JP2002199885A - β１，３−ガラクトース転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有す
る蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用
いたβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白
質の製造法、および該蛋白質を用いたガラクトース含有
糖鎖の製造法を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、β１，３−ガラクトー
ス転移酵素活性を有する新規蛋白質、該蛋白質をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転
換体、該形質転換体を用いた上記蛋白質あるいはガラク
トース含有糖鎖の製造法を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、β１，３−ガラク
トース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用
いたβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白
質の製造法、および該形質転換体を用いたガラクトース
含有糖質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子
に関しては、高等動物由来の遺伝子[J. Biol. Chem., 2
73, 58 (1998)、J. Biol. Chem., 273, 12770 (1998)、
J. Biol. Chem., 274, 12499 (1999)]が取得されてい
るが、一般に動物細胞由来の遺伝子を微生物を用いて活
性のある蛋白質として発現させることは困難な場合が多
く、動物由来のβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子
を大腸菌などの微生物を用いて活性のある蛋白質として
発現させた例はない。

【０００３】一方、微生物においては、キャンピロバク
ター・ジェジュニからβ１，３−ガラクトース転移酵素
遺伝子が取得されており、大腸菌を用いて該酵素遺伝子
を発現させた報告があるが、該酵素は、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミンにガラクトースを転移する活性を有する
が、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移す
る活性については報告されていない[J. Biol. Chem., 2
74, 12499 (1999)]。

【０００４】人乳中にはガラクトース含有糖質（ラクト
−Ｎ−テトラオースが主要成分のひとつ）が豊富に含ま
れている [Acta Paediatr., 82, 903 (1993)、J. Pedia
tr.Gastroenterol. Nutr., 30, 181 (2000)]。ガラクト
ース含有オリゴ糖であるラクト−Ｎ−テトラオースやラ
クト−Ｎ−ネオテトラオースは、シュードモナス・エア
ルギノーサにより認識されることが知られていることか
ら[Infect. Immun.,59, 700 (1991）]、ガラクトース含
有糖質はシュードモナス・エアルギノーサの人体への感
染を妨げる、安全な感染予防薬の有力な候補と考えられ
る。

【０００５】しかしながら、ラクト−Ｎ−テトラオース
などのガラクトース含有糖質の製造に関しては、人乳か
らの抽出法や化学合成法が知られているが、いずれもコ
スト面や生産性の面で問題があり、工業的な製造法は未
だ確立されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、β
１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該
蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたβ１，３
−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、
および該蛋白質を用いたガラクトース含有糖質の製造法
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、ストレプトコッカス・
アガラクチエの夾膜多糖生合成に関与する遺伝子群の中
に、これまで見出されていなかったβ１，３−ガラクト
ース転移酵素をコードするＤＮＡを見出し、該ＤＮＡを
取得することにより本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は以下の（１）〜（１９）に
関する。 （１） Ｎ−アセチルグルコサミンにβ１，３結合でガ
ラクトースを転移する活性を有する微生物由来のβ１，
３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。 （２） 微生物が、ストレプトコッカス属に属する微生
物である上記（１）の蛋白質。 （３） ストレプトコッカス属に属する微生物が、スト
レプトコッカス・アガラクチエである上記（２）の蛋白
質。 （４） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋
白質。 （５） 配列番号１で表されるアミノ酸配列において１
個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質。 （６） 上記（１）〜（５）のいずれか１つの蛋白質を
コードするＤＮＡ。 （７） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 （８） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を
コードするＤＮＡ。 （９） 上記（６）〜（８）のいずれか１つのＤＮＡを
ベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。 （１０） 上記（９）の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導
入して得られる形質転換体。 （１１） 宿主細胞が、微生物である上記（１０）の形
質転換体。 （１２） 微生物が、エシェリヒア属に属する微生物で
ある上記（１１）に記載の形質転換体。 （１３） エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒ
ア・コリである上記（１２）の形質転換体。 （１４） 上記（１０）〜（１３）のいずれか１つの形
質転換体を培地に培養し、培養物中にβ１，３−ガラク
トース転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該
培養物から該蛋白質を採取する、β１，３−ガラクトー
ス転移酵素活性を有する蛋白質の製造方法。 （１５） （１０）〜（１３）のいずれか１つの形質転
換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用
い、該酵素源、ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース
および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒
体中でガラクトース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒
体中からガラクトース含有糖質を採取することを特徴と
するガラクトース含有糖質の製造法。 （１６） 培養液の処理物が、培養液の濃縮物、培養液
の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体
の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処
理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理
物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体
の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より
抽出して得られる酵素標品である上記（１５）の製造
法。 （１７） 受容体糖質が、非還元末端にＮ−アセチルグ
ルコサミンを有する糖質である上記（１５）の製造法。 （１８） 受容体糖質が、Ｎ−アセチルグルコサミン、
またはラクト−Ｎ−トリオースIIである上記（１５）の
製造法。 （１９） ガラクトース含有糖質が、ラクト−Ｎ−ビオ
ース、またはラクト−Ｎ−テトラオースである上記（１
５）の製造法。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のβ１，３−ガラクトース
転移酵素活性を有する蛋白質は、非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと略す）を有す
る受容体糖質を基質とする微生物由来のβ１，３−ガラ
クトース転移酵素活性を有する蛋白質であり、例えば、
好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物由来の
β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、
より好ましくはストレプトコッカス・アガラクチエ由来
のβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質
をあげることができる。

【００１０】本発明の蛋白質として、具体的には、配列
番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげる
ことができ、また、配列番号１で表されるアミノ酸配列
において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラク
トース転移酵素活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白
質としてあげることができる。

【００１１】上記の１つ以上のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３
−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質は、Molecu
larCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, C
old Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、
モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons
(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acid
s Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., U
SA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic
Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sc
i., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導
入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配
列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入する
ことにより取得することができる。

【００１２】欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の
数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異誘発法
により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、
１個〜数十個、好ましくは１個〜２０個、より好ましく
は１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個である。
また、本発明の蛋白質がβ１，３−ガラクトース転移酵
素活性を有するためには、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol.,
215, 403(1990)］やＦＡＳＴＡ［Methods. Enzymol.,
183, 63(1990)］等を用いて計算したときに、配列番号
１で表されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好
ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さら
に好ましく９５％以上の相同性を有していることが好ま
しい。

【００１３】本発明のＤＮＡとしては、上記本発明の蛋
白質をコードするＤＮＡをあげることができる。具体的
には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白
質をコードするＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列
からなるＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列
からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列からなるＤＮＡであり、かつβ１，
３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡをあげることができる。

【００１４】上記のストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡとは、配列番号２で表される塩基配
列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブ
リダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーショ
ン法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用い
ることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コ
ロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィ
ルターを用いて、0.7〜1.0 mol/lの塩化ナトリウム存在
下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2
倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、
150 mmol/l塩化ナトリウム、15 mmol/l クエン酸ナトリ
ウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄
することにより同定できるＤＮＡをあげることができ
る。

【００１５】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Cor
e Techniques, A Practical Approach, Second Editio
n, Oxford University (1995)等の実験書に記載されて
いる方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可
能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ
等を用いて計算したときに、配列番号２で表される塩基
配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに
好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげる
ことができる。

【００１６】本発明のβ１，３−ガラクトース転移酵素
活性を有する蛋白質を生産する形質転換体は、例えば上
記した本発明のＤＮＡをモレキュラー・クローニング第
２版に記載の方法に従ってベクターＤＮＡと連結するこ
とで組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用い
てモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従
い宿主細胞を形質転換することにより取得することがで
きる。

【００１７】以下に本発明を詳細に説明する。 ［１］本発明のＤＮＡの調製 本発明のＤＮＡはストレプトコッカスに属する微生物よ
り調製することができる。ストレプトコッカスに属する
微生物としては、例えばストレプトコッカス・アガラク
チエをあげることができ、具体的にはストレプトコッカ
ス・アガラクチエ Type Ib等をあげることができる。

【００１８】ストレプトコッカスに属する微生物を公知
の方法[例えば、J. Bactriol., 181, 5176 (1999)に記
載の方法]により培養する。培養後、公知の方法（例え
ば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体
ＤＮＡを単離精製する。本発明のＤＮＡを含む断片は、
ストレプトコッカス・アガラクチエ Type IIIまたはTyp
e Iaの夾膜多糖生合成遺伝子群中の塩基配列に基づいて
設計された合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼイショ
ン法、ＰＣＲ法などにより取得することができる。

【００１９】該ＤＮＡを連結するベクターとしては、大
腸菌Ｋ１２株中で自立複製可能なベクターであればファ
ージベクター、プラスミドベクター等いずれも使用可能
であるが、具体的には、ZAP Express[ストラタジーン社
製、Strategies, 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK
(+)[ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 94
94 (1989)]、λzap II（ストラタジーン社製）、λgt1
0、λgt11[DNA Cloning, APractical Approach, 1, 49
(1985)]、λ TriplEx（クローンテック社製）、λExCel
l（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製） 、pU
C18[Gene, 33, 103(1985)]等をあげることができる。

【００２０】該ベクターに上記で取得した本発明のＤＮ
Ａを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いるエ
シェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生
物であればいずれでも用いることができるが、具体的に
は、Escherichia coli XL1-Blue MRF' [ストラタジーン
社製、Strategies, 5, 81 (1992)]、Escherichia col i
C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]、Escherichia coli
Y1088 [Science, 222,778 (1983)]、Escherichia coli
Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、Escherichia coli
NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、Escherichia
coli K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]、Escher
ichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等をあげる
ことができる。

【００２１】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレ
ーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等
をあげることができる。

【００２２】上記のようにして得られた形質転換体から
組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本
発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基
配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例
えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5
463 (1977)]または373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキ
ン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いること
ができる。

【００２３】また、上記において決定されたＤＮＡの塩
基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ
社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成すること
によっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得した組換え体ＤＮＡを保有する形
質転換体として、例えば配列番号２で表される塩基配列
を有するプラスミドＤＮＡを保有するEscherichia coli
JM109/pBBPJをあげることができる。 ［２］本発明の蛋白質の調製 本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２
版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下
の方法により、上記［１］の方法により取得した本発明
のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することがで
きる。

【００２４】本発明のＤＮＡを用いる際には、必要に応
じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長
さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該蛋白
質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適な
コドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋
白質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮ
Ａを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発
現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによ
り、組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを、該
発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより
取得することができる。

【００２５】宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現で
きるものであればいずれも用いることができる。発現ベ
クターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能な
いしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転
写できる位置にプロモーターを含有しているものが用い
られる。

【００２６】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡ
は原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモー
ター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結
配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ま
しい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても
よい。

【００２７】発現ベクターとしては、pHelix1（ロシュ
・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム
・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビト
ロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8
（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10
（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 4
8,669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277
(1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 43
06 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS
(+)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [大腸菌JM109/pTr
S30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [大腸菌JM109/pT
rS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、
pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(宝酒造社製)、
pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を
例示することができる。

【００２８】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、Ｐ_SE
プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロ
モーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。ま
たＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ×
２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプ
ロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ
ー等も用いることができる。

【００２９】リボソーム結合配列であるシャイン−ダル
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいて
は、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも
必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配
置することが好ましい。

【００３０】原核生物としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属、ストレプトコッカス属等に属する微生物、例えば、
Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Bl
ue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC100
0、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W148
5、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB10
1、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W311
0、Escherichia coli NY49、Serratia ficaria、Serrat
ia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marc
escens、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Ba
cillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immarioph
ilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATC
C14066、Corynebacterium ammmoniagenes、Corynebacte
rium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutami
cum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC1386
9、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Mic
robacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas s
p.D-0110、Streptococcus agalactiae Type Ia、Strept
ococcus agalactiae TypeIb、Streptococcus agalactia
e Type III、Streptococcus pneumoniae Type 14等をあ
げることができる。

【００３１】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレ
ーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等
をあげることができる。

【００３２】酵母菌株を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC3711
5）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS1
9、pHS15等を用いることができる。プロモーターとして
は、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの
を用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1
プロモーター等のプロモーターをあげることができる。

【００３３】宿主細胞としては、サッカロマイセス属、
シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコ
スポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディ
ダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的に
は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces
pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulan
s、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candi
da utilis等をあげることができる。

【００３４】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enz
ymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 81,4889 (1984)]、酢酸リチウ
ム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげること
ができる。

【００３５】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ
社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特
開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pc
DNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビト
ロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (198
7)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。

【００３６】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate ear
ly）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあ
るいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイル
スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲ
αプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCM
VのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用い
てもよい。

【００３７】宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細
胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ
細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞また
はNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病
細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハ
ムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-29
9）等をあげることができる。

【００３８】マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/
0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、
ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)、29
3等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミ
ドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげること
ができる。組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細
胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いること
ができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechn
ology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2
-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456(1973)
に記載の方法等をあげることができる。

【００３９】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory M
anual, W. H. Freeman and Company, New York (199
2)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manu
al、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法
によって、蛋白質を発現することができる。

【００４０】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができ
る。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとし
ては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（とも
にインビトロジェン社製）等をあげることができる。

【００４１】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s) 等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣
細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができ
る。

【００４２】Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞として
はSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション
・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Tri
choplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4
（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細
胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。組
換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換
え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入
方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-
227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 84,7413 (1987)]等をあげることができる。

【００４３】植物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タ
バコモザイクウイルスベクター等をあげることができ
る。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるも
のであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリ
フラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモータ
ー、イネアクチン１プロモーター等をあげることができ
る。

【００４４】宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、
トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルフ
ァ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげるこ
とができる。組換えベクターの導入方法としては、植物
細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いるこ
とができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/0097
7）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、
パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第26
06856、特許第2517813）等をあげることができる。

【００４５】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行う
ことができる。酵母、動物細胞または昆虫細胞により発
現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質
を得ることができる。

【００４６】以上のようにして得られる形質転換体を培
地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積さ
せ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質
を製造することができる。本発明の形質転換体を培地に
培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に
従って行うことができる。

【００４７】大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類
等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭
素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、
グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有
する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭
水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、
プロパノール等のアルコール類等を用いることができ
る。

【００４８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。

【００４９】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条
件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、
通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持す
る。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、
尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

【００５０】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加
してもよい。

【００５１】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、Eagle
のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Viro
logy, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Me
d., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を
添加した培地等を用いることができる。

【００５２】培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ₂
存在下等の条件下で1〜7日間行う。また、培養中必要に
応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン等の抗生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿
主として得られた形質転換体を培養する培地としては、
一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社
製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社
製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエ
ンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195,
788 (1962)]等を用いることができる。

【００５３】培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下
で1〜5日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマ
イシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。植物細胞
を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、また
は植物の細胞や器官に分化させて培養することができ
る。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用
されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワ
イト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サ
イトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用い
ることができる。

【００５４】培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で
3〜60日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイ
シン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加して
もよい。上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物、動
物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の
培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該
培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を
製造することができる。

【００５５】本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主
細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方
法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、
使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変える
ことにより、該方法を選択することができる。本発明の
蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産され
る場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17
619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl. Acad. Sci., U
SA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（199
0)]、または特開平05-336963、特開平06-823021等に記
載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外
に積極的に分泌させることができる。

【００５６】すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、
本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナ
ルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発
明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることがで
きる。また、特開平2-227075に記載されている方法に準
じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増
幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。

【００５７】さらに、遺伝子導入した動物または植物の
細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動
物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個
体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体
を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。形質
転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法
に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積さ
せ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取する
ことにより、該蛋白質を製造することができる。

【００５８】動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造す
る方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nut
r., 63, 639S (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S
(1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝
子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産す
る方法があげられる。動物個体の場合は、例えば、本発
明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェ
ニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成
・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することによ
り、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成
・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭
63-309192）、卵等をあげることができる。この際に用
いられるプロモーターとしては、動物で発現できるもの
であればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺
細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモータ
ー、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロ
モーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適
に用いられる。

【００５９】植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造す
る方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤ
ＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法
[組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends
Biotechnol.,15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質
を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を
採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげら
れる。

【００６０】本発明の形質転換体により製造された蛋白
質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、
精製法を用いることができる。例えば、本発明の蛋白質
が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了
後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁
後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリン
ホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無
細胞抽出液を得る。

【００６１】該無細胞抽出液を遠心分離することにより
得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶
媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒によ
る沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロー
ス、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰
イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Ph
armacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマト
グラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロ
ース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、
分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグ
ラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳
動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて
用い、精製標品を得ることができる。

【００６２】また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成し
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。

【００６３】本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。

【００６４】このようにして取得される蛋白質として、
例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋
白質をあげることができる。また、本発明の蛋白質を他
の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質
に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロ
ウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA,86, 8227 (1
989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平05-3
36963、特開平06-823021に記載の方法に準じて、本発明
のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質とし
て生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製することができる。

【００６５】また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチド
との融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すること
ができる[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (19
89)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]。更に、該ポリ
ペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーで精製することもできる。

【００６６】上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を
基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）
等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造すること
ができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エ
ルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrume
nt社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所
等のペプチド合成機を利用して化学合成することもでき
る。 ［３］ガラクトース含有糖質の調製 上記［２］の培養により得られた形質転換体の培養液お
よび該培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中
でガラクトース含有糖質を製造することができる。

【００６７】培養液の処理物としては、培養液の濃縮
物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械
的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理
物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは
該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげること
ができる。

【００６８】ガラクトース含有糖鎖の生成において用い
られる酵素源は、37℃で1分間に1 mmolのガラクトース
含有糖質を生成することのできる活性を1単位（Ｕ）と
して、1 mU/l〜1,000 U/lであり、好ましくは10 mU/l〜
100 U/lの濃度で用いる。ガラクトース含有糖鎖の生成
において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、
炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの
緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、
酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン
類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることがで
きる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性
媒体として用いることができる。

【００６９】ガラクトース含有糖質の生成において、必
要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ
い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタ
デシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社
製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアン
モニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルア
ンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油
脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザ
ルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジ
メチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）な
どの三級アミン類など、ガラクトース含有糖質の生成を
促進するものであればいずれでもよく、１種または数種
を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常
0.1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、
キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢
酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用
いられる。

【００７０】ガラクトース含有糖鎖の生成反応は水性媒
体中、pH 5〜10、好ましくはpH 6〜8、20〜50℃の条件
で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じて
ＭnＣｌ₂、ＭgＣｌ₂等の無機塩等を添加することができ
る。水性媒体中に生成したガラクトース含有糖鎖の定量
はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができ
る[Anal. Biochem., 189, 151 (1990)]。

【００７１】反応液中に生成したガラクトース含有糖鎖
の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の
方法によって行うことができる。以下に本発明の実施例
を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

【００７２】

【実施例】実施例１ β１，３−ガラクトース転移酵素
遺伝子を含有するＤＮＡの取得 ［１］ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株か
らの夾膜多糖生合成遺伝子のクローニング（１） ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株をJ. Bac
teriol., 181, 5176 (1999)記載の方法により培養し
た。遠心分離により菌体を取得した後、カレント・プロ
トコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載
の方法に従って、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製し
た。

【００７３】ストレプトコッカス・アガラクチエ Type
IIIの夾膜多糖生合成遺伝子であるcpsD遺伝子周辺の塩
基配列[Mol. Microbiol., 8, 843 (1993)]に基づいて設
計された配列番号４および５で表される塩基配列からな
るＤＮＡをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905
型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成ＤＮＡをプラ
イマーセットとして用い、ストレプトコッカス・アガラ
クチエ Type Ia株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを
行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ 0.1μg、プライマー各
0.5μmol/l、Takara LA Taqポリメラーゼ(宝酒造社製)
2.5 units、Takara LA Taqポリメラーゼ用緩衝液 4μ
l、deoxyNTP各 200μmol/lを含む反応液 40μlを用い、
94℃で1分間、42℃で2分間、72℃で3分間の工程を30回繰
り返すことにより行った。得られた増幅断片をランダム
プライマーDNAラベリングキット(宝酒造社製)を用いて
ラベリングすることにより、プローブを調製した。

【００７４】ストレプトコッカス・アガラクチエ Type
Ia株の染色体ＤＮＡを制限酵素EcoRIにより処理した断
片をpBluescriptII SK(+)に連結して組換え体ＤＮＡを
作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌JM109株を形
質転換することによりライブラリーを作製した。上記で
調製したプローブおよびライブラリーを用いて、常法に
従ってコロニーハイブリダイゼイションを行い、強いシ
グナルを示すクローン１株を取得した。この株の保有す
るプラスミドをpBA101と命名し、その構造を解析したと
ころ、pBluescriptII SK(+)にストレプトコッカス・ア
ガラクチエ Type Ia株の染色体ＤＮＡ由来の 3.5kbの断
片が挿入された構造であった。常法により該ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定したところ、該ＤＮＡ断片には、J. B
acteriol., 181, 5176 (1999)でcpsIaF、cpsIaGおよびc
psIaHと命名された３つの遺伝子とcpsIaEと命名された
遺伝子の一部が見出され、該ＤＮＡ断片は、夾膜多糖生
合成遺伝子群の一部を含有するＤＮＡであることが確認
された。また、相同性検索の結果、cpsIaE遺伝子はグル
コース転移酵素遺伝子、cpsIaG遺伝子はβ１，４−ガラ
クトース転移酵素遺伝子と高い相同性を示すことが確認
された（図１）。 ［２］ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株か
らの夾膜多糖生合成遺伝子のクローニング（２） 実施例１の［１］で得られたプラスミドpBA101に挿入さ
れているストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株
由来の 3.5kbの断片をランダムプライマーDNAラベリン
グキット(宝酒造社製)を用いてラベリングすることによ
り、プローブを調製した。

【００７５】ストレプトコッカス・アガラクチエ Type
Ia株の染色体ＤＮＡを制限酵素BglIIにより処理した断
片をpBluescriptII SK(+)に連結して組換え体ＤＮＡを
作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌JM109株を形
質転換することによりライブラリーを作製した。上記で
調製したプローブおよびライブラリーを用いてコロニー
ハイブリダイゼイションを行い、強いシグナルを示すク
ローン１株を取得した。この株の保有するプラスミドを
pBA103と命名し、その構造を解析したところ、pBluescr
iptII SK(+)にストレプトコッカス・アガラクチエ Type
Ia株の染色体ＤＮＡ由来の 3.1kbのＤＮＡ断片が挿入
された構造であった。常法により該 3.1kbのＤＮＡ断片
の塩基配列を決定したところ、該ＤＮＡ断片には、cpsI
aI、cpsIaJと命名した遺伝子とcpsIaH遺伝子の一部が見
出され、pBA103に保有されるＤＮＡ断片は、pBA101に保
有されるＤＮＡ断片と染色体上で隣接しているＤＮＡで
あることがわかり、pBA103もまた夾膜多糖生合成遺伝子
群の一部のＤＮＡを保有するプラスミドであることが判
明した。また、相同性検索の結果、cpsIaI遺伝子はβ
１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、cp
sIaJはβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子と高い相
同性を示すことが確認された[図１、J. Bacteriol., 18
1, 5176(1999)]。 ［３］ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ib株か
らのβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子を含有する
ＤＮＡの取得 実施例１の［２］で得られたプラスミドpBA103に挿入さ
れているストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株
由来の 3.1kbの断片をランダムプライマーDNAラベリン
グキット(宝酒造社製)を用いてラベリングすることによ
り、プローブを調製した。

【００７６】ストレプトコッカス・アガラクチエ Type
Ib株を、J. Bactriol., 181, 5176(1999)記載の方法に
より培養した。遠心分離により菌体を取得した後、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジーに記載の方法に従って、該微生物の染色体ＤＮＡを
単離精製した。ストレプトコッカス・アガラクチエ Typ
e Ib株の染色体ＤＮＡを制限酵素BglIIにより処理した
断片をpBluescriptII SK(+)に導入し、これを大腸菌JM1
09に形質転換することによりライブラリーを作製した。

【００７７】上記で調製したプローブおよびライブラリ
ーを用いてコロニーハイブリダイゼイションを行い、強
いシグナルを示すクローン2株を取得した。これらの株
の保有するプラスミドをそれぞれpBB102およびpBB103と
命名し、その構造を解析したところ、それぞれpBluescr
iptII SK(+)にストレプトコッカス・アガラクチエ Type
Ib株の染色体ＤＮＡ由来の 5.5および 1.4kbの断片が
挿入された構造であった（図１）。

【００７８】これら２つのＤＮＡ断片について、常法に
従い塩基配列を決定したところ、該２つのＤＮＡ断片は
染色体ＤＮＡ上で隣接して存在しており、配列番号３で
表される連続した塩基配列からなることが明らかとなっ
た。配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡに
は、cpsIbE、cpsIbF、cpsIbG、cpsIbH、cpsIbI、および
cpsIbJと命名される遺伝子が存在することが判明した。
相同性検索の結果、cpsIbE遺伝子はcpsIaE遺伝子および
グルコース転移酵素遺伝子、cpsIbG遺伝子はcpsIaG遺伝
子およびβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子、cpsI
bI遺伝子はcpsIaI遺伝子およびβ１，３−Ｎ−アセチル
ガラクトサミン転移酵素遺伝子と相同性が高かったこと
から、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
は、ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ib株の夾
膜多糖生合成遺伝子群の一部を含有するＤＮＡであるこ
とが確認された。

【００７９】また、配列番号２で表される塩基配列から
なるcpsIbJ遺伝子にコードされる蛋白質は、糖転移酵素
の保存配列を有するが、cpsIaJ遺伝子と相同性が低いこ
と、ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia株にお
ける夾膜多糖生合成においてcpsIaJ遺伝子産物はガラク
トースの転移を担っていること[J. Bactriol., 181,517
6 (1999)]、およびストレプトコッカス・アガラクチエ
Type Ia株とストレプトコッカス・アガラクチエ Type I
b株では該ガラクトースの結合様式がそれぞれβ１，４
とβ１，３と異なっていること[J. Bactriol., 181, 51
76 (1999)]から、cpsIbJ遺伝子はβ１，３−ガラクトー
ス転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡから
なる遺伝子であると推定された。該ＤＮＡにコードされ
る蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。 実施例２ β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子発現
株の造成 パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合
成機を用いて合成した、配列番号６および７で表される
塩基配列からなるＤＮＡを用いて、実施例１の［３］で
取得されたガラクトース転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断
片を、下記の方法で増幅した。

【００８０】上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、
ストレプトコッカス・アガラクチエType Ib株の染色体
ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体Ｄ
ＮＡ0.1μg、プライマー各 0.5μmol/l、Takara LA Taq
ポリメラーゼ(宝酒造社製)2.5 units、Takara LA Taqポ
リメラーゼ用緩衝液 4μl、deoxyNTP各 200μmol/lを含
む反応液 40μlを用い、94℃で1分間、42℃で2分間、72℃
で3分間の工程を30回繰り返すことにより行った。

【００８１】該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳
動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの
反応液からジーンクリーンIIキット(バイオ101社製）を
用いて増幅断片を回収し、該ＤＮＡのＴＥ[10 mmol/l T
ris-HCl、1 mmol/l EDTA (pH8.0)] 溶解液 20μlを得
た。該溶解液 5μlを用い、ＤＮＡを制限酵素NotIおよ
びXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより2.0
kbのＤＮＡ断片を回収した。

【００８２】pBluescriptII SK(+) ＤＮＡ 0.2μgを制
限酵素NotIおよび XhoIで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキッ
トにより 3.0 kbのＤＮＡ断片を回収した。該 2.0 kbお
よび 3.0 kbの断片をライゲーションキットを用いて、1
6℃で16時間、連結反応を行った。

【００８３】該連結反応液を用いて大腸菌JM109株を前
述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン 50μg/mlを含むＬＢ寒天培地[バクトトリプ
トン（ディフコ社製）10 g/l、酵母エキス（ディフコ社
製）10 g/l、塩化ナトリウム5 g/l、寒天15g/l]に塗布
後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコ
ロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出
し、発現プラスミドであるpBBPIJを得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図２）。

【００８４】同様に、パーセプティブ・バイオシステム
ズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号
７および８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライ
マーセットとして用い、ストレプトコッカス・アガラク
チエ Type Ib株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行
った。該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、
目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液
からジーンクリーンIIキット(バイオ101社製）を用いて
増幅断片を回収し、該ＤＮＡのＴＥ溶解液 20μlを得
た。

【００８５】該溶解液 5μlを用い、ＤＮＡを制限酵素
EcoIおよび XhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット
により 1.0 kbのＤＮＡ断片を回収した。pBluescriptII
SK(+) ＤＮＡ 0.2μgを制限酵素 EcoRIおよび XhoIで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分
離し、ジーンクリーンIIキットを用いて 3.0 kbのＤＮ
Ａ断片を回収した。

【００８６】該 1.0 kbおよび 3.0 kbの断片をライゲー
ションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いて大腸菌JM109株を前述の公知
の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリ
ン 50μg/mlを含むＬＢ寒天培地に塗布後、37℃で一晩
培養した。

【００８７】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラ
スミドであるpBBPJを得た。該プラスミドの構造を制限
酵素消化により確認した（図２）。ストレプトコッカス
・アガラクチエ type Ib由来のβ１，３−ガラクトース
転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有
するプラスミドpBBPJを保有する大腸菌 Escherihia col
i JM109/pBBPJは、平成１２年１２月２１日付けで、工
業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−７４００とし
て寄託されている。 実施例３ ラクト−Ｎ−テトラオースの生産 実施例２で得られたEscherichia coli JM109/pBBPIJ株
およびJM109/pBBPJ株をそれぞれアンピシリン 50μg/ml
を含むＬＢ培地 8 mlの入った太型試験管に接種し37℃
で17時間培養した。該培養液をアンピシリン 50μg/ml
を含むＬＢ培地 8ml の入った太型試験管に1％接種し37
℃で5時間培養後、1 mmol/lとなるようにIPTGを添加し
た。さらに2時間培養した後、遠心分離により湿菌体を
取得した。該湿菌体から公知の方法[J. Biol. Chem., 2
72, 19502 (1997)、Mol. Microbiol.,26, 197 (1997)]
に従って膜画分を調製した。該膜画分は必要に応じて-8
0℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができた。

【００８８】受容体糖質となるラクト−Ｎ−トリオース
IIは、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（シグマ社製）に
β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を作用させ、
非還元末端のガラクトースを完全に除去した後、100℃
で5分間熱処理することによりβ−ガラクトシダーゼ活
性を失活させることにより調製した。JM109/pBBPIJ株膜
画分(200μg/ml)、50 mmol/lクエン酸バッファー（pH
7.0）、5 mmol/l ＭｎＣｌ₂、10 mmol/l ラクト−Ｎ−
トリオースII、5 mmol/l ＵＤＰ−ガラクトースからな
る 0.1 mlの反応液中で、37℃で72時間反応を行った。

【００８９】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて以下の分析条件で分析
し、反応液中に 0.2 mmol/lのラクト−Ｎ−テトラオー
スが生成蓄積していることを確認した。同様にJM109/pB
BPJ株の膜画分を用いた場合には、0.05 mmol/lのラクト
−Ｎ−テトラオースが生成蓄積していることが確認でき
た。 分析条件： カラム：CarboPAC PA10 溶離液：A；H₂O、B；500 mmol/l NaOH グラジエント：10−70％ B in 20 min 検出器：パルスドアンペロメトリー検出器

【００９０】

【発明の効果】本発明により、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンにβ１，３結合でガラクトースを転移する活性を有す
る微生物由来のβ１，３−ガラクトース転移酵素が提供
される。該酵素を用いることにより効率的にガラクトー
ス含有糖質を製造できる。

【００９１】

【配列表フリーテキスト】

配列番号４：合成ＤＮＡ 配列番号５：合成ＤＮＡ 配列番号６：合成ＤＮＡ 配列番号７：合成ＤＮＡ 配列番号８：合成ＤＮＡ

【００９２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Beta 1,3-galactosyltransferase and a DNA coding for said enzyme <130> H12-2111A4 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae Type Ib <400> 1 Met Asn Tyr Ser Ile Ile Met Ser Val Tyr Asn Glu Pro Leu Asn Tyr 1 5 10 15 Val Arg Asp Ser Val Glu Ser Ile Leu Asn Gln Thr Leu Thr Asp Phe 20 25 30 Glu Phe Ile Ile Val Ile Asp Asn Pro Ser Arg Gly Asp Leu Lys Gln 35 40 45 Phe Leu Thr Glu Tyr Ser Val Val Asp Asn Arg Ile Lys Ile Leu Leu 50 55 60 Asn Glu Glu Asn Ile Gly Leu Ala Ser Ser Leu Asn Lys Ala Val Lys 65 70 75 80 Ile Ser Lys Gly Glu Tyr Ile Phe Arg Met Asp Ala Asp Asp Ile Ser 85 90 95 Tyr Pro Ser Arg Phe Asp Lys Gln Ile Arg Phe Met Glu Glu Asn Ser 100 105 110 Leu Asp Phe Ser Ala Thr Leu Ile Glu Leu Ile Asp Gln Lys Gly Asn 115 120 125 Leu Val Tyr Lys Gln Arg Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Leu Thr Asn Asp 130 135 140 Ile Arg Lys Met Leu Leu Asn Arg Ser Ile Leu Ala His Pro Thr Trp 145 150 155 160 Cys Val Lys Lys Lys Val Phe Asp Lys Leu Met Gly Tyr Arg Asp Leu 165 170 175 Val Pro Val Glu Asp Tyr Asp Phe Ala Ile Arg Gly Ala Leu Ala Asp 180 185 190 Phe Lys Ile Gly Leu Leu Asn Lys Val Leu Leu Gln Tyr Arg Leu Asn 195 200 205 Glu Asn Gly Ile Ser Gln Thr Asn Lys Phe Lys Gln Tyr Ile Tyr Ser 210 215 220 Ala Ile Leu Gln Asp Phe Tyr Lys Glu Lys Ser Tyr Ile Asp Ile Thr 225 230 235 240 Lys Ile Thr Asn Tyr Phe Gln Glu Tyr Val Ile Lys Lys Arg Tyr Thr 245 250 255 Gln Gln Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Glu Leu Lys Ser Thr Pro Ser Ile 260 265 270 Thr Ile Arg Lys Leu Tyr Ile Cys Leu Tyr Leu Tyr Phe Lys Ser Pro 275 280 285 Leu Val Arg Arg Leu Leu Ile Asn Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Lys 290 295 300 Leu Phe Gly Gly Glu Lys Gln Ser Asp 305 310 313 <210> 2 <211> <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae Type Ib <400> 2 atg aat tat agt atc att atg tcg gta tat aat gag cct tta aat tat 48 Met Asn Tyr Ser Ile Ile Met Ser Val Tyr Asn Glu Pro Leu Asn Tyr 1 5 10 15 gtg aga gat tca gta gaa tct ata tta aat caa acg ctt act gat ttt 96 Val Arg Asp Ser Val Glu Ser Ile Leu Asn Gln Thr Leu Thr Asp Phe 20 25 30 gag ttc ata att gtc att gat aat cca agt aga ggt gat tta aag caa 144 Glu Phe Ile Ile Val Ile Asp Asn Pro Ser Arg Gly Asp Leu Lys Gln 35 40 45 ttc tta aca gaa tat tca gtt gta gat aat aga ata aaa atc ttg ctt 192 Phe Leu Thr Glu Tyr Ser Val Val Asp Asn Arg Ile Lys Ile Leu Leu 50 55 60 aat gaa gaa aat att ggt tta gca tca agt ttg aac aaa gcg gtg aaa 240 Asn Glu Glu Asn Ile Gly Leu Ala Ser Ser Leu Asn Lys Ala Val Lys 65 70 75 80 att tct aag gga gaa tat att ttt aga atg gat gct gat gat att tca 288 Ile Ser Lys Gly Glu Tyr Ile Phe Arg Met Asp Ala Asp Asp Ile Ser 85 90 95 tat cca agt aga ttt gat aag caa att cgt ttt atg gag gaa aat tca 336 Tyr Pro Ser Arg Phe Asp Lys Gln Ile Arg Phe Met Glu Glu Asn Ser 100 105 110 ttg gat ttc tca gca act cta ata gaa ttg ata gac caa aaa gga aat 384 Leu Asp Phe Ser Ala Thr Leu Ile Glu Leu Ile Asp Gln Lys Gly Asn 115 120 125 tta gta tat aaa caa cga gaa agt aat aaa ata tac tta act aat gat 432 Leu Val Tyr Lys Gln Arg Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Leu Thr Asn Asp 130 135 140 ata cgg aag atg tta ttg aat aga tct ata ctt gcc cac cca acg tgg 480 Ile Arg Lys Met Leu Leu Asn Arg Ser Ile Leu Ala His Pro Thr Trp 145 150 155 160 tgc gta aaa aag aaa gtt ttc gat aag tta atg gga tat aga gat tta 528 Cys Val Lys Lys Lys Val Phe Asp Lys Leu Met Gly Tyr Arg Asp Leu 165 170 175 gta cct gtt gaa gat tat gat ttt gca ata aga gga gct ctg gct gat 576 Val Pro Val Glu Asp Tyr Asp Phe Ala Ile Arg Gly Ala Leu Ala Asp 180 185 190 ttc aaa atc ggc tta ctc aat aaa gta ctt tta cag tat aga tta aac 624 Phe Lys Ile Gly Leu Leu Asn Lys Val Leu Leu Gln Tyr Arg Leu Asn 195 200 205 gag aat gga ata tca caa acc aat aag ttt aag caa tat att tac tca 672 Glu Asn Gly Ile Ser Gln Thr Asn Lys Phe Lys Gln Tyr Ile Tyr Ser 210 215 220 gct att tta caa gat ttt tat aaa gaa aaa tct tat att gat atc aca 720 Ala Ile Leu Gln Asp Phe Tyr Lys Glu Lys Ser Tyr Ile Asp Ile Thr 225 230 235 240 aaa att act aat tac ttt caa gag tat gtg ata aag aaa cgc tat act 768 Lys Ile Thr Asn Tyr Phe Gln Glu Tyr Val Ile Lys Lys Arg Tyr Thr 245 250 255 cag caa gag ctc tct aaa tat ttt gag cta aaa tct acc cct agt att 816 Gln Gln Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Glu Leu Lys Ser Thr Pro Ser Ile 260 265 270 act att aga aaa cta tat att tgt tta tat tta tac ttt aag tct ccc 864 Thr Ile Arg Lys Leu Tyr Ile Cys Leu Tyr Leu Tyr Phe Lys Ser Pro 275 280 285 ttg gtt agg agg tta tta ata aat gat att aat att tta gta ctg aaa 912 Leu Val Arg Arg Leu Leu Ile Asn Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Lys 290 295 300 ttg ttt gga gga gag aaa caa agt gac 939 Leu Phe Gly Gly Glu Lys Gln Ser Asp 305 310 <210> 3 <211> 6865 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae Type Ib <220> <221> CDS <222> (617)..(1789) <220> <221> CDS <222> (1816)..(2262) <220> <221> CDS <222> (2265)..(2744) <220> <221> CDS <222> (2843)..(3979) <220> <221> CDS <222> (3982)..(4953) <220> <221> CDS <222> (5009)..(5947) <400> 3 agatcttgga gatattatct gtgaaaccaa tgttcctaga ctgatggtcg ttccttcagg 60 gaaagtacca ccaaatccaa cagcattact tcagaacgct tattttaata agatgattga 120 agctattaaa aatatatttg attatattat catcgatact ccacctattg gtttagttgt 180 tgatgccgca ataatcgcta atgcttgcga tggttttatt ttagtaaccc aagcaggtag 240 aataaaacgt aattatgttg aaaaagcaaa agaacagatg gaacaaagtg gttcaaagtt 300 cttaggtatt attcttaata aagttaatga atctgttgct acttacggcg attatggaaa 360 ttacggaaaa agggatagaa aaaggaagta aggggctctt gtattgaaag aaaaagaaaa 420 tatacaaaag attattatag cgatgattca aaccgttgtg gtttattttt ctgcaagttt 480 gacattaaca ttaattactc ccaactttaa aagcaataaa gatttattgt ttgttctatt 540 gatacattat attgtctttt atctttctga tttttacaga gacttttgga gtcgtggcta 600 tcttgaagag tttaaa atg gta ttg aaa tac agc ttt tac tat att ttc ata 652 Met Val Leu Lys Tyr Ser Phe Tyr Tyr Ile Phe Ile 1 5 10 tca agt tca tta ttt ttt att tct aaa aac tct ttt aca acg aca cga 700 Ser Ser Ser Leu Phe Phe Ile Ser Lys Asn Ser Phe Thr Thr Thr Arg 15 20 25 ctt tcc ttt ttt act ttt att gct atg aat tcg att tta tta tat cta 748 Leu Ser Phe Phe Thr Phe Ile Ala Met Asn Ser Ile Leu Leu Tyr Leu 30 35 40 ttg aat tca ttt tta aaa tat tat cga aaa tat tct tac gct aag ttt 796 Leu Asn Ser Phe Leu Lys Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ser Tyr Ala Lys Phe 45 50 55 60 tca cga gat acc aaa gtt gtt ttg ata acg aat aag gat tct tta tca 844 Ser Arg Asp Thr Lys Val Val Leu Ile Thr Asn Lys Asp Ser Leu Ser 65 70 75 aaa atg acc ttt agg aat aaa tac gac cat aat tat atc gct gtc tgt 892 Lys Met Thr Phe Arg Asn Lys Tyr Asp His Asn Tyr Ile Ala Val Cys 80 85 90 atc ttg gat tcc tct gaa aag gat tgt tat gat ttg aaa cat aac tcg 940 Ile Leu Asp Ser Ser Glu Lys Asp Cys Tyr Asp Leu Lys His Asn Ser 95 100 105 tta agg ata ata aac aaa gat gct ctt act tca gag tta acc tgc tta 988 Leu Arg Ile Ile Asn Lys Asp Ala Leu Thr Ser Glu Leu Thr Cys Leu 110 115 120 act gtt gat caa gct ttt att aac ata ccc att gaa tta ttt ggt aaa 1036 Thr Val Asp Gln Ala Phe Ile Asn Ile Pro Ile Glu Leu Phe Gly Lys 125 130 135 140 tac caa ata caa gat att att aat gac att gaa gca atg gga gtg att 1084 Tyr Gln Ile Gln Asp Ile Ile Asn Asp Ile Glu Ala Met Gly Val Ile 145 150 155 gtc aat gtt aat gta gag gca ctt agc ttt gat aat ata gga gaa aag 1132 Val Asn Val Asn Val Glu Ala Leu Ser Phe Asp Asn Ile Gly Glu Lys 160 165 170 cga atc caa act ttt gaa gga tat agt gtt att aca tat tct atg aaa 1180 Arg Ile Gln Thr Phe Glu Gly Tyr Ser Val Ile Thr Tyr Ser Met Lys 175 180 185 ttc tat aaa tat agt cac ctt ata gca aaa cga ttt ttg gat atc atg 1228 Phe Tyr Lys Tyr Ser His Leu Ile Ala Lys Arg Phe Leu Asp Ile Met 190 195 200 ggt gct att ata ggt ttg ctc ata tgt ggc att gtg gca att ttt cta 1276 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Leu Ile Cys Gly Ile Val Ala Ile Phe Leu 205 210 215 220 gtt ccg caa atc aga aaa gat ggt gga ccg gct atc ttt tct caa aat 1324 Val Pro Gln Ile Arg Lys Asp Gly Gly Pro Ala Ile Phe Ser Gln Asn 225 230 235 aga gta ggt cgt aat ggt agg att ttt aga ttc tat aaa ttc aga tca 1372 Arg Val Gly Arg Asn Gly Arg Ile Phe Arg Phe Tyr Lys Phe Arg Ser 240 245 250 atg cga gta gat gca gaa caa att aag aaa gat tta tta gtt cac aat 1420 Met Arg Val Asp Ala Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Leu Val His Asn 255 260 265 caa atg acg ggg cta atg ttt aag tta gac gat gat cct aga att act 1468 Gln Met Thr Gly Leu Met Phe Lys Leu Asp Asp Asp Pro Arg Ile Thr 270 275 280 aaa ata gga aaa ttt att cga aaa aca agc ata gat gag ttg cct caa 1516 Lys Ile Gly Lys Phe Ile Arg Lys Thr Ser Ile Asp Glu Leu Pro Gln 285 290 295 300 ttc tat aat gtt tta aaa ggt gat atg agt tta gta gga aca cgc cct 1564 Phe Tyr Asn Val Leu Lys Gly Asp Met Ser Leu Val Gly Thr Arg Pro 305 310 315 ccc aca gtt gat gaa tat gaa aag tat aat tca acg cag aag cga cgc 1612 Pro Thr Val Asp Glu Tyr Glu Lys Tyr Asn Ser Thr Gln Lys Arg Arg 320 325 330 ctt agt ttt aag cca gga atc act ggt ttg tgg caa ata tct ggt aga 1660 Leu Ser Phe Lys Pro Gly Ile Thr Gly Leu Trp Gln Ile Ser Gly Arg 335 340 345 aat aat att act gat ttt gat gaa atc gta aag tta gat gtt caa tat 1708 Asn Asn Ile Thr Asp Phe Asp Glu Ile Val Lys Leu Asp Val Gln Tyr 350 355 360 atc aat gaa tgg tct att tgg tca gat att aag att att ctc cta acg 1756 Ile Asn Glu Trp Ser Ile Trp Ser Asp Ile Lys Ile Ile Leu Leu Thr 365 370 375 380 cta aag gta gtt tta ctc ggg aca gga gct aag taaaggtaag gtttgaaagg 1809 Leu Lys Val Val Leu Leu Gly Thr Gly Ala Lys 385 390 aatata atg aaa att tgt ctg gtt ggt tca agt ggt ggt cac cta gca 1857 Met Lys Ile Cys Leu Val Gly Ser Ser Gly Gly His Leu Ala 395 400 405 cac ttg aac ctt ttg aaa ccc att tgg gaa aaa gaa gat agg ttt tgg 1905 His Leu Asn Leu Leu Lys Pro Ile Trp Glu Lys Glu Asp Arg Phe Trp 410 415 420 gta act ttt gat aaa gaa gat gct agg agt att cta aga gaa gag att 1953 Val Thr Phe Asp Lys Glu Asp Ala Arg Ser Ile Leu Arg Glu Glu Ile 425 430 435 gta tat cat tgc ttc ttt cca aca aac cgt aat gtc aaa aac ttg gta 2001 Val Tyr His Cys Phe Phe Pro Thr Asn Arg Asn Val Lys Asn Leu Val 440 445 450 aaa aat act att cta gct ttt aag gtc ctt aga aaa gaa aga cca gat 2049 Lys Asn Thr Ile Leu Ala Phe Lys Val Leu Arg Lys Glu Arg Pro Asp 455 460 465 gtt atc ata tca tct ggt gcc gct gta gca gta cca ttc ttt tat att 2097 Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala Ala Val Ala Val Pro Phe Phe Tyr Ile 470 475 480 485 ggt aag tta ttt ggc tgt aag acc gtt tat ata gag gtt ttc gac agg 2145 Gly Lys Leu Phe Gly Cys Lys Thr Val Tyr Ile Glu Val Phe Asp Arg 490 495 500 ata gat aaa cca act ttg aca gga aaa tta gtg tat cct gta aca gat 2193 Ile Asp Lys Pro Thr Leu Thr Gly Lys Leu Val Tyr Pro Val Thr Asp 505 510 515 aaa ttt att gtt cag tgg gaa gaa atg aaa aaa gtt tat cct aag gca 2241 Lys Phe Ile Val Gln Trp Glu Glu Met Lys Lys Val Tyr Pro Lys Ala 520 525 530 att aat tta gga gga att ttt ta atg att ttt gtc aca gta ggg aca 2288 Ile Asn Leu Gly Gly Ile Phe Met Ile Phe Val Thr Val Gly Thr 535 540 545 cat gaa cag cag ttc aac cgt ctt att aaa gaa gtt gat aga tta aaa 2336 His Glu Gln Gln Phe Asn Arg Leu Ile Lys Glu Val Asp Arg Leu Lys 550 555 560 ggg aca ggt gct att gat caa gaa gtg ttc att caa acg ggt tac tca 2384 Gly Thr Gly Ala Ile Asp Gln Glu Val Phe Ile Gln Thr Gly Tyr Ser 565 570 575 580 gac ttt gaa cct cag aat tgt cag tgg tca aaa ttt ctc tca tat gat 2432 Asp Phe Glu Pro Gln Asn Cys Gln Trp Ser Lys Phe Leu Ser Tyr Asp 585 590 595 gat atg aac tct tac atg aaa gaa gct gag att gtt atc aca cac ggc 2480 Asp Met Asn Ser Tyr Met Lys Glu Ala Glu Ile Val Ile Thr His Gly 600 605 610 ggt cca gca acg ttt atg aat gca gtt tct aaa ggg aaa aaa act att 2528 Gly Pro Ala Thr Phe Met Asn Ala Val Ser Lys Gly Lys Lys Thr Ile 615 620 625 gtg gtt cct aga caa gaa cag ttt gga gag cat gtg aat aat cat cag 2576 Val Val Pro Arg Gln Glu Gln Phe Gly Glu His Val Asn Asn His Gln 630 635 640 gtg gat ttt ttg aaa gag tta ttc ttg aaa tat gag tta gat tat att 2624 Val Asp Phe Leu Lys Glu Leu Phe Leu Lys Tyr Glu Leu Asp Tyr Ile 645 650 655 660 ttg aat atc agt gaa tta gag aat att att aag gaa aaa aat ata tct 2672 Leu Asn Ile Ser Glu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Glu Lys Asn Ile Ser 665 670 675 act agt aaa gta ata tca caa aac aat gat ttt tgt tcc tct ttc aaa 2720 Thr Ser Lys Val Ile Ser Gln Asn Asn Asp Phe Cys Ser Ser Phe Lys 680 685 690 aat gaa ctt tct aaa cta ttt gaa taaatatatt ttgttggaga aaaaaattga 2774 Asn Glu Leu Ser Lys Leu Phe Glu 695 700 aattaactat caatccaaag tatttgttaa taggaggaat tttcgcttta accctatttt 2834 caaagcca atg caa ctt ttg tta ctt tta gca tta ata gtt tta ctt att 2884 Met Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Val Leu Leu Ile 705 710 tgt agt agt tat aat gaa aaa atg aaa ttt tta aat atg gct gaa att 2932 Cys Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Met Lys Phe Leu Asn Met Ala Glu Ile 715 720 725 730 ttt ttc att gta ttt tat atg gtt tat tta gta tca ata gta tta aat 2980 Phe Phe Ile Val Phe Tyr Met Val Tyr Leu Val Ser Ile Val Leu Asn 735 740 745 tcg tta ttt aga agt cca gaa ttt cat aga gtc att gct gca ttc aat 3028 Ser Leu Phe Arg Ser Pro Glu Phe His Arg Val Ile Ala Ala Phe Asn 750 755 760 tca ctg gca gta ggg gtt gtg tcc tta tta ttt tac cat tac tat aag 3076 Ser Leu Ala Val Gly Val Val Ser Leu Leu Phe Tyr His Tyr Tyr Lys 765 770 775 aat act aat att gaa tta aca aaa ttg cta aaa tca ttt ttg ttt aat 3124 Asn Thr Asn Ile Glu Leu Thr Lys Leu Leu Lys Ser Phe Leu Phe Asn 780 785 790 gca att att ttg ttt tgt tta gga ttt cta tat tat tat gcc ata tat 3172 Ala Ile Ile Leu Phe Cys Leu Gly Phe Leu Tyr Tyr Tyr Ala Ile Tyr 795 800 805 810 ttt gat gta gag aat gta agt ctt ttt gga aga aat tta att gga tca 3220 Phe Asp Val Glu Asn Val Ser Leu Phe Gly Arg Asn Leu Ile Gly Ser 815 820 825 gat tgg ata aat ggg atg cat acg cag aga gca atg gct ttc ttt gaa 3268 Asp Trp Ile Asn Gly Met His Thr Gln Arg Ala Met Ala Phe Phe Glu 830 835 840 tat tca aat ctt ata ata ccc tta act atc ata act aat ata tat ata 3316 Tyr Ser Asn Leu Ile Ile Pro Leu Thr Ile Ile Thr Asn Ile Tyr Ile 845 850 855 tat ata tat att aag caa aga tat agc tca ggg atg atg ata ctc ggt 3364 Tyr Ile Tyr Ile Lys Gln Arg Tyr Ser Ser Gly Met Met Ile Leu Gly 860 865 870 gct ctt ctc tcc act att ata cta ccc atc ggg tct gga tct aga gct 3412 Ala Leu Leu Ser Thr Ile Ile Leu Pro Ile Gly Ser Gly Ser Arg Ala 875 880 885 890 ggt att ata gtt gtg cta cta cag gtt ata att tta ttg ttg aat aca 3460 Gly Ile Ile Val Val Leu Leu Gln Val Ile Ile Leu Leu Leu Asn Thr 895 900 905 att gta ata aaa aga caa acg ata aga ttt ttc ctg tat tta gtt ccg 3508 Ile Val Ile Lys Arg Gln Thr Ile Arg Phe Phe Leu Tyr Leu Val Pro 910 915 920 ata cta ata tta cta tta gtg ata tta cgt ttt gat aat ttg gtg agc 3556 Ile Leu Ile Leu Leu Leu Val Ile Leu Arg Phe Asp Asn Leu Val Ser 925 930 935 ata tat aat aga ata atc aat ttg cgg tcg gga agt agt gaa tct aga 3604 Ile Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Leu Arg Ser Gly Ser Ser Glu Ser Arg 940 945 950 ttt tct ttg tac aag gat acc gta cac tca gta att act gac tca cta 3652 Phe Ser Leu Tyr Lys Asp Thr Val His Ser Val Ile Thr Asp Ser Leu 955 960 965 970 ttt ctg gga aaa ggt gta aaa gaa ttg tgg tta aat agt gat tta cca 3700 Phe Leu Gly Lys Gly Val Lys Glu Leu Trp Leu Asn Ser Asp Leu Pro 975 980 985 cta gga tcg cat tcg acc tac ata ggt tat ttc tat aaa act ggc cta 3748 Leu Gly Ser His Ser Thr Tyr Ile Gly Tyr Phe Tyr Lys Thr Gly Leu 990 995 1000 ttt gga cta ata aat gtg att tta ggt ttg ttt cta att ctt att agc 3796 Phe Gly Leu Ile Asn Val Ile Leu Gly Leu Phe Leu Ile Leu Ile Ser 1005 1010 1015 att atc aag gaa gct aaa aag tca gat ttc tat tat gag ata gta ggg 3844 Ile Ile Lys Glu Ala Lys Lys Ser Asp Phe Tyr Tyr Glu Ile Val Gly 1020 1025 1030 tct gtc ata ctc cta ttt tca ttt ttt gca ctt gaa gat att gat ggc 3892 Ser Val Ile Leu Leu Phe Ser Phe Phe Ala Leu Glu Asp Ile Asp Gly 1035 1040 1045 1050 gcc aat tgg ctc att att ttt gtc ttt aca gtg ttg gga att tta gaa 3940 Ala Asn Trp Leu Ile Ile Phe Val Phe Thr Val Leu Gly Ile Leu Glu 1055 1060 1065 aat aag gat ttc tat agt caa ctt aaa agg tgg gaa agt ta atg gaa 3987 Asn Lys Asp Phe Tyr Ser Gln Leu Lys Arg Trp Glu Ser Met Glu 1070 1075 1080 aaa caa ata ctt gtt tct atc gtt ata cct ata tac aac tcg gaa gca 4035 Lys Gln Ile Leu Val Ser Ile Val Ile Pro Ile Tyr Asn Ser Glu Ala 1085 1090 1095 tat ctt aaa gaa tgc gtg caa tcc gtc cta caa cag act cat tca ttg 4083 Tyr Leu Lys Glu Cys Val Gln Ser Val Leu Gln Gln Thr His Ser Leu 1100 1105 1110 ata gaa gtt ata ctg att aat gat gga tcc act gat aat agt gga gaa 4131 Ile Glu Val Ile Leu Ile Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn Ser Gly Glu 1115 1120 1125 att tgt gat aat tta tct caa aaa gac gat cgc ata ctt gta ttt cat 4179 Ile Cys Asp Asn Leu Ser Gln Lys Asp Asp Arg Ile Leu Val Phe His 1130 1135 1140 1145 aaa aaa aat gga ggg gta tct tcg gca agg aac cta ggt ctt gat aaa 4227 Lys Lys Asn Gly Gly Val Ser Ser Ala Arg Asn Leu Gly Leu Asp Lys 1150 1155 1160 tcc aca ggc gaa ttc ata acg ttt gta gat agt gat gat ttt gta gca 4275 Ser Thr Gly Glu Phe Ile Thr Phe Val Asp Ser Asp Asp Phe Val Ala 1165 1170 1175 ccg aat ata att gaa ata atg tta aaa aat tta atc act gag gat gct 4323 Pro Asn Ile Ile Glu Ile Met Leu Lys Asn Leu Ile Thr Glu Asp Ala 1180 1185 1190 gat ata gca gaa gta gat ttt gat att tcg aat gag aga gat tat aga 4371 Asp Ile Ala Glu Val Asp Phe Asp Ile Ser Asn Glu Arg Asp Tyr Arg 1195 1200 1205 aag aaa aaa aga cga aac ttt tat aag gtc ttt aaa aac aat aat tct 4419 Lys Lys Lys Arg Arg Asn Phe Tyr Lys Val Phe Lys Asn Asn Asn Ser 1210 1215 1220 1225 tta aaa gaa ttt tta tca ggt aat aga gtg gaa aat att gtt tgt aca 4467 Leu Lys Glu Phe Leu Ser Gly Asn Arg Val Glu Asn Ile Val Cys Thr 1230 1235 1240 aaa tta tat aaa aaa agt ata att ggt aac ttg agg ttt gat gag aat 4515 Lys Leu Tyr Lys Lys Ser Ile Ile Gly Asn Leu Arg Phe Asp Glu Asn 1245 1250 1255 tta aaa att ggt gag gat tta ctt ttt aat tgt aaa att tta tgt caa 4563 Leu Lys Ile Gly Glu Asp Leu Leu Phe Asn Cys Lys Ile Leu Cys Gln 1260 1265 1270 gag cac tgc ata gtc gta gat acg act tct tcc ttg tac acc tat cgc 4611 Glu His Cys Ile Val Val Asp Thr Thr Ser Ser Leu Tyr Thr Tyr Arg 1275 1280 1285 atc gta aag act tct gca atg aat cag gag ttc aac gaa aat tca tta 4659 Ile Val Lys Thr Ser Ala Met Asn Gln Glu Phe Asn Glu Asn Ser Leu 1290 1295 1300 1305 gat ttt ata aca att ttt aat gaa ata agc agt att gtt cct gca aaa 4707 Asp Phe Ile Thr Ile Phe Asn Glu Ile Ser Ser Ile Val Pro Ala Lys 1310 1315 1320 tta gct aat tat gtt gaa gcg aaa ttt tta aga gaa aag gta aag tgt 4755 Leu Ala Asn Tyr Val Glu Ala Lys Phe Leu Arg Glu Lys Val Lys Cys 1325 1330 1335 ctc cga aaa atg ttt gaa tta ggt agt aat att gac agt aaa atc aaa 4803 Leu Arg Lys Met Phe Glu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Ser Lys Ile Lys 1340 1345 1350 tta caa cga gag att ttt ttc aaa gat gtt aaa tta tac cct ttc tat 4851 Leu Gln Arg Glu Ile Phe Phe Lys Asp Val Lys Leu Tyr Pro Phe Tyr 1355 1360 1365 aaa gcg gtt aag tac tta tca tta aag gga tta ttg agt att tac tta 4899 Lys Ala Val Lys Tyr Leu Ser Leu Lys Gly Leu Leu Ser Ile Tyr Leu 1370 1375 1380 1385 atg aaa tgt tca ccc atc ttg tat ata aaa tta tat gac agg ttt caa 4947 Met Lys Cys Ser Pro Ile Leu Tyr Ile Lys Leu Tyr Asp Arg Phe Gln 1390 1395 1400 aaa cag taagtaatca aaaattaaat taactcaatt accttttaaa ttataggagt 5003 Lys Gln tgaaa atg aat tat agt atc att atg tcg gta tat aat gag cct tta aat 5053 Met Asn Tyr Ser Ile Ile Met Ser Val Tyr Asn Glu Pro Leu Asn 1405 1410 1415 tat gtg aga gat tca gta gaa tct ata tta aat caa acg ctt act gat 5101 Tyr Val Arg Asp Ser Val Glu Ser Ile Leu Asn Gln Thr Leu Thr Asp 1420 1425 1430 ttt gag ttc ata att gtc att gat aat cca agt aga ggt gat tta aag 5149 Phe Glu Phe Ile Ile Val Ile Asp Asn Pro Ser Arg Gly Asp Leu Lys 1435 1440 1445 1450 caa ttc tta aca gaa tat tca gtt gta gat aat aga ata aaa atc ttg 5197 Gln Phe Leu Thr Glu Tyr Ser Val Val Asp Asn Arg Ile Lys Ile Leu 1455 1460 1465 ctt aat gaa gaa aat att ggt tta gca tca agt ttg aac aaa gcg gtg 5245 Leu Asn Glu Glu Asn Ile Gly Leu Ala Ser Ser Leu Asn Lys Ala Val 1470 1475 1480 aaa att tct aag gga gaa tat att ttt aga atg gat gct gat gat att 5293 Lys Ile Ser Lys Gly Glu Tyr Ile Phe Arg Met Asp Ala Asp Asp Ile 1485 1490 1495 tca tat cca agt aga ttt gat aag caa att cgt ttt atg gag gaa aat 5341 Ser Tyr Pro Ser Arg Phe Asp Lys Gln Ile Arg Phe Met Glu Glu Asn 1500 1505 1510 tca ttg gat ttc tca gca act cta ata gaa ttg ata gac caa aaa gga 5389 Ser Leu Asp Phe Ser Ala Thr Leu Ile Glu Leu Ile Asp Gln Lys Gly 1515 1520 1525 1530 aat tta gta tat aaa caa cga gaa agt aat aaa ata tac tta act aat 5437 Asn Leu Val Tyr Lys Gln Arg Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Leu Thr Asn 1535 1540 1545 gat ata cgg aag atg tta ttg aat aga tct ata ctt gcc cac cca acg 5485 Asp Ile Arg Lys Met Leu Leu Asn Arg Ser Ile Leu Ala His Pro Thr 1550 1555 1560 tgg tgc gta aaa aag aaa gtt ttc gat aag tta atg gga tat aga gat 5533 Trp Cys Val Lys Lys Lys Val Phe Asp Lys Leu Met Gly Tyr Arg Asp 1565 1570 1575 tta gta cct gtt gaa gat tat gat ttt gca ata aga gga gct ctg gct 5581 Leu Val Pro Val Glu Asp Tyr Asp Phe Ala Ile Arg Gly Ala Leu Ala 1580 1585 1590 gat ttc aaa atc ggc tta ctc aat aaa gta ctt tta cag tat aga tta 5629 Asp Phe Lys Ile Gly Leu Leu Asn Lys Val Leu Leu Gln Tyr Arg Leu 1595 1600 1605 1610 aac gag aat gga ata tca caa acc aat aag ttt aag caa tat att tac 5677 Asn Glu Asn Gly Ile Ser Gln Thr Asn Lys Phe Lys Gln Tyr Ile Tyr 1615 1620 1625 tca gct att tta caa gat ttt tat aaa gaa aaa tct tat att gat atc 5725 Ser Ala Ile Leu Gln Asp Phe Tyr Lys Glu Lys Ser Tyr Ile Asp Ile 1630 1635 1640 aca aaa att act aat tac ttt caa gag tat gtg ata aag aaa cgc tat 5773 Thr Lys Ile Thr Asn Tyr Phe Gln Glu Tyr Val Ile Lys Lys Arg Tyr 1645 1650 1655 act cag caa gag ctc tct aaa tat ttt gag cta aaa tct acc cct agt 5821 Thr Gln Gln Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Glu Leu Lys Ser Thr Pro Ser 1660 1665 1670 att act att aga aaa cta tat att tgt tta tat tta tac ttt aag tct 5869 Ile Thr Ile Arg Lys Leu Tyr Ile Cys Leu Tyr Leu Tyr Phe Lys Ser 1675 1680 1685 1690 ccc ttg gtt agg agg tta tta ata aat gat att aat att tta gta ctg 5917 Pro Leu Val Arg Arg Leu Leu Ile Asn Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu 1695 1700 1705 aaa ttg ttt gga gga gag aaa caa agt gac taatagaaaa atttatgtat 5967 Lys Leu Phe Gly Gly Glu Lys Gln Ser Asp 1710 1715 gtcatactct ttatcattta ttgatttgtt tatataaaga agagatatat tcaaatttag 6027 aaattattct ctcttcttct attcctgatg ttgataattt agagaaaaaa ttaaaatcaa 6087 aaacaataaa tatacatatt ttagaagaat ctagtggtga aagtgaagaa ttattatcag 6147 tacttaaaga tgctggtcta agttatagta agtttgatag taattgtttt atttttaatg 6207 atgcaacgcc tattgggagg acactaataa agcatggtat ttattataat ctaattgaag 6267 atggtttaaa ttgttttact tactctatat ttagtcaaaa actttggaag tattatgtaa 6327 aaaaatatat tcttcacaaa attcagccac atggattttc acgatattgt ttagggattg 6387 aagttaattc attagttaat ttgccaaagg atccgcgtta taaaaaattt attgaagtcc 6447 ctaggaaaga actttttgac aatgtaacag aatatcaaaa agaaatggca ataaatcttt 6507 ttggagcagt aagagttagt attaaatcac cttcagtact agtattaacg cagcctctat 6567 ctatagataa agagtttatg agttataaca ataagataga aacgtccgaa gaacaattta 6627 atttttataa atcaatagtc aatgaatata taaataaagg gtacaatgtt tatttaaaag 6687 ttcatcctag agatgtagta gattattcca aattgccggt agagctatta ccatcaaatg 6747 ttcctatgga aattatagag ttgatgttaa caggtcggtt cgaatgtggg ataacacatt 6807 cgtccactgc gctggatttt ttaacttgtg ttgataaaaa aataacttta gtagatct 6865 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 gggggatcca atggtattga aatacag 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 5 aatctgcaga cttagctcct gtcccgagt 29 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 6 ccaagcggcc gctatagtca acttaaaagg tgg 33 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 7 cggctcgagt cccaataggc gttgcatc 28 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> ccggaattcg aaaaggtaaa gtgtctccga aa 32

【図面の簡単な説明】

【図１】 ストレプトコッカス・アガラクチエ Type Ia
株およびTypeIb株の夾膜多糖生合成遺伝子の構造を示
す。

【図２】 β１，3−ガラクトース転移酵素発現プラス
ミドpBBPIJおよびpBBPJの造成工程を示す。

【符号の説明】

Ｐ_lac：lacプロモーター cpsI：β１，3−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺
伝子 cpsJ：β１，3−ガラクトース転移酵素遺伝子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA10 BA80 CA01 CA03 CA09 DA06 EA04 GA11 GA19 HA14 4B050 CC03 DD02 FF01C LL05 4B064 AF21 CA02 CA19 CA21 CB30 CC24 CD09 CD12 CE02 DA16 4B065 AA26X AA49Y AB01 BA02 BD01 BD32 BD36 CA29 CA60

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−アセチルグルコサミンにβ１，３結
   合でガラクトースを転移する活性を有する微生物由来の
   β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 微生物が、ストレプトコッカス属に属す
   る微生物である請求項１に記載の蛋白質。
3. 【請求項３】 ストレプトコッカス属に属する微生物
   が、ストレプトコッカス・アガラクチエである請求項２
   に記載の蛋白質。
4. 【請求項４】 配列番号１で表されるアミノ酸配列から
   なる蛋白質。
5. 【請求項５】 配列番号１で表されるアミノ酸配列にお
   いて１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
   たアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラクトース
   転移酵素活性を有する蛋白質。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
   白質をコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号２で表される塩基配列からなる
   ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号２で表される塩基配列からなる
   ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する
   蛋白質をコードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の組換え体ＤＮＡを宿
    主細胞に導入して得られる形質転換体。
11. 【請求項１１】 宿主細胞が、微生物である請求項１０
    に記載の形質転換体。
12. 【請求項１２】 微生物が、エシェリヒア属に属する微
    生物である請求項１１に記載の形質転換体。
13. 【請求項１３】 エシェリヒア属に属する微生物がエシ
    ェリヒア・コリである請求項１２に記載の形質転換体。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１３のいずれか１項に記
    載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にβ１，３−
    ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積さ
    せ、該培養物から該蛋白質を採取する、β１，３−ガラ
    クトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項１０〜１３のいずれか１項に記
    載の形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素
    源として用い、該酵素源、ウリジン−５’−二リン酸ガ
    ラクトースおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せし
    め、該水性媒体中でガラクトース含有糖質を生成蓄積さ
    せ、該水性媒体中からガラクトース含有糖質を採取する
    ことを特徴とするガラクトース含有糖質の製造法。
16. 【請求項１６】 培養液の処理物が、培養液の濃縮物、
    培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、
    該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活
    性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩
    砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、
    該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌
    体より抽出して得られる酵素標品である請求項１５に記
    載の製造法。
17. 【請求項１７】 受容体糖質が、非還元末端にＮ−アセ
    チルグルコサミンを有する糖質である請求項１５に記載
    の製造法。
18. 【請求項１８】 受容体糖質が、Ｎ−アセチルグルコサ
    ミン、またはラクト−Ｎ−トリオースIIである請求項１
    ５に記載の製造法。
19. 【請求項１９】 ガラクトース含有糖質が、ラクト−Ｎ
    −ビオース、またはラクト−Ｎ−テトラオースである請
    求項１５に記載の製造法。