明 細 書
核酸検出方法
技術分野
本発明は、 試料中 に存在する核酸分子を検出ま たは定量す る方法に関する。
背景技術
生体試料中 に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、 基礎的研究分野お よ び臨床学的分野の両方において重要であ る。 特に、 該技術は、 例えば、 特定の臓器において発現お よ び機能する タ ンパク 質を核酸分子 レベルで解析する場合や、 情報伝達系 (例えば、 神経系お よび免疫系等) におけ る タ ン パク 質の発現お よびその発現の制御メ カ ニズムに関する研究 を行 う 場合等に重要である。 ま た、 遺伝子的疾患に関連する 変異遺伝子、 癌に関連する遺伝子、 およびウ ィ ルス に関連す る遺伝子等を検出する こ と に よ つ て遺伝子診断を行 う 際に も 、 該技術は極めて重要な技術である。
例えば、 ハィ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン法は、 核酸.分子を検出す る ための代表的な方法であ る。 こ の方法において、 目 的核酸 は、 こ の 目 的の核酸に相補的な配列を有 した核酸プロ ーブに 対 してハイ ブ リ ダィ ズする。 その後、 当該プロ ーブを使用 に して該 目 的核酸が検出 される。 こ の方法の欠点は、 少ない コ ピー数、 例えば、 1 か ら 1 0 0 0 個程度の標的核酸を検出す
る こ と が困難な こ と であ る。 ま た、 特異性が低いため、 類似 した配列を各々認識 して夫々 に検出する こ と も困難である。 所謂、 D N Aチ ッ プは、 多種類の核酸プロ一ブが基体に固 相化 された装置であ る。 従来のハイ プ リ ダイ ゼ一シ ョ ン法に 比べて、 D N Aチ ッ プを用いた検出方法はその操作が簡単で ある。 しか しなが ら 、 固相 さ れた各プロ ーブの至適条件が異 なる ために、 偽陽性のハイ ブ リ ダイ ゼ一シ ョ ン反応が生 じる こ と が問題であ る。 ま た、 検出すべき核酸に応 じて、 固相 さ れる プロ ーブのデザィ ン を変更 し、 適切な D N Aチ ッ プをそ の都度製造する こ と も必要であ る。 一方、 臨床検査では、 極 めて多種類の核酸が検出対象 と な る。 従っ て、 従来の方法で は、 多 く の種類の D N Aチ ッ プを用意 しな く てはな ら ない。
上述の方法を含む従来の技術は、 多 く の工程を含み煩雑で ある。 その上、 検出には長時間を要 し、 実施者には熟練 した 技術が必要 と される。
ま た、 通常、 遺伝子診断は確定診断 と して使用 される ため 、 誤診は許さ れず、 同時に迅速性も要求 さ れる。 公知の従来 の中には、 こ の よ う な要請を十分に満足する方法はない。 発明の開示
本発明の 目 的は、 試料中か ら 、 高い特異性を も っ て 目 的 と する核酸分子を検出する方法を提供する こ と である。 本発明 によれば、 複数種類の核酸分子が存在する試料の中から 、 高 精度に且つ迅速に特定の核酸のみを検出お よび定量する こ と が可能である。
ま た、 本発明の他の 目 的は、 少なレ、 コ ピー数で標的配列を 検出する こ と ができ 、 D N Aチ ッ プの所要数を節約する こ と が可能な方法を提供する こ と であ る。 ま た、 本発明の他の 目 的は、 少ない工程で簡単に実行でき る方法を提供する こ と で ある:
上記の 目 的は、 以下に示す本発明に よ り 達成される ; 試料中の所定の配列を有する標的核酸を検出ま たは定量する 方法であっ て、
( a ) 以下のプ ロ ーブ A と プロ ーブ B を準備する 工程 と 前記標的核酸中の第 1 の部分配列 F に相補的な配 列 F ' と 、 こ の F ' に連結 さ れた結合分子 と を含む第 1 のプ ロ ーブである プロ ーブ A、 およ び
前記標的核酸中の第 2 の部分配列 S に相補的な配 列 S ' と 、 こ の S ' に連結 さ れたフ ラ ッ グ と を含む第 2 のプ ロ ーブであ る プロ ーブ B [ こ こ で 、 前記フ ラ ッ グは二本鎖配 列であ り 、 その一方の鎖には標識物質が含まれる ] ;
( b ) 前記標的核酸中の前記第 1 の部分配列 F に前記第 1 のプロ ーブ A をハイ ブ リ ダィ ズさせる と 共に、 前記第 2 の 部分配列 S に前記第 2 のプロ ーブ B をハイ ブ リ ダィ ズさせる 工程と 、
( c ) 前記標的核酸にハイ ブ リ ダィ ズ した前記第 1 のプ ロ ーブ A と 前記第 2 のプロ ーブ B を連結 してプロ ーブ ( A + B ) を生 じる工程と 、
( d ) 前記結合対の一方であ る物質を、 前記結合分子に
高親和性の物質に結合 させて前記プロ ーブ ( A + B ) を回収 する 工程と 、 並びに
( e ) 前記フ ラ ッ グを構成する核酸の う ちの標識物質を 含む一本鎖を回収 し、 前記標識物質を検出ま たは定量する こ と に よ っ て、 前記試料中の標的核酸を検出ま たは定量する ェ 程 と
を具備する方法である。
本発明の方法は、 2 つのプロ ーブを用いて標的核酸を検出 する。 これに よ つ て本方法は、 非特異的結合を防ぎ、 且つ安 定 したハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンを行 う こ と が可能であ る。 ま た、 本方法は、 プローブ ( A + B ) を検出する こ と によ り 標 的核酸の検出が達成される。 従っ て、 配列特異性が高 く 、 且 つ検出精度も高い。
ま た本発明は、 フ ラ ッ グを検出する こ と に よ っ て標的核酸 の検出 を実施する。 後に詳細に説明する通 り 、 本発明の利点 は、 基本的に、 標的核酸に関する情報を フ ラ ッ グに置き換え 、 当該フ ラ ッ グを検出ま たは解析する こ と に よ っ て、 前記情 報を入手する こ と にある。 施行者は、 都合良 く フ ラ ッ グを設 計する こ と が可能であ る。 従っ て、 どの よ う な核酸を検出对 象と した場合であっ て も 、 検出対象毎に D N Aチ ッ プを製造 する こ と な く 、 共通する D N Aチ ッ プを一律に使用する こ と が可能である。 それに よ り 、 D N Aチ ッ プの所要数を節約す る こ と が可能である。 ま た、 D N Aチ ッ プに固相化する プロ ーブの種類を少な く する こ と が可能である。 ま た、 当該フ ラ ッ グの設計を工夫する こ と に よ り 、 標的核酸の検出効率は飛
躍的に向上する。 ま た、 検出工程も よ り 簡便にな る。
例えば、 安定な核酸配列を有する フ ラ ッ グを設計すれば、 安定 した検出結果が得 られる。 或いは、 該フ ラ ッ グを複数の ユニ ッ ト カゝ ら構成する こ と も 可能であ る。 当該複数のュニ ッ ト を使用する こ と に よ り 、 標的核酸の情報を コ ー ド化する こ と が可能であ る。 即ち、 フ ラ ッ グ配列に含まれる複数のュニ ッ 卜 の組合せに応 じて、 標的核酸の多種多様な情報を シ ンプ ルな コー ドに変換する こ と が可能であ る。 ま た更に、 得 られ る コ ー ドを D N A を用いて構築すれば、 当該 D N A コ ー ド 自 体を増幅する こ と が可能であ る。 長 さ と 安定性がー様な D N A コ ー ドを同一のプラ イ マ ー対を用いて増幅する と 、 従来の 標的核酸を増幅する方法に比較 して顕著な定量性が得られる 。 従っ て、 少ない コ ピー数の標的配列 も正確に検出お よび定 量する こ と が可能であ る。 ま た、 特定のアルゴ リ ズムを用い て D N A コ ー ドを数値に変換でき る よ う に設計すれば、 D N A分子反応を利用する計算が可能にな る。 これに よ り 、 血球 型や S N P S 等の個人の遺伝子情報の解析の簡便化が達成で き る。 また、 本発明では、 標的核酸の情報を、 任意に構成 し た該ュニ ッ 卜 の組合せを コー ド と して読み と る こ と が可能で ある。
更に、 本発明は、 簡便な操作に よ り 、 試料中か ら複数種類 の標的核酸を同時に検出する方法を提供する こ と を 目 的 と す る。
こ の 目 的は、 複数種類の標的核酸 N 1 か ら N n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数) の各々 に対 して、 プロ一フ " A 1 カゝら A n
( こ こ で、 n は 2 以上の整数) と 、 プロ 一ブ B 1 カゝ ら B n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数) と を用意 し、 上述の場合 と 同様 の工程を経る こ と に よ り 達成 される。 本発明 に よれば、 各々 の標的核酸は、 高い特異性を持っ て簡便に検出 される。 複数 種類の標的核酸を検出する場合に、 フ ラ ッ グは特に有利であ る。 図面の簡単な説明
本発明の方法の幾つかの好ま しい例を、 添付の図面を参照 して説明する。 図面は以下の通 り である。
図 1 は、 本発明の方法の第 1 の例を示すフ ロ ーチヤ一 卜 で ある。
図 2 は、 本発明の方法の第 2 の例を示すフ ロ ーチヤ 一 ト で ある。
図 3 は、 本発明の方法の第 3 の例を示すフ ロ ーチヤ一 ト で ある - 図 4 は、 本発明の方法の第 4 の例を示すフ ロ ーチヤ一 卜 で ある。
図 5 は、 本発明の方法の第 5 の例を示すフ ロ ーチヤ一 ト で ある。
図 6 は、 本発明の方法の更な る例を示すフ ロ ーチヤ一 卜 で ある。
図 7 Aは、 本発明で使用 さ れる フ ラ ッ グの設計例を示す表 である。 図 7 B は、 図 7 Aの設計例に対応する検出装置の例 を示す図である。
図 8 は、 本発明の第 1 の例の評価実験において、 プロ ーブ が標的核酸と 結合 した状態を示す模式図である。
図 9 は、 本発明の第 1 の例の評価実験に使用 したプロ ーブ Aお よびプロ ーブ B 、 標的配列、 検出用配列および変異配列 を示す図である。
図 1 0 は、 各 々 の洗浄過程におけ る 上清か ら得た配列を、 キヤ ビラ リ 電気泳動に よ り 検出 した結果を示すチヤ一 ト であ る。
図 1 1 は、 検出用核酸の回収率に対する標的核酸の濃度の 影響を示すグラ フである。
図 1 2 は、 検出用核酸の回収率に対する標的配列の一部が 異な る変異配列の影響を示すダラ フである。
図 1 3 Aは、 本発明の第 5 の例の評価実験に使用 した 2 種 類のプロ ーブ A、 プロ ーブ B お よび標的配列を示す図である 。 図 1 3 B は、 各プロ ーブ と 、 これを構成する要素 と の対応 を示す図である。
図 1 4 Aお よ び B は、 本発明のエ ンコー ド反応の特異性を 示すグラ フである。
図 1 5 は、 本発明のエンコー ド反応の特性を評価する 実験 のス キーム図である。
図 1 6 は、 本発明のエンコ ー ド反応後の P C R の定量的増 幅を示すグラ フである。
図 1 7 は、 本発明のエンコー ド反応後の P C R の定量的增 幅の試験方法を示すス キーム図である。
図 1 8 Aお よ び B は、 本発明のデコ ー ド反応の特異性 と 定
量性を示すグラ フである。
図 1 9 は、 本発明のデコ ー ド反応の特異性 と 定量性の試験 方法のス キーム図であ る。 発明を実施する ため の最良の形態
こ こ で使用 さ れる 「核酸」 の語は、 c D N A、 ゲノ ム D N A、 合成 D N A、 m R N A、 全 R N A、 h n R N Aおよび合 成 R N Aを含む全ての D N A並びに R N Aを意味する - こ こ で使用 さ れる 「標的核酸」 の語は、 任意の配列を有す る任意の核酸を示す。 これに限定する も の ではないが、 遺伝 病の原因遺伝子、 癌関連遺伝子、 ま たは ウ ィ ルス 由来の核酸 等の疾患のマ 一カー と なる得る核酸が特に好ま しい。
こ こ で使用 さ れる 「結合対」 の語は、 互いに特異的に結合 し得る 1 対の物質をい う 。 例 えば、 ア ビジン と ピオチン、 ス ト レプ ト ア ビジン と ピオチン、 お よびジ ゴキシュゲン と ジゴ キ シュゲン抗体等をレ、 う が、 これに限 られる も のではな く 、 互いに特異的に結合する も の であれば何れの物質を使用 して も よい。 従っ て、 例えば、 ア ビジン と ピオチンの場合であれ ば、 「結合対の一方」 と 言えば、 ア ビジンま たは ピオチンの 何れかを指 し、 「結合対の も う 一方の物質」 と 言えば、 残 り の一方を指す。 ま た、 こ こ で使用 される 「結合分子」 の語は 、 「結合对の一方」 ま たは 「結合対の も う 一方の物質」 の語 と 交換可能であ る。 同様に 「結合分子に高親和性な分子」 ま たは 「結合分子に特異的に結合する分子」 の語は 「結合対の 一方」 ま たは 「結合対の も う 一方の物質」 の語と 交換可能に
使用 される。
こ こ で使用 さ れる 「試料」 の語は、 血液、 尿お よび唾液等 の体液を示すが、 これに限 られる も のではな く 、 体液以外の 任意の試料も含まれる。 例えば、 試料が固体であ る場合、 酵 素処理、 界面活性剤ま たは有機溶媒の添加等の適切な方法で 液体にすればよ い。
こ こ で使用 さ れる 「相補的な配列」 と は、 適切な条件下に おいて、 所定の標的核酸のみに特異的にハイ プ リ ダィ ズ し得 る配列を意味する。 例 1 . 検出方法
本発明の検出方法の 1 例を図 1 を用いて説明する (図 1 ) 。 本例の方法では、 以下に示すよ う な 2 種類の核酸ブロ ーブ (以下、 単にプロ ーブ と も称す) 、 即ち、 プロ ーブ A 1 およ びプロ ーブ B 2 が使用 される (図 1 a ) 。
プロ ーブ A 1 は、 該標的核酸 3 の一部の領域におけ る塩基 配列 F に対 して相補的な配歹 IJ F ' と 、 配列 F ' に結合 された 結合分子 4 か ら な る。 こ こ で、 結合分子 4 は、 直接に配列 F ' に結合 して も 、 ま たは、 任意の塩基配列等の何 ら かの仲介 部分を介 して間接的に配列 F ' に結合 して も よ い。 プロ ーブ A 1 の塩基配列 F 以外の部分を タ グ、 タ グ配列 T g ま たは T g と も と も称す。 例えば、 任意の配列を も っ て間接的に結合 させる場合、 当該配列は如何な る塩基配列であっ て も 、 如何 なる塩基数であっ て も よ い。 好ま し く は、 標的核酸上の塩基 配列に非相補的であ る。 或いは、 他の化学的ま たは物理的な
手段によ り 結合 さ れていて も よ い。 ま た、 T g は、 標的核酸 の何れの部分 と も結合せず、 ま た T g は標的核酸 と どの様な 相互作用 も生 じない こ と が必要であ る。 こ こ で使用する 「非 相補的」 の語は、 標的核酸の配列、 特に、 検出に使用する任 意の領域の配列 と ハイ ブ リ ダイ ズ しない塩基配列をい う 。
本発明に使用 さ れる配列 F ' は、 1 以上の塩基数を有す。 安定なハイ プ リ ダイ ゼ一シ ョ ンを達成する ためには、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有す。
本発明 に使用 さ れる結合分子 4 は、 上述 した通 り 、 互いに 特異的に結合する 1 対の分子の何れか 1 方であっ て よ い。
プロ ーブ B 2 は、 標的核酸 3 の一部の領域の塩基配列 S に 相補的な配列 S ' と 、 配列 S ' に結合 した任意のフ ラ ッ グ ( 以下、 F L と も示す) と カゝ ら な る。 こ の例では、 フ ラ ッ グは 、 酉己歹 S ' に連な る二本鎖配列 と これに続く 標識物質 5 力、ら な る。 一般的に、 フ ラ ッ グは、 これ 自 身が標的核酸 3 と 結合 はせず、 ま た、 これ ら は互いに如何な る相互作用 も示 さ ない こ と が必要であ る。 従っ て、 フ ラ ッ グが塩基配列である場合 、 必ず し も全長に亘 り ニ本鎖であ る必要はな く 、 標的核酸 3 に結合せず、 且つ標的核酸と 如何な る相互作用 も示 さ ない配 列であれば部分的ある いは全体が一本鎖であっ て も よい。 ま た、 いかな る塩基数であっ て も よ い。 或いは以下の例 3 で詳 述する よ う に配列 S ' に何れかの手段に よ り 標識物質 5 が結 合される構造であっ て も よ い。 また、 フ ラ ッ グが二本鎖配列 である場合、 これは如何な る塩基配列であっ て も 、 如何なる 塩基数であっ て も よ いが、 配歹 ij F およ び配歹 IJ S の T m よ り 十
分に高い T mを もつ配列であ る こ と が必要であ る。 特に、 こ こ では、 フ ラ ッ グが二本鎖であ る場合には、 酉 S歹 ij S ' に直接 に結合 してお らず、 即ち、 酉己歹 S ' に直接結合 している配列 にノ、イ ブ リ ダィ ズ している配歹 をフ ラ ッ グ配歹 IJ と レヽ う 。
本発明で使用 される標識物質 5 は、 一般的に標識物質 と し て使用 される如何な る物質であっ て も よ い。 好ま しい標識物 質は、 例 えば、 蛍光物質、 発光物質、 3 2 P 等の放射性物質 、 高吸収性物質、 高光反射性物質、 高電位性物質、 磁性物質 お よ び色素等を含み、 好ま し く は、 F I T C等の蛍光物質で ある。
本発明に使用 される配列 S ' は、 1 以上の塩基数を有 し、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有する。
また、 プロ 一ブ A 1 に具備 さ れる T g と 、 プロ ーブ B 2 に 具備 される F L と は、 図 1 b に示すよ う に、 両プロ ーブが標 的核酸 3 の各 々 目 的 と する領域に結合 した と き に、 互いに遠 方の端に位置する よ う に設計 さ れる こ と が好ま しい。 ま た、 プロ ーブ A 1 お よびプロ ーブ B 2 は、 両プロ ーブが標的核酸 3 の各 々 目 的 と する領域に結合 した と き に、 標的核酸 3 の隣 り 合 う 塩基に対 して相補的な塩基を近方の端に有する こ と が 好ま しい。 これに よ り 、 以後の工程におけ る ライ ゲ一シ ヨ ン に有利 と なる。 し力 し、 これに限定される も のではない。
ま た、 プロ ーブ A 1 および B 2 は、 配歹 IJ F および配歹 IJ S の T mが同一にな る よ う に、 例えば、 G C含量や塩基の組成等 の条件を適切に選択 して も よい。
こ の例は、 以下の よ う に実施する。 まず、 標的核酸 3 に応
じて、 上述の よ う なプロ ーブ A 1 と プロ ーブ B 2 を準備する 。 これ ら を適切な割合で、 標的核酸 3 と 混合する (図 1 a ) 次に、 該混合物をハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン に適 した任意の 条件で一定時間イ ンキュべ一シ ョ ン し、 ハイ ブ リ ダイ ゼーシ ヨ ンを行な う (図 1 b ) 。
該ハィ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ンは、 一般的な何れの手法に よ つ て も行な う こ と が可能であ る。 好ま しいハイ プ リ ダイ ゼ一シ ヨ ンは、 先ず、 核酸の変性に有効な適宜の高温、 例えば、 9 5 °Cで 5 分間静置する こ と に よ り 、 標的核酸の相補的結合を 解除 して二本鎖から一本鎖へ と 変性させる。 標的核酸が一本 鎖の場合は 7 0 °Cで 5 分間静置する こ と に よ り 、 その 2 次構 造へ変性させる。 次に、 相補的塩基配列の再結合に有効な適 宜の.温度、 例えば 5 5 °Cにて 1 5 分間静置する こ と に よ り 、 一本鎖の標的核酸が、 相補的な塩基配列 と 再び結合する よ う に実施 される。 かかるハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン に よ り 、 プ ロ ーブ A 1 およびプロ ーブ B 2 の両方が、 同一の標的核酸 3 上に結合 してハイ ブ リ ッ ドを生成する。 従っ て、 使用する緩 衝液の種類、 温度条件等は、 上述の条件に限定 さ れる必要は な く 、 プロ ーブ A 1 お よびプロ ーブ B 2 が標的核酸 3 にハイ ブ リ ダイ ズする条件であれば、 どの よ う な条件であっ て も よ レヽ
次に、 プロ ーブ A 1 と プロ ーブ B 2 を連結する (図 1 c ) 。 本発明では、 標的核酸 3 上にハイ ブ リ ダィ ズ した状態のプ ロ ーブ A 1 と プロ ーブ B 2 を連結 し、 プロ ーブ ( A + B ) 7
を生成する。 こ の連結は連結部 6 の形成に よ り 達成 される。 こ の連結には 、 例えば、 サー ム ス ' ア ク ア チ ウ ス ( T a q j D N A ' リ ガ k ( T h e r m u s a q u a t i u s (
T a q ) D N A L i g a s e ; N e w E n g l a n d B i o 1 a b 社製) 等の T a q D N A リ ガ一ゼを利用でき る : しか し、 これに限 られず、 一般的に使用 さ れる何れの連結 剤 も使用可能であ る。 ま た、 酵素的な手段に代わっ て、 何 ら かの化学的な手段に よ り 、 両プロ ーブを連結 して も よ い。
ま た、 標的核酸 3 上の配列 F と 配列 S が、 互いに隣接 して いない場合には、 D N Aポ リ メ ラ ーゼ I と リ ガーゼを用いて 、 ギャ ッ プの充填反応を行えばよ い。 それに よ り 、 両プロ 一 ブ間隙に核酸塩基が導入 される。 使用 される D N Aポ リ メ ラ —ゼ I と リ ガーゼは、 一般的に使用 される何れの も の で も よ いが、 耐熱性の D N Aポ リ メ ラ 一ゼお よび リ ガーゼが好ま し レヽ:
読いて、 前記で得たプロ ーブ ( A + B ) 7 を標的核酸 3 力 ら解離する (図 1 d ) 。 該解離は、 熱的変性等の変性処理に よ り 行な えばよ い。 例えば、 熱的変性に よ り 行な う 場合には 、 生理的条件下では、 8 5 °C以上、 好ま し く は 9 0 eC以上の 温度にすればよ いが、 これに限定されない。 ただ し、 フ ラ ッ グ配列が二本鎖の場合はその T m よ り も低い温度で行 う こ と が望ま しい。
次に、 結合分子 4 、 即ち、 結合対の一方を、 これ対 して高 親和性な分子に結合 させる こ と に よ り プロ ーブ ( A + B ) 7 を回収する (図 1 e ) 。 続いて、 フ ラ ッ グを一本鎖に変性 し
、 標識物質 5 の結合 した一本鎖について、 これに相補的な配 列にハイ ブ リ ダィ ズする こ と に よ り 回収する (図 1 g ) 。 そ の後、 標識物質 2 を検出ま たは定量 し、 標的核酸の検出ま た は定量を達成する (図 1 g ) 。 該検出は、 使用 した標識物質 に応 じて、 一般的に使用 される何れの方法も使用でき る。
こ こ で、 プロ 一ブ ( A + B ) 7 と 標識物質 5 の結合 した一 本鎖を、 B o u n d / F r e e 分離 (以降、 B / F 分離 と 称 する) に よ り 回収する こ と に よ り 、 精度が向上 されて レ、 る。 こ の B / F 分離は、 一般的に使用 される B Z F 分離に準 じて 行な う こ と が可能である。
本方法において、 標識物質 5 の結合 した一本鎖のための好 ま しい B / F 分離は、 当該一本鎖に相補的な塩基配列を適当 な支持体上に固相化 させた固相担体を用いて行える (図 1 g ) 。 プロ ーブ ( A + B ) 7 のための好ま しい B / F 分離は、 当該結合分子 4 に特異的に結合する分子を適当 な支持体上に 固相化させた固相担体を用いて行える (図 1 e ) 。
使用 される支持体には、 例えば、 シ リ コ ンお よびガラ ス等 の基板、 ビーズ等の粒子、 試験管やバイ アル瓶等の容器、 繊 維、 キヤ ビラ リ 一等を含む管、 フ イ ノレタ ー、 ァ フ ィ 二テ ィ カ ラ ム 、 電極等が含まれる が、 これに限定 されない。 該支持体 の材質または表面処理は、 プロ ーブの固定成績に応 じて適宜 選ぶのが好ま しい。
フ ラ ッ グは、 人為的な配列である ので、 プロ ーブ ( A + B ) のハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン の特異性が向上する よ う な特性 を持つよ う に、 配列を設計する こ と が可能であ る。
例 2 . 検出方法の例
本方法は、 複数の標的核酸を同時に検出する場合に も有効 であ る。 図 2 に複数の標的核酸 N 1 、 N 2 、 N 3 · · · N n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数。 以下、 N 1 — N n と 称する) を 同時に検出する例を示 した。
検出对象が複数である こ と を除けば、 各工程お よ び各プロ 一 ブの構成は、 例 1 と 同様である (図 2 a カゝら e ) 。
具体的には、 標的核酸 N 1 — N n と 、 プロ ーブ A 1 _ A n と 、 およびプロ ーブ B 1 — B n を混合する (図 2 a ) 。 次に 、 これ ら をノヽイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン し、 プロ 一ブ A 1 — A n と プロ ーブ B 1 — B n を連結する (図 2 b ) 。 得られたプロ —ブ ( A 1 + B 1 ) ― ( A n + B n ) を解離する (図示せず ) 。 次に、 プロ ーブ ( A 1 + B 1 ) — ( A n + B n ) を回収 する (図 2 c ) 。 フ ラ ッ グを変性 して一本鎖 と する (図 2 d ) 。 当該標識物質の結合 して い る一本鎖を回収 し、 該標識物 質を検出ま たは定量する (図 2 e ) 。 これに よ り 複数の種類 の標的核酸を一度に、 且つ同 じ標識物質を用い る こ と に よ り 検出ま たは定量する こ と が可能である。 従っ て、 従来よ り も 少ない工程で複数の標的核酸を容易に検出でき る。
同 じ標識物質を使用 して、 複数の標的核酸を識別する には 、 標識核酸毎にフ ラ ッ グの配列を変更すればよ い。 ま た、 図 2 の工程 e 、 即ち、 標識一本鎖の回収に使用する相補的な配 列を基板に固相化する と き に、 配列毎に異な る領域に固相化 すればよ い。 前記フ ラ ッ グの配列の変更 と 、 領域毎の固相化
を同時に行 う こ と も可能である。
或いは、 標的核酸毎に、 各々 異な る標的物質を結合 して使 用する こ と も可能である。 こ の場合には、 フ ラ ッ グを変更す る こ と 、 ま たは領域毎の固相化を行 う 必要性は必ず し も なレヽ プ ロ ーブ ( A 1 + B 1 ) 、 ( A 2 + B 2 ) · · · ( A n + B n ) [以下、 ( A 1 + B 1 ) - ( A n + B n ) と 称する ] の F n ' お よび S n ' 配列の G C 含量や、 核酸塩基の組成等を 適切に選択すれば、 各プロ ーブの至適ハイ プ リ ダィ ゼ一シ ョ ン条件 (例えば、 温度、 塩濃度等) のバラ ツ キを抑制する こ と が可能であ る。 また、 複数種類のフ ラ ッ グ配列を用いる場 合に も 、 フ ラ ッ グ間でのハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン条件を統一 する こ と が好ま しい。 これに よ り 、 検出精度が向上する。 更 に、 F n ' お よ び S n ' 配歹 IJの T m値よ り フ ラ ッ グの酉己歹 ijの T m値を十分に高 く する こ と に よ り 、 検出精度が更に向上す る。
これに対 して、 標的核酸の相補的配列を固相化する従来の 核酸検出方法では、 固相化 さ れてい る各プロ ーブの至適ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン条件は、 一般に異な る の で、 全プロ 一ブ に適 した条件を設定する こ と は不可能である。 例 3 . 検出方法の例
次に図 3 を参照 しなが ら 、 本発明の方法の更な る例を説明 する。 本例の方法は、 複数の標的核酸 N 1 、 N 2 、 N 3 · · · N n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数。 以下、 N l — N n と 称す
る) を同時に検出する例であ る。 標的核酸 N 1 — N n に応 じ て、 プロ ーブ A l 、 A 2 、 A 3 · · · A n ( n は 2 以上の整数 。 以下、 A 1 — A n と 称する ) と プロ ーブ B l 、 B 2 、 B 3 • · · B n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数。 以下、 8 1 — 8 11 と 称する) を準備する。 これ ら は、 更に以下に示すよ う な特徴 を有す核酸プロ ーブである (図 3 a ) 。
プロ ーブ A 1 — A n は、 該標的核酸 N 1 _ N n の一部の領 域におけ る塩基配列 F 1 カゝ ら F n に対 して相補的な配列 F 1 ' 力 ら F n ' と 、 夫々 の配歹 IJ F 1 ' 力 ら F n ' に結合 された タ グ T g l 力 ら T g n (以下、 T g l — T g n と も称す) か ら な る。 本例の タ グ T g 1 力 ら T g n (以下、 T g l ' — T g n ' と も称す) は塩基配列であ り 、 夫々 の タ グ T g 1 力 ら T g n は、 標的核酸の何れの部分 と も結合せず、 また標的核 酸と どの様な相互作用 も生 じなレ、 こ と が必要である。 こ こ で 、 タ グ T g 1 力 ら T g n は、 直接に酉己歹リ F 1 ' 力 ら F n ' に 結合 して も 、 ま たは、 任意の塩基配列等の何 ら かの仲介部分 を介 して間接的に配列 F 1 ' 力、 ら F n ' に結合 して も よ い。 例えば、 任意の配列を も っ て間接的に結合 させる場合、 当該 配列は如何な る塩基配列であっ て も 、 如何な る塩基数であつ て も よ い。 好ま し く は、 標的核酸上の塩基配列に非相補的で ある。 或いは、 他の化学的ま たは物理的な手段に よ り 結合 さ れていて も よ い。
本発明に使用 される配列 F 1 ' カゝら F n ' は、 夫々 異な る 1 以上の塩基数を有す。 安定なハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ンを達 成する ためには、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有す。
図 3 a に示す よ う に、 プロ ーブ B 1 — B n は、 標的核酸の 一部の領域の塩基配列 S 1 カゝ ら S n に相補的な配列 S 1 ' か ら S n ' と 、 配列 S 1 ' 力 ら S n ' に結合 した任意のフ ラ ッ グ (以下、 F L と も示す) と カゝ ら な る。 こ の例では、 フ ラ ッ グは標識物質を含む。 上述の例 と 同様にフ ラ ッ グは、 こ れ自. 身が標的核酸 と 結合はせず、 ま た、 これ ら は互いに如何なる 相互作用 も示 さ ない こ と が必要であ る。 本例のプ ロ ーブ B 1 — B n は、 配歹 IJ S 1 ' カゝ ら S n ' に何れかの手段に よ り 標識 物質が結合 される構造である。
本発明で使用 される標識物質は、 例 1 において記載通 り の 一般的に標識物質 と して使用 さ れる如何な る物質であっ て も よい。
本発明に使用 される酉己歹 IJ S 1 ' カゝ ら S n ' は、 1 以上の塩 基数を有 し、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有する。
ま た、 プロ ーブ A 1 — A n に具備 さ れる T g と 、 プロ ーブ B 1 — B n に具備 さ れる F L と は、 図 3 b に示す よ う に、 両 プロ ーブが標的核酸の各 々 目 的 と する領域に結合 した と き に
、 互いに遠方の端に位置する よ う に設計 さ れる こ と が好ま し レヽ (図 3 b ) 。 また、 プロ ーブ A 1 — A n お よ びプロ 一ブ B 1 一 B n は、 両プロ ーブが標的核酸の各 々 目 的 と する領域に 結合 した と き に、 標的核酸の隣 り 合 う 塩基に対 して相補的な 塩基を近方の端に有する こ と が好ま しい。 これに よ り 、 以後 の工程におけ る ライ ゲ一シ ヨ ンに有利 と な る。 しカゝ し、 これ に限定される も のではない- これ ら のプロ ーブに含まれる F 1 ' カゝ ら F n ' お よび S I
' か ら S n ' の配列は、 例えば、 G C含量や核酸塩基の組成 等を適切に選択すれば、 各プロ ーブの至適ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン条件のばらつき を抑制する こ と が可能である。 ま た複 数種類の タ グ配列を用いる場合に も 、 タ グ間のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン条件を統一する こ と が好ま しい。 さ ら に F n ' お よび S n ' 配列の T m値よ り タ グ配列の T m値を十分に高 く する こ と によ り 、 検出感度が向上する。
こ の例は、 以下の よ う に実施する。 まず、 標的核酸 N 1 — N n に応 じて、 上述の よ う なプ ロ ーブ A 1 — A n お よびプロ ーブ B 1 — B n を準備する。 これ ら を適切な割合で、 標的核 酸 N 1 — N n と 混合する (図 3 a ) 。
次に、 該混合物をハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン に適 した任意の 条件で一定時間ィ ンキ ュベー シ ョ ン し、 ハイ ブ リ ダイ ゼーシ ヨ ンを行な う (図示せず) 。
該ハィ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ンは、 一般的な何れの手法に よ つ て も行な う こ と が可能である。 好ま しいハイ ブ リ ダィ ゼ一シ ョ ンは、 先ず、 核酸の変性に有効な適宜の高温、 例えば、 9 5 °Cで 5 分間静置する こ と に よ り 、 標的核酸の相補的結合を 解除 して二本鎖か ら一本鎖へ と 変性させる。 標的核酸が一本 鎖の場合は 7 0 °Cで 5 分間静置する こ と に よ り 、 その 2 次構 造へ変性 させる。 次に、 相補的塩基配列の再結合に有効な適 宜の温度、 例えば 5 5 °Cにて 1 5 分間静置する こ と によ り 、 一本鎖の標的核酸が、 相補的な塩基配列 と 再び結合する よ う に実施される。
かかるハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンに よ り 、 プロ ーブ A 1 — A
n お よびプロ ーブ B 1 — B n の両方が、 夫々 の組毎に同一の 標的核酸上に結合 してハイ プ リ ッ ドを生成する。 従っ て、 使 用する緩衝液の種類、 温度条件等は、 上述の条件に限定され る必要はな く 、 プロ ーブ A 1 — A n お よびプロ ーブ B 1 - B n が標的核酸にハイ ブ リ ダィ ズする条件であれば、 どの よ う な条件であっ て も よ い。
次に、 プロ 一ブ A 1 — A n お よ びプロ ーブ B 1 — B n を夫 々 連結する (図 3 b ) 一 本発明では、 標的核酸 N 1 — N n 上 にハィ ブ リ ダィ ズ した状態のプロ ーブ A 1 — A n お よ びプロ —ブ B 1 — B n を連結 し、 プロ ーブ ( A 1 + B 1 ) — プロ一 ブ ( A n + B n ) を生成する。 こ の連結は連結部の形成に よ り 達成される。 こ の連結は、 例 1 と 同様に行えばよ い。
ま た、 標的核酸上の配列 F と 配列 S が、 互いに隣接 してレヽ ない場合には、 D N Aポ リ メ ラ ーゼ I と リ ガーゼを用いて、 ギャ ッ プの充填反応等を行えばよ い。 それに よ り 、 両プロ ー ブ間隙に核酸塩基が導入 される。 使用 される D N Aポ リ メ ラ ーゼ I と リ ガ一ゼは、 一般的に使用 さ れる何れの も ので も よ いが、 耐熱性の D N Aポ リ メ ラ 一ゼお よび リ ガーゼが好ま し レヽ Q
続いて、 前記で得たプロ ーブ ( A 1 + B 1 ) ― ( A n + B n ) を標的核酸か ら解離する (図 3 c ) 。 該解離は、 熱的変 性等の変性処理に よ り 行なえばよ い。 例えば、 熱的変性に よ り 行な う 場合には、 生理的条件下では、 8 5 °C以上、 好ま し く は 9 0 °C以上の温度にすればよ いが、 これに限定されなレ、
次に、 プロ ーブ ( A l + B l ) ― ( A n + B n ) を、 夫々 の T g 1 力 ら T g n に相補的な酉己歹 1J T g 1 ' 力、 ら T g n ' に ハイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ンする こ と に よ り 回収する (図 3 d ) = その後、 標識物質を検出ま たは定量 し、 標的核酸の検出ま たは定量を達成する (図 3 d ) 。 該検出は、 使用 した標識物 質に応 じて、 一般的に使用 される何れの方法も使用でき る。
相補的な配列 T g 1 ' カゝ ら T g n ' は支持体に固定されて 使用する こ と が好ま しい: 使用 さ れる 支持体には、 例えば、 シ リ コ ンお よ びガラ ス等の基板、 ビーズ等の粒子、 試験管や バイ ア ル瓶等の容器、 繊維、 キ ヤ ビラ リ 一等を含む管、 フ ィ ルター、 ァ フ ィ 二テ ィ カ ラ ム 、 電極等が含まれる が、 これに 限定さ れない。 該支持体の材質ま たは表面処理は、 プロ ーブ の固定成績に応 じて適宜選ぶの が好ま しい。
例 3 では、 複数の標的核酸についての例を示 したが、 1 種 類の標的核酸について も こ の方法を使用する こ と も 可能であ る - 更に、 標識物質の種類を増やすこ と に よ り 、 更に多 く の 種類の標的核酸を簡便に識別する こ と が可能であ る。 例 4
次に図 4 を参照 しなが ら 、 本発明の方法の更な る例を説明 する。 本例の方法は、 複数の標的核酸 N 1 、 N 2 、 ' N 3 · · '
N n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数。 以下、 N 1 — N n と称す る) を同時に検出する例であ る。 標的核酸 N 1 — N n に応 じ て、 プロ ーブ A l 、 A 2 、 A 3 · · · A n ( n は 2 以上の整数
。 以下、 A 1 — A n と 称する) と プロ ーブ B l 、 B 2 、 B 3
••• B n ( こ こ で、 n は 2 以上の整数。 以下、 B l — B n と 称する) を準備する。 これ ら は、 更に以下に示すよ う な特徴 を有す核酸プロ ーブである (図 4 a ) 。
プロ ーブ A 1 一 A n は、 該標的核酸 N 1 一 N n の一部の領 域におけ る塩基配列 F 1 カゝ ら F n に対 して相補的な配列 F 1 ' 力、ら F n ' と 、 夫々 の配列 F 1 ' 力、 ら F n ' に結合 された タ グ T g 1 力 ら T g n 力 ら な る。 本例のタ グ T g 1 力、 ら T g n は塩基配列であ り 、 夫々 の タ グ T g 1 カゝ ら T g n は、 標的 核酸の何れの部分 と も結合せず、 ま た標的核酸 と どの様な相 互作用 も生 じなレヽ こ と が必要であ る。 こ こ で、 タ グ T g 1 力 ら T g n は、 直接に.配列 F 1 ' 力、 ら F n ' に結合 して も 、 ま たは、 任意の塩基配列等の何 ら かの仲介部分を介 して間接的 に配列 F 1 ' カゝ ら F n ' に結合 して も よ い。 例えば、 任意の 配列を も っ て間接的に結合 させる場合、 当該配列は如何な る 塩基配列であっ て も 、 如何な る塩基数であっ て も よ い。 好ま し く は、 標的核酸上の塩基配列に非相補的であ る。 或いは、 他の化学的ま たは物理的な手段に よ り 結合 されていて も ょ レヽ 本発明に使用 される配列 F 1 ' カゝ ら F n ' は、 夫々 異な る 1 以上の塩基数を有す。 安定なハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ンを達 成する ためには、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有す。
図 4 a に示すよ う に、 プロ ーブ B 1 — B n は、 標的核酸の 一部の領域の塩基配列 S 1 カゝ ら S n に相補的な配列 S 1 ' 力 ら S n ' と 、 配列 S 1 ' 力 ら S n ' に結合 した任意のフ ラ ッ グ と 力、 ら なる。 こ の例では、 フ ラ ッ グは任意の塩基配列 F L
1 から F L n と 標識物質と を含む。 上述の例 と 同様にフ ラ ッ グは、 これ 自 身が標的核酸と 結合はせず、 ま た、 これ ら は互 いに如何な る相互作用 も示 さ ない こ と が必要であ る。 本例の プロ ーブ B 1 — B n は、 配歹 IJ S 1 ' カゝ ら S n ' に何れかの手 段に よ り 標識物質が結合 される構造である。
本発明で使用 される標識物質は、 例 1 において記載 した通 り の一般的に標識物質 と して使用 される如何な る物質であつ て も よ い。
本発明に使用 される配列 S ' は、 1 以上の塩基数を有 し、 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有する。
また、 プロ ーブ A 1 — A n に具備 される T g と 、 プロ ーブ B 1 — B n に具備 される F L と は、 図 4 b に示すよ う に、 両 プロ ーブが標的核酸の各々 目 的 と する領域に結合 した と き に 、 互いに遠方の端に位置する よ う に設計 される こ と が好ま し レヽ (図 4 b ) 。 また、 プロ ーブ A 1 — A n お よ びプロ ーブ B 1 — B n は、 両プロ ーブが標的核酸の各々 目 的 と する領域に 結合 した と き に、 標的核酸の隣 り 合 う 塩基に対 して相補的な 塩基を近方の端に有する こ と が好ま しい。 これに よ り 、 以後 の工程におけ る ライ ゲーシ ヨ ンに有利 と なる。 し力 し、 これ に限定される ものではない。
これ ら のプロ ーブに含まれる F 1 ' カゝ ら F n ' および S I ' か ら S n ' の配列は、 例えば、 G C含量や核酸塩基の組成 等を適切に選択すれば、 各プロ ーブの至適ハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン条件のばらつき を抑制する こ と が可能であ る。 また複 数種類のタ グ配列お よびフ ラ ッ グ配列を用レ、る場合に も 、 タ
グ間およびフ ラ ッ グ間のハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン条件を統一 する こ と が好ま しレ、。 さ ら に F n ' お よび S n ' 配列の T m 値よ り も タ グ配列お よびフ ラ ッ グ配列の T m値を十分に高 く する こ と に よ り 、 検出感度が向上する。 また一つの タ グ配列 に対 して複数種類の フ ラ ッ グ配列を用い る と 互いに区別でき る標的核酸の種類を飛躍的に増やすこ と ができ る。
こ の例は、 以下の よ う に実施する。 まず、 標的核酸 N 1 — N n に応 じて、 上述の よ う なプ ロ ーブ A 1 一 A n およびブロ —ブ B 1 — B n を準備する。 こ れ ら を適切な割合で、 標的核 酸 N 1 — N n と 混合する (図 4 a ) 。
次に、 該混合物をハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン に適 した任意の 条件で一定時間ィ ンキ ュベ一シ ョ ン し、 ハイ ブ リ ダイ ゼーシ ヨ ンを行な う (図示せず) 。
該ハィ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンは、 一般的な何れの手法に よ つ て も行な う こ と が可能であ る。 好ま しいハイ プ リ ダイ ゼーシ ヨ ンは、 先ず、 核酸の変性に有効な適宜の高温、 例えば、 9 5 °Cで 5 分間静置する こ と に よ り 、 標的核酸の相補的結合を 解除 して二本鎖か ら一本鎖へ と 変性させる。 次に、 相補的塩 基配列の再結合に有効な適宜の温度、 例えば 5 5 °Cにて 1 5 分間静置する こ と に よ り 、 一本鎖の標的核酸が、 相補的な塩 基配列 と 再び結合する よ う に実施 される。
力、カゝるノヽィ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン に よ り 、 プロ ーブ A 1 _ A n お よびプロ 一ブ B 1 — B n の両方が、 夫々 の組毎に同一の 標的核酸上に結合 してハイ ブ リ ッ ドを生成する。 従っ て、 使 用する緩衝液の種類、 温度条件等は、 上述の条件に限定され
る必要はな く 、 プロ ーブ A 1 _ A n およびプロ ーブ B 1 — B n が標的核酸にハイ ブ リ ダィ ズする条件であれば、 どの よ う な条件であっ て も よ い - 次に、 プロ ーブ A 1 — A n お よびプロ ーブ B 1 — B n を夫 々 連結する (図 4 b ) = 本発明では、 標的核酸 N 1 — N n 上 にハィ ブ リ ダィ ズ した状態のプ ロ ーブ A 1 — A n お よ びプ口 —ブ B l — B n を連結 し、 プロ ーブ ( A 1 + B 1 ) - ( A n + B n ) を生成する。 こ の連結は連結部の形成に よ り 達成 さ れる。 こ の連結は、 例 1 と 同様に行えばよ い。
ま た、 標的核酸上の配列 F と 配列 S が、 互いに隣接 してい ない場合には、 D N Aポ リ メ ラ 一ゼ I と リ ガーゼを用いて、 ギャ ッ プの充填反応等を行えばよ い。 それに よ り 、 両プロ 一 ブ間隙に核酸塩基が導入 される。 使用 さ れる D N Aポ リ メ ラ —ゼ I と リ ガ一ゼは、 一般的に使用 される何れの も ので も よ いが、 耐熱性の D N Aボ リ メ ラ 一ゼおよ び リ ガーゼが好ま し レヽ -一
続いて、 前記で得たプロ ーブ ( A 1 + B 1 ) — ( A n + B n ) を標的核酸か ら解離する (図示せず) 。 該解離は、 熱的 変性等の変性処理に よ り 行なえばよ い。 例えば、 熱的変性に よ り 行な う 場合には、 生理的条件下では、 8 5 °C以上、 好ま し く は 9 0 °C以上の温度にすればよ いが、 これに限定されな レ、
次に、 プロ ーブ ( A 1 + B 1 ) - ( A n + B n ) を、 夫々 の T g 1 力、ら T g n に相補的な配列 T g 1 ' 力 ら T g n ' に ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ンする こ と によ り 回収する (図 4 c )
, 続いて、 変性に よ り 当該プロ ーブを解離 し、 その^、 F L 1 力 ら F L n の配列に相補的な配歹リ F L 1 ' 力 ら F L n ' に ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ンする こ と に よ り 回収する (図 4 d ) 次に、 夫々 の標識物質を検出ま たは定量 し 、 標的核酸の検 出ま たは定量を達成する (図 4 e ) 。 該検出は、 使用 した標 識物質に応 じて、 一般的に使用 される何れの方法も使用でき る。
相補的な酉 5列 T g 1 ' 力 ら T g n ' お よび配列 F L 1 ' 力 ら F L n ' は、 支持体に固定 さ れて使用する こ と が好ま しい 。 使用 さ れる 支持体には、 例 えば、 シ リ コ ンお よびガラ ス等 の基板、 ビーズ等の粒子、 試験管やバイ アル瓶等の容器、 繊 維、 キヤ ビラ リ 一等を含む管、 フ イ ノレタ ー、 ァ フ ィ 二テ ィ カ ラ ム、 電極等が含まれる が、 これに限定されない。 該支持体 の材質ま たは表面処理は、 プロ ーブの固定成績に応 じて適宜 選ぶの が好ま しい: 例 5 . 検出方法の例
以下に、 本発明の好ま しい更な る例について説明する。 以 下の方法は、 フ ラ ッ グの設計を工夫する こ と に よ り 、 多種類 の標的核酸を、 高精度に且つ効率よ く 検出する こ と が可能な 方法である。
こ の方法では、 以下に示すよ う な 2 種類の核酸プロ ーブ、 即ち、 プロ ーブ Aお よ びプロ ーブ B が使用 される (図 5 a ) プロ ーブ Aは、 標的核酸の一部の領域の塩基配列 F に相補
的な配列 F ' と 、 これに結合 した結合分子から な る。
こ こ で、 結合分子は、 互いに特異的に高親和性を有する 2 つの物質の内の何れか一方の物質である。 例えば、 ピオチン ま たはア ビジン若 し く はス ト レプ ト ア ビジン等であ る。 ま た 、 結合分子は、 直接に配列 F ' に結合 して も 、 或いは任意の 配列を解 して間接的に配列 F ' に結合 して も よ い。 間接的に 結合する場合の任意の配列は、 如何な る塩基配列であっ て も 、 如何な る塩基数であっ て も よ い。 好ま し く は、 標的核酸上 の塩基配列に非相補的な配列であ る。
プロ ーブ B は、 標的核酸の一部の領域の塩基配列 S に相補 的な配列 S ' と フ ラ ッ グ と 力 ら な る。 本例における フ ラ ッ グ は二本鎖から な る。 前記二本鎖は、 複数のュニ ッ 卜 か ら なる 任意の配列を有す。 ま た、 フ ラ ッ グは、 これ 自 身が標的核酸 と 結合はせず、 ま た、 これ ら は互いに如何な る相互作用 も示 さ なレヽ こ と が必要である。
本方法に使用 される配列 F ' お よび配列 S ' は、 1 以上の 塩基数を有 し、 よ り 好ま し く は 1 5 以上の塩基数を有する。
ュニ ッ ト の設計例を図 7 に示す。 フ ラ ッ グ F L の複数のュ ニ ッ ト の各 1 ユニ ッ ト は、 1 0 塩基数以上 と して よ く 、 よ り 好ま し く は約 1 5 塩基数であ る。 フ ラ ッ グ F L のユニ ッ ト数 は、 何れでも よ いが、 解析の容易 さ 力、 ら 4 ユニ ッ ト が好ま し い。 しか し、 これに限られる ものではない
複数の標的核酸を同時に検出する場合には、 多種類のュニ ッ ト を組み合わせて フ ラ ッ グ F L を構築する。 た と えば、 S D 、 D 0 、 D l 、 E D の 4 ユニ ッ ト 力 ら な る フ ラ ッ グ F L を
設計する場合を例 と する と 、 先ず、 2 2 種類のユニ ッ ト を設 計 し、 その中か ら 2 種類を選択 してプラ イ マー と な る S Dュ ニ ッ ト と 、 も う 1 つのプラ イ マ 一であ る E Dユニ ッ ト と する 。 残 り の 2 0 種類のユニ ッ ト を用いて、 各標的核酸の種類毎 に、 選択する 2 つのュニ ッ ト の種類を変え る こ と に よ り D O 、 D 1 を設計する と 、 1 0 0 種類の異な る核酸配列を検出す る こ と が可能である (図 7 A ) 。
2 2 種類のュニ ッ ト は、 正規直交化 された塩基配列に よ り 設計する こ と が好ま しい。 正規直交化 さ れた塩基配列は T m 値が揃っ てお り 、 相補配列以外 と は安定 したハィ ブ リ ッ ドは 形成 しない。 ま た、 相補配列 と のハイ ブ リ ッ ド形成を阻害す る よ う な安定 した 2 次構造は形成 しない。 これに よ り 、 最終 的な検出時の ミ スハイ プ リ を少な く し、 ハイ プ リ の形成速度 を上げる こ と が可能になる。 したがっ て、 検出精度を向上す る こ と 、 お よび検出時間を短縮する こ と が可能にな る。 ま た 、 ユニ ッ ト 数を増すこ と や、 ユニ ッ ト の種類を増すこ と に よ り 、 1 0 0 0 0 種類の異なる核酸配列を も検出する こ と が可 能である。
図 5 を用いて、 本例の方法を更に説明する。 図 5 a に、 4 ュニ ッ ト カ ら な る フ ラ ッ グ F L の例を示 した。 該 4 ュニ ッ ト は、 ポ リ メ ラーセ 鎖反応 ( p o 1 y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ; 以後、 P C R増幅ま たは P C R反 応 と 称す) においてプライ マー と な る S Dユニ ッ ト と 、 標的 核酸の種類を認識する ための認識用ュニ ッ ト 、 即ち、 D 0 ュ ニ ッ ト お よび D 1 ュニ ッ ト と 、 お よびも う 1 つ のプラ イ マ ー
配列であ る E Dュニ ッ ト と カゝ ら な る。 これ ら の各ュニ ッ ト は 、 後の工程においては、 夫々 が読み取 り 枠と なる。
検出は、 まず上記のプロ ーブ A と プロ ーブ B を、 標的核酸 と 混合する (図 5 a ) こ と に よ り 行 う 。 こ の と き 、 試料に含 まれる標的核酸は、 複数の異な る核酸分子群であっ て も よ い : 例えば、 検出 さ れるべき標的核酸の種類が 1 ◦ 0 種類以下 である な ら ば、 D 0 ユニ ッ ト は、 D 0 — 1 力 ら D 0 _ 1 0 の 1 0 種類の中カゝ ら選択 され、 且つ D 1 ユニ ッ ト は、 D 1 — 1 から D 1 — 1 0 の 1 0 種類の 中カゝ ら選択 される (図 7 A ) , 次に、 プロ ーブ A、 プロ ーブ B 、 お よ び標的核酸をハイ ブ リ ダイ ゼ一シ ョ ンに適 した条件で一定時間ィ ン キ ュ ベ一 シ ョ ン し、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行な う (図 5 b ) 。 ノヽイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンの条件は、 例 1 に示す通 り でよ い。
かかるハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン に よ り 、 プロ 一ブ Aお よ び ブロ ーブ B の両方が同一の標的核酸上に結合する (図 5 b ) 次に、 標的核酸にハイ ブ リ ダィ ズ したプロ ーブ Aおよ びブ ロ ーブ B を連結する (図 5 c ) 。 連結の条件は、 例 1 に示す 通 り でよ い。
また、 フ ラ ッ グ F L の T m値は、 配歹 IJ F ' および S ' よ り 高い温度に設計する こ と が好ま しい。 これに よ り 本検出方法 におけ るハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン、 ラ イ ゲーシ ョ ンおよび変 性等の操作の加熱ま たは冷却の際に、 検出感度の低下を も た らすフ ラ ッ グの変性を防ぐこ と が可能であ る。
次に、 得 られたフ ラ ッ グ F L の情報を B Z F 分離する。 具
体的には、 プロ ーブ ( A + B ) に具備 される結合分子を、 そ の対 と なる べき結合分子を介 して固相担体に補足する (図 5 e ) 0
前記固相担体は、 基板、 ビーズ等の粒子、 容器、 繊維、 管 、 フ イ ノレタ ー 、 ァ フ ィ 二テ ィ ' カ ラ ム 、 電極等を用 い る こ と が可能であ るが、 好ま し く は ビーズであ る。
次に、 結合分子に捕捉 された状態で、 プロ ーブ ( A + B ) の フ ラ ッ グ F L を変性 し一本鎖にする (図 5 f ) 。 得られた 液相中の一本鎖配列 F L ' に対 して P C R増幅を行な う (図 5 g ) 。 上述 したよ う に、 予め フ ラ ッ グ F L には、 2 つのプ ラ イ マー配歹 |J S Dおよ び E D が配置 してあ る。 従っ て、 こ の プラ イ マー配列を利用 して P C R反応が容易に行ない得る。 ま た、 こ の と き 、 P C R に使用する 2 つのプラ イ マーの一方 、 た と えば S D配列に、 ピオチン等の結合分子を結合 してお く こ と が好ま しいつ こ の と き の P C R の詳細な条件は、 設計 したフ ラ ッ グ F L に依存する。
続いて、 該 P C R反応の終了後、 結合分子を固相 した固相 担体に結合する こ と に よ って、 P C R産物であ る二本鎖配列 を回収する (図 5 i ) 。 こ こ で、 固相化 された担体は、 前記 結合分子 と 対になる結合対の も う 一方の物質であ る。 さ ら に 、 変性に よ り 配列 F L ' を除き 、 一本鎖配列 F L のみを固相 担体上で回収する (図 5 i ) 。
続いて、 固相上の一本鎖フ ラ ッ グ配歹 U F L の解析を行な う 。 まず、 一本鎖フ ラ ッ グ配列 F L が結合 した前記固相担体を 1 0 等分する ( D 1 ユニ ッ ト 力 — 1 力 ら D l — D 1 0 の
場合) 。 各々 に、 標識分子 と 結合 した D 1 — 1 ' か ら D 1 — 1 0 ' 配列の一つお よび全ての D 0 ' 配歹 IJ ( D 0 — 1 ' 力、ら D 0 — 1 ◦ ' ) をカ卩え、 フ ラ ッ グ配歹 IJ F L にハイ ブ リ ダィ ズ する。
続いて、 ハイ プ リ ダイ ズ した 2 つの核酸分子を ラ イ ゲーシ ヨ ンに よ り 連結する。 こ こ で、 ラ イ ゲーシ ヨ ンの条件お よび 標識物質に関する 定義は上述 した通 り であ る。 その後、 変性 に よ り 連結された分子を液相に回収する。
得られた標識 さ れた核酸分子の解析は、 予め D 0 - 1 か ら D O — 1 0 の核酸分子を固相化 した D N Aチ ッ プま たは D N Aキヤ ビラ リ 等に対 して、 ノヽイ ブ リ ダィ ズする こ と に よ り 行 う こ と 力 でき る。 特に、 D N Aキヤ ビラ リ は、 D O — 1 力、 ら D 0 — 1 0 で 1 0 等分に分け られた も のを同時に処理でき る ので、 これによ り 分析は容易になる であろ う 。
例えば、 各 1 0 種類の D O — 1 力 ら D O — 1 0 と 、 D 1 — 0 力、 ら D 1 - 1 0 の配列を用レ、て フ ラ ッ グ F L を設計 した場 合、 図 7 Aの 1 の位置には D 0 — 1 に相当する配列が固定さ れ、 標識された D 1 — 1 ' 分子 と 連結 された拡散分子 6 3 に ハイ ブ リ ダィ ズされる。 同様に、 他の位置には列に よ り 相当 する D 0 配列が固定され、 行に よ り 相 当する D 1 ' 分子 と 連 結 された拡散分子にハイ ブ リ ダィ ズさ れる。 こ の よ う な行列 の配置を、 後述する D N Aキ ヤ ビラ リ に对 して用レヽる (図 7 B ) と 解析が容易に行える。
こ こ では、 1 0 種類のュニ ッ ト を用 いた例を挙げたが、 ュ ニ ッ 卜 の種類は 1 0 種類に限 られる も のではな く 、 それ以下
でも 、 それ以上でも よ い。
こ こ で使用する 「 D N Aキ ヤ ビラ リ 」 と は、 標的核酸を検 出する ための装置であ り 、 その内側に該標的核酸に対する相 補的配列が結合 されてお り 、 該相補的配列に標的核酸を結合 する こ と に よ り 、 該標的分子を検出する装置をい う 。 図 7 B に示す通 り 、 多数の D N Aキ ヤ ビラ リ を同時に使用 し、 且つ 斜線で示 した部分に、 互いに異な る プロ ーブを配置する こ と に よ り 、 同時に多 く の標的核酸を検出する こ と が可能であ る ま た、 本方法では、 フ ラ ッ グ配歹り F L の各ュニ ッ 卜 には正 規直交化配列が使用 さ れている ので、 実施 されるハイ プ リ ダ ィ ズの反応温度等の条件を均一化する こ と が可能である。 こ れに よ り 、 ミ スハイ プ リ を防止でき 、 高い精度が得 られる。 また、 同一条件の下で一度に多 く の解析を行な う こ と が可能 であ る ため、 検出時間の短縮化を達成する こ と が可能であ る 。 ま た、 本方法に よ り 複雑なゲ ノ ム情報を D N Aの塩基配列 で表現 した数値に変換する こ と も可能 と な り 、 D N A分子反 応を利用 した計算を行 う こ と に よ り 、 多種類の情報や、 互い に連鎖 した複雑な遺伝子情報を容易に解析する こ と が可能に なる。 また、 コー ド化 したのち に容易に コー ド化核酸を増幅 でき る ので、 少ない コ ピ一数の標的配列であっ て も正確に且 つ定量的に検出する こ と が可能であ る。 また、 コー ド化する こ と に よ り 、 多 く の情報を圧縮する こ と が可能であ る。 従つ て D N Aチ ッ プま たはキヤ ビラ リ ーア レイ 等の検出手段の所 要数を節約する こ と が可能であ る。
こ こ で使用する 「エ ン コー ド反応」 と は、 あ る塩基配列を 、 正規直交化塩基配列で表現 さ れる コ ー ドに変換する こ と を レ、 う 。 上述の図 5 a カゝら f の工程力; これに相当する。
ま た、 こ こ で使用する 「デコ ー ド反応」 と は、 前記で変換 された コ ー ドの読み取 り を行ない、 それに よ り 元の情報を復 元する こ と をい う 。 上述の図 5 j の工程が これに相当する。
上記の例 5 では、 1 種類の標的核酸を検出する例を示 した が、 複数種類の フ ラ ッ グ配列を設計すれば、 同様な工程を経 る こ と に よ り 複数種類の標的核酸を同時に検出する こ と も 可 能である。
ま た、 例 5 の応用例を図 6 に示す。 図 6 に示 した例では、 検出する標的核酸に応 じて、 D O 1 - D 1 1 カゝ ら D O 1 一 D I n ( こ こ で、 n は整数である ) を含むフ ラ ッ グ配列が設計 される。 これを例 5 の工程 a か ら f と 同様に処理 し、 更に、 以下の よ う なデコ ー ド反応を行 う (図 6 ) 。 即ち、 得 られた 一本鎖配列 F L ' に対 して、 2 つのプラ イ マ ー配歹 IJ S Dおよ び E D を用レ、て、 P C R反応を行 う (図 6 g ) 。 こ こ で図 6 g か ら i の工程は、 多種類のプロ ーブ等を代表 して n につい て図示 したが 、 こ の工程では、 1 カゝ ら n の多種類のプロ ーブ 等も 同様に存在 している と 理解 されるべき であ る。 ま た、 こ の と き 、 S D配列には ピオチン等の結合分子を結合 してお く こ と が好ま しい。 の と き の P C R の詳細な条件は、 設計 した フ ラ ッ グ F L に依存 して よ い。 得 られた二本鎖を前記結合分 子 と 対 と なる物質を用いて回収する (図 6 h ) 。 これを変性 し、 洗浄 して一本鎖にする (図 6 i ) 。 続いて、 夫々 の F L
配列の D 1 1 — D 1 n に相補的であ り 、 且つ標識物質を付与 されたプラ イ マ ーをハイ プ リ ダイ ズ して伸長する (図 6 j ) : 得 られた各 D l l ' - D i n ' を、 D O l — D i n 力 S固相 されたチ ッ プま たはキ ヤ ビラ リ 一ア レイ を用レ、る こ と に よ つ て検出する (図 6 k ) 。 ま た、 当該反応は、 以下の よ う な方 法に よ っ て も 実施する こ と が可能である。 即ち、 プロ ーブ A と プロ ーブ B を連結 し、 プロ ーブ B に付与 した結合物質ま た は T g n 配列を利用 して B Z F 分離を行っ た後で、 P C R を 行わずに、 得 られた F L を直接に検出する こ と も可能である 。 こ の場合に も 、 S n ' に連結する配歹 1Jは、 2 ユニ ッ ト でも よ い。 ま た、 その場合には、 D O n 配列および D 1 n 配列を D N Aチ ッ プま たはキヤ ビラ リ 一ア レイ に固相化 して用いて も よい。 こ の場合の検出は、 予め当該 F L 配列毎に異な る上 述の標識物質を付与 しておいて も 、 または、 D N Aチ ッ プ等 の所望する領域に配列毎に結合 した後に標識物質を付与 して ち ょ い: 例 6 . 実験
本発明の方法が、 実際に有用である こ と を示すために以下 の よ う な実験を行なっ た。 使用 した配列 と 、 その結合様式を 図 8 に示す。
( 1 ) 標的配列 と 変異配歹 IJ
使用する標的配列は、 r _ 3 2 — f 1 を用いた (図 9 ) 。 また、 検出方法の特異性を確認する ために該標的配列 と その 配列が異なる変異配列を使用 した。 変異配列は、 f 1 - n e
g — r — 3 2 A B である (図 9 ) 。
( 2 ) プロ ーブと検出用配列
プロ ーブ Aは、 b — 1 6 A を用いた (図 9 ) 。 プロ 一ブ A に含まれる b は、 ピオチンを示す。 ま た、 プロ 一ブ B は、 P — 1 6 B — 4 8 を用いた (図 9 ) 。 プロ ーブ B は、 フ ラ ッ グ F L を含み、 P は リ ン酸基を示す。 プロ ーブ B の F L配列に 相補的な配列が、 検出用配列であ り 、 fl-r-48 を使用 した ( 図 9 ) 。
( 3 ) 実験方法
上記のプロ ーブ等を用いて、 標的配列の検出 を試みた。 先 ず、 夫々 、 p H 8 . 0 の T E緩衝液中で 5 0 0 p m o l のプ ロ ーブ B溶液 と 、 同量の検出用配列の溶液を混合 し、 9 5 °C で 1 分間イ ンキュベーシ ョ ン し、 その後、 7 分間かけて 2 5 °C と し二本鎖 と した。
次に、 得 られた二本鎖化 したプロ ーブ B と 、 標的配列 と 、 プロ ーブ A と を混合 し、 1 0 0 μ 1 の ラ イ ゲー シ ヨ ン用緩衝 液中で 2 0 Uの T a g D N A リ ガ一ゼ ( N e w E n g 1 a n d B i o 1 a b 社製) を用 いて ライ ゲー シ ヨ ン反応を行 なっ た。 こ の反応は、 7 0 °Cカゝ ら 5 5 °Cま で 5 分間かけて温 度を下げる こ と でプロ ーブ Aお よびプロ ーブ B を標的配列に ァニールさせたのち、 T a g D N A リ ガ一ゼを添力!] して、 5 5 °Cで 1 5 分間 ラ イ ゲーシ ヨ ン反応を行い、 次いで、 室温に 温度を下げる こ と と に よ り 進行 した。 ス ト レプ ト ァ ビジ ンを固相 した磁気 ビーズに上記の ライ ゲーシ ヨ ン後の試料を カロ え、 3 0 °Cでプ レ コ — ノレ ド ウ ォ ッ シュ ( pre-cold wash)
を行ない、 未反応の標的配列を除去 し、 同一温度でコ ール ド ゥ ォ ッ シュ を行ない標的配列を除去 した。 上清を除去 した後 、 T E緩衝液を 1 0 0 μ 1 添力 D し、 7 0 °Cで洗浄、 gPち、 ホ ッ ト ウ ォ ッ シ ュ ( h o t was h ) を行ない、 検出用配列を回収 し た。
( 4 ) . 実験結果
以下に検出結果を示す。 図 1 0 は、 各々 の洗浄過程におい て上清か ら得 られた配列をキヤ ビラ リ 電気泳動に よ り 検出 し た も のであ る。 プ レ ゥ ォ ッ シュ で回収 された上清には、 ラ イ ゲ一シ ョ ン反応に付さ れなかっ た標的配列が含まれる こ と 力; 示 された。 ま た、 コール ド ゥ ォ ッ シュ によ り 回収 された上清 には、 ラ イ ゲーシ ョ ンに付 された塩基配列の標的配列が含ま れる こ と が示 さ れた。 ま た、 ホ ッ ト ゥ ォ ッ シュ に よ り 回収 さ れた上清中には、 検出用配列が含まれ、 その塩基長に相応す る長 さ の D N Aが検出 された 二 と が示 された。
図 1 1 は、 標的配列の濃度 と 回収 された検出用配列の濃度 と の関係を示す結果である。 これは、 上述の方法において添 カロ した標的配列の濃度を、 0 、 5 、 1 0 、 2 0 、 2 5 お よび 5 0 n M と 変えた場合に検出 さ れた検出用配列の回収率をパ —セ ンテージで示 したグラ フである。 グラ フカゝ ら 明 ら かであ る よ う に、 標的配列の濃度が増加する に従い、 検出 された検 出用配列の回収率も増加 した。 こ の こ と は、 本検出方法が有 用である こ と の証明の 1 つである。
図 1 2 は、 本方法の特異性について検討 した結果を示す。 即ち、 標的配列の一部の塩基配列が異な る変異配列を検出系
に存在 した場合の、 検出用配列の回収率について示す結果で ある。 上述の方法において、 標的配列を添加する の と 同時に 、 変異配列を 0 . 0 5 、 0 . 5 お よび 1 μ Mで添カ卩 した。 そ の結果、 図 1 2 に示す通 り 、 変異配列の存在は、 検出用配列 の回収率に影響を与えなかっ た。 従っ て、 本検出方法は、 標 的配列を特異的に検出でき る こ と が証明 された。 例 7 . 実験
本発明の方法、 特に、 エン コ ー ド反応 と デコ ー ド反応の特 異性と 定量性について示すために以下の よ う な実験を行なつ た。 使用 した配列を図 1 3 Αに示す。 また、 各プロ ーブ と 、 これを構成する要素 と の対応を図 1 3 B に示す。
7 - 1 . エ ンコー ド反応の特異性
( 1 ) 実験方法
まず、 I G T P の プ ロ ー ブ B I A T P ( S ' , G x p +SD + D0IGT P + Dl IGTP + ED, 0.3nM) 、 お よび L R G — ァ の プ ロ 一ブ し R G - 4 7 ( S ' L R G — 4 7 +SD + D0LRG-47 + D1 IGTP + ED、 0.3nM) 、 I G T P の プ ロ ー ブ A I G T P (0.3nM)、 標的遺伝子 と し て の I G T P 遺伝子を 0 . 3 n M力、 ら 0 . 0 0 3 n Mを、 T a q D N A リ ガーゼ(TaqDNAligase、 New England Biolab 社)に添 付のラ イ ゲー シ ョ ン緩衝液中で混合 した。 得 られた混合液の 温度を、 7 0 °Cか ら 1 分間当 た り 3 °Cの割合で下げ、 5 5 °C になっ た と こ ろで 2 0 ュニ ッ ト の リ ガーゼを添加 し、 総量を 3 0 L と した。 その後、 ラ イ ゲーシ ヨ ン反応を 1 5 分間行 つ た。 その後、 1 0 πl g / m L のダィ ナ ビ一ズM— 2 8 0 ス
ト レ プ ト ァ ビ ジ ン(Dynabeads M-280 streptavidin)を 1 μ L で 添加 して、 1 5 分間混合 した。 上清を除去 した後、 T r i s E D T A緩衝液 (以下、 T E を略す) を 2 0 μ L添加 した。 これを 6 0 °Cで洗浄 し、 未反応のプロ ーブ A、 プロ ーブ B お よ び標的核酸配列を洗浄 した (即ち、 コ 一ル ド ゥ ォ ッ シュ ま たは室温洗浄である) こ の洗浄を 2 回行っ た。 上清を除去 し た後、 2 0 L の T E を添力 Q した。 9 5 °Cで、 エ ンコー ド さ れた フ ラ ッ グ配列を回収 した。 L R G — 4 7 に対するェン コ — ド反応について も 、 同様に、 標的遺伝子であ る L R G — 4 7 遺伝子に対応する プロ ーブ A と プロ ーブ B と を、 ラ イ ゲー シ ョ ンする こ と に よ っ て評価を行っ た。 ェン コ 一 ド反応を行 う こ と に よ り 連結されたプロ ーブに対 して、 S D配列 と E D 配列を各々 プラ イ マー と して使用 して、 P C R を行った。 本 鎖用のキヤ ビラ リ 一電気泳動に よ り 計測 した。
( 2 ) . 実験結果
図 1 5 は、 上述で行っ た試験の概要を示すス キーム図であ る。 以下に検出結果を示す。 図 1 4 Aおよ び B は、 キヤ ビラ リ ー電気泳動に供 した場合に得 られる結果を した ものである 。 図 1 4 Aお よび B に示す通 り 、 本発明のエンコー ド反応に よ り 、 各々 の F L配列に対 して特異的な P C R増幅が達成 さ れ、 それに よ つて特異的な P C R産物が得 られた。
7 — 2 . エ ン コ ー ド反応後の P C R増幅の定量性
( 1 ) 実験方法
ェ ン コ一 ド反応後に行 う P C R の一様性 と 定量性を以下の 方法を用いて検証 した。 本試験は、 上述の通 り の I G T P を
検出する ための フ ラ ッ グ配列 と L R G — 4 7 を検出する ため のフ ラ ッ グ配列にっレ、て行っ た。 I G T P お よ び L R G — 4 7 を検出する ためのフ ラ ッ グ配列は、 各々 S D配歹 IJ と E D配 列を含む。 従っ て、 I G T P 用 のフ ラ ッ グ配歹 IJ と 、 L R G — 4 7 用のフ ラ ッ グ配列にっレ、て、 S D配列および E D配列を 用いて、 各々 P C R を行っ た。 こ の P C R に添加 した両配列 鎖は、 夫々 1 O O p Mカゝ ら 1 0 f M と した。 ま た、 こ の P C R は、 9 4 °Cで 3 0 秒、 6 5 °Cで 6 0 秒、 7 2 °Cで 3 0 秒を 2 5 回繰 り 返 した。
( 2 ) 実験結果
図 1 7 は、 上述で行っ た試験の概要を示すス キー ム図であ る。 以下に検出結果を示す。 図 1 5 は、 キャ ピラ リ ー電気泳 動に供 した場合に得られる結果を した も のであ る。 図 1 6 に 示す通 り 、 本発明のェンコ一 ド反応後の P C R増幅量は標的 配列の濃度依存 している こ と が示 された。
7 — 3 . デコー ド反応の特異性と 定量性
( 1 ) 実験方法
使用 した配列は、 上述 した通 り であ る。 即ち、 ピオチン化 した S D + D 0 τ ρ + D 1 I G Τ + E D配歹 IJ (以下、 b-cod e l と も称す) と 、 ピオチンィ匕 した S D + D O L R C 4 7 + D 1 L R G - 4 7 + E D配歹 U (以下、 b-code2 と も称す) について 、 デコー ド反応を行っ た。 夫々 1 0 Ο μ Μの濃度の b — c o d e l および b — c o d e 2 の 0 . 2 し と 、 1 Mの N a C 1 を含有する T E緩衝液 4 9 . と 、 4 0 i L の 1 0 m g Z m L のダイ ナ ビーズ M— 2 8 0 ス ト レプ ト ア ビジン と を
混合 し、 1 5 分間撹拌 した。 これを室温で洗浄 して、 その上 清を除去 した。 得られた当該 ビーズに、 更に 5 0 μ L の T E 緩衝液を添加 して室温で洗浄 した。 上清を除去 し、 得 られた ビーズに更に 5 0 L の Τ Ε緩衝液を添力 [] して、 8 0 °Cで洗 浄 し、 その上清を除去 した。 その後、 ライ ゲー シ ヨ ン緩衝液 を用いて、 室温で洗浄 し、 その上清を除去 した。 続いて、 D 1 に対する リ ノくース鎖を、 最終濃度で 4 0 0 n m、 並びに D 0 1 G T Pお よ び D O L R G 4 7 に対する リ バース鎖を、 最終濃 度で各々 4 0 0 n mになる よ う に当該得 られた ビーズに添加 した。 これを 9 5 °Cに加温 して一本鎖化を行い、 次に、 1 分 間当 た り 7 °C の割合で温度を下げた。 続いて、 6 0 °Cで 2 0 ュニ ッ ト の T a q リ ガーゼを添力 [] して ライ ゲーシ ヨ ン反応を 1 5 分間行っ た。 その上清を除去 した後、 5 0 μ L の T E緩 衝液を添加 して、 室温で洗浄 した。 その上清を除去 し、 再度 、 5 0 L の Τ Ε緩衝液を添力□ した。 こ の温度を 8 0 °C にカロ 温 し、 その上清を回収する こ と に よ っ て、 前記ラ イ ゲーシ ョ ン したプロ ーブを回収 した。 得 られた上清に、 上記のス ト レ プ ト ア ビジン ビーズの 4 0 μ L を添力□ し、 更に、 1 Μの N a C 1 を含有する T E緩衝液 1 2 . 5 L を添力 D して、 1 5 分 間撹拌 した。 その後、 8 0 °Cで上清を回収 し、 2 本のチュー ブに前記上清を各 2 0 μ Lずつ分注 した。 前記 2 本のチュー ブの各々 に対 して、 ピオチン化 した D 0 , G τ Ρ に対応する配 列を持っ たプ ロ ーブ(即 ち 、 b - 1 )と 、 ピオチン化 した D 0 L R G - 4 7 に対応する配列を持っ たプロ 一ブ(即 ち 、 b - 2 )を 、 各々 、 l O O ^u m o l ずつ各チューブに添力 D し、 更に、 2
Mの N a C 1 を含有する 1 6 n L の T E緩衝液を添カ卩 した。 これを 9 5 °Cに加温 した。 その後、 1 分間当 た り 1 0 での割 合で 2 5 °Cま で温度を下げる こ と に よ り ハイ プ リ ダイ ゼーシ ヨ ンを行っ た。 こ の溶液に、 4 の上記のス ト レプ ト ァ ビジン ビーズを添加 し、 1 5 分間撹拌 した。 その後、 上清を 除去 し、 4 0 /i L の T E緩衝液を添加 して、 室温で洗浄 した 。 その上清を除去 し、 更な る 4 0 μ L の T E緩衝液を添加 し て、 4 0 °Cで洗浄 した。 その上清を除去 し、 更な る 4 0 L の Τ Ε緩衝液を添加 して 7 0 °Cま で加温 した。 その上清を回 収 し、 各 々 、 一本鎖用のキ ヤ ピラ リ ー電気泳動を行っ た。
( 2 ) 実験結果
図 1 9 は、 上述で行っ た試験の概要を示すス キー ム図であ る。 以下に検出結果を示す。 図 1 8 Aおよび B は、 キヤ ビラ リ 一電気泳動に供 した場合に得 られる結果を した も のであ る 。 本発明のデ コ ー ドは、 当該エ ン コー ド反応に よ り 増幅 した P C R産物に対 して、 各々 の遺伝子に対応 した D l 、 ラベル した D 2 配列を用いて連結反応を行っ た。 ピオチン標識 した
D 1 , G T pお よび D 1 L R G— 4 7 を用レ、て、 連結反応が起 こ つ たプロ ーブを検出 した結果、 図 1 7 に示す通 り 、 各々 の遺伝 子に対応 した産物を特異的に検出する こ と が可能であ る こ と が示 された。