WO2001042475A1

WO2001042475A1 - Peroxydases du riz aux propriétés diverses

Info

Publication number: WO2001042475A1
Application number: PCT/JP2000/008728
Authority: WO
Inventors: Yuko Ohashi; Ichiro Mitsuhara; Takuji Sasaki; Yoshiaki Nagamura; Hiroyuki Ito; Takayoshi Iwai; Susumu Hiraga
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2001-06-14
Also published as: AU1735601A; KR20020068052A; EP1995311A1; EP1249493A4; US20040091860A1; CN1434867A; AU779563B2; EP1249493A1; CA2390680A1

Description

明細書種々の特性を持つィネペルォキシダーゼ技術分野

本発明は、植物のペルォキシダーゼ遺伝子に関する。より詳細には、イネ由来の新規ペルォキシダーゼ遺伝子に関する。本発明はまた、イネ由来の新規ペルォキシダーゼ遺伝子群を用いたマイクロアレイによる遺伝子解析の方法ならびにそれを行うためのシステムおよび装置に関する。背景技術

ペルォキシダーゼ（EC. 1. 1 1. 1. 7) (本明細書中で「POX」ともいう）は、一般に種々の基質の過酸化水素による酸化反応を触媒する酵素であつて、微生物から動植物までに広く存在する。ペルォキシダーゼは、. 種々のァイソザィムおよびァイソフォームの形態からなるスーパーファミリーを構成し、現在では、その反応特異性および構造により、クラスしクラス I Iおよびクラス I

I Iに分類されている（We i i n d e r、文献 1 ) 。クラス Iは、原核生物べルォキシダ一ゼとも呼ばれ、酵母ミトコンドリアシトクローム c POX、葉緑体ァスコルビン酸 POX、細胞質ゾルァスコルビン酸 POXおよび遺伝子二重細菌 P〇Xなどが含まれる。クラス I Iは、分泌型真菌ペルォキシダーゼとも呼ばれ、代表的には P. c h r y s o s p o r i umマンガン依存性 POX (PCM) 、およびリグニナーゼなどが含まれる。クラス I I Iは、古典的分泌型植物ペルォキシダ—ゼとも呼ばれ、代表的には西洋ヮサビ POXなどが含まれる。クラス I

I I植物 POXは、植物において普遍的に見い出されており、さらに複数のアイソフォームが同一植物から見い出されている（文献 1) 。クラス I I I植物ペルォキシダ一ゼ（POX) は、植物における種々の生理的過程（例えば、木化（Wh e t t e nら、（文献 2) ) 、コルク化（E s p e 1 i eら、（文献 3) ) 、細胞壁タンパク質の架橋（F r yら（文献 4) ) 、ォーキシン分解および植物ホルモンであるィンドール酢酸（ I AA) の酸化（H i n manら（文献 5) ) 、病原体からの防御（Ch i t t o o rら（文献 6) ) 、塩耐性（Amayaら（文献 7) ) 、老化（Abe 1 e sら（文献 8) ) 、'植物の発生、分化および生長（Ho r t onら（文献 9) ) など）に寄与することが示唆されており、植物の生長および病傷害ストレス応答などにおいて重要な役割を担っていると考えられている。ペルォキシダーゼが単一の植物中に複数存在すること、および基質特異性が広いことなどから、個々のペルォキシダーゼの特異的な生理的機能を特定することは未だ困難である。植物の POX遺伝子については、例えば、アルフアルファ、トマトおよびコムギから、それぞれ 7以上の POX遺伝子が単離され、そして同定されている（C h i t t o rら（1999) 、文献 6) 。 Ch i t t oo rらは、イネから相同性の高い 3つの c DN Aおよびゲノム DN Aフラグメントを単離し、そしてこの 3つの POXがイネ白葉枯病菌（X a n t h omo n a s o r y z a e p v. o ry z a e) による感染の際に異なる誘導を受けることを示した（Ch i t o o rら（1997) 、文献 10) 。 I t oらは、イネの地上部組織にタンパク質レベルで 25の POXが存在することを示し、そのうち 4種を精製して、 N末端アミノ酸配列とそれぞれに対する抗体の反応性とから、これらが 2組のアイソフオームであることを推定した（ I t oら、文献 1 1) 。 I t oらは、 2つの構造的に関連する POXをコードする cDNA (p r xRPAおよび p r xRPN) を単離したが、この 2つの遺伝子は、同一ではないが類似する発現パターンを示した。（I t oら、文献 12) 。タバコにおいて、 12の POXアイソザィムが、等電点電気泳動後の活性染色によって検出され、そして、これらのアイソザィムが器官特異性および傷害または TMV感染に対する応答性が異なることが示された。これらのタバコ POXについての観察から、個々の POX遺伝子の発現が異なって調節されることが示唆された（L a n g r im i n iら、文献 13) 。このように、発現特異性について従来研究された POXアイソザィムの数は限定されており、数十あると予測される POXの発現動向について概括的な解析は. なされておらず、また従来の知見からではそのような解析は困難であった。ペルォキシダーゼ（POX) は、過酸化水素に代表される活性酸素種の除去において役割を有することが知られている。一般に、植物などの細胞中の活性酸素種（スーパーォキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素など）の濃度が上昇した状態は、酸化ストレス（ox i d a t i ve s t r e s s) と呼ばれる。これは、過酸化状態、紫外線および放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペルォキシゾーム異常増加、高温 ·低温 ·化学物質等の非生物的作因、オゾンおよび二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす酸化状態と、スーパ一ォキシドジスムターゼ（SOD) 、カタラーゼ（CAT) 、 POX、ビタミン£、 Cおよび A等の作用による、細胞内の抗酸化剤防御機構とのバランスが崩れたときに起きる。真核生物では、酸化ストレスに曝されると SODなどの活性が高まることが以前から知られている。あらかじめ SODなどを誘導しておくことにより、細胞が酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示す例も観察されている。植物においても、酸化ストレスの発生について、次のことが知られている。（ 1) 光合成を妨げる様々な条件（光照射下の低温、除草剤処理など）によって、光合成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生し得る。（2) 暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等の活性酸素種の濃度が上昇し得る。（3) 除草剤（パラコート（商品名）（1, 1—ジメチルー 4, 4—ジピリジニゥムジクロリド）等）および紫外線も、その作用機構に活性酸素種が関わっている。そして、（4) 乾燥ストレスや重金属なども、酸化ストレスを引き起こすと考えられている。近年、酸化ストレスを含む環境ストレスが植物を含む生物の生体に与える影響が注目されている。近代の工業化による地球環境の悪化が深刻な社会問題になつており、植物においても環境ストレス耐性を向上させるための研究が行われている。 POXのような抗酸化酵素は、種々の環境ストレスによって生体中に過多に発生する活性酸素を除去するのに有効な、環境ストレス耐性（生体防御）因子であると考えられている。しかし、 POXについては、アイソザィムの多様性および広範な基質特異性などの点から、環境ストレス耐性における役割は充分に解明されていない。従って、現段階では環境ストレス耐性植物を作製するための材料とすることは困難である。クラス I I I POXについては、病原菌の感染のような生物的刺激に対しての役割も示唆されている。大橋ら（文献 14) においては、タバコ POXについて、タバコモザイクウィルス（TMV) 感染による局部病斑形成と POXとの関連が研究され、 TMVによる壊死病斑形成の過程で POXがポリフエノールの酸化という形で機能していることが示唆された。従って、 POXは、病原体の感染に対して植物に防御機能を付与することにおいても重要な役割を果たし得ることが示唆される。従って、ストレス耐性植物を含む有用植物の、遺伝子工学的手法に'よる作出という観点から、 POX遺伝子の発現特性についての詳細な知見の蓄積が所望されている' 最近、イネを含む多くの植物において、大規模な発現配列タグ（EST) 配列決定プログラムが進行中である。イネ（Yamamo t oら、（文献 15) ) およびシロイヌナズナ（Oe s t e rgaa rdら（文献 16) ) からも、それぞれ 42および 41の異なる POX遺伝子の存在が確認された。しかし、これらの EST配列は、遺伝子の部分配列情報を提供するのみである。これらの遺伝子の機能についての分析が報告された例は知られていない。

(発明が解決しようとする課題）

本発明は、個々の遺伝子の発現特性が解明された、新規なペルォキシダーゼ遺伝子群およびそのメンバーを提供することを目的とする。本発明はまた、特定された発現特異性を有する植物発現プロモーターを提供することを目的とする。本発明は、発現特異性の異なるペルォキシダーゼ群の全体像の解明、およびそこから得られる情報を利用した、所望の性質を有する改変植物の作出のために有用である。本発明はまた、 DNAマイクロアレイなどを利用した、遺伝子発現の分析において有用である。発明の開示

(発明の要旨）

本発明は、本明細書の定義による 2以上の発現特異性によって特徴付けられるペルォキシダーゼ遺伝子およびそのセッ卜に関する。発現特異性の例としては、時期特異性、部位特異性、ストレス応答性などが挙げれる。本発明はさらに、特定の発現特異性を有するペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターに関する。本発明は、 21の代表的なイネペルォキシダ一ゼ遺伝子についての多面的な発現特性データの解析に基づく。本発明者らによって、個々のイネペルォキシダ一ゼ遺伝子が、種々のパラメ一夕（例えば、生長時期、組織など）に対して独自の発現パターンを示すことが明らかになった。さらに、酸素ストレス、病原体への感染などのストレスに際して、発現が異なって誘導されるイネペルォキシダーゼ遺伝子が複数存在することが明らかになった。

1つの局面において、本発明は、植物の特性を評価するために有用なペルォキシダーゼ遺伝子のセットであって：

(A1) 以下からなる遺伝子群：

(1) 配列番号 1の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(2) 配列番号 3の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片：

(3) 配列番号 5の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(4) 配列番号 7の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(5) 配列番号 9の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(6) 配列番号 1 1の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(7) 配列番号 13の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(8) 配列番号 15の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(9) 配列番号 17の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(10) 配列番号 19の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(1 1) 配列番号 21の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；から選択される 1種類以上を含む、根発現型構成的遺伝子のサブセッ卜；

(A2) 以下からなる遺伝子群：

(12) 配列番号 23の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；および

(13) 配列番号 25の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

から選択される 1種類以上を含む、地上部発現型構成的遺伝子のサブセット； (B 1) 以下からなる遺伝子群：

(14) 配列番号 27の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(15) 配列番号 29の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(16) 配列番号 31の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(17) 配列番号 33の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(18) 配列番号 35の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

から選択される 1種類以上を含む、根発現型ス卜レス誘導性遺伝子のサブセッ卜；

ならびに、 (B2) 以下からなる遺伝子群：

(19) 配列番号 37の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；および

(20) 配列番号 39の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

から選択される 1種類以上を含む、地上部発現型ストレス誘導性遺伝子のサブセッ卜；

ならびに、

任意に、

(C) 以下の遺伝子：

(21) 配列番号 41の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片、を含む、ペルォキシダーゼ遺伝子のセットに関する。

別の局面において、本発明は、以下のいずれかのペルォキシダ一ゼ遺伝子に関する：

(a) 配列番号 3の 50位から 102 1位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA ;

(b) 配列番号 5の 108位から 1 109位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA ;

(c) 配列番号 7の 66位から 1046位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA

.(d) 配列番号 9の 71位から 1078位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(e) 配列番号 11の 134位から 1 108位までの配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA；

( f ) 配列番号 13の 75位から 1058位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA ; (g) 配列番号 15の 136位から 1 147位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

( i) 配列番号 17の 29位から 997位までの配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA ;

( j ) 配列番号 19の 14位から 997位までの配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA ;

(k) 配列番号 21の 1 10位から 1090位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

( 1 ) 配列番号 23の 53位から 1033位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(m) 配列番号 25の 20位から 982位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(n) 配列番号 29の 81位から 1025位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA ;

(o) 配列番号 31の 44位から 1084位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(p) 配列番号 33の 68位から 11 14位までの配列の配列を有するペルォキシダーゼ DN A；

(q) 配列番号 35の 31位から 1 101位までの配列の配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA；

( Γ) 配列番号 37の 34位から 10.89位までの配列の配列を有するペルォキシダーゼ DN A；

(s) 配列番号 39の 52位から 1062位までの配列の配列を有するペルォキシダーゼ DN A；または、

(t) (a) 〜（s) のいずれか 1つの配列とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする配列を有し、上記配列によってコードされるペルォキシダーゼと同一の発現特異性を有するペルォキシダーゼをコードする遺伝子を提供する。他の局面においてい本発明は、ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであつて、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または上記ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記ペルォキシダーゼ遺伝子と同一の特異的な発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーターに関する。

1つの実施態様において、本発明は、ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21、 27、 29、 31、 33、および 35からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または上記ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、根特異的発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコ一ド領域上流側に存在する、プロモーターに関する。別の実施態様において、本発明は、ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 15、 17、 19および 21からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または上記ペルォキシダ一ゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、根および地上部で発現活性を示すペルォキシダ一ゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーターに関する。

他の実施態様において、本発明は、ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 23、 25、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または上記ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、地上部特異的な発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコ一ド領域上流側に存在する、プロモータ一に関する。別の実施態様において、本発明は、ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 13、 15、 17、 21、 23および 2 5からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または上記べルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、構成的な発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーターに関する。別の実施態様において、本発明は、ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1 1および 19からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または上記ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、ストレス減少性発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモータ一に関する。別の実施態様において、本発明は、ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または上記ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、ストレス誘導性の発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、請求項 2 0に記載のプロモ一夕一に関する。別の局面において、本発明は、発現カセットの製造方法であって、上記方法が以下の工程：

(1) (a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、

21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子；または

( b ) 上記ペルォキシダ一ゼ遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、上記ペルォキシダーゼ遺伝子と同一の特異的な発現活性を示すぺルォキシダーゼ遺伝子

を提供する工程；

( 2 ) ( a ) または（b ) のペルォキシダ一ゼ遺伝子のコード領域上流側においてプロモータ一活性を有する領域を特定する工程；および

( 3 ) 上記特定されたプロモーター活性を有する領域を、異種遺伝子と作動可能に連結する工程、を包含する、方法に関する。本発明のペルォキシダーゼ遺伝子は、特性が改変された植物品種を作出する方法において有用であり得る。植物品種の作出方法は、例えば、以下の工程：本発明のペルォキシダーゼ遺伝子またはそのホモログからなる遺伝子群より選択される 1以上の遺伝子をプロモーターに作動可能に結合した発現カセッ卜を調製する工程；

上記発現カセットを植物品種の細胞に導入する工程；および

上記細胞を再生して植物体とする工程、

を包含し得る。このとき、上記遺伝子は、植物品種において、その発現量が、上記植物の属する種における標準的な発現量と異なると評価されて選択されたものであり得る（ただし、上記選択工程において、配列番号 1の配列を有する D N A またはそのホモログまたは配列番号 2 7の配列を有する D N Aまたはそのホモ口グが選択されるときは、他の遺伝子の少なくとも 1種以上が同時に選択される）。ここで、「標準的な発現量」とは、遺伝子について言及する場合、改変を施すべき植物品種が属する種の正常な生育条件下での平均的な発現量をいう。上記作出方法はまた、以下の工程：

本発明のペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターを含む発現カセットを植物品種の細胞に導入する工程：および

上記細胞を再生して植物体とする工程、

を包含し得る。植物品種の特性の改変には、例えば、大気汚染物質、傷、過酸化水素、 U V、病原体、環境ストレスおよびエチレンからなる群から選択される要因によって生じるストレスに対する抵抗性の改変が含まれる。上記改変には又、植物の生育特性または代謝特性の改変が含まれる。別の局面において、本発明は、本発明のペルォキシダーゼ遺伝子のセットを用いて、植物の特性を解析するための方法に関する。この方法は、以下の工程：サンプルから R N Aを抽出する工程；

この R N Aをメンブレンに結合させる工程；

本発明のペルォキシダーゼ遺伝子のセッ卜を標識する工程；

このメンブレンをこの標識された.ペルォキシダーゼのセットとともにインキュペートする工程；および

この標識されたペルォキシダーゼのセッ卜に由来するシグナルを検出する工程、を包含する。本発明はまた、サンプル中の本発明の遺伝子を用いて、植物の特性を解析するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：

サンプルから R N Aを抽出する工程；

この R NAをメンブレンに結合させる工程；

本発明のペルォキシダーゼ遺伝子を標識する工程；このメンブレンをこの標識されたペルォキシダーゼのセットとともにインキュペートする工程；および

この標識されたペルォキシダーゼ遺伝子に由来するシグナルを検出する工程、を包含する。

一つの実施態様において、上記特性は、ィモチ病菌に対する応答である。別の実施態様において、好ましくは、上記方法における遺伝子は、配列番号 2 9、配列番号 3 1、配列番号 3 3および配列番号 3 7からなる群より選択される少なくとも 1つの遺伝子である。本発明のサンプルは、任意の植物由来であり得る。 1つの実施態様において、上記サンプルは、イネ科植物由来であり得る。別の実施態様において、本発明のプロモーターに由来する配列を用いて、植物の特性を解析するための方法が提供される。この方法は、以下の工程：

サンプルから R N Aを抽出する工程；

この R N Aをメンブレンに結合させる工程；

本発明のプロモーターに由来する配列を有するオリゴヌクレオチドを標識する工程；

このメンブレンをこの標識されたオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程；および

この標識されたペルォチシダ一ゼ遺伝子に由来するシグナルを検出する工程、を包含する。別の局面において、本発明は、 D N Aマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析方法を提供する。この方法は、以下の工程：

( a ) D N Aマイクロアレイに本発明のペルォキシダ一ゼ遺伝子のセットを固定させる工程；

(b) 植物から 2種類以上のサンプルを調製する工程；

(c) このサンプルを標識する工程；

(d) この標識されたサンプルを、この DNAマイクロアレイと混合し、ハイ ,ブリダィズさせる工程；および

(e) このハイブリダィズされた DNAマイクロアレイを洗浄し、この標識に由来するシグナルを検出する工程、

を包含する。別の局面において、本発明は、 DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析方法を提供する。この方法は、以下の工程：

( a ) DNAマイクロアレイに本発明のペルォキシダーゼ遺伝子および Zまた 'は本発明のプローブを固定させる工程；

(b) 植物から 2種類以上のサンプルを調製する工程；

(c) このサンプルを標識する工程；

(d) この標識されたサンプルを、この DNAマイクロアレイと混合し、ハイブリダィズさせる工程；および

を包含する。

1つの実施態様において、本発明の DN Aマイクロアレイを用いた解析方法は、さらに、

(f) この検出されたシグナルを、補正する工程、

を包含し得る。別の実施態様において、本発明の DN Aマイクロアレイを用いた解析方法は、さらに、

(g) この検出されたシグナルまたは補正されたシグナルを、解析ソフトゥエアを用いて解析する工程、

を包含し得る。

1つの実施態様において、本発明の D N Aマイクロアレイを用いた解析方法においては、経時的な遺伝子発現の変化がモニターされ得る。別の実施態様において、本発明の方法は、異なる刺激を受けたか、または受けていない植物サンプルにおける遺伝子発現の変化が比較され得る。これらの比較により、経時的な遺伝子発現のグローバルな変化がモニタ一され得、またはある刺激による植物の遺伝子発現のパターンから、その植物内部における代謝などを推定することが可能である。図面の簡単な説明

図 1は、イネペルォキシダーゼをその推定アミノ酸配列に基づいてクラスターに分類した系統分析の結果を示す。図 2 Aは、イネペルォキシダーゼの生長段階、部位、および種々の刺激による遺伝子発現の解析を示す電気泳動写真である。本明細書において使用した代表的な 21のペルォキシダーゼのうち p r xRPN、 R2877、 R 1420、 R 0 317、 S I 3316、 R 2151および S 4325についての発現特異性を示す。図 2Bは、イネペルォキシダーゼの生長段階、部位、および種々の刺激による遺伝子発現の解析を示す電気泳動写真である。本明細書において使用した代表的な 21のペルォキシダーゼのうち、 C62847、 R 1617、 R3025、 R 2391、 S 10927、 S 14493および p r x R P Aの発現特異性を示す。図 2Cは、イネペルォキシダーゼの生長段階、部位、および種々の刺激による遺伝子発現の解析を示す電気泳動写真である。本明細書において使用した代表的な 21のペルォキシダ一ゼのうち、 R2576、 R2184、 R2693、 C 5 2903、 R2329、 S 11222および S 14082の発現特異性を示す。図 3は、本明細書で開示した p r x RPNペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 3 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 3 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 4は、本明細書で開示した R 2877ペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 4 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 4 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、.根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 5は、本明細書で開示した R 1420ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 5 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 5 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 6は、本明細書で開示した R0317ペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 6 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 6 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 7は、本明細書で開示した S 13316ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 7 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 7 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 8は、本明細書で開示した R 2151ペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 8 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 8 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 8 (d) のグラフは、 16日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 9は、本明細書で開示した S 4325ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 9 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 9 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根（R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 10は、本明細書で開示した C 62847ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 10 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 10 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 1 1は、本明細書で開示した R 1617ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 1 1 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 1 1

(b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根

(R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 12は、本明細書で開示した R 3025ペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 12 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 1 2 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 12 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 13は、本明細書で開示した R 2391ペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 13 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 1 3

(R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 14は、本明細書で開示した S 10927ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 14 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 14 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 14 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 15は、本明細書で開示した S 14493ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 15 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 15 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 15 (d) のグラフは、 1 6 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 16は、本明細書で開示した p r xRP Aペルォキシダ一ゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 16 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 16 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 16 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 17は、本明細書で開示した R 2576ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 1 7 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相対値で示す。図 1 7 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16.日目のそれぞれについて、根

(R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 17 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 18は、本明細書で開示した R 2184ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。 18 (a) のグラフは、 5日目および 16日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 1 8 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 18 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 19は、本明細書で開示した R 2693ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 19 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 19 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 19 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコン卜ロールと比較して示す。図 20は、本明細書で開示した C 52903ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 20 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRNAの発現量を相値で示す。図 20 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 20 (d) のグラフは、 16 日目における種々のス卜レスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 21は、本明細書で開示した R 2329ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 2 1 (a) のグラフは、 5日目および 16 日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 2 1 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 21 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 22は、本明細書で開示した S 1 1222ペルォキシダーゼについて発現特異性の解析結果をまとめた図である。図 22 (a) のグラフは、 5日目および 1 6日目における根部および地上部での mRN Aの発現量を相対値で示す。図 22 (b) および（c) のグラフは、 5日目および 16日目のそれぞれについて、根 (R) と地上部（A) との発現量の比率を示す。図 22 (d) のグラフは、 16 日目における種々のストレスに対する遺伝子発現の応答レベルをコントロールと比較して示す。図 23は、 DNAマイクロアレイ実験の流れの概略を示す。図 24は、 3種類のイネサンプルを用いて、ィモチ病菌 r a c e (003) 感染刺激による本発明の遺伝子（R2184、 R2576、 R2693、 C 529 03、 R 2329および S 1 1222) の発現パターンの変化を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。 (定義）

本明細書において使用される主要な用語の一部を以下に定義する。本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、ォォムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマィモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリ一、ニンジン、キゥリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。本明細書において、 D NAの「断片」とは、参照 D N Aの全長よりも短く、少なくともプローブまたはプライマ一としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。ある D N Aの断片を、それが由来した元の D N Aに対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイプリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてある D N Aが「特異的にハイブリダィズ」するとは、ペルォキシダーゼ（P O X) について使用される場合、少なくとも 2 1種の本発明の P O X D NAを互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも 1 0ヌクレォチド長であり、好ましくは少なくとも 1 5ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも 2 0ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも 3 0、 4 0または 5 0ヌクレオチド長であり得、 5 0を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いた P C R増幅産物として入手され得る。 1対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーを P C R に使用する場合、選択的プライマ一は、代表的には少なくと 9ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも 10ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも 15ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 30または 50ヌクレオチド長あるいはそれ以上であり得る。本明細書において、各 POXについて断片が特異的であるためには、 POX保存領域を除いた領域から選択される必要がある。本明細書において、「POX保存領域」とは、本発明における POX間で DNA配列またはアミノ酸配列が保存されている領域をいい、「POX非保存領域」とは、それ以外の領域をいう。「保存されている」とは、ある核酸配列領域において、その配列がコードするポリペプチドの機能を保持するに必要とされる程度にその核酸配列が同一または類似であることをいう。 POX保存領域は、代表的には、以下の化 1に示す配列ァラインメントにおいてボックスで示される部分である。これらの部分は、特に、 2つの不変ヒスチジン（hで表される）残基および 8つのシスティン残基（c 1 〜c 8で表される）を含む領域として特徴付けられる。 POX保存領域の不変ヒスチジン残基は、例えば、クローン p r xRPA (配列番号 28) のアミノ酸 6 7位および 193位に、 POX保存領域の不変システィン残基は、例えば、クロ —ン p r xRP A (配列番号 28) のアミノ酸 38位、 71位、 76位、 1 15 位、 121位、 200位、 230位および 322位に、それぞれ該当する。

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25 差替え用紙（規則 26)

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羞替え周紙（規則 26)

25 I 2 差替え用紙（規則 26) 本明細書において、 DNAの「ホモログ」とは、参照 DN Aのヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する DNAをいう。ホモログは、代表的には、参照 DNAと、ストリンジェント条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドをいう。ペルォキシダーゼ（POX) についていう場合、 POX遺伝子の「ホモログ」とは、 POX DNA配列と相同性を有する DNA配列を有する DNAであって、その発現特性（例えば、部位特異性、時期特異性、ストレス応答性など）が同一または類似する DNAをいう。本明細書において、ある POX遺伝子のホモログは、一般的に、参照される P OXポリペプチドの POX非保存領域において相同性を有するが、他の POXポリペプチドの POX非保存領域とは相同性を有さない。遺伝子の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェン卜な条件下でのハイブリダィゼ一シヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で DN A配列が、代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。塩基配列の同一性の比較は、例えば、配列分析用ツールである FASTA (P e a r s onら、文献 17) を用いて算出し得る。

POX遺伝子について、発現特性が「同一または類似」であるとは、発現の部位特異性、時期特異性およびストレス応答性のうち少なくとも 1つの特性、好ましくは任意の 2つの特性の組合せ、より好ましくは全ての特性が同一または類似

26 であることをいう。本明細書において部位特異性について言及する場合、 P O X 遺伝子の根と地上部との発現量の比率を評価して、根部で優勢か、地上部で優勢か、または両部でほぼ均一かの 3つに分類したとき、同じカテゴリ一に属することを「同一または類似」であるという。時期特異性について言及する場合、 P O X遺伝子の 5日目の芽生えと 1 6日目の芽生えとでの発現量の比率を評価して、 5日目（幼若期）に優勢か、 1 6日目（成熟期）に優勢か、または両時期でほぼ均一の 3つに分類したとき、同じカテゴリーに属することを、「同一または類似」であるという。ストレス応答性について言及する場合、植物が、化学物質 (例えば、パラコート、ェテフォン、ジャスモン酸メチル（M e J A) など）および物理的刺激（例えば、紫外線（UV) 、切断、摩擦など）のいずれかによるストレスを受けたときの、 P O X遺伝子の発現量の変化を評価して、特定のストレスへの応答を発現量の増大、発現量の減少、または発現量の無変化の 3つに分類したとき、おなじカテゴリ一に属することを、「同一または類似」であるという。上記の各発現特性に関して、 P OX遺伝子の発現量は、下記の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析によって確認され得る。本明細書において、ハイブリダィゼ一シヨンのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダィズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダィズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、 Aに対する T、 Gに対する C) をいう。ストリンジェン卜な条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダィズする。一般に、ストリンジェン卜な条件は、規定されたイオン強度および Ρ Η での特定の配列についての熱融解温度（T_m) より約 5で低く選択される。 T_m は、規定されたイオン強度、 p H、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌ

27 クレオチドの 50 %が平衡状態で標的配列にハイブリダィズする温度である。「ストリンジェン卜な条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメ一夕一によつて異なる。核酸のハイブリダィゼーシヨンの一般的な指針は、 T i j s s e n (文献 18) に見出される。代表的には、ストリンジェン卜な条件は、塩濃度が約 1. 0M Na⁺未満であり、代表的には、 pH7. 0〜8. 3で約 0. 0 1〜1. 0Mの Na⁺濃度 (または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、 10〜5 0ヌクレオチド）については少なくとも約 30 、そして長いヌクレオチド（例えば、 50ヌクレオチドより長い）については少なくとも約 60でである。ストリンジェン卜な条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、 50%のホルムアミド、 1Mの NaCし 1 %の SDS ( 37 ）の緩衝溶液中でのハイブリダィゼーシヨン、および 0. 1 XSSCで 60 での洗浄が挙げられる。本明細書において、植物におけるペルォキシダーゼ（POX). の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位（例えば、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）における POX遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じた POX遺伝子の発現の特異性をいう。「ストレス応答性」とは、植物に与えられた少なくとも一種のストレスに対して、 POX遺伝子の発現が変化することをいう。ここで、「ストレス」とは、植物に対して、物理的、化学的、生物学的に加えられ得る、植物の正常な生長を妨げる因子のことをいう。ストレスには、例えば、物理的ストレス（光、熱、冷却、凍結、紫外線、 X線、切断、摩擦など）、化学

28 的ストレス（酸素ストレス、化学物質、生理活性物質など）、生物学的なストレス（ウィルス、病原体（例えば、ィモチ病菌）感染など）などが挙げられる。本明細書において使用される場合、「環境ストレス」とは、地球環境の変化に起因する植物に対するストレスをいい、例えば、オゾン層破壊による紫外線量の増加、大気汚染による活性酸素種、化学物質などが、その主な原因として挙げられる。

「酸素ストレス」または「酸化ストレス」とは、酸素および酸素誘導体によつてもたらされるストレスをいい、代表的には、活性酸素種（スーパ一ォキシド、過酸化水素、ハイド口キシルラジカル、一重項酸素など）、オゾン、 S O xおよび N O Xなどの大気汚染物質などによって引き起こされる。酸化ストレスは、過酸化状態、紫外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異^"、ペルォキシゾーム異常増加、高温 ·低温 ·化学物質等の非生物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御機構 (スーパ一オキサイドジスムターゼ（S O D) 、力夕ラーゼ（C A T) 、ペルォキシダーゼ（P O X) 、ビタミン E、 Cおよび A等）」とのバランスが崩れたときに起きる。本明細書において、「根発現型」とは、 P O X遺伝子またはそのプロモー夕一の発現について、植物の根において優先的に発現される性質、および植物の根および地上部において同程度に発現される性質のいずれかをいう。特に言及する場合、植物の根および地上部において同程度の発現を示すことを、「根および地上部発現型」と称する。「地上部発現型」とは、植物体の地上部の少なくとも一部において根におけるよりも優先的に発現される性質をいう。これらの性質は、それぞれの部分から R N Aを抽出してノ一ザンブロッ卜分析で発現量を分析することにより決定することができる。

29 本明細書において、 P O X遺伝子またはそのプロモーターの発現が「構成的」であるとは、植物の組織において、その植物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンプロット分析したとき、 5日目の芽生えおよび 1 6 日目の芽生えの同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的ペルォキシダーゼは、通常の生育環境にある植物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。 P O X 遺伝子またはそのプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも 1つのストレスが植物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、植物の任意の部分から R N Aを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することにより決定することができる。

(種々のィネペルォキシダーゼ）

本発明者らによつて、多数のィネペルォキシダーゼ遺伝子がそれぞれ互いに異なる種々の発現特異性を有することが示された。本明細書において、イネペルォキシダ一ゼは、その発現特異性に応じて、代表的に、 A l、 A 2、 B l、 B 2および Cの少なくとも 5クラスに分類され得る。 Aおよび Bの分類は、刺激に対する応答性（誘導性）に基づく。ストレスに対する誘導性を有さない P O Xをクラス Aに分類し、ストレスに対する誘導性を有する P O Xをクラス Bに分類する。クラス Cには、発現が検出限界以下のものを分類する。 A 1および B 1には、地中部分に優先的に発現されるか地中部分と地上部分とに同程度に発現される「根発現型」または「根および地上部発現型」の P O Xを

30 分類し、他方で、 A 2および B 2には、主に地上部分に発現されるものを分類する。（例えば、図 2 A〜図 2 Cおよび図 3〜図 2 2を参照のこと。分類のまとめを表 1に示す。）本発明者らによる 2 1の P O X遺伝子の発現解析により、 A 1および B 1に属する酵素が 1 6個、 A 2および B 2に属するものが 4個、 Cに属するものが 1個と分類された。本発明の P O X遺伝子は、以下に詳細に説明するように、ストレスに対して種々の異なる独自の応答性を示すこと、および、地上部におけるよりもむしろ根において主に発現されることが明らかになった。これは、従来の予備的な知見（文献 1 1など）からは予測し難かったことである。

31 表 1

a:16曰齢植物の葉身

b:16曰齢植物

c：根≥地上部は、根：地上部比が 4 6を超えるものに対応する

d：分類された POX遺伝子の数

以下に、本発明の範囲内に属する、代表的なイネ POX遺伝子について解説する < p r xRPNは、後述の p r xRPAとともに、本発明者らが以前に単離した POXである（ I t oら（ 1994) 、文献 12) 。これらの配列は、植物ペルォキシダーゼに保存された配列をもとにイネから単離された。 p r xRPN遺伝子は配列番号 1に示される配列を有する。この遺伝子の遺伝子産物は、その発現特異性から、 A 1と分類される。遺伝子産物が根において優先的に発現されていることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与する機能を示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 p r xRPNFP 1および p r xRPNRP 1 (配列番号 58および 59 ) が挙げられる。これらのプライマ一は、目的遺伝子またはそれに類似する遺伝子を取得するために有用である。 p r xRPN遺伝子に由来するプロモーターも p r xRP Nの発現特異性を反映していると考えられる。 p r xRPN遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

32 R 2 8 7 7は、 E S T配列に基づいてイネから得られた新規な P〇Xで、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 3で示される遺伝子配列を有する。 R 2 8 7 7は、根部分で優先的に発現され得る。 R 2 8 7 7はまた、幼若期よりも成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。遺伝子産物が根において優先的に発現されることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与する機能を示唆する。成熟期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の成齊期の代謝に必要なこと、—例えば、植物ホルモンであるィンドール酢酸（I AA) 量の調節などに関与することを示唆する。 R 2 8 7 7遺伝子に由来するプロモーターも R 2 8 7 7の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2 8 7 7遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモー夕一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

R 1 4 2 0もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 5で示される遺伝子配列を有する。 R 1 4 2 0もまた、根部分で優先的に発現され得る R 1 4 2 0はまた、幼若期よりも成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。遺伝子産物が根において優先的に発現されていることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与する機能を示唆する。成熟期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の成,熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I A A量の調節などに閧与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例としては、 R 1 4 2 0 F P 1 (配列番号 4 8 ) が挙げられる。 R 1 4 2 0遺伝子に由来するプロモータ一も R 1 4 2 0の発現特異性を反映していると考えられる。 R 1 4 2 0遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

33 R 0 3 1 7もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 7で示される遺伝子配列を有する。 R 0 3 1 7もまた、根部分で優先的に発現され得る。 R 0 3 1 7はまた、幼若期よりも成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。遺伝子産物が根において優先的に発現されていることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与する機能を示唆する。成熟期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I AA量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するブライマーの例として、 R 0 3 1 7 F 1 (配列番号 4 7 ) が挙げられる。 R 0 3 1 7遺伝子に由来するプロモーターも R 0 3 1 7の発現特異性を反映していると考えられる。 R 0 3 1 7遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

S 1 3 3 1 6もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 9で示される遺伝子配列を有する。 S 1 3 3 1 6もまた、根部分で優先的に発現され得る。 S 1 3 3 1 6はまた、幼若期よりも成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。遺伝子産物が根において優先的に発現されていることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与する機能を示唆する。成熟期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I A A量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 1 3 3 1 6 F P 1 (配列番号 5 4 ) が挙げられる。 S 1 3 3 1 6遺伝子に由来するプロモータ一も S 1 3 3 1 6の発現特異性を反映していると考えられる。 S 1 3 3 1 6遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

34 R 2 1 5 1もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 1 1で示される遺伝子配列を有する。 R 2 1 5 1もまた、根部分で優先的に発現され得る。 R 2 1 5 1はまた、幼若期よりも成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I A A量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は、切断ストレスおよび摩擦ストレス、ならびに傷害情報伝達物質（例えば、 M e J A) 刺激およびエチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激に対して、減少性の応答を示し得る。 R 2 1 5 1遺伝子に由来するプロモーターも S 4 3 2 5 の発現特異性を反映していると考えられる。 S 4 3 2 5遺伝子およびそのホモ口グならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

S 4 3 2 5もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 1 3で示される遺伝子配列を有する。 S 4 3 2 5もまた、根部分で優先的に発現され得る。 S 4 3 2 5はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 4 3 2 5 F 1 (配列番号 5 7 ) が挙げられる。 S 4 3 2 5遺伝子に由来するプロモータ一も S 4 3 2 5の発現特異性を反映していると考えられる。 S 4 3 2 5遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

C 6 2 8 4 7もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細

35 書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 1 5で示される遺伝子配列を有する。 C 6 2 8 4 7は、根部分と地上部分とで同等に発現され得る。 C 6 2 8 4 7はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。遺伝子産物が根部分と地上部分とで同等に発現されることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与するとともに、地上部の生長を促進または維持（例えば、茎の伸長など）に寄与する機能を示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 C 6 2 8 4 7 F P 1 (配列番号 4 4 ) が挙げられる。 C 6 2 8 4 7遺伝子に由来するプロモーターも C 6 2 8 4 7の発現特異性を反映していると考えられる。 C 6 2 8 4 7遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

R 1 6 1 7もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 1 7で示される遺伝子配列を有する。 R 1 6 1 7もまた、根部分と地上部分とで同等に発現され得る。 R 1 6 1 7はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。遺伝子産物が根部分と地上部分とで同等に発現されることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与するとともに、地上部の生長を促進または維持（例えば、茎の伸長など）に寄与する機能を示唆する。 R 1 6 1 7遺伝子に由来するプロモー夕一も R 1 6 1 7の発現特異性を反映していると考えられる。 R 1 6 1 7遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

36 R 3 0 2 5もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 1 9で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。 R 3 0 2 5もまた、根部分と地上部分とで同等に発現され得る。 R 3 0 2 5はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。遺伝子産物が根部分と地上部分とで同等に発現されることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与するとともに、地上部の生長を促進または維持（例えば、茎の伸長など）に寄与する機能を示唆する。 R 3 0 2 5遺伝子に由来するプロモー夕一,も R 3 0 2 5の発現特異性を反映していると考えられる。 R 3 0 2 5遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。 R 2 3 9 1もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 1に属する。この遺伝子は配列番号 2 1で示される遺伝子配列を有する。 R 2 3 9 1もまた、根部分と地上部分とで同等に発現される。遺伝子産物が根部分と地上部分とで同等に発現されることは、水中などの嫌気性条件下での生長能のような植物の特性に寄与するとともに、地上部の生長を促進または維持（例えば、茎の伸長など）に寄与する機能を示唆する。 R 2 3 9 1はまた、幼若期の方が成熟期よりも顕著に発現され得る。幼若期の芽生えにおいて顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマ一の例として、 R 2 3 9 1 F P 2 (配列番号 5 0 ) が挙げられる。 R 2 3 9 1遺伝子に由来するプロモーターも R 2 3 9 1の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2 3 9 1遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモー夕

37 一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

S 1 0 9 2 7もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 2に属する。この遺伝子は配列番号 2 3で示される遺伝子配列を有する。 S 1 0 9 2 7は地上部で優先的に発現される。遺伝子産物が地上部で優先的に発現されることは、地上部の生長の促進または維持（例えば、茎の伸長など）に優先的に寄与する機能を示唆する。 S 1 0 9 2 7はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝に必要なこと、例えば、細胞壁の合成および植物ホルモンである I AA量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 1 0 9 2 7 F P 1 (配列番号 5 2 ) が挙げられる。 S 1 0 9 2 7遺伝子に由来するプロモーターも S 1 0 9 2 7の発現特異性を反映していると考えられる。 S 1 0 9 2 7遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

S 1 4 4 9 3もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 A 2に属する。この遺伝子は配列番号 2 5で示される遺伝子配列を有する。 S 1 4 4 9 3は地上部で優先的に発現される。遺伝子産物が地上部で優先的に発現されることは、地上部の生長の促進または維持（例えば、茎の伸長など）に優先的に寄与する機能を示唆する。 S 1 4 4 9 3はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 1 4 4 9 3 F P 1 (配列番号 5 6 ) が挙げられる。 S 1 4 4 9 3遺伝子に由来するプロモ —ターも S 1 4 4 9 3の発現特異性を反映していると考えられる。 S 1 4 4 9 3

38 遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。 p rxRPAは、上述の p r xPRNとともに、本発明者らが以前に単離した ?0 でぁる（1 1： 0ら、（1994) 文献 12) 。 p r xRPA遺伝子は配列番号 27で示される遺伝子配列を有する。本発明の分類に従えば、 B 1に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 p r xRPAは、ストレスに対する植物の防御機構に M与していることを示唆する。具体的には、 p r xRPAは、酸素ストレス（例えば、 UVおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、 Me JA) 刺激、エチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激、および摩擦ストレスによって誘導され得る（実施例 3〜 5を参照のこと）。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。 p r xRPAはまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I AA量の調節などに関与することを示唆する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマ —の例として、 p r xRPAFP l (配列番号 45 ) および p r x R P AR P 1 (配列番号 46) が挙げられる。 p r xRP A遺伝子に由来するプロモーターも p r xRP Aの発現特異性を反映していると考えられる。 p r xRPA遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

R 2576は、 EST配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 1に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 R 2576は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示

39 唆する。具体的には、 R 2576は、酸素ストレス（例えば、 UVおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、 Me JA) 刺激、エチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激、および摩擦ストレスによって誘導され得る（実施例 3〜 5を参照のこと）。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。 R 2576はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I AA 量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 29で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマ —の例として、 R 2576 F 1 (配列番号 51) が挙げられる。 R 2576遺伝子に由来するプロモーターも R 2576の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2576遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ —を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

R2184もまた、 EST配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 1に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 R2184は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、 R2184は、酸素ストレス（例えば、 UV) および傷害情報伝達物質（例えば、 Me JA) 刺激、エチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激によって誘導され得る（実施例 4および 5を参照のこと）。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る（実施例 3を参照のこと）。従って、この POXは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。 R2184はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現される

40 ことは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 3 1で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は、液胞局在性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 R 2 1 8 4 F P 1 (配列番号 4 9 ) が挙げられる。 R 2 1 8 4遺伝子に由来するプロモ —ターも R 2 1 8 4の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2 1 8 4遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。 R 2 6 9 3もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 1に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 R 2 6 9 3は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、 R 2 6 9 3は、酸素ストレス（例えば、 U V) および傷害情報伝達物質（例えば、 M e J A) 刺激、エチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激によって誘導され得る（実施例 4および 6を参照のこと）。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る（実施例 3を参照のこと）。従って、この P O Xは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。 R 2 6 9 3はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 3 3で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。 R 2 6 9 3遺伝子に由来するプロモーターも R 2 6 9 3の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2 6 9 3遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有

41 用であり得る。

C 52903もまた、 EST配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 1に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 C 52903は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、 C 52903は、酸素ストレス（例えば、 UVおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、 Me JA) 刺激、エチレン放出因子（例えば、ェテフォン）刺激、摩擦ストレス、および切断ストレスによって誘導され得る（実施例 3〜 5を参照のこと）。この POXは、広範なストレスに対して誘導性であることは、種々のストレスに対して防御の役割を果たしていることを示唆する。 C 52903はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I AA量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 35で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は液胞局在性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 C52903FP 1 (配列番号 43) が挙げられる。 C 52903遺伝子に由来するプロモーターも C 529 03の発現特異性を反映していると考えられる。 C 52903遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

R 2329もまた、 EST配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 2に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 R2329は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、 R 2329は、酸素ストレス（例えば、 UVおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、 Me JA) 刺激、エチレン放出因子

42 、 (例えば、ェテフォン）刺激、摩擦ストレス、および切断ストレスによって誘導され得る（実施例 3〜 5を参照のこと）。この P O Xは、広範なストレスに対して誘導性であることは、種々のストレスに対して初期防御の役割を果たしていることを示唆する。 R 2 3 2 9はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンである I A A量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 3 7で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。 R 2 3 2 9遺伝子に由来するプロモーターも R 2 3 2 9の発現特異性を反映していると考えられる。 R 2 3 2 9遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモー夕—を利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

S 1 1 2 2 2もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、 B 2に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、 S 1 1 2 2 2は、ストレスに対する植物の防御機構に関与してることを示唆する。具体的には、 S 1 1 2 2 2は、傷害情報伝達物質（例えば、 M e J A) 刺激およびエチレン放出因子（例えば、ェテフォン）剌激によって誘導され得る（実施例 4を参照のこと）。このことは、この遺伝子は、病原体からの防御について役割を果たしていることを示唆する。 S 1 1 2 2 2はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号 3 9で示される遺伝子配列を有する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 1 1 2 2 2 F P 1 (配列番号 5 3 ) が挙げられる。 S 1 1 2 2 2遺伝子に由来するプロモーターも S 1 1 2 2 2の発現特異性を反映していると考えられる。 S 1 1 2 2 2遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモータ一を利用することは、植物の特

43 性を改変するのに有用であり得る。

S 1 4 0 8 2もまた、 E S T配列に基づいてイネから得られた配列であるが、本明細書における実験ではその発現が検出されず、従って、本明細書の分類に従つて、 Cに属すると分類される。この遺伝子は配列番号 4 1で示される遺伝子配列を有する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、 S 1 4 0 8 2 F P 1 (配列番号 5 5 ) が挙げられる。 S 1 4 0 8 2遺伝子に由来するプ口モーターも S 1 4 0 8 2の発現特異性を反映じていると考えられる。 S 1 4 0 8 2遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。

(各遺伝子およびそのホモ口グの取得方法ならびに発現特異性の確認方法）本発明のペルォキシダーゼ（P O X) 遺伝子およびこれとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする P O X遺伝子のホモ口グは、公知の P O X遺伝子によりコードされるァミノ酸配列の非保存領域に対応する縮重プライマー対を用いて、単離され得る。このプライマ一対を用いて、任意の対象植物の c D N Aまたはゲノム D N Aをテンプレートとして用いて P C Rを行い、その後、得られた増幅 D NA断片をプローブとして用いて、同じ対象植物の c D NAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、陽性クローンを選択し、配列決定を行い本発明の P O X遺伝子またはそのホモログの特徴付けを行い得る。このようにして得られた本発明の P O X遺伝子またはそのホモ口グが所望の発現特異性を有することは、例えば、当該遺伝子またはその断片を選択的プローブとして用いて、元の植物における発現特性を分析することで確認し得る。本明細書に開示の方法に従って当該遺伝子を任意の植物に導入して形質転換植物を作出

44 することで確認してもよい。所望の発現特性に基づいて適切な植物材料から R N Aサンプルを調製し、この R N Aサンプルを用いてノーザンブロット分析を行い、発現量を確認し、比較することができる。 (プロモーターの特定）

上記の各遺伝子のプロモーターは、周知のように、コード領域の上流配列から取得することができる。プロモーターは、代表的には、翻訳開始点の上流約 2 k bの範囲に存在する配列として定義されるが、これに限定されない。プロモーター領域の特定は、当該分野で周知の方法に基づいて実施され得る。簡単に述べると、プロモーター領域の候補配列およびレポーター遺伝子（例えば、 G U S遺伝子）を作動可能に連結した発現カセットを構築する。構築した発現力セットを用いて適切な植物細胞を形質転換し、形質転換細胞を植物に再生する。形質転換植物におけるレポーター遺伝子の発現を、適切な検出系（例えば、色素染色）を利用して検出する。検出結果に基づいて、プロモー夕一領域およびその発現特性を確認し得る。

(発現特異的 P O X遺伝子を利用する植物の改変方法）

上記のように、本発明の P O X遺伝子（構造遺伝子）およびプロモーターは、それぞれ、植物の特性を所望の様式で改変するための材料として有用であり得る。改変すべき特性は、植物のストレスに対する抵抗性、および植物の生育または代謝に関連する特性（例えば、生育の速度または期間）を含むがこれらに限定されない。本発明の P O X遺伝子は、適切なプロモーターに作動可能に連結された発現力セットとして、植物細胞に導入され得る。また、本発明のプロモーターは、当該

45 分野において周知の方法を用いて、適切な異種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。本明細書において、「発現カセット J とは、本発明における P O Xをコードする D NAと、これに作動可能に（すなわち、当該 D N Aの発現を制御し得るように）連結された植物遺伝子プロモー夕一とを含む核酸配列、ならびに、本発明のプロモーターと、これに作動可能に (すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸配列をいう。天然のペルォキシダ一ゼ遺伝子の発現カセット自体を、必要に応じて他の調節ェレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る発現カセッ卜である。本発明のプロモーターに連結され得る「異種遺伝子」とは、そのプロモーターが由来する P O X遺伝子以外の本発明の P O X遺伝子、もしくは P O X遺伝子以外の植物における内因性遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌および真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発現が発現カセッ卜が導入される植物において所望される任意の遺伝子をいう。本発明の P O X遺伝子に連結され得る「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味する。例えば、タバコ P R 1 aプロモーターなどのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモーター、 C a MV 3 5 S プロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター（P n o s ) などが挙げられるがこれらに限定されない。上記の発現カセットは、好ましくは、植物発現ベクターの形態が利用される。「植物発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐

46 性遺伝子および、ェンハンサ一を含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現べクタ一はさらに T— DN A領域を有し得る。 T— DNA領域は、特にァグロパクテリゥムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。

「夕一ミネ一夕一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結ポリ A配列の付加に関与する配列である。夕一ミネ一夕一は、 mRN Aの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。夕一ミネ一夕一としては、 CaMV35 S夕一ミネ一夕一、ノパリン合成酵素遺伝子の夕一ミネ一ター（Tno s) 、タバコ P R 1 a遺伝子のターミネータ一が挙げられるが、これに限定されない。

「薬剤耐性遺伝子」とは、その遺伝子産物が宿主において発現される場合に、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子をいう。薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましく、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラ一ゼ I I (NPT I I) 遺伝子、およびハイ遺伝子などが好適に用いられ得る。

「ェンハンサ一」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。ェンハンサ一としては、 CaMV35 Sプロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領域が好適である。ェンハンサーは複数個用いられ得る。植物発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、 pB I系のベクター、 P

UC系のベクタ一あるいは pTRA系のベクタ一が好適に用いられ得る。 pB I

47 系および pTRA系のベクタ一は、ァグロパクテリゥムを介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。 pB I系のバイナリーベクターまたは中間べクタ一系が好適に用いられ得る。例えば、 pB I 121、 pB I 101、 pB I 101. 2、 p B I 101. 3などが挙げられる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域（T—領域）の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現される NPT 2遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）とを含む。 pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、 pUC 18、 pUC l 9、 pUC 9などが挙げられる。植物発現べクタ一は、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、ァグロパクテリゥムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。ァグロパクテリゥムを介する方法としては、例えば、 Nage 1らの方法（文献 19) が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現べクタ一でエレクトロボレ一シヨンによってァグロパクテリゥムを形質転換し、次いで、形質転換されたァグロパクテリゥムを Ge 1 V i nら（文献 20) に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーシヨン法（Sh imamo t oら、文献 21 ；および R hod e sら、文献 22を参照のこと）、パーティクルガン法（文献 23を参照のこと ) ならびにポリエチレングリコール（PEG) 法（文献 24を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および Zまたは植物体に再生され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導

48 入した遺伝子の発現は、ノーザン法または PC R法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウエスタンプロット法により確認し得る。本発明の POX遺伝子およびプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物の改変にも利用し得る。これは、両植物間でゲノム構造が類似していることにより説明される（Moo r eら、文献 25、および長村ら、文献 26) 。特に好ましい対象植物としては、コムギ、トウモロコシ、イネ、ォォムギ、ソルガム、カンキッ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。 POX遺伝子を植物に導入できることは、シロイヌナズナ（文献 27) 、ャマナラシ（文献 28) 、サツマィモ（文献 29) 、およびイネ（文献 30) などで実証されている。再生した形質転換が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアツセィを行うことにより確認し得る。例えば、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再生した植物体にモデリレ菌、例えばタバコ野火病菌（P s eud omo n a s s y r i ng a e p v. t aba c i) を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。あるいは、形質転換植物のストレス抵抗性は、 UV処理に対する抵抗性、スーパーォキシド発生型除草剤（例えば、パラコート）処理に対する抵抗性、および /または塩ストレスに対する抵抗性などとして評価され得る。 (遺伝子発現アツセィ）

本発明はまた、本発明のペルォキシダーゼ遺伝子またはそのセット、あるいは

49 プロモーター由来の配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、植物の特性を解析するための方法を提供する。このような方法としては、ノーザンプロット分析などが挙げられる。そのような方法の概説としては、例えば、 S amb r ook J. ら（文献 60) 、文献 36などが挙げられる。

(DNAアレイ）

本発明のヌクレオチドは、 DN Aアレイを用いた遺伝子解析方法において使用され得る。 DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説されている。また、 DNAアレイを用いた植物の解析についても最近行われるようになつている（文献 58) 。以下、 D N Aアレイおよびそれを使用する遺伝子分析方法を簡単に説明する。

「DNAアレイ」とは、 DNAを基板上に整列（a r r ay) させて、固定させたデバイスをいう。 DNAアレイは、基盤の大きさまたは載せる DN Aの密度によって、 DNAマクロアレイおよび DNAマイクロアレイなどに分けられる。マクロとマイク口との境界は厳密に決まっているわけではないが、一般に、「DNAマクロアレイ」とは、メンブレン上に DNAをスポットした高密度フィルター（h i gh d e n s i t y f i l t e r) をいい、「DNAマイクロアレイ」とは、ガラス、シリコンなどの基板表面に DNAを載せたものをいう。載せる種類によって、 cDNAアレイ、オリゴ DNAアレイなどがある。高密度ォリゴ D N Aアレイのうち、半導体集積回路製造のための光リソグラフィ一（pho t o l i t hog r a phy) 技術を応用し、基板上で一度に複数種のオリゴ DN Aを合成することで作製されたものを、半導体チップになぞらえて、特に「DNAチップ（c h i p) 」という。この方法を用いて作製されたものとしては、 Ge neCh i p (登録商標）（A f f i me t r i x、 C A) な

50 どが挙げられる（文献 50〜51) 。好ましくは、本発明におけるマイクロアレィを用いた遺伝子解析においては、この Ge n eCh i p (登録商標）が用いられ得る。 DNAチップは、狭義には上記のように定義されるが、 DNAアレイまたは DN Aマイクロアレイ全体をいうこともある。

DNAマイクロアレイは、このように、ガラス基板上に数千〜数万またはそれを超える遺伝子 DN Aを高密度に配列したデバイスであることから、 c DNA、 c RN Aまたはゲノム DNAとのハイブリダィゼーシヨンによって、遺伝子発現のプロフアイルまたは遺伝子多型をゲノムスケールで解析することが可能となつている。この手法により、シグナル伝達系およびまたは転写制御経路の解析 (文献 45) 、組織修復の機構の解析（文献 46) 、医薬品の作用機構（文献 4 7) 、発生 ·分化の過程における遺伝子発現変動の広汎な解析、病態に伴って発現変動する遺伝子群の同定、またはシグナル伝達系もしくは転写制御に関与する新たな遺伝子の発見などが可能となってきた。また、遺伝子多型についても、多数の SNPを 1つの DNAマイクロアレイで解析することが可能となっている (文献 48) 。

(DN Aマイクロアレイのアツセィ原理）

DN Aマイクロアレイを用いたアツセィの原理を説明する。 DN Aマイクロアレイは、表面を適切に加工したスライドガラスのような固相基板上に多数の異なる DNAプローブを高密度に固定して作製する。その後、標識した核酸（標的）を、適切なハイブリダィゼーシヨン条件下で、ハイブリダィズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出する。このデータをコンピュータで大量解析する。例えば、遺伝子モニタリングにおいては、オリゴ DNAまたは cDN Aをプローブとしたマイクロアレイに、 mRN Aから逆転写反応により蛍光標識を取り込ませた標的 c DNAをハイブリダィズさせて、蛍光イメージアナライザ

51 で検出する。この際、 T7ポリメラーゼを用いて c RNA合成反応を行ったり、酵素反応を介させたりと、他の種々のシグナル増幅反応も行い得る。 DNAマイクロアレイ実験の流れを図 23に示す。 (合成型 DNAチップ）

Fo r 0 rらは、コンビナトリアルケミストリと半導体製造用光リソグラフィ技術とを合わせて、基板上にポリマーを合成する技術を開発した（文献 53) 。これを、合成型 DNAチップという。光リソグラフィでは、極めて微細な表面加ェが可能なので、 10 m²ZDNAサンプルといった集積度の高い DNAマイクロアレイを作製し得る。この方法では、一般に、ガラス基板上に 25〜30程度の DN Aが合成され得る。合成型 DN Aチップを用いた遺伝子発現は、 Lo c k a r tらが報告している (文献 54) 。この方法では、合成され得る長さが短いため特異性が低いという本タイプのチップの欠点が解消された。ここでは、 1つの遺伝子発現をみるために、十数か所に対応するパ一フエクトマツチ（p e r f e c t ma t c h ； P M) オリゴヌクレオチドプローブと、 PMプローブの中央の 1塩基に変異を入れたミスマッチ（mi sma t c h ; MM) オリゴヌクレオチドプローブとを調製することで、この問題が解決された。 MMプローブは、ここでは、ハイブリダィゼーシヨンの特異性の指標として用いられ、そして PMプローブと MMプローブとのシグナル比から、遺伝子発現レベルが決定され得る。 PMプローブと MMプローブとのシグナル比が同等な場合は、クロスハイブリダィゼーシヨンと呼び、有意なシグナルとは解釈されない。 (貼り付け型 DNAマイクロアレイ）

いわゆる貼り付け型 DNAマイクロアレイにおいては、スライドグラスに DN

52 Aを貼り付けていくタイプの DNAマイクロアレイを作製し、蛍光検出する（5 4) (h t tp ://cmgm. s t an ford, edu/pbrown もまた参照のこと）。この方法では、大掛かりな半導体製造機は必要ではなく、 D N Aアレイ機および検出器があれば、研究室内でアツセィすることが可能である。この方法は、貼り付ける DNAを選択することが可能であるという利点を有する。高密度化についても、例えば、直径 100 mのスポットを 100 zm間隔でスポッ卜すれば、計算上 1 cm²に 2500の DNAをスポッ卜することが可能である。したがって、通常スライドグラス（有効面積は、およそ 4 cm²) におよそ— 1万個の DNAを載せ得る。合成型 DNAアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が挙げられる。この方法では、 2つの異なる mRN Aサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダィゼーシヨンを行って、療法の蛍光を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、例えば、 Cy 5および Cy 3などが最も用いられているが、それらに限定されない。 Cy 3および Cy 5の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され得る。

DNAアレイを用いるアツセィにおいては、アレイ機が使用され得る。アレイ機は、基本的に、高性能サーポモーターと組み合わせて、コンピュータの制御下でピン先またはスライドホルダを XYZ軸方向に作動し、マイクロタイ夕一プレ —卜からスライドグラス表面上に DNAサンプルを運ぶ装置である。ピン先の形状には、種々の加工がなされている。例えば、烏口のように割れたペン先に DN A溶液を溜めて、複数のスライドガラスにスポッ卜する方式である。洗浄 ·乾燥のサイクルを挟んで、次に DNAサンプルを載せるという工程を繰り返す。ここで、サンプル同士の混入を防ぐためにも、ピン先の洗浄 ·乾燥を完全に行うこと

53 に注意する。このようなアレイ機としては、 SPB I O2000 (日立ソフトゥエアエンジニアリング； 1回打ち型）、 GMS417Ar r aye r (宝酒造；ピンリング型）、 Ge n e T i p S t amp i n g (日本レーザ電子；万年筆型）などが挙げられる。

D N Aアレイを用いたアツセィに使用される D N A固定法には種々の方法が存在する。基板の材質として、ガラスは、メンブレンと比較して有効固定面積が小さく、荷電量も少ないことから、種々のコーテングがなされている。実用的には、ポリ L—リシンコート（文献 55) またはシラン化（文献 56) などが行われている。また、市販の DNAマイクロアレイ専用コーティング済スライドガラス（例えば、ポリカルポジイミドガラス（日清紡）など）も使用され得る。オリゴ DNAの場合は、 DNA末端をァミノ化してシラン化ガラスに架橋する方法も利用可能である。 (cDNAコレクションの調製法）

DNAマイクロアレイには、主に、 PCRで増幅された cDNA断片が載せられ得る。 cDNAの濃度が充分ではない場合、シグナルを充分に検出し得ない場合が存在する。このように、一度の PC Rにおいて充分量の ό DN A断片が得られなかった場合には、 PCRを何度か繰り返し、得られた PC R産物をまとめて精製，濃縮し得る。プローブ cDNAは、一般的には、 cDNAをランダムに数多く載せるが、実験の目的によっては、選択された一群の遺伝子（例えば、本発明の遺伝子群またはプロモータ一群）または RDA (r e p r e s e n t a t i o n a 1 d i f f e r e n t i a l an a l y s i s) で得られた発現変化候補遺伝子を載せ得る。クローンの重複は避けることが好ましい。クローンは、手持ちの c DNAライブラリーから調製してもよく、 cDNAクローンをまとめて入手してもよい。

54 DN Aアレイを用いたアツセィにおいては、 DN Aマイクロアレイ上でハイブリダィズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在までに種々の検出器が利用可能である。例えば、スタンフォード大学のグループは、オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを組み合わせたものである（http：〃 cmgm.stanford.edu/pbrownを参照のこと）。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザである FMB I〇（日立ソフトウェアエンジニアリング）、 S t o rm (Mo l e c u l a r Dy n am i c s) などでも、スポットがそれほど高密度でなければ、 DNAマイクロアレィの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器としては、 S c anAr r ay 4000、同 5000 (Ge n e r a l S c a n n i ng ;スキャン型 (共焦点型）；）、 GMS418 Ar r ay S c anne r (宝酒造；スキヤン型（共焦点型））、 Gene T i p S c a nn e r (日本レーザ電子；スキャン型（非共焦点型））、 Gen e Ta c 2000 (Ge nomi c S o 1 u t i o n s ; CCDカメラ型））などが挙げられる。

(データ解析ソフトウェア）

DN Aマイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのソフトウエアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（57) 。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、 A f f yme t r i xが提唱している GAT C (ge ne t i c an a l y s i s t e c hno l ogy c on s o r t i um) と呼ばれる形式が挙げられる。

(ディファレンシャルディスプレイ技術）

55 本発明はまた、ディファレンシャルディスプレイ（d i f f e r e n t i a l d i s p l ay) 技術を用いた遺伝子解析に用いられ得る。

ディファレンシャルディスプレイ技術とは、発現変動する遺伝子を検出または同定するための方法である。この方法では、 2つ以上のサンプルから cDN Aをそれぞれ作製し、任意のプライマ一セットを用いて PCRにより増幅し、その後、生成された複数の PC R産物をゲル電気泳動により分離し、パターン化した後、各パンドの相対的なシグナル強度変化をもとに、発現変動遺伝子がクローニングされる。以上、本発明の遺伝子、遺伝子群、それらの利用方法、 DNAアレイを用いた分析方法について、詳説してきた。以下に、本発明の例示である、実施例を記載する。実施例

以下に記載する実施例は、本発明の例示であり、いかなる様式においても本発明を限定するものではない。従って、当業者は、実施例に記載された事項に基づき、特許請求の範囲内において、本発明に任意の改変を施し得る。なお、以下の実施例において使用した試薬類は、特記した場合を除いて、和光純薬から入手した。

(実施例 1) POX遺伝子の選択、配列決定および系統分析

以下の表 2に示される各々の材料から、常法に従って mRNAを抽出し、逆転写酵素によって c DNAを合成した。この c DNAを一定方向でプラスミドべク夕一 p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) (S t r a g t a g e n e ) に挿入した。このプラスミドベクタ一で、宿主大腸菌株 NM 522を形質転換し、得られ

56 た形質転換クローンをランダムにピックアップした後、 _80°Cに保存した。得られた c DN Aクローンの遺伝子産物を推定するために、各クローンの 5，側から部分塩基配列を AB I 373 A DNA配列決定機（PE B i o s y s t ems) を用いて決定した。決定した配列は平均約 300 bpであった。得られた配列の 3種類の読み枠で推定したァミノ酸配列を F A S T Aアルゴリズムを用いて、 NBRF— P I Rデ一夕ベースに対して類似性検索を行った。検索の結果、類似性が一番高いとされた、ペルォキシダーゼタンパク質との類似性スコアが 2 00以上の場合、そのクローンがイネにおいてペルォキシダーゼと有意な相同性を有するアミノ酸配列を有するとみなした。

57 表 2

ここでペルォキシダーゼと相同性を有する遺伝子の配列の一部は、 E S T配列として公のデ一夕バンク（DDB J (DNA Da t a Bank o f J a an) から入手可能である。 URLは h t t p ： //www. d d b j . n i g. a c. j p である。）に登録されている。以下の実施例では、ジベレリン（GA₃) 、熱ショックカルス、根、緑色シュ —ト、および黄化シュート由来の cDNAライブラリーから単離されたものを使用した。本発明のクローンは、それぞれ、頭文字に Rが付されているものがライブラリー R (根）に由来し、 Sに続いて 4桁の数字がつくものはライブラリー S (鞘葉： e t i o l a t ed s hoo t) に由来し、 S 1に続いて 4桁の数字がっくものはライブラリー S 1 (緑幼苗）に由来し、 C 5に続いて 4桁の数字がつくものはライブラリ一（GA₃処理カルス）、そして C 6に続いて 4桁の数字がっくものはライブラリー（熱ショック処理カルス）に由来する。 - このようにして得られた、ペルォキシダ一ゼの推定オープンリーディングフレームを網羅する c D N Aを 34個選択し、両側から配列決定した。配列決定した cDNAから 31個を選択し、さらに I t oら（1994) (文献 12) および Ch i t t oo rら（1997) (文献 10) において単離された 5個の cDNAを選択した。これら合計 36個の c DNAの推定アミノ酸配列について、 K imu r aによるタンパク質距離予測法（p r o t e i n d i s t a n c e p r e d i c t i on) (K i mu r aら、文献 31 ) および近隣連結法 (ne i gh bo r j o i n i ng me t hod) (S a i t ouら、文献 32、および S t u d i e rら、文献 33) を用いて、系統樹の構築を行つた。アミノ酸配列の分析は、近位ヘム結合ドメインの上流と 5番目のシスティン不変残基の近傍との間の領域に限定して行った（この部分は、西洋ヮサビ POX

59 Cアイソザィムの 168グリシン〜 210プロリン（We i i nd e rら、文献 34) の領域に対応する）。なぜなら、この領域は、各 POXに特異的な生理的機能を規定する触媒活性に重要であることが提唱されているからである（Ch i t t o rら（1997) 、文献 10) 。 POXの特徴である 2番目のヒスチジンおよび 8番目のシスティン残基を欠く ESTクローン（34個のうち残りの 3 偭）は、系統分析から排除した。以上のようにして、 36個のイネ POXのアミノ酸配列の系統分析を行った。結果を図 1に示す。. 上記 36個のイネ POXは、複数のクラス夕一に分類された。 7つの POX (P I R3、 R 2576、 R 2577、 R 3025、 POX8. 1、 POX 5. 1および S I 4493) が同じクラスターに属し、これらは、複数の植物種において見い出されている多くの病原体誘導性 POX (Ch i t t o r (1999) 、文献 6) と高い相同性を示した。実際、 POX22. 3 (P I R3と同一）および POX8. 1は、 Xan t homon a s o r y z a e p v. o r y z a eに感染した後のイネ葉において誘導されたことが観察されている（Ch i t t o o rら（1997) 、文献 10) 。同様に、図 1に示した他のクラスタ一における POX遺伝子もまた、系統樹上の近縁さに応じて共通または関連した役割を有し得ると考えられる。これらのクラスターの中から、代表的な P〇X遺伝子を均一に選択し、以下の実施例に使用した。図 1中、選択された遺伝子名をボックスで示す。

(実施例 2 ) 生長段階および植物の各部分における各ィネペルォキシダーゼの発現の変化

(イネの生育）

60 イネ（Or yz a s a t ί v a c v. N i pon b a r e) の植物を温室（20で〜 32で）において栽培した。 5日目の若い芽生えから根および地上部を得、そして 16日目のより成熟した芽生えから根、葉鞘、および葉身を得、以下の実験に使用した。 ·

(遺伝子発現分析）

遺伝子の発現分析は、 ATA法（Na gyら、文献 35) を用いて単離した総 RNAを用いて、 RNAゲルブロット分析（Au s u b e 1 ら、文献 36) により行った。図 1においてブロックで示した 21のイネ POX遺伝子の 3' 非翻訳領域を力バーする c DNAフラグメントを、 PCR法により増幅し、この増幅フラグメン卜を各 POX遺伝子に特異的なプローブとして、 RNAゲルブロット分析に使用した。各クローンに特異的なプローブを作製する際に使用した主な配列（配列番号 43~59) を表 3に示す。

61 表 3

各 POXに特異的な PCRプロ一:

上記 RNAを電気泳動後、転写したメンブレン（HyBond N、アマシャム）に、特異的プローブをハイブリダィズさせた後、 0. 1%SDSを含有する 2XSSCを用いて、 5分間（1回）および 10分間（2回）、室温で洗浄し、その後、 0. 1 %SDSを含有する 1 X S S Cを用いて、 65でで 15分間で 3 回洗浄した。次いで、オートラジオグラフィ一用フィルム（XA OMT、コダック）を用いて、 _ 80°Cでォ一トラジオグラフィーに一晩以上かけた。取り出したフィルムを、 BAS 2000 B i o i ma g i n g分析機（富士写真フィルム）または P h o s p h o r I ma g e r S I (モリキユラ一ダイナミク

62 ス）を、製造業者の指示に従つて用いて分析した。ロードした RNA量の確認は、メチレンブルー染色したリボソーム RNA (r RNA) のレベルをモニターすることによって行った。各 POXの発現量を、この r RNAのレベルを標準として用いて比較した。

(生長段階および植物の部位に応じた発現量の変化）

5日目および 16日目のイネ植物の芽生えを上記のように作出し、各サンプルからの全 RN Aを上記のように分析して、異なる生長段階における根部分ならびに地上部分での各 P O Xの発現量を比較した。比較した結果を図 2 A〜図 2 Cに示し、そして各 POX遺伝子について発現パターンをまとめたものを図 3〜図 2 2に示す。図から明らかなように、分析した 21の POX遺伝子は、生長段階および植物の部位に応じて種々の発現を示した。 S 14802以外の分析したすべての POX遺伝子が、 5日目および 16日目の両方の芽生えの根部分において m RNAを発現していた。地上部分（葉鞘および葉身を含む）においては、 17の POX遺伝子の転写物が検出された。

16日目に発現している POXの種類は 5日目の芽生えに比べて減少していた。これは、生長段階で特に必要である POXは幼若期のみで発現し、生長後は使用されなくなるためであると考えられる。この実施例の結果から、分析した 21種の POX遺伝子を A 1、 A 2、 B l、 B 2および Cの 5つのクラスに分類した。これらの分類を図 1においてボックスに隣接して記載する。部位特異性については、根 Z地上部の発現の比が約 4 Z 6 以上のものを、「根≥地上部」として、それ未満のものを「根 <地上部」として分類した。

63 R2151および R 3025以外の A 1群に属する 9種の P O X遺伝子は、 1 6日目の植物の葉身において検出されなかった。 R2151および R3025は、 16日目の植物の葉身において、顕著なレベルの転写物が検出された。これらのことは、 A1群の POX遺伝子は、植物生長（例えば、細胞壁タンパク質とフエルラ酸化ポリサッカリドとの架橋、木化、コルク化、およびオーキシン分解）のような基礎代謝に関与することを示唆する。 R2151、 S4325、 R287 7、 R 1420, p r xPRN、 S 13316および R 3017は、根で優先的に発現した。他方、 R 1617、 R 2391, R 3025および C 62847は、根および地上部において同程度に発現した。従って、これらの遺伝子は A 1群に分類された。これらの部位特異性は、各 POX遺伝子の発現された部分での役割を示唆する。 S 10927および S 14493は、根よりも地上部においてより高い発現レベルを示した。従って、これらの遺伝子は A 2群に分類された。これらの POX遺伝子は、地上部において基礎的な役割を果たしていることが示唆される。また、以下の実施例によって示されるように、 A 1群および A 2群に属する POX遺伝子がストレス刺激に応答しないことは、環境ストレスによって阻害されない基礎的な役割を果たしていることを示唆する。

R2693、 p r xPRA、 R2576、 R2184、および C 52903遺伝子は、根において優先的に発現した。従って、これらの遺伝子は、 B 1群に分類された。他方、 R 2329および S 1 1222は、地上部において優先的に発現された。従って、これらの遺伝子は、 B 2群に分類された。これらの B群遺伝子は、以下の実施例に示されるように、ストレス応答性であった。

(実施例 3) 物理的ストレス刺激に対する各イネペルォキシダーゼの誘導性実施例 2に記載した条件を用いて、 16日目の芽生えを作出した。これを用いて、物理的ストレスとしての、切断ストレスおよび摩擦ストレス対するイネペル

64 ォキシダーゼの誘導性について分析した。切断ストレスを、市販の剪定鋏で葉身の尖端を切断することによって与えた。摩擦ストレスを、葉身全体をカボランダム（c a b o r u n d u m) # 6 0 0 (半井化学）を用いて手で摩擦することによって与えた。剌激後のイネ植物の葉身から、実施例 2に記載のように、 R NAを抽出し、各 P O Xについて発現特異性を分析した。コントロールとして、ストレスを与えていない葉身を使用した。分析結果を図 2 A〜図 2 Cに示し、これらを各遺伝子についてまとめたものを図 3〜2 2に示す。処理した植物または葉身切片は、サンプリングまで、連続的な照射（2 0 0 z E Zm²Z s ) の下、 2 5 °Cで 4 8時間インキュベートした。

B 1に属する C 5 2 9 0 3および B 2に属する R 2 3 2 9の遺伝子発現は、切断ストレスおよび摩擦ストレスの両方に応答した。他方、 B 1に属する p r X R P Aおよび R 2 5 7 6遺伝子は、摩擦ストレスによってのみ発現が誘導された。 B 1に属する R 2 6 9 3および R 2 1 8 4は、葉身を小片に刻む処理をした場合には発現が誘導されたが（データ示さず）、本実施例で行った切断ストレスでも摩擦ストレスでも発現は誘導されなかった。このことは、同じ切断ストレスでも、その処理様式によって発現誘導特異性が異なることを示唆する。切断ストレスおよび摩擦ストレスはともに、傷害ストレスを引き起こし、この傷害ストレスは、植物の正常な生育および再生を阻害し、そして病原体が植物組織へ容易に侵入することを可能にすることが知られている。従って、植物による傷害ストレスからの回復の過程において、コルク化、木質化、および細胞壁タンパク質架橋などの種々の段階で、特異的なペルォキシダーゼ遺伝子の発現制御が行われていることが示唆される。

65 ある種の傷害ストレス誘導性 POX遺伝子はまた、病原体によっても誘導され得る（C h i t t o 0 r ( 1 997) 文献 1 0、および Mo h a nら、文献 3 7) 。従って、本実施例において示された傷害ストレス誘導性の POXは、このような病原体の感染に対する防御系にも関与していることが示唆される。

(実施例 4) ェテフォンおよび Me J Aに対する各イネペルォキシダ一ゼの誘導性

実施例 2に記載した条件を用いて、 1 6日目の芽生えを作出した。これを用いて、エチレン放出因子であるェテフォンおよび傷害情報伝達物質である Me J A に対するイネペルォキシダーゼの誘導性について分析した。ェテフォン刺激については、 0. 05 %エタノールを含有する ImMェテフォン溶液を使用した。 M e J A刺激については、 0. 125%T r i t on X— 100を含有する 25 ixM Me J A溶液を使用した。これらの溶液を植物全体に噴霧した後、 48時間保持した。刺激後のイネ植物の葉身から、実施例 2に記載のように RNAを抽出し、各 P OXについて発現特異性を分析した。コントロールとして、トレスを与えていない葉身を使用した。分析結果を図 2 A〜図 2 Cに示し、結果を各遺伝子についてまとめたものを図 3〜 22に示す。ェテフォンはエチレン放出因子として知られる。 Me J Aは、傷害情報伝達物質などの働きがあることが知られている。これらの因子は、 R 2693、 R23 29、 S 1 1 222, p r xRPA、 R 2576、 R 2 184および C 5290 3の POX遺伝子の発現を誘導した。これらの遺伝子はまた、実施例 3、および実施例 5のような傷害ストレス、薬剤ストレスおよび UVストレスと同様に、誘導された。従って、ジャスモン酸（J A) およびエチレンは、イネ POX遺伝子

66 のストレス誘導性発現についてのシグナル化合物であることが示唆される。実際、

J Aは、傷害を受けたイネ植物体において局所的にも全体的にも蓄積することが示されている（S c hwe i z e rら、文献 38、 S c hwe i z e rら、文献 39) 。従って、これら 7つの Me J A誘導性の POX遺伝子は、病原体誘導性であることが示唆される。

(実施例 5) 酸化ストレスに対する各イネペルォキシダーゼの誘導性実施例 2に記載した条件を用いて、 16日目の芽生えを作出した。このサンプルを用いて、酸化ストレスとしての紫外線刺激およびパラコートに対するイネペルォキシダ一ゼの誘導性について分析した。パラコートは、 1 Mのパラコー卜溶液を使用した。パラコート刺激については、葉身片を 1 M溶液中に 48時間浮遊させることによって実施した。紫外線刺激は、滅菌水中に浮遊させた葉身片に対して紫外光を 1 Ί 5 WZcm²で 7分間照射することによって行った。紫外光源は滅菌ランプ（GL— 1 5、 NEC) を使用した。刺激後のイネ植物の葉身から、実施例 2に記載のように、 RNAを抽出し、各 P〇Xについて発現特異性を分析した。コントロールとして、ストレスを与えていないものを使用した。分析結果を図 2 A〜図 2 Cに示し、結果を各伝子についてまとめたものを図 3〜22に示す。図 2 A〜図 2 Cからも明らかなように、 R2329、 p r xRPA、 R 257 6および C 52903がパラコートにより発現誘導を受けた。また、 R 2693、 R2329、 p r xRPA、 R2576、 R 2184および C 52903が紫外線照射により発現誘導を受けた。これらは、傷害ストレスによる発現誘導と同じ群のペルォキシダーゼであり、また、パラコート処理の発現誘導と類似するパ夕ーンであった。

67 パラコートは、非選択的な接触性の除草剤である。これは、チラコイド膜を介してプロトン転移を阻害し、活性酸素種の生成およびエネルギー涸渴をもたらす

(B a b b sら、文献 40) 。紫外線は、 H₂0₂の蓄積が起こることが報告されている（Mu r phyら、文献 41) 。種々のペルォキシダ一ゼのうち、これまでは、ァスコルビン酸ペルォキシダ一ゼのみが、植物における H₂0₂除去酵素であると考えられてきた（As ad a、文献 42) 。近年の生化学的研究の伸展により、本発明のペルォキシダーゼを含むクラス I I Iペルォキシダ一ゼもまた、 H₂0₂除去に関与していることが示唆されている（Me h 1 h o r nら、文献 43, および Kv a r a t s k h e 1 i aら、文献 44) 。本実施例でパラコートによって誘導を受けることが示されたペルォキシダーゼは、活性酸素種によって生成した H₂0₂などの毒性除去に関与していることが示唆される。

(実施例 6) ィモチ病菌（Ma g n a p o r t h e g r i s e a) 接種後の植物についての RN A発現パターンの解析およびマーカー遺伝子としての P〇 X遺伝子

次に、本発明の POX遺伝子群と、ィモチ病との関係について調べた。実験系統として、ィモチ病感受性のイネ（O r y z a s a t i v a c v. N i p o n b a r e) (本実施例において以下、親和性（c omp a t i b 1 e) または一 P i— iと称する）、ィモチ病抵抗性のイネ（Or y z a s a t i v a c v. N i pponb a r e) (本実施例において、非親和性（ i n c o m p a t i 1 e) または +P i - iと称する。（国立農業研究センター（Na t. Ag r. Re s. Ce n t, o f J a p an) より入手可能；文献 61を参照のこと）、および親和性のイネにィモチ病予防農薬であるプロべナゾール（明治製菓からォリゼメート粒剤として入手可能）（10 Omg/m l ) で、 8葉期 (6週齢、背丈はほぼ 40 cm) のものを処理したものの 3種類を使用した。各

68 植物を、温室（20で〜 32 ）において栽培した。各系統のイネ植物に、ィモチ病菌（M. g r i s e a r a c e (003) ) (1 10⁵胞子 1111 ) で処理した。処理した時点を 0日目とした（プロべナゾール処理群については、処理後 2日後にィモチ病菌処理をした）。処理する直前、ならびに処理後 2、 3、 4および 5日目の全 RN Aを、上記のように調製し、本発明の POX遺伝子を用いて、上記のようにノーザン分析を行った。この実験においては、 R2 184, R2576、 R 2693および C 52903 (B 1 群）、 R 2329および S 1 1222 (B 2群）、 R 3025 (A 1群）、ならびに p r xRPA (B 1群）を用いた。結果を図 24に示す。次いで、ィモチ病菌による病斑形成について観察した。親和性のものについては、病斑は 4日目および 5日目に見出され、その後ィモチ病菌の胞子の形成が確認された。他方、非親和性のものは、 2日目から 3日目にかけて、病斑の形成が見られたが、この病斑はィモチ病菌を封じ込める際に特有の形状であり、その後にィモチ病菌の胞子の形成は見られなかった。プロべナゾール処理のものも非和性のものと同様に、 2日目から 3日目にかけて、病斑の形成が見られ、これは親和性のものに類似する病斑であった。 R3025および p r xRPAでは、有意なシグナルは見出されなかった（デ

—夕は示さず）。また、図 24から明らかなように、 E2184、 R 2576, R 2693および R 2329をプローブとした発現パターンをみると、親和性のものと、プロべナゾ一ル処理のもので、病斑形成の推移と類似する遺伝子発現のパターンが顕著に見出された。このパターンは、別の病斑形成のマ一力一遺伝子を用いたパターンの推移とも一致した（データ示さず）。

69 従って、本発明の POX遺伝子またはその遺伝子群は、ストレス応答の例としてィモチ病菌などの病原菌に対する応答のマーカーとして利用可能であることが実証された。 (実施例 7) DNAマイクロアレイでの遺伝子発現解析

次に、 DNAマイクロアレイでの遺伝子発現解析において、 POX遺伝子群をマーカ一として用いた分析を行う。実験系統としては、実施例 6に用いた 3系統を用いる。これら 3系統から、実施例 6と同様の時点でのサンプルを調製する。

DNAマイクロアレイには、 3つ以上の本発明の POX遺伝子群（例えば、 R

2184, R2576、 R2693など）を、コントロール遺伝子（例えば、従来型の POX遺伝子）、他のマーカー遺伝子などとともに DNAマイクロアレイに結合させ、固定させる。 DNAの固定は、 http：〃 cmgm, Stanford, edu/pbrown に記載される方法などに準じて行う。次に、上記で調製した全 RNAから、 mRNAを単離し（Q i a g e n M i d i K i t, Ch a t swo r t h, CA) により単離し、そして Su p e r s c r i p t I I逆転写酵素（L i f e Te c hno l og i e s、 Gr a nd I s 1 and, NY) およびオリゴ（dT) を用いて製造業者が推奨する方法に従って逆転写する。得られた c DNAを、 1ユニットの RNa s e Hで

30分、 37°C処理し、 Ce n t r i c on— 30スピン濾過カラム（Am i c on, Beve r l y, MA) を用いて精製し、 20 1未満に濃縮する。この 10分の 1の量を Cy— 3標識 dUTPまたは Cy— 5標識 dUTP (それぞれ、 Ame r s h amから入手可能）について用いて、ランダムプライムポリマー化

70 反応によって、標識する。ランダムプライムポリマー化は、手短には、 cDNA を、 20 Z 1の標識反応物（2 lの l O XK l e n o w緩衝液（Un i t e d S t a t e s B i o c h emi c a l) ) 、 0. 5 μ. 1の蛍光 dUTP (2 5 nmo 1 ) 、 3 μ, 1のランダムプライマ一（L i f e Te c hno l o g i e s) 、各々 2 z lの 250 / Mの dATP、 dCTP, d GTPおよび 90 n 1の dTTP、ならびに 1ュニッ卜の K 1 e n ow酵素（Un i t e d S t a t e s B i o c h em i c a l) を含む）に加える。 37 °Cで 3時間インキュペート後、 2つの（すなわち、 Cy— 3および Cy— 5) 反応物を併せ、 Ce n t r i c 0 n- 30スピン濾過カラムで濃縮し、精製する。次いで、このサンプルを高潔乾燥し、そして 14/ 1のハイブリダィゼーシヨン緩衝液（上記）に溶解し、 99でで熱変性させて、 DNAマイクロアレイに適用する。

POX遺伝子群などが固定された DN Aマイクロアレイに上記で調製した蛍光ハイブリダィゼ一シヨンプローブを加え、 22 X 22mm²の Hy b r i s 1 i p (Re s e a r c h P r odu c t s I n t e r n a t i on a l) で覆う。次いで、このスライドを、耐水性のハイブリダィゼーシヨンチャンバに入れ、ハイブリダイゼーシヨンを 65での水浴において 12〜 16時間行う。ハイブリダイゼーシヨン後、そのスライドを、 0. 03%を含む 1 XSSCで洗浄し、次いで 0. 2 33(3ぉょび0. 05 XS SCで洗浄する。これを、 S c anA r r ay 3000 (GS I Lumon i c s, Oxn a r d, CA) を用いてスキャンする。スキャンは、ハイブリダィゼ一シヨンの前のものについても行う。次いで、得られた蛍光についての生データについて補正処理を行う。経時変化のような発現量に差があまりない場合は、全遺伝子発現量は変化しないと考え、各スポッ卜から得られる蛍光シグナル総計または（me d i an) 中間値より補正係数を算出し、蛍光強度を補正する（グローバル補正（gj o b a 1 n o r

71 ma 1 i z a t i on) と称する）（文献 59) 。また、異なる系統の比較のように 1種類の細胞の発現量が異なっていると金型が得られる場合などには、ハウスキーピング遺伝子のような発現量が一定であると考えられる遺伝子の蛍光シグナルより補正係数を算出する。また、蛍光標識時に内部標準を使用する方法も使用し得る。このように得られた補正データをもとに、本発明の POX遺伝子群と、ィモチ病菌感染による遺伝子パターンの発現変化の推移との関連を、同時に解析し得る。 (発明の効果）

上記のように、 B 1および B 2に属する全てのペルォキシダ一ゼ（POX) 遺伝子は、 5.日目および 16日目の芽生えにおいて構成的に根に発現した。 p r x R PAを除いて、これらの遺伝子はまた、種々のレベルで構成的に地上部に発現した。これらの結果から、本発明者らは、 B 1および B 2に属する遺伝子が、植物において生長過程での基礎代謝の調節およびス卜レス応答性反応に関与すると推測する。

R 2184および C 52903は B 1に属する。これら 2つの POXは、 N末端の推定シグナルペプチドおよび C末端延長を有する。この構造は、これらの P OXが液胞に局在化されることを示唆する。対照的に、 B 1に属する R 2693、 p r xRPA、および R 2576、ならびに B 2に属する R 2329および S 1 1222は、 N末端の推定シグナルペプチドのみを有した。従って、後者は、細胞外に放出される、つまりアポプラスト性のペプチドであるとを示唆される。傷害ストレスおよびパラコート処理は、アポプラスト性（R2329、 p r X 25 76および R 2576) および液胞性（例えば、 R 2184および C 5290 3) の両方の POXを誘導した。従って、液胞性 POXおよびアポプラスト性 (すなわち細胞外分泌性） POXの両方を含む、複数の異なる性質を有する P〇

72 Xが、同様の生理的反応において、異なる様式でまたは協調して機能することが示唆される。単一の植物に多様な P O Xが含まれる理由の一つは、.植物生理を、このように微妙に制御する必要性にあると考えられる。 (産業上の利用可能性）

本発明の開示により、イネ科植物品種を含む任意の植物の特性を評価するために有用なペルォキシダーゼ（P O X) 遺伝子のセットが提供される。さらに、多様な発現特異性を有する種々の P O X遺伝子およびそのプロモータが提供される。これらの遺伝子およびプロモーターは、所望の特性を与える植物の改変のための材料として有用である。本発明はまた、本発明の遺伝子またはプロモー夕一を利用して、植物の遺伝子発現を分析することにおいて利用可能である。

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76

Claims

請求の範囲

1. 植物の特性を評価するために有用なペルォキシダーゼ遺伝子のセッ卜であって：

(A1) 以下からなる遺伝子群：

(2) 配列番号 3の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(3) 配列番号 5の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(5) 配列番号 9の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(1 1) 配列番号 21の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれ

77 らの断片；から選択される 1種類以上を含む、根発現型構成的遺伝子のサブセッ卜；

(A2) 以下からなる遺伝子群：

(13) 配列番号 25の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(15) 配列番号 29の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(16) 配列番号 31の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

(18) 配列番号 35の配列を有する DN Aまたはそのホモログ、またはそれらの断片；

から選択される 1種類以上を含む、根発現型ストレス誘導性遺伝子のサブセッ卜；

ならびに、

(B2) 以下からなる遺伝子群：

(20) 配列番号 39の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれ

78 らの断片；

ならびに、

任意に、

(C) 以下の遺伝子：

(21) 配列番号 41の配列を有する DNAまたはそのホモログ、またはそれらの断片、

を含む、ペルォキシダーゼ遺伝子のセット。

2. 以下のいずれかである、ペルォキシダ一ゼ遺伝子：

(a) 配列番号 3の 50位から 1021位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(b) 配列番号 5の 108位から 1 109位までの配列を有するペルォキシダ —ゼ DNA；

(d) 配列番号 9の 71位から 1078位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

(e) 配列番号 1 1の 134位から 1 108位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA ;

(f ) 配列番号 13の 75位から 1058位までの配列を有するペルォキシダ —ゼ DNA；

(g) 配列番号 15の 136位から 1 147位までの配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA；

( i ) 配列番号 17の 29位から 997位までの配列を有するペルォキシダー

79 ゼ DNA；

( j ) 配列番号 19の 14位から 997位までの配列を有するペルォキシダーゼ DNA；

( 1 ) 配列番号 23の 53位から 1033位までの配列を有するペルォキシダ —ゼ DNA；

(n) 配列番号 29の 81位から 1025位までの配列を有するペルォキシダ —ゼ DNA；

(o) 配列番号 31の 44位から 1084位までの配列を有するペルォキシダ DNA；

(p) 配列番号 33の 68位から 1 1 14位までの配列の配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA ;

(q) 配列番号 35の 31位から 1 101位までの配列の配列を有するペルォキシダ一ゼ DNA ;

(r) 配列番号 37の 34位から 1089位までの配列の配列を有するペルォキシダーゼ DN A；

( s ) 配列番号 39の 52位から 1062位までの配列の配列を有するペルォキシダーゼ DN A；または、

(t) (a) 〜（s) のいずれか 1つの配列とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする配列を有し、該配列によってコードされるペルォキシダーゼと同一の発現特異性を示すペルォキシダーゼをコードする遺伝子。

3. ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモータ一であって、配列番号 1、 3、 5、

80 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または該ペルォキシダ一ゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、該ペルォキシダーゼ遺伝子と同一の特異的な発現活性を示すペルォキシダ一ゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモ一夕一。

4. ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21 27、 29、 31、 33、および 35からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または該ペルォキシダ一ゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、根特異的発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プ口モ一々一。

5. ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 15、 17、 19および 21からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または該ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、根および地上部で発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーター。

6. ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 23、 25、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または該ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、地上部特異的な発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコ一ド領域上流側に存在する、プロモー夕一。

7. ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1、 3、 5、

81 7、 9、 13、 15、 17、 21、 23および 25からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子、または該ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、構成的な発現活性を示すペルォキシダ一ゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーター。.

8. ペルォキシダ一ゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 1 1および 19からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または該ぺルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、ストレス減少性発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーター。

9. ペルォキシダーゼ遺伝子のプロモーターであって、配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダ一ゼ遺伝子、または該ペルォキシダーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、ストレス誘導性の発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側に存在する、プロモーター。

10. 発現カセッ卜の製造方法であって、該方法が以下の工程：

(1) (a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、および 39からなる群より選択される配列を含むペルォキシダーゼ遺伝子；または

(b) 該ペルォキシダ一ゼ遺伝子とス卜リンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ペルォキシダーゼ遺伝子と同一の特異的な発現活性を示すペルォキシダーゼ遺伝子

を提供する工程；

(2) (a) または（b) のペルォキシダーゼ遺伝子のコード領域上流側にお

82 いてプロモータ一活性を有する領域を特定する工程；および

( 3 ) 該特定されたプロモーター活性を有する領域を、異種遺伝子と作動可能に連結する工程、

を包含する、方法。

1 1 . 請求項 1の記載のペルォキシダーゼ遺伝子のセットを用いて、植物の特性を解析するための方法であって、該方法は、以下の工程：

サンプルから R N Aを抽出する工程；

該 R N Aをメンブレンに結合させる工程；

請求項 1に記載のペルォキシダーゼ遺伝子のセットを標識する工程；該メンプレンを該標識されたペルォキシダ一ゼのセットとともにィンキュベー卜する工程；および

該標識されたペルォキシダーゼのセッ卜に由来するシグナルを検出する工程、を包含する、方法。

1 2 . サンプル中の請求項 2の記載の遺伝子を用いて、植物の特性を解析するための方法であって、該方法は、以下の工程：

サンプルから R N Aを抽出する工程；

該 R N Aをメンブレンに結合させる工程； '

請求項 2に記載のペルォキシダーゼ遺伝子を標識する工程；

該メンプレンを該標識されたペルォキシダーゼのセットとともにインキュベー卜する工程；および

該標識されたペルォキシダーゼ遺伝子に由来するシグナルを検出する工程、を包含する、方法。

1 3 . 請求項 1 2に記載の方法であって、前記特性が、ィモチ病菌に対する

83 応答である、方法。

14. 請求項 12または 13に記載の方法であって、前記遺伝子が、配列番号 29、配列番号 31、配列番号 33および配列番号 37からなる群より選択される少なくとも 1つの遺伝子である、方法。

15. 前記サンプルがイネ科植物由来である、請求項 1 1〜 14のいずれか 1項に記載の方法。 16. 請求項 3〜 9のいずれか 1項に記載のプロモーターに由来する配列を用いて、植物の特性を解析するだめの方法であって、該方法は、以下の工程：サンプルから RNAを抽出する工程；

該 RNAをメンブレンに結合させる工程；

請求項 3〜 9のいずれか 1項に記載のプロモーターに由来する配列を有するォリゴヌクレオチドを標識する工程；

該メンプレンを該標識されたオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程；および

、

17. DN Aマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析方法であって、該方法は以下の工程：

(a) DN Aマイクロアレイに請求項 1に記載のペルォキシダーゼ遺伝子のセットを固定させる工程；

(b) 植物から 2種類以上のサンプルを調製する工程；

(c) 該サンプルを標識する工程；

84 (d) 該標識されたサンプルを、該 DNAマイクロアレイと混合し、ハイプリダイズさせる工程；および

(e) 該ハイブリダィズされた DNAマイクロアレイを洗浄し、該標識に由来するシグナルを検出する工程、

を包含する、方法。

18. DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析方法であって、該方法は以下の工程： ―

(a) DNAマイクロアレイに請求項 2に記載のペルォキシダーゼ遺伝子を固定させる工程；

(b) 植物から 2種類以上のサンプルを調製する工程；

(c) 該サンプルを標識する工程；

(d) 該標識されたサンプルを、該 DNAマイクロアレイと混合し、ハイプリダイズさせる工程；および

を包含する、方法。

19. DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析方法であって、該方法は以下の工程：

(a) D N Aマイクロアレイに請求項 3〜 9のいずれか 1項に記載のプロモー夕由来の配列を有するオリゴヌクレオチドを固定させる工程；

(b) 植物から 2種類以上のサンプルを調製する工程；

(c) 該サンプルを標識する工程；

. (d) 該標識されたサンプルを、該 DNAマイクロアレイと混合し、ハイプリダイズさせる工程；および

85 (e) 該ハイブリダィズされた DNAマイクロアレイを洗浄し、該標識に由来するシグナルを検出する工程、

を包含する、方法。

20. さらに、

(f ) 前記検出されたシグナルを、補正する工程、

を包含する、請求項 17〜19のいずれか 1項に記載の方法。

21. さらに、

(g) 前記検出されたシグナルまたは補正されたシグナルを、解析ソフトゥエアを用いて解析する工程、

を包含する、請求項 17〜 20のいずれか 1項に記載の方法。

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