WO2001022089A1 - Sonde d'hybridation a reconnaissance automatique - Google Patents

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WO2001022089A1
WO2001022089A1 PCT/JP2000/006524 JP0006524W WO0122089A1 WO 2001022089 A1 WO2001022089 A1 WO 2001022089A1 JP 0006524 W JP0006524 W JP 0006524W WO 0122089 A1 WO0122089 A1 WO 0122089A1
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energy
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labeling substance
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PCT/JP2000/006524
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Akio Yamane
Original Assignee
Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the present invention relates to a self-recognizing probe used for nucleic acid detection, and more particularly, to a probe in which energy release (for example, fluorescence) from a labeling substance is controlled by an energy absorbing substance.
  • energy release for example, fluorescence
  • a method using a probe as a method for detecting a gene.
  • a sample containing a nucleic acid to be detected is immobilized on a solid phase, and a nucleic acid to which a label complementary to the sample is introduced (hereinafter, a nucleic acid complementary to the nucleic acid to be detected is referred to as a probe) is hybridized.
  • a probe a nucleic acid complementary to the nucleic acid to be detected.
  • the presence or absence of the target nucleic acid in the sample is determined by detecting the labeled substance in the nucleic acid trapped in the solid phase after forming a double strand by washing the solid phase.
  • the probe has an acridinium ester introduced therein, and when the probe forms a complementary chain, it is more resistant to hydrolysis by alcohol than when the probe does not form a complementary chain.
  • hydrolysis is performed with alkali after hybridization, and the remaining acridinium ester that is not decomposed is detected by chemiluminescence.
  • This method is excellent in that it does not require solid-liquid separation, and is widely used. However, it still requires treatment such as hydrolysis after hybridization, degrades acridinium ester at high temperature, and has only one-time chemiluminescence, which makes further application difficult.
  • a typical method is to use two probes in which a label has been introduced near the 5 'end of one probe and another label has been introduced in the vicinity of the 3' end of the other probe.
  • two types of labels can be accessed by hybridization only when a nucleic acid complementary to both probes is present, and the energy transfer that occurs between the two types of labels at that time is used.
  • the fluorescence is quenched when the gene of interest is present, or the fluorescence of one label is absorbed by the other fluorescent substance to emit fluorescence. There is.
  • TaqMan TM method Lik, KJ et. Al. PCR Methods Appl. 4, 357-362 (1995)
  • Two fluorescent labels are introduced, and only when this oligonucleotide forms a complementary strand with a complementary sequence, it is degraded by the exonuclease activity of DNA polymerase in the 5 'to 3' direction.
  • Still another method is the Molecular Beacon method (ramer F. R. et. Al. Nature Biotec hnology 49-53 (1988)).
  • a fluorescent receptor and a donor are introduced into both ends of an oligonucleotide, and an extra sequence other than a sequence complementary to the target is added to both ends of the oligonucleotide.
  • a hairpin is formed with extra sequences at both ends. That is, the two types of labels are located at a sufficiently close position due to the formation of the hair bin, and can cause energy transfer.
  • this method utilizes the fact that the fluorescence of one fluorescent substance is absorbed by the other fluorescent substance when the target is not present, and such quenching does not occur when the target is present. .
  • this oligonucleotide forms a double strand with another nucleic acid
  • acridine intensifies in the double-stranded nucleic acid and transfers energy to fluorescein even when irradiated with light at 34 nm. It cannot be generated efficiently and therefore cannot detect the fluorescence from fluorescein.
  • the fluorescent substance and the in-one-one-one-one-in-one were simultaneously introduced into the ends of the oligonucleotide.
  • the second fluorescent substance is often excited to some extent by the light excited by the fluorescent substance, and thus the background is often high. In addition, it emits fluorescence when no complementary strand is present, and decreases in fluorescence when a complementary strand is present, so that it is not suitable for general diagnostic methods.
  • An object of the present invention is to provide a probe for detecting a nucleic acid and a method for detecting a nucleic acid, which can perform gene detection in a short time and with high sensitivity by a simple operation that does not require a solid-liquid separation operation.
  • Another object of the present invention is to provide a solid phase carrier for nucleic acid detection capable of detecting a target nucleic acid without labeling a sample.
  • the probe according to the present invention is a probe consisting of a nucleic acid carrying a labeling substance that releases energy and an energy absorbing substance that can absorb the energy released from the labeling substance.
  • the probe is characterized in that the energy transfer from the labeling substance to the energy absorbing substance is prevented by the hybridization.
  • the method for detecting a nucleic acid according to the present invention comprises contacting the probe with a nucleic acid sample, and then measuring the energy released from the labeling substance.
  • the solid phase carrier for nucleic acid detection according to the present invention has the probe immobilized thereon.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a probe according to the present invention.
  • Single Stranded indicates that the probe is not hybridized with the target nucleic acid.
  • Double Stranded indicates that the probe has hybridized with the target nucleic acid.
  • F indicates a labeling substance such as fluorescein
  • P indicates a light absorbing substance such as pyrene.
  • FIG. 2 is a diagram showing a specific structure of a modified portion of an oligonucleotide (EFN1-1F, EFN2-F) in which an amino group and fluorescein are immobilized.
  • EFN 3— F and E FN4-F have the same structure as E FN 1-F and EFN 2-F except for the base (Fig. 3 shows oligonucleotides with immobilized pyrene and fluorescein (EFN1-FP and EFN2-FP) It is a figure which showed the specific structure of the modification part of EFN3-FP, EFN4-FP is the same structure as EFN1-FP and EFN2-FP except a base.
  • the “labeling substance” may be any substance that becomes an excited state by receiving photochemically or chemically energy and emits energy when returning from the excited state to the original state.
  • photochemically excited substances include fluorescent substances such as fluorescein and tetramethylrhodamine.
  • photochemically excited substances include delayed fluorescent substances such as a lanthanide complex (eg, a palladium complex) (Hemmila, I. et. Al. Drug Discovery Today 2, 373-381 ( 1997)).
  • Chemically excited substances include chemiluminescent substances such as luminol.
  • energy includes light energy, heat energy, electromagnetic energy, and chemical energy.
  • the term "energy absorbing substance” refers to a substance whose absorption of energy is prevented by hybridization between a probe and a complementary nucleic acid, and is preferably a light energy absorbing substance.
  • the light energy absorbing substance include a substance that is capable of absorbing a double-stranded nucleic acid (intercalation) and a substance that specifically binds to a double-stranded nucleic acid.
  • Light absorbing intercalates include acridine, anthracene, pyrene and their derivatives.
  • Examples of the light-absorbing substance that selectively binds to the double-stranded nucleic acid include ethidium bromide and Hoechst33258.
  • These energy-absorbing substances only need to have the ability to absorb the energy released from the labeling substance, and are capable of releasing the absorbed energy as light, for example, fluorescence, or as heat. May be.
  • the combination of the labeling substance and the energy-absorbing substance used in the present invention is a labeling substance.
  • a combination of fluorescein and birene, fluorescein and acridine, fluorescein and coumarin, tetramethyl mono-damine and pyrene can be mentioned.
  • the labeling substance and the energy-absorbing substance are modified for nucleic acid synthesis, they can be directly introduced into a specific site of the oligonucleotide using an automatic synthesizer.
  • those functional groups are introduced during the oligonucleotide synthesis using a nucleic acid synthesis reagent that introduces an amino group, a thiol group, etc., and then a functional group that reacts with the functional group is introduced.
  • Labeling can be performed using the introduced label. Labels can be introduced using these reagents at the 5 'end or 3' end of the oligonucleotide, at the phosphate moiety, or at the base or sugar moiety at any position. . It can also be introduced between the diester phosphate linkages (Goodchild, J. Bioconhugate Chemistry 1, 165-187 (1990)).
  • the method of adjusting the positional relationship between the two types of labels can be achieved by changing the introduced portion of the oligonucleotide, or by changing the structure or length of the spacer connecting the nucleic acid and the label. Can also be adjusted.
  • the positional relationship of the label must be such that energy transfer from the label to the energy-absorbing substance can take place. Or, it must not be in a position that prevents binding.
  • quenching of fluorescence by a nucleic acid base may be observed depending on the base sequence of the oligonucleotide. Needs to take that into account. However, this quenching phenomenon may be eliminated by forming a double strand.
  • the probe according to the present invention can be composed of a nucleic acid having 4 bases or more, preferably 8 bases or more.
  • nucleic acid includes not only DNA, RNA but also modified nucleic acids or those that form double strands with nucleic acids such as PNA (peptide nucleic acids).
  • PNA peptide nucleic acids
  • the light-absorbing substance introduced into the probe for example, a light-absorbing substance that specifically binds to a light-absorbing intercalate or double-stranded nucleic acid Interacts with the double-stranded nucleic acid, causing no quenching of the labeling substance introduced into the probe (see Figure 1).
  • the probe does not hybridize to the sample or incompletely hybridizes to the sample, the light that specifically binds to the light-absorbing inducer or double-stranded nucleic acid introduced into the probe is used.
  • the absorbing substance does not interact with the double-stranded nucleic acid, and quenching of the labeling substance introduced into the probe occurs (see FIG. 1).
  • the presence of light emitted from the labeling substance indicates that the probe and the target nucleic acid have hybridized, and the absence of light emitted from the labeling substance indicates that the probe and the target nucleic acid have hybridized. Indicates that the target nucleic acid has not been hybridized.
  • the probes according to the invention can also detect single salt tD mismatches. That is, even when the probe does not pair with the sample at one base, the structure of the double-stranded nucleic acid changes, and the energy-absorbing substance introduced into the probe, for example, a light-absorbing intercalator or two The light-absorbing substance that specifically binds to the strand nucleic acid does not interact with the double-stranded nucleic acid, and the quenching of the labeling substance introduced into the probe occurs.
  • the energy release from the labeling substance is not prevented by the energy absorbing substance. Therefore, the complementary strand nucleic acid in the sample can be detected by bringing the probe into contact with the sample and measuring the energy release such as fluorescence from the labeling substance.
  • the probe according to the present invention and the nucleic acid prepared from the sample are mixed in a solution containing an appropriate buffer solution, etc., and a hybridization operation is performed. By comparing with the above, it can be determined whether or not a sequence complementary to the probe exists in the sample.
  • the method and conditions for hybridization may be in accordance with a general method (Keller, G.H. et al. DNA Probes Stockton Press (1993)). Detection after hybridization can be detected using a detection device corresponding to the label. For example, if the label is fluorescent, a fluorescence spectrophotometer can be used. However, if the number of specimens is large, it can be easily performed using a fluorescent microplate reader or the like. Further, as described later, in a hybridization with a probe fixed to a carrier such as a gene chip, the fluorescence on the carrier can be measured using a fluorescence scanner or the like.
  • the sample nucleic acid may be either DNA or RNA, and may be extracted from any organism or may be in a crudely purified state.
  • the gene may be amplified by a gene amplification method, for example, the PCR method, and then hybridized with the probe of the present invention.
  • the temperature can be changed, many reaction vessels are provided, and the fluorescence
  • a device that can measure pH ABSI PRISM TM 7700 Perkin-elmer, etc., it is also possible to perform hybridization and measurement continuously in one container.
  • the probe of the present invention can be used not only for homogeneous hybridization in a solution but also in a state of being bound to a solid phase carrier.
  • a method for preparing the probe of the present invention bound to a solid phase carrier a method of synthesizing an oligonucleotide on a solid phase used for detection and a method described in (Fodor, SPA et al. Science 251, 767-773 (1991)), There is a method of synthesizing an oligonucleotide into which an appropriate functional group is introduced, and then binding the oligonucleotide to a solid phase using the introduced functional group (Rasmussen, SR Anal. Biochem. 198, 138-142 (1991)).
  • a microplate As the solid phase carrier, a microplate (Rasmussen, SR Anal. Biochem. 198, 138-142 (1991)) ⁇ slide glass (Fodor, SPA et al. Science 251, 767-773 (1991)) or There is an end of an optical fiber (Ferguson, JA Nature Biotechnolog 14, 1681-1684 (1996)).
  • the solid phase carrier according to the present invention may be a gene chip.
  • gene chip technology There are two main uses of gene chip technology, one for examining the expression level of RNA and the other for examining gene mutations (Lander, ES Nature Genetics supplement, 21, 3-4 (1999)).
  • the probe of the present invention can be a powerful method in any case, but can be particularly effective in the former case.
  • oligonucleotides, cDNA, etc. are immobilized on the chip (Duggan, DJ et. A. Nature Genetics supplement, 21, 10-14 (1999), Lipshutz, RJ Nature Genetics supp. lement, 21, 20-24 (1999)), it is necessary to label nucleic acids in a sample in order to detect hybridization.
  • RNA is unstable, and the risk of degradation in various labeling reactions is extremely high.
  • the probe of the present invention is immobilized on a chip, hybridization can be performed without performing labeling operation on mRNA extracted from a living body or the like. Can be detected. If such a method is used, gene expression analysis will be greatly simplified, and it will be possible to easily process a very large number of samples.
  • Oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer (DNA / NA synthesizer Model 392, PerkinElmer).
  • the introduction of fluorescein was performed using fluorescein foam amidite (Glenlisach, Cat. No .: 10-1963).
  • Pyrene was introduced by introducing an amino group using Unilink TM Amino Modifier (Clontech, Cat. No .: 5190-1), and then keeping it with 1-Dvrenebutanoic acid, succinimidyl ester, and selefuf. H. (Cat. No .: P-130).
  • the unlabeled oligonucleotide was purchased from Amersham Pharmacia Biotech.
  • Example 1 Synthesis of Oligonucleotide Introducing Fluorescein and Bilen
  • the following oligonucleotides having an amino group and fluorescein introduced were synthesized using an automatic synthesizer.
  • F indicates fluorescein.
  • the specific structure of the modified moiety is as shown in FIG.
  • the fluorescence spectrum of fluorescein was confirmed (excitation wavelength: 494 nm, maximum fluorescence wavelength: 517 nm).
  • E FN 1 -F 5 'GCAACAGGC (NH 2 ) (F) CGACAACG (SEQ ID NO: 1)
  • E FN 2 -F 5 'GCAACAGG (NH 2 ) C (F) CGACAACG (SEQ ID NO: 1)
  • E FN 3 -F 5 'ACGC ACAAA (NH 2 ) (F) AC CAAGCA (SEQ ID NO: 2)
  • EFN4-F 5 'ACGC AC AA (NH 2)
  • Refining oligonucleotides (8 0 ig) in 1M NaHCOs (4 ⁇ L) pyrene active ester DM F solution (2 0 g / L, 20 // L), while handling H 2 0 (16 ⁇ L)
  • the reaction was performed at 25 ° C for 14 hours. After the reaction, remove excess reagent by gel filtration (Sephdex G-50, 5 OmM TEAB buffer).
  • oligonucleotides are shown below.
  • P represents pyrene
  • F represents fluorescein
  • the structure of the modified moiety is as shown in FIG.
  • the introduction of pyrene was confirmed by measuring the fluorescence spectrum (excitation wavelength: 341 nm, maximum fluorescence wavelength: 383 nm, 400 nm)
  • E FN 2 -FP 5, GCAACAGG (P) C (F) CGACAACG (SEQ ID NO: 1)
  • E FN 3 -FP 5 'ACGCACAAA (P) (F) AC CAAGCA (SEQ ID NO: 2)
  • E FN4 -FP 5, ACGCACAA (P) A (F) AC C AAG CA (SEQ ID NO: 2)
  • Example 2 Increase in fluorescence intensity by hybridization of fluorescein-pyrene-labeled oligonucleotides
  • E C 1 5 'CGTTGTCGGCCTGTTGC (SEQ ID NO: 3)
  • EC2 5 'TGCTTGGTTTTGTGCGT (SEQ ID NO: 4) Labeled oligonucleotide and unlabeled oligonucleotide were buffered as shown below (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM Na The mixture was mixed with C 1, 50 ng / jcarrier DNA) to prepare a double-stranded solution and a control solution. The mixed solution was annealed from 94 ° C to 34 ° C for 5 hours.
  • the fluorescence intensity may be increased by forming a double strand (No. 4 and No. 5). This is because the fluorescence of the fluorescein introduced into the oligonucleotide was released by the formation of a double-stranded structure that had been quenched by the interaction with the oligonucleotide. Such phenomena often depend on the sequence and are not seen in Nos. 7 to 12. On the other hand, in the case of introducing biylene, the fluorescence intensity increased only when the double strand was formed (Nos. 13 to 24, No. 4, No. 17, No. 21, No. 21). 24) This indicates that this probe increases the fluorescence intensity due to hybridization.

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Description

明 細 書 ハイブリダイゼーシヨン自己認識型プロ一ブ 発明の背景
発明の分野
本発明は核酸検出に用いられる自己認識型プローブに関し、 更に詳細には、 標 識物質からのエネルギー放出 （例えば蛍光） がエネルギー吸収性物質により制御 されているプローブに関する。
背景技術
近年の遺伝子医学の進歩は著しく、 ヒト遺伝子の全塩基配列の解読も現実のも のとなつてきた。 また、 遺伝子の多型と疾患に関するデータも日々刻々と蓄積さ れており、 ヒト遺伝子全領域の多型解析も進展しつつある。 一方、 ヒトの病気を 弓 Iき起こすウィルスや細菌の遺伝子検査は実用化され、 医療に貢献している。 こ のような状況下、 遺伝子検査技術に関する期待は大きく、 更なる簡便化、 低コス ト化が求められている。
従来から遺伝子を検出する方法としてプローブを用いた方法がある。 一般的に は、 検出しょうとする核酸を含む試料を固相に固定し、 これに相補的な標識物を 導入した核酸 （以下検出しょうとする核酸に相補的な核酸をプローブと呼ぶ） を ハイブリダィズさせて二本鎖を形成させ、 固相を洗浄した後、 固相にトラップさ れた核酸中の標識物を検出することにより試料中の目的核酸の有無を調べる方法 である。 また、 逆に試料核酸を標識し、 固相に固定したプローブとの間で相補鎖 を形成させて検出する方法もある。 これらの方法は確立され信頼できる方法では あるが、 過剰の試料や、 過剰のプローブ、 あるいは検出のための過剰の試薬等を 必要とし、 また洗浄操作が煩雑で遺伝子検査普及の一つの妨げともなつている。 これらの問題を克服するために種々の方法が検討されているが、 いずれも固液 の分離を必要としない均一系ハイブリダイゼ一ション （homogeneous hybridizatio n) と呼ばれるものである。 具体的な方法の一つとしてァクリジニゥムエステル を用いるハイブリダイゼ一ションプロテクション法がある （Arnold et.al. Clin. Ch em. 35, 1588-1594 ( 1988 ) ) 。 この方法はプローブにァクリジニゥムエステルが 導入されており、 プロ一ブが相補鎖を形成した時の方が相補鎖を形成しない場合 よりアル力リによる加水分解に抵抗性を示すことと利用した方法で、 ハイプリダ ィゼ一シヨンのあとアルカリによる加水分解を行い分解されないで残ったァクリ ジニゥムエステルを化学発光で検出する方法である。 この方法は固液の分離を必 要としない点で優れており、 広く実用化されている。 しかしながら、 依然ハイブ リダイゼーシヨン後の加水分解などの処理が必要であることや、 ァクリジニゥム エステルが高温で分解すること、 また化学発光は一度限りであることから更なる 応用を困難にしている。 一方、 均一系ハイプリダイゼーシヨンの典型的な方法と してエネルギー転移を利用する方法が開発されてきた （Kricka L. J. Nonisotopic DNA Probe Techniques p311-352, Academic Press, Inc. ( 1992) ) 。 代表的な方法と しては一方のプローブの 5 ' 末端付近に標識が導入されており、 もう一方のプロ ーブの 3， 末端付近には別の標識が導入されている二つのプローブを利用し、 両 方のプローブに相補的な核酸が存在する時のみハイブリダィゼーシヨンによって 二種の標識が接近でき、 その時の二種の標識間で起こるエネルギートランスファ 一を利用する方法である。 これらの方法はいずれも目的とする遺伝子が存在する 時に蛍光が消光するか、 あるいは一方の標識の蛍光を他方の蛍光物質が吸収して 蛍光を発するかであり、 バックグランドの影響など種々の問題がある。
これらの問題を解決すべく、 エネルギートランスファーを利用した新たな方法 が開発されている。 その一つの方法は TaqMan™法と呼ばれるもので （Livak, K. J. et. al. PCR Methods Appl. 4， 357-362 ( 1995) ) 、 オリゴヌクレォチドにドナーと なる蛍光標識とァクセプ夕一となる蛍光標識の二つを導入しておき、 このオリゴ ヌクレオチドが相補的な配列と相補鎖を形成している場合のみ D N A ポリメラー ゼの 5， から 3 ' 方向へのェキソヌクレアーゼ活性により分解されることを利用 する方法である。 すなわち、 二種の標識が一つのオリゴヌクレオチド上に存在す る時はエネルギートランスファーを起こすのに十分近い位置にあり、 一方の蛍光 物質の蛍光は他方の蛍光物質に吸収され、 蛍光が観察されない状態にある。 しか し、 D N Aポリメラ一ゼの 5 ' から 3 ' 方向へのェキソヌクレアーゼにより分解 されると二種の標識は別々の分子として存在することになり、 エネルギートラン スファーを起こすことができなくなり、 蛍光が観察される状態となる。 この方法 はポリメラーゼチェーン反応と組合わせた方法として普及しているが、 一塩基の 置換を検出するのは容易ではない。
さらに別な方法として Molecular Beacon法 ( ramer F. R. et. al. Nature Biotec hnology 49-53 ( 1988) ) がある。 この方法は、 オリゴヌクレオチドの両末端に蛍 光のァクセプ夕一とドナーを導入しておき、 さらにその両末端には夕ーゲッ 卜と 相補的な配列以外の余分な配列が付加されており、 ターゲッ 卜が存在しない時は 両末端の余分な配列でヘアピンを形成している。 すなわち、 ヘアビンの形成によ り二種の標識は十分近レヽ位置にありエネルギートランスファーを起こすことがで きる。 一方、 このオリゴヌクレオチドに相補的なターゲットが存在する場合には 夕ーゲッ トと相補鎖を形成しヘアピン構造は破壊されエネルギートランスファ一 は起こらない。 つまり、 ターゲットが存在しない場合には一方の蛍光物質の蛍光 が他方の蛍光物質で吸収され、 夕ーゲッ卜が存在する場合はそのような消光は起 こらない状態となることを利用した方法である。
さらにエネルギートランスファーを利用する方法ではないが、 二本鎖核酸に結 合すると蛍光を発する物質をォリゴヌクレオチドに導入する方法も開発されてい るが (Ishiguro, T. et. al. Nucleic Acids Res. 24, 4992-4997 ( 1996) ) 、 バックグラ ンドが高くなるなどの問題が考えられる。
また、 沢井らは (J. Chem. So ， Chem. Commun., 1994， 1337-1378) ォリゴヌク レオチドの 5， 末端にフルォレセィンとインター力レーターであるァクリジンの 両物質をスぺーサ一で結合した物質を導入し、 オリゴヌクレオチドのニ本鎖形成 反応の挙動を調べている。 すなわち、 このオリゴヌクレオチドが一本鎖状態で存 在する場合、 ァクリジンの吸収波長である 3 4 0 nmを照射すると、 ァクリジン からフルォレセィンへのエネルギー転移が生じ、 フルォレセィンからの蛍光を観 察することができる。 一方このオリゴヌクレオチドが他の核酸と二本鎖を形成し ている場合、 ァクリジンは二本鎖核酸にイン夕一力レートし、 3 4 0 nmの光を 照射してもフルォレセインへのエネルギー転移を効率的に起こすことができず、 よってフルォレセインからの蛍光を検出することができない。 この方法は、 蛍光 物質とイン夕一カレ一夕一を同時にォリゴヌクレオチドの末端に導入したという 点で新規な方法であるが、 一般的に、 ある蛍光物質を励起し、 それから生じる蛍 光で第二の蛍光物質を励起して第二の蛍光物質から生じる蛍光を測定する方法は、 第一の蛍光物質を励起した光で、 第二の蛍光物質もある程度励起されることが多 く、 従ってバックグランドが高くなることが多い。 また、 相補鎖が存在しない時 に蛍光を発し、 相補鎖が存在するときに蛍光が減少するため一般的な診断方法に は適していない。 発明の概要
本発明は、 遺伝子の検出を固液の分離作業を必要としない簡易操作により短時 間で高感度に実施できる核酸検出用プローブおよび核酸の検出法の提供をその目 的とする。
本発明は、 また、 試料を標識せずに標的核酸を検出できる核酸検出用固相担体 の提供をその目的とする。
本発明によるプローブは、 エネルギーを放出する標識物質と、 標識物質から放 出されたエネルギーを吸収することができるエネルギー吸収性物質とを担持して なる核酸からなるプローブであって、 プローブと標的核酸とのハイプリダイゼ一 シヨンにより標識物質からエネルギー吸収性物質へのエネルギー転移が妨げられ ることを特徴とするプローブである。
本発明による核酸の検出法は、 上記プローブと核酸試料とを接触させ、 次いで 標識物質から放出されるエネルギーを測定することを含んでなるもの、 である。 本発明による核酸検出用固相担体は、 上記プローブが固定化されたものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明によるプローブの概略図である。 Single Strandedはプローブが 標的核酸とハイプリダイズしていない状態を示す。 Double Strandedはプローブ が標的核酸とハイプリダイズした状態を示す。 Fはフルォレセィン等の標識物質、 Pはピレン等の光吸収性物質を示す。
図 2は、 ァミノ基とフルォレセインを固定化したオリゴヌクレオチド （E F N 1一 F、 E F N 2 - F ) の修飾部分の具体的構造を示した図である。 E F N 3— F、 E FN4— Fは塩基以外は E FN 1— F、 E F N 2— Fと同様の構造である ( 図 3は、 ピレンとフルォレセインを固定化したオリゴヌクレオチド （EFN1 — FP、 EFN 2 -FP) の修飾部分の具体的構造を示した図である。 EFN3 — FP、 EFN4— FPは塩基以外は EFN1— FP、 EFN2— FPと同様の 構造である。 発明の具体的説明
本明細書において 「標識物質」 は、 光化学的あるいは化学的にエネルギーを受 け取ることにより励起状態となり、 その励起状態から元の状態に戻る時にェネル ギーを発するものであればいずれのものでもよい。 光化学的に励起されるものと してはフルォレセイン、 テトラメチルローダミン等の蛍光物質が挙げられる。 光 化学的に励起されるものとしてはさらにラン夕二ド錯体 （例えば、 ユウ口ピウム 錯体） 等の遅延蛍光物質が挙げられる (Hemmila, I. et. al. Drug Discovery Today 2, 373-381 (1997)) 。 化学的に励起されるものとしてはルミノール等の化学発光 物質が挙げられる。
本発明において 「エネルギー」 としては、 光エネルギー、 熱エネルギー、 電磁 エネルギー、 化学エネルギーが挙げられる。
本明細書において 「エネルギー吸収性物質」 はプローブと相補鎖核酸とのハイ ブリダイゼーシヨンによりエネルギ一の吸収が妨げられるものであり、 好ましく は光エネルギー吸収性物質である。 光エネルギー吸収性物質としては、 二本鎖核 酸にイン夕一力レートするもの （インターカレ一夕一） や二本鎖核酸に特異的に 結合するものが挙げられる。 光吸収性のインターカレ一夕一としては、 ァクリジ ン、 アントラセン、 ピレンおよびそれらの誘導体が挙げられる。 また、 二本鎖核 酸に選択的に結合する光吸収性の物質としてはェチジゥムブロミ ド、 Hoechst33 258が挙げられる。
これらエネルギー吸収性物質は、 標識物質から放出されたエネルギーを吸収す る能力があればよく、 それ自身吸収したエネルギーを光、 例えば蛍光、 として放 出するものでも熱として放出するものでもいずれのものでもよい。
本発明において用いる標識物質とエネルギ一吸収性物質との組合せは、 標識物 質からエネルギー吸収性物質へのェネルギー転移が起こるものであれば特に限定 されない。 例えば、 フルォレセインとビレン、 フルォレセインとァクリジン、 フ ルォレセインとクマリン、 テトラメチル口一ダミンとピレンの組合せが挙げられ る
標識物質およびエネルギー吸収性物質は、 核酸合成用に修飾されたものがあれ ば、 そのまま自動合成機を用いてオリゴヌクレオチドの特定の場所に直接導入す ることができる。 また、 そのような試薬がない場合はオリゴヌクレオチド合成の 過程でァミノ基、 チオール基等を導入する核酸合成用試薬を用いてそれら官能基 を導入し、 そのあとそれら官能基と反応する官能基を導入した標識物を用いて標 識することができる。 それら試薬を用いて標識物を導入できる位置としては、 ォ リゴヌクレオチドの 5 ' 末端あるいは 3 ' 末端、 あるいはリン酸部分、 さらには 任意の位置の塩基部や糖部に導入することも可能である。 また、 リン酸ジエステ ノレ結合の間に導入することもできる （Goodchild, J. Bioconhugate Chemistry 1, 165 -187( 1990 ) ) 。
本発明においては標識物質から、 ェネルギー吸収性物質への効率的なエネルギ —トランスファーを引き起こす必要があり、 二種の標識はその標識物の組合わせ に応じて効率よくエネルギートランスファーを引き起こす位置関係に導入する必 要がある。 一般的に二種の標識物が近いほどエネルギートランスファーの効率が 良いと考えられるが、 例外的な場合もありうるのでその位置関係は標識物の組合 わせに応じて検討しなければならない (Morrison L. E. Nonisotopic DNA Probe Te chniques 311-352, Academic Press Inc.、 1992) ) 0
二種の標識物の位置関係を調節する方法としてはオリゴヌクレオチドにおける 導入部分をかえることによつてもできるし、 また、 核酸と標識物をつなぐスぺー サ一の構造や長さを変えることによつても調節できる。 この様に標識物の位置関 係は標識物質からエネルギー吸収性物質へのエネルギートランスファーが起こり うるものでなければならないが、 同時にエネルギー吸収性物質が形成された二本 鎖にィン夕一力レートあるいは結合することを妨げる位置であってはならない。 また、 オリゴヌクレオチドに蛍光物質を導入すると、 オリゴヌクレオチドの塩基 配列によって核酸塩基による蛍光の消光が見られる場合があり、 本発明において はその点を考慮する必要がある。 ただし、 この消光現象も二本鎖を形成すること により解消する場合がある。
本発明によるプローブは、 4塩基以上、 好ましくは 8塩基以上、 の核酸からな ることができる。
本明細書において 「核酸」 とは、 D N A、 ： R N Aのみならず修飾核酸あるいは P N A (ペプチド核酸） など核酸と二本鎖を形成するものも含まれる。 ただし、 形成した二本鎖にエネルギー吸収性物質が結合できうる構造であることは言うま でもない。
本発明によるプローブが標的核酸に完全に相補的な場合には、 プローブに導入 したエネルギー吸収性物質、 例えば、 光吸収性のインターカレ一夕一あるいは二 本鎖核酸と特異的に結合する光吸収性物質、 が二本鎖核酸と相互作用を起こし、 その結果プローブに導入した標識物質の消光がおこらない （図 1参照） 。 一方、 プロ一ブが試料とハイブリダィズしないときあるいは試料と不完全にハイブリダ ィズするときは、 プローブに導入した光吸収性のィン夕一力レーターあるいは二 本鎖核酸と特異的に結合する光吸収性物質が該ニ本鎖核酸と相互作用せず、 プロ ーブに導入した標識物質の消光がおきる （図 1参照） 。 従って、 核酸試料とのハ イブリダィゼーシヨンにおいて標識物質から放出された光の存在はプローブと標 的核酸とがハイブリダィズしたことを示し、 標識物質から放出された光の不存在 は、 プローブと標的核酸とがハイブリダィズしていないことを示す。
本発明によるプロ一ブは 1塩 ¾tDミスマッチも検出できる。 すなわち、 プロ一 ブが試料と 1塩基において対合しないときでも二本鎖核酸の構造が変化し、 プロ ーブに導入したエネルギー吸収性物質、 例えば、 光吸収性のインターカレー夕一 あるいは二本鎖核酸と特異的に結合する光吸収性物質、 が該ニ本鎖核酸と相互作 用せず、 プロ一ブに導入した標識物質の消光がおきる。
ノ、ィプリダイゼーションプロテクション法 （Nelson, N. C. et. al . Nucleic Acids Res. 24, 4998-5003 ( 1988 ) ) においては、 ァクリジニゥムエステルのアルカリに よる加水分解のされ易さが、 ターゲッ トがプローブと完全に相補的であるか、 一 塩基のミスマッチがあるかによって変わってくることが確認されており、 一塩基 の変異を検出できると考えられる。 すなわち、 イン夕一力レート剤であるァクリ ジンは二本鎖が完全に相補的である場合と、 一塩基のミスマッチがある場合とで ィン夕一力レートのしかたが異なり、 ァクリジンは完全に相補的な二本鎖とはィ ンタ一カレートするが、 ミスマッチが存在するとィン夕一力レートできないと考 えられる。
このように、 試料中に相補鎖核酸が存在する場合には標識物質からのエネルギ 一放出がエネルギー吸収性物質により妨げられない。 従って、 プローブと試料と を接触させ標識物質からの蛍光等のエネルギー放出を測定することにより試料中 の相補鎖核酸を検出できる。
具体的には、 適切な緩衝溶液等を含む溶液中で、 本発明によるプローブと検体 から調製した核酸とを混合してハイプリダイゼーシヨン操作を行い、 反応溶液の 蛍光等をそのまま測定し、 コントロールと比較すれば試料中にプローブと相補的 な配列が存在するかどうか判定することができる。
ハイプリダイゼーシヨンの方法や条件は一般的方法に従えばよい （Keller, G.H. et al. DNA Probes Stockton Press ( 1993 ) ) 。 ノヽィブリダイゼーション後の検出は、 標識物に応じた検出装置を用いて検出することができる。 たとえば、 標識物が蛍 光であれば、 蛍光分光光度計等を使うことができる。 但し、 検体数が多い場合な どは蛍光マイクロプレートリーダー等を使えば簡便に行なうことができる。 また、 後述するように遺伝子チップのように担体に固定したプローブとのハイプリダイ ゼ一シヨンでは担体上の蛍光を蛍光スキャナ一等を用いて測定することができる。 これらの測定はハイプリダイゼーシヨン後の平衡に達した状態で行なうのが一般 的であるが、 温度変化に伴う動力学的な測定を行いプローブと試料核酸のより精 密な特性を観察することができる (Howell, W.M. et al. Nature Biotechnology 17, 8 7-88( 1999 ) ) 。 すなわち、 この方法により、 一塩基ミスマッチ等をより正確に検 出することが可能になる。
本発明において試料核酸は D N Aまたは R N Aのいずれでもよく、 あらゆる生 体から抽出したものであっても、 粗精製の状態のものであってもよい。 また、 試 料核酸がごく微量の場合は遺伝子増幅法、 例えば P C R法などで遺伝子を増幅し た後、 本発明のプローブとハイブリダィゼーシヨンを行なってもよい。
また、 温度変化可能で、 たくさんの反応容器を備え、 その反応容器のまま蛍光 が測定できる装置 (ABI PRISM™ 7700 Perkin-elmer) などを使えばハイプリダイ ゼ一ションと測定を一つの容器中で連続して行なうこともできる。
本発明のプロ一ブは、 溶液中での均一ハイプリダイゼ一シヨンに用いるだけで なく、 固相担体に結合した状態で使用することもできる。 固相担体に結合した本 発明のプロ一ブの調製法としては、 検出に用いる固相上でオリゴヌクレオチドを 合成する方法と ( Fodor, S.P.A. et al. Science 251， 767-773 ( 1991 ) ) 、 適切な官能 基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、 そのあと導入した官能基を利用して 固相と結合する方法がある ( Rasmussen, S.R. Anal. Biochem. 198， 138-142 ( 199 1 ) ) 。 さらには、 オリゴヌクレオチドに導入したリガンドとそのレセプ夕一を固 相化した固相との間の結合利用して行なうこともできる （Broude, N.E. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3072-3076 ( 1994 ) ) 。
固相担体としては、 マイクロ夕イタ一プレート （Rasmussen, S.R. Anal. Bioche m. 198, 138-142 ( 1991 ) ) ゃスライ ドグラス (Fodor, S.P.A. et al. Science 251， 767- 773 ( 1991 ) ) あるいは光ファイバ一の先端などがある （Ferguson, J.A. Nature Biot echnolog 14, 1681-1684 ( 1996) ) 。
さらに、 本発明による固相担体は遺伝子チップであってもよい。 遺伝子チップ 技術の利用法としては、 おもに RNAの発現量を調べるケースと、 遺伝子の変異 を調べるケースの二つがある (Lander, E. S. Nature Genetics supplement, 21, 3-4 ( 1999 ) ) 。 本発明のプローブはいずれのケースに関しても有力な方法となりうる が、 特に前者において効力を発揮することができる。 従来の遺伝子チップはオリ ゴヌクレオチドや c D N A等がチップ上に固相化されており （Duggan, D. J. et. a 1. Nature Genetics supplement, 21， 10-14 ( 1999) , Lipshutz, R. J. Nature Genetics supp lement, 21, 20-24 ( 1999) ) 、 ハイブリダィゼ一シヨンを検出するためには試料中 の核酸を標識する必要がある。 一般に遺伝子チップでの検出では遺伝子増幅法を 用いて遺伝子を増幅する際に標識物を導入する方法が行われているが、 R N Aの 発現量の定量においては遺伝子増幅により定量性を失ってしまうケースが多い。 また、 R N Aは不安定であり、 種々の標識反応において分解を起こす危険性が非 常に高い。 そこで、 本発明のプローブをチップ上に固相化すれば、 生体等から抽 出した mR N Aを標識操作などを行うこと無くハイブリダイゼーシヨンを行ない 検出することができる。 このような方法を用いれば遺伝子発現解析は飛躍的に簡 易化され、 非常に多くの検体を容易に処理することができると考えられる。 実 施 例
オリゴヌクレオチドの合成は核酸自動合成装置 （ D N A/ N Aシンセサイザ Model 392、 パーキンエルマ一社） を用いてフォスフォアミダイ ト法で行なつ た。 フルォレセインの導入はフルォレセインフォスフオアミダイ ト （グレンリサ —チ、 Cat. No.:10-1963) を用いて行った。 ピレンの導入はュニリンク™ァミノ モディファイァ一 （クロンテク、 Cat. No.:5190-1) を用いてアミノ基を導入し、 兄保 し/こ後、 1-Dvrenebutanoic acid, succinimidyl ester、セレ ュフ一フ。口一フ、'、 Cat. No.:P-130) を反応させることにより行った。 非標識のオリゴヌクレオチド はアマシャムフアルマシアバイオテク社より購入した。
実施例 1： フルォレセィンおよびビレンを導入したオリゴヌクレオチドの合成 以下に示すアミノ基とフルォレセィンを導入したオリゴヌクレオチドを自動合 成機を用いて合成した。 Fはフルォレセインを示す。 修飾部分の具体的構造は図 2に示される通りである。 また、 フルォレセインについては蛍光スペクトルを測 定して確認した （励起波長： 494 nm、 極大蛍光波長： 5 17 nm) 。
E FN 1 -F ： 5 ' GCAACAGGC (NH2) (F) CGACAACG (配列 番号 1)
E FN 2 -F ： 5 ' GCAACAGG (NH2) C (F) CGACAACG (配列 番号 1)
E FN 3 -F ： 5 ' ACGC ACAAA (NH2) (F) AC CAAGCA (配列 番号 2)
EFN4-F ： 5 ' ACGC AC AA (NH2) A (F) AC CAAGCA (配列 番^" 2 ) 脱保護後、 変性 2 0%ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を用いて精製した。 精 製したオリゴヌクレオチド （ 8 0 ig) に 1M NaHCOs (4〃L) 、 ピレン 活性エステル DM F溶液 （2 0 g/ L, 20 //L)、 H20 ( 16〃L) を加 え、 25°Cで 14時間反応した。 反応後、 ゲルろ過 （S e phd ex G— 50， 5 OmM TEAB バッファー） で過剰の試薬を除き、 濃縮後逆相 HPLC
(JLL Bondapak C I 8, ウォーターズ社） で精製した。 得られたォ リゴヌクレオチドを以下に示す。 Pはピレン、 Fはフルォレセインを示し、 修飾 部分の構造は図 3に示されるとおりである。 ピレンの導入については蛍光スぺク トルを測定して確認した （励起波長： 341 nm、 極大蛍光波長： 383 nm, 400 nm)
E F N 1 - F P： 5 ' GCAACAGGC (P) (F) CGACAACG (配列 番号 1)
E FN 2 -FP： 5， GCAACAGG (P) C (F) CGACAACG (配列 番号 1)
E FN 3 -FP： 5 ' ACGCACAAA (P) (F) AC CAAGCA (配列 番号 2)
E FN4 -FP： 5， ACGCACAA (P) A (F) AC C AAG CA (配列 番号 2)
実施例 2 ： フルォレセィン-ピレン標識ォリゴヌクレオチドのハイプリダイゼ一 シヨンによる蛍光強度の増大
上記 2種の塩基配列をもつォリゴヌクレオチドに相補的な下記に示す非標識の ォリゴヌクレオチドを用意した。
E C 1 ： 5 ' CGTTGTCGGCCTGTTGC (配列番号 3)
E C 2 ： 5 ' TGCTTGGTTTTGTGCGT (配列番号 4) 標識ォリゴヌクレオチドと非標識ォリゴヌクレオチドを下記に示すようにバッ ファー （50mM T r i s -HC l pH 8. 0， 5 mM ED T A, 250 mM N a C 1 , 50 n g/j c a r r i e r D N A) とともに混合し、 二本鎖溶液、 およびコントロール溶液を調製した。 混合溶液は 94°Cから 34°C まで 5時間かけてァニーリングした。
表 1
Figure imgf000015_0001
アニーリングした溶液 （30〃L) に測定溶液 （ 1 0 mM T r i s-HC l: ImM ED T A, 50 mM NaC l, 1 0 n g/j c a r r i e r D NA： 420〃L) を加えて、 S h i ma z u R F— 5000を用いて蛍光 を測定した （Ex = 494 nm, Em= 5 1 8 nm) 。 なお、 スケールオーバー したものについてはさらに希釈して測定し、 蛍光強度は原液に換算した。 蛍光強 度は表中に示し、 またグラフ 1に示した。
ピレンの導入されていないものでも二本鎖を形成することによって蛍光強度が 高くなつている場合がある （No. 4および No. 5) 。 これはオリゴヌクレオ チドに導入されたフルォレセィンの蛍光が、 オリゴヌクレオチドとの相互作用に より消光されていた状態が二本鎖を形成することによって解放されたためである このような、 現象は配列に依存する場合が多く、 No. 7から No. 12では見 られない。 一方ビレンを導入したものでは、 いずれも二本鎖を形成した時のみ蛍 光強度が増大しており （No. 13から No. 24の No l 4, No. 17， N o. 21, No. 24) 、 本プローブがハイブリダィゼーシヨンによって蛍光強 度が増すことを示している。

Claims

請求の範囲
1 . エネルギーを放出する標識物質と、 標識物質から放出されたエネルギー を吸収することができるエネルギ一吸収性物質とを担持してなる核酸からなるプ ローブであって、 プローブと標的核酸とのハイブリダィゼ一シヨンにより標識物 質からエネルギー吸収性物質へのエネルギー転移が妨げられることを特徴とする プローブ。
2 . エネルギーが光エネルギーである、 請求項 1に記載のプロ一ブ。
3 . 標識物質が、 蛍光物質、 遅延蛍光物質、 および化学発光物質からなる群 から選択される、 請求項 1または 2に記載のプローブ。
4 . エネルギー吸収性物質が、 インタ一カレ一夕一または二本鎖核酸と特異 的に結合する物質である、 請求項 1〜 3のいずれか一項に記載のプローブ。
5 . イン夕一カレ一夕一が、 ァクリジン、 アントラセン、 ビレン、 およびそ れらの誘導体からなる群から選択される、 請求項 4に記載のプロ一ブ。
6 . 標識物質がフルォレセインであり、 エネルギー吸収性物質がピレン、 ク マリン、 およびァクリジンからなる群から選択される、 請求項 1または 2に記載 のプローブ。
7 . 請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のプローブが固定化された核酸検出 用固相担体。
8 . 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のプローブと核酸試料とを接触させ、 次いで標識物質から放出されるエネルギーを測定することを含んでなる、 核酸の 検出法。
9 . 標識物質から放出されたエネルギーの存在がプローブと標的核酸とのハ ィブリダイゼーションを示す、 請求項 8に記載の検出法。
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