WO2001038536A1 - POLYPEPTIDE GlmU ET ADN CODANT POUR CE POLYPEPTIDE - Google Patents

POLYPEPTIDE GlmU ET ADN CODANT POUR CE POLYPEPTIDE Download PDF

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WO2001038536A1
WO2001038536A1 PCT/JP2000/008120 JP0008120W WO0138536A1 WO 2001038536 A1 WO2001038536 A1 WO 2001038536A1 JP 0008120 W JP0008120 W JP 0008120W WO 0138536 A1 WO0138536 A1 WO 0138536A1
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polypeptide
dna
phosphate
acetylglucosamine
transformant
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PCT/JP2000/008120
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Inventor
Kazuo Nagai
Masaaki Wachi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07023—UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase (2.7.7.23)

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having N-acetylglycosamine-1-peridyl phosphate transferase (hereinafter abbreviated as GlmU) activity, a DNA encoding the polypeptide, and a recombinant DNA containing the DNA.
  • GlmU N-acetylglycosamine-1-peridyl phosphate transferase
  • landscape N-acetylglycosamine-1-peridyl phosphate transferase
  • N-Acetylglucosamine-11-phosphate-pyridyltransferase (G 1 mU) is a biosynthesis intermediate of bacterial cell wall and lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. It is an enzyme that catalyzes the production of acetylglycosamine (hereinafter abbreviated as UDP-GlcNAc).
  • UDP-GlcNAc acetylglycosamine
  • bacteria belonging to the genus Escherichia [J.
  • G 1 mU derived from Escherichia coli has an unstable N-acetylation activity [J. Bacteriol., 176, 6852. (1994)], there is a problem for industrial use.
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide having GI mU activity, a DNA encoding the polypeptide, a method for producing a polypeptide having GI mU activity using the DNA, and a method using the polypeptide.
  • An object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing UDP-GlcNAc.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and found that a gene that complements the temperature sensitivity of a lysozyme-sensitive strain of Corynebacterium glutamicum encodes GI mU polypeptide. Thus, the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (13).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has one or more amino acids deleted, substituted or added, and comprises N-acetylglucosamine.
  • Polypeptides having monophosphate peritransferase activity are:
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above. It is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • polypeptide of the present invention in order for the polypeptide of the present invention to have N-acetylglycosamine-l-monophosphate ditransylase activity, it is necessary to use BLAST (J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)), FASTA When calculated using [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)] and the like, homology of at least 60%, usually 80% or more, particularly 95% or more with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 It is preferable to have
  • polypeptide does not include known polypeptides.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a probe, a colony hybridization method, and a plaque hybridization method. Or the DNA obtained by using the Southern hybridization method.Specifically, 0.7 to 1.0 mol / l using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized.
  • a 0.1- to 2-fold concentration of SSC (saline-sodium citrate) solution [1-fold concentration of SSC solution (150 t-sodium chloride, 15 mmol / l Sodium citrate)]
  • SSC saline-sodium citrate
  • Hybridization is based on Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current Protocols' in' Molecular Biology, DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) etc. Can be performed according to the method described in (1).
  • a hybridizable DNA a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 when calculated using BLAST, FASTA, or the like, preferably 80% DNA having the above homology, more preferably DNA having the homology of 95% or more can be mentioned.
  • the DNA does not include any known DNA.
  • the transformant according to any one of the above (9) to (11) is cultured in a medium, and the N-acetylglucosamine-1-monophosphate-pyridyltransferase activity is cultured in the culture.
  • N-acetylglucosamine 1-phosphate characterized by producing and accumulating a polypeptide having the same, and collecting the polypeptide from the culture.
  • a substrate selected from peridine 5'-triphosphate and N-acetylglucosamine phosphate, and the enzyme source, and in the aqueous medium, peridine 5'-diphosphate-N-acetylglucosamine
  • a method for producing perysine 5'-diphosphate-N-acetylglucosamine comprising collecting peridine 5'-diphosphate-N-acetylglucosamine from the aqueous medium.
  • Glucosamine phosphate is glucosamine monomonophosphate or glucosamine-6-phosphate
  • N-acetyldarcosamine phosphate is N-acetylglucosamine-1-phosphate or N—phosphate.
  • the DNA of the present invention can be prepared from a microorganism belonging to the genus Corynepacterium.
  • the microorganism belonging to the genus Corynebacterium may be any microorganism belonging to the genus Corynebacterium, for example, Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium aimoniagenes), Corynebacterium-Corilebacterium (Corynebacterium) callunae), Corynebacterium glutamicum and the like. Specific examples include Corynebacterium glutamicum ′ (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 strain.
  • Microorganisms belonging to the genus Corynebacterium are subjected to a known method [for example, the method described in Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318 (1993)]. And culture. After culturing, the chromosomal DN of the microorganism is isolated and purified according to a known method [eg, the method described in Current Protocols in 'Molecular' Biology, Agric. Biol. Chem., 49, 2925 (1985)]. I do.
  • the obtained chromosomal DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the DNA fragment is inserted into a vector for Corynebacterium in a conventional manner, for example, according to the method described in, for example, Molecular cloning, Second Edition, etc. Recombinant DNA can be produced.
  • Any vector can be used as long as it can replicate autonomously in microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, and pCGl (JP-A-57-134500) and pCG2 (JP-A-58 -35197), pCG4, pCGll (all JP-A-57-183799), pCE53, pCBlOl (all JP-A-58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 (all Mol.Gen. Genet., 196, 175) (1984)], pAJ1844 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-21619), pHK4 (Japanese Patent Laid-Open Publication No.
  • pHM1519 [Agric. Biol. Chem., 48, 2901, (1985)]
  • pCV35 pECMl [all J. Bacteriol., 172, 1663 (1990)] pC2 [Plasmid, 36, 62 (1996)].
  • the recombinant DNA prepared above is introduced into a lysozyme-sensitive microorganism belonging to Corynebacterium lutamicum.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum
  • a lysozyme-sensitive microorganism belonging to the genus Corynebacterium glutamicum is a wild-type strain if it belongs to Corynebacterium glutamicum and shows lysozyme sensitivity. Any of the lysozyme-sensitive mutants may be used.
  • the wild-type strain is usually lysozyme-sensitive mutant strain, since the growth of 100 g / ml lysozyme is usually not affected at all even if it is present in the medium.
  • the lysozyme-sensitive microorganism refers to a microorganism whose growth is inhibited when a low concentration of lysozyme of 50 / g / ml or less is present in a medium.
  • the lysozyme susceptible microorganism is Corynepacterium glutamicum Using (Corynebacterium glutamicum) as a parent strain, it can be isolated as a mutant strain according to a known method (Japanese Patent Publication No. 62-49038, Japanese Patent Publication No. 29555, Japanese Patent Publication No. 58-56678). Such mutants include Corynebacterium gulcus Mikum
  • Corynebacterium glutamicum ATCC31833 strain isolated from Corynebacterium glutamicum ATCC31834 strain (JP-A-58-56678), or Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain isolated from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain described below.
  • Corynebacterium ⁇ Glutamicum Corynebacterium ⁇ Glutamicum
  • lysozyme-sensitive organisms exhibit temperature-sensitive growth.
  • the lysozyme-sensitive and temperature-sensitive (hereinafter abbreviated as lysozyme / temperature-sensitive) microorganisms cannot grow in a high temperature range (for example, 34 to 39 ° C) even when lysozyme is not present in the medium.
  • Examples of such mutants include Corynebacterium glutamicum LS6 strain isolated from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain described below.
  • the DNA of the present invention can be obtained as DNA that complements the temperature sensitivity of the lysozyme / temperature-sensitive strain.
  • the DNA obtained above is integrated into a vector, and the lysozyme / temperature-sensitive strain is transformed with the vector into which the DNA has been integrated.
  • the transformant is cultured in a medium containing no lysozyme at a temperature at which the lysozyme-sensitive microorganism cannot grow, for example, 34 to 39 ° C, preferably 36 to 38 ° C.
  • a strain that can grow under the temperature conditions is selected as a strain having the desired DNA, and DNA can be obtained from the strain.
  • any method for introducing DNA into the above-mentioned lysozyme / temperature-sensitive microorganism can be used.
  • the plast method [JP-A-57-186492, JP-A-58-56678, J. Bacteriol., 159, 306 (1984)], the electrification method (JP-A-2-207791) and the like can be mentioned.
  • recombinant DNA is conjugated from Escherichia coli of the library by conjugative transfer according to a known method. It can also be introduced into the lysozyme / temperature-sensitive strain of Corynebacterium glutamicum (J. Bacteriol. 172, 1663 (1990), J. Bacteriol. 178, 5768) (1996)].
  • lysozyme / temperature-sensitive strain for example, LB medium [Pacto tryptone (Difco) 10 g / l, yeast extract (Difco) 5 g / l, sodium chloride 5 g / l (pH 7.2)] Incubate in a high temperature range (34-39.C) for 24-72 hours. After the culture, the strain grown on the medium is selected as a strain having the desired DNA.
  • the obtained DNA is used as it is, or after digestion with an appropriate restriction enzyme, etc., and incorporated into a vector by an ordinary method.
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method for example, 373A'DNA Sequencer (manufactured by Perkin-Elma) is used.
  • Jidokishi method using [p roc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] by determining the nucleotide sequence of the DNA.
  • Examples of a vector for incorporating the DNA include pBluescriptKS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7Blue (manufactured by Novazidin), pCR II (manufactured by Invitrogen), pCR-TRAP (manufactured by Genehan Yuichi) and pNoTAT7 (manufactured by 5 Prime to 3 Prime) can be mentioned.
  • Examples of the DNA having the novel nucleotide sequence obtained as described above include DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
  • the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide having an amino acid sequence is coded.
  • strains having a plasmid having DNA having a sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) LS6 / pV5, Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) LS6 / pVll and the like.
  • a primer based on the nucleotide sequence determined as described above is prepared, and the target DNA can be obtained by PCR using the chromosome DNA as a type [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • a target DNA can also be prepared by chemical synthesis using a Perceptive 8905 DNA synthesizer manufactured by Biosystems.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared by subjecting the DNA of the present invention to host cells by the method described in Molecular 'Cloning 2nd edition, Current' Protocols' in 'Molecular' biology, etc., for example, the following method. It can be produced by expressing it.
  • a transformant producing the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • the host cell any cells that can express the target gene, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • An expression vector is one which is capable of autonomous replication in the above-described host cell or capable of integration into a chromosome, and which contains a promoter at a position capable of transcribing DNA encoding the polypeptide of the present invention. Used.
  • a recombinant DNA containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be replicated autonomously in prokaryotes, and at the same time, a promoter and a ribosome can be used. Binding sequence, polypeptide of the invention It is preferable that the vector be composed of a DNA encoding a DNA and a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors include, for example, pC2 [Plasmid, 36, 62 (1996)], pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all sold by Beilinger Ringermannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 ( Invitrogen), pGEMEX-l (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 (Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)), pLSAl (Agric) Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)].
  • the promoter may be any promoter that can be expressed in the host cell.
  • trp promoter evening one (P trp), lac promoter evening one, P L promoter Isseki -, P R promoter evening one, one such T7 promoter Isseki, the flop Romo Isseki one derived from Escherichia coli or phage, etc. I can give it.
  • the promoter evening one obtained by two series of P trp (P trp X 2) , tac promoter evening one, lacT7 promoter Isseki one, also used promoters are for designed modified human as letl Promo Isseki one such be able to.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a liposome-binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • Host cells include the genus Escherichia, the genus Serratia, the genus Bacillus, the genus Brevibacterium, the Corynebacterium, and the Microbacterium.
  • Microorganisms belonging to the genus Pseudomonas such as Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia col i XL2-Blue, Escherichia coli DHK Escherichia coli MC1000, Escherichia col i KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escher col i HB101, Escherichia col i No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia col i NY49, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Baci l lus subti l is Bacillus amyloliquef
  • i Marauder ariophilum ATCC14068 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium f lavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium sp.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • a method using calcium ions for example, a method using calcium ions
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), and YCp50 (ATCC37419).
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, etc. 1, GAP Promote, ADH Promote, gal1 promoter, gal10 promoter, Heat Shock Polypeptide Promote, MF Hi Promote, CUP1 Promote, etc.
  • Examples of the host cell include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Trichosporon, the genus Schwanniomyces, etc. O, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, etc.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • an electrolysis method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)], USA, 84, 1929 (1978), Lithium acetate method [J. BacterioL, 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978).
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), PAGE107 [Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979; Cytotechnology,, 133, (1990)], pAS3-3 (Japanese Patent Laid-open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), REP4 (Invitrogen), pAGE103 [J.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE Eli ediateearly
  • CMV cytomegalovirus
  • early promoter of SV40 retrovirus promoter
  • retrovirus promoter meta mouth choynein promoter
  • heat shock promoter even
  • SR hip mouth promoter etc.
  • enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cell include Namalwa cell which is a human cell, COS cell which is a monkey cell, CH0 cell which is a Chinese hamster cell, and HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299). .
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and the like.
  • polypeptide can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988) and the like.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain the recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the recombinant virus is infected into the insect cells to express the polypeptide. Can be done.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, and pBlueBacII (all manufactured by Invitorogen).
  • baculovirus for example, Atographa, Californi force, Nuclea, polyhedrosis, virus (Autographa cal iiornica nuclear polyhedrosis virus), which is a virus that infects insects of the night moth family, can be used.o
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda ovarian cells Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], and Trichoplusia ovarian cell High 5 (manufactured by Invitrogen) can be used.
  • Methods for co-transferring the above-described recombinant gene into insect cells and the above-mentioned baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), and Lipofexion method. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the expression vector may be, for example, Ti plasmid, evening paco mosaic virus vector, or the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S promoter of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) —Yuichi, Inactin 1 promoter and the like.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • Examples of the host cell include plant cells of tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, wheat, and the like.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, 60-70080, W094 / 00977
  • the electoration method Japanese Patent 60-251887
  • a method using a particle gun (gene gun) Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed by yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture. Ripeptides can be produced.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing the transformant may be a carbon which the organism can assimilate. Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium contains a source, a nitrogen source, inorganic salts and the like, and can efficiently culture the transformant.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or hydrolyzed starch, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. Alcohols such as acid, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, copper extract, etc. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during culture is maintained at 3.0-9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ambicillin, tetracycline, and kanamycin may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • transformed with a recombinant vector using the lac promoter When culturing microorganisms, use isoprovir-1 /?-D-thiogalactobilanoside, etc., and when culturing microorganisms transformed with a recombinant vector using trp promoter overnight, use indoleacrylic acid, etc. It may be added to the medium.
  • RPMI 1640 medium As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical
  • Culture is carried out usually p H6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5 ° C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • T-FH medium manufactured by PharMingen
  • Sf-900 II SFM medium manufactured by Life Technologies
  • ExCel OO ExCe 11405
  • Grace's Insect Medium a medium for culturing a transformant obtained using an insect cell as a host
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culturing.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a cell organ of a plant.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige and Skog (MS) medium, white (White) medium, or plant medium such as auxin, cytokinin, etc. And the like can be used.
  • Cultivation is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a microorganism, animal cell, or plant cell-derived transformant having a recombinant DNA into which the DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method. By producing and accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture, the polypeptide can be produced.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide outside the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention is expressed extracellularly by adding a signal peptide in front of the polypeptide containing the active site of the polypeptide of the present invention using a gene recombination technique. Can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal or plant cells are redifferentiated to create transgenic non-human animals or transgenic plants (transgenic plants) into which the gene has been introduced. Can be used to produce the polypeptide of the present invention.
  • the transformant is an animal or plant, rear it according to the usual method.
  • the polypeptide can be produced by cultivation, producing and accumulating the polypeptide, and collecting the polypeptide from the animal or plant individual.
  • a transgenic non-human animal into which the DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced is bred, and the polypeptide is produced and accumulated in the animal, and By collecting the polypeptide, the polypeptide can be produced.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs and the like.
  • the promoter used at this time any promoter that can be expressed in an animal can be used.
  • a promoter that is specific to a mammary gland cell, a casein promoter, a casein promoter, Lactoglobulin promoter, whey acidic protein promoter and the like are preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 20 (1994) , Tissue Culture, 21 (1995), Trends in
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a lysed state in cells, after the culture is completed, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated. The cells are crushed with a mortar, French press, Mentongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent Precipitation method, anion exchange chromatography using resin such as getylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), resin using S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectrics
  • a purified sample can be obtained using techniques such as electrophoresis such as point electrophoresis alone or in combination.
  • the cells are similarly recovered, crushed, and the precipitate fraction obtained by centrifugation is subjected to a conventional method to obtain the polypeptide.
  • the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturing agent.
  • the lysate is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturing agent or diluted so that the concentration of the polypeptide denaturing agent does not denature the polypeptide.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as the polypeptide or a sugar chain adduct thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
  • polypeptide examples include a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide of the present invention can be synthesized by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Can also be manufactured. Also, manufactured by Advanced ChemTech, Perkin Enolema, Pharmacia ( ⁇ , Protein Technology Instrument,
  • Chemical synthesis can also be performed using a peptide synthesizer manufactured by Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu, or the like.
  • the culture medium of the transformant obtained by the culture described in (2) above and the culture product obtained by variously treating the culture medium are used as an enzyme source, and the enzyme source and the substrate are both present in an aqueous medium. By doing so, UDP-GlcNAc can be produced in the aqueous medium.
  • Examples of the processed product of the culture solution include a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, cells obtained by centrifuging the culture solution, a dried product of the cells, a freeze-dried product of the cells, and the cells.
  • Surfactant treated product ultrasonically treated product of the cell, mechanically ground product of the cell, solvent-treated product of the cell, enzyme-treated product of the cell, polypeptide component of the cell O, an immobilized product of the cells or an enzyme preparation obtained by extraction from the cells.
  • the concentration of the enzyme source used in the production of UDP-GlcNAc is 1 to 500 g of wet cells / 1 when converted into cells (wet cells) obtained from the culture solution by centrifugation.
  • an enzyme concentration corresponding to a concentration of 10 to 300 g wet cells / 1 is used.
  • Aqueous media used in the production of UDP-GkMc include water, buffer solutions such as phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate, and tris; alcohols such as methanol and ethanol; and acetic acid. Examples include esters such as ethyl, ketones such as acetone, and amides such as acetoamide.
  • a culture solution of the microorganism used as the enzyme source can be used as the aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added as necessary.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (for example, Nymeen S-215, manufactured by NOF Corporation), acetyltrimethylammonium, bromidealkyldimethyl, benzylammonium.
  • Cationic surfactants such as dimethyl chloride (eg, cation F2-40E, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl 'sarcosinate, alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, manufactured by NOF Corporation) Any of the tertiary amines, such as tertiary amines, which do not inhibit the production of UDP-GlcNAc can be used, and one or more of them can be used in combination.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / l.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, and ethyl acetate, which are generally used at a concentration of 0.1 to 50 ml / l.
  • Substrates used in the production of UDP-GlcNAc include peridine 5'-triphosphate and glucosamine derivatives.
  • Glucosamine derivatives include glucosamine phosphate selected from glucosamine-monophosphate and glucosamine-6-phosphate, or N-acetylglucosamine-1-phosphate and N-acetylglucosamine-16-phosphate. N-acetyldarcosamine phosphate.
  • acetylcoenzyme A acetyl CoA
  • glucosamine monomonophosphate or N-acetylglucosamine-1-monophosphate is used as the glucosamine derivative.
  • an enzyme having an activity of converting glucosamine-6-phosphate or N-acetylglucosamine-6-phosphate to glucosamine-1-phosphate or N-acetylglucosamine-11-monophosphate is used.
  • glucosamine-6-phosphate or N-acetylglucosamine-16-phosphate can also be used as the glucosamine derivative.
  • These substrates are used at a concentration of 0.1-500 t ol / l.
  • the production reaction of UDP-GlcNAc is performed in an aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, at 20 to 60 ° C for 1 to 96 hours.
  • aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, at 20 to 60 ° C for 1 to 96 hours.
  • MgCl 2 Inorganic salts can be added.
  • the quantification of UDP-GlcNAc produced in the aqueous medium can be performed by a known method using HPLC or the like [for example, W098 / 12343].
  • the UDP-GlcNAc generated in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, ion exchange resin, or the like.
  • FIG. 1 shows the results of the complementation test of the temperature sensitivity of Corynebacteriuin glutamicum LS6 strain by preparing various deletion plasmids for the inserted DNA fragment of about 7 kb
  • FIG. plac indicates the position of the lactose promoter present on the vector pC2. + Indicates complementation of temperature sensitivity.
  • a schematic restriction enzyme map of the inserted DNA fragment of about 7 kb and the position and direction of the glmU gene are shown in the figure.
  • Corynebacterium 'Corynebacteriuin glutamicum ATCC13032 strain was added to 10 ml of L' medium (polypeptone 1%, yeast extract 0.53 ⁇ 4, sodium chloride 0.53 ⁇ 4, glucose 0.1%, thiamine hydrochloride 20mg / l, pH7.2 ) And inoculated at 30 ° C.
  • L' medium polypeptone 1%, yeast extract 0.53 ⁇ 4, sodium chloride 0.53 ⁇ 4, glucose 0.1%, thiamine hydrochloride 20mg / l, pH7.2
  • the cells were washed with TE buffer [10 ol / l Tris-HCl, lmol / 1 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ⁇ . ⁇ ], and suspended in 800 ⁇ 1 of the same buffer. did. To the suspension, add 40 mg / ml 50 mg / ml lysozyme solution and 20 mg / ml 10 mg / ml RNaseA solution. The reaction was performed at 37 ° C for 1 hour.
  • TE buffer 10 ol / l Tris-HCl, lmol / 1 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ⁇ . ⁇
  • a 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution was added to the reaction solution at a ratio of 20/1, and reacted at 70 ° C. for 1 hour.
  • 24 mg / ml of a 20 mg / ml proteinase K solution was added and reacted at 50 ° C for 1 hour.
  • a 24/1 proteinase K solution was added and reacted at 50 ° C for 1 hour.
  • an equal amount of phenol was added, and the mixture was stirred. The mixture was allowed to stand at 4 ° C for 1 minute, DNA was extracted into an aqueous layer, and the aqueous layer was collected.
  • the ligation reaction solution was used to transform the lysozyme z temperature-sensitive strain Corynebacterium glutamicum LS6 strain by an electroporation method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791), and the growth of the LS6 strain was determined by temperature. Transformants were selected based on their sensitivity. That is, the transformant was spread on an L-agar plate medium (L, a medium supplemented with 1.5% agar) containing 5 zl / ml kanamycin, and cultured at 37 ° C for 3 days.
  • L-agar plate medium L, a medium supplemented with 1.5% agar
  • Plasmid pV5 was found to contain an approximately 7 kb DNA fragment derived from Corynebacterium glutamicum at the ⁇ HI site of plasmid pC2. Had the structure shown.
  • various deletion plasmids were prepared according to a conventional method.
  • the Corynebacterium glutamicum LS6 strain was transformed with the deletion plasmid, and the temperature sensitivity of the transformant was examined. The complementation of the temperature sensitivity required a 2.3 kt ⁇ -fragment. (Fig. 1).
  • this region encodes the amino acid sequence of 485 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 There was a 1455 bp open reading frame (ORF) consisting of the sequence.
  • HI-1 fragment was designated as FERM BP-6937 as of January 12, 2001 Deposited at the Technical Research Institute (1-3 1-3 Tsukuba East, Ibaraki, Japan, postal code 305-8566).
  • FERM BP-6937 The Corynebacterium glutamicum LS6 / pVll containing the plasmid pVll containing the 2.3 kb ⁇ 5
  • the Corynebacterum glutamicum LS6 / pVll strain obtained in Example 2 was cultured according to the method described in Example 1, and the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells could be stored at ⁇ 20 ° C. if necessary, and thawed before use. Final concentration lOg / 1
  • the wet cells 100 germs ol / l Tris-HCl (pH 8.0), 10 kinetics 1/1 glucosamine-1-phosphoric acid, 10 ol / l acetyl C 0 A, 10 ol
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes in a 0.2 ml reaction solution containing UTP, 2 mmol / l MgCl 2 , 4 g / l Nimin S-215, and 10 ml / l xylene.
  • a large amount of G1 mU polypeptide derived from a microorganism belonging to Corynebacterium glutamicum can be produced by a gene recombination technique.
  • UDP-GlcMc can be efficiently produced by using the enzyme.

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Description

明 现
G lmUポリべプチドおよび該ポリべプチドをコヌドする DNA 技術分野
本発明は、 N—ァセチルグルコサミンヌ 1—リン酞ゥリゞルトランスフェラ —れ 以䞋、 GlmUず略す 掻性を有するポリペプチド、 該ポリペプチドを コヌドする DNA、 該 DNAを含有する組換え䜓 DNA、 該組換え䜓 DNAを 保有する圢質転換䜓、 該圢質転換䜓を甚いた G lmUポリべプチドの補造法、 および該圢質転換䜓を甚いたゥリゞン 5 ' 䞀二リン酞— N—ァセチルグルコサ ミンの補造法に関する。 景技俯
N—ァセチルグルコサミン䞀 1—リン酞ゥリゞルトランスフェラ䞀れ G 1 mU) は、 现菌の现胞壁およびグラム陰性菌のリポ倚糖の生合成䞭間䜓である ゥリゞン 5' —二リン酞— N—ァセチルグルコサミン 以䞋、 UDP-GlcNAcず略 す の生成を觊媒する酵玠である。 G lmUポリペプチドに関しおは、 ェシェ リヒア ·コリから酵玠が粟補され、 ゥリゞル化の反応ず同時にグルコサミン— 1䞀リン酞の N—ァセチル化の反応も觊媒するこずが明らかにな぀おいる [J. Bacteriol., 176, 6852 (1994)]0
該 g lmU遺䌝子に関しおは、 ェシ゚リヒア (Escherichia) 属现菌 [J.
Bacteriol., 175, 6150 (1993) バチルスBacillus)属现菌 [J. Bacteriol., 174, 6852 (1992)]、ストレプトコッカス (Streptococcus)属现菌特開平 11— 155582)、 ナむセリア (Neisseria) 属现菌 [J. Bacteriol., 177, 6902 (1995)]などから 遺䌝子が取埗されおいるが、 コリネバクテリゥム Corynebacterium)属现菌に おいおは g lmU遺䌝子は特定されおいない。
ェシ゚リヒア ' コリ (Escherichia coli) 由来の G 1 mUは N—ァセチル化 の掻性が䞍安定であるこずが報告されおおり [J. Bacteriol., 176, 6852 ( 1994) ]、 工業的利甚のためには問題がある。
その他の遺䌝子が単離された现菌に関しおも、 該遺䌝子を甚いお G I mUポ リぺプチドを工業的に有利に生産できるこずに関する蚘茉はない。 発明の開瀺
本発明の目的は、 G I mU掻性を有するポリペプチド、 該ポリべプチドをコ ヌドする D N A、 該 D N Aを甚いた G I mU掻性を有するポリべプチドの補造 法、 および該ポリべプチドを甚いた工業的に有利な UDP-GlcNAcの補造法を提䟛 するこずにある。
本発明者らは䞊蚘課題を解決するために鋭意研究を行い、 コリネパクテリゥ ム · グル倕ミクム (Corynebacterium glutamicum) のリゟチヌム感受性株の枩 床感受性を盞補する遺䌝子が、 G I mUポリべプチドをコ䞀ドする遺䌝子であ るこずを芋出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は以䞋の  1 ) 〜  1 3 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 1蚘茉のァミノ酞配列からなるポリペプチド
( 2 ) 配列番号 1蚘茉のアミノ酞配列においお 1以䞊のアミノ酞が欠倱、 眮換若しくは付加されたアミノ酞配列からなり、 か぀ N—ァセチルグルコサミ ン䞀 1—リン酞ゥリゞルトランスフェラ䞀れ掻性を有するポリべプチド。
かかる配列番号 1蚘茉のアミノ酞配列においお 1以䞊のアミノ酞が欠倱、 眮 換たたは付加されたアミノ酞配列からなり、 か぀ N—ァセチルグルコサミン䞀
1䞀リン酞ゥリゞル卜ランスフェラヌれ掻性を有するポリべプチドは、
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) (以䞋、 モレキュラヌ ' クロ䞀ニング第 2版ず略す 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons ( 1987-1997)
(以䞋、 カレント 'プロ トコヌルズ 'むン 'モレキュラヌ 'バむオロゞヌず略 す 、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 ( 1982)、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 79, 6409 ( 1982)、 Gene, 34, 315 ( 1985 )、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に蚘茉の郚䜍特異的 倉異導入法を甚いお、 䟋えば配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列を有するポリ ぺプチドをコ䞀ドする DNAに郚䜍特異的倉異を導入するこずにより、 取埗す るこずができる。
欠倱、 眮換もしくは付加されるアミノ酞の数は特に限定されないが、 䞊蚘の 郚䜍特異的倉異法等の呚知の方法により欠倱、 眮換もしくは付加できる皋床の 数であり、 1個から数十個、 奜たしくは 1〜20個、 より奜たしくは 1〜10 個、 さらに奜たしくは 1〜5個である。
たた、 本発明のポリべプチドが N—ァセチルグルコサミン䞀 1䞀リン酞ゥリ ゞルトランスフェラヌれ掻性を有するためには、 B LAS T[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]、 F A S T A [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)]等を甚 いお蚈算したずきに、 配列番号 1蚘茉のアミノ酞配列ず少なくずも 60%以䞊、 通 垞は 80%以䞊、 特に 95%以䞊の盞同性を有しおいるこずが奜たしい。
ただし、 該ポリペプチドは公知のものを含たない。
(3) 䞊蚘 1) たたは 2) のポリペプチドをコヌドする DNA。
( 4 ) 配列番号 2蚘茉の塩基配列を有する D N A。
(5) 䞊蚘 3) たたは 4) の DN Aずストリンゞェン卜な条件䞋でハ むブリダむズし、 か぀ N—ァセチルグルコサミンヌ 1—リン酞ゥリゞルトラン スプラヌれ掻性を有するポリぺプチドをコ䞀ドする DNA。
䞊蚘の 「ストリンゞェン卜な条件䞋でハむブリダィズする DNA」 ずは、 配 列番号 2で衚される塩基配列を有する DN Aをプロヌブずしお、 コロニヌ ·ハ むブリダィれヌシペン法、 プラヌク ·ハむブリダィれ䞀シペン法あるいはサザ ンハむプリダむれヌシペン法等を甚いるこずにより埗られる DN Aを意味し、 具䜓的には、 コロニヌあるいはプラヌク由来の DN Aを固定化したフィルタ䞀 を甚いお、 0.7〜1.0mol/lの塩化ナトリりム存圚䞋、 65°Cでハむブリダィれ䞀シ ペンを行った埌、 0.1〜2倍濃床の SSC (saline-sodium citrate) 溶液 [1倍 濃床の SSC溶液 150腿 οΐΛ 塩化ナトリりム、 15mmol/lクェン酞ナトリりム ] を甚い、 65°C条件䞋でフィル倕䞀を掗浄するこずにより同定できる DNAをあ げるこずができる。
ハむブリダィれヌシペンは、モレキュラヌ 'クロヌニング第 2版、 カレント · プロトコ䞀ルズ 'むン 'モレキュラヌ ·バむオロゞヌ、 DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 等の実隓曞に蚘茉されおいる方法に準じお行うこずができる。 ハむプリダむズ 可胜な DNAずしお具䜓的には、 BLAST、 F A S T A等を甚いお蚈算した ずきに、 配列番号 2で衚される塩基配列ず少なくずも 60%以䞊の盞同性を有す る DNA、 奜たしくは 80%以䞊の盞同性を有する DNA、 さらに奜たしくは 95% 以䞊の盞同性を有する DN Aをあげるこずができる。
ただし、 該 DNAは公知のものを含たない。
( 6 ) DNAがコリネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属する埮生物 由来の DNAである、 䞊蚘 3) 〜 5) いずれか 1぀に蚘茉の DNA。
(7) コリネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属する埮生物がコリネ バクテリゥム ·グル倕ミクム (Corynebacterium glutamicum)である、 䞊蚘 6 ) の DNA。
(8) 䞊蚘 3) 〜 7) いずれか 1぀に蚘茉の DN Aをベクタヌに組み 蟌んで埗られる組換え䜓 DNA。
(9) 䞊蚘 8) の組換え䜓 DNAを宿䞻现胞に導入しお埗られる圢質転 換䜓。
(10) 圢質転換䜓がコリネバクテリりム'グル倕ミクムCorynebacterium glutamicum) である、 䞊蚘 9) 蚘茉の圢質転換䜓。
(11) 圢質転換䜓 Corynebacterium glutamicum LS6/PV11(FERM BP-6937)0
(12) 䞊蚘  9 ) 〜  1 1 ) いずれか 1぀に蚘茉の圢質転換䜓を培地に 培逊し、 培逊物䞭に N—ァセチルグルコサミン— 1䞀リン酞ゥリゞルトランス フェラ䞀れ掻性を有するポリべプチドを生成蓄積させ、 該培逊物から該ポリぺ プチドを採取するこずを特城ずする、 N—ァセチルグルコサミン䞀 1—リン酞 ゥリゞルトランスフェラヌれ掻性を有するポリべプチドの補造方法。
( 1 3 ) 䞊蚘 9 ) 〜  1 1 ) いずれか 1぀の圢質転換䜓を培地に培逊し お埗られる培逊液たたは該培逊液の凊理物を酵玠源ずしお甚い、 氎性媒䜓䞭に
(a)ゥリゞン 5 ' —䞉リン酞、 グルコサミンリン酞化物およびァセチルコェンザ ィム A、 たたは
(b)ゥリゞン 5 ' —䞉リン酞および N—ァセチルグルコサミンリン酞化物、 から遞ばれる基質、および該酵玠源を存圚せしめ、該氎性媒䜓䞭にゥリゞン 5 ' —ニリン酞— N—ァセチルグルコサミンを生成蓄積させ、 該氎性媒䜓䞭からゥ リゞン 5 ' —ニリン酞ヌ N—ァセチルグルコサミンを採取するこずを特城ずす るゥリゞン 5 ' —二リン酞ヌ N—ァセチルグルコサミンの補造法。
( 1 ) グルコサミンリン酞化物が、 グルコサミン䞀 1䞀リン酞たたはグ ルコサミン— 6—リン酞であり、 N—ァセチルダルコサミンリン酞化物が、 N —ァセチルグルコサミン— 1—リン酞たたは N—ァセチルグルコサミン䞀 6— リン酞である䞊蚘  1 3 ) のゥリゞン 5 ' —ニリン酞ヌ N—ァセチルグルコサ ミンの補造法。
以䞋に本発明を詳现に説明する。
( 1 ) 本発明の D N Aの調補
本発明の D N Aはコリネパクテリゥム属に属する埮生物より調補するこずが できる。 コリネパクテリゥム (Corynebacterium) 属に属する埮生物ずしおはコ リネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属する埮生物であればいずれでもよ く、 䟋えばコリネバクテリりム ·アンモニアゲネス (Corynebacterium aimoniagenes) 、 コ Uネノ クテリりム -カリレナェ ( Corynebacterium callunae)、 コリネバクテリゥム · グル倕ミクムCorynebacterium glutamicum)等があげら れる。 具䜓的な䟋ずしおは、 コリネパクテリゥム  グルタミクム ' (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032株をあげるこずができる。
コリネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属する埮生物を公知の方法 [䟋 えば、 Appl . Microbiol . Biotechnol . , 39, 318 ( 1993)に蚘茉の方法] に埓぀ お培逊する。培逊埌、 公知の方法 [䟋えば、 カレント ·プロトコヌルズ ·むン ' モレキュラヌ 'バむオロゞヌ、 Agric. Biol . Chem. , 49, 2925 ( 1985 )に蚘茉の 方法] に埓っお該埮生物の染色䜓 D N Αを単離粟補する。
埗られた染色䜓 D N Aを適圓な制限酵玠で切断し、 垞法、 䟋えばモレキナラ ― · クロヌニング第 2版等の蚘茉に準じお、 該 D N A断片をコリネパクテリゥ ム (Corynebacterium) 甚ベクタヌに揷入するこずにより、 組換え䜓 D N Aを䜜 補するこずができる。
ベクタ䞀ずしおは、 コリネバクテリゥム (Corynebacterium) 属に属する埮生 物䞭で自立耇補できるものであればいずれも甚いるこずができ、 pCGl (特開昭 57-134500)、 pCG2 (特開昭 58-35197)、 pCG4、 pCGll (いずれも特開昭 57-183799)、 pCE53、 pCBlOl (いずれも特開昭 58-105999) 、 pCE51、 pCE52、 pCE53 [いずれも Mol . Gen. Genet. , 196, 175 ( 1984)] 、 pAJ1844 (特開昭 58-21619) 、 pHK4 (特 開平 7- 20399) 、 pHM1519 [Agric. Biol . Chem. , 48, 2901, ( 1985 )] 、 pCV35、 pECMl [いずれも J. Bacteriol. , 172, 1663 ( 1990)] pC2[Plasmid, 36, 62 ( 1996)] 等を䟋瀺するこずができる。
䞊蚘で䜜補した組換え䜓 D N Aを、 コリネパクテリゥム · グル倕ミクム (Corynebacterium lutamicum) に属するリゟチヌム感受性埮生物に導入する。 コリネノクテリゥム · グノレ倕ミクム (Corynebacterium glutamicum) ίこ属す るリゟチヌム感受性埮生物ずしおは、 コリネパクテリゥム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) に属し、 か぀リゟチヌム感受†生を瀺すもので あれば、 野生型株、 リゟチヌム感受性倉異株のいずれを甚いおもよい。 䞀般的 に、野生型株は通垞 100〃g/mlのりゟチヌムが培地䞭に存圚しおいおもその生育 には䜕等圱響を受けない堎合が倚いため、 リゟチヌム感受性倉異株である方が 奜たしい。
本発明では、 リゟチヌム感受性埮生物ずは、 50 /g/ml以䞋の䜎濃床のリゟチ —ムが培地䞭に存圚するず、 その生育が阻害される埮生物をいう。
該リゟチヌム感受性埮生物は、 コリネパクテリゥム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) を芪株ずしお、 公知の方法 特公昭 62-49038、 特公平卜 29555、 特閧昭 58-56678) に準じお、 倉異株ずしお分離するこずができ る。 このような倉異株ずしおは、 コリネバクテリりム · グル倕ミクム
(Corynebacterium glutamicum) ATCC31833株より分離されたコリネバクテリゥ ム ·グル倕ミクムCorynebacterium glutamicum) ATCC31834株特開昭 58-56678)、 あるいはコリネバクテリゥム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032株より分離された埌述のコリネバクテリゥム · グルタミクム
(Corynebacterium glutamicum) LS6株等を䟋瀺するこずができる。
リゟチヌム感受性埮生物には、 枩床感受性の生育を瀺すものもある。 該リゟ チヌム感受性か぀枩床感受性 以䞋、 リゟチヌム/枩床感受性ず略す の埮生 物は、 リゟチヌムが培地䞭に存圚しない堎合でも高枩域 䟋えば 34〜39°C) で は生育できない。
このような倉異株ずしおは、 䟋えば埌述のコリネバクテリゥム · グル倕ミク ム (Corynebacterium lutamicum) ATCC13032株より分離されたコリネバクテリ ゥム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) LS6株等を䟋瀺するこずが できる。
本発明の D N Aは、 䞊蚘リゟチヌム/枩床感受性株の枩床感受性を盞補する D N Aずしお取埗するこずができる。
即ち、 䞊蚘で埗られた D N Aをベクタヌに組み蟌み、 該 D N Aが組み蟌たれ たベクタヌで、 䞊蚘リゟチヌム/枩床感受性株を圢質転換する。 該圢質転換株 をリゟチヌムを含有しない培地で該リゟチヌム感受性埮生物が生育できない枩 床、 䟋えば 34〜39°C、 奜たしくは 36〜38°Cで培逊する。 該枩床条件䞋で生育可 胜ずなった菌株を、 目的の D N Aを有する菌株ずしお遞択し、 該菌株より D N Aを取埗するこずができる。
以䞋に、 該方法を具䜓的に説明する。
組換え䜓 D N Aの導入方法ずしおは、 䞊蚘リゟチヌム/枩床感受性の埮生物 ぞ D N Aを導入する方法であればいずれも甚いるこずができ、 䟋えば、 プロト プラスト法 [特開昭 57- 186492、 特開昭 58-56678、 J. Bacteriol., 159, 306 (1984)]、 ゚レク トロボレ䞀シペン法 特開平 2-207791)等をあげるこずができ る。
あるいは倧腞菌で䜜補されたコリネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属 するリゟチヌム非感受性株の染色䜓 DN Aラむブラリヌを甚い、 公知の方法に したがっお、 該ラむブラリヌの倧腞菌より接合䌝達によっお組換え䜓 DNAを コリネノ クテ Uゥム · クリレ倕ミクム (Corynebacterium glutamicum) のリ゜ *チ —ム /枩床感受性株に導入するこずも可胜である [J. Bacteriol. 172, 1663 (1990)、 J. Bacteriol. 178, 5768 (1996)] 。
組換え䜓 DNAを導入したコリネパクテリゥム · グル倕ミクム
(Corynebacterium glutamicum) のリゟチヌム/枩床感受性株を、 䟋えば L B 培地 [パク ト トリプトン ディフコ瀟補 10g/l、 酵母゚キス ディフコ瀟補 5g/l、 塩化ナトリりム 5g/l(pH7.2)] を甚い、 高枩域 (34〜39。C) で 24〜72時 間培逊する。 培逊埌、 該培地で生育した菌株を、 目的の DN Aを有する菌株ず しお遞択する。
取埗した DNAをそのたた、 あるいは適圓な制限酵玠などで切断埌垞法によ りべクタ䞀に組み蟌み、 通垞甚いられる塩基配列解析方法、 䟋えば 373A'DNA シヌクェンサ䞀パヌキン ·゚ルマ䞀瀟補等を甚いたゞデォキシ法 [proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] により該 D N Aの塩基配列を決定する。 該 DNAを組み蟌むベクタヌずしおは、 pBluescriptKS( + ) (ストラタゞヌン 瀟補 、 pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)]、 pCR-Script Amp SK ( + ) (ス トラ倕ゞヌン瀟補 、 pT7Blue (ノバゞヱン瀟補 、 pCR II (むンビ トロゞェン瀟補 、 pCR- TRAP (ゞヌンハン倕䞀瀟補 および pNoTAT7 (5プラむ ム→3プラむム瀟補 などをあげるこずができる。
䞊蚘のようにしお取埗された新芏な塩基配列を有する DNAずしお、䟋えば、 配列番号 2で衚される配列を有する D N A等をあげるこずができる。
配列番号 2で衚される塩基配列を有する D N Aには、 配列番号 1で衚される アミノ酞配列を有するポリべプチドがコ䞀ドされおいる。
配列番号 2で衚される配列を有する DNAを保有するプラスミ ドを保有する 菌株ずしおは、 䟋えばコリネパクテリゥム ' グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) LS6/pV5、 コリネバクテリゥム · グル倕ミクム (Corynebacterium glutamicum) LS6/pVll等をあげるこずができる。
たた、 䞊蚘により決定された塩基配列に基づいたプラむマヌを調補し、 染色 䜓 DN Aを铞型ずしお、 PCR法 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] により目的ずする DNAを取埗するこずができる。
曎に、 決定された DN Aの塩基配列に基づいお、 パヌセプティブ 'バむオシ ステムズ瀟補 8905型 DNA合成装眮等を甚いお化孊合成するこずにより目的ず する DN Aを調補するこずもできる。
(2) 本発明のポリべプチドの調補
本発明のポリペプチドは、 モレキュラヌ ' クロヌニング第 2版、 カレント ' プロ トコ䞀ルズ 'むン 'モレキュラヌ 'バむオロゞヌ等に蚘茉された方法、 䟋 えば以䞋の方法により、 本発明の DNAを宿䞻现胞䞭で発珟させるこずで補造 するこずができる。
すなわち、 本発明の DN Aを適圓な発珟ベクタヌのプロモ䞀倕䞀の䞋流に揷 入した組換え䜓 DN Aを䜜補し、 それを該発珟べクタ䞀に適合した宿䞻现胞に 導入するこずにより、 本発明のポリべプチドを生産する圢質転換䜓を埗るこず ができる。 宿䞻现胞ずしおは、 现菌、 酵母、 動物现胞、 昆虫现胞、 怍物现胞等、 目的ずする遺䌝子を発珟できるものであればいずれも甚いるこずができる。 発 珟べクタ䞀ずしおは、 䞊蚘宿䞻现胞においお自立耇補可胜ないしは染色䜓䞭ぞ の組蟌が可胜で、 本発明のポリべプチドをコヌドする DN Aを転写できる䜍眮 にプロモヌタヌを含有しおいるものが甚いられる。
现菌等の原栞生物を宿䞻现胞ずしお甚いる堎合は、 本発明のポリべプチドを コヌドする DN Aを含有しおなる組換え䜓 DN Aは原栞生物䞭で自立耇補可胜 であるず同時に、 プロモヌタヌ、 リボ゜ヌム結合配列、 本発明のポリペプチド をコ䞀ドする D N A、 転写終結配列より構成されたベクタヌであるこずが奜た しい。 プロモヌタヌを制埡する遺䌝子が含たれおいおもよい。
発珟べクタ䞀ずしおは、䟋えば、 pC2[Plasmid, 36, 62 ( 1996 )]、pBTrp2、pBTacl、 pBTac2 (いずれもべ䞀リンガヌマンハむム瀟より巿販 、pKK233- 2 (Pharmacia 瀟補 、pSE280 ( Invitrogen瀟補) 、pGEMEX-l (Promega瀟補) 、pQE-8 (QIAGEN 瀟補、 pKYP10(特開昭 58-110600)、 pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 ( 1984) ] 、pLSAl [Agric . Biol . Chem. , 53, 277 ( 1989)] 、pGELl [Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 82, 4306 ( 1985 )] . pBluescript I I SK (-) (Stratagene 瀟補 、pTrs30 [Escherichia coli JM109/pTrS3Q (FERM BP-5407) より調補] 、 pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) より調補] 、pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400) より調補、 特開昭 60-221091] 、pGKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798)より調補、特開昭 60-221091]、pTerm2 (US468619K US4939094、 US5160735) 、pSupex、pUB110、pTP5、 pC194、 pEG棚 [J. Bacteriol. , 172, 2392 ( 1990)] 、pGEX (Pharmacia瀟補 、pETシステム (Novagen瀟補 等をあげるこずができる。
宿䞻がコリネバクテリゥム (Corynebacterium)属に属する埮生物の堎合は、 䞊蚘に述べたベクタ䞀の他に、 pCGl、 pCG2、 pCG4、 pCGll、 pCE53、 pCB101、 pCE51、 pCE52、 pCE53、 pAJ1844、 pHK4、 pHM1519、 pCV35、 pECMl等を甚いるこずができる。 プロモヌ倕—ずしおは、 宿䞻现胞䞭で発珟できるものであればいかなるもの でもよい。 䟋えば、 trpプロモヌ倕䞀 Ptrp) 、 lacプロモヌ倕䞀、 PLプロモ䞀倕 ―、 PRプロモヌ倕䞀、 T7プロモ䞀倕䞀等の、 倧腞菌やファヌゞ等に由来するプ ロモ䞀倕䞀をあげるこずができる。たた Ptrpを 2぀盎列させたプロモヌ倕䞀Ptrp X 2 ) 、 tacプロモヌ倕䞀、 lacT7プロモ䞀倕䞀、 letlプロモ䞀倕䞀のように人 為的に蚭蚈改倉されたプロモヌタヌ等も甚いるこずができる。
リポ゜ヌム結合配列であるシャむン䞀ダルガノ Shine-Dalgarno) 配列ず開 始コドンずの間を適圓な距離 䟋えば 6〜 18塩基 に調節したプラスミ ドを甚 いるこずが奜たしい。 本発明のポリべプチドをコ䞀ドする郚分の塩基配列を、 宿䞻の発珟に最適な コ ドンずなるように、 塩基を眮換するこずにより、 目的ずするポリペプチドの 生産率を向䞊させるこずができる。
本発明の組換えベクタヌにおいおは、 本発明の D N Aの発珟には転写終結配 列は必ずしも必芁ではないが、 構造遺䌝子の盎䞋に転写終結配列を配眮するこ ずが奜たしい。
宿䞻现胞ずしおは、 ェシ゚リヒア (Escherichia) 属、 セラチア (Serratia) 属、 バチルス (Bacillus) 属、 ブレビパクテリゥム (Brevibacterium) 属、 コ リ朚ノ クテリゥム (Corynebacterium) ϋ、ミク ロノ 'クテリ ム (Microbacterium) 属、 シュ䞀ドモナス (Pseudomonas)属等に属する埮生物、 䟋えば、 Escherichia coli XLl - Blue、 Escherichia col i XL2 - Blue、 Escherichia coli DHK Escherichia coli MC1000、 Escherichia col i KY3276, Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia col i HB101、 Escherichia col i No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia col i NY49、 Serratia ficaria、 Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens、 Serratia marcescens、 Baci l lus subti l is Bacillus amyloliquefacinesN Brevibacterium ammoniageness Brevibacterium
i匪 ariophilum ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium f lavum ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium anunoniaphi lum ATCC15354. Pseudomonas sp. D-0110 等をあげるこずができる。
組換えべクタ䞀の導入方法ずしおは、 䞊蚘宿䞻现胞ぞ D N Aを導入する方法 であればいずれも甚いるこずができ、 䟋えば、 カルシりムむオンを甚いる方法
[Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 69, 2110 ( 1972 ) ] 、 プロトプラスト法 特開 昭 63- 248394)、゚レクトロポレヌシペン法特開平 2- 207791)、 たたは Gene,  107 ( 1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 ( 1979)に蚘茉の方法等 をあげるこずができる。 酵母を宿䞻现胞ずしお甚いる堎合には、 発珟べクタ䞀ずしお、 䟋えば、 YEP13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげるこずがで きる。
プロモヌタヌずしおは、 酵母菌株䞭で発珟できるものであればいずれのもの を甚いおもよく、 䟋えば、 ぞキ゜ヌスキナヌれ等の解糖系の遺䌝子のプロモヌ 倕䞀、 PH05プロモ䞀倕䞀、 PGKプロモヌ倕䞀、 GAPプロモ䞀倕䞀、 ADHプロモヌ倕 䞀、 gal 1プロモヌタヌ、 gal 10プロモヌタヌ、 ヒヌトショックポリペプチドプ ロモ䞀倕䞀 、 MFひ 1 プロモヌ倕䞀、 CUP 1プロモヌ倕䞀等をあげるこずができ o
宿䞻现胞ずしおは、 サッカロミセス (Saccharomyces)属、 クリュむべ口ミセ ス (Kluyveromyces) 属、 卜リコスポロン (Trichosporon) 属、 シュヮニォミセ ス (Schwanniomyces)属等に属する埮生物、 䟋えば、 Saccharomyces, cerevisia、 Schizosaccharomyces pombe、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans、 Schwanniomyces alluvius等をあげるこずができる o
組換え䜓 DN Aの導入方法ずしおは、 酵母に DN Aを導入する方法であれば いずれも甚いるこずができ、 䟋えば、 ゚レクトロボレ䞀シペン法 [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)] 、 スプロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)] 、 酢酞リチりム法 [J. BacterioL, 153, 163 (1983)] 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)蚘茉の方法等をあげるこずがで きる。
動物现胞を宿䞻ずしお甚いる堎合には、発珟ベクタヌずしお、䟋えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナコシ瀟より垂販 、 PAGE107 [特開平 3-22979 Cytotechnology  133 (1990)] 、 pAS3-3 (特開平 2-227075) 、 pCDM8 [Nature, 329 840 (1987)] 、 pcDNAI/Amp ( Invitrogen瀟補 、 REP4 ( Invitrogen瀟補 、 pAGE103 [J.
Biochemistry, 101, 1307 (1987)] 、 pAGE210等をあげるこずができる。
プロモヌタヌずしおは、 動物现胞䞭で発珟できるものであればいずれも甚い るこずができ、 䟋えば、 サむ トメガロりィルス CMV) の IE (i麗 ediateearly) 遺䌝子のプロモヌタヌ、 SV40の初期プロモヌ倕䞀、 レトロりむルスのプロモ䞀 倕䞀、 メタ口チォネむンプロモ䞀倕䞀、 ヒヌトショックプロモ—倕—、 SRひプ 口モヌ倕䞀等をあげるこずができる。 たた、 ヒト CMVの IE遺䌝子のェンハンサヌ をプロモヌ倕䞀ず共に甚いおもよい。
宿䞻现胞ずしおは、 ヒ卜の现胞であるナマルバ Namalwa) 现胞、 サルの现胞 である COS现胞、 チャむニヌズ 'ハムスタヌの现胞である CH0现胞、 HBT5637 (特 閧昭 63- 299) 等をあげるこずができる。
動物现胞ぞの組換えべクタ䞀の導入方法ずしおは、 動物现胞に D N Aを導入 する方法であればいずれも甚いるこずができ、 䟋えば、 ゚レク トロボレ䞀ショ ン法 [Cytotechnology, 3 133 ( 1990)]、 リン酞カルシりム法特開平 2- 227075)、 リポプクシペン法 [Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)] 等をあ げるこずができる。
昆虫现胞を宿䞻ずしお甚いる堎合には、 䟋えばカレント · プロ トコ䞀ルズ · ィン ·モレキュラヌ · ノボ'ィォロゞ䞀、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York ( 1992)、
Bio/Technology, 6, 47 ( 1988)等に蚘茉された方法によっお、 ポリペプチドを 発珟するこずができる。
即ち、 組換え遺䌝子導入ベクタヌおよびバキュロりィルスを昆虫现胞に共導 入しお昆虫现胞培逊䞊枅䞭に組換えりィルスを埗た埌、 さらに組換えりィルス を昆虫现胞に感染させ、 ポリべプチドを発珟させるこずができる。
該方法においお甚いられる遺䌝子導入べクタ䞀ずしおは、 䟋えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacI I I (ずもに Invitorogen瀟補 等をあげるこずができる。 バキュロりィルスずしおは、 䟋えば、 倜盗蛟科昆虫に感染するりィルスであ るァゥトグラファ ·カリフォルニ力 · ヌクレア䞀 ·ポリぞドロシス · りィルス (Autographa cal iiornica nuclear polyhedrosis virus)等を甚レ、るこずができ る o
昆虫现胞ずしおは、 Spodoptera frugiperdaの卵巣现胞である Sf9、 Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York ( 1992)] 、 Trichoplusia の卵巣现胞である High 5 ( Invitrogen瀟補 等を甚いるこずができる。
組換えりィルスを調補するための、 昆虫现胞ぞの䞊蚘組換え遺䌝子導入べク 倕䞀ず䞊蚘バキュロりィルスの共導入方法ずしおは、 䟋えば、 リン酞カルシゥ ム法 特開平 2-227075) 、 リポプクシペン法 [Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)] 等をあげるこずができる。
怍物现胞を宿䞻现胞ずしお甚いる堎合には、 発珟べクタ䞀ずしお、 䟋えば、 T iプラスミ ド、 倕パコモザむクりィルスベクタ䞀等をあげるこずができる。 プロモヌタヌずしおは、 怍物现胞䞭で発珟できるものであればいずれのもの を甚いおもよく、 䟋えば、 カリフラワヌモザむクりィルス CaMV) の 35Sプロモ —倕䞀、 ィネアクチン 1プロモヌタヌ等をあげるこずができる。
宿䞻现胞ずしおは、 タバコ、 ゞャガむモ、 トマト、 ニンゞン、 ダむズ、 アブ ラナ、 アルフアルファ、 むネ、 コムギ、 ォォムギ等の怍物现胞等をあげるこず ができる。
組換え䜓 D N Aの導入方法ずしおは、 怍物现胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも甚いるこずができ、䟋えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) を甚いる方法 特開昭 59- 140885、 特閧昭 60-70080、 W094/00977) 、 ゚レク ト口 ポレヌシペン法 特閧昭 60- 251887) 、 パヌティクルガン 遺䌝子銃 を甚いる 方法 特蚱第 2606856、 特蚱第 2517813) 等をあげるこずができる。
遺䌝子の発珟方法ずしおは、 盎接発珟以倖に、 モレキュラヌ 'クロ䞀ニング 第 2版に蚘茉されおいる方法等に準じお、 分泌生産、 融合タンパク質発珟等を 行うこずができる。
酵母、 動物现胞、 昆虫现胞たたは怍物现胞により発珟させた堎合には、 糖あ るいは糖鎖が付加されたポリペプチドを埗るこずができる。
以䞊のようにしお埗られる圢質転換䜓を培地に培逊し、 培逊物䞭に本発明の ポリペプチドを生成蓄積させ、 該培逊物から採取するこずにより、 本発明のポ リペプチドを補造するこずができる。 本発明の圢質転換䜓を培地に培逊する方 法は、 宿䞻の培逊に甚いられる通垞の方法に埓っお行うこずができる。
本発明の圢質転換䜓が倧腞菌等の现菌あるいは酵母等の真栞生物を宿䞻ずし お埗られた圢質転換䜓である堎合、 該圢質転換䜓を培逊する培地ずしおは、 該 生物が資化し埗る炭玠源、 窒玠源、 無機塩類等を含有し、 圢質転換䜓の培逊を 効率的に行える培地であれば倩然培地、 合成培地のいずれを甚いおもよい。 炭玠源ずしおは、 該生物が資化し埗るものであればよく、 グルコヌス、 フラ クト䞀ス、 スクロヌス、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加 氎分解物等の炭氎化物、 酢酞、 プロピオン酞等の有機酞、 ゚タノヌル、 プロパ ノヌルなどのアルコ䞀ル類等を甚いるこずができる。
窒玠源ずしおは、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酞アンモニゥム、 酢酞 アンモニゥム、 リン酞アンモニゥム等の無機酞もしくは有機酞のアンモニゥム 塩、 その他の含窒玠化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉゚キス、 酵母゚キス、 コ 䞀ンスチ䞀プリカ䞀、 カれむン加氎分解物、 倧豆粕および倧豆粕加氎分解物、 各皮発酵菌䜓およびその消化物等を甚いるこずができる。
無機物ずしおは、 リン酞第䞀カリりム、 リン酞第二カリりム、 リン酞マグネ シゥム、 硫酞マグネシりム、 塩化ナトリりム、 硫酞第䞀鉄、 硫酞マンガン、 ç¡« 酞銅、 炭酞カルシりム等を甚いるこずができる。
培逊は、 通垞振盪培逊たたは深郚通気攪拌培逊などの奜気的条件䞋で行う。 培逊枩床は 15〜40°Cがよく、 培逊時間は、 通垞 16時間〜 7日間である。 培逊䞭の p Hは 3.0〜9.0に保持する。 p Hの調敎は、 無機たたは有機の酞、 アルカリ溶 液、 尿玠、 炭酞カルシりム、 アンモニアなどを甚いお行う。
たた、 培逊䞭必芁に応じお、 アンビシリン、 テトラサむクリン、 カナマむシ ン等の抗生物質を培地に添加しおもよい。
プロモヌタヌずしお誘導性のプロモヌ倕䞀を甚いた組換えベクタヌで圢質転 換した埮生物を培逊するずきには、 必芁に応じおィンデュ䞀サ䞀を培地に添加 しおもよい。䟋えば、 lacプロモヌタヌを甚いた組換えベクタヌで圢質転換した 埮生物を培逊するずきにはむ゜プロビル䞀/?— D—チォガラクトビラノシド等 を、 trpプロモ䞀倕䞀を甚いた組換えべクタ䞀で圢質転換した埮生物を培逊する ずきにはィンドヌルァクリル酞等を培地に添加しおもよい。
動物现胞を宿䞻ずしお埗られた圢質転換䜓を培逊する培地ずしおは、 䞀般に 䜿甚されおいる RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical
Association, 199, 519 ( 1967) ] 、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 ( 1952 )] 、 ダルベッコ改倉 MEM培地 [Virology, 8, 396 ( 1959)] 、 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 ( 1950)] たたはこれら 培地に牛胎児血枅等を添加した培地等を甚いるこずができる。
培逊は、 通垞 p H6〜8、 30〜40°C、 5° C02存圚䞋等の条件䞋で 1〜7日間行う。 たた、 培逊䞭必芁に応じお、 カナマむシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地 に添加しおもよい。
昆虫现胞を宿䞻ずしお埗られた圢質転換䜓を培逊する培地ずしおは、 䞀般に 䜿甚されおいる T -FH培地 (PharMingen瀟補) 、 Sf-900 I I SFM培地 (Life Technologies瀟補 、 ExCel OO, ExCe 11405 (いずれも JRH Biosciences瀟補 、 Grace' s Insect Medium [Nature, 195, 788 ( 1962 ) ] 等を甚いるこずができる。 培逊は、 通垞 p H 6〜7、 25〜30°C等の条件䞋で、 1〜5日間行う。
たた、 培逊䞭必芁に応じお、 ゲンタマむシン等の抗生物質を培地に添加しお もよい。
怍物现胞を宿䞻ずしお埗られた圢質転換䜓は、 现胞ずしお、 たたは怍物の现 胞ゃ噚官に分化させお培逊するこずができる。 該圢質転換䜓を培逊する培地ず しおは、 䞀般に䜿甚されおいるムラシゲ .アンド .スク䞀グ (MS)培地、 ホワむ トWhite )培地、 たたはこれら培地にオヌキシン、 サむ トカむニン等、 怍物ホル モンを添加した培地等を甚いるこずができる。
培逊は、 通垞 p H 5〜9、 20〜40°Cの条件䞋で 3〜60日間行う。
たた、 培逊䞭必芁に応じお、 カナマむシン、 ハむグロマむシン等の抗生物質 を培地に添加しおもよい。 䞊蚘のずおり、 本発明のポリべプチドをコ䞀ドする D N Aを組み蟌んだ組換 え䜓 D N Aを保有する埮生物、 動物现胞、 あるいは怍物现胞由来の圢質転換䜓 を、 通垞の培逊方法に埓っお培逊し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該培逊 物より該ポリぺプチドを採取するこずにより、 該ポリぺプチドを補造するこず ができる。
遺䌝子の発珟方法ずしおは、 盎接発珟以倖に、 モレキュラヌ · クロヌニング 第 2版に蚘茉されおいる方法等に準じお、 分泌生産、 融合ポリペプチド発珟等 を行うこずができる。
本発明のポリべプチドの生産方法ずしおは、 宿䞻现胞内に生産させる方法、 宿䞻现胞倖に分泌させる方法、 あるいは宿䞻现胞倖膜䞊に生産させる方法があ り、 䜿甚する宿䞻现胞や、 生産させるポリべプチドの構造を倉えるこずにより、 該方法を遞択するこずができる。
本発明のポリべプチドが宿䞻现胞内あるいは宿䞻现胞倖膜䞊に生産される堎 合、 ポヌル゜ンらの方法 [J. Biol . Chem. , 264, 17619 ( 1989)] 、 ロりらの 方法 [Proc. Natl . Acad. Sci USA, 86, 8227 ( 1989 )、 Genes Develop. , 4 1288 ( 1990 ) ]、 たたは特開平 5-336963 W094/23021等に蚘茉の方法を準甚するこず により、 該ポリべプチドを宿䞻现胞倖に分泌させるこずができる。
すなわち、 遺䌝子組換えの手法を甚いお、 本発明のポリペプチドの掻性郚䜍 を含むポリぺプチドの手前にシグナルぺプチドを付加した圢で発珟させるこず により、 本発明のポリべプチドを宿䞻现胞倖に分泌させるこずができる。
たた、 特開平 2-227075に蚘茉されおいる方法に準じお、 ゞヒドロ葉酞還元酵 玠遺䌝子等を甚いた遺䌝子増幅系を利甚しお生産量を䞊昇させるこずもできる。 さらに、 遺䌝子導入した動物たたは怍物の现胞を再分化させるこずにより、 遺䌝子が導入された動物個䜓 トランスゞ゚ニック非ヒト動物 たたは怍物個 䜓 トランスゞ゚ニック怍物 を造成し、 これらの個䜓を甚いお本発明のポリ ぺプチドを補造するこずもできる。
圢質転換䜓が動物個䜓たたは怍物個䜓の堎合は、 通垞の方法に埓っお、 飌育 たたは栜培し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該動物個䜓たたは怍物個䜓よ り該ポリべプチドを採取するこずにより、 該ポリべプチドを補造するこずがで きる。
動物個䜓を甚いお本発明のポリべプチドを補造する方法ずしおは、 䟋えば公 知の方法〔American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S ( 1996)、 American Journal of Clinical Nutrition, 63 627S ( 1996 )、 Bio/Technology, 9, 830 ( 1991 )〕 に準じお遺䌝子を導入しお造成した動物䞭に本発明のポリべプチドを 生産する方法があげられる。
動物個䜓の堎合は、 䟋えば、 本発明のポリペプチドをコヌドする D N Aを導 入したトランスゞ゚ニック非ヒト動物を飌育し、 該ポリべプチドを該動物䞭に 生成 '蓄積させ、 該動物䞭より該ポリペプチドを採取するこずにより、 該ポリ ペプチドを補造するこずができる。 該動物䞭の生成 ·蓄積堎所ずしおは、 䟋え ば、 該動物のミルク 特開昭 63-309192) 、 卵等をあげるこずができる。 この際 に甚いられるプロモ䞀倕䞀ずしおは、 動物で発珟できるものであればいずれも 甚いるこずができるが、 䟋えば、 乳腺现胞特異的なプロモヌ倕䞀であるひカれ むンプロモヌ倕䞀、 ?カれむンプロモヌタヌ、 ?ラク トグロブリンプロモヌ倕 ―、 ポヌ酞性プロティンプロモヌタヌ等が奜適に甚いられる。
怍物個䜓を甚いお本発明のポリべプチドを補造する方法ずしおは、 䟋えば本 発明のポリべプチドをコ䞀ドする D N Aを導入したトランスゞ゚ニック怍物を 公知の方法 〔組織培逊 20 ( 1994)、 組織培逊 21 ( 1995 )、 Trends in
Biotechnology, 15, 45 ( 1997)〕 に準じお栜培し、 該ポリペプチドを該怍物䞭 に生成 '蓄積させ、 該怍物䞭より該ポリペプチドを採取するこずにより、 該ポ リぺプチドを生産する方法があげられる。
䞊蚘圢質転換䜓の培逊液から、 䞊蚘方法により発珟させたポリべプチドを単 離粟補するためには、 通垞の酵玠の単離、 粟補法を甚いればよい。
䟋えば、 本発明のポリペプチドが、 现胞内に溶解状態で発珟した堎合には、 培逊終了埌、 现胞を遠心分離により回収し氎系緩衝液にけん濁埌、 超音波砎砕 機、 フレンチプレス、 マントンガりリンホモゲナむザヌ、 ダむノミル等により 现胞を砎砕し、 無现胞抜出液を埗る。 該無现胞抜出液を遠心分離するこずによ り埗られた䞊枅から、 通垞の酵玠の単離粟補法、 即ち、 溶媒抜出法、 硫安等に よる塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ゞェチルアミノ゚チル DEAE) ヌセファロヌス、 DIAI0N HPA-75 (䞉菱化成瀟補 等レゞンを甚いた陰むオン亀 換クロマトグラフィヌ法、 S-Sepharose FF (フアルマシア瀟補 等のレゞンを 甚いた陜むオン亀換クロマトグラフィヌ法、 ブチルセファロ䞀ス、 プ二ルセ ファロヌス等のレゞンを甚いた疎氎性クロマトグラフィ䞀法、 分子篩を甚いた ゲルろ過法、 ァフィ二ティ䞀クロマトグラフィヌ法、 クロマトフォヌカシング 法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせお甚い、 粟補暙品を埗るこずができる。
たた、 該ポリペプチドが现胞内に䞍溶䜓を圢成しお発珟した堎合は、 同様に 现胞を回収埌砎砕し、 遠心分離を行うこずにより埗られた沈殿画分より、 通垞 の方法により該ポリべプチドを回収埌、 該ポリべプチドの䞍溶䜓をポリべプチ ド倉性剀で可溶化する。 該可溶化液を、 ポリペプチド倉性剀を含たないあるい はポリべプチド倉性剀の濃床がポリべプチドが倉性しない皋床に垌薄な溶液に 垌釈、 あるいは透析し、 該ポリペプチドを正垞な立䜓構造に構成させた埌、 侊 蚘ず同様の単離粟補法により粟補暙品を埗るこずができる。
本発明のポリべプチドあるいはその糖修食䜓等の誘導䜓が现胞倖に分泌され た堎合には、 培逊䞊枅に該ポリべプチドあるいはその糖鎖付加䜓等の誘導䜓を 回収するこずができる。 即ち、 該培逊物を䞊蚘ず同様の遠心分離等の手法によ り凊理するこずにより可溶性画分を取埗し、 該可溶性画分から、 䞊蚘ず同様の 単離粟補法を甚いるこずにより、 粟補暙品を埗るこずができる。
このようにしお取埗されるポリペプチドずしお、 䟋えば、 配列番号 1蚘茉の ァミノ酞配列を有するポリぺプチドをあげるこずができる。
たた、 本発明のポリペプチドは、 F m o c法 フルォレニルメチルォキシカ ルポ二ル法 、 t B o c法  t —ブチルォキシカルボニル法 等の化孊合成法 によっおも補造するこずができる。 たた、 Advanced ChemTech瀟補、 パヌキン · ゚ノレマ——瀟補、 Pharmacia (±補、 Protein Technology Instrument瀟補、
Synthecell- Vega瀟補、 PerSeptive瀟補、 島接補䜜所補等のペプチド合成機を利 甚しお化孊合成するこずもできる。
( 3 ) UDP-GlcNAcの調補
䞊蚘 2) 蚘茉の培逊により埗られた圢質転換䜓の培逊液および該培逊液を 皮々凊理した培逊液の凊理物を酵玠源ずしお甚い、 該酵玠源ず基質ずを氎性媒 䜓䞭に共に存圚させるこずにより、 該氎性媒䜓䞭で UDP-GlcNAcを補造するこず ができる。
培逊液の凊理物ずしおは、 培逊液の濃瞮物、 培逊液の也燥物、 培逊液を遠心 分離しお埗られる菌䜓、 該菌䜓の也燥物、 該菌䜓の凍結也燥物、 該菌䜓の界面 掻性剀凊理物、 該菌䜓の超音波凊理物、 該菌䜓の機械的摩砕凊理物、 該菌䜓の 溶媒凊理物、 該菌䜓の酵玠凊理物、 該菌䜓のポリペプチド分画物、 該菌䜓の固 定化物あるいは該菌䜓より抜出しお埗られる酵玠暙品などをあげるこずができ o
UDP-GlcNAcの生成においお甚いられる酵玠源の濃床ずしおは、 遠心分離によ り培逊液より取埗される菌䜓 湿菌䜓 で換算したずきに、 l〜500g湿菌䜓 /1 であり、奜たしくは 10〜300g湿菌䜓 /1の濃床に盞応する酵玠濃床で甚いられる。
UDP-GkMcの生成においお甚いられる氎性媒䜓ずしおは、 氎、 りん酞塩、 炭 酞塩、 酢酞塩、 ほう酞塩、 クェン酞塩、 トリスなどの緩衝液、 メタノヌル、 ェ 倕ノヌルなどのアルコヌル類、 酢酞ェチルなどの゚ステル類、 アセトンなどの ケトン類、 ァセトアミ ドなどのアミ ド類などをあげるこずができる。 たた、 酵 玠源ずしお甚いた埮生物の培逊液を氎性媒䜓ずしお甚いるこずができる。
UDP-GlcNAcの生成においお、 必芁に応じお界面掻性剀あるいは有機溶媒を添 加しおもよい。 界面掻性剀ずしおは、 ポリオキシ゚チレン ·ォク倕デシルアミ ン 䟋えばナむミヌン S- 215、 日本油脂瀟補 などの非むオン界面掻性剀、 セチ ルトリメチルアンモニゥム · ブロマむ ドゃアルキルゞメチル ·ベンゞルアンモ ニゥムクロラむ ド 䟋えばカチオン F2-40E、 日本油脂瀟補 などのカチオン系 界面掻性剀、 ラりロむル 'ザルコシネヌトなどのァニオン系界面掻性剀、 アル キルゞメチルァミン 䟋えば䞉玚アミン FB、 日本油脂瀟補 などの䞉玚アミン 類など、 UDP-GlcNAcの生成を阻害しないものであればいずれも甚いるこずがで き、 1皮たたは数皮を混合しお䜿甚するこずもできる。 界面掻性剀は、 通垞 0.1 〜50g/lの濃床で甚いられる。 有機溶剀ずしおは、 キシレン、 トル゚ン、 脂肪族 アルコヌル、 アセトン、 酢酞ェチルなどがあげられ、 通垞 0.1〜50ml/lの濃床で 甚いられる。
UDP-GlcNAcの生成においお甚いられる基質ずしおは、 ゥリゞン 5 ' —䞉リン 酞、 およびグルコサミン誘導䜓があげられる。
グルコサミン誘導䜓ずしおは、 グルコサミン䞀 1䞀リン酞およびグルコサミ ン— 6—リン酞から遞ばれるグルコサミンリン酞化物、 たたは N—ァセチルグ ルコサミン— 1―リン酞および N—ァセチルグルコサミン䞀 6 -リン酞から遞 ばれる N—ァセチルダルコサミンリン酞化物があげられる。 グルコサミン誘導 䜓ずしお、 グルコサミンリン酞化物を甚いる堎合は、 ァセチルコェンザィム A (ァセチル C o A ) を添加する必芁があるが、 酵玠源䞭にァセチル C 0 Aが既 に存圚する堎合は、氎性媒䜓䞭にさらにァセチル C 0 Aを添加しなくおもよい。 酵玠源ずしお、 菌䜓より抜出しお埗られる酵玠暙品を甚いるずきは、 グルコ サミン誘導䜓ずしおは、 グルコサミン䞀 1䞀リン酞たたは N—ァセチルグルコ サミン— 1䞀リン酞を甚いるが、 該酵玠源䞭に、 グルコサミン䞀 6—リン酞た たは N—ァセチルグルコサミンヌ 6—リン酞を、 グルコサミン䞀 1―リン酞た たは N—ァセチルグルコサミン䞀 1䞀リン酞に倉換する掻性を有する酵玠が含 たれおいる堎合は、 グルコサミン誘導䜓ずしおは、 グルコサミン䞀 6—リン酞 たたは N—ァセチルグルコサミン䞀 6—リン酞も甚いるこずができる。
これらの基質は 0.1〜500腿 ol/lの濃床で甚いられる。
UDP-GlcNAcの生成反応は氎性媒䜓䞭、 p H5〜10、 奜たしくは p H6〜8、 20 〜60°Cの条件で 1〜96時間行う。 該生成反応においお、 必芁に応じお MgCl2等の 無機塩を添加するこずができる。
氎性媒䜓䞭に生成した UDP- GlcNAcの定量は H P L C等を甚いた公知の方法 [䟋えば W098/12343] により行うこずができる。
反応液䞭に生成した UDP-GlcNAcの採取は、 掻性炭やむオン亀換暹脂などを甚 いる通垞の方法によっお行うこずができる。
以䞋に本発明の実斜䟋を瀺すが、 本発明はこれら実斜䟋に限定されるもので はない。 図面の簡単な説明
第 1図は、玄 7 kbの挿入 D N A断片に぀いお皮々の欠倱プラスミ ドを䜜補し、 コ Uネノ クテリゥム · グノレ倕ミクム (Corynebacteriuin glutamicum) LS6株の枩 床感受性の盞補詊隓を行った結果を瀺した図である。 placは、 ベクタヌ pC2䞊に 存圚するラクトヌスプロモヌタヌの䜍眮を瀺す。 +は枩床感受性を盞補するこ ずを瀺す。 箄 7 kbの挿入 D N A断片の抂略の制限酵玠地図および glmU遺䌝子の 䜍眮ず方向を図䞭に瀺す。 発明を実斜するための最良の圢態
実斜䟋 1 コリネノ クテリゥム'グル倕ミクムCor_ynebacterium glutamicum) ATCC13032株の染色䜓 D N Aの調補
コリネバクテリゥム 'グル倕ミクム (Corynebacteriuin glutamicum) ATCC13032 株を、 10mlの L '培地ポリペプトン 1%、酵母゚キス 0.5Ÿ、塩化ナトリりム 0.5Ÿ、 グルコヌス 0.1%、 チアミン塩酞塩 20mg/l、 pH7.2) に怍菌し、 30°Cでヌ晚培逊 した。
培逊埌、 埗られた培逊液より遠心分離により菌䜓を取埗した。
該菌䜓を T E緩衝液 [ 1 0匪 ol/l ト リス塩酞、 l mol/1゚チレンゞァミン四 酢酞 EDTA) 、 ρ Ηή. Ο] を甚いお掗浄埌、 800〃1の同緩衝液に懞濁した。 懞濁 液に、 50mg/mlのリゟチヌム溶液を 40〃1、 10mg/mlの RNaseA溶液を 20〃 1添加し、 37°Cで 1時間反応させた。
反応液に 20%ドデシル硫酞ナトリりム SDS) 溶液を 20 / 1添加し、 70°Cで 1時 間反応させた。 20mg/mlのプロティナ䞀れ Proteinase) K溶液を 24〃 I添加し、 50°Cで 1時間反応させた。 曎に ProteinaseK溶液を 24 / 1添加し、 50°Cで 1時間反 応させた。 埗られた反応液に、 等量のフヱノヌルを加えお撹拌埌、 4 °Cで 1晚 攟眮し、 D N Aを氎局に抜出し、 氎局を回収した。
該氎局に等量のプノヌル/クロロフオルム 1 : 1、 vol/vol) を加えお撹拌 埌、 2時間抜出し、 氎局を回収した。 該氎局に等量のクロロフオルム /む゜ァ ミルアルコヌル 24: 1、 vol/vol) を加えお撹拌埌、 30分間抜出し、 氎局を回 収した。 該氎局に 2倍量の゚タノヌルを添加し、 D N Aを沈殿させた。 埗られた 沈殿物を 300〃 1の T E緩衝液に溶解し、 染色䜓 D N Aずしお甚いた。 実斜䟋 2 枩床感受性を回埩する遺䌝子の取埗
䞊蚘実斜䟋 1で取埗した染色䜓 D N A0.5 igずプラスミ ド pC2 0.5 ずを i^HIで切断埌、 ラむゲ䞀シペンキット 宝酒造瀟補、 TaKaRa MA Ligation Kit ver.2) を甚いお、 16°Cで 16時間連結反応を行った。
該連結反応液を甚いお、 リゟチヌム z枩床感受性株であるコリネバクテリり ム · グノレタミクム (Corynebacterium glutamicum) LS6株を゚レク 卜口ポレヌシ ペン法 特開平 2-207791) により圢質転換し、 LS6株の生育が枩床感受性である ずいう性質を利甚しお圢質転換䜓を遞択した。 即ち、 該圢質転換䜓を 5 z l/ml のカナマむシンを含む L 寒倩平板培地 L 培地に 1.5%寒倩を加えたもの に塗垃し、 37°Cで 3日間培逊した。
生じたコロニヌを䞊蚘実斜䟋 1に蚘茉の方法に埓っお培逊し、モレキュラヌ . クロ䞀ニング第 2版に蚘茉の方法に埓っおプラスミ ドを回収した。 回収したプ ラスミ ド pV5に぀いお、 その構造を解析したずころ、 プラスミ ド pV5はプラスミ ド pC2の ^HI郚䜍に、 コリネバクテリゥム · グル倕ミクム Corynebacterium glutamicum) 由来の玄 7kbの D N A断片が揷入された構造を有しおいた。 取埗したプラスミ ド pV5に挿入された玄 7kbの D N A断片を甚いお、 垞法に埓 い皮々の欠倱プラスミ ドを䜜補した。 該欠倱プラスミ ドでコリネバクテリり ム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) LS6株を圢質転換し、 該圢質 転換株の枩床感受性を調べたずころ、 枩床感受性の盞補には、 2.3kt Ÿ^HI- 断片が必芁であるこずが刀明した 第 1図 。
該 2.3kbの^ 5HI-^£l断片の D N A塩基配列を決定したずころ、 この領域には 配列番号 1に瀺される 485アミノ酞残基のアミノ酞配列をコ䞀ドする、配列番号 2に瀺される塩基配列からなる 1455bpのオヌプンリヌディングフレヌム O R F ) が存圚しおいた。
BLAST P2.0.10によりアミノ酞配列の盞同性を調べたずころ、 該配列番号 1に 蚘茉されおいるアミノ酞配列ず、 これたでに報告されおいる倧腞菌由来の G 1 mUのアミノ酞配列 J. Biochem. , 115, 965 ( 1994)]ずの盞同性は 40%であり、 Bacillus subtilis由来の G 1 mUのアミノ酞配列 (J. Gen. icrobiol . , 139 3185 ( 1993)]ずの盞同性は 40%であった。
たた、 BLAST N2.0.10により塩基配列の盞同性を調べたずころ、 該アミノ酞配 列をコヌドする配列番号 2に瀺される塩基配列ず既知の配列ずの盞同性は認め られなかった。
該 2.3kbの^ 5|HI- 1断片を含有するプラスミ ド pVllを含む Corynebacterium glutamicum LS6/pVllは、 FERM BP-6937ずしお、 平成 1 1幎 1 1月 1 2日付けで 工業技術院生呜工孊工業技術研究所 日本囜茚城県぀くば巿東 1䞁目 1番 3号 郵䟿番号 305-8566) に寄蚗されおいる。 実斜䟋 3 G l mU掻性の枬定
䞊蚘実斜䟋 2で埗られた Corynebacterum glutamicum LS6/pVll株を䞊蚘実斜 䟋 1蚘茉の方法に埓っお培逊し、 該培逊液を遠心分離し湿菌䜓を取埗した。 該 湿菌䜓は必芁に応じお- 20°Cで保存するこずが可胜で、䜿甚前に解凍しお甚いる こずができた。 終濃床 lOg/1 該湿菌䜓、 100醒 ol/l Tris-HCl (pH8.0) 、 10動 1/1 グルコサ ミン— 1—リン酞、 10顧 ol/l ァセチル C 0 A、 10匪 ol U T P、 2mmol/l MgCl2、 4g/l ナむミ䞀ン S - 2 1 5、 10ml/l キシレンからなる 0.2mlの反応液䞭で、 37°C、 10分間反応を行った。
反応終了埌、 生成した UDP-GlcNAcを W098/12343蚘茉の方法で分析し、 反応液 䞭に 7.4腿01/1の1Ÿ?-610^(が生成蓄積しおいるこずを確認した。ベクタ䞀のみ を含む LS6/pC2株では、 UDP-GlcNAcの生成量は 1.2mmol であ぀た。 産業䞊の利甚可胜性
本発明により、 コリネバクテリりム · グルタミクム (Corynebacterium glutamicum) に属する埮生物由来の G 1 mUポリべプチドを遺䌝子組換え手法 により倧量に生産するこずが可胜ずなる。 たた、 該酵玠を甚いるこずにより効 率的に UDP-GlcMcを補造できる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1蚘茉のアミノ酞配列からなるポリべプチド。
2. 配列番号 1蚘茉のアミノ酞配列においお 1以䞊のアミノ酞が欠倱、 眮 換若しくは付加されたァミノ酞配列からなり、 か぀ N—ァセチルグルコサミン — 1—リン酞ゥリゞルトランスフェラヌれ掻性を有するポリべプチド。
3. 請求項 1たたは 2蚘茉のポリべプチドをコヌドする D N A。
4. 配列番号 2蚘茉の塩基配列を有する D N A。
5. 請求項 3たたは 4蚘茉の D N Aずストリンゞェン卜な条件䞋でハむブ リダむズし、 か぀ N—ァセチルグルコサミン䞀 1—リン酞ゥリゞルトランスフ ェラヌれ掻性を有するポリペプチドをコヌドする D N A。
6. D N Aがコリネバクテリゥム (Corynebacterium) 属に属する埮生物 由来の D N Aである、 請求項 3〜5いずれか 1項に蚘茉の D N A。
7. コリネバクテリゥム (Corynebacterium) 属に属する埮生物がコリネ ノ、"クテリゥム · グノレタミクム (Corynebacterium glutamicum) である、 蚀青求項 6蚘茉の D N A。
8. 請求項 3〜 7いずれか 1項に蚘茉の D N Aをベクタヌに組み蟌んで埗 られる組換え䜓 D N A。
9. 請求項 8蚘茉の組換え䜓 D N Aを宿䞻现胞に導入しお埗られる圢質転 換䜓。
10. 圢質転換䜓がコリネパクテリゥム · グルタミクムである、 請求項 9 蚘茉の圢質転換䜓。
11. 圢質転換䜓 Corynebacterium glutamicum LS6/PV1KFERM BP-6937)。
12. 請求項 9〜 1 1いずれか 1項に蚘茉の圢質転換䜓を培地に培逊し、 培逊物䞭に N—ァセチルグルコサミンヌ 1—リン酞ゥリゞルトランスフェラヌ れ掻性を有するポリべプチドを生成蓄積させ、 該培逊物から該ポリべプチドを 採取するこずを特城ずする、 N—ァセチルグルコサミン䞀 1 䞀リン酞ゥリゞル トランスフ: ラヌれ掻性を有するポリべプチドの補造方法。
13. 請求項 9〜 1 1いずれか 1項に蚘茉の圢質転換䜓を培地に培逊しお 埗られる培逊液たたは該培逊液の凊理物を酵玠源ずしお甚い、 氎性媒䜓䞭に
(a)ゥリゞン 5 ' 䞀䞉リン酞、 グルコサミンリン酞化物およびァセチルコェンザ ィム A、 たたは
(b)ゥリゞン 5 ' —䞉リン酞および N—ァセチルグルコサミンリン酞化物、 から遞ばれる基質、 および該酵玠源を存圚せしめ、 該氎性媒䜓䞭にゥリゞン 5 ' —二リン酞䞀 N—ァセチルグルコサミンを生成蓄積させ、 該氎性媒䜓䞭から ゥリゞン 5 ' —二リン酞ヌ N—ァセチルグルコサミンを採取するこずを特城ず するゥリゞン 5 ' —二リン酞— N—ァセチルグルコサミンの補造法。
14. グルコサミンリン酞化物が、 グルコサミン— 1—リン酞たたはグルコ サミン— 6—リン酞であり、 N—ァセチルグルコサミンリン酞化物が、 N—ァ セチルグルコサミン䞀 1―リン酞たたは N—ァセチルグルコサミンヌ 6 —リン 酞である請求項 1 3蚘茉のゥリゞン 5 ' 䞀二リン酞—N—ァセチルグルコサミ ンの補造法。
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