WO2001029244A1 - Transporteur d'acide nucleique contenant un polypeptide et un vecteur viral de recombinaison - Google Patents

Transporteur d'acide nucleique contenant un polypeptide et un vecteur viral de recombinaison Download PDF

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WO2001029244A1
WO2001029244A1 PCT/JP2000/007337 JP0007337W WO0129244A1 WO 2001029244 A1 WO2001029244 A1 WO 2001029244A1 JP 0007337 W JP0007337 W JP 0007337W WO 0129244 A1 WO0129244 A1 WO 0129244A1
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nucleic acid
vector
present
acid
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PCT/JP2000/007337
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Takeshi Goto
Osamu Iijima
Takashi Shimada
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Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
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    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Definitions

  • Nucleic acid carriers containing polypeptides and recombinant viral vectors are provided.
  • the present invention relates to a nucleic acid carrier containing a recombinant virus vector for use in gene therapy.
  • a treatment method targeting blood cells a treatment method (US Pat. No. 5,399,346) is used in which target blood cells are once separated from a living body, transfected in a test tube, and then returned to the living body (US Pat. No. 5,399,346).
  • Gene Transfer Law the gene transfer efficiency is low (Dunbar, CE, et al., Blood 85, 3048-3057, 1995), and multiple gene transfer operations are required. Remains.
  • both polyprene and polyethyleneimine are substances that do not exist in living organisms, so that administration to living organisms is difficult.
  • cationic ribosomes have high toxicity depending on the composition of ribosomes prepared (Yagi K. et al., Biochem. Biophys. Res. Co. un. 196, 1042- 1048, 1993) Attention is required.
  • synthetic polyamino acids, especially polylysine tend to precipitate with increasing concentration, and are, in fact, difficult to use for treating diseases.
  • administration of a drug solution containing particles that cause precipitation into the vein may cause embolization or thrombosis of blood vessels, and may cause clogging of injection needles even when administered locally.
  • problems such as the inability to introduce a gene in an amount necessary for treating target cells.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid carrier for efficiently and safely introducing a drug gene into cells.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and as a result, using a nucleic acid carrier comprising a polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a recombinant virus vector
  • the present inventors have found that drug genes can be efficiently and safely introduced into cells, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to diaminobutyric acid and Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof. And a nucleic acid carrier comprising a recombinant viral vector.
  • the present invention also provides the nucleic acid carrier, wherein the polypeptide comprises a block copolymer of a polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof and polyethylene glycol.
  • the present invention provides the nucleic acid carrier, wherein the polypeptide comprises diaminobutyric acid having a residue number of 20 to 280 and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof. I do.
  • the present invention provides any one of the above nucleic acid carriers, wherein the recombinant virus vector contains a drug gene.
  • the present invention provides any one of the above nucleic acid carriers, wherein the recombinant virus vector is an HIV vector.
  • the present invention provides the above nucleic acid carrier, wherein the HIV vector is a pseudotype HIV vector with VSV-G.
  • an agent for improving the gene transfer efficiency of a recombinant virus vector which comprises a polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a synthesis route of diaminobutyric acid and a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of helper plasmid PCMV-R8.2, which constitutes the recombinant virus vector according to the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of a plasmid pMD.G for supplying VSV-G, which constitutes the recombinant virus vector according to the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure of the vector plasmid pHXCAGEGFP constituting the recombinant virus vector according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the H results of EGFP gene transfer + by the GFP / HIV vector-1 / PDBA complex, which is the nucleic acid carrier of the present invention.
  • FIG. 6 shows the stability of the nucleic acid carrier of the present invention, GFP / HIV vector-1 / PDBA complex.
  • the polypeptide comprising diaminobutyric acid according to the present invention has a structure represented by the formula (1) (where n represents a natural number), and may optionally contain other monomer units. Good.
  • the polypeptide comprising a pharmaceutically acceptable salt of diaminobutyric acid according to the present invention has a structure represented by the formula (2) (where n represents a natural number): Optionally, other monomer units may be included.
  • polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof may have a structure containing the above two structures in any ratio. That is, those which exist in any ratio in the form of polydiaminobutyric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof are also included.
  • the diaminobutyric acid is an optical isomer!
  • the diaminobutyric acid and z or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention may be in the D-form or the L-form, or a mixture thereof arbitrarily. It also includes peptides. That is, any polypeptide containing any of poly-L-diaminobutyric acid, poly-D-diaminobutyric acid, and poly-DL-diaminobutyric acid may be used.
  • the term “residue of a polypeptide comprising diaminobutyric acid and Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof” refers to diaminobutyric acid, which is a monomer forming the polypeptide (or a pharmaceutically acceptable salt thereof).
  • the number of residues thereof means the number of those molecules (ie, represented by n in the above formula).
  • the preferred number of residues of the polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is at least 10 or more. It is more preferably at least 20 residues or more, most preferably 25 or more residues.
  • the preferred number of residues of the polypeptide comprising diaminobutyric acid and Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is preferably 280 or less. More preferably, the number is 250 or less. If the number of residues is too large, synthesis becomes difficult and handling becomes inconvenient. On the other hand, if the number of residues is too small, the performance as a nucleic acid carrier will be insufficient.
  • the preferred number of residues can be optimally selected depending on the type of the recombinant virus vector to be used and the properties of components that can be used simultaneously.
  • the pharmaceutically acceptable salt of diaminobutyric acid is not particularly limited as long as it does not show toxicity or shows an acceptable degree of toxicity when the nucleic acid carrier of the present invention is administered to a subject.
  • an inorganic acid salt such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, acetic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, oxalic acid, succinic acid, tartaric acid, malonic acid, fumaric acid
  • Organic acid salts such as vac acid and malic acid are mentioned, and among these, acetate is particularly preferable.
  • polypeptide of diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a diaminobutyric acid'acetate
  • the diaminobutyric acid'acetate has a molecular weight of 160, and the above-mentioned residue is used. It is also possible to represent the numbers by molecular weight.
  • Another example of a polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention (hereinafter also referred to as “polypeptide according to the present invention”) is a polypeptide comprising diaminobutyric acid described above.
  • Peptides include those having a block copolymer structure in which polyethylene glycol is further bound, and are represented by Formula (3) (where m and n each represent a natural number).
  • the polypeptide has one carboxylic acid group
  • the one having the above-mentioned block copolymer structure may be represented by the formula (4) (where m , N, n 'indicate natural numbers respectively).
  • the molecular weight (or several m) of ethylene glycol is not particularly limited, but is usually preferably about 200 to 25,000 for the reasons described later.
  • a tissue-specific ligand can be bound to the polypeptide of the present invention.
  • the nucleic acid carrier of the present invention containing such a polypeptide is effectively and tissue-specifically incorporated into a specific tissue to which the ligand is specific.
  • saccharides galactose, lactose, sialoglycoprotein, oligogalactose, hyaluronic acid, etc.
  • the nucleic acid carrier of the present invention can be more effectively delivered to the liver.
  • diaminobutyric acid represented by the formula (3) or (4) is used as the polypeptide of the present invention.
  • PEG polyethylene glycol
  • the molecular weight of PEG is preferably not more than 2,500, more preferably not more than 10,000, and most preferably not more than 5,000. Above 5,000, the efficiency of nucleic acid (gene) transfer decreases due to a decrease in affinity with the cell surface, and below 2,000, the effect of the target PEG is small, which is not preferred.
  • the method for synthesizing the polypeptide according to the present invention is not particularly limited.
  • Organic chemical reactions including various commonly known methods for synthesizing polypeptides can be preferably used.
  • the monomer component is obtained by polymerization by an appropriate reaction.
  • the monomers used are diaminobutyric acid, Diaminobutyric acid in which a protecting group is introduced into a amino group, or diaminobutyric acid having an amino group and / or a carboxylic acid group activated for peptide group formation can be preferably used.
  • amine compounds and alcohol compounds can be used.
  • examples of the amine compound include alkylamines, and butylamine is particularly preferable.
  • polyethylene glycols are used as alcohols, a polypeptide according to the present invention to which a polyethylene glycol group is added (that is, consisting of a block copolymer of diaminobutyric acid and polyethylene glycol) can be obtained.
  • FIG. 1 illustrates a particularly preferred synthetic route for the synthesis of the polypeptide according to the present invention. That is, it is preferable to protect the amino group with an appropriate protecting group and convert the amino acid portion into an acid anhydride using phosgene, and use it as a condensation polymerization monomer ((10) in FIG. 1). Also, by using this monomer, an appropriate initiator can be used in the polycondensation reaction, and a preferable number of monomers can be introduced. Although there is no particular limitation on the initiator, various amine compounds are preferred, and butylamine is particularly preferred. Also, by using an appropriate ethylene glycol as an initiator, it is also possible to obtain a block copolymer having a preferred number of monomers and having an ethylene glycol group. . Specifically, according to the method described in Helv. Chim. Acta, 43, 270-279 (1960) or “New Experimental Chemistry Course 19 Polymer Chemistry ⁇ 1980, published by Maruzen Co., Ltd.” It can be carried out.
  • the structure of the polypeptide according to the present invention has the characteristics described above. It is. Therefore, it is possible to detect the polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention based on such structural characteristics. In addition, even when the polypeptide of the present invention itself, or a nucleic acid carrier or a composition for gene therapy using the same is used in various forms of use, it is possible to carry out an appropriate pretreatment. Similarly, the polypeptide according to the present invention can be detected. It is easy for those skilled in the art to select the necessary pretreatment.
  • the detection method is not particularly limited, and various generally known polypeptide analysis methods (Young HC, et al., J.
  • Controlled Release 54, 39-48, 1998) can be used.
  • qualitative and quantitative analysis of diaminobutyric acid by amino acid analysis of peptides determination of the number of residues by molecular weight measurement using various liquid chromatographs, various spectrum analysis to detect the presence of polyethylene glycol groups ( Infrared absorption spectrum, nuclear magnetic resonance absorption spectrum), mass spectrometry, or chemical qualitative analysis methods can be used.
  • the recombinant virus vector according to the present invention can be produced based on DNA or RM virus, but the virus species from which it is derived is not particularly limited, and it includes MoMLV vector, Herpes virus vector, Any virus vector such as an adenovirus vector, an MV vector, an HIV vector, or a Sendai virus vector may be used. Furthermore, a virus having a host range other than human can be used as a virus vector if the virus has a therapeutic effect.
  • an HIV vector is particularly preferably used. Since the HIV vector integrates the introduced nucleic acid into the chromosome, the drug gene, which is the nucleic acid, can be expressed over a long period of time. In addition, the HIV vector can selectively transfer genes to CD4 positive T cells, which are cell surface molecules. Furthermore, since the HIV vector can be integrated into the chromosome even in the quiescent phase when the cell is not dividing, using the pseudotyped HIV virus vector described below It is possible to efficiently introduce a drug gene into any cell in the stationary phase, such as stem cells, hematopoietic stem cells, nerve cells, and muscle cells.
  • a virus vector can also be used as the recombinant virus vector according to the present invention.
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • a gene group containing the HIV gag poU env gene and lacking a packaging signal was prepared, and a gene construct in which a cytomegalovirus (CMV) promoter was located upstream of the gene construct was used as a replication origin for the ampicillin resistance gene and SV40.
  • the helper plasmid (pCMV-R9) inserted into the expression vector containing is constructed by a known gene manipulation method.
  • pCMV-R9 inserted into the expression vector containing is constructed by a known gene manipulation method.
  • a part of the env gene of PCMV-H9 is deleted, and PCMV-R8.2 that does not express the Env protein is constructed by a known gene manipulation method.
  • the above genes can be constructed based on the genome sequences of immunodeficiency virus in mammals, including HIV-1 HIV-2 and simian immunodeficiency virus (SIV), feline immunodeficiency virus (FIV), etc. .
  • Co-transfection of helper plasmid and plasmid pMD.G that expresses VSV-G protein into cells as shown below, allows pseudotyped recombination using VSV-G as a coat protein by cotransfection into cells. HIV virus vectors can be prepared.
  • the RCR By removing the packaging signal from the helper plasmid, the RCR
  • any one or more of the vif, vpr, vpu, tat, rev, nef genes other than the gag, pol, and env genes required to constitute HIV, or one or more of the accessory genes corresponding thereto are arbitrarily deleted.
  • the promoter used to express the HIV gene is not limited to CMV.For example, use a promoter such as CAG, RSV, TK, SV40, SR-hi,? -Actin, EF1-hi, etc. Can o
  • an enhancer sequence that enhances the promoter is added by a viral enhancer protein such as herpes virus or hepatitis B virus, or a cellular transcriptional activator protein such as NF_B or SP-1.
  • the plasmids encoding these proteins can be cotransfected to produce recombinant HIV vectors.
  • the cells for preparing the recombinant HIV vector can be any cell line that can produce the HIV protein.
  • mammalian cell lines such as CV-1, HeLa, Raji, RD, SW480, CH0, COS, 293 cells, 293T cells transformed with SV40 large T antigen, and particularly C0S, 293T cells are preferred, and more preferably 293T cells.
  • HIV-LTR Long-Terminal-Repeats: consisting of U3, R, U5 regions
  • packaging signal any promoter that expresses drug gene, drug gene and HIV-LTR.
  • a vector plasmid in which the gene construct in which these are arranged is inserted into an expression plasmid containing an ampicillin resistance gene and a replication origin of SV40 is constructed by a known gene manipulation method.
  • the vector is HIV-1, HIV-2, simian immunodeficiency virus (SIV), cat It can be constructed based on the genome sequence of immunodeficiency virus in mammals, including immunodeficiency virus (FIV).
  • a polyadenylation signal sequence can be added to the drug gene as needed.
  • any promoter that expresses a drug gene For example, promoters such as CAG, CMV, RSV, TK, SV40, SR-hi, MBP,? -Actin, and EF tohi are used. be able to.
  • the LTR at the end of the drug gene and the promoter that expresses it, and the LTR at the end use the U3 region of the LTR as a promoter such as CAG, CMV, RSV, TK, SV40, SR-H, MBP, actin, and EF1-H.
  • a substituted, chimeric LTR can be used.
  • the plasmid thus constructed is cotransfected into, for example, COS cells by a known method such as a calcium phosphate method, a lipofection method using various cationic lipids, or an electoporation method.
  • the infected cells are cultured for 24 to 72 hours at the optimal temperature for the host cell used, but more preferably for at least 48 hours or more.
  • the recombinant HIV vector released into the culture supernatant is derived from the host cells by centrifuging the culture supernatant at 2000 rpm for 10 minutes or using a filter with a pore size of 0.45 zm. By removing the contaminants, a recombinant HIV vector solution can be prepared. Further, impurities can be removed by a density gradient centrifugation method, PEG (Polyethylene glycol) precipitation method, or a column method such as a cellulose sulfate column or an affinity column.
  • PEG Polyethylene glycol
  • the drug gene and other genes to be inserted into the recombinant virus vector according to the present invention are composed of various nucleic acids and derivatives of Z or nucleotide, and their type, molecular weight, shape, sequence and the like are not particularly limited.
  • nucleic acids have the form of a single-stranded gene, a double-stranded gene, a triple RNA, DNA / RNA chimeric gene, phosphorothioate gene, linear gene, circular gene and the like can be used without limitation.
  • sequence of the gene encoded in the recombinant virus vector may be a drug gene, a promoter for transcription of the drug gene, a poly-A signal, a label of a cell into which the gene has been introduced.
  • a signal sequence for retention etc., but any sequence can be used.
  • a gene corresponding to the disease that is, a gene that acts antagonistically to the disease or a gene that complements the lack in the disease is used.
  • genes for specific diseases include SOD, anti-inflammatory cytokines, genes encoding peptides that act antagonistically to cell adhesion factors, and enzyme deficiency for inflammatory diseases.
  • Genes encoding normal enzymes, genes encoding normal receptors for receptor deficiency, thymidine kinase, diphtheria toxin, etc. for killing virus-infected cells for viral infections Genes encoding antisense, triple helix, ribozyme, decoy, transdominant mutant, etc., which inhibit the replication of genes and viruses encoding toxins, thymidine kinase for killing cancer cells, and diphtheria for cancer.
  • Antisense for inactivating genes encoding toxins and other toxins and oncogenes Genes encoding ribozyme, triple helix, etc., tumor suppressor genes such as p53 for normalizing cancer cells, antisense, triple helix for inactivating genes involved in multidrug resistance to anticancer drugs And genes encoding ribozyme, and for familial hypercholesterolemia, genes encoding the LDL receptor.
  • any expression cassette used for the drug gene can be used without particular limitation as long as the gene can be expressed in the target cell.
  • an expression cassette capable of expressing a gene in animal-derived cells more preferably, an expression cassette capable of expressing a gene in mammalian cells, and particularly preferably, a human-derived expression cassette.
  • Gene promoters used for expression sets include, for example, adenovirus, cytomegalovirus, human immunodeficiency (HIV) virus, simian virus 40, rous sarcoma virus, simple herpes virus, mouse leukemia virus, simvis virus, Sendai virus Promoters derived from viruses such as virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, norovirus, human T-cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, parvovirus B19, and poliovirus And mammalian-derived promoters such as albumin heat shock protein, and chimeric promoters such as CAG Promoter.
  • viruses such as virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, norovirus, human T-cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, parvovirus B19, and poliovirus And mammalian-
  • the nucleic acid carrier of the present invention is characterized by containing the polypeptide comprising the diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the recombinant virus vector.
  • a predetermined ratio of the polypeptide and the recombinant virus vector are combined, a complex is easily formed, and becomes the nucleic acid carrier of the present invention.
  • one recombinant viral vector of the present invention already contains a suitable drug gene as indicated above.
  • the recombinant virus vector and the plasmid according to the present invention By combining the peptides, a nucleic acid carrier that can be used for gene therapy and a composition for gene therapy can be obtained.
  • a gene therapy composition is prepared by mixing the recombinant virus vector containing the drug gene with the polypeptide comprising diaminobutyric acid and Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the gene therapy composition thus obtained is also included in the scope of the present invention.
  • a polypeptide comprising diaminobutyric acid and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a recombinant virus vector containing a drug gene are each dissolved in water, physiological saline, isotonic buffer, etc. After dissolving in a suitable solvent and mixing, a composition for gene therapy can be prepared.
  • the mixing ratio of the recombinant virus vector containing the drug gene and the polypeptide of the present invention to be used is not particularly limited.
  • the polypeptide of the present invention is used at a concentration of 5 / zgZml to 20 zg / ml, preferably 5 gZml to 10 gZml.
  • IU infectious units indicates the gene transfer efficiency (titer) of the recombinant virus vector, and means the number of cells into which the gene can be introduced with 1 ml of the virus vector solution.
  • the gene transfer efficiency is determined, for example, by performing gene transfer treatment on any cell with a recombinant virus vector containing a neomycin drug resistance gene, and then culturing it in a culture solution containing the drug. Obtained by counting.
  • the nucleic acid carrier of the present invention has formed a complex already 1 minute after mixing the polypeptide and the recombinant virus vector, and this complex is stable even after 1 hour from the formation. Present in the mixing solution.
  • the nucleic acid carrier of the present invention does not cause precipitation even after mixing and complex formation. Therefore, there is no risk of causing a thrombus even if the nucleic acid carrier of the present invention is directly administered to blood vessels, It is possible to efficiently and safely administer drug genes.
  • the nucleic acid carrier of the present invention can further contain an additive, if necessary.
  • the peptide of the present invention is used to promote adsorption to cells, stabilize a recombinant virus vector, promote the introduction of drug genes into cells or nuclei, or control the release of recombinant virus vectors.
  • Additives can be added as needed.
  • Such additives are not particularly limited as long as they achieve the above-mentioned purpose, but are not particularly limited.
  • the nucleic acid carrier of the present invention makes it possible to introduce and express a drug gene into a target cell more than three times more efficiently than introducing a drug gene with a single recombinant virus vector.
  • the nucleic acid carrier of the present invention can be used for autologous gene therapy (ex vivo gene therapy) in which target cells are first taken out of a patient, a drug gene is introduced, and then the cells are returned to the patient. is there. It can also be used for gene therapy in which drug genes are directly administered to patients (in vivo gene therapy).
  • Methods of gene therapy can be broadly classified into a method of adding a new (normal) gene while leaving the abnormal (cause) gene intact (Augumentation Gene Therapy) and a method of replacing the abnormal gene with a normal gene (Replacement Gene Therapy).
  • the nucleic acid carrier of the present invention can be used for any of them.
  • the method for administering the nucleic acid carrier of the present invention to a living body is not particularly limited.
  • it can be preferably carried out by parenteral administration or injection administration.
  • the dose of the nucleic acid carrier of the present invention varies depending on the method of use, the purpose of use, and the like, and those skilled in the art can easily and appropriately determine the optimal dose for the subject to be treated. is there.
  • a daily dose of about 0.1 g / kg 100 mg / kg, and more preferably a daily dose of about 100 g / kg. 110 O mg / kg.
  • poly- (2,4-diajninobutyric acid) is abbreviated as PDBA, including its acetate, and PDBA includes those based on all possible optical isomers.
  • block copolymer with polyethylene glycol is also abbreviated as PDBApeg (or PDBA-PEG).
  • DL-2,4-Diaminobutyric acid dihydrochloride (DL-2,4-diamino-n-butyric acid dihydrochloride) (1) Dissolve 15 g (manufactured by Sigma) in 75 ml of water. After adding 11.7 g of copper (2) and standing, the mixture was boiled under reflux and filtered. To the filtrate, 16.6 g of sodium hydrogencarbonate and 17.8 ml of carbobenzoxycyclolide (4) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added and stirred to obtain a product as a precipitate.
  • N-carbobenzoxy-D-resaminobutyric acid copper complex (4N-carbobenzoxy-DL-2, 4-diaminobutyric acid copper complex; hereinafter referred to as Dba (Z) -Cu) ( 5) was obtained.
  • Polypeptides composed of diaminobutyric acids having various numbers of residues are obtained by degenerating the obtained N-carbobenzoxy-DL-diaminobutyric acid NCA (10) using various ratios of initiators, It was obtained by removing the protecting group of the amino group.
  • the molecular weight in the present invention means that represented by the following formula.
  • EGFP EGFP Protein
  • HIV-LTR HIV-LTR
  • the gene construct expression downy Kuta containing the replication initiation point of the ampicillin resistance gene and SV40 - were co-transfected full Ekushi Yon into COS cells by the calcium phosphate method with the vector one was ⁇ the plasmid PHXCAGEGFP ( Figure 4). After culturing for 2 days, the obtained culture supernatant was centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, and the precipitate was removed to obtain a GFP / HIV vector solution.
  • the GFP / HIV vector prepared in Production Example 2 and the PDBA solution prepared at twice the desired concentration were mixed in equal amounts immediately before administration, and the GFP / HIV vector, the nucleic acid carrier of the present invention, was mixed.
  • a / PDBA complex solution was prepared.
  • the final concentrations of PDBA were adjusted to be 0, 0.3, 1.0, 3.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0 g / ml, respectively.
  • the solvent used was DMEM medium (Sigma).
  • PDBA having a molecular weight of 7800 obtained in Synthesis Example 3 in Table 2 was used.
  • PDBA having a molecular weight of 7800 obtained in Synthesis Example 3 in Table 2 was used.
  • Test Example 1 Gene transfer into HeLa cells by GFP / HIV vector-1 / PDBA complex
  • HeLa cells were placed on a 12-well multiwell plate (Coaster). 5 seeds were seeded per 1 well.
  • a GFP / HIV vector / PDBA complex solution was administered in the presence of 10% fetal fetus serum (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.), and incubated at 37 ° C. for 4 hours. After replacing with a fresh culture solution, the cells were incubated for another 48 hours.
  • FIG. 5 shows the ratio of cells into which the marker gene (EGFP) was introduced in 10,000 cells. It was confirmed that about 30% of cells were transfected with only one recombinant HIV vector (PDBA 0 ⁇ g / ml) used as a control.
  • PDBA 0 ⁇ g / ml recombinant HIV vector
  • the GFP / HIV vector prepared in Production Example 2 and the PDBA solution prepared at 20.0 g / ml were mixed in equal amounts 60, 30, 15, 10, 3, and 1 minute before the test to obtain a GFP / HIV vector.
  • An HIV vector / PDBA complex solution (final concentration of PDBA was 10.0 ug / ml) was prepared.
  • the solvent used was DEM medium (Sigma).
  • PDBA having a molecular weight of 7,800, obtained by Synthesis Example 3 in Table 2, was used.
  • Each GFP / HIV vector-1 / PDBA complex solution was allowed to stand at room temperature and then administered to HeLa cells. 48 hours later, the cells were fixed, and the gene transfer efficiency was measured using a flow cytometer overnight (FACS Cal ibur; manufactured by Becton Dickinson).
  • FIG. 6 shows the percentage of cells into which the EGFP gene was introduced among 10,000 cells. From FIG. 6, it was confirmed that the PDBA and the recombinant virus vector immediately formed a stable complex after mixing, and that there was no change in the gene transfer efficiency even when left at room temperature for 1 hour. still, As in FIG. 5, the unit of the vertical axis in FIG. 6 is%, and the graph shows the gene transfer rate at each concentration in%, with the control being 100%.
  • the nucleic acid carrier of the present invention forms a complex between a polypeptide comprising diaminobutyric acid and Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a recombinant virus vector, and efficiently and safely transmits a drug gene to cells.
  • the gene can be introduced, and high gene expression in the cells is guaranteed, which is useful for gene therapy.

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Description

明細書
ポリぺプチドおよび組換えウィルスベクターを含む核酸運搬体
¾ 分野
本発明は、 遺伝子治療に用いる、 組換えウィルスべク夕一を含む核酸運搬体に 関する。
背景技術
遺伝子治療の臨床応用において、 薬物遺伝子を効率良く安全に標的細胞へ導 入するための最適な遺伝子の形態や方法の開発が大きな技術的課題の 1つとなつ ている。
1980年代初期には、マイクロインジェクション等物理的手法の応用が試みられ たが、 疾患治療のために必要な薬物遺伝子を安定かつ効率良く導入することがで きず、 臨床応用には至らなかった。 その後、 薬物遺伝子を効率良く細胞に導入す るための担体となる組換えウィルスベクタ一が開発され、 初めて遺伝子治療の臨 床応用が可能となった。米国においては、 1998年 4月までに 212の遺伝子治療プ 口トコールが NIHの組換え DNA委員会（RAC)で承認され、 先天性免疫不全症、 家 族性高コレステロール血症、 嚢胞性線維症等の遺伝性疾患および各種の癌を対象 とし、 既に 2000 人以上の患者に対して臨床試験が行われてきた （Hum. Gene Therapy, 9 :2143 -2161 , 1998)。
現在臨床で使われている組換えウィルスベクターを用いて、 すべての標的細胞 に薬物遺伝子を導入することは不可能である。 そのため、 例えば血液細胞を対象 とした治療法では、 標的血液細胞を生体から一度分離し、 試験管内で遺伝子導入 を行なった後、 再び生体に戻す治療法 （US5399346 ) が行われている （ex vivo遺 伝子導入法)。しかし、この方法においても、遺伝子導入効率は低く（Dunbar, C. E. , et al .， Blood 85， 3048-3057, 1995 )、 複数回の遺伝子導入作業が必要で、 依然 として遺伝子導入の効率化の問題が残る。
一方、 このような組換えウィルスベクタ一の遺伝子導入効率を向上させる方法 として、 ウィルスベクターとの複合体を形成可能な物質をウィルスと相互作用さ せることで、目的の細胞へ効率良く遺伝子導入しょうとする試みが行われている。 例として、 ポリプレン (Morgan, J.R. , et al.， Biotechnol. Prog. , 10， 441 -446, 1994)、 ポリエチレンィミン （Meunier-Durmort C.， et al .， Gene Therapy, 4, 808-814, 1997)、 カチオン性リボソーム （Hodgson P.， and Solaiman F.， Nature Biotechnol. , 14, 339 -342, 1996 )、合成ポリアミノ酸（Curiel D.T.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 88， 8850 -8854, 1991 ) 等を組換えウィルスベクタ一と の複合体を形成させるべき担体として利用する方法が挙げられる。
しかしながら、 ポリプレン、 ポリエチレンイミンはともに生体に存在しない物 質であるため、 生体への投与は困難である。 また、 カチオン性リボソームに関し て、 リボソームを調製する際の組成によっては、 毒性が高くなることが報告され ており (Yagi K. et al. , Biochem. Biophys. Res. Co顧 un. 196， 1042 -1048, 1993) 注意が必要である。 さらに、 合成ポリアミノ酸、 特にポリリジンは濃度の増加と ともに沈殿を生じやすく、実際に疾患の治療に対しては使用が困難である。特に、 静脈内へ沈殿を生じるような粒子を含む薬液を投与することは、 血管の塞栓や血 栓等を引き起こす原因となり、 また、 局所的に投与される場合でも、 注射針の詰 まりの問題や、 標的細胞に対して治療をするために必要な量の遺伝子を導入でき ない等の問題を有している。
発明の開示
本発明は、 細胞に薬物遺伝子を効率よく、 安全に導入するための、 核酸運搬体 を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、 ジァミノ酪酸および /またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、 組換えウィルスべ クタ一とを含む核酸運搬体を用いれば、 薬物遺伝子を細胞内に効率良く、 安全に 導入できることを見いだし本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 ジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容できる塩 からなるポリぺプチドと、 組換えウィルスベクタ一とを含む核酸運搬体を提供す る。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドが、 ジァミノ酪酸および またはその薬学 的に許容できる塩からなるポリぺプチドとポリエチレングリコールとのブロック コポリマーを含むことを特徴とする、 上記核酸運搬体を提供する。
さらに、 本発明は、 前記ポリペプチドが、 残基数 2 0以上 2 8 0以下のジアミ ノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなることを特徴とする、 上 記核酸運搬体を提供する。
また、 本発明は、 前記組換えウィルスベクターが、 薬物遺伝子を含むことを特 徴とする、 上記いずれかの核酸運搬体を提供する。
さらに、 本発明は、 前記組換えウィルスベクターが、 HIV ベクターであること を特徴とする上記 ゝずれかの核酸運搬体を提供する。
加えて、 本発明は、 前記 HIVベクターが、 VSV- Gとのシユードタイプ HIVべク ターであることを特徴とする上記の核酸運搬体を提供する。
さらに、 本発明に従えば、 ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容でき る塩からなるポリべプチドを有効成分とする、 組換えウィルスベクタ一の遺伝子 導入効率改善剤が提供される。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明に係るジアミノ酪酸およびその薬学的に許容できる塩の合成経 路の一例を示す図である。
図 2は、 本発明に係る組換えウィルスベクタ一を構成するへルパープラスミ ド PCMV-R8.2の構造を示す模式図である。
図 3は、 本発明に係る組換えウィルスベクターを構成する VSV- G供給用プラス ミド pMD. Gの構造を示す模式図である。
図 4は、 本発明に係る組換えウィルスベクタ一を構成するベクタープラスミ ド pHXCAGEGFPの構造を示す模式図である。 H
図 5は、本発明の核酸運搬体である、 GFP/HIVベクタ一/ PDBA複合体による EGFP 遺伝子導入 +の H結果を示す図である。
図 6は、 本発明の核酸運搬体である、 GFP/HIVベクタ一 /PDBA複合体の安定性
C
o
試験の結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の構成および好ましい実施の形態について詳細に説明する。
(ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリべプチ 卜つ
本発明に係わるジァミノ酪酸からなるポリペプチドは、 式（1) で表される （こ こで、 n は自然数を示す） 構造を有するものであるが、 随意にその他のモノマー ュニットを含んでいてもよい。
NH2
CH2
CH2
- HN - CH - CO ^ j-
. (化 1 ) 本発明に係わるジァミノ酪酸の薬学的に許容できる塩からなるポリぺプチドは、 式 （2) で表される （ここで、 nは自然数を示す） 構造を有するものであるが、 随 意にその他のモノマーュニットを含んでいてもよい。
Figure imgf000005_0001
(化 2 ) 本明細書で用いる 「ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩か らなるポリペプチド」 とは、 前記の 2つの構造を任意の割合で含む構造を有する ものであってもよい。 すなわち、 任意の割合で、 ポリジァミノ酪酸、 若しくはそ の薬学的に許容できる塩の形で存在するものも含まれる。
前記ジァミノ酪酸には、光学異性体である！)体および L体が存在可能であるが、 本発明に係るジァミノ酪酸および zまたはその薬学的に許容できる塩からなるポ リぺプチドは、 D体若しくは L体若しくはそれらの任意に混ざつたポリぺプチド をも含むものである。 すなわち、 ポリ- L-ジァミノ酪酸、 ポリ- D-ジァミノ酪酸、 およびポリ -DL-ジアミノ酪酸のいずれかを含むポリぺプチドであればよい。また、 本明細書で用いる 「ジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容できる塩から なるポリペプチドの残基」 とは、 該ポリペプチドを形成するモノマ一であるジァ ミノ酪酸 （またはその薬学的に許容できる塩） 基を意味し、 その残基数とはそれ らの分子の数を意味するものとする （すなわち、 前記式の nで表される）。本発明 に係るジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリぺプ チドの好ましい残基数は、 少なくとも 1 0残基以上である。 さらに好ましくは少 なくとも 2 0残基以上であり、 最も好ましくは 2 5残基以上である。 また、 本発 明に係るジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容できる塩からなるポリべ プチドの好ましい残基数は、 2 8 0残基以下が好ましい。 また、 より好ましくは 2 5 0残基以下である。 残基数があまり多い場合は、 合成が困難となり、 また取 り扱いが不便となる。 一方、 あまり残基数が少ないと、 核酸運搬体としては性能 が不十分になる。 また、 好ましい残基数は、 使用する組換えウィルスベクタ一に より、 また同時に使用され得る成分の性質等から最適に選択することができる。 ジァミノ酪酸の薬学的に許容できる塩は、 本発明の核酸運搬体を対象に投与し た際に、 毒性を示さないか、 或いは許容される程度の毒性を示す塩類であれば特 に限定はされない。好ましくは、 塩酸、 硫酸、硝酸、 リン酸等の無機酸塩、 酢酸、 プロピオン酸、 クェン酸、 乳酸、 シユウ酸、 コハク酸、 酒石酸、 マロン酸、 フマ ル酸、リンゴ酸等の有機酸塩が挙げられ、これらの中でも特に酢酸塩が好ましい。 なお、 ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリべ プチドのポリペプチドをジァミノ酪酸'酢酸塩とすれば、 ジァミノ酪酸'酢酸塩は 分子量 1 6 0であるため、 前記の残基数を分子量で表わすことも可能である。 本発明に係るジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなる ポリペプチド （以下、 「本発明に係るポリペプチド」 ともいう） の他の 1例は、 上 で説明したジァミノ酪酸からなるポリペプチドに、 さらに、 ポリエチレングリコ —ルを結合させた、 ブロックコポリマー構造を有するものが含まれ、 式（3) で表 される （ここで、 m、 nはそれそれ自然数を示す）。
NH2
CH2
CH2
-(- HN - CH - CO 0 H- CH2CH2O -)— H
(化 3 ) さらに、 前記ポリペプチドがカルボン酸基を 1つ有することから、 前記ブロヅ クコポリマ一構造を有するものには、 式 （4 ) で表されるものも可能である （こ こで、 m、 n、 n'はそれそれ自然数を示す）。
NHク NH2
I I
CH2 CH2
I I
CH2 CH2
-(■HN-CH-C0 ^0 -(-CH2CH20 ^CH2CH20-fc0-CH- H-}^
(化 4 ) ここでエチレングリコールの分子量（または数 m)については特に制限はないが、 後述する理由から、 通常は 2 0 0から 2 5 , 0 0 0程度であることが好ましい。 本発明の一つの実施の形態として、 組織特異的なリガンドを本発明に係るポリ ぺプチドに結合させることも可能である。 このようなポリぺプチドを含む本発明 の核酸運搬体は、 効果的に、 また組織特異的に該リガンドがそれに対して特異的 である特定組織に取り込まれる。 例えば、 肝臓を標的とする場合は、 糖類 （ガラ クトース、 ラクト一ス、 ァシァログリコプロテイン、 オリゴガラクト一ス、 ヒア ルロン酸等） を本発明に係るポリペプチドに結合させると、 肝臓に対する親和性 が上昇し、より効果的に本発明の核酸運搬体を肝臓に送達することが可能となる。 また、 細胞毒性の軽減、 血中滞留、 溶媒へのさらなる溶解性の向上を目的とし て、 本発明に係るポリペプチドとして、 式 （3 ) または式 （4 ) で表される、 ジ ァミノ酪酸とポリエチレングリコール（PEG)とのブロックコポリマーを採用する ことが好ましい。 その場合、 P E Gの分子量は 2 0 0以上のものを使用すること が好ましい。 より好ましくは、 1 , 0 0 0以上のものを使用する。 また、 P E G の分子量は 2 5， 0 0 0以下であることが好ましいが、 より好ましくは 1 0， 0 0 0以下であり、最も好ましくは 5 , 0 0 0以下である、 P E Gの分子量が 2 5 , 0 0 0以上では、 細胞表面と親和性が低下することによる核酸 （遺伝子） 導入効 率の低下が起こり、 2 0 0以下では、 目的とする P E Gによる効果が小さく好ま しくない。
(本発明に係るポリぺプチドの合成方法）
上記で説明した構造を有することを特徴とする、 本発明に係るポリペプチドの 合成方法については、 特に制限はない。 通常公知の種々のポリペプチド合成方法 (新実験化学講座 19高分子化学 I 1980年発行、 丸善株式会社） を含む有機化学 反応が好ましく使用できる。
より具体的には、 本発明においては、 モノマー成分を適当な反応により重合し て得ることが好ましい。 この場合、 使用するモノマーとしては、 ジァミノ酪酸、 ァァミノ基に保護基が導入されたジァミノ酪酸、 またはぺプチド基形成のために 活性化されたアミノ基および/またはカルボン酸基を有するジァミノ酪酸が好ま しく使用できる。 特に、 本発明においては、 ァァミノ基を保護し、 かつペプチド 結合形成を容易にするためにジァミノ酪酸を酸無水物化することが好ましい （新 実験化学講座 19 高分子化学 I 1980年発行、 丸善株式会社)。
また、 かかるモノマーを重合するには、 種々の種類、 適当な量の開始剤を使用 することが可能である。 具体的には、 種々のァミン化合物、 アルコール化合物が 使用可能である。 前記アミン化合物にはアルキルアミン類が挙げられ、 特にプチ ルァミンが好ましい。 また、 アルコール類としてポリエチレングリコール類を用 いると、 ポリエチレングリコール基が付加した、 本発明に係るポリペプチド （す なわち、 ジァミノ酪酸とポリエチレングリコールとのブロックコポリマ一からな る） が得られる。
図 1に、 本発明に係るポリぺプチドの合成に、 特に好ましい合成経路を例示す る。 すなわち、 ァァミノ基を適当な保護基で保護し、 かつアミノ酸部分を、 ホス ゲンを用いて酸無水物とし、 縮重合のモノマー（図 1の （10)) として使用するこ とが好ましい。 また、 このモノマーを用いることで、 縮重合反応は適当な開始剤 を用いることが可能となり、 好ましい数のモノマー数を導入することが可能とな る。 開始剤には特に制限はないが、 種々のァミン化合物が好ましく、 特にブチル ァミンの使用が好ましい。 また、 適当なエチレングリコ一ル類を開始剤に使用す ることにより同様に、 好ましい数のモノマ一を有するポリペプチドであって、 か つエチレングリコール基を有するプロックコポリマーを得ることが可能となる。 具体的には、 Helv. Chim. Acta, 43, 270-279 (1960) または 「新実験化学講座 19 高分子化学〗 1980年発行、 丸善株式会社」 に記載された方法に従い、 若しく は準じて行うことができる。
(本発明に係るポリペプチドの検出）
本発明に係るポリぺプチドの構造は、 上記で説明したような特徴を有するもの である。 従って、 かかる構造上の特徴に基づいて、 本発明に係るジァミノ酪酸お よび/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを検出することが 可能となる。 また、 本発明に係るポリペプチド自体、 またはそれを用いた核酸運 搬体若しくは遺伝子治療用組成物が、 種々の使用形態で使用されている場合にお いても、 適当な前処理を施すことにより、 同様に本発明に係るポリペプチドを検 出することが可能となる。当業者が、必要な前処理を選択することは容易である。 検出方法についても特に制限はなく、 種々の通常公知のポリぺプチド分析方法 (Young H.C. , et al.， J. C ontrolled Release, 54, 39 -48, 1998) を用いるこ とが可能である。 具体的には、 ペプチドのアミノ酸分析方法によるジァミノ酪酸 の定性および定量分析、 種々の液体クロマトグラフを用いた分子量測定による残 基数の決定、 ポリエチレングリコール基の存在を検出する種々のスぺクトル分析 (赤外線吸収スぺクトル、核磁気共鳴吸収スぺクトル)、 質量分析、 または化学的 な定性分析方法が使用可能である。
(組換えウィルスベクタ一）
本発明に係る組換えウィルスべク夕一は、 DNAまたは RMウィルスをもとに作 製できるが、 それが由来するウィルス種は特に限定はされず、 MoMLV ベクタ一、 ヘルぺスウィルスベクタ一、 アデノウィルスベクター、 MVベクタ一、 HIVベクタ ―、 センダイウィルスベクタ一等のいかなるウィルスベクターであってもよい。 さらに、 ウィルスが治療効果を持つものであれば、 ヒト以外の宿主域を持つウイ ルスもウィルスベクターとして使用可能である。
本発明に係る組換えウィルスベクターとして、 特に HIVベクターが好ましく用 いられる。 HIV ベクタ一は導入した核酸を染色体に組み込むため、 該核酸である 薬物遺伝子を長期間に渡って発現することができる。 また、 HIV ベクタ一は、 細 胞表面分子である CD4陽性 T細胞への選択的な遺伝子導入が可能である。さらに、 HIV ベクターは細胞が分裂していない静止期でも、 染色体に組み込むことが可能 であるため、 後述のシユードタイプ型の HIVウィルスベクタ一を用いれば、 骨髄 幹細胞、 造血幹細胞、 神経細胞、 筋肉細胞などの静止期にある、 いかなる細胞へ も効率的に薬物遺伝子を導入することが可能となる。
ウィルスベクタ一の構成タンパク質群のうち 1つ以上を、 異種ウィルスの構成 タンパク質に置換した、 或いは、 遺伝子情報を構成する核酸配列のうち 1部を異 種ウィルスの核酸配列に置換した、 シユードタイプ型のウィルスベクタ一も本発 明に係る組換えウィルスベクタ一として使用できる。 例えば、 HIV の外皮タンパ ク質である Envタンパク質を、 小水痘性口内炎ウィルス （Vesicular stomatitis virus: VSV) の外皮夕ンパク質である VSV-Gタンパク質に置換したシユードタイ プウィルスベクタ一が挙げられる (Naldini L et al. Science 272, 263-267, 1996)。
以下、 本発明に用いる組換え HIVベクターおよびその製造法について詳しく説 明する。
すなわち、 HIVの gag poU env遺伝子を含み、 パッケージングシグナルを欠 く遺伝子群を調製し、 その上流にサイ トメガロウィルス （CMV)のプロモーターを 配置した遺伝子構築物をアンピシリン耐性遺伝子と SV40 の複製開始点を含む発 現ベクターに挿入したヘルパープラスミ ド（pCMV-R9)を公知の遺伝子操作方法に より構築する。 さらに PCMV-H9の env遺伝子の 1部を欠損させ、 Env蛋白質を発 現しない PCMV-R8.2を公知の遺伝子操作方法により構築する。 上記遺伝子群は、 HIV-l HIV-2、および、サル免疫不全ウィルス（SIV)、ネコ免疫不全ウィルス（FIV) 等を含む、 哺乳類における免疫不全ウィルスのゲノム配列をもとに構築すること ができる。ヘルパープラスミ ドと、 VSV-Gタンパク質を発現するブラスミド pMD.G さらに、 以下に示すベクタ一プラスミ ドとを細胞にコトランスフエクシヨンする ことで、 VSV-Gを外皮タンパク質とするシユードタイプ型の組換え HIVウィルス ベクタ一を調製することができる。
ヘルパープラスミ ドからパッケージングシグナルを除くことによって、 RCR
(Replication competent retrovirus ) の出現の確立を低減することが可能であ り、 Envタンパク質を VSV-Gタンパク質に置換することによって、 さらに CD4を 発現しない細胞への遺伝子導入も可能となる (Naldini L. , et al. , Science 272, 263-267, 1996 )。
さらに、 HIVを構成するために必須な gag、 pol、 env遺伝子以外の vif、 vpr、 vpu、 tat, rev, nef遺伝子、 若しくはそれらに該当するアクセサリ一遺伝子の 1 つ若しくはそれ以上を任意に欠損させて、 安全性を高めることができる。 HIV 遺 伝子を発現させるために用いるプロモー夕一は CMVに限定されず、 例えば、 CAG、 RSV、 TK、 SV40、 SR-ひ、 ?-actin、 EF1-ひ等のプロモ一夕一を用いることができ o
また、 例えば、 ヘルぺスウィルス、 B型肝炎ウィルス等のウィルス性ェンハン サータンパク質、 または NF _B、 SP-1等の細胞性転写活性化タンパク質によつ てプロモータ一を増強するェンハンサー配列を付与することが可能であり、 これ らタンパク質をコードするプラスミ ドをコトランスフエクシヨンして組換え HIV ベクタ一を作製することができる。 組換え HIV ベクタ一を調製する細胞は、 HIV タンパク質を産生しうる細胞であればいかなる細胞系の使用も可能である。 好ま しくは、 哺乳類動物細胞系、 例えば、 CV-1、 HeLa、 Raji、 RD、 SW480、 CH0、 COS, 293細胞、 SV40 large T antigenをトランスフオームした 293T細胞等が挙げられ るが、 特に C0S、 293T細胞が好ましく、 さらに好ましくは 293T細胞である。
HIV ビリオン中にパッケージングされ、 その後、 標的細胞で逆転写され、 染色 体へ組み込まれ、 薬物遺伝子を発現するために必要な断片は、 5'末端から 3'末端 方向に順に次の通りである ： HIV-LTR (Long -Terminal -Repeats :U3, R、 U5 領 域から成る）、パッケージングシグナル、薬物遺伝子を発現させる任意のプロモー 夕一、薬物遺伝子および HIV— LTR。これらが配置された遺伝子構築物を、例えば、 アンピシリン耐性遺伝子と SV40 の複製開始点を含む発現プラスミ ドに揷入した ベクタープラスミドを公知の遺伝子操作方法により構築する。 ここで、 前記べク 夕一プラスミ ドは、 HIV-1、 HIV- 2、 および、 サル免疫不全ウィルス （SIV)、 ネコ 免疫不全ウィルス （FIV)等を含む、 哺乳類における免疫不全ウィルスのゲノム配 列をもとに構築することができる。
薬物遺伝子には必要に応じてポリアデニル化シグナル配列を付与することがで きる。 また、 薬物遺伝子を発現させる任意のプロモーターにも特に制限はなく、 例えば、 CAG、 CMV、 RSV、 TK、 SV40、 SR-ひ、 MBP、 ?-actin、 EF卜ひ等のプロモ一 夕一を用いることができる。 また、 薬物遺伝子とそれを発現させるプロモータ一 5，末端の LTRは、 LTRの U3領域を例えば、 CAG、 CMV、 RSV、 TK、 SV40、 SR-ひ、 MBP、 actin、 EF1—ひ等のプロモーターに置換した、 キメラ型 LTRを用いることが できる。
このようにして構築したプラスミ ドをリン酸カルシウム法、 種々のカチオン性 脂質を用いたリポフエクション法、 またはエレクト口ポレーション法等の公知の 方法により、 例えば COS細胞にコトランスフエクシヨンする。
組換え HIVベクタ一を効率よく作製するために、 使用する宿主細胞における至 適温度で、 感染細胞を 2 4〜 7 2時間培養するが、 少なくとも 4 8時間以上培養 することがより好ましい。
培養上清に放出される組換え HIVベクターは、 培養上清を 2 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心するか、 或いは、 ポアサイズが 0 . 4 5 z mのフィル夕一を用いて、 宿主細胞由来の夾雑物を除くことによって、 組換え HIVベクター溶液として調製 できる。 さらに、 密度勾配遠心法、 PEG(Polyethylene glycol )沈殿法、 または硫 酸セルロースカラム、 ァフィ二ティ一カラム等のカラム法によっても夾雑物を除 くことができる。
(薬物遺伝子）
本発明に係る組換えウィルスベクターに挿入される薬物遺伝子、 およびその他 の遺伝子は、 種々の核酸および Zまたはヌクレオチドの誘導体からなり、 それら の種類、 分子量、 形状、 配列等には特に制限はない。
例えば、核酸の形状は、 1重鎖遺伝子、 2重鎖遺伝子、 3重鎮形成遺伝子、 DNA, RNA, DNA/RNAキメラ型遺伝子、 ホスホロチォエート型遺伝子、 直鎖状遺伝子、 環 状遺伝子等制限なく用いることができる。 さらに、 前記組換えウィルスベクター 内にコードされる遺伝子の配列は、 薬物遺伝子のほか、 薬物遺伝子を転写するた めのプロモ一夕一ゃェンハンサ一、 ポリ Aシグナル、 遺伝子が導入された細胞の 標識および または選別のためのマーカ一遺伝子、 細胞のゲノム D N A配列内に 効率良く遺伝子を挿入するためのウィルス由来の遺伝子配列、 薬物として作用す る物質を細胞外に分泌および/または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル 配列等があるが、 どのような配列でも用いることが可能である。
薬物遺伝子は疾患に対応する遺伝子、 即ち、 疾患に対して拮抗的に作用する遺 伝子や疾患における欠如を補足する遺伝子が用いられる。例えば、サイ トカイン、 成長因子、 抗体または抗体断片、 サイ ト力インまたは成長因子に対するレセプ夕 ―、増殖防止または細胞増殖抑制作用を有する夕ンパク質、酵素、脈関係抑制剤、 血栓誘発物質、 および凝集抑制剤、 フイブリン溶解作用を有するタンパク質、 ゥ ィルスコートタンパク質、 細菌性抗原および寄生動物性抗原、 腫瘍抗原、 血液循 環に効果を有するタンパク質、 ペプチドホルモン、 およびリポザィムおよびアン チセンス RNAのようなリボ核酸からなる群より選択される薬理活性化合物をコー ドする遺伝子が挙げられる。
特定の疾患に対する代表的な遺伝子としては、 炎症性疾患に対しては、 SOD, 抗 炎症性のサイ トカイン類、 細胞接着因子に拮抗的に作用するペプチドをコードす る遺伝子、 酵素欠損症に対しては正常な酵素をコードする遺伝子、 受容体欠損症 に対しては正常な受容体をコードする遺伝子、 ウィルス感染症に対してはウィル ス感染細胞を殺傷するためのチミジンキナーゼ、 ジフテリアトキシン等の毒素を コードする遺伝子やウィルスの複製等を阻害するアンチセンス、 トリプルヘリッ クス、 リボザィム、 デコイ、 トランスドミナントミュータント等をコードする遺 伝子、 癌に対しては癌細胞を殺傷するためのチミジンキナーゼ、 ジフテリアトキ シン等の毒素をコードする遺伝子や癌遺伝子を不活性化するためのアンチセンス、 リボザィム、 トリプルへリックス等をコードする遺伝子や、 癌細胞を正常化する ための p53等の癌抑制遺伝子、 抗癌剤に対する多剤耐性に関与する遺伝子を不活 性化するためのアンチセンス、 トリプルへリックス、 リボザィム等をコードする 遺伝子、 家族性高コレステロール血症に対しては LDLレセプ夕一をコードする遺 伝子等が挙げられる。
さらに、 薬物遺伝子に用いられる発現カセットは、 標的細胞内で遺伝子を発現 させることができるものであれば、 特に制限されることなく何でも用いることが できる。 当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。 好ま しくは、 動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、 より好ま しくは、 哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、 特に好 ましくは、 ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。 発現力 セットに用いられる遺伝子プロモーターは、 例えばアデノウイルス、 サイ トメガ ロウィルス、 ヒト免疫不全 （HIV) ウィルス、 シミアンウィルス 40、 ラウス肉腫 ウィルス、 単純へルぺスウィルス、 マウス白血病ウィルス、 シンビスウィルス、 センダイウィルス、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、 ノ ピロ一マウィルス、 ヒト T細胞白血病ウィルス、 インフルエンザウイルス、 日本 脳炎ウィルス、 JCウィルス、 パルボウイルス B19、 ポリオウイルス等のウィルス 由来のプロモーター、 アルブミンゃ熱ショック蛋白等の哺乳類由来のプロモー夕 ―、 CAGプロモ一夕一等のキメラ型プロモ一夕一等を含む。
(核酸運搬体）
本発明の核酸運搬体は、 前記ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容で きる塩からなるポリべプチドと、 前記組換えウィルスベクターとを含むことを特 徴とする。 所定比のポリペプチドと、 組換えウィルスベクターを合わせると複合 体が容易に形成され、 本発明の核酸運搬体となる。 本発明の好ましい実施の形態 に従えば、 本発明の一つの組換えウィルスベクタ一は、 上記で示したように既に 適当な薬物遺伝子を含む。 この組換えウィルスベクターと、 本発明に係るポリぺ プチドを合わせると遺伝子治療に使用できる核酸運搬体であり、 かつ遺伝子治療 用組成物であるものが得られる。 従って、 前記薬物遺伝子を含む組換えウィルス ベクターと、 前記ジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容できる塩からな るポリペプチドとを混合することによって遺伝子治療用組成物が調製される。 こ のようにして得られた遺伝子治療用組成物も本発明の範囲に包含される。
より具体的には、 ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩から なるポリペプチドと、 薬物遺伝子を含む組換えウィルスベクタ一とを各々、 水、 生理食塩水、 等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解後、 混和することで遺伝子 治療用組成物が調製できる。
このとき、 用いられる前記薬物遺伝子を含む組換えウィルスベクタ一と本発明 に係るポリぺプチドの混合比は、 特に限定されない。 実用上、 1 X 102〜 1 X 1 013IU/ml、好ましくは 1 X 103〜： L X 1012I U/ml,さらに好ましくは 1 104〜 1 X 10"1 U/mlの組換えウィルスべク夕一溶液 1 m lに対し て、 本発明に係るポリペプチドは、 5 /zgZmlから 20 zg/ml 好まし くは 5 gZmlから 10 gZmlの濃度で使用される。
ここで、 IU (infectious units) とは、 組換えウィルスベクターの遺伝子導 入効率 （titer) を表し、 前記ウィルスベクター溶液 1 mlで遺伝子を導入する ことができる細胞数を意味する。 遺伝子導入効率は、 例えば、 ネオマイシン薬剤 耐性遺伝子を含む組換えウィルスベクターで任意の細胞に遺伝子導入処理を行つ た後、 薬剤を含む培養液中で培養し、 増殖してきた薬剤耐性細胞の数をカウント することによって得られる。
本発明の核酸運搬体は、 ポリペプチドと組換えウィルスべク夕一を混和後、 1 分後にはすでに複合体を形成しており、 この複合体は形成後 1時間を経過しても 安定して混和溶液中に存在する。
また、 本発明の核酸運搬体は、 混和、 複合体形成後も沈殿生成を起こさない。 従って、血管に本発明の核酸運搬体を直接投与しても血栓を起こす危険性はなく、 効率的に、 安全に薬物遺伝子を投与することが可能となる。
本発明の核酸運搬体は、 必要に応じて添加剤をさらに含有することができる。 例えば、 本発明のペプチドに、 細胞への吸着促進、 組換えウィルスベクターの安 定化、 薬物遺伝子の細胞内もしく核内への導入促進、 または組換えウィルスべク 夕一の放出制御のために、 必要に応じて添加剤を加えることができる。
このような添加剤としては、 上記目的を達成するものであれば特に限定はされ ないが、 ショ糖、 グリシン、 グルタミン酸ナトリウム、 コンドロイチン硫酸、 ゼ ラチン、 アルブミン、 サイ トカイン、 HMG-1、 HMG-2 混合物、 クロ口キン、 VSV-G (小水痘性口内炎ウィルス外皮タンパク質）、ペントン（アデノウィルス構造蛋白 質） 等が挙げられる。
本発明の核酸運搬体は、 組換えウィルスベクタ一単独で薬物遺伝子を導入する よりも、 約 3倍以上も効率的に標的細胞に薬物遺伝子を導入し、 かつ発現させる ことを可能にする。
(本発明の核酸運搬体の使用方法）
本発明の核酸運搬体は、 まず患者から標的細胞を体外に取り出し、 薬物遺伝子 を導入した後に、 再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子 治療 (ex vivo 遺伝子治療） に使用可能である。 また、 薬物遺伝子を直接患者に 投与する遺伝子治療 ( in vivo遺伝子治療） にも使用可能である。
遺伝子治療の方法として、 異常 （原因） 遺伝子をそのままにして、 新しい （正 常） 遺伝子を付け加える方法 （Augumentation Gene Therapy ) と、 異常遺伝子を 正常遺伝子で置き換える方法 （Replacement Gene Therapy ) に大別できるが、 本 発明の核酸運搬体は、 それらいずれにも使用可能である。
本発明の核酸運搬体の生体への投与の方法については、 特に制限はない。 例え ば、 非経口的投与、 注射投与することにより好ましく実施できる。
本発明の核酸運搬体の用量は、 その使用方法、 使用目的等により異なり、 当 業者は容易に適宜、 治療される対象にとって最適な用量を決定することが可能で ある。 例えば、 注射投与して用いる場合には、 1 日量、 約 0 . l ^ g/k g l 0 0 O m g/k gを投与するのが好ましく、 より好ましくは、 1 日量、 約 l〃g /k g〜 1 0 O m g/k gである。
(実施例）
以下、 製造例、 実施例、 試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本 発明はこれらの例によって制限されるものではない。
以下の製造例および実施例において用いたジァミノ酪酸および/またはその薬 学的に許容できる塩からなるポリべプチドの合成は、 Vogeler K. らの方法 (Vogler K. and Lanz P. , Helv. Chim. Acta, 43, 270 -279 (I960)) に準じて行った、 そ の合成経路を図 1に示した。
本明細書においては、 ポリ-ジァミノ酪酸 (Poly (2,4-diajninobutyric acid ) を、 その酢酸塩を含めて PDBAと略す。 また、 PDBAには、 可能な全ての光学異性 体に基づくものをも含むものとする。 さらに、 ポリエチレングリコールとのプロ ックコポリマーを同様に PDBApeg (又は PDBA— PEG) と略す。
(製造例 1) ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポ リペプチドの合成
( I ) モノマ一としての、 Nァ-カルボベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 NCA (4N-carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric acid N - carboxy - anhydride) (10) の 合成
(1 -1) Nァ-カルボベンゾキシ -Dレジァミノ酪酸 （4N-carbobenzoxy- DL-2， 4- diaminobutyric acid ) (8) の合成
DL-2,4- ジ ァ ミ ノ 酪酸 2 塩酸塩 （ DL-2,4-diamino-n-butyric acid dihydrochloride ) (1) 15g (シグマ社製） を水 75mlに溶解し、 これに塩基性炭酸 銅 （2) 11.7gを加えて放置後、 煮沸還流し、 ろ過した。 ろ液に炭酸水素ナトリウ ム 16.6g、 カルボベンゾキシクロリ ド （4) (和光純薬社製） 17.8mlを加えて撹拌 し、 生成物を沈殿として得た。 得られた生成物をろ過し、 アセトン、 およびジェ チルェ一テルで洗浄した後乾燥し、 15gの Nァカルボベンゾキシ -Dレジァミノ酪酸 銅錯体 ( 4N-carbobenzoxy-DL-2 , 4-diaminobutyric acid copper complex；以下 Dba (Z) -Cuとする） （5) を得た。
上記得られた錯体 (5) の llgを、 35% HC1 9.3mU 水 22ml、 メタノール 11ml の混合液に入れ、 硫化水素 （¾S) ガスの存在下で撹拌した。 室温に静置し、 過剰 の硫ィ匕水素を除去した後、 ろ過により不溶物を除いた。 ろ液は減圧し、 水とメタ ノールを加えて冷却した。 さらにメタノールを加えた後、 ジェチルァミン （7) (diethylamine )を加えて溶液の pHを 7に調整した。析出した結晶をろ過して分 離し、 ジェチルエーテルを用いて漏斗上で洗浄、 および乾燥し、 白色の結晶とし て 4gの生成物を得た。さらに、前記ろ液を濃縮して冷却することにより析出した 結晶をろ過して分離し、ジェチルエーテルを用いて漏斗上で洗浄、および乾燥し、 白色結晶として 1.5gの生成物を得た。 これらを合わせて合計 5.5g (原料ァミノ 酸から計算して収率 31%) の Nァ-カルボベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 （8) を得 た。
(1-2) Nァ-カルボベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 NCA (4N-carbobenzoxy -DL-2 , - diaminobutyric acid N -carboxy-anhydride (10) の合成
上記で得られた （8) の 5gをテトラヒドロフラン （THF) 200mlに溶解し、 そこ に卜リホスゲン (9) (triphosgene , bis (tricholoromethyl ) carbonate , Aldrich 社製） 4.5gを 40mlの THFに溶解したものを加え、 さらに 40°Cで 60分撹拌した。 減圧で溶媒を除去した後、 得られた粗生成物にへキサンを加えて溶解した。 冷却 し、 さらに減圧で十分へキサンを除いた後、 得られた粗生成物に酢酸ェチルを加 えて溶解し、 不溶物をろ過して除いた。 得られたろ液にへキサンを加えて冷却す ることで生成物が白色結晶として沈殿した。 析出した結晶をろ過して分離し、 減 圧にて乾燥した。 また、 前記ろ液も減圧濃縮した後、 同様に処理し生成物を結晶 として得た。 これら得られた結晶をジェチルェ一テルから再結晶することにより 精製された生成物 （10) が 2.7g (収率 50%) 得られた。 (I I ) 重合反応
種々の残基数のジァミノ酪酸からなるポリべプチドは、前記得られた Nァ-カル ボベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 NCA (10) を、 種々の割合の開始剤を用いて縮重 合させ、 その後ァミノ基の保護基を脱保護することにより得られた。
ここで、本発明における残基数とは以下の式（Arieh Yaron等、 Biochim. Biophys.
Acta, 69, 397-399 (1963) ) で算出したものを意味する （最後に 0.9を掛ける理 由は、 保護基を除去する反応条件で、 約 10%分子量が低下することによる）。 さ らに、 本発明における分子量は以下の式で表されるものを意味する。
残基数 =重合度 （n) = [Nァ-カルポベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 NCA (10) の 量 （モル数） ノ開始剤の量 （モル数）] X収率 （％) ノ 100x0.9
分子量 =n (重合度） X残基量 （酢酸塩として、 DBA酢酸塩の残基量 = 160) 以下、 表 1、 表 2の合成例 3 (残基数 49) に示すポリ -Dいジァミノ酪酸 （Poly (DL-2,4-diajninobutyric acid ) およびその酢酸塩の合成を詳述する。 表 1に示 す他の条件を用いて、同様に合成例 1 (残基数 12)、 2 (残基数 26)、 4 (残基数 62)、 5 (残基数 170)、 6 (残基数 278)、 7 (残基数 348) の PDBAを得た。 また、 合成例 3 のポリジァミノ酪酸およびその酢酸塩にポリエチレングリコ一ル （14) (PEG, 分子量 1000) を末端に結合させたポリジァミノ酪酸- PEG (15) およびその酢酸塩 の合成条件も、 合成例 8として表 1および表 2に示した。
(II-1)ポリ -Nァ-カルボベンゾキシ - DL-ジァミノ酪酸（poly (4-N-carbobenzoxy - DL-2,4-diaminobutyoric acid ) (11) の合成
Nァ-カルボベンゾキシ -DL-ジァミノ酪酸 NCA (10) の lg (3.6mmol ) をァセトニ トリル (acetonitrile ) 19mlに溶解した。
開始剤としてブチルァミン （butylamine ) 4.38mg (0.06腿 ol ) を加え、 30°C で 307時間静置した。 得られたポリマーをろ過し、 ァセトニトリルで洗浄した。 ソックスレ一抽出器を用いてジェチルエーテルで抽出した後、 減圧で乾燥して、 ポリ -Nァ-カルボベンゾキシ -DL-ジアミノ酪酸（11) 0.77g (重合率 91%)を得た。 ( 11-2) ポリ- DL-ジァミノ酪酸 (poly (DL-2,4-diaminobutyric acid ) (13) 酢酸 塩の合成
ポリ Nァ-カルボベンゾキシ -D ジァミノ酪酸 （11) の 0.5gをトリフルォロ酢 酸 (trifluoroacetic acid ) 2mlに溶解し、 これに 25%臭化水素酢酸溶液 (12) を加え振り混ぜた。 静置した後、 ジェチルエーテルを加え、 上澄エーテル相を傾 斜で除去し、 さらにジィソプロピルエーテルで同じ操作を行い上澄エーテル相を 傾斜で除去した。 得られた沈殿物を減圧で十分乾固した。 得られた固体に酢酸ナ トリゥ厶と水を加えて得た混合液を、 分子量 1, 000以下除去の透析チューブを用 いて流水で透析を行った後、 20，000Gで一時間遠心分離を行い沈殿物を除去した。 得られた溶液を凍結乾燥し、 ポリ- DL-ジァミノ酪酸 （13) 酢酸塩を 0.34g (収率 91%) 得た。
4一 N - Carbobenzaxy - DL - 2,4 - diamlnobutyric add NCAの重縮合による Po 4-N-Carbobenzaxy-DL-2,4-dianimobutyric acid)の合 J5¾^件
Figure imgf000022_0001
a) BA； but5¾mine
PEGIOOO； pci ^hylene glycol MW 1000
b) Initiator / N-Carbcesy Anh drideC CA mol ratio (開^]と NCAのモル It) c) ACN； Acetonitrile ( ioB oti^nqomuiBi -^'^-qQ- xozuaqoqiBQ-^-^iC j； ((z)BClQ)^i0d
Figure imgf000023_0001
(製造例 2 ) GFP/ HIVベクターの調製
HIVの gag、 pol遺伝子を含み、 env遺伝子とパッケージングシグナルを欠く遺 伝子群の上流に、 サイ トメガロウィルスのプロモーターを配置した遺伝子構築物 をアンピシリン耐性遺伝子と SV40 の複製開始点を含む発現ベクターに挿入した プラスミ ド pCMV- R8.2 (Naldini L .， et al .， Proc . Natl . Acad. Sci . USA. , 93， 11382-11388, 1996 ：図 2) と、 小水痘性口内炎ウィルス (Vesicular stomatitis virus : VSV ) の外皮タンパク質である VSV-Gをコードする遺伝子の上流に、 サイ トメガロウィルスのプロモー夕一を配置した遺伝子構築物を発現ベクターである PXF3に組み込んだプラスミド pMD. G (Naldini L.， et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA. , 93， 11382 -11388, 1996：図 3) を、 5'末端から 3'末端方向に順次 HIV-LTR、 CAGプロモータ一、 緑色蛍光蛋白質 （EGFP) 遺伝子および HIV-LTRが配置された 遺伝子構築物をアンピシリン耐性遺伝子と SV40 の複製開始点を含む発現べクタ —に揷入したベクタ一プラスミ ド PHXCAGEGFP (図 4) とともにリン酸カルシウム 法により COS細胞にコトランスフエクシヨンした。 2日間培養した後、 得られた 培養上清を 2000rpmで 10分間遠心し、沈殿物を除いて GFP/HIVベクター溶液を得 た。
(実施例 1 ) GFP/HIVベクタ一 ZPDBA複合体の調製
製造例 2で調製した GFP/HIVベクターと、所望濃度の 2倍濃度で調製した PDBA 溶液とを投与直前に等量ずつ混合して、 本発明の核酸運搬体である GFP/HIVべク 夕一/ PDBA複合体溶液を調製した。 PDBAの終濃度は、それそれ 0、 0.3、 1.0、 3.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0、 25.0 g/ml となるように調製した。 溶媒は DMEM培地 (Sigma社製） を使用した。 PDBAは表 2の合成例 3で得られた、 分子量 7800のも のを使用した。 ここで、 PDBAの終濃度を 25 gZmlで複合体を形成させても、 溶液中に沈殿は生じなかった。
(試験例 1 ) GFP/HIVベクタ一/PDBA複合体による HeLa細胞への遺伝子導入 試験前日に HeLa細胞を 12穴のマルチウエルプレート （コースター社製） 上の 1 ゥエルあたり ΙχΙΟ5個播種した。 10%ゥシ胎仔血清 （三光純薬社製） 存在下で GFP/HIVベクター/ PDBA複合体溶液を投与し、 37°Cで 4時間ィンキュベ一トした。 新鮮な培養液に交換後、 さらに 48時間ィンキュベ一トした。
(試験例 2 ) フローサイ トメ一夕一を用いた遺伝子導入効率の測定
試験例 1で遺伝子導入した HeLa 細胞をトリプシン処理してプレートから回収 した。 回収した細胞懸濁液を 1% パラホルムアルデヒドで固定して、 フローサイ トメ一夕一 （FACS Cal ibur；べクトンディッキンソン社製） で測定した。 10，000 個の細胞中で、マーカー遺伝子（EGFP)が導入された細胞の割合を図 5に示した。 コントロールとして用いた組換え HIVベクタ一のみ（PDBA 0〃g/ml )では、 約 30% の細胞内に遺伝子導入されていることが確認された。 PDBAと GFP/HIVベクタ一の 複合体群では、 PDBAの濃度依存的に遺伝子導入効率が上昇し、終濃度 10.0 zg/ml 以上では、 コントロールと比較して約 3倍高い遺伝子導入が確認された。 尚、 図 5の縦軸の単位は、 ％であり、 グラフはコントロールを 100%として、 各濃度で の遺伝子導入率を％で表したものである。
(試験例 3 ) GFP/HIVベクタ一ZPDBA複合体の安定性評価
GFP/HIVベクタ一/PDBA複合体の調製
製造例 2で調製した GFP/HIVベクタ一と、 20.0 g/mlで調製した PDBA溶液と を試験のそれそれ 60、 30、 15， 10， 3， 1分前に等量ずつ混合して GFP/HIVベクタ 一/ PDBA複合体溶液 （PDBAの終濃度は、 10.0 ug/ml ) を調製した。
溶媒は D EM培地（Sigma社製） を使用した。 PDBAは表 2の合成例 3により得ら れた、分子量 7800のものを使用した。各 GFP/HIVベクタ一/ PDBA複合体溶液は、 室温で静置後、 HeLa細胞に投与した。 48時間後、 細胞を固定し、 フローサイ トメ 一夕一 （FACS Cal ibur；べクトンディッキンソン社製） で遺伝子導入効率を測定 した。 10，000個の細胞中で、 EGFP遺伝子が導入された細胞の割合を図 6に示した。 図 6から、 PDBAと組換えウィルスベクタ一は混合後、 直ちに安定な複合体を形成 し、 1時間室温で放置しても遺伝子導入効率に変化のないことが確認された。尚、 図 5と同様に、図 6の縦軸の単位は、％であり、グラフはコントロールを 1 0 0 % として、 各濃度での遺伝子導入率を％で表したものである。
産業上の利用可能性
本発明の核酸運搬体は、 ジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容できる 塩からなるポリぺプチドと組換えウィルスベクタ一とで複合体を形成し、 薬物遺 伝子を細胞に効率的、 安全に、 導入可能にするものであり、 該細胞内での高い遺 伝子発現を保証するので、 遺伝子治療に有用である。

Claims

請求の範囲
1 . ジァミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリぺプ チドと、 組換えウィルスベクターとを含む核酸運搬体。
2 . 前記ポリペプチドが、 ジァミノ酪酸および Zまたはその薬学的に許容でき る塩からなるポリぺプチドとポリエチレングリコ一ルとのプロックコポリマ一を 含むことを特徴とする、 請求項 1に記載の核酸運搬体。
3 . ポリペプチドが、 残基数 2 0以上 2 8 0以下のジァミノ酪酸および Zまた はその薬学的に許容できる塩からなることを特徴とする、 請求項 1に記載の核酸 運搬体。
4 . ポリペプチドが、 残基数 2 0以上 2 8 0以下のジァミノ酪酸および また はその薬学的に許容できる塩からなることを特徴とする、 請求項 2に記載の核酸 運搬体。
5 . 前記組換えウィルスベクターが、 薬物遺伝子を含むことを特徴とする請求 項 1〜 4のいずれか 1項に記載の核酸運搬体。
6 . 組換えウィルスベクタ一が、 HIV ベクターであることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の核酸運搬体。
7 . 組換えウィルスベクターが、 HIV ベクタ一であることを特徴とする請求項 5に記載の核酸運搬体。
8 . 前記 HIVベクターが、 VSV-Gとのシユードタイプ HIVベクターであること を特徴とする、 請求項 6に記載の核酸運搬体。
9 . 前記 HIVベクターが、 VSV-Gとのシユード夕イブ HIVベクターであること を特徴とする、 請求項 7に記載の核酸運搬体。
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