KR20020068052A

KR20020068052A - 다양한 특성을 가지는 벼 퍼옥시다제

Info

Publication number: KR20020068052A
Application number: KR1020027007415A
Authority: KR
Inventors: 오하시유코; 미츄하라이치로; 사사키타쿠지; 나가무라요시아키; 이토히로유키; 이아위타카요시; 히라가수수무
Original assignee: 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-08-24
Also published as: WO2001042475A1; AU779563B2; EP1249493A4; CN1434867A; EP1995311A1; AU1735601A; CA2390680A1; EP1249493A1; US20040091860A1

Abstract

본 발명은 복수의 퍼옥시다제에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 종래에는 곤란하였던 다양한 퍼옥시다제의 발현 특성이 해명되며, 퍼옥시다제 발현 특이성을 사용하여 식물을 변형시키는 수단이 제공된다. 본 발명은 또한 다양한 발현 특이성을 가지는 퍼옥시다제 및 이러한 퍼옥시다제 유래의 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 퍼옥시다제 유전자를 사용한 DNA 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 분석에 관한 것이다.

Description

다양한 특성을 가지는 벼 퍼옥시다제{RICE PEROXIDASES WITH VARIOUS CHARACTERISTICS}

퍼옥시다제 (EC.1.11.1.7) (본 명세서에서 "POX"라고도 함)은, 일반적으로 과산화수소에 의한 다양한 기질의 산화를 촉매하는 효소로서, 미생물에서 동식물까지 광범위하게 존재한다. 퍼옥시다제는 다양한 이소자임 및 이소형으로 이루어진 수퍼패밀리를 구성하며, 현재, 반응 특이성 및 구조에 따라 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III로 분류된다 (Welinder, 참고 문헌 1). 클래스 I은, 원핵 생물 퍼옥시다제로도 칭해지며, 효모 미토콘드리아 사이토크롬 c POX, 엽록체 아스코르브산 POX, 세포질 아스코르브산 POX, 및 유전자 세균 POX 등을 포함한다. 클래스 II는, 분비형 진균류 퍼옥시다제로도 칭해지며, 대표적으로는 피. 크라이소스포륨 (P.chrysosporium) 망간 의존성 POX (PCM), 및 리그니나제 등을 포함한다. 클래스 III은, 고전적 분비형 식물 퍼옥시다제로도 칭해지며, 대표적으로는 서양 고추냉이 POX 등을 포함한다. 클래스 III 식물 POX는 식물에서 보편적으로 발견되며, 복수개의 이소형이 동일 식물에서 발견되었다 (참고 문헌 1).

클래스 III 식물 퍼옥시다제 (POX)는 식물에 있어서 다양한 생리적 과정 (예를 들어 목질화 (lignification) (Whetten 등 (참고 문헌 2)), 코르크화 (Espelie 등 (참고 문헌 3)), 세포벽 단백질의 가교 (Fry 등 (참고 문헌 4)), 옥신 분해 및 식물 호르몬인 인돌아세트산 (IAA)의 산화 (Hinman 등 (참고 문헌 5)), 병원체에 대한 방어 (Chittoor 등 (참고 문헌 6)), 염 내성 (Amaya 등 (참고 문헌 7)), 노화 (Abeles 등 (참고 문헌 8)), 식물의 발생, 분화 및 생장 (Horton 등 (참고 문헌 9)) 등)에 기여한다는 것이 제안되어 있다. 또한, 클래스 III 식물 퍼옥시다제 (POX)는 식물의 생장 및 병상해 스트레스에 대한 응답 등에 있어서도 중요한 역할을 한다고 생각되고 있다. 복수개의 퍼옥시다제가 단일 식물에 존재하며 그의 기질 특이성이 낮기 때문에, 개개의 퍼옥시다제의 특이적인 생리적 기능을 특정하는 것이 또한 곤란하다.

식물의 POX 유전자에 대해서는, 예를 들어 7종 이상의 POX 유전자가 각각의 알팔파, 토마토 및 밀로부터 단리 동정되었다 (Chittoor 등 (1999), 참고 문헌 6). Chittoor 등은 벼로부터 상동성이 높은 3개의 cDNA 및 게놈 DNA 단편을 단리하여,벼가 잔토모나스 오리자에 피브이. 오리자에 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)로 감염시 상기 3종의 POX가 상이한 유도 패턴을 가진다는 것을 보여주었다 (Chittoor 등 (1997), 참고 문헌 10). Ito 등은 지상부 조직에 dlTdjtj 단백질 면에서 25종의 POX가 존재하여야 한다는 것을 보여주었다. Ito 등은 25종의 POX 중 4종을 정제하여, 4종의 POX 각각의 N-말단 아미노산 서열 및 항체의 반응성을 연구하였다. 그 결과, Ito 등은 4종의 POX가 두 세트의 이소형이라고 추정하였다 (Ito 등, 참고 문헌 11). Ito 등은 2종의 구조적으로 연관되어 있는 POX를 코딩하는 cDNA (prxRPA 및 prxRPN)을 단리하였다. 상기 2종의 유전자는 동일하지 않으나 유사한 발현 패턴을 나타내었다 (Ito 등, 참고 문헌 12). 등전점 전기 영동, 이어서 활성 염색에 의해 12종의 POX 이소자임이 담배에서 검출되었으며, 상기 이소자임은 기관 특이성, 및 상해 또는 TMV 감염에 대한 응답성이 상이하다는 것이 나타났다. 상기 담배 POX의 관찰에 따라, 개개의 POX 유전자의 발현이 상이하게 조절된다는 것이 제안되었다 (Langrimini 등, 참고 문헌 13).

이와 같이, 발현 특이성에 대하여 종래에 연구된 POX 이소자임의 수는 한정되어 있었다. 수십가지일 것으로 예측되는 POX의 발현 동향은 개괄적인 방식으로 분석되지 않았으며, 종래의 발견에 기초한 이러한 분석의 수행은 곤란하였다.

퍼옥시다제 (POX)는, 과산화수소로 대표되는 것과 같은 활성 산소종의 제거에 있어서 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 일반적으로, 식물 등의 세포에서의활성 산소종 (수퍼옥사이드, 과산화수소, 히드록실 라디칼, 일중항 (singlet) 산소 등)의 농도가 증가한 상태는 산화 스트레스로 칭해진다. 이는, 과산화상태, 자외광 또는 방사선; 사이토크롬의 전자 전달계의 이상; 퍼옥시좀 이상 증가; 고온, 저온, 화학 물질 등과 같은 비생물적 작인(作因); 오존, 이산화황 등과 같은 대기 오염 물질에 의해 야기되는 "산화 상태"와, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD), 카탈라제 (CAT), POX, 비타민 E, C 및 A 등의 작용으로 인한 세포내의 "항산화제 방어 기작" 사이의 밸런스의 상실에 의해 야기된다.

진핵 생물이 산화 스트레스에 노출될 경우, SOD 등의 활성이 증가한다는 것이 종래에 알려져 있었다. 먼저 SOD의 유도에 의해 세포가 약간의 내성을 나타낸다는 예가 관찰되었다.

또한, 식물에 있어서, 산화 스트레스의 발생을 고려하면, 하기의 것이 알려져 있다: (1) 광합성을 저해하는 다양한 조건 (광 조사 하에서 저온, 제초제 처리 등) 하에서, 광합성 반응 경로 등으로 인해 활성 산소종이 엄청난 정도로 발생되며; (2) 암소에서도 식물이 저온에 노출될 경우 과산화수소 등과 같은 활성 산소종의 농도가 증가할 수 있고; (3) 제초제 (파라쿼트 (paraquat) (상품명) (1,1-디메틸-4,4-디피리디늄 디클로라이드) 등) 및 자외광의 작용 기작에 활성 산소종이 연루되어 있다. (4) 건조 스트레스, 중금속 등은 산화 스트레스를 야기하는 것으로 생각된다.

최근, 산화 스트레스를 포함하는 환경 스트레스의 식물을 포함하는 유기체에 대한 영향이 주목받고 있다. 근대의 공업화가 지구 환경을 악화시켜 사회 문제를 야기하였다. 환경 스트레스에 대한 식물의 내성 개선이 연구되어 왔다. POX와 같은 항산화효소는, 다양한 환경 스트레스에 의해 과도하게 발생되는 활성 산소종의 제거에 유용한 환경 스트레스 내성 (유기체의 방어) 인자인 것으로 생각된다. 그러나, 환경 스트레스 내성에 있어서의 POX의 역할은 이소자임의 다양성 및 광범위한 기질 특이성 등으로 인하여 충분히 해명되지 않았다. 따라서, 현재 환경 스트레스 내성 식물을 생성하는 재료로서 POX를 사용하는 것은 곤란하다.

클래스 III POX가 병원균에 의한 감염과 같은 생물적 자극에 대한 작용에 있어서 역할을 한다는 것이 제안되어 있다. Ohashi 등의 문헌 (참고 문헌 14)에 있어서, 담배 POX와, 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 감염에 의한 국소적 병반 형성 사이의 상관 관계가 연구되었으며, POX가 TMV로 인한 괴사에 의해 야기되는 병반 형성의 과정에서 폴리페놀을 산화시키는 기능을 한다는 것이 제안되었다. 이와 같이, POX는 병원체의 감염에 대한 방어 기능을 식물에 부여하는 역할을 한다는 것이 제안되었다.

따라서, 스트레스 내성 식물을 포함하여 유용한 식물을 유전자 공학적 방법을 사용하여 생성한다는 면에서, POX 유전자의 발현 특성에 대한 상세한 발견의 축적이 요구된다.

최근, 벼를 포함하여 다수의 식물에 있어서 대규모 발현 서열 태그 (expressed sequence tag, EST) 서열 결정 프로그램이 진행 중이다. 벼 (Yamamoto 등 (참고 문헌 15)) 및 아라비돕시스 (Arabidopsis) (??stergaard 등 (참고 문헌 16))에서 각각 42 및 41 종의 상이한 POX 유전자의 존재가 확인되었다. 그러나, 상기 EST 서열은 단지 상기 유전자의 부분 서열에 대한 정보를 제공할 뿐이다. 상기 유전자의 기능 분석에 대해서는 보고되어 있지 않다.

(발명이 해결하고자 하는 과제)

본 발명의 목적은 각각의 유전자의 발현 특성이 해명된 신규한 퍼옥시다제 유전자 군 및 그의 구성원을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 특정된 발현 특이성을 가지는 식물 발현 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명은 발현 특이성이 상이한 퍼옥시다제군 전체의 상의 해명, 및 이러한 해명에 의해 수득되는 정보를 이용한, 소망하는 성질을 가지는 변형 식물의 생성에 유용하다. 또한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 등을 사용한 유전자 발현 분석에 유용하다.

발명의 개시

(발명의 요지)

본 발명은, 본 명세서에서 정의된 2 이상의 발현 특이성을 특징으로 하는 퍼옥시다제 유전자, 및 이러한 유전자의 세트에 관한 것이다. 상기와 같은 발현 특이성의 예는 시기 특이성, 부위 특이성, 스트레스 응답성 등을 포함한다. 본 발명은 또한 특정된 발현 특이성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 프로모터에 관한 것이다.

본 발명은, 21종의 대표적인 벼 퍼옥시다제 유전자의 다면적인 발현 특이성 데이터의 해석에 기초한다. 본 발명자들은, 개개의 벼 퍼옥시다제 유전자가 다양한 파라미터 (예를 들어 생장 시기, 조직 등)에 대하여 개별적인 발현 패턴을 가진다는 것을 해명하였다. 또한, 산소 스트레스, 병원체 감염 등과 같은 스트레스 하에서 상이하게 유도되는 발현 패턴을 가지는 벼 퍼옥시다제 유전자가 복수 존재한다는 것을 해명하였다.

하나의 측면에 있어서, 본 발명은 식물의 특성 평가에 유용한 퍼옥시다제 유전자 세트로서,

(A1) 하기:

(1) 서열 번호 1의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(2) 서열 번호 3의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(3) 서열 번호 5의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(4) 서열 번호 7의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(5) 서열 번호 9의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(6) 서열 번호 11의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(7) 서열 번호 13의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(8) 서열 번호 15의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(9) 서열 번호 17의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(10) 서열 번호 19의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(11) 서열 번호 21의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 뿌리 발현형 구성적 유전자의 서브세트;

(A2) 하기:

(12) 서열 번호 23의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(13) 서열 번호 25의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 지상부 발현형 구성적 유전자의 서브세트;

(B1) 하기:

(14) 서열 번호 27의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(15) 서열 번호 29의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(16) 서열 번호 31의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(17) 서열 번호 33의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(18) 서열 번호 35의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 뿌리 발현형 스트레스 유도성 유전자의 서브세트;

(B2) 하기:

(19) 서열 번호 37의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(20) 서열 번호 39의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 지상부 발현형 스트레스 유도성 유전자의 서브세트; 및 임의로

(C) 하기의 유전자:

(21) 서열 번호 41의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편을 포함하는 퍼옥시다제 유전자 세트에 관한 것이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기 중 어느 하나의 퍼옥시다제 유전자에 관한 것이다:

(a) 서열 번호 3의 50 내지 1021 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(b) 서열 번호 5의 108 내지 1109 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(c) 서열 번호 7의 66 내지 1046 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(d) 서열 번호 9의 71 내지 1078 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(e) 서열 번호 11의 134 내지 1108 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(f) 서열 번호 13의 75 내지 1058 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(g) 서열 번호 15의 136 내지 1147 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(i) 서열 번호 17의 29 내지 997 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(j) 서열 번호 19의 14 내지 997 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(k) 서열 번호 21의 110 내지 1090 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(l) 서열 번호 23의 53 내지 1033 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(m) 서열 번호 25의 20 내지 982 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(n) 서열 번호 29의 81 내지 1025 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(o) 서열 번호 31의 44 내지 1084 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(p) 서열 번호 33의 68 내지 1114 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(q) 서열 번호 35의 31 내지 1101 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(r) 서열 번호 37의 34 내지 1089 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(s) 서열 번호 39의 52 내지 1062 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA; 또는

(t) 엄격한 조건 하에서 (a) 내지 (s) 중 임의의 하나의 서열과 혼성화하는 서열을 가지며, 상기 하나의 서열에 의해 코딩되는 퍼옥시다제와 동일한 발현 특이성을 가지는 퍼옥시다제를 코딩하는 유전자.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 상기 퍼옥시다제 유전자와 동일한 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서,서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33 및 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 뿌리 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 15, 17, 19 및 21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 뿌리 및 지상부에서 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 23, 25, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 지상부 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 21, 23 및 25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 구성적인 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 11 및 19로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 스트레스 감소성 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 스트레스 유도성 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터에 관한 것이다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 발현 카세트의 제조 방법으로서, 하기:

(1) (a) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 퍼옥시다제 유전자; 또는

(b) 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 상기 퍼옥시다제 유전자와 동일한 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자

를 제공하는 단계;

(2) (a) 또는 (b)의 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에서 프로모터 활성을 가지는 영역을 특정하는 단계; 및

(3) 상기 프로모터 활성을 가지는 특정된 영역을 이종 유전자에 작동가능하게 연결시키는 단계

를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 퍼옥시다제 유전자는 특성이 변형된 식물 품종을 생성하는 방법에 유용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 식물 품종의 생성 방법은 하기 단계를 포함한다:

본 발명의 퍼옥시다제 유전자 또는 그의 호몰로그로 이루어지는 유전자 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 프로모터를 작동가능하게 연결시킨 발현 카세트를 제조하는 단계;

상기 발현 카세트를 식물 품종의 세포 내로 도입하는 단계; 및

상기 세포를 식물체로 재생시키는 단계.

상기의 경우, 식물 품종에 있어서 상기 유전자의 발현량이 상기 식물 품종이 속하는 종의 표준 발현량과 상이하다고 평가되어, 식물 품종이 선발될 수 있다 (단, 상기 선발 단계에 있어서, 서열 번호 1의 서열을 가지는 DNA 또는 그의 호몰로그, 또는 서열 번호 27의 서열을 가지는 DNA 또는 그의 호몰로그가 선발될 경우, 하나 이상의 다른 유전자가 동시에 선발됨).

여기에서, 유전자의 "표준 발현량"은 변형시킬 식물 품종이 속하는 종의 정상적인 생장 조건 하에서의 평균 발현량을 나타낸다.

상기 생성 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

본 발명의 퍼옥시다제 유전자의 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 식물 품종의 세포 내로 도입하는 단계; 및

상기 세포를 식물로 재생시키는 단계.

식물 품종의 특성의 변형예는 대기 오염 물질, 상해, 과산화수소, UV, 병원체, 환경 스트레스 및 에틸렌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자에 의해 야기되는 스트레스에 대한 내성의 변형, 및 추가로 식물의 생장 특성 또는 대사 특성의 변형을 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 퍼옥시다제 유전자의 세트를 사용하여 식물의 특성을 분석하는 방법에 관한 것이다:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

본 발명에 따른 퍼옥시다제 유전자 세트를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 퍼옥시다제 유전자 세트와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

상기 표식 퍼옥시다제 유전자로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계.

또한 본 발명은, 샘플 중의 본 발명에 따른 유전자를 사용하여 식물의 특성을 분석하는 방법을 제공한다. 본 방법은 하기 단계를 포함한다:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

본 발명의 퍼옥시다제 유전자를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 퍼옥시다제 유전자와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

하나의 실시 형태에 있어서, 상기 특성은 벼 고사병균 (rice blast fungus)에 대한 응답이다.

다른 실시 형태에 있어서, 유전자는 서열 번호 29, 31, 33 및 37로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자이다.

본 발명에서의 샘플은 임의의 식물로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 샘플은 벼과 식물로부터 유래될 수 있다.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 프로모터로부터 유래되는 서열을 사용한 식물 특성의 분석 방법이 제공된다. 본 방법은 하기의 단계를 포함한다:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

본 발명에 따른 프로모터로부터 유래되는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

표식 올리고뉴클레오티드로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현의 분석 방법을 제공한다. 본 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) DNA 마이크로어레이 상에 본 발명에 따른 퍼옥시다제 유전자 세트를 고정화하는 단계;

(b) 식물로부터 2종류 이상의 샘플을 제조하는 단계;

(c) 상기 샘플을 표식시키는 단계;

(d) 상기 표식 샘플을 DNA 마이크로어레이와 혼합하여 혼성화하는 단계; 및

(e) 상기 혼성화한 DNA 마이크로어레이를 세정하고, 표식으로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현의 분석 방법을 제공한다:

(a) DNA 마이크로어레이 상에 본 발명의 퍼옥시다제 유전자 및/또는 본 발명의 프로브를 고정화하는 단계;

(b) 식물로부터 2종류 이상의 샘플을 제조하는 단계;

(c) 상기 샘플을 표식시키는 단계;

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다:

(f) 상기 검출된 시그널을 보정하는 단계.

다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다:

(g) 상기 검출된 시그널 또는 보정된 시그널을 분석 소프트웨어로 분석하는 단계.

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 DNA 마이크로어레이를 사용한 분석 방법에 있어서는, 시간에 따른 유전자 발현의 변화가 모니터링될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서는, 상이한 자극이 주어지거나 자극이 전혀 주어지지 않은 식물 샘플들 사이에서 유전자 발현의 변화가 비교될 수 있다. 이러한 비교에 의해 시간에 따른 유전자 발현의 총체적인 변화가 모니터링될 수 있거나, 특정 자극으로 인한 유전자 발현 패턴에 의해 식물의 대사 등이 추정될 수 있다.

본 발명은 식물의 퍼옥시다제 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 벼 유래의 신규한 퍼옥시다제 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벼 유래의 신규 퍼옥시다제 유전자 군을 사용한 마이크로어레이 (microarray)에 의한 유전자 분석 방법과, 유전자 분석 방법 수행용 시줄기 및 장치에 관한 것이다.

도 1은 벼 퍼옥시다제를 그의 추정 아미노산 서열에 따라 클러스터로 분류한계통 분석 결과를 예시한다.

도 2A는 생장 단계 및 부위와, 다양한 자극으로 인한 벼 퍼옥시다제의 유전자 발현의 분석을 예시하는 전기영동 사진이다. 본 명세서에서 사용한 21종의 퍼옥시다제 중 prxRPN, R2877, R1420, R0317, S13316, R2151 및 S4325의 발현 특이성을 예시한다.

도 2B는 생장 단계 및 부위와, 다양한 자극으로 인한 벼 퍼옥시다제의 유전자 발현의 분석을 예시하는 전기영동 사진이다. 본 명세서에서 사용한 21종의 퍼옥시다제 중 C62847, R1617, R3025, R2391, S10927, S14493 및 prxRPA의 발현 특이성을 예시한다.

도 2C는 생장 단계 및 부위와, 다양한 자극으로 인한 벼 퍼옥시다제의 유전자 발현의 분석을 예시하는 전기영동 사진이다. 본 명세서에서 사용한 21종의 퍼옥시다제 중 R2576, R2184, R2693, C52903, R2329, S11222 및 S14082의 발현 특이성을 예시한다.

도 3은 prxRPN 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 3(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 3(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 4는 R2877 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 4(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 4(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 5는 R1420 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 5(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 5(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 6은 R0317 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 6(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 6(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 7은 S13316 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 7(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 7(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 8은 R2151 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 8(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 8(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 8(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 9는 S4325 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 9(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 9(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 10은 C62847 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 10(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 10(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 11은 R1617 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 11(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을예시하는 그래프이다. 도 11(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 12는 R3025 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 12(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 12(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 12(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 13은 R2391 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 13(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 13(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다.

도 14는 S10927 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 14(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 14(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 14(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 15는 S14493 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 15(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 15(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 15(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 16은 prxRPA 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 16(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 16(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 16(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 17은 R2576 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 17(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 17(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 17(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 18은 R2184 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 18(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을예시하는 그래프이다. 도 18(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 18(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 19는 R2693 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 19(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 19(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 19(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 20은 C52903 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 20(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 20(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 20(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 21은 R2329 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 21(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 21(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 21(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 22는 S11222 퍼옥시다제의 발현 특이성의 분석 결과를 예시하는 도면이다. 도 22(a)는 5일 및 16일째의 뿌리 및 지상부에서의 mRNA의 발현량의 상대적인 값을 예시하는 그래프이다. 도 22(b) 및 (c)는, 5일 및 16일째의 뿌리 (R)와 지상부 (A)의 발현량의 비를 각각 예시한다. 도 22(d)는 16일째에 있어서 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현의 응답 수준을 대조와 비교하여 예시한 그래프이다.

도 23은 DNA 마이크로어레이 실험의 흐름을 개략적으로 예시한다.

도 24는 3종류의 벼 샘플을 사용하여, 벼 고사병균 레이스 (race) (003)에 의한 감염 자극이 주어진 본 발명의 유전자 (R2184, R2576, R2693, C52903, R2329 및 S11222)의 발현 패턴의 변화를 예시하는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 기술한다.

(정의)

본 명세서에서 사용되는 주요 용어의 일부를 이하에 정의한다.

본 명세서에서 사용되는 "식물"은 임의의 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 바람직한 식물의 예로는 벼과에 속하는 단자엽 식물, 예를 들어 밀, 옥수수, 벼, 보리, 수수 등을 들 수 있다. 바람직한 식물의 다른 예로는, 담배, 피망, 가지, 멜론, 토마토, 고구마, 양배추, 양파, 브로콜리, 당근, 오이, 감귤류, 배추, 상추, 복숭아, 감자, 및 사과를 들 수 있다. 바람직한 식물은 작물에 한정되지 않으며, 꽃, 수목, 풀 (grass), 잡초 등을 포함한다. 식물은 달리 특정되지 않는 한, 임의의 식물 그 자신, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 및 종자를 의미한다. 식물 기관의 예로는, 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 등을 들 수 있다. 식물 세포의 예로는 캘러스 및 현탁 배양 세포를 들 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 DNA의 "단편"은, 참조 DNA의 전장보다는 짧지만, 적어도 프로브 또는 프라이머로 사용하기에는 충분한 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 어떤 DNA 단편은, 그 단편이 유래한 DNA에 대해서 선발적 프로브 또는 선발적 프라이머로 사용되기 위하여 특이적으로 혼성화할 수 있어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "어떤 DNA는 특이적으로 혼성화한다"는 것은, 퍼옥시다제 (POX)를 사용하는 경우, 21종 이상의 본 발명의 POX DNA가 개별적으로 검출 및 증폭될 수 있다는 것을 나타낸다. 선발적 프로브는, 대표적으로는 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 20개 이상의뉴클레오티드, 훨씬 더 바람직하게는 30, 40 또는 50 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있으며, 50 초과의 뉴클레오티드 길이도 가질 수 있다. 선발적 프로브는 선발적 프라이머를 사용한 PCR 증폭 산물로서 입수될 수 있다. PCR에서 하나 이상의 프라이머 쌍으로서 선발적 프라이머를 사용할 경우, 선발적 프라이머는 대표적으로는 9개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 10개 이상의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드, 훨씬 더 바람직하게는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 또는 50개 이상의 뉴클레오티드, 또는 50개 초과의 뉴클레오티드의 길이를 가진다.

본 명세서에 있어서, 각각의 POX의 단편이 특이적이기 위해서는, 단편은 POX 보존 영역을 제외한 영역으로부터 선발되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "POX 보존 영역"이라는 것은 본 발명의 POX들 사이에서 DNA 서열 또는 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역을 나타낸다. "POX 비보존 영역"은 이러한 영역 이외의 영역을 나타낸다. "보존되어 있다"라는 것은, 어떤 핵산 서열 영역의 서열이, 그 서열에 의해 코딩되는 폴리뉴클레오티드의 기능이 유지되는 정도로 원래 핵산 서열과 동일하거나 유사하다는 것을 나타낸다. POX 보존 영역은 대표적으로는 하기 서열에 있어서 박스에 의해 나타내어지는 서열 정렬 부분이다. 상기 부분은, 특히 2개의 불변 히스티딘 (h로 표시됨) 잔기 및 8개의 시스테인 잔기 (c1 내지 c8로 표시됨)을 포함하는 영역을 그 특징으로 한다. POX 보존 영역 중의 불변 히스티딘 잔기는, 예를 들어 prxRPA (서열 번호 28)에 있어서, 각각 아미노산 67 및 193에 해당한다.POX 보존 영역 중의 불변 시스테인 잔기는, 예를 들어 prxRPA (서열 번호 28)에 있어서, 각각 아미노산 38, 71, 76, 115, 121, 200, 230 및 322에 해당한다.

본 명세서에서 사용되는 DNA의 "호몰로그"는, 참조 DNA의 뉴클레오티드 서열에 대해 상동성인 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA를 나타낸다. 대표적으로는, 호몰로그는 엄격한 조건 하에서 참조 DNA에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 퍼옥시다제 (POX)의 경우, POX 유전자의 "호몰로그"는 POX 유전자의 DNA 서열과 상동성을 가지는 DNA 서열을 가지며, 발현 특성 (예를 들어 부위 특이성, 시기 특이성, 스트레스 응답성 등)이 동일하거나 유사한 DNA이다.

본 명세서에 있어서, 어떤 POX 유전자의 호몰로그는, 일반적으로 참조하는 POX 폴리펩티드의 POX 비보존 영역에 대해서는 상동성을 가지지만, 다른 POX 폴리펩티드의 POX 비보존 영역에 대해서는 상동성을 가지지 않는다. 유전자의 "상동성"은, 2 이상의 유전자들 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 따라서, 두 유전자 사이의 상동성이 클수록, 그의 서열 사이의 동일성 또는 유사성도 커진다. 두 유전자가 상동성을 가지는지의 여부는, 그들의 서열을 직접 비교하거나 엄격한 조건 하에서의 혼성화 방법에 의해 결정될 수 있다. 두 유전자 서열을 서로 직접 비교할 경우, 대표적으로는 유전자의 DNA 서열의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 동일하다면 유전자가 상동성을 가진다.

염기 서열들 사이의 동일성 비교는, 예를 들어 서열 분석용 도구인 FASTA (Pearson 등, 참고 문헌 17)를 사용하여 산출할 수 있다.

"POX 유전자가 '동일하거나 유사한' 발현 특성을 가진다"는 것은, 발현의 부위 특이성, 시기 특이성 및 스트레스에 대한 응답성 중 하나 이상의 특성, 바람직하게는 상기 특성들 중 임의의 2개의 특성, 더 바람직하게는 상기 특성 모두가 서로 동일하거나 유사하다는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 부위 특이성이 언급되는 경우, 뿌리 및 지상부에서의 POX 유전자의 발현량의 비율이 평가된다. POX 유전자는, 발현이 뿌리에서 우선적이거나; 발현이 지상부에서 우선적이거나; 발현이 뿌리와 지상부 사이에서 실질적으로 동일한 수준인 세가지 군으로 분류된다. 이러한 경우, 유전자의 카테고리가 동일 군일 경우, 상기 유전자는 서로 "동일하거나 유사하다"라고 한다. 기간 특이성이 언급되는 경우, 발아 5일 및 16일째의 POX 유전자의 발현량의 비가 평가된다. POX 유전자는, 발현이 5일째 (유약기)에 우세하거나; 발현이 16일째 (성숙기)에 우세하거나; 발현이 두 시기 모두에서 실질적으로 동일한 세가지 군으로 분류된다. 상기의 경우, 유전자의 카테고리가 동일 군에 속하는 경우, 상기 유전자를 서로 "동일하거나 유사하다"라고 한다. 스트레스에 대한 응답성이 언급되는 경우, 화학물질 (예를 들어 파라쿼트, 에테폰, 메틸 자스모네이트 (MeJA) 등) 및 물리적 자극 (예를 들어 자외광 (UV), 절단, 마찰 등)으로 인한 스트레스 중 어느 하나를 식물이 받을 경우 POX 유전자의 발현량 변화가 평가된다. POX 유전자는 특정 스트레스에 대한 응답성에 따라, 발현량이 증가하거나; 발현량이 감소하거나; 발현량이 변화하지 않는 세가지의 군으로 분류된다. 상기의 경우, 유전자의 카테고리가 동일한 군일 경우, 유전자는 서로 "동일하거나 유사하다"라고 한다. 상기의 각각의 발현 특성을 조사하기 위하여, 하기 실시예와 유사한 조건 하에서 노던 블롯 분석에 의해 POX 유전자의 발현량을 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은, 표적 서열에 대한 상동성을 가지는 뉴클레오티드 가닥의 상보 가닥이 표적 서열과 우선적으로 혼성화하며, 상동성을 전혀 가지지 않는 뉴클레오티드 가닥의 상보 가닥은 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 나타낸다. 어떤 핵산 서열의 "상보 가닥"은, 핵산 염기들사이에서 수소 결합에 의해 상기 핵산 서열과 쌍을 이루는 핵산 서열 (예를 들어 A에 대하여 T, 및 G에 대하여 C)을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열에 의존적이며, 다양한 상황에 따라 다양해진다. 서열이 클수록 서열이 특이적으로 혼성화하는 온도가 커진다. 일반적으로, 엄격한 조건은, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열의 열 용융점 (Tm) 보다 약 5℃ 더 낮은 온도가 선택된다. Tm은 규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에서, 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 50%가 평형 상태로 표적 서열에 혼성화하는 온도이다. "엄격한 조건"은 서열에 의존적이며, 다양한 환경 파라미터에 따라 다양해진다. 핵산 혼성화의 일반적인 지침은 Tijssen의 문헌 (참고 문헌 18)에서 알 수 있다.

대표적으로는, 엄격한 조건은, 염 농도가 약 1.0 M Na+ 미만이며, 대표적으로는 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 뉴클레오티드 (예를 들어 10 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30℃ 이상이며, 긴 뉴클레오티드 (예를 들어 50개의 뉴클레오티드)의 경우에는 약 60℃ 이상이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 엄격한 조건의 예로는, 50%의 포름아미드, 1 M의 NaCl, 1%의 SDS (37℃)를 포함하는 완충 용액 중에서의 혼성화, 및 0.1 x SSC를 사용한 60℃에서의 세정을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 식물에서의 퍼옥시다제 (POX)의 발현을 고려하여 사용하는 경우, 일반적으로 "부위 특이성"은 식물의 부위 (예를 들어 뿌리, 줄기, 간(幹), 잎, 꽃, 종자, 배아, 배, 과실 등)에 대한 POX 유전자의 발현 특이성을 나타낸다. "시기 특이성"은, 식물의 생장 단계 (예를 들어 발아 후의 묘종의 일수)에 대한 POX 유전자의 발현 특이성을 나타낸다. "스트레스에 대한 응답성"은, 식물에 주어진 하나 이상의 스트레스에 의해 야기되는 POX 유전자 발현의 변화를 나타낸다.

여기에서, "스트레스"는 식물에 대하여 물리적, 화학적, 또는 생물학적으로 가해지며, 이것이 다시 식물의 정상적인 생장을 저해하는 인자일 수 있다. 스트레스의 예로는 물리적 스트레스 (광, 열, 냉각, 동결, 자외광, X선, 절단, 마찰 등), 화학적 스트레스 (산소 스트레스, 화학 물질, 생물학적 활성 물질 등), 생물학적 스트레스 (바이러스, 병원체 (예를 들어 벼 고사병균 감염)) 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우, "환경 스트레스"는 지구 환경의 변화에 의해 야기되는 식물에 대한 스트레스를 나타낸다. 예를 들어, 상기 스트레스는 오존층의 파괴로 인한 자외광량의 증가, 및 대기 오염으로 인한 활성 산소종 및 화학 물질 등에 의해 주로 야기된다.

"산소 스트레스" 또는 "산화 스트레스"는, 산소 및 산소 유도체, 대표적으로는 활성 산소종 (수퍼옥사이드, 과산화수소, 히드록실 라디칼, 일중항 산소 등), 오존, 대기 오염 물질 (예를 들어 SOx, NOx 등) 등에 의해 야기되는 스트레스를 나타낸다. 산화 스트레스는, 과산화상태; 자외광 또는 방사선; 사이토크롬의 전자 전달계의 이상; 퍼옥시좀 이상 증가; 고온, 저온, 화학 물질 등과 같은 비생물적 작인(作因); 오존, 이산화황 등과 같은 대기 오염 물질에 의해 야기되는 "산화 상태"와, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD), 카탈라제 (CAT), POX, 비타민 E, C 및 A 등의 작용으로 인한 세포내의 "항산화제 방어 기작" 사이의 밸런스의 상실에 의해 야기된다.

본 명세서에서 사용되는 "뿌리 발현형"은, POX 유전자 또는 그의 프로모터가 식물의 뿌리에서 우선적으로 발현되는 성질, 및 POX 유전자 또는 그의 프로모터가 식물의 뿌리 또는 지상부에서 유사하게 발현되는 성질 중 어느 하나를 나타낸다. 특히, POX 또는 그의 프로모터가 식물의 뿌리 또는 지상부에서 유사하게 발현되는 성질은, "뿌리 및 지상부 발현형"으로 칭해진다. "지상부 발현형"은, POX 유전자 또는 그의 프로모터가 식물의 지상부의 적어도 일부에서 뿌리보다 더 우선적으로 발현되는 성질을 나타낸다. 이러한 성질은, 각각의 부분으로부터 RNA를 추출하고, RNA를 노던 블롯 분석하여 발현량을 분석함으로써 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 POX 유전자 또는 그의 프로모터의 "구조적" 발현은, 식물의 조직에서, 식물의 생장 경로에 있어서 유약기 및 성숙기 동안 발현이 유사하게 실시되는 성질을 나타낸다. 구체적으로는, 본 명세서에 기술된 실시예와 유사한 조건 하에서 노던 블롯 분석을 실시할 경우, 5일 및 16일째에서 묘종의 동일하거나 해당하는 부위에서 발현이 관찰되면, 본 발명의 정의상, 발현이 구성적이라고 간주된다. 구조적 퍼옥시다제는 통상의 생장 환경에서의 식물의 항상성에 있어서 역할을 한다고 생각된다. POX 유전자 또는 그의 프로모터의 발현이 "스트레스 응답성"이라는 것은, 하나 이상의 스트레스가 식물에 가해질 경우, 발현량이 변화하는 성질을 나타낸다. 특히, 발현량이 증가하는 성질을 "스트레스 유도성"이라 칭하고, 발현량이 감소하는 성질을 "스트레스 감소성"이라 칭한다. "스트레스 감소성" 발현은 정상의 경우에 발현이 관찰될 수 있다는 가정에 기초하며, 따라서, "구성적" 발현의 개념과 중복된다. 이러한 성질은, 식물의 임의의 부분으로부터 RNA를 추출하여 노던 블롯으로 분석하여 발현량을 분석함으로써 결정될 수 있다.

(다양한 벼 퍼옥시다제)

본 발명자들에 의하면, 다수의 벼 퍼옥시다제 유전자가 상이한 발현 특이성을 가진다는 것이 나타났다. 본 명세서에 있어서, 벼 퍼옥시다제는 발현 특이성에 따라 대표적으로는 A1, A2, B1, B2 및 C의 적어도 5 클래스로 분류될 수 있다. 카테고리 A 및 B는 자극에 대한 응답성 (유도성)에 기초한다. 스트레스에 대한 유도성을 전혀 가지지 않는 POX는 클래스 A로 분류되고, 스트레스에 대한 유도성을 가지는 POX는 클래스 B로 분류된다. 검출 한계 이하인 발현 수준을 가지는 POX는 클래스 C로 분류된다.

지중 부분 (belowground)에서 우선적으로 발현되거나, 지중 부분과 지상 부분에서 유사하게 발현되는 "뿌리 발현형" 또는 "뿌리 및 지상부 발현형"의 POX는 A1 및 B1으로 분류된다. 지상부에서 주로 발현되는 POX는 A2 및 B2로 분류된다 (예를 들어, 도 2A 내지 2C 및 3 내지 22 참조; 분류를 표 1에 요약하여 나타냄).

본 발명자들은 21종의 POX 유전자의 발현을 분석하였다. 그 결과, 16종의 효소가 A1 및 B1으로 분류되었으며, 4종의 효소가 A2 및 B2로 분류되었고, 하나의 효소가 C로 분류되었다. 본 발명의 POX 유전자는, 이하에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 스트레스에 대하여 다양하면서도 상이한 개별적인 응답성을 나타내며, 지상부보다는 뿌리에서 주로 발현된다는 것이 명확해졌다. 이는 종래의 예비적인 발견 (참고 문헌 11 등)으로부터는 예측하기 어려운 것이다.

군	자극에 대한 유도a	공간적 분포b,c	수d
A1	없음	뿌리 ≥지상부	11
A2	없음	뿌리 < 지상부	2
B1	있음	뿌리 ≥지상부	5
B2	있음	뿌리 < 지상부	2
C	검출되지 않음	검출되지 않음	1
a: 16일령의 엽신(葉身)b: 16일령 식물c: 뿌리 ≥지상부는 뿌리:지상부의 비가 4/6을 초과하는 것임d: 군 중 POX 유전자의 수

이하에, 본 발명의 범주 내의 대표적인 벼 POX 유전자를 기술한다.

prxRPN, 및 후술하는 prxRPA는 본 발명자들에 의해 단리된 POX이다 (Ito 등 (1994), 참고 문헌 12). 상기 서열은 식물 퍼옥시다제에서 보존되어 있는 서열에 기초하여 벼로부터 단리되었다. prxRPN 유전자는 서열 번호 1로 나타내어지는 서열을 가진다. 상기 유전자의 유전자 산물은, 그의 발현 특이성으로 인하여 A1으로 분류된다. 유전자 산물은 뿌리에서 우선적으로 발현된다. 이는, prxRPN 유전자가 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 이 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 prxRPNFP1 및 prxRPNRP1 (서열 번호 58 및 59)를 들 수 있다. 상기 프라이머는 목적 유전자 또는 그와 유사한 유전자를 수득하는 데에 유용하다. prxRPN 유전자로부터 유래되는 프로모터는 prxRPN의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. prxRPN 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2877은 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 신규한 POX로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 3으로 나타내어지는 서열을 가진다. R2877은 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. R2877은 유약기보다 성숙기의 묘종에서 더 현저하게 발현된다. 유전자 산물이 뿌리에서 우세하게 발현되는 것은, R2877이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 성숙기의 묘종에서의 현저한 발현은, R2877이 식물의 성숙기 동안의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물호르몬인 인돌아세트산 (IAA)의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. R2877 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2877의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2877 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R1420도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 5로 나타내어지는 서열을 가진다. R1420도 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. R1420도 유약기보다 성숙기의 묘종에서 더 현저하게 발현된다. 유전자 산물이 뿌리에서 우선적으로 발현된다는 것은, R1420이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 성숙기의 묘종에서의 현저한 발현은, R1420이 식물의 성숙기 동안의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 R1420FP1 (서열 번호 48)이 있다. R1420 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R1420의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R1420 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R0317도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 7로 나타내어지는 서열을 가진다. R0317도 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. R0317도 유약기보다 성숙기의 묘종에서 더 현저하게 발현된다. 유전자 산물이 뿌리에서 우선적으로 발현되는 것은, R0317이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 성숙기의 묘종에서의 현저한 발현은, R0317이 식물의 성숙기 동안의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 R0317F1 (서열 번호 47)이 있다. R0317 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R0317의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R0317 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S13316도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 9로 나타내어지는 서열을 가진다. S13316도 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. S13316도 유약기보다 성숙기의 묘종에서 더 현저하게 발현된다. 유전자 산물이 뿌리에서 우선적으로 발현되는 것은, S13316이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 성숙기의 묘종에서의 현저한 발현은, S13316이 식물의 성숙기 동안의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S13316FP1 (서열 번호 54)이 있다. S13316유전자로부터 유래되는 프로모터는 S13316의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S13316 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2151도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 11로 나타내어지는 서열을 가진다. R2151도 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. R2151도 유약기보다 성숙기의 묘종에서 더 현저하게 발현된다. 성숙기의 묘종에서의 현저한 발현은, R2151이 식물의 성숙기 동안의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 절단 및 마찰 스트레스와, 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극 및 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극에 대한 감소성 응답을 나타낼 수 있다. R2151 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2151의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2151 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S4325도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 13으로 나타내어지는 서열을 가진다. S4325도 뿌리에서 우선적으로 발현될 수 있다. S4325는 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의유사한 발현은, S4325가 식물의 생장, 신장 및 대사에 전반적으로 연루되어 있다는 것을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S4325F1 (서열 번호 57)이 있다. S4325 유전자로부터 유래되는 프로모터는 S4325의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S4325 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

C62847도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 15로 나타내어지는 서열을 가진다. C62847은 또한 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현될 수 있다. C62847는 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의 유사한 발현은, C62847가 식물의 생장, 신장 및 대사에 전반적으로 연루되어 있다는 것을 암시한다. 유전자 산물이 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현된다는 것은, C62847이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능, 및 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 C62847FP1 (서열 번호 44)이 있다. C62847 유전자로부터 유래되는 프로모터는 C62847의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. C62847 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R1617도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 17로 나타내어지는 서열을 가진다. R1617 도 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현될 수 있다. R1617는 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의 유사한 발현은, R1617이 식물의 생장, 신장 및 대사에 전반적으로 연루되어 있다는 것을 암시한다. 유전자 산물이 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현된다는 것은, R1617이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능, 및 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. R1617 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R1617의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R1617 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R3025도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 19로 나타내어지는 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물이 세포외 분비형이라는 것이 나타났다. R3025 도 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현될 수 있다. R3025는 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의 유사한 발현은, R3025가 식물의 생장, 신장 및 대사에 전반적으로 연루되어 있다는 것을 암시한다. 유전자 산물이 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현된다는 것은, R3025가 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능, 및 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. R3025 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R3025의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R3025 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2391도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A1에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 21로 나타내어지는 서열을 가진다. R2391 도 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현될 수 있다. 유전자 산물이 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현된다는 것은, R2391이 수중 등의 혐기성 조건 하에서의 생장능과 같은 식물의 특성에 기여하는 기능, 및 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. R2391은 성숙기보다 유약기에서 더 현저하게 발현될 수 있다. 유약기의 묘종에서의 현저한 발현은, R2391이 식물의 생장 및 신장, 예를 들어 세포벽의 합성 등에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 R2391FP2 (서열 번호 50)이 있다. R2391 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2391의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2391 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S10927도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A2에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 23으로 나타내어지는 서열을 가진다. S10927은 지상부에서 우선적으로 발현된다. 유전자 산물이 지상부에서 우세하게 발현된다는 것은, S10927이 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 우선적으로 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다. S10927도 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의 유사한 발현은, S10927이 식물의 생장, 신장 및 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 세포벽의 합성 및 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S10927FP1 (서열 번호 52)이 있다. S10927 유전자로부터 유래되는 프로모터는 S10927의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S10927 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S14493도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 A2에 속한다. 이 유전자는 서열 번호 25로 나타내어지는 서열을 가진다. S14493은 지상부에서 우선적으로 발현된다. 유전자 산물이 지상부에서 우세하게 발현한다는 것은, S14493이 지상부의 생장의 촉진 및 유지 (예를 들어 줄기의 신장 등)에 우선적으로 기여하는 기능을 가진다는 것을 암시한다.S14493도 유약기 및 성숙기 동안 유사하게 발현될 수 있다. 유약기 및 성숙기의 묘종에서의 유사한 발현은, S14493이 식물의 생장, 신장 및 대사에 전반적으로 연루되어 있다는 것을 암시한다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S14493FP1 (서열 번호 56)이 있다. S14493 유전자로부터 유래되는 프로모터는 S14493의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S14493 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

prxRPA, 및 상기 prxPRN은 본 발명자들에 의해 단리된 POX이다 (Ito 등 (1994), 참고 문헌 12). prxRPA 유전자는 서열 번호 27로 나타내어지는 유전자 서열을 가지며, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B1으로 분류된다. 상기 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, prxRPA가 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, prxRPA는 산소 스트레스 (예를 들어 UV 및 파라쿼트), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극, 및 마찰 자극에 의해 유도될 수 있다 (실시예 3 내지 5 참조). 따라서, 상기 유전자는 병원체에 대한 방어 및 활성 산소종의 제거에 있어서 그 역할을 하는 것으로 생각된다. prxRPA는 또한 성숙기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 성숙기 동안 현저하게 발현한다는 것은, prxRPA가 성숙기의 식물의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 추정 아미노산서열의 분석에 의하면, 단백질 산물은 세포외 분비형이라는 것이 나타났다. 상기 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 prxRPAFP1 (서열 번호 45) 및 prxRPARP1 (서열 번호 46)를 들 수 있다. prxRPA 유전자로부터 유래되는 프로모터는 prxRPA의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. prxRPA 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2576은 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B1에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, R2576이 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, R2576의 유전자 산물은 산소 스트레스 (예를 들어 UV 및 파라쿼트), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극, 및 마찰 자극에 의해 유도될 수 있다 (실시예 3 내지 5 참조). 따라서, 이 유전자는 병원체에 대한 방어 및 활성 산소종의 제거에 있어서 그 역할을 하는 것으로 생각된다. R2576은 또한 성숙기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 성숙기 동안 현저하게 발현한다는 것은, R2576이 성숙기의 식물의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 29로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물은 세포외 분비형이라는 것이 나타났다. 상기 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는R2576F1 (서열 번호 51)을 들 수 있다. R2576 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2576의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2576 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2184도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B1에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, R2184가 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, R2184의 유전자 산물은 산소 스트레스 (예를 들어 UV), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 및 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극에 의해 유도될 수 있다 (실시예 4 및 5 참조). 또한, 이러한 유도는 조각으로의 절단으로 인한 스트레스에 의해 야기될 수 있다 (실시예 3 참조). 따라서, 본 POX는 특히 식물에 있어서 발생하는 현저한 상해에 대한 방어에 연루되어 있다고 생각된다. 이와 같이, 이 유전자는 병원체에 대한 방어 및 활성 산소종의 제거에 있어서 그 역할을 하는 것으로 생각된다. R2184도 유약기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 유약기 동안의 현저한 발현은, R2184가 식물의 생장 및 신장에 필요하다는 것, 예를 들어 세포벽의 합성에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 31로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물은 액포 국소화형이라는 것이 나타났다. 상기 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 R2184FP1 (서열 번호 49)를 들 수 있다. R2184 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2184의 발현특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2184 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2693도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B1에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, R2693이 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, R2693의 유전자 산물은 산소 스트레스 (예를 들어 UV), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 및 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극에 의해 유도될 수 있다 (실시예 4 및 6 참조). 또한, 이러한 유도는 조각으로의 절단으로 인한 스트레스에 의해 야기될 수 있다 (실시예 3 참조). 따라서, 본 POX는 특히 식물에 있어서 발생하는 현저한 상해에 대한 방어에 연루되어 있다고 생각된다. 이와 같이, 이 유전자는 병원체에 대한 방어 및 활성 산소종의 제거에 있어서 그 역할을 하는 것으로 생각된다. R2693도 유약기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 유약기 동안의 현저한 발현은, R2693이 식물의 생장 및 신장에 필요하다는 것, 예를 들어 세포벽의 합성에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 33으로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물은 세포외 분비형이라는 것이 나타났다. R2693 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2693의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2693 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

C52903도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B1에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, C52903이 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, C52903의 유전자 산물은 산소 스트레스 (예를 들어 UV 및 파라쿼트), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극, 및 마찰 및 절단 스트레스에 의해 유도될 수 있다 (실시예 3 내지 5 참조). 이 POX의 광범위한 범위의 스트레스에 의한 유도성은, 이 유전자가 다양한 스트레스에 대한 방어에서 그 역할을 한다는 것을 암시한다. C52903은 또한 성숙기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 성숙기 동안의 현저한 발현은, C52903이 성숙기 동안의 식물의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 35로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물은 액포 국소화형이라는 것이 나타났다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 C52903FP1 (서열 번호 43)이 있다. C52903 유전자로부터 유래되는 프로모터는 C52903의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. C52903 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

R2329도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B2에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, R2329가 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, R2329의 유전자 산물은 산소 스트레스 (예를 들어 UV 및 파라쿼트), 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극, 및 마찰 및 절단 스트레스에 의해 유도될 수 있다 (실시예 3 내지 5 참조). 이 POX의 광범위한 범위의 스트레스에 의한 유도성은 이 유전자가 다양한 스트레스에 대한 방어에서 그 역할을 한다는 것을 암시한다. R2329도 성숙기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 성숙기 동안의 현저한 발현은, R2329가 성숙기 동안의 식물의 대사에 필요하다는 것, 예를 들어 식물 호르몬인 IAA의 양의 조절에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 37로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 추정 아미노산 서열의 분석에 의하면, 단백질 산물이 세포외 분비형이라는 것이 나타났다. R2329 유전자로부터 유래되는 프로모터는 R2329의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. R2329 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S11222도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열로서, 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 B2에 속한다. 본 유전자의 유전자 산물은 다양한 스트레스에 의해 유도된다. 이는, S11222가 스트레스에 대한 식물의 방어 기작에 연루되어 있다는 것을 암시한다. 구체적으로는, S11222의 유전자 산물은 상해 정보 전달 물질 (예를 들어 MeJA) 자극, 및 에틸렌 방출 인자 (예를 들어 에테폰) 자극에 의해 유도될 수 있다 (실시예 4 참조). 따라서, 이 유전자는 병원체에 대한 방어에 있어서 그 역할을 하는 것으로 생각된다. S11222는 또한 유약기의 묘종에서 현저하게 발현될 수 있다. 유약기의 묘종에서의 현저한 발현은, S11222가 식물의 생장 및 신장에 필요하다는 것, 예를 들어 세포벽의 합성에 필요하다는 것 등을 암시한다. 이 유전자는 서열 번호 39로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S11222FP1 (서열 번호 53)이 있다. S11222 유전자로부터 유래되는 프로모터는 S11222의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S11222 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

S14082도 EST 서열에 기초하여 벼로부터 수득되는 서열이다. 본 명세서에 있어서, 상기 유전자의 발현은 실험에서 전혀 검출되지 않았다. 따라서, S14082는 본 명세서에 기술되어 있는 분류에 따르면 C에 속한다. 상기 유전자는 서열 번호 41로 나타내어지는 유전자 서열을 가진다. 본 유전자에 특이적인 서열을 가지는 프라이머의 예로는 S14082FP1 (서열 번호 55)가 있다. S14082 유전자로부터 유래되는 프로모터는 S14082의 발현 특이성을 반영하는 것으로 생각된다. S14082 유전자 및 그의 호몰로그와, 그로부터 유래되는 프로모터를 이용하는 것은 식물 특성의 변형에 유용하다.

(각각의 유전자 및 그의 호몰로그의 수득 방법과 발현 특이성의 확인 방법)

본 발명의 퍼옥시다제 (POX) 유전자, 및 엄격한 조건 하에서 POX 유전자에 혼성화하는 POX 유전자의 호몰로그는 POX 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 비보존 영역에 해당하는 축중 프라이머 쌍을 사용하여 단리할 수 있다. 상기 프라이머 쌍을 사용하고, 임의의 대상 식물의 cDNA 또는 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 실시할 수 있다. 그 후, 수득된 증폭 DNA 단편을 프로브로 사용하여 동일한 대상 식물의 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 다음, 양성 클론을 선발하여 서열결정함으로써 본 발명의 POX 유전자 또는 그의 호몰로그를 특성화한다.

이와 같이 수득되는 본 발명의 POX 유전자 또는 그의 호몰로그가 소망하는 발현 특이성을 가진다는 것은, 상기 유전자 또는 그의 단편을 선발적 프로브로 사용하여 원래 식물의 발현 특성을 분석함으로써 확인할 수 있다. 이와는 달리, 상기와 같은 소망하는 발현 특이성은, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 POX 유전자를 임의의 식물 내로 도입하여 형질전환 식물을 생성함으로써 확인할 수 있다. 소망하는 발현 특성에 기초하여 적절한 식물 재료로부터 RNA 샘플을 제조하여 노던 블롯으로 분석할 수 있으며, 그에 의해 발현량의 확인 및 비교가 가능해진다.

(프로모터의 특정)

상기 유전자 각각의 프로모터가 코딩 영역의 상류 서열로부터 수득될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 프로모터는 대표적으로는 번역 개시점의 상류의 약 2 kb 범위에 존재하는 서열로서 정의되지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

프로모터 영역은 당 업계에 잘 알려진 방법에 따라 특정할 수 있다. 간략하게는, 프로모터 영역의 후보 서열을 리포터 유전자 (예를 들어 GUS 유전자)에 작동가능하게 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 구축된 발현 카세트를 사용하여 적절한 식물 세포를 형질전환시킨다. 형질전환 세포를 식물로 재생시킨다. 형질전환 식물에서의 리포터 유전자의 발현은 적절한 검출 시줄기 (예를 들어 색소 염색)을 이용하여 검출한다. 검출 결과에 기초하여, 프로모터 영역 및 그의 발현 특성을 확인할 수 있다.

(발현 특이적 POX 유전자를 이용한 식물의 변형 방법)

상기한 바와 같이, 본 발명의 POX 유전자 (구조 유전자) 및 그의 프로모터는, 각각 식물의 특성을 소망하는 방식으로 변형시키기 위한 재료로 유용할 수 있다. 변형시킬 특성은, 식물의 스트레스에 대한 내성, 및 식물의 생장 또는 대사에 관련된 특성 (예를 들어 생장 속도 또는 시기)를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 POX 유전자는, 각각의 유전자가 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 카세트로서 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 본 발명의 프로모터는, 당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 각각의 프로모터가 적절한 이종 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 카세트로서 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "발현 카세트"는, 본 발명의 POX를 코딩하는 DNA, 및 그에 작동가능하게 연결된 식물 유전자 프로모터 (즉, 프로모터는 상기 DNA의 발현을 제어할 수 있음)를 포함하는 핵산 서열, 및 본 발명의 프로모터와 그에 작동가능하게 연결된 (즉, 그에 인-프레임으로 연결된) 이종 유전자를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. 천연의 퍼옥시다제 유전자포함 발현 카세트를, 임의로 다른 조절 요소와 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 범주 이내이다. 바람직한 발현 카세트는 특정 제한 효소에 의해 절단될 수 있으며, 용이하게 회수된다.

본 발명의 프로모터에 연결될 수 있는 "이종 유전자"는, 상기 프로모터가 유래되는 POX 유전자 이외의 본 발명의 POX 유전자, POX 유전자 이외의 식물 내인성 유전자, 또는 식물에 대하여 외래인 유전자 (예를 들어, 동물, 곤충, 세균 및 진균류 유래의 유전자) 중 임의의 것을 나타내되, 단, 이러한 유전자를 포함하는 발현 카세트는 식물 내로 도입되어 유전자의 유전자 산물을 식물 내에서 발현시킬 수 있다.

본 발명의 POX 유전자에 연결될 수 있는 "식물 유전자 프로모터"는 식물에서 발현될 수 있는 임의의 프로모터를 의미한다. 이러한 식물 유전자 프로모터의 예는, 특정 스트레스에 의해 발현이 유도되는 담배 PR1a 프로모터 등, CaMV35S 프로모터, 노팔린 신테타제 프로모터 (Pnos) 등과 같은 프로모터를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

상기 발현 카세트는 바람직하게는 식물 발현 벡터의 형태로 이용된다. "식물 발현 벡터"는, 다양한 조절 요소, 및 구조 유전자와, 발현을 조절하기 위한 프로모터가 숙주 식물의 세포 내에서 작동가능하게 연결되어 있는 핵산 서열을 나타낸다. 조절 요소의 예는 바람직하게는 터미네이터, 약제 내성 유전자, 및 인핸서를 포함한다. 식물 발현 벡터의 유형 및 사용되는 조절 요소의 유형은 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다는 것이 당 업계의 숙련자에게는 잘 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 식물 발현 벡터는 또한 T-DNA 영역을 가질 수 있다. T-DNA 영역은 식물이 특히 아그로박테륨 (Agrobacterium)으로 형질전환될 경우 유전자 도입의 효율을 향상시킬 수 있다.

"터미네이터"는, 유전자의 단백질 코딩 영역의 하류에 위치하며, DNA가 mRNA로 전사되는 경우의 전사의 종결, 및 폴리 A 서열의 부가에 연루되어 있는 서열이다. 터미네이터는 mRNA의 안정성에 기여하며, 유전자 발현량에 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. 이러한 터미네이터의 예는 CaMV35S 터미네이터, 노팔린 신테타제 유전자의 터미네이터 (Tnos), 및 담배 PR1a 유전자의 터미네이터를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

"약제 내성 유전자"는 유전자 산물이 숙주에서 발현되는 경우 숙주에게 약제 내성을 부여하는 유전자를 나타낸다. 약제 내성 유전자는 바람직하게는 형질전환 식물의 선발을 돕는 것이다. 카나마이신 내성을 부여하기 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NPTII) 유전자, 하이그로마이신 내성을 부여하기 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

"인핸서"는 목적 유전자의 발현 효율을 증강시키기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 인핸서로는, CaMV35S 프로모터 내의 상류 서열을 포함하는 인핸서 영역이 바람직하다. 복수개의 인핸서가 사용될 수 있다.

식물 발현 벡터의 구축에 사용하기 위한 벡터로는, pBI 벡터, pUC 벡터, 또는 pTRA 벡터가 바람직하게 사용된다. pBI 및 pTRA 벡터를 사용하여 목적 유전자를 아그로박테륨을 통해 식물 내로 도입할 수 있다. pBI 2성분 (binary) 벡터 또는 중간 벡터가 바람직하게 사용될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3 등을 포함한다. 상기 벡터는 식물 내로 도입되는 영역 (T-영역)의 유전자, 및 식물 프로모터의 제어 하에 발현되는 마커 유전자로서 NPT2 유전자 (카나마이신 내성을 부여함)를 포함한다. pUC 벡터를 이용하여 유전자를 식물내로 직접 도입할 수 있다. pUC 벡터의 예는 pUC18, pUC19, pUC9 등을 포함한다. 식물 발현 벡터는 당 업계의 숙련자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

식물 세포 내로 식물 발현 벡터를 도입할 목적에 있어서는, 당 업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 아그로박테륨을 이용한 간접 방법 및 세포 내로 직접 도입하는 방법이 사용될 수 있다. 상기 아그로박테륨을 사용하는 간접 방법으로는, 예를 들어 Nagel 등 (참고 문헌 19)의 방법을 사용할 수 있다. 상기의 방법에 있어서는, 먼저 아그로박테륨을 전기천공법에 의해 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 이어서 형질전환 아그로박테륨을 Gelvin 등의 문헌 (참고 문헌 20)에 기술되어 있는 방법으로 식물 세포 내로 도입한다. 세포 내로 식물 발현 벡터를 직접 도입하는 방법으로는, 전기천공법 (Shimamoto 등, 참고 문헌 21; 및 Rhodes 등, 참고 문헌 22 참조), 파티클 건 (particle gun) 방법 (참고 문헌 23 참조), 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 방법 (참고 문헌 24 참조)을 들 수 있다. 상기 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 형질전환시킬 식물에 적합한 방법은 당 업계의 숙련자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

식물 발현 벡터가 도입된 세포는 먼저 약제 내성, 예를 들어 카나마이신 내성 등에 따라 선발된다. 그 후, 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 세포를 식물 조직, 식물 기관 및/또는 식물로 재생시킬 수 있다. 또한, 식물로부터 종자가수득될 수 있다. 도입된 유전자의 발현은 노던 방법 또는 PCR 방법에 의해 검출될 수 있다. 유전자 산물인 단백질의 발현은 예를 들어 웨스턴 블롯 방법으로 확인할 수 있다.

본 발명의 POX 유전자 및 프로모터는 단자엽 식물 뿐만 아니라 쌍자엽 식물의 변형에도 이용될 수 있는데, 이는 두 식물 모두가 유사한 게놈 구조를 가지기 때문이다 (Moore 등, 참고 문헌 25, 및 Nagamura 등, 참고 문헌 26). 특히 바람직한 대상 식물의 예로는, 밀, 옥수수, 벼, 보리, 수수, 감귤류, 배추, 상추, 담배, 복숭아, 감자, 토마토, 사과 등을 들 수 있다. POX 유전자는 아라비돕시스 (참고 문헌 27), 일본 포플러 (Japanese aspen) (참고 문헌 28), 고구마 (참고 문헌 29), 벼 (참고 문헌 30) 등의 식물 내로 도입될 수 있음이 입증되었다.

형질전환 세포로부터 재생시킨 식물이 소망하는 변형 특정을 가진다는 것은 특성의 유형에 적절한 분석을 실시함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 스트레스 내성으로서 병원성 세균에 대한 내성을 부여하고자 할 경우, 모델 세균 (예를 들어 슈도모나스 시린가에 피브이. 타바시 (Pseudomonas syringae pv. tabaci)를 재생 식물에 접종하고, 이를 다시 대조 식물과 비교하여 접종으로 인한 변화의 유무를 관찰한다. 그 결과, 특성의 변화를 평가할 수 있다.

이와는 달리, 형질전환 식물의 스트레스 내성은, UV 처리에 대한 내성, 수퍼옥사이드 발생형 제초제 (예를 들어 파라쿼트) 처리에 대한 내성, 및/또는 염 스트레스에 대한 내성 등으로서 평가할 수 있다.

(유전자 발현 분석)

본 발명은 또한 본 발명의 퍼옥시다제 유전자 또는 그의 세트와, 프로모터로부터 유래되는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용한 식물의 특성 분석 방법을 제공한다. 이러한 방법의 예는 노던 블롯 분석 등을 포함한다. 상기 방법은 예를 들어 Sambrook J 등의 문헌 (참고 문헌 60), 참고 문헌 36 등에 개설되어 있다.

(DNA 어레이)

본 발명의 뉴클레오티드는, DNA 어레이를 사용한 유전자 분석 방법에서 사용될 수 있다. DNA 어레이는 (Shujunsha 편저, Saibo-kogaku (Cellular Engineering), Special issue, "DNA-maikuro-arei-to-saisin-PCR-ho [DNA microarray and Up-to-date PCR method]")에 광범위하게 개설되어 있다. 또한, DNA 어레이를 사용한 식물 분석법이 최근에 사용되었다 (참고 문헌 58). 이하, DNA 어레이 및 그를 사용한 유전자 분석 방법을 간략하게 기술한다.

"DNA 어레이"는 DNA를 기판 상에 정렬하여 고정화한 장치이다. DNA 어레이는 기판의 크기 또는 기판 상에 놓여지는 DNA의 밀도에 따라 DNA 마크로어레이, DNA 마이크로어레이 등으로 나뉘어진다.

마크로와 마이크로의 경계는 엄밀하게 결정되지는 않는다. 그러나, 일반적으로 "DNA 마크로어레이"는 DNA를 막 상에 스폿팅 (spotting)한 고밀도 필터를 나타내며, 반면 "DNA 마이크로어레이"는 표면 상에 DNA를 보유하는 유리, 규소 등의 기판을 나타낸다. 놓여지는 DNA의 유형에 따라 cDNA 어레이, 올리고DNA 어레이 등이 존재한다.

반도체 집적 회로 제조를 위한 광 리쏘그래피 (photolithography) 기술을 적용하여 복수개의 올리고DNA가 기판 상에서 동시에 합성되는 고밀도 올리고DNA 어레이를, "반도체 칩"이라는 용어를 채용하여 "DNA 칩"이라고 칭한다. 상기 방법에 의해 제조된 DNA 칩의 예로는 GeneChip (등록상표, Affymetrix, CA) 등을 들 수 있다 (참고 문헌 50 및 51). 바람직하게는 GeneChip는 본 발명에 따른 마이크로어레이를 사용한 유전자 분석에서 사용될 수 있다. DNA 칩은 협의로는 상기와 같이 정의되지만, 모든 유형의 DNA 어레이 또는 DNA 마이크로어레이를 나타낼 수 있다.

이와 같이, DNA 마이크로어레이는 수천 내지 수만개 또는 그를 초과하는 유전자 DNA가 고밀도로 유리 기판 상에 정렬되어 있는 장치이다. 따라서, cDNA,cRNA 또는 게놈 DNA의 혼성화에 의해 게놈 규모로 유전자 발현 프로필 또는 유전자 다형성을 분석할 수 있게 된다. 상기 기술을 사용하여, 시그널 전달 시줄기 및/또는 전사 제어 경로의 분석 (참고 문헌 45); 조직 수복 기작의 분석 (참고 문헌 46); 의약의 작용 기작의 분석 (참고 문헌 47); 발생 및 분화 과정 동안의 유전자의 발현 변동의 광범위한 분석 등; 병태에 따라 발현이 변동되는 유전자 군의 동정; 시그널 전달 시줄기 도는 전사 제어에 연루된 신규 유전자를 찾는 것 등이 가능해진다. 또한, 유전자 다형성에 있어서도 단일 DNA 마이크로어레이를 사용하여 다수의 SNP를 분석하는 것이 가능해진다 (참고 문헌 48).

(DNA 마이크로어레이를 사용한 분석의 원리)

DNA 마이크로어레이를 사용한 분석의 원리를 기술한다. DNA 마이크로어레이는 표면을 적절하게 가공한 고체상 기판, 예를 들어 슬라이드 유리 상에 다수의 상이한 DNA 프로브를 고밀도로 고정화함으로써 제조된다. 그 후, 표식 핵산 (표적)을 적절한 혼성화 조건 하에서 혼성화하고, 각각의 프로브로부터의 시그널을 자동화 검출기로 검출한다. 수득된 데이터를 컴퓨터로 대량 분석한다. 예를 들어, 유전자 모니터링의 경우, 올리고DNA 또는 cDNA를 프로브로 하여 마이크로어레이 상에서 mRNA로부터의 역전사에 의해 형광 표식이 통합된 표적 cDNA를 혼성화하고, 형광 이미지 분석기로 검출한다. 상기의 경우, T7 폴리머라제를 사용하여 cRNA 합성 반응 또는 효소 반응을 통하는 것과 같은 다른 다양한 시그널 증폭 반응을 실시할 수있다. DNA 마이크로어레이 실험의 흐름을 도 23에 예시하였다.

(합성형 DNA 칩)

Fodor 등은 조합 화학과 반도체 제조를 위한 광 리쏘그래피 기술을 조합하여, 기판 상에서 중합체를 합성하는 기술을 개발하였다 (참고 문헌 53). 이는 합성형 DNA 칩으로 칭해진다. 광리쏘그래피는 극히 미세한 표면 가공을 가능하게 하여, 10μm2/DNA 샘플 이라고 하는 집적도가 큰 DNA 마이크로어레이의 제조가 가능해진다. 상기 방법에 있어서는, 일반적으로 약 25 내지 약 30 DNA가 유리 기판 상에서 합성된다.

합성형 DNA 칩을 사용한 유전자 발현은 Lockart 등에 의해 보고되었다 (참고 문헌 54). 상기 방법은 합성 DNA의 길이가 짧기 때문에 특이성이 낮아지는 본 유형의 칩의 결점을 해소하였다. 상기 문제는, 하나의 유전자의 발현을 모니터링하기 위하여 약 10 내지 약 20 영역에 해당하는 완전 매치 (perfect match; PM) 올리고뉴클레오티드 프로브와, PM 프로브의 중앙의 하나의 염기에 변이가 도입된 미스매치 (mismatch; MM) 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조함으로써 해소되었다. 여기에서, MM 프로브는 혼성화 특이성의 지표로서 사용된다. PM 프로브와 MM 프로브 사이의 시그널 비에 기초하여 유전자 발현 수준이 결정될 수 있다. PM 프로브와 MM 프로브 사이의 시그널 비가 실질적으로 1:1일 경우, 교차 혼성화 (crosshybridization)라 칭하는데, 이는 유의한 시그널로는 해석되지 않는다.

(부착형 DNA 마이크로어레이)

소위 부착형 DNA 마이크로어레이는 슬라이드 유리 상에 DNA를 부착함으로써 제조되는데, 형광을 검출한다 (54) (http://cmgm. stanford. edu/pbrown도 참조). 상기 방법에 있어서는, 거대한 반도체 제조기가 필요하지 않으며, DNA 어레이기 및 검출기만을 사용하여 연구실에서 분석을 수행할 수 있다. 상기 방법은 부착 DNA의 선발이 가능하다는 잇점을 가진다. 고밀도 어레이는, 예를 들어 직경 100 μm의 스폿을 100 μm 간격으로 스폿팅함으로써 수득할 수 있다. 수학적으로 cm2 당 2500개의 DNA를 스폿팅하는 것이 가능하다. 따라서, 통상 슬라이드 유리 (유효 면적은 약 4 cm2임)은 약 10,000개의 DNA를 보유할 수 있다.

합성형 DNA 어레이의 표식 방법으로는, 예를 들어 이중 형광 표식법이 사용된다. 상기의 방법에 있어서, 2개의 상이한 mRNA 샘플을 각각 상이한 형광 색소로 표식한다. 2개의 샘플을 동일한 마이크로어레이 상에서 경쟁적 혼성화하고, 두 형광 모두를 측정한다. 형광을 비교함으로써 유전자 발현의 상위를 검출한다. 형광 색소의 예로는 가장 흔히 사용되는 Cy5 및 Cy3 등을 들 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. Cy3 및 Cy5의 잇점은, 형광 파장이 실질적으로 중복되지 않는다는 것이다. 이중 형광 표식법은, 돌연변이 또는 다형성, 및 유전자 발현의 상위의 검출에 사용될 수 있다.

어레이기가 DNA 어레이를 사용하는 분석에 사용될 수 있다. 어레이기에 있어서는, 기본적으로 컴퓨터의 제어 하에서 고성능의 서보 (servo) 모터와 조합하여 핀 팁 또는 슬라이드 홀더를 X, Y 및 Z 축 방향으로 작동시켜 마이크로타이터 플레이트로부터 슬라이드 유리 표면 상으로 DNA 샘플을 전달시킨다. 핀 팁은 다양한 형상으로 가공된다. 예를 들어, DNA 용액은 까마귀의 부리와 같은 갈라진 펜 팁에 보유되어 복수개의 슬라이드 유리 상에 스폿팅된다. 이어서 세정 및 건조 사이클 후, DNA 샘플을 슬라이드 유리 상에 놓는다. 상기 단계를 반복한다. 상기의 경우, 상이한 샘플에 의한 핀 팁의 오염을 방지하기 위하여, 핀 팁을 완전하게 세정 및 건조시켜야 한다. 이러한 어레이기의 예로는 SPBIO2000 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.; 단일 스트라이크형), GMS417 Arrayer (Takara Shuzo Co., Ltd.; 핀 링형), GeneTip Stamping (Nippon Laser & Electronics Lab.; 만년필형) 등을 들 수 있다.

DNA 어레이를 사용한 분석에 사용되는 다양한 DNA 고정화 방법이 존재한다. 기판의 재료로서의 유리는 막과 비교하여 유효 고정 면적 및 하전량이 작기 때문에, 다양한 코팅이 주어진다. 실제, 폴리 L-라이신 코팅 (참고 문헌 55), 실란 피니싱 (참고 문헌 56) 등이 실시된다. 또한, 시판되는 DNA 마이크로어레이 전용의 예비코팅 슬라이드 유리 (예를 들어 폴리카르보이미드 유리 (Nissin Spinning Co.,Ltd.) 등)도 사용될 수 있다. 올리고DNA의 경우, DNA의 말단을 아미노화하여 실란 피니싱 유리에 가교시키는 방법이 이용가능하다.

(cDNA 콜렉션의 제조 방법)

DNA 마이크로어레이는 주로 PCR로 증폭된 cDNA 단편을 보유할 수 있다. cDNA의 농도가 불충분할 경우, 몇몇 경우에 있어서 시그널이 충분히 검출될 수 없다. 충분한 양의 cDNA 단편이 1회의 PCR 작업에 의해 수득되지 않는 경우, PCR을 몇회 반복한다. 수득되는 전체 PCR 산물을 한번에 정제하여 농축시킬 수 있다. 프로브 cDNA는 일반적으로는 다수의 랜덤 cDNA를 보유할 수 있지만, 실험의 목적에 따라 선발 유전자 군 (예를 들어 본 발명의 유전자 또는 프로모터군), 또는 RDA (representational differential analysis)에 의해 수득되는 유전자 발현 변화를 위한 후보 유전자를 보유할 수 있다. 클론의 중복을 회피하는 것이 바람직하다. 클론은 원액 cDNA 라이브러리로부터 제조할 수 있거나, cDNA 클론을 구매할 수 있다.

DNA 어레이를 사용한 분석에 있어서, DNA 마이크로어레이 상에서의 혼성화를 나타내는 형광 시그널은 형광 검출기 등으로 검출된다. 이러한 검출기로는, 종래의 입수가능한 다양한 검출기가 있다. 예를 들어 스탠포드 대학의 연구진은 오리지널 스캐너를 개발하였는데, 이는 형광 현미경과 이동가능한 스테이지의 조합물이다 (http://cmgm.stanford.edu/pbrown 참조). 종래의 겔용 형광 이미지 분석기, 예를 들어 FMBIO (Hitachi Software Engineering), Storm (Molecular Dynamics)등은, 스폿이 그다지 고밀도로 정렬되어 있지 않아도 DNA 마이크로어레이를 판독할 수 있다. 다른 입수가능한 검출기의 예로는 ScanArray 4000 및 5000 (GeneralScanning; 스캔형 (공초점형)), GMS418 Array Scanner (Takara Shuzo; 스캔형 (공초점형)), Gene Tip Scanner (Nippon Laser & Electronics Lab.; 스캔형 (비-공초점형)), Gene Tac 2000 (Genomic Solutions; CCD 카메라형)) 등을 들 수 있다.

(데이터 분석 소프트웨어)

DNA 마이크로어레이로부터 수득되는 데이터의 양은 거대하다. 클론과 스폿의 대응의 관리, 데이터 분석 등을 위한 소프트웨어가 중요하다. 이러한 소프트웨어로는, 각각의 검출 시줄기에 부착되어 있는 소프트웨어가 이용가능하다 (57). 또한, 데이터베이스 포맷의 예로는, Affymetrix에 의해 제안된 GATC (genetic analysis technology consortium)이 있다.

(차등 표시 (differential display) 기술)

본 발명은 차등 표시 기술을 사용한 유전자 분석에도 사용될 수 있다.

차등 표시 기술은 발현이 변동되는 유전자를 검출 또는 동정하는 방법이다. 상기의 방법에 있어서, cDNA를 2가지 이상의 샘플 각각으로부터 제조하고, 임의의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 그 후, 복수개의 생성된 PCR 산물을 겔 전기영동으로 분리한다. 전기영동 패턴의 생성 후, 각각의 밴드 사이의 상대적 시그널 강도 변화에 기초하여 발현이 변동하는 유전자를 클로닝한다.

이상, 본 발명의 유전자, 유전자 군, 그의 사용 방법, 및 DNA 어레이를 사용한 분석 방법을 상세하게 기술하였다. 이하에는, 본 발명의 실시예를 기술한다.

이하에 기술하는 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지만, 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하는 것은 아니다. 따라서, 당 업계의 숙련자는 본 발명의 범주를 벗어남이 없이 실시예에 기술된 사항에 기초하여 본 발명을 변형할 수 있다.

이하의 실시예에서 사용한 시약은, 달리 특정하지 않는 한, Wako Pure Chemical Industries로부터 입수하였음을 알아야 한다.

(실시예 1) POX 유전자의 선발, 서열결정 및 계통 분석

이하의 표 2에 예시한 재료 각각을 사용하여 통상의 방법에 따라 mRNA를 추출하였다. 역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 일정 방향으로 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) (Stratagene) 내로 삽입시켰다. 상기 플라스미드 벡터를 사용하여 숙주 이. 콜라이 (E. coli) 균주 NM522를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환 클론을 랜덤하게 피킹 업 (picking up)하여, -80℃에서 보관하였다. 수득된 cDNA 클론의 유전자 산물을 추정하기 위하여, ABI 373A DNA 서열결정기 (PE Biosystems)를 사용하여 각각의 클론의 부분 염기 서열을 5' 말단으로부터 결정하였다. 서열결정된 서열의 평균 길이는 약 300 bp이었다. 세가지 판독 프레임을 사용하여 수득된 서열로부터 아미노산 서열을 추정하였다. 수득된 아미노산 서열에 대하여 FASTA 알고리즘을 사용하여 NBRF-PIR 데이터베이스에서 유 사성 검색을 실시하였다. 검색 결과, 유사성이 가장 크다는 것을 나타내는, 퍼옥시다제 단백질에 대한 유사성 스코어가 200 이상인 경우는, 상기 스코어를 가지는 클론이 퍼옥시다제에 대해 유의한 상동성을 가지는 벼 유래의 아미노산 서열을 가지는 것으로 간주하였다.

번호	라이브러리 명칭	기관	벡터
C1	BA Callus	배반 유래의 캘러스 (BA 처리)	pBluescriptSK(+)
C2	C(-) Callus	배반 유래의 캘러스 (C 삭제)	pBluescriptSK(-)(λUni-ZAP XR)
C3	NAA Callus	배반 유래의 캘러스 (NAA 및 BA 처리)	pBluescriptSK(-)(λUni-ZAP XR)
C4	Root Callus	뿌리 첨단 유래의 캘러스	pBluescriptSK(-)(λUni-ZAP XR)
C5	GA3 treatment Callus	배반 유래의 캘러스 (GA 처리)	pBluescriptSK(+)
C6	Heat shock Callus	배반 유래의 캘러스 (열 쇼크 처리)	pBluescriptSK(+)
C	Growth Phase Callus	배반 유래의 캘러스 (생장기)	pBluescriptSK(+)
(V)	Developing Seed	발생 중의 종자 (5DAF 내지 15DAF)	pBluescriptSK(+)
E	Flowering Panicle	개화시의 원추 화서	pBluescriptSK(+)
E1	Ripening Panicle	성숙기의 원추 화서	pBluescriptSK(+)
E2	Young panicle3	원추 화서 (10 cm보다 김)	pBluescriptSK(+)
E3	Young panicle1	원추 화서 (3 cm 미만)	pBluescriptSK(+)
E4	Young panicle2	원추 화서 (3 내지 10 cm)	pBluescriptSK(+)
E5	Apical meristem(long)	생장점을 포함하는 미숙 잎 (장일 조건)	pBluescriptSK(+)
E6	Apical meristem(short)	생장점을 포함하는 미숙 잎 (단일 조건)	pBluescriptSK(+)
F1	Early heading lines	잎 (명기 불감성, 단일 1일 처리)	λZAP II
F	Late heading lines	잎 (명기 감수성, 단일 1일 처리)	λZAP II
R	Root	슈트의 뿌리	pBluescriptSK(+)
R1	Chilled Root	슈트의 뿌리	pBluescriptSK(+)
S2	Adult leaf(SD)	성숙 잎 (단일 조건)	pBluescriptSK(+)
S1	Shoot	녹색 슈트	1-9 6; pBluescriptSK(-)(λUni-ZAP XR),101-; pBluescriptSK(+)
S	Etiolated Shoot	황화 슈트	1-9 6; pBluescriptSK(-)(λUni-ZAP XR),101-; pBluescriptSK(+)

퍼옥시다제에 대해 상동성을 가지는 유전자 서열의 일부는 EST 서열로 등록되어 있으며 공개 데이터뱅크 (DDBJ (DNA Data Bank of Japan))로부터 입수가능하다. 그의 URL은 http://www.ddbj.nig.ac.jp/이다.

이하의 실시예에 있어서, 지베렐린 (GA3) 캘러스, 열 쇼크 캘러스, 뿌리, 녹색 슈트, 및 황화 슈트 유래의 cDNA 라이브러리로부터 단리한 cDNA를 사용하였다.본 발명의 클론 중, 두문자가 R인 클론은 라이브러리 R (뿌리)로부터 유래하며, S에 이어 4개의 숫자를 가지는 클론은 라이브러리 S (황화 슈트)로부터 유래하고, S1에 이어 4개의 숫자를 가지는 클론은 라이브러리 S1 (슈트)로부터 유래하며, C5에 이어 4개의 숫자를 가지는 클론은 라이브러리 C5 (GA3 처리 캘러스)로부터 유래하고, C6에 이어 4개의 숫자를 가지는 클론은 라이브러리 C6 (열 쇼크 캘러스)로부터 유래한다.

이와 같이 수득한 퍼옥시다제의 추정 개봉 판독 프레임을 가지는 cDNA 중 34개를 선발하여 양측으로부터 서열결정하였다.

서열결정한 cDNA 중 31개를 선발하였는데, Ito 등 (1994) (참고 문헌 12) 및 Chittoor 등 (1997) (참고 문헌 10)의 문헌에서는 5개의 cDNA가 선발되었다. 총 36개의 cDNA에 있어서, Kimura의 단백질 거리 측정법 (Kimura 등, 참고 문헌 31) 및 근린 연결법 (neighbor joining method) (Saitou 등, 참고 문헌 32, 및 Studier 등, 참고 문헌 33)에 의해 그의 추정 아미노산 서열을 분석함으로써 계통수를 구축하였다. 아미노산 서열의 분석은, 근위 헴 결합 도메인의 상류와 5번째의 시스테인 불변 잔기의 근방과의 사이의 영역에 한정하였다 (상기 부분은, 서양 고추냉이 POX C 이소자임의 글라이신 168 내지 프롤린 210의 영역에 해당함). 이는, 상기 영역이 각각의 POX의 생리적 기능을 결정하는 촉매 활성에 중요하다는 것이 제안되어 있기 때문이다 (Chittoor 등 (1997), 참고 문헌 10). POX의 특징인 히스티딘잔기 2 및 시스테인 잔기 8이 없는 EST 클론 (34개 중 나머지 3개)는 계통 분석에서 배제하였다.

이와 같이, 36종의 벼 POX를 그의 아미노산 서열에 기초하여 계통 분석하였다. 그 결과를 도 1에 예시하였다.

상기 36종의 벼 POX를 복수개의 클러스터로 분류하였다. 7종의 POX (PIR3, R2576, R2577, R3025, POX8.1, POX5.1 및 S14493)가 동일 클러스터로 분류되었는데, 이들은 복수의 식물에서 발견된 병원체-유도성 POX (Chittoor (1999), 참고 문헌 6)에 대하여 높은 수준의 상동성을 나타내었다. 실제, POX22.3 (PIR3과 동일) 및 POX8.1은, 잔토모나스 오리자에 피브이. 오리자에로 감염된 벼의 잎에서 유도된다는 것이 관찰되었다 (Chittoor (1997), 참고 문헌 10). 이와 유사하게, 도 1에 예시한 다른 클러스터의 POX 유전자는 계통수 상에서의 그의 근사성에 따라 공통되거나 관련된 역할을 가진다고 생각된다. 대표적인 POX 유전자를 상기 클러스터로부터 균일하게 선발하여 이하의 실시예에서 사용하였다. 선발 유전자명을 도 1에서 박스로 나타내었다.

(실시예 2) 생장 단계 및 식물 부분으로부터 유래된 벼 퍼옥시다제의 발현의 변화

(벼의 생장)

벼 (오리자에 사티바 씨브이. 니폰베어 (Oryza sativa cv. Nipponbare))를 온실 (20 내지 32℃)에서 재배하였다. 5일령의 어린 묘종의 뿌리 및 지상부를 수득하고, 16일령의 성숙 묘종의 뿌리, 엽초 및 엽신을 수득하였다. 상기 재료를 이하의 실험에서 사용하였다.

(유전자 발현의 분석)

유전자의 발현 분석은 ATA법 (Nagy 등, 참고 문헌 35)으로 단리한 전체 RNA를 RNA 겔 블롯 분석함으로써 수행하였다.

도 1에서 박스로 나타낸 21종의 POX 유전자의 3' 비번역 영역을 포함하는 cDNA 단편을 PCR 방법으로 증폭시켰다. 증폭 단편을, RNA 겔 블롯 분석을 위한 개개의 POX 유전자에 특이적인 프로브로 사용하였다. 각각의 클론-특이적 프로브의 제조에 사용한 주요 서열 (서열 번호 43 내지 59)를 표 3에 예시하였다.

각각의 POX 에 특이적인 PCR 프로브

프라이머	서열번호	서열(5' - 3')	길이(bp)	온도(℃)
C52903FP1	43	TGTGCCCGTCGAACGCGTCG	20	63
C62847FP1	44	TGCCCGCTCAGCTACAGC	18	60
prxRPAFP1	45	AACCTCCAGAGCCTCTGTGC	20	59
prxRPARP1	46	AAGGCACATACATTCAGTTC	20	51
R0317F1	47	TCAAGACGTTCGACCTGG	18	55
R1420FP1	48	TTCACCTCTGACGCGGCG	18	60
R2184FP	49	CGACAACAAGTACTACTTCG	20	58
R2391FP2	50	GCCTCTACAACGAGACGG	18	58
R2576F1	51	TCAAGGCCAACTGCCCA	17	55
S10927FP1	52	CGACCTCGCCGCGCTGTCCG	20	67
S11222FP1	53	GACGACGGCGCCCATCGTCG	20	65
S13316FP1	54	GCGACAACACGACGCTGGCG	20	63
S14082FP1	55	TCTTCCACTCCGACTCCGCG	20	61
S14493FP1	56	CGGCGGCGACACCAACCTGG	20	65
S4325F1	57	ATGTTCAGCGCCAAGGGC	18	57
prxRPNFP1	58	CCTCGTCTCCAGCTCCGGCG	20	65
prxRPNRP1	59	TTAAACCATATGGCAGTTGC	20	51

상기 RNA를 전기영동하고, 이어서 막 (HyBond N, Amersham)으로 전사시켰다. 특이적 프로브를 혼성화시키고, 이어서 0.1% SDS를 포함하는 2 x SSC에서 5분 (1회) 및 10분 (2회) 동안 실온에서 세정하고, 이어서 0.1% SDS를 포함하는 1 x SSC에서, 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세정하였다. 그 후, 오토라디오그래피용 필름 (XA OMT, Kodak)를 사용하여, -80℃에서 하룻밤 이상 막에 대하여 오토라디오그래피를 수행하였다. 회수한 필름을, 제조업자의 지시에 따라 BAS2000 Bioimaging 분석기 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) 또는 PhosphorImager SI (Molecular Dynamics)로 분석하였다. RNA의 로딩량은 메틸렌 블루로 염색되는 리보좀 RNA (rRNA)의 수준을 모니터링함으로써 확인하였다. POX의 발현량을 rRNA의 수준을 참조로 하여 서로 비교하였다.

(생장 단계 및 식물 부위에 따른 발현량의 변화)

5일령 및 16일령의 벼 식물 묘종을 상기 방식으로 생성하였다. 각각의 샘플로부터의 전체 RNA를 상기 방식으로 분석하였다. 상이한 생장 단계들, 및 뿌리와 지상부 사이에서 POX의 발현량을 비교하였다. 비교 결과를 도 2A 내지 2C에 예시하였다. POX 유전자의 발현 패턴을 도 3 내지 22에 나타내었다. 도면으로부터 알 수 있듯이, 분석한 21종의 POX 유전자는 생장 단계 및 식물 부위에 따라 다양한 발현 패턴을 나타내었다. S14802를 제외하고는, 분석한 모든 POX 유전자가 5일령 및 16일령의 묘종 둘 모두의 뿌리에서 mRNA를 발현하였다. 17종의 POX 유전자의 전사체가 지상부 (엽초 및 엽신을 포함)에서 검출되었다.

16일째에 발현되는 POX 유형은 5일령의 묘종과 비교하여 그 수가 감소되었다. 그 이유는, 생장 단계에서 특히 필요한 POX가 단지 유약기에서만 발현되며 생장 후에는 더이상 사용되지 않기 때문인 것으로 생각된다.

본 실시예의 결과에 따라, 분석한 21종의 POX 유전자를 A1, A2, B1, B2 및 C의 5개의 클래스로 분류하였다. 이러한 클래스를 도 1의 박스에 인접하여 기술하였다. 부위 특이성에 있어서, 뿌리/지상부의 발현비가 약 4/6 이상인 것을 "뿌리≥지상부"로 분류하며, 반면, 부위 특이성에 있어서 상기 비가 상기 값 미만인 것을 "뿌리 < 지상부"로 분류하였다.

R2151 및 R3025 이외의 A1 군에 속하는 9종의 POX 유전자는 16일령의 엽신에서 검출되지 않았다. R2151 및 R3025에 있어서는, 16일령의 식물의 엽신에서 상당량의 전사체가 검출되었다. 이는, A1군의 POX 유전자가 식물 생장의 기초 대사 (예를 들어 세포벽 단백질과 페룰롤릴화 폴리사카라이드의 가교, 목질화, 코르크화, 및 옥신 분해)에 연루되어 있다는 것을 암시한다. R2151, S4325, R2877, R1420, prxPRN, S13316 및 R3017은 뿌리에서 우선적으로 발현되며, 반면, R1617, R2391, R3025 및 C62847은 뿌리 및 지상부에서 유사하게 발현되었다. 따라서, 상기 유전자를 A1군으로 분류하였다. 부위 특이성에 의하면, 각각의 POX 유전자는 유전자가 발현되는 부위에서 그 역할을 한다는 것이 나타났다. S10927 및 S14493에 있어서, 그의 발현 수준은 뿌리에서보다 지상부에서 더 높았다. 따라서, 상기 유전자를 A2 군으로 분류하였다. 상기 pOX 유전자는 지상부에서 기초적인 역할을 한다고 생각된다. 또한, 이하의 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, A1 및 A2 군에 속하는 POX 유전자는 스트레스 자극에 대하여 응답하지 않았는데, 이는 상기 유전자가 환경 스트레스에 의해 저해되지 않는 기초적 역할을 한다는 것을 나타낸다.

R2693, prxPRA, R2576, R2184 및 C52903 유전자는 뿌리에서 우선적으로 발현되었다. 따라서, 상기 유전자를 B1 군으로 분류하였다. R2329 및 S11222는 지상부에서 우선적으로 발현되었다. 따라서, 상기 유전자를 B2 군으로 분류하였다. 이러한 B군 유전자는 이하의 실시예에 나타내어져 있는 바와 같이 스트레스에 응답하였다.

(실시예 3) 물리적 스트레스 자극에 대한 벼 퍼옥시다제의 유도성

실시예 2에 기술되어 있는 조건 하에서, 16일령의 묘종을 생성하였다. 상기 묘종을 사용하여 물리적 스트레스로서 절단 스트레스 및 마찰 스트레스에 대한 퍼옥시다제의 유도성을 분석하였다. 절단 스트레스는, 시판되는 전정 전단기로 엽신의 첨단을 절단함으로써 주어졌다. 마찰 스트레스는 카보런덤 (caborundum) #600 (Nacalai Tesque)를 사용하여 손으로 엽신 전체를 마찰함으로써 주어졌다.

실시예 2에 기술된 방식으로 자극을 준 벼 식물의 엽신으로부터 RNA를 추출하였다. 각각의 POX에 있어서, 발현 특이성을 분석하였다. 대조로서, 스트레스를 주지 않은 엽신을 사용하였다. 분석 결과를 도 2A 내지 2C에 예시하였으며, 개개의 유전자로부터의 결과를 도 3 내지 22에 예시하였다. 처리한 식물 또는 엽신 절편을 연속적인 조사 (200 μE/m2/s) 하에서 25℃에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 샘플링하였다.

B1에 속하는 C52903 및 B2에 속하는 R2329에 있어서, 그의 유전자 발현은 절단 스트레스 및 마찰 스트레스 둘 모두에 응답하였다. B1에 속하는 prxRPA 및 R2576 유전자에 있어서, 그의 발현은 단지 마찰 스트레스에 의해서만 유도되었다. B1에 속하는 R2693 및 R2184에 있어서, 엽신을 작은 조각으로 절단했을 경우에 발현이 유도되기는 하였지만 (데이터는 예시하지 않음), 본 실시예에서 실시한 절단 스트레스 또는 마찰 스트레스에 의해서는 발현이 유도되지 않았다. 이는, 유사 절단 스트레스에 의해 그 처리 방법에 따라 발현 유도 특이성이 상이해진다는 것을 암시한다. 절단 및 마찰 스트레스 둘 모두는 상해 스트레스를 야기한다. 이러한 상해 스트레스는 정상적인 식물의 생장 및 재생을 저해하여, 병원체가 식물 조직을 용이하게 침입할 수 있다는 것이 알려져 있다. 따라서, 상해 스트레스로부터의 회복 과정에 있어서, 코르크화, 목질화, 및 세포벽 단백질 가교 등의 다양한 단계에서 퍼옥시다제 유전자의 발현이 특이적으로 제어된다는 것이 나타났다.

특정 상해 스트레스 유도성 POX 유전자는 병원체에 의해 유도될 수 있다 (Chittoor (1997), 참고 문헌 10, 및 Mohan 등, 참고 문헌 37). 따라서, 본 실시예에서 예시한 상해 스트레스 유도성 POX도 병원체 감염에 대한 방어 시줄기에 연루되어 있다고 생각된다.

(실시예 4) 에테폰 및 MeJA에 대한 벼 퍼옥시다제의 유도성

실시예 2에 기술한 조건 하에서 16일령의 묘종을 생성하였다. 상기 묘종을 사용하여, 에테폰 (에틸렌 방출 인자) 및 MeJA (상해 정보 전달 물질)에 대한 벼 퍼옥시다제의 유도성을 분석하였다. 에테폰 자극에 있어서는, 0.05% 에탄올을 포함하는 1 mM 에테폰 용액을 사용하였다. MeJA 자극에 있어서는, 0.125%의 트리톤X-100을 포함하는 25 μM MeJA 용액을 사용하였다. 상기 용액을 전체 식물에 분무하고, 48시간 동안 유지하였다.

실시예 2에 기술된 방식으로 자극한 벼 식물의 엽신으로부터 RNA를 추출하였다. 각각의 POX에 있어서, 발현 특이성을 분석하였다. 대조로서, 스트레스를 주지 않은 엽신을 사용하였다. 분석 결과를 도 2A 내지 2C에 예시하였으며, 개개의 유전자로부터의 결과를 도 3 내지 22에 예시하였다.

에테폰은 에틸렌 방출 인자로 알려져 있다. MeJA는 상해 정보 전달 물질 등으로 기능하는 것으로 알려져 있다. 상기 인자는 R2693, R2329, S11222, prxRPA, R2576, R2184 및 C52903 POX 유전자의 발현을 유도하였다. 상기 유전자는, 실시예 3 및 실시예 5와 유사한 방식으로 상해 스트레스, 약제 스트레스 및 UV 스트레스에 의해 유도되었다. 따라서, 자스민산 (JA) 및 에틸렌은 벼 POX 유전자의 스트레스 유도성 발현에 있어서의 시그널 화합물이라고 생각된다. 실제, JA는 상해 벼 식물에 있어서, 국소적으로, 또는 전체적으로 축적된다 (Schweizer 등, 참고 문헌 38, 및 Schweizer 등, 참고 문헌 39). 따라서, 상기 7개의 MeJA 유도성 POX 유전자는 병원체 유도성이라고 생각된다.

(실시예 5) 산화 스트레스에 대한 벼 퍼옥시다제의 유도성

실시예 2에 기술되어 있는 조건 하에서 16일령의 묘종을 생성하였다. 상기 샘플을 사용하여 산화 스트레스로서의 자외광 자극 및 파라쿼트에 대한 벼 퍼옥시다제의 유도성을 분석하였다. 파라쿼트에 있어서는, 1 μM 파라쿼트 용액을 사용하였다. 파라쿼트 자극을 주기 위하여, 엽신 절편을 1 μM 용액에서 48시간 동안 현탁시켰다. 자외광 자극은, 멸균수에 현탁시킨 엽신 절편에 175 μW/cm2의 자외광을 7분 동안 조사함으로써 주었다. 자외광원으로는, 멸균 램프 (GL-15, NEC)를 사용하였다.

실시예 2에 기술한 방식으로 자극 벼 식물의 엽신으로부터 RNA를 추출하였다. 각각의 POX에 있어서, 발현 특이성을 분석하였다. 대조로서, 자극을 주지 않은 엽신을 사용하였다. 분석 결과를 도 2A 내지 2C에 예시하였으며, 개개의 유전자로부터의 결과를 도 3 내지 22에 예시하였다.

도 2A 내지 2C로부터 알 수 있듯이, R2329, prxRPA, R2576 및 C52903의 경우 파라쿼트에 의해 발현이 유도되었다. 또한, R2693, R2329, prxRPA, R2576, R2184 및 C52903의 경우에는, 자외광 조사에 의해 발현이 유도되었다. 이들은, 그의 발현이 상해 스트레스에 의해 유도되는 것과 동일한 군의 퍼옥시다제이다. 또한, 파라쿼트 처리에 의해 야기되는 발현 패턴은 상해 스트레스에 의해 유도되는 것과 유사하였다.

파라쿼트는 비선발적인 접촉성의 제초제이다. 파라쿼트는 틸라코이드 막을 통한 프로톤 전이를 저해하여, 활성 산소종의 생성 및 에너지 고갈을 일으킨다 (Babbs 등, 참고 문헌 40). 자외광은 H2O2의 축적을 야기한다고 보고되어 있다 (Murphy 등, 참고 문헌 41). 다양한 유형의 퍼옥시다제 중, 아스코르브산 퍼옥시다제가 식물에 있어서의 유일한 H2O2 제거 효소라고 생각된다 (Asada, 참고 문헌 42). 최근의 생화학적 연구의 진전은, 본 발명의 퍼옥시다제를 포함하여 클래스 III 퍼옥시다제도 H2O2의 제거에 연루되어 있음을 암시한다 (Mehlhorn 등, 참고 문헌 43, 및 Kvaratskhelia 등, 참고 문헌 44). 본 실시예에 나타내어져 있는 바와 같이 파라쿼트에 의해 유도되는 퍼옥시다제는 활성 산소종에 의해 발생하는 H2O2 등의 독성제거에 연루되어 있다고 생각된다.

(실시예 6) 벼 고사병균 (마그나포르테 그리세아 (Magnaporthe grisea)을 접종한 식물에서의 RNA 발현 패턴의 분석 및 마커 유전자로서의 POX 유전자

다음, 본 발명의 POX 유전자 군과 벼 고사병과의 상관 관계를 조사하였다. 실험 계통으로서, 3종의 벼, 즉, 벼 고사병 감수성 벼 (오리자 사티바 씨브이. 니폰베어) (이하, 본 실시예에서 친화성 (compatible) 또는 -Pi-i로 칭함), 벼 고사병 내성 벼 (오리자 사티바 씨브이. 니폰베어) (본 실시예에서 비친화성 또는 +Pi-i로 칭함 (일본 국립 농업 연구 센터로부터 입수 가능함; 문헌 61 참조), 및 친화성의 벼에 벼 고사병 예방 농약인 프로베나졸 (Meiji Seika Kaisha Ltd.로부터 오라제메이트 (Oryzemate) 입제로서 입수가능함) (100 mg/ml)을 8엽기 (6주령, 높이는 거의 40 cm임)에 처리한 것을 사용하였다. 각각의 식물을 온실 (20 내지 32℃)에서 재배하였다.

각각의 계통의 벼 식물에 벼 고사병균 (엠. 그리세아 레이스 (M. grisea race(003)) (1 x 105 포자/ml)을 처리하였다. 처리 시점을 0일째로 하였다 (프로베나졸 처리군은 프로베나졸 처리 2일 후 벼 고사병균으로 처리함). 전체 RNA를, 처리 직전, 및 처리 2, 3, 4 및 5일 후에 상기에 기술한 방식으로 제조하고, 본 발명의 POX 유전자를 사용하여 노던 분석하였다. 본 실험에서는 R2184, R2576, R2693 및 C52903 (B1 군), R2329 및 S11222 (B2 군), R3025 (A1 군), 및 prxRPA (B1 군)을 사용하였다. 결과를 도 24에 예시하였다.

다음, 벼 고사병균에 의해 야기되는 병반의 형성을 관찰하였다. 친화성 벼에 있어서는, 병반이 4일 및 5일째에 발견되었다. 그 후, 벼 고사병균 포자의 형성을 관찰하였다. 비친화성 벼에 있어서는, 병반의 형성이 2일 내지 3일째에 발견되었다. 상기 병반은 벼 고사병균을 봉입하는 특유의 형태를 가진다. 그 후, 벼 고사병균 포자의 형성은 발견되지 않았다. 프로베나졸 처리 벼에 있어서, 병반 형성은 비친화성 벼와 유사하게 2 내지 3일째에 발견되었으며, 병반은 친화성 벼의 것과 유사하였다.

R3025 및 prxRPA에 있어서는 유의한 시그널이 전혀 발견되지 않았다 (데이터는 예시하지 않음). 또한, 도 24로부터 알 수 있듯이, E2184, R2576, R2693 및 R2329를 프로브로 사용할 경우, 친화성 벼 및 프로베나졸 처리 벼의 발현 패턴은 병반 형성의 추이 패턴과 유의하게 유사하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 패턴은, 다른 마커 유전자를 사용할 경우의 병반 형성의 패턴의 추이와 일치하였다 (데이터는 예시하지 않음).

이와 같이, 본 발명의 POX 유전자 또는 그의 유전자 군은 스트레스 응답의 예로서 병원성 균, 예를 들어 벼 고사병균 등에 대한 응답 마커로서 이용될 수 있다는 것이 입증되었다.

(실시예 7) DNA 마이크로어레이 상에서의 유전자 발현 분석

다음, POX 유전자 군을 마커로 하여 DNA 마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현을 분석하였다.

실험 계통으로는, 실시예 6에서 사용한 3 계통을 사용하였다. 실시예 6과 유사한 시점에서 상기 3 계통으로부터 샘플을 제조하였다.

3종 이상의 본 발명의 POX 유전자 군 (예를 들어 R2184, R2576, R2693 등),대조 유전자 (예를 들어 종래의 POX 유전자), 기타 마커 유전자 등을 DNA 마이크로어레이 상에 결합 및 고정화하였다. DNA는 http://cmgm.stanford.edu/pbrown 등에 기술된 방법에 따라 고정화하였다.

다음, 상기에서 제조한 전체 RNA로부터 mRNA를 단리하고 (Qiagen Midi KIT, Chatsworth, CA), Superscript II 역전사효소 (Life Technologies, Grand Island, NY) 및 올리고(dT)를 사용하여 제조 업자에 의해 권고되는 방법에 따라 전사시켰다. 수득된 cDNA를 37℃에서 30분 동안 1 유닛의 RNase H로 처리하고, Centricon-30 여과 컬럼 (Amicon, Bervely, MA)을 사용하여 정제하여 20 ㎕ 미만으로 농축하였다. Cy-3 표식 dUTP 또는 Cy-5 표식 dUTP (각각은 Amersham으로부터 입수가능함)를 사용하여 랜덤 프라이머 중합 반응으로 상기 양의 1/10의 cDNA를 표식하였다. 랜덤 프라이머 중합 반응을 수행하기 위해서, 간략하게는, 20 ㎕의 표식 반응 혼합물 (2 ㎕의 10 x 클레나우 (Klenow) 완충 용액 (United States Biochemical)), 0.5 ㎕의 형광 dUTP (25 nmol), 3 ㎕의 랜덤 프라이머 (Life Technologies), 각각 2 ㎕의 250 μM dATP, dCTP, 및 dGTP 및 90 ㎕의 dTTP와, 1 유닛의 클레나우 효소 (United States Biochemical))에 cDNA를 첨가하였다. 37℃에서의 3시간의 인큐베이션 후, 두 반응 산물 (즉, Cy-3 및 Cy-5)를 조합하고, Centricon-30 스핀 여과 컬럼을 사용하여 농축 정제하였다. 그 후, 상기 샘플을 동결건조시키고, 14 ㎕의 혼성화 완충 용액 (상기)에 용해시키고, 이어 99℃에서 열 변성시켰다. 수득한 샘플을 DNA 마이크로어레이에 적용하였다.

POX 유전자 군을 고정화한 DNA 마이크로어레이에 상기와 같이 제조한 형광 혼성화 프로브를 첨가하였다. 마이크로어레이를 22 x 22 mm2 Hybrislip (Research Products International)로 덮었다. 그 후, 상기 슬라이드를 내수성 혼성화 챔버에 넣고, 이어서 65℃에서 12 내지 16시간 동안 수조에서 혼성화하였다. 혼성화 후, 0.03% SDS를 포함하는 1 x SSC, 이어서 0.2 x SSC 및 0.05 x SSC에서 슬라이드를 세정하였다. 슬라이드를 ScanArray 3000 (GSI Lumonics, Oxnard, CA)으로 스캐닝하였다. 스캐닝은 또한 혼성화 전의 슬라이드에 대해서도 실시하였다.

그 후, 수득된 형광에 대한 조 데이터 (raw data)를 보정하였다. 시간에 따른 발현량의 변화가 거의 없을 경우, 총 유전자 발현량이 변동하지 않는다고 생각한다. 스폿으로부터 수득되는 형광 시그널 총계 또는 중간값으로부터 보정 계수를 산출하여 형광 강도를 보정하였다 (총체적인 보정으로 칭함) (참고 문헌 59). 이와는 달리, 상이한 계통의 비교에 의해 하나의 종류의 세포의 발현량이 상이하다고 생각될 수 있는 경우에는, 하우스키핑 (housekeeping) 유전자와 같이 발현량이 일정한 유전자로부터의 형광 시그널로부터 보정 계수를 산출하였다. 또한, 형광 표식시에 내부 표준을 사용한 방법을 사용할 수 있다.

이와 같이 수득된 보정 데이터에 기초하여, 본 발명의 POX 유전자 군과 벼 고사병균에 의한 감염에 의해 야기되는 유전자 발현 패턴의 변화의 추이와의 상관관계를 동시에 분석할 수 있다.

(발명의 효과)

상기한 바와 같이, B1 및 B2에 속하는 모든 퍼옥시다제 (POX) 유전자는 5일령 및 16일령의 묘종에 있어서 뿌리에서 구성적으로 발현되었다. prxRPA를 제외하고는, 상기 유전자는 지상부에서 다양한 수준으로 구성적으로 발현되었다. 이러한 결과에 따라, 본 발명자들은 B1 및 B2에 속하는 유전자가 식물에 있어서 생장 과정에서의 기초 대사의 조절 및 스트레스 응답성 반응에 연루된다고 추측하였다.

R2184 및 C52903은 B1에 속한다. 상기 2종의 POX는 추정 N-말단 시그널 펩티드 및 C-말단 신장을 가진다. 이러한 구조는, 상기 POX가 액포에 국소화되어 있음을 암시한다. 반대로, B1에 속하는 R2693, prxRPA 및 R2576과, B2에 속하는 R2329 및 S11222는 단지 추정 N-말단 시그널 펩티드만을 가진다. 따라서, 후자는 세포 외부로 방출되는데, 즉, 이들은 아포플라스트성 펩티드일 것으로 생각된다. 상해 스트레스 및 파라쿼트 처리는 아포플라스트성 (R2329, prx2576 및 R2576) 및 액포성 (예를 들어 R2184 및 C52903) POX 둘 모두의 발현을 유도하였다. 따라서, 액포성 POX 및 아포플라스트성 (즉, 세포외 분비형) POX를 포함하여 상이한 특성을 가지는 복수개의 POX는 동일한 생리적 반응에서 상이하게, 또는 협조적으로 기능한다고 생각된다. 다양한 POX가 단일 식물에 포함되어 있는 이유 중 하나는, 식물생리를 상기와 같이 미소하게 제어해야 하기 때문인 것으로 생각된다.

본 발명의 개시에 의하면, 벼과 식물 품종을 포함하여 임의의 식물의 특성을 평가하기에 유용한 퍼옥시다제 (POX) 유전자 세트가 제공된다. 또한, 다양한 발현 특이성을 가지는 다양한 POX 유전자 및 그의 프로모터가 제공된다. 이러한 유전자 및 프로모터는 소망의 특성을 부여하기 위하여 식물을 변형시키기 위한 재료로 유용하다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 유전자 및 그의 프로모터를 사용하여 식물에서의 유전자 발현을 분석할 수 있다.

(참고문헌)

Claims

식물의 특성 평가에 유용한 퍼옥시다제 유전자 세트로서,

(A1) 하기:

(1) 서열 번호 1의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(2) 서열 번호 3의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(3) 서열 번호 5의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(4) 서열 번호 7의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(5) 서열 번호 9의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(6) 서열 번호 11의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(7) 서열 번호 13의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(8) 서열 번호 15의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(9) 서열 번호 17의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(10) 서열 번호 19의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(11) 서열 번호 21의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 뿌리 발현형 구성적 유전자의 서브세트;

(A2) 하기:

(12) 서열 번호 23의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;및

(13) 서열 번호 25의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 지상부 발현형 구성적 유전자의 서브세트;

(B1) 하기:

(14) 서열 번호 27의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(15) 서열 번호 29의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(16) 서열 번호 31의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편;

(17) 서열 번호 33의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(18) 서열 번호 35의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 뿌리 발현형 스트레스 유도성 유전자의 서브세트;

(B2) 하기:

(19) 서열 번호 37의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편; 및

(20) 서열 번호 39의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

으로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 지상부 발현형 스트레스 유도성 유전자의 서브세트; 및 임의로

(C) 하기의 유전자:

(21) 서열 번호 41의 서열을 가지는 DNA, 그의 호몰로그, 또는 그의 단편

을 포함하는 퍼옥시다제 유전자 세트.
하기 중 어느 하나의 퍼옥시다제 유전자:

(a) 서열 번호 3의 50 내지 1021 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(b) 서열 번호 5의 108 내지 1109 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(c) 서열 번호 7의 66 내지 1046 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(d) 서열 번호 9의 71 내지 1078 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(e) 서열 번호 11의 134 내지 1108 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(f) 서열 번호 13의 75 내지 1058 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(g) 서열 번호 15의 136 내지 1147 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(i) 서열 번호 17의 29 내지 997 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(j) 서열 번호 19의 14 내지 997 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(k) 서열 번호 21의 110 내지 1090 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(l) 서열 번호 23의 53 내지 1033 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(m) 서열 번호 25의 20 내지 982 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(n) 서열 번호 29의 81 내지 1025 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(o) 서열 번호 31의 44 내지 1084 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(p) 서열 번호 33의 68 내지 1114 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(q) 서열 번호 35의 31 내지 1101 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(r) 서열 번호 37의 34 내지 1089 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA;

(s) 서열 번호 39의 52 내지 1062 위치의 서열을 가지는 퍼옥시다제 DNA; 또는

(t) 엄격한 조건 하에서 (a) 내지 (s) 중 하나의 서열과 혼성화하는 서열을 가지며, 상기 하나의 서열에 의해 코딩되는 퍼옥시다제와 동일한 발현 특이성을 가지는 퍼옥시다제를 코딩하는 유전자.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 상기 퍼옥시다제 유전자와 동일한 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33 및 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 뿌리 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 15, 17, 19 및 21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 뿌리 및 지상부에서 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 23, 25, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 지상부 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 21, 23 및 25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 구성적인 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 11 및 19로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 스트레스 감소성 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
퍼옥시다제 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 퍼옥시다제 유전자, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 스트레스 유도성 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에 존재하는 프로모터.
발현 카세트의 제조 방법으로서, 하기:

(1) (a) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 퍼옥시다제 유전자; 또는

(b) 엄격한 조건 하에서 상기 퍼옥시다제 유전자와 혼성화하며 상기 퍼옥시다제 유전자와 동일한 특이적 발현 활성을 가지는 퍼옥시다제 유전자

를 제공하는 단계;

(2) (a) 또는 (b)의 퍼옥시다제 유전자의 코딩 영역의 상류측에서 프로모터 활성을 가지는 영역을 특정하는 단계; 및

(3) 상기 프로모터 활성을 가지는 특정된 영역을 이종 유전자에 작동가능하게 연결시키는 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 따른 퍼옥시다제 유전자 세트를 사용하여 식물의 특성을 분석하는 방법으로서, 하기:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

제1항에 따른 퍼옥시다제 유전자 세트를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 퍼옥시다제 유전자 세트와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

상기 표식 퍼옥시다제 유전자로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
제2항에 따른 퍼옥시다제 유전자를 사용하여 식물의 특성을 분석하는 방법으로서, 하기:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

제2항에 따른 퍼옥시다제 유전자를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 퍼옥시다제 유전자와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

상기 표식 퍼옥시다제 유전자로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 특성이 벼 고사병균 (rice blast fungus)에 대한 응답인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 유전자가 서열 번호 29, 31, 33 및 37로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자인 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 벼과 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 프로모터로부터 유래되는 서열을 사용하여 식물의 특성을 분석하는 방법으로서, 하기:

샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 막에 결합시키는 단계;

제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 프로모터로부터 유래되는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 표식시키는 단계;

상기 막을 표식 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및

표식 올리고뉴클레오티드로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
DNA 마이크로어레이 (microarray)를 사용한 유전자 발현의 분석 방법으로서, 하기:

(a) DNA 마이크로어레이 상에 제1항에 따른 퍼옥시다제 유전자 세트를 고정화하는 단계;

(b) 식물로부터 2종류 이상의 샘플을 제조하는 단계;

(c) 상기 샘플을 표식시키는 단계;

(d) 상기 표식 샘플을 DNA 마이크로어레이와 혼합하여 혼성화하는 단계; 및

(e) 상기 혼성화한 DNA 마이크로어레이를 세정하고, 표식으로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현의 분석 방법으로서, 하기:

(a) DNA 마이크로어레이 상에 제2항에 따른 퍼옥시다제 유전자를 고정화하는 단계;

(b) 식물로부터 2종류 이상의 샘플을 제조하는 단계;

(c) 상기 샘플을 표식시키는 단계;

(d) 상기 표식 샘플을 DNA 마이크로어레이와 혼합하여 혼성화하는 단계; 및

(e) 상기 혼성화한 DNA 마이크로어레이를 세정하고, 표식으로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현의 분석 방법으로서, 하기:

(a) DNA 마이크로어레이 상에 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 프로모터로부터 유래되는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 단계;

(b) 식물로부터 2종류 이상의 샘플을 제조하는 단계;

(c) 상기 샘플을 표식시키는 단계;

(d) 상기 표식 샘플을 DNA 마이크로어레이와 혼합하여 혼성화하는 단계; 및

(e) 상기 혼성화한 DNA 마이크로어레이를 세정하고, 표식으로부터 유래되는 시그널을 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 하기:

(f) 상기 검출된 시그널을 보정하는 단계

를 포함하는 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 하기:

(g) 상기 검출된 시그널 또는 보정된 시그널을 분석 소프트웨어로 분석하는 단계

를 포함하는 방법.