbau (Lachse) und Schalenaufbau (Shrimps) schnell wachsender Zuchttiere positiv unterstützen kann. Das als Beiprodukt zusammen mit Calciumcitrat und Astaxanthin anfallende Proteinhydrolysat dient ebenfalls als Nahrungsquelle. Somit wird neben der Gewinnung eines qualitativ hochwertigen Biopolymers zur Chitosanherstellung eine Abfalleinsparung über Verwertung aller Schalenprodukte und des Komplexbildners mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht. Das beschriebene Verfahren soll vorwiegend bei der Gewinnung von Chitin aus Krustentieren eingesetzt werden, was jedoch die Verwendung bei anderen Ausgangsstoffen wie Insekten oder Pilzen nicht einschränken soll.
Das chitinhaltige Ausgangsmaterial wird dabei mit dem bioabbaubaren Komplexbildner und einer Protease versetzt und unter definierten Temperaturen und eingestelltem pH-Wert über mehrere Stunden gerührt. Der Überstand bestehend aus Proteinhydrolysat, gelöstem Calcium, Komplexbildner und Astaxanthin wird danach abdekantiert, der feste Rückstand (die Schalen) mit Wasser gewaschen und erneut mit Komplexbildner und Protease versetzt. Der Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden, bis die gewünschte Reinheit des Biopolymeres erreicht ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zusätzlich mit herkömmlichen Methoden kombiniert werden. Eine nach der enzymatischen Reaktion anschließende Behandlung mit Mineralsäuren und Alkalilaugen wie zum Beispiel Salzsäure und Natronlauge ist dabei denkbar. Durch das gemischt enzymatisch- chemische Verfahren können trotz einer Verringerung der Umweltbelastung deutlich über 99% sowohl des Proteins als auch des Calciums aus dem Krustentierabfall entfernt werden.
Zur Demineralisierung des Ausgangsmaterials werden Komplexbildner eingesetzt, die biologisch abbaubar sind und eine hohe Umweltverträglichkeit aufweisen. Sie sind somit sogar als Futterbestandteil ohne vorherige Abtrennung einsetzbar. Dabei sind Citrate, insbesondere Natriumeitrat das bevorzugte Agens zur Demineralisierung.
Die Komplexbildner können direkt in situ durch Einsatz von Säuren und Laugen, im hervorgehobenen Fall Citronensäure und Natronlauge, hergestellt werden. Dabei finden Konzentrationen von 25 bis 500 mM, vorzugsweise 50 bis 200 mM Natriumeitrat bezogen auf das Gesamtvolumen Anwendung.
Zur enzymatischen Deproteinierung sollen Proteasen eingesetzt werden, die ihr Optimum im neutralen bis alkalischen Bereich haben. Sie ermöglichen eine schonende Behandlung des Chitins, unter Vermeidung einer hydrolytischen Spaltung, so daß ein hochmolekulares Biopolymer als Ausgangssubstanz für hochmolekulares Chitosan mit guten filmbildenden Eigenschaften zur Verfügung steht. Mögliche Proteasen sind Chymotrypsin, Trypsin, Chymopapain, Papain, Thermoly- sin, Alcalase, Nagarse, Proteinase A, Proteinase K, Metalloendopeptidase, Endoproteinase, Kal- likrein, Ficin, Elastase, Collagenase, Clostripain, Calpain oder aus Bakterien isolierte Proteasen mit einem pH-Optimum im neutralen bis basischen Bereich. Protease-Cocktails, das heißt Mischungen von mehreren Proteasetypen mit unterschiedlichen pH-Optima, sind ebenfalls zur Deproteinierung einsetzbar. Besonders bevorzugt aufgrund ihres guten Leistungs/Einsatzmengen-Verhältnisses sind Proteasen vom Subtilisin-Typ. Je nach Proteasetyp und Reaktionszeiten werden die Enzyme eingesetzt im Enzym/Schalen-Gewichtsverhältnis von 0,1 :100 bis 5:100. Subtilisin findet Anwendung im Enzym/Schalen-Gewichtsverhältnis von 0,1 :100 bis 3:100, vorzugsweise 0,2:100 bis 0,5:100. Der pH-Wert, bei dem die Deproteinierung abläuft, ist dem Reaktionsoptimum des jeweiligen Enzyms anzupassen. Im Falle von Subtilisin soll der pH-Bereich der Reaktion auf pH-Werte von pH 7 bis 11 , vorzugsweise pH 9,0 bis 10 eingestellt werden. Auch die Reaktionstemperatur muß im ersten Schritt dem Temperaturoptimum des Enzyms angepasst werden. Der Gesamtprozess findet bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 100°C statt, wobei für den ersten Schritt Temperaturen von 20 bis 50°C bevorzugt werden, während weitere Schritte, wie zum Beispiel Waschschritte wiederum bei höheren Temperaturen ablaufen können.
Beispiele
Versuch 1 :
Untersuchung der demineralisierenden Eigenschaften von Citrat
Demineralisierung von Shrimpschalen und Shrimppulver mit Citrat im schwach alkalischen Millieu unter gleichzeitiger Deproteinierung mit Savinase
Ansatz 1 :
100 g Shrimp Peeling-Abfall wurden mit 1000 ml 100 mM Na-Citrat eingestellt auf pH 9,1
(Lösung wurde in situ aus Citronensäure und NaOH hergestellt).
0,5 ml 5 Gew.%ige Subtilisin-Lösung wurden zugefügt.
Der Ansatz wurde 16 h bei 45 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert und die
Schalen wurden gründlich mit Wasser gewaschen.
Die Schalen (Roh-Chitin) wurden erneut inkubiert, mit 500 ml 100 mM Na-Citrat eingestellt auf pH 9,1. (Lösung wurde in situ aus Citronensäure und NaOH hergestellt)
0,25 ml 5 Gew.%ige Subtilisin-Lösung wurden zugefügt.
Der Ansatz wurde 63 h bei 30 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert und
Schalen wurden gründlich mit Wasser und Ethanol gewaschen.
Das Chitin wurde gefriergetrocknet
Ansatz 2:
50 g getrocknetes und gemahlenes Pulver aus Shrimp Peeling-Abfall wurden analog zu Ansatz 1 aufgearbeitet.
Ergebnis:
Tabelle 1
Figure imgf000007_0001
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Figure imgf000008_0001
Versuch 2:
Untersuchung der Deproteinierungs-Eigenschaften von alkalischen Proteasen vom Typ
Subtilisin
Deproteinierung von Shrimpschalen mit Subtilisin im schwach alkalischen Millieu unter gleichzeitiger Demineralisierung mit Citrat
Ansatz 3:
200 g Shrimp Peeling-Abfall wurden mit 1000 ml 50 mM Na-Citrat eingestellt auf pH 9,5 (Lösung wurde in situ aus Citronensäure und NaOH hergestellt) 0,5 ml 5 Gew.%ige Subtilisin-Lösung wurde zugefügt.
Der Ansatz wurde 4 h bei 50 °C gerührt, der Überstand abdekantiert und die Schalen wurden gründlich mit Wasser und einmal mit 100 mM HCI gewaschen.
Die Behandlung der Schalen wurde zweimal wie oben beschrieben wiederholt.
1. Wiederholung) Volumen 750 ml, t = 4 h, T = 50 °C
2. Wiederholung) Volumen 500 ml, t = 13 h, T = 30 °C
Nach der dritten Inkubation wurde für 1 h mit heißem Wasser (80 °C) gewaschen, Das Chitin wurde gefriergetrocknet
Ansatz 4:
200 g Shrimp Peeling-Abfall
2000 mM00 mM HCI-Lösung
Der Ansatz wurde 14 h bei Raumtemperatur gerührt, der Überstand wurde abdekantiert, und die Schalen wurden gründlich mit Wasser gewaschen.
Die weitere Behandlung der Schalen erfolgt analog zu Ansatz 3
1. Ansatz) Volumen 1000 ml, t = 3 h, T = 50 °C
1. Wiederholung) Volumen 500 ml, t = 3 h, T = 50 °C 2. Wiederholung) Volumen 500 ml, t = 4 h, T = 50 °C
Nach der dritten Inkubation wurde für 1 h mit heißem Wasser (80 °C) gewaschen,
Das Chitin wurde gefriergetrocknet
Ergebnis:
Tabelle 2
Figure imgf000009_0001
Fazit: Die alkalische Protease vom Typ Subtilisin ist gut geeignet zur Deproteinierung von Shrimp Peeling-Abfall.
Vergleiche mit Literaturdaten zur Deproteinierung von Shrimp-Schalen mit anderen Proteasen zeigen, daß alkalische Proteasen vom Subtilin-Typ ein sehr gutes Leistungs/Einsatzmenge-Ver- hältnis haben (Tabelle 3). Andere Autoren (Takeda & Abe, 1962; Takeda & Katsura, 1964) erzielten mit verschiedenen anderen Proteasen lediglich Rest-Protein Gehalte im Chitin von 5 % bei > 60 h Reaktionszeit.
Tabelle 3: Vergleich von Subtilisin mit Papain, Chymotrypsin (Gagne & Simpson, Food Biotech- nology 1993, 7 (3), 253 - 263).
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000010_0001
Versuch 3:
Gemischt Enzymatisch-Chemischer Ansatz zur Deproteinierung und Demineralisierung von
Shrimp Peeling-Abfall
Ansatz 5:
50 g Shrimp Peeling-Abfall wurden mit 100 ml Wasser und 3 g Na-Citrat versetzt und der pH-Wert eingestellt auf pH 9,5.
0,1 ml 5 Gew.%ige Subtilisin-Lösung wurden zugefügt.
Der Ansatz wurde 14 h bei 45 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert, und die
Schalen wurden gründlich mit Wasser gewaschen
Roh-Chitin wurde mit 100 ml 4 Gew.% NaOH versetzt, der Ansatz wurde 2 h bei 80 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert, und die Schalen wurden gründlich mit Wasser gewaschen
Roh-Chitin wurde mit 100 ml 3 Gew.% HCI versetzt, der Ansatz wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt, der Überstand wurde abdekantiert, und die Schalen wurden einmal gründlich bei 80 °C für 1 h mit Wasser gewaschen. Das Chitin wurde gefriergetrocknet.
Ergebnis:
Tabelle 4:
Figure imgf000010_0002
Mit der gemischt chemisch und enzymatischen Behandlung können deutlich über 99 % sowohl von Protein als auch Calcium aus dem Shrimp Peeling-Abfall entfernt wurden. Versuch 4:
Isolierung von Proteinhydrolysat, rotem Krabbenfarbstoff, Citrat und löslichem Calcium aus enzymatischem Deproteinierungs und Demineralisierungs Überstand von Shrimp Peeling- Abfall.
Ansatz 6 (analog zu Schritt 1 aus Ansatz 5):
50 g Shrimp Peeling-Abfall wurden mit 100 ml Wasser und 3 g Na-Citrat versetzt und der pH-Wert eingestellt auf pH 9,5. 0,1 ml 5 Gew.%ige Subtilisin-Lösung wurden zugefügt.
Der Ansatz wurde 14 h bei 45 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert. Der Überstand wurde komplett gefriergetrocknet.
Ergebnis:
Tabelle 5:
Figure imgf000011_0001
Fazit: In Relation zum gewonnenen Chitin (durchschnittlich etwa 4 %/Feuchtgewicht Shrimp Peeling-Abfall) läßt sich ein 6facher Überschuß pulverförmiger Wertstoff gewinnen, der reich an partiell hydrolysiertem Protein, Citrat und Calcium ist. Der gewonnene rote Farbstoff entspricht in der Größenordnung den Literaturangaben zum Astaxanthin-Gehalt in Shrimp Peeling-Abfall von der Gattung Pandalus Borealis (230 ppm auf getrocknetes Produkt, Joensen & Villadsen, In Chitin World 1994).
Extrahiertes Calcium entspricht etwa 65 % des maximal extrahierbarem Calcium. Mit höheren Cit- rat-Konzentrationen konnten auch höhere Werte gelösten Calciums erzielt wurden (~ 0,9 g = 7,5 %). Versuch 5:
Herstellung von Chitosan aus enzymatisch hergestelltem Chitin durch chemische Deacety- lierung. Qualitative Untersuchung der produzierten Chitosane im Vergleich zu chemisch hergestelltem Chitosan.
Ansatz 7:
200 mg getrocknetes und gemahlenes Chitin aus Ansatz 1 wurden mit
10 ml 50 % NaOH versetzt und 4 h unter Rühren und Rückfluß gekocht.
Der Überstand wurde abdekantiert und das Chitosan gewaschen bis das Waschwasser neutral wurde.
Ansatz 8:
200 mg getrocknetes und gemahlenes Chitin aus Ansatz 3 wurden mit
10 ml 50 % NaOH versetzt und 4 h unter Rühren und Rückfluß gekocht.
Der Überstand wurde abdekantiert und das Chitosan gewaschen bis das Waschwasser neutral wurde.
Ansatz 9:
200 mg getrocknetes und gemahlenes Chitin aus Ansatz 4 wurden mit
10 ml 50 % NaOH versetzt und 4 h unter Rühren und Rückfluß gekocht.
Der Überstand wurde abdekantiert und das Chitosan gewaschen bis das Waschwasser neutral wurde.
Ansatz 10:
200 mg getrocknetes und gemahlenes Chitin aus Ansatz 5 wurden mit 10 ml 50 % NaOH versetzt und 4 h unter Rühren und Rückfluß gekocht.
Der Überstand wurde abdekantiert und das Chitosan gewaschen bis das Waschwasser neutral wurde.
Ansatz 11:
200 g Shrimp Peeling-Abfall wurden mit 350 ml 4 % HCI versetzt. Der Ansatz wurde 14 h bei
4 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert, und die Schalen wurden gründlich mit
Wasser gewaschen. Das Roh-Chitin wurde mit 350 ml 4,5 % NaOH versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei 80 °C gerührt, der Überstand wurde abdekantiert und die Schalen wurden gründlich mit Wasser gewaschen.
Das Roh-Chitin wurde mit 350 ml 2 % HCI versetzt und der Ansatz wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Überstand wurde abdekantiert, und die Schalen wurden gründlich bei 80 °C für 1 h mit Wasser gewaschen. Das Chitin wurde gefriergetrocknet.
200 mg getrocknetes und gemahlenes Chitin wurden mit10 ml 50 % NaOH 4 h unter Rühren und Rückfluß gekocht. Der Überstand wurde abdekantiert und das Chitosan gewaschen bis das Waschwasser neutral wurde.
Ergebnis:
Figure imgf000013_0001
Gewerbliche Anwendbarkeit
Da die Deproteinierung und Demineralisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Chitinspaltung verhindert, bietet das nach dieser Methode hergestellte Chitin einen hochwertiges Vorprodukt für die Herstellung von hochmolekularem Chitosan mit guten filmbildenden Eigenschaften.
Verwendung findet das Chitosan zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Mitteln, wie beispielsweise Haut- oder Haar- Pflegemitteln, Hautrepairstoffen und Wundheilmitteln, in denen sie in Mengen von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 1 ,5 Gew.-% - bezogen auf die Mittel - enthalten sein können.
Das weiterhin bei der Chitinherstellung gewonnene Proteinhydrolysat findet wie auch das Astaxanthin und gelöstes Calcium Verwendung als Futtermittelzusatz, insbesondere als Fischfutter.

Claims

Patentansprüche
1. Biopolymere mit einem Proteingehalt von maximal 1% m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1% m/m, dadurch erhältlich, daß man chitinhaltige Ausgangsstoffe in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildnern und Proteasen demineralisiert und deproteiniert.
2. Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit einem Proteingehalt von maximal 1% m/m und einem Calciumgehalt von maximal 1% m/m, bei dem man chitinhaltige Ausgangsstoffe in Gegenwart von biologisch abbaubaren Komplexbildnern und Proteasen demineralisiert und deproteiniert und das Wertprodukt von dem Calcium und Proteinhydrolysat enthaltenden Beiprodukt abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Citrate als Komplexbildner zur Demineralisierung einsetzt.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als chitinhalti- ges Ausgangsmaterial Schalen von Krustentieren einsetzt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur enzymatischen Deproteinierung neutrale und/oder alkalische Proteasen einsetzt.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymati- sche Deproteinierung bei einem pH-Wert von 7 bis 11 durchführt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Deproteinierung und Demineralisierung bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 100°C durchführt.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das im Beiprodukt enthaltene Calcium in gelöster Form vorliegt.
9. Verwendung der bei dem Verfahren nach Anspruch 2 anfallenden Beiprodukte als Tierfuttermittel.
10. Verwendung der Biopolymere nach Anspruch 1 zur Herstellung von Chitosan und/oder Chito- sanderivaten.
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