明 細 書
タンパク質一分子間相互作用解析法
技術分野
本発明は、 C末端がラベル化されたタンパク質と相互作用する分子を同定する 方法に関する。 本発明により、 現在急速に蓄積されている遺伝子の塩基配列がコ —ドするタンパク質の機能解析、 例えばタンパク質一タンパク質相互作用、 タン パク質一核酸相互作用、 夕ンパク質一低分子化合物相互作用等の解析を迅速化す るための手段が提供される。 また、 本発明はタンパク質の機能解析において不可 欠である大量のデータを迅速に解析する方法 (ハイスループッ ト化) において有 力な手段を提供する。
背景技術
分子生物学の進歩により、 個々の遺伝子産物の解析が容易となった結果、 生命 現象を分子レベルで解析することが可能となった。 例えば、 タンパク質一タンパ ク質相互作用やタンパク質—核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通 して、 遺伝子産物であるタンパク質の機能が解析される。
タンパク質一タンパク質相互作用の解析法としては、 ィ一ストヅ一ハイプリッ ド (yeast two hybrid) 法 (Chien, C. T., et al ., Proc. Natl . Acad. Sci . USA, SS, 9578-9582 ( 1991 ) )、 ファージディスプレー法 (Smith, G.P. , Science, 22£, pp.1315-1317 ( 1985))、 G S T _融合タンパク質プルダウン法、 免疫共沈法等が 知られている。 G S T—融合タンパク質プルダウン法、 及び免疫共沈法では、 試 験管内で反応が行われるのに対し、 イーストツーハイブリッド法では、 細胞内で の相互作用が検出される。
タンパク質一核酸相互作用の解析法としては、 電気泳動移動度シフトアツセィ
(electrophoresis mobility shift assay)法 (Revzin, A., et al . , Anal . Biochem.:
, 172 ( 1986) )、 D N a s e lフットプリント法 (Calas, D., et al. , Nucleic Acids Res. , 5, 3157 ( 1978))、 メチル化緩衝法等が知られている。 電気泳動シフ トアツセィ法では、 目的の核酸配列を有する断片を放射線同位元素等で標識して プローブとし、 これとタンパク質ライブラリ一を接触させ、 次いでポリアクリル アミ ドゲル電気泳動で検出する。 タンパク質—核酸相互作用が存在すると、 プロ —ブの元の移動度と異なるバンドが検出される。 この方法によれば、 タンパク質 が認識し結合する核酸配列、 及びタンパク質内の D N A結合ドメイン等を解析で きる。
一方、 遺伝子産物であるタンパク質を直接ラベルし、 相互作用を検定する方法 も知られている。この方法は、ラペル化されたタンパク質から発せられる信号が、 該タンパク質が他分子との相互作用することにより変化することを用いて解析す るため、 上記した方法と比し、 感度、 正確性において優れた方法である。
夕ンパク質の直接ラペル化方法としては、 無細胞翻訳系や生細胞で遺伝子を発 現させる際、 基質となるアミノ酸を35 S、 3 H、 " C等の放射能性同位元素でラベ ルしたものを用いることによりタンパク質に取り込ませる放射能ラペル化法が一 般的である。 しかし、 この場合放射能を利用するため安全管理上、 特別な施設等 が必要とされる。
放射性化合物を利用しない方法としてはラベル化 t R N Aを用いる方法が知ら れている。 この方法によれば、 まず、 アミノ酸のリジンの e—ァミノ基にビォチ ン等のラベル物質を共有結合させ、 これをリジン等のアンチコドンをもつ t R N Aにエステル結合させたもの (ピオチン一リジン—t R N A) を合成し、 無細胞 翻訳系に投入し、 翻訳産物であるタンパク質をピオチン化する。 この方法により 作成されたタンパク質は、 電気泳動後、 メンブレンに移し、 アルカリフォスファ 夕一ゼとストレブトアビジンとの融合タンパク質によって化学発光させる。 これ を、 X線フィルム等を使って、翻訳産物を同定する(Promega社、(1993) Technical Bulletin, No.182, p.2)。 この方法は、 合成したピオチン—リジン一 t R N Aが極 めて不安定 (一 7 0 °Cで 6力月) であり、 高価であるという欠点を有する。 さら
に、翻訳されたタンパク質は、複数のリジン側鎖がピオチンで修飾され、 しかも、 その修飾される側鎖は各分子ごとに異なるため、 同一の遺伝子から翻訳されたに も関わらず、 機能及び構造が本来のものとは異なる複数の翻訳産物が得られる。 そのため、 タンパク質の機能解析を極めて難しいものにする。
また、 タンパク質のアミノ酸の N H2、 S H、 O H基に、 直接、 化学的に蛍光 物質を結合させる方法が複数知られている (PanVera社、 (1998) Fluorescence Polarization Applications Guide Chapter 7)。 しかし、 これらの方法はどれも タンパク質を変性させる条件下で化学結合させるため、 タンパク質の構造及び機 能を著しく変化させる可能性が高い。 しかも、 蛍光物質がタンパク質の側鎖に部 位特異的に結合することなく、 複数の側鎖に非特異的に結合するため、 本来のも のとは構造及び機能が異なる夕ンパク質が複数存在することになり、 タンパク質 の機能解析において正確な情報が得られない。 さらに、 この化学修飾法において は、 目的のタンパク質の精製操作が不可欠である。
本発明者等は、 ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク 質の C末端にラベル物質を直接結合させる方法を先に提案している (特願平 1 0 - 1 3 3 1 7 0号明細書,特願平 1 0— 3 2 0 0 9 3号明細書)。この方法により、 構造及び機能を損なうことなくタンパク質をラベル化することが可能となった。 しかし、この方法においても C末端へのラベル分子の結合の効率に問題があった。 上記した公知のタンパク質のラベル化法には、 これと相互作用する分子を同定 する方法に用いるためには、 ラベル化されたタンパク質が構造及び機能を保持で きない、 安全性に欠ける、 ラベル化の効率が悪い等の問題点があった。 また迅速 に分子間相互作用を解析する方法として蛍光偏光解消法、 表面プラズモン共鳴法 等の手段が存在するにも関わらず、 これを有効に利用するための技術については 満足のいくものが得られていない。 発明の要約
そこで、 本発明者等は C末端ラベル化タンパク質を用いてタンパク質と相互作
用する分子を同定する方法を確立すべく鋭意検討した。 その結果、 C末端ラベル 化タンパク質、 C末端にスぺーサ一を介してラベル化物質が結合してなるタンパ ク質を固相化した固相化 C末端ラベル化タンパク質、 及びラペル化分子等を用い れば、 タンパク質と相互作用する分子を効率的に同定し得ることを見いだした。 本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、 本発明によれば、
1 . タンパク質一分子間相互作用の解析方法であって、 下記の工程:
( 1 ) C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程;及び
(2)該 C末端ラベル化タンパク質又は標的分子が発する信号において、該 C末端ラ ベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づいて発せられる信号の変化を検 出する工程
を含む方法;
2 . 標的分子がタンパク質、 核酸、 糖鎖、 又は低分子化合物である上記 1に記載 の方法;
3 . 標的分子が標識物質によりラベル化されているラベル化分子である上記 1又 は 2に記載の方法;
4 . 標識物質が蛍光標識試薬である上記 3に記載の方法;
5 . C末端ラベル化タンパク質が、 標識物質を含むラベル部とタンパク質の C末 端に結合する能力を有する化合物を含むァクセブ夕一部とを含むラベル化試薬の 存在下で、 該タンパク質のコーディング領域を含む核酸を転写及び/又は翻訳系 で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製されたものである上記 1 ないし 4のいずれかに記載の方法;
6 . ァクセプ夕一部がピューロマイシン、 3 ' -N-アミノアシルビユ一ロマイシン アミノヌクレオシド、 3 ' -N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学 構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体を含む上記 5に記載の方法;
7 . ラベル化試薬がラベル部とァクセプ夕一部とがスぺ一サ一を介して結合して いる化合物を含む上記 5又は 6に記載の方法;
8 . C末端ラベル化夕ンパク質又は標的分子のいずれか一方が固相に結合してい る上記 1ないし 7のいずれかに記載の方法、 及び上記方法において、 固相への結 合の態様が下記の a又は b :
a :該 C末端ラペル化タンパク質又は該標的分子のいずれか一方が基盤に 1種類 ずつ番地付けされて固定化されている ;又は
b :該 C末端レベル化タンパク質又は該標的分子のいずれか一方が複数の穴を有 するマイクロプレートの各穴底面に 1種類ずつ固定化されている
のいずれかである方法;
9 . C末端ラベル化タンパク質が、 該タンパク質を構成するラベル部又はラベル 部以外の部分により固相に結合している上記 8に記載の方法;
1 0 . C末端ラベル化タンパク質を構成するラベル部が特定のポリペプチドと特 異的に結合する能力を有する分子を含み、 該分子が固相表面に結合している特定 のポリべプチドとの連結を介して固相に結合する上記 9に記載の方法;
1 1 . 特定のポリペプチドとそれに特異的に結合する能力を有する分子の組み合 わせが、 ピオチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一ス結合タンパク質/マル ト一ス、 Gタンパク質/グァニンヌクレオチド、 ポリヒスチジンペプチド/金属 イオン、 グル夕チオン一S—トランスフェラ一ゼ /グル夕チオン、 D N A結合夕 ンパク質/ D N A、 抗体/抗原分子、 カルモジュリン/カルモジュリン結合ぺプ チド、 A T P結合タンパク質/ A T P、 及びェストラジオ一ル受容体タンパク質 /エス卜ラジオ一ルよりなる群から選ばれるレ、ずれかの組み合わせである上記 1 0項に記載の方法;
1 2 . 信号の変化の測定を表面プラズモン共鳴法、 エバネッセン卜場イメージン グ法、 蛍光イメージングアナライズ法、 固相酵素免疫検定法、 蛍光偏光解消法、 及び蛍光相関分光法よりなる群から選択される 1以上の方法により行う上記 1な いし 1 1のいずれかに記載の方法;
1 3 . C末端ラベル化タンパク質が該タンパク質を構成するラベル部により固相 に結合されており、 標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラベル化され
たラベル化分子であり、 信号の変化の測定が表面プラズモン共鳴法、 エバネッセ ント場イメージング法、 蛍光イメージングアナライズ法、 及び固相酵素免疫検定 法よりなる群から選択される 1以上の方法により行われる上記 1、 2、 5ないし 1 1のいずれかに記載の方法;
1 4 . ラベル化分子が蛍光標識試薬によりラペル化された標的分子である上記 1 3に記載の方法;
1 5 . C末端ラベル化タンパク質が該タンパク質を構成するラベル部以外の部分 により固相に結合されており、 標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラ ベル化されたラベル分子であり、 信号の変化の測定が表面プラズモン共鳴法、 ェ バネッセント場イメージング法、 蛍光イメージングアナライズ法、 及び固相酵素 免疫検定法よりなる群から選択される 1以上の方法により行われる上記 1、 2、 5ないし 1 1のいずれかに記載の方法;
1 6 . ラベル化分子が蛍光標識試薬によりラベル化された標的分子である上記 1 5に記載の方法;
1 7 . 標的分子が固相に結合されており、 C末端ラベル化タンパク質のラベル部 より発せられる信号の変化の測定が表面プラズモン共鳴法、 エバネッセント場ィ メージング法、 蛍光イメージングアナライズ法、 及び固相酵素免疫検定法よりな る群から選択される 1以上の方法により行われる上記 1、 2、 5ないし 1 1のい ずれかに記載の方法;
1 8 . C末端ラベル化タンパク質及び標的分子が固相に結合されずに溶液中に存 在しており、 標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラベル化されたラベ ル化分子であり、 信号の変化の測定が蛍光偏光解消法及び/又は蛍光相関分光法 により行われる、 上記 1、 2、 5ないし 1 1のいずれかに記載の方法;
1 9 . ラベル部とァクセプ夕一部とを含むタンパク質のラベル化試薬であって、 該ラベル部が特定のポリぺプチドと特異的に結合する能力を有する分子であり、 該ァクセプ夕一部がタンパク質の C末端に結合する能力を有する化合物である夕 ンパク質のラベル化試薬。
2 0 . ラベル部がスぺ一サ一を介してァクセプ夕一部に共有結合している上記 1 9項に記載の試薬;
2 1 . スぺ一サ一がポリエチレン又はポリエチレングリコールのいずれかである 上記 1 9又は 2 0に記載の試薬;
2 2 . ラベル部がピオチン、 マルト一ス、 グァニンヌクレオチド、 金属イオン、 グル夕チオン、 タンパク質結合性 D N A、 抗原分子、 カルモジュリン結合べプチ ド、 A T P、 及びェストラジオ一ルよりなる群より選ばれる 1以上の分子を含む 上記 1 9ないし 2 1のいずれかに記載の試薬;
2 3 . ァクセプ夕一部がピューロマイシン、 3 ' -N-アミノアシルビユ一ロマイシ ンアミノヌクレオシド、又は 3 ' - N-ァミノァシルアデノシンアミノヌクレオシド のいずれかの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体を含む上記 1 9ない し 2 2のいずれかに記載の試薬;
2 4 . C末端ラベル化夕ンパク質が該夕ンパク質を構成するラベル部により固相 に結合していることを特徴とする固定化タンパク質;
2 5 . C末端ラベル化タンパク質が、 標識物質よりなるラベル部とタンパク質の C末端に結合する能力を有する化合物よりなるァクセプ夕一部とから構成される ラベル化試薬の存在下で、 該タンパク質のコーディング領域を含む核酸を転写及 び/又は翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製されたも のである上記 2 4に記載の固定化タンパク質;
2 6 . ラベル化試薬のラベル部がスぺ一サ一を介してァクセプ夕一部に共有結合 している上記 2 4又は 2 5に記載の固定化タンパク質;
2 7 . ラベル部が特定のポリべプチドと特異的に結合する能力を有する分子であ り、 該分子が固相に結合された特定のポリべプチドと結合する上記 2 4ないし 2 6のいずれかに記載の固定ィ匕タンパク質;
2 8 . ァクセプ夕一部がピューロマイシン、 3 ' -N-アミノアシルピューロマイシ ンアミノヌクレオシド、又は 3 ' -N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド のいずれかの化学構造骨格を有する化合物又はその類縁体を含む上記 2 4ないし
2 8のいずれかに記載の固定化タンパク質;
2 9 . ラベル部を構成する特定の分子と該分子と特異的に結合する能力を有する 分子の組み合わせが、 ピオチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一ス結合タン パク質/マルト一ス、 Gタンパク質 グァニンヌクレオチド、 ポリヒスチジンべ プチド /金属イオン、 グル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ /グル夕チオン、 D N A結合夕ンパク質/D N A、 抗体/抗原分子、 カルモジュリン/カルモジュ リン結合ペプチド、 A T P結合タンパク質/ A T P、 及びェストラジオ一ル受容 体タンパク質/エストラジオールよりなる群より選ばれるいずれかの組み合わせ である上記 2 4ないし 2 8のいずれかに記載のタンパク質;
3 0 . 上記 2 4ないし 2 9のいずれかに記載の固定化タンパク質の集合体を含む プロティンチップ;
3 1 . アダプタータンパク質が表面に結合した基盤を保持する手段、 該基盤に C 末端ラペル化タンパク質を導入する手段、 及び該基盤を洗浄する手段を有する上 記 3 0に記載のプロティンチップを作成するための装置;
3 2 . チップを保持する手段、 該チップに標的分子を接着させる手段、 該チップ を洗浄する手段、 及び該 C末端ラベル化タンパク質からの信号を測定し、 該 C末 端ラペル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づく信号の変化を検出するた めの手段を有する、 上記 1 0、 1 1、 1 3、 又は 1 4のいずれかに記載の方法に おいて多数の検体の同時解析を行うための装置;
3 3 . タンパク質と相互作用する分子又は分子と相互作用するタンパク質の同定 方法であって、
a . 下記の工程:
( 1 )タンパク質の C末端をラベル化して C末端ラベル化タンパク質を製造するェ 程;
(2) C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程;及び
(3) C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該 C 末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には
該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程を含む方法;並びに b . 上記工程(1)ないし(3)に続き、
(4)相互作用すると判定された該タンパク質及び該標的分子を特定する工程 を含む方法;
3 4 . 特定のタンパク質と相互作用する分子又は特定の分子と相互作用するタン パク質の同定方法であって、
a . 下記の工程:
( 1 )該タンパク質を含む C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させるェ 程;及び
(2) C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該 C 末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には 該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程
を含む方法;並びに
b . 上記工程(1 )及び (2)に続き、
(3)相互作用すると判定された該タンパク質及び該標的分子を特定する工程 を含む方法;
3 5 . タンパク質と相互作用する分子又は分子と相互作用するタンパク質のスク リーニング方法であって、 下記の工程:
( 1 )該タンパク質を含む C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させるェ 程;及び
(2) C末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該 C 末端レベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には 該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程
を含む方法。
3 6 . 上記 3 5でスクリーニングされた上記タンパク質と相互作用する分子又は 上記分子と相互作用するタンパク質;
3 7 . 上記 3 3又は 3 4に記載のタンパク質に相互作用する分子の同定方法に使
用するための C末端ラベル化タンパク質;
3 8 . 上記 3 5に記載のスクリーニング方法に使用するための C末端ラベル化夕 ンパク質
が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、ピューロマイシン及びその誘導体の化学構造である。 Iは Puroinycin、 IIは rCpPur、 II Iは dCpPur、 IVは dUpPurである。
第 2図は、 蛍光物質と結合したビューロマイシンの化学構造である。 I は F luorpur、 11は F luorthiopurである。
第 3図は、 ラベル部としてのリガンドが、 固相に結合したアダプタ一タンパク 質を介して結合した固相化 C末端タンパク質をあらわした模式図である。
第 4図は、蛍光偏光解消測定装置により ドメイン Bとヒト IgG との相互作用を 測定し、その結果を各ヒト IgG の濃度に対する偏光度の変化として示した図であ る o
第 5図は、ピオチンビューロマイシン (Biotin-puro) でラペル化されたタンパク 質の蛍光強度を蛍光イメージングアナライザーのディスプレー上に表示した写真 である。
第 6図は、 蛍光イメージングアナライザ一による固相化 Bドメインとヒト IgG との相互作用の強度を蛍光強度として蛍光イメージングアナライザーのディスプ レー上に表示した写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
( 1 ) C末端ラベル化タンパク質
( 1 - 1 ) C末端ラベル化タンパク質の構成
本発明のタンパク質—分子間相互作用解析方法は、 C末端ラベル化タンパク質
を用いることに一つの特徴を有する方法である。 C末端ラベル化タンパク質は、 タンパク質部と該タンパク質の c末端がラベル化試薬により標識 (ラベル) され ているラベル部とにより構成される。
「タンパク質部」 とは、 その機能が既知又は未知である相互作用の解析対象と して用いるタンパク質部を意味し、 このタンパク質部と後述する標的分子との相 互作用の有無の測定が行われる。
このタンパク質部は、 天然タンパク質又はその変異体、 及び人工タンパク質又 はその変異体の何れでもよい。 天然タンパク質としては、 種々の生物の器官、 組 織又は細胞に由来する c D N Aライブラリーから転写、 翻訳される多様性を有す るタンパク質のライブラリ一をも含むものである。 人工タンパク質としては、 天 然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、 又はランダムなアミ ノ酸配列を含むものである。
( 1 - 2 ) ラペル化試薬
「ラベル化試薬」 は、 標識物質を含む 「ラベル部」 と、 タンパク質の C末端に 結合する能力を有する化合物を含む 「ァクセプ夕一部」 とを含む。 ラベル部とァ クセプ夕一部とは化学結合で連結されている。 ラベル部とァクセプ夕一部とは直 接化学結合していてもよく、 またスぺーサ一を介して化学結合していてもよい。 標識物質は、 通常は蛍光性物質などの非放射性標識物質から選択される。 蛍光 物質としては、 フリーの官能基 (例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル 基、 ホスホアミダイ ドに変換可能な水酸基、 あるいはアミノ基など) を持ち、 ピ ユーロマイシン又はピューロマイシン様化合物などの上記核酸誘導体に連結可能 な種々の蛍光色素、例えばフルォレセィン系列、口一ダミン系列、ェォシン系列、 N B D系列などのいかなるものであってもよい。 その他、 ラベル部としては後述 する特定のポリぺプチドと特異的に結合する能力を有する分子 (以下、「リガンド」 と称することがある)、 タンパク質、 ペプチド、 糖類、 脂質類、 色素、 ポリエチレ ングリコールなどの非放射性標識物質、あるいはラベル化可能な化合物であれば、 その化合物の種類、 大きさを問わない。
これらの標識物質は、 C末端ラベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基 づいて発生される信号の変化の測定に適したものが適宜用いられる。
ラベル化試薬を構成する 「ァクセプ夕一部」 としては、 通常は核酸誘導体が用 いられる。 この核酸誘導体としては、 無細胞タンパク質合成系又は生細胞中で夕 ンパク質の合成 (翻訳) が行われた時に、 合成されたタンパク質の C末端に結合 する能力を有する化合物である限り限定されないが、 その 3 ' 末端がアミノアシ ル tRNAに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化 合物として、 アミ ド結合を有するピューロマイシン (Puromycin)、 3, ァミノ アシノレビュー口マイシンアミノヌクレオシド (3, -N-Aminoacylpuromycin ajninonucleoside , PANS-アミノ酸)、 たとえば、 アミノ酸部がグリシンの
PANS-Glys アミノ酸部がパリンの PANS-Val、 アミノ酸部がァラニンの PANS-Ala、 その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応する PANS—アミノ酸化合物が挙げ られる。
また、 3 ' —アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水 縮合して形成されるアミ ド結合で連結した 3,-Ν-アミノアシルアデノシンアミノ ヌクレオシド (3, - Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸)、 たと えば、 アミノ酸部がグリシンの AANS-Gly、 アミノ酸部がパリンの MNS-Val、 アミ ノ酸部がァラニンの AANS- Ala、 その他、 アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に 対応する AANS-ァミノ酸化合物を使用できる。
また、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したもの なども使用できる。 さらにまた、 核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び 塩基を有する物質と、 アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的 に結合した化合物は、 すべて本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。 ァクセプ夕一部としては、 ビューロマイシン、 P A N S—アミノ酸もしくは A A N S—アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより 好ましい。 これらの化合物の中でピューロマイシン (第 1図の (1 ))、 リボシチ ジルビユ一ロマイシン (r C p P u r :第 1図の 1 1 )、 デォキシジルビユ一口マ
ィシン((1。 ?11 1^ :第 1図の1 1 I )、デォキシゥリジルビユ一ロマイシン(d U p P u r :第 1図の I V) などのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
ラベル化試薬は、 上記ラベル部とァクセプ夕一部とを所望によりスぺ一サ一を 介して、 それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造するこ とができる。 具体的には、 例えば、 適当な保護基で保護された上記ァクセプ夕ー 部を固相担体上に結合させ、 核酸合成機を用いてスぺ一サ一としてスぺ一サーホ スホアミダイ ト、 ラベル部として蛍光物質などを結合したホスホアミダイ トを順 次結合させた後、 脱保護を行うことによって作成することができる。 上記各部の 種類、 あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を 併用することもできる。 また、 ラベル部としてニッケル等の金属イオンを結合さ せるには、 金属イオンが配位しうる二トリロトリ酢酸やィミノジ酢酸等のキレ一 ト性の試薬用いて行うことができる。
ラベル部とァクセプ夕一部をつなぐスぺーサ一としては、 ポリエチレン、 ポリ エチレングリコールなどの高分子物質が用いられ、 好ましくはポリエチレングリ コールが用いられる。
( 1 - 3 ) C末端ラベル化タンパク質の調製
本発明で用いる C末端ラベル化タンパク質の調製法は特に制限されないが、 例 えば、 上記ラベル化試薬の存在下で、 前記タンパク質部をコードするコーディン グ領域を T 7等のウィルスや細胞に由来するプロモ一夕一領域の制御下に連結し、 これを転写することにより mRNAを合成する。該コ一ディング領域 D N Aとしては、 ラベル化の効率が数十倍よくするためにストップコドンを削除した配列が好まし く用いられる。 また、 それ自体既知の方法で生体から取得された mRNA を用いる こともできる。これらの mRNAは、翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせる ことにより調製することができる。
用いられる翻訳系としては、 無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。 無細 胞翻訳系又は生細胞などは、 その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導 入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されない。 無
細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、 例えば大腸菌、 ゥサギ網状赤血球、 小麦胚芽抽出物などが使用できる。 生細胞翻 訳系としては、 原核又は真核生物、 例えば大腸菌の細胞などが使用できる。 無細 胞翻訳系を用いる場合、 用いる核酸が D N Aである場合、 それ自体既知の R NA ポリメラーゼなどを用いる方法により転写して合成した R N Aを鎵型として導入 する。
この翻訳系において、 ラベル化試薬を適当な濃度で存在させることにより合成 されたタンパク質部の C末端にァクセプ夕一部を介してラベル物質を結合させる ことができる。 存在させるラベル化試薬の濃度としては、 実際に用いるラベル化 試薬、 核酸、 あるいは翻訳系によって異なるが、 一般的には最終濃度が 2 0 0〜 0 . 1 Mの範囲が好ましく用いられる。
好ましいラベル化試薬の濃度の選定は、 種々の濃度のラペル化試薬を、 用いる 鍊型核酸とともに翻訳系に投入し、 合成されたタンパク質を適当な方法で分離し た後、 タンパク質より発せられる信号の強度を測定し、 最も高い値を示した系に 投入したラベル化試薬の濃度を選択することによって行うことができる。
このようにして選定した、 ラベル化試薬の濃度として具体的には、 錶型となる 核酸が、 T 7プロモー夕とチォレドキシンのコーディング領域の全長 D N A、 ラ ベル化試薬がピューロマイシンとフルォレセィンの結合体で、 翻訳系がゥサギ網 状赤血球抽出液を用いた場合には、 0 . 1〜 1〃M、 また翻訳系に小麦胚芽抽出 液を用いた場合には 1 0〜5 0〃Mである。
本方法に用いるラベル物質が結合した核酸誘導体の濃度としては、 実際に使用 する RNA、 ラペル物質、 核酸誘導体、 及び翻訳系等によって異なるが、 下記の方 法等により当業者は該濃度を適宜決定することができる。
上記した C末端ラベル化タンパク質を作成する系において、 ラベル物質が結合 した核酸誘導体、 例えばフルォレセ二ルビユ一ロマイシン (Fluorpur:第 2図の I ) を濃度を違えて添加し、 得られた翻訳産物を S D Sポリアクリルアミ ド電気 泳動を用いる等して分離し、 C末端に結合しているラペル物質より発せられる信
号強度を測定し、 最も信号強度の高い値を示した濃度を選択する。 具体的には、
T 7プロモー夕の制御下にあるチォレドキシンのコ一ディング領域の全長を、 Fluorpur, もしくは Fluorthiopur (第 2図の I I ) の存在下で大腸菌の無細胞転 写翻訳系においてタンパク質を合成する場合には、 Fluorpur、 も しくは Fluorthiopurの最適濃度は、 0 . 1〜 1 である。 またゥサギ網状赤血球抽出 液を用いた場合では 0 . 3〜5 0 M、 小麦胚芽抽出液を用いた場合には 1 0〜 5 である。
このようにして合成された C末端ラベル化タンパク質は、 翻訳系に生細胞を用 いた場合は細胞をそれ自体既知の方法で溶解後、ゲル濾過など(例えば、 Bio-Spin 6 ; BI0-Rad社製) によって未反応のラベル化試薬を除去し、 取得することができ る。 また、 無細胞翻訳系を用いた場合には、 ゲル濾過によって未反応のラベル化 試薬を除去すればよい。
また、 本発明においては C末端ラベル化タンパク質を固相に結合させる場合が あるが、 固相に結合させる方法としては、 ラベル部を介して結合させる方法と、 ラベル部以外の部分により結合させる方法が挙げられる。
ラベル部を介して結合させる場合に用いられるラベル部は特定のポリべプチド に特異的に結合する分子 (以下、 「リガンド」 と称することがある。) であり、 固 相表面には該リガンドと結合する特定のポリぺプチド(以下、「アダプタ一夕ンパ ク質」 と称することがある) を結合させる (第 3図)。 アダプタ一タンパク質とし ては、 結合タンパク質、 受容体を構成する受容体タンパク質、 抗体も含まれる。 ァダブ夕一タンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 例えば、 アビジン及 びストレプトアビジン等のピオチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一ス結合 タンパク質/マルト一ス、 Gタンパク質/グァニンヌクレオチド、 ポリヒスチジ ンべプチド /ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、 グル夕チオン一 S—ト ランスフェラ一ゼ /グル夕チオン、 D N A結合夕ンパク質/D NA、 抗体/抗原 分子(ェビトープ)、 カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、 A T P結合 タンパク質/ A T P、 あるいはエストラジオール受容体タンパク質/エストラジ
オールなどの、 各種受容体タンパク質 / /そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、 アダプタ一タンパク質 リガンドの組み合わせとしては、 アビ ジン及びストレブトアビジンなどのピオチン結合タンパク質、 マルト一ス結合夕 ンパク質/マルト一ス、 ポリヒスチジンぺプチドノニッケルあるいはコバルト等 の金属イオン、 グル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ /グル夕チオン、 抗体/ 抗原分子 (ェピトープ) などが好ましく、 特にストレプトアビジン/ピオチンの 組み合わせが最も好ましい。 これらの結合タンパク質は、 それ自体既知のもので あり、 該タンパク質をコ一ドする D N Aは既にクローニングされている。
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、 それ自体既知の方法を用いるこ とができるが、 具体的には、 例えば、 タンニン酸、 ホルマリン、 グルタルアルデ ヒド、 ピルビックアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン- 2, 4-ジイソ シァネート、 アミノ基、 カルボキシル基、 又は水酸基あるいはアミノ基などを利 用する方法を用いることができる。
ラベル部以外の部分により固相に結合させる場合は、 通常はタンパク質を固相 に結合させるのに用いられる既知の方法、 例えばタンニン酸、 ホルマリン、 グル タルアルデヒド、 ビルビックアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン - 2,4-ジイソシァネート、 アミノ基、 カルボキシル基、 又は水酸基あるいはァミノ 基などを利用して行うことができる。
( 2 ) 標的分子
「標的分子」 とは、 本発明において C末端ラベル化タンパク質と相互作用する 分子を意味し、 具体的にはタンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物などが挙げら れる。
タンパク質としては、 C末端ラベル化タンパク質と相互作用する能力を有する 限り特に制限はなく、 タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ぺプ チドでもよい。 またアミノ酸配列、 及びその機能が既知のタンパク質でも、 未知 のタンパク質でもよい。 これらは、 合成されたペプチド鎖、 生体より精製された タンパク質、あるいは c D N Aライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、
精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。 合成されたべプ チド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。 これらのうち好ま しくはァミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、 あるいは c D N Aライブ ラリー等から適当な方法を用いて翻訳、 精製されたタンパク質を用いることがで きる。
核酸としては、 C末端ラベル化タンパク質と相互作用する能力を有する限り、 特に制限はなく、 D N Aあるいは R NAも用いることができる。 また、 塩基配列 あるいは機能が既知の核酸でも、 未知の核酸でもよい。 好ましくは、 タンパク質 に結合能力を有する核酸としての機能、 及び塩基配列が既知のものか、 あるいは ゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いるこ とができる。
糖鎖としては、 C末端タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限 はなく、 その糖配列あるいは機能が、 既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。 好ま しくは、 既に分離解析され、 糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。 低分子化合物としては、 C末端タンパク質と相互作用する能力を有する限り、 特に制限はない。 機能が未知のものでも、 あるいはタンパク質に結合する能力が 既に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子が C末端タンパク質と行う 「相互作用」 とは、 通常は、 タンパ ク質と標的分子間の共有結合、 疎水結合、 水素結合、 ファンデルワールス結合、 及び静電力による結合のうち少なくとも 1つから生じる分子間に働く力による作 用を示すが、 この用語は最も広義に解釈すべきであり、 いかなる意味においても 限定的に解釈してはならない。 共有結合としては、 配位結合、 双極子結合を含有 する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、 上記作用の結果生じる結合反応、 合成反応、 分解反応も相互作用に含有される。 相互作用の具体例としては、 抗原と抗体間の結合及び解離、 タンパク質レセプ 夕一とリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、 酵素と基質の間の結合及び解離、 核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及
び解離、 情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、 糖タンパク質と タンパク質との間の結合及び解離、 あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び 解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、 態様に応じて標識物質により標識して用いることがで きる。 標識物質は、 通常、 蛍光性物質などの非放射性標識物質から選択される。 蛍光物質としては、 フリーの官能基 (例えばカルボキシル基、 水酸基、 アミノ基 など)を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、 例えばフルォレセイン系列、 ローダミン系列、 ェォシン系列、 N B D系列などの いかなるものであってもよい。 その他、 色素など標識化可能な化合物であれば、 その化合物の種類、 大きさは問わない。
これらの標識物質は、 標的分子と C末端ラベル化タンパク質との間の相互作用 に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いら れる。
上記標識物質の標的分子への結合は、 それ自体既知の適当な方法を用いて行う ことができる。 具体的には、 例えば、 標的分子がタンパク質の場合、 上記 1 . に 記載した C末端を標識化する方法等を用いることができる。 また標的分子が核酸 の場合は、 予め標識物質を共有結合などで結合させたオリゴ D N Aプライマ一を 用いた P C Rを行う方法などによって簡便に標識化することができる。
また、 本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、 固相に結合させる場合が あるが、 固相に結合させる方法としては、 標識物質を介して結合させるものと、 それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
標識物質を介して結合させる場合に用いられる標識物質はリガンドであり、 固 相表面には該リガンドと結合するアダプタ一タンパク質を結合させる。
アダプタ一タンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 例えば、 アビジン及 びストレブトアビジン等のピオチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一ス結合 タンパク質/マルト一ス、 Gタンパク質/グァニンヌクレオチド、 ポリヒスチジ ンぺプチド /ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、 グル夕チオン一 S—ト
ランスフェラーゼ /グル夕チオン、 D N A結合タンパク質/ D N A、 抗体/抗原 分子(ェピトープ)、 カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、 A T P結合 タンパク質/ A T P、 あるいはエストラジオ一ル受容体タンパク質/エストラジ オールなどの各種受容体夕ンパク質/そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、 ァダブ夕一タンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 アビ ジン及びストレブトアビジンなどのビォチン結合タンパク質、 マルト一ス結合夕 ンパク質/マルト一ス、 ポリヒスチジンぺプチド /ニッケルあるいはコバルト等 の金属イオン、 グル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ /グル夕チオン、 抗体/ 抗原分子(ェビトープ)、 などが好ましく、 特にストレブトアビジン/ピオチンの 組み合わせが最も好ましい。 これらの結合タンパク質は、 それ自体既知のもので あり、 該タンパク質をコードする D N Aは既にクローニングされている。
アダプタ一タンパク質の固相表面への結合は、 それ自体既知の方法を用いるこ とができるが、 具体的には、 例えば、 タンニン酸、 ホルマリン、 グルタルアルデ ヒド、 ピルビックアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン- 2,4-ジイソ シァネート、 アミノ基、 活性エステルに変換可能なカルボキシル基、 又はホスホ アミダイ ドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いるこ とができる。
標識物質以外の部分により固相に結合させる場合は、 通常タンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、 具体的には 例えば、タンニン酸、ホルマリン、 グルタルアルデヒド、 ピルビックアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン- 2, 4-ジイソシァネー卜、 アミノ基、 活性ェ ステルに変換可能なカルボキシル基、 又はホスホアミダイ ドに変換可能な水酸基 あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
( 3 ) 信号の変化の測定法
上記で得られた C末端ラベル化タンパク質と標的分子を、 標識物質の種類又は 固相化の方法により適宜組み合わせて C末端夕ンパク質と接触せしめ、 該 C末端 ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に
基づいて発生される上記信号の変化を測定、 検出することにより相互作用を解析 する。
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、 いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 用いられる測定法として は、 例えば、 表面プラズモン共鳴法、 エバネッセント場分子イメージング法、 蛍 光イメージングアナライズ法、 固相酵素免疫検定法、 蛍光偏光解消法、 及び蛍光 相関分光法等が挙げられる。
( 3 - 1 ) 表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、 金属/液体界面で相互作用する分子によって表面 プラズモンが励起され、 これを反射光の強度変化で測定する方法である(Cullen, D.C. , et al . , Biosensors, 3(4), 211-225( 1987-88))。 この方法を用いてタンパ ク質ー分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末端ラベル化タンパク質は 上記した方法により固相化されていることが必要であるが、 標的分子の標識化は 必要ない。
C末端ラベル化タンパク質を固相化するための基盤としては、 ガラスの等の透 明基盤上に金、 銀、 白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。 透明基盤 としては、 通常表面ブラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるも のであってもよく、 レーザ一光に対して透明な材料からなるものとして一般的に はガラス等からなるものであり、 その厚さは 0 . 1〜 5 mm程度のものが用いら れる。 また金属薄膜の膜厚は 1 0 0〜2 0 0 0 A程度が適当である。 このような 表面ブラズモン共鳴装置用固基盤として市販されているものも用いることができ る。 C末端ラベル化タンパク質の上記基盤への固相化は前述した方法により行う ことができる。
本方法において標的分子を C末端ラベル化タンパク質へ接触せしめる方法とし ては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるもの であってもよいが、 好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適 当な濃度で溶解した溶液に固相化された C末端タンパク質を接触させる方法を用
いることができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、 例えば BIAcore2000
(Pharmacia Biosensor社製)によって よい 0
両分子を接触せしめた後、 それ自体既知の表面ブラズモン共鳴装置を用いて、 それそれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、 固相化された C末端ラベル化タンパク質と標的分子の相互作用が解析できる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記表面プ ラズモン共鳴装置に用いられる基盤に、 複数の C末端ラベル化タンパク質を番地 付けして固相化するか、 あるいは 1種類の固相化された C末端ラベル化タンパク 質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
( 3 - 2 ) エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、 Funatsu, T., et al. , Nature, 374, 555-559 ( 1995 )等に記載されている方法で、 ガラス等の透明体に固相化した分子 に溶液として第 2の分子を接触せしめ、 これにエバネッセント場が発生する角度 でレーザー光等の光源を照射し、 発生したエバネッセント光を検出器によって測 定又は解析する方法である。 これらの操作は、 それ自体既知のエバネッセント場 蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いてタンパク質一分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C 末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により 固相化されていることが必要である。 標的分子は固相化する場合は標識の必要は ないが、 固相化しないで用いる場合には上記した標識物質により標識化されてい ることが必要である。
C末端ラベル化タンパク質、 あるいは標的分子を固相化するための基盤として は、 ガラス等の材質の基盤が用いられ、 好ましくは石英ガラスが用いられる。 ま た、 レ一ザ一光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。 本方法において固相化していない C末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標 的分子を固相化分子へ接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分
な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、 好ましくは固相 化していない C末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を生化学的に通 常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、 これを固相表面に滴 下する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、 ェパネッセント場照明により励起された蛍光を C C Dカメラ等の検出器を用いて測定することにより、 固相化された分子と相互作用 する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基盤に、 複数の C末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を番地付けして固相化 する方法等が用いられる。
( 3 - 3 ) 蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、 固相化された分子に、 標識化分子を接触せ しめ、 両分子の相互作用により、 固相化された分子上にとどまった標識化分子か ら発せられる蛍光を、 市販の蛍光イメージングアナライザ一を用いて測定又は解 析する方法である。
この方法を用いてタンパク質一分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C 末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により 固相化されていることが必要である。 標的分子は固相化して用いる場合には標識 されているものと、 されていないもののどちらも利用可能である。 また、 固相化 しないで用いる場合には上記した標識物質により標識化されていることが必要で ある。 C末端ラベル化タンパク質は、ラベル部を介して固定化されているものも、 ラベル部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
C末端ラベル化タンパク質、 あるいは標的分子を固相化するための基盤として は、 通常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメン プレンやナイロンメンブレン、 あるいはプラスチック製のマイクロプレ一ト等も 用いることができる。
本方法において標識ィ匕標的分子あるいは c末端ラベル化タンパク質を固相化分
子へ接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する 方法であればいかなるものであってもよいが、 好ましくは標識化標的分子あるい は C末端ラベル化タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で 溶解した溶液を作成し、 これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、 好ましくは過剰に存在する標識化標的分子あるいは C末端ラベル化タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、 固相上にと どまった標的分子あるいは C末端ラベル化タンパク質の標識物質から発せられる 蛍光信号、 又は固相化されている標識化分子から発せられる蛍光と固相上にとど まった標識化分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、 市販のイメージン グアナライザ一を用いて測定あるいは解析することにより、 固相化された分子と 相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記固相表 面に、 複数の C末端ラベル化タンパク質あるいは標識化又は非標識化標的分子を 番地付けして固相化する方法、 あるいは 1種類の C末端ラベル化タンパク質ある V、は標識化又は非標識化標的分子に固相化されていな t、複数種の C末端ラベル化 タンパク質あるいは標識化標的分子を接触させる方法等が用いられる。 複数種の
C末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を接触させる場合には、 固相 にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、 これを既知 の方法により分析することにより同定できる。
( 3 - 4 ) 固相酵素免疫検定法
固相酵素免疫検定法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) : Crowther, J.R. , Methods in Molecular Biology, (1995 ) ) は、 固相上に固定化した抗原 に対し、 抗体を含む溶液を接触せしめ、 両分子の相互作用 (抗原抗体反応) によ り、 固相化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する標識化分子 ( I g G等) から発せられる蛍光、 あるいは標識化分子を基質とする色素から発 せられる信号を、 市販の検出器 (E L I S Aリーダー) を用いて測定又は解析す る方法である。
この方法を用いてタンパク質一分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 抗 原となる C末端ラベル化タンパク質を上記した方法により固相化されていること が必要である。 また抗体となる標的分子は上記した標識物質により標識ィ匕されて いることが必要である。
抗原となる C末端ラベル化夕ンパク質を固相化するための基盤としては、 通常 E L I S Aに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることがで きる。
本方法において抗体となる標識化標的分子を固相分子へ接触せしめる方法とし ては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるもの であってもよいが、 好ましくは標識化標的分子を生化学的に通常使用される緩衝 液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、 これをマイクロプレートに注入する方 法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、 好ましくは過剰に存在する固相化分子に結合してい ない標識化分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、 固相上にとどまった標 識分子から発せられる蛍光を、 市販の E L I S Aリーダー等を用いて測定あるい は解析することにより、 固相化された抗原分子と相互作用する分子を同定するこ とができる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記マイク 口プレートの各穴にそれそれ異なる複数の標識化標的分子を固相化する方法が用 いられる。
( 3 - 5 ) 蛍光偏光解消法
蛍光偏光法 (Perran, J., et al. , J. Phys. Hadリ 丄, 390-401( 1926)) は、 蛍 光偏光で励起された蛍光分子が、 励起状態の間、 定常状態を保っている場合には 同一の偏光平面で蛍光を放射するが、 励起された分子が励起状態中に回転ブラウ ン運動等を行った場合に、 放射された蛍光は励起光とは異なった平面になること を利用する方法である。 分子の運動はその大きさに影響を受け、 蛍光分子が高分 子である場合には、 励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、 放射光は偏光を
保ったままになっているのに対して、 低分子の蛍光分子の場合は、 運動速度が速 いために放射光の偏光が解消される。 そこで、 平面偏光で励起された蛍光分子か ら放射される蛍光の強度を、 元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、 両平面の 蛍光強度の割合からこの分子の運動性及びその存在状態に関する情報が得られる ものである。 この方法によれば、 夾雑物があってもこれに影響されることなく、 蛍光ラベル化された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。 これは蛍 光ラベル化された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、 偏光度の変化とし て測定されるからである。
この方法を行うための装置としては例えば BECON (Panyera社製)等が市販され ており、 本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いてタンパク質一分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C 末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供する必要であ る。 標的分子は標識の必要はない。 また相互作用を調べようとする C末端ラベル 化タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、 C末端ラベル化タンパク質のブ ラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法において C末端ラベル化タンパク質に標的分子を接触せしめる方法とし ては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるもの であってもよいが、 好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ゥエルに通常生 化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度で C末端ラベル化タンパク質溶解した 溶液を投入し、 さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入す る方法によって行われる。
本方法において測定する C末端ラベル化タンパク質及び標的分子との間の相互 作用は、 必ずしも抗原抗体方法ほど特異性は高くないことが考えられるため、 最 適の組み合わせを検出するためには、 相互作用の程度を数値化することが有効で ある。 相互作用の程度を示す指標としては、 例えば一定濃度の C末端ラベル化夕 ンパク質に対して、 極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いること ができる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記蛍光偏 光解消法測定装置の各測定用ゥエルにそれそれ異なる複数の C末端ラベル化夕ン パク質を投入し、 これに特定の標的分子溶液を投入するか、 あるいは特定の C末 端ラベル化タンパク質を投入し、 各ゥエルに互いに異なる複数種の標的分子溶液 を投入する方法が用いられる。
( 3 - 6 ) 蛍光相関分光法
笛光相関分光法 (Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) : Eigen, M. , et al . , Proc. Natl. Acad. Sci . USA, , 5740-5747( 1994) ) は、 共焦点レーザ
—顕微鏡等の下で、 粒子の流動速度、 あるいは拡散率、 容積収縮等を測定する方 法であり、 本発明においては、 C末端ラペル化タンパク質と標的分子間の相互作 用により元のラベル化分子 1分子の並進ブラゥン運動の変化を測定することによ り、 相互作用する分子を測定することができる。
具体的には資料粒子が励起光により励起されて、 資料液容積の一部において蛍 光を放射し、 この放射光を測定し光子割合を得る。 この値は、 特定の時間に観測 されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。 上述した種々のパラ メタ一は自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。 この FCSを 行う為の装置もカールツァイス (Zeiss)社等から市販されており、 本方法におい てもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いてタンパク質—分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C 末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供することが必 要である。 標的分子は標識の必要はない。 また相互作用を調べようとする C末端 ラベル化タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、 C末端ラベル化タンパク 質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。 本方法において C末端ラベル化タンパク質に標的分子を接触せしめる方法とし ては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるもの であってもよいが、 好ましくは市販の F C S用装置の測定用ゥエルに通常生化学 的に用いられる緩衝液等に適当な濃度で C末端ラベル化タンパク質溶解した溶液
を投入し、 さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方 法によって行われる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記 F C S 用測定装置の各測定用ゥエルにそれそれ異なる複数の C末端ラベル化タンパク質 を投入し、 これに特定の標的分子溶液を投入するか、 あるいは特定の C末端ラベ ル化タンパク質を投入し、 各ゥエルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入 する方法が用いられる。
( 4 ) 相互作用する分子の同定方法
上記 (3 ) のそれそれの方法により測定され C末端ラペル化タンパク質との間 に相互作用が認められた分子は、 該分子の一次構造が未知の場合、 それ自体既知 の適当な方法により、 その一次構造を解析することができる。 具体的には、 相互 作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、 ァミノ酸分析装置等によりアミ ノ酸配列を解析し、 一次構造を特定することができる。 また、 標的分子が核酸の 場合には、 塩基配列決定方法により、 オート D N Aシーケンサーなどを用いれば 塩基配列を決定することができる。
( 5 ) C末端ラベル化タンパク質の固相化のための装置
上記 ( 1— 3 ) に記載した C末端ラベル化タンパク質のラベル部を介した固相 への固定化方法を行うために、 既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築する こともできる。 本装置における各手段自体はそれそれ既知のものであり、 これら の手段における、 基盤の保持、 C末端ラベル化タンパク質溶液の添加、 洗浄等の 各操作は、 それ自体既知の方法により行えばよい。 これらの操作を組み合わせ、 全自動又は半自動の、 C末端ラベル化タンパク質の固相化のための装置を構築す ることができる。
( 6 ) タンパク質—分子間相互作用測定のための装置
上記 (3 ) に記載したタンパク質一分子間相互作用測定を行うために、 既知の 適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。 本装置における各手段 自体はそれそれ既知のものであり、 これらの手段における、 基盤の保持、 標的分
子の添加、洗浄、信号検出等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。 これらの操作を組み合わせ、 全自動又は半自動の、 タンパク質—分子間相互作用 測定のための装置を構築することができる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 下記の実施例は本発 明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本発明の範囲は下 記の実施例により何ら制限されるものではない。
雜俐 1 ス トップコ ドン》削除し 銪 』》用い タンパク晳の C主蹦ラベルの 効率化の解木斤
( 1 ) 転写用 DNAの構築と mRNAの作成
転写効率の高い大腸菌ウィルス T 7の RN Aポリメラ一ゼによって認識される DNA配列 (T 7プロモー夕一配列) と翻訳の際に真核細胞のリボゾームによつ て認識されやすい DNA配列 (Ko z akコンセンサス配列) を持つ領域、 及び その下流に/?—ラクタマーゼをコ一ドする DNAが連結した DNA断片を、 次の ようにして構築した。
まず、 T 7プロモー夕一配列 (Rosenberg, A.H., et al., Gene, 5£, 125-135 (1987)) と Ko z akコンセンサス配列を含む 1本鎖 DNA (配列番号 1 ) を化 学合成し、 DN Aプライマー (配列番号 2) と DNA/RNAプライマ一 (配列 番号 3) によってポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 一方、 ラク夕 マ一ゼ遺伝子を、 DNA/RNAプライマ一 (配列番号 4) と DN Aプライマー
(配列番号 5) で PCRすることにより、 ?—ラク夕マ一ゼをコードする DNA を増幅した。 これらを RRR法 (Nishigaki, K., et al., Chem. Lett., 131-132(1995))に従って、 それそれの PCR反応液にリボヌクレア一ゼ A (シグ マ社製) を加え、 60°Cで 30分反応させることによって DNA/RNAプライ マー (配列番号 3, 4) の RNAの 3, 側のリン酸ジエステル結合を切断して突 出末端を作った。 これらをフエノール抽出後、 プライマ一リムーバー (Primer
remover: Edge Biosystems社製) によってプライマ一及び切断された D N A断片 を除去し、 エタノール沈殿を行った。 沈殿を乾燥後、 T4DNAリガ一ゼ用バッ ファーに溶解し、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ (Polynucleotide Kinase: NEB 社製) を加えて 45°C、 30分反応後、 さらに 30分かけて徐々に 16°Cに温度 を下げてから T4DNAリガ一ゼ (NEB社製) を加え、 上述の 2つの DNA領域 を結合させた。 この反応液の一部を採取し、 DNAプライマ一 (配列番号 2及び 5)を使って再度 PCRで増幅し、転写用鎵型とした。 P C Rは Ampl iTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-E lmer社製)を用いた。
6—ラク夕マーゼのストヅプコドンを除いた DNAプライマ一 (配列番号 6) を上記 DNAプライマー (配列番号 5) の代わりに用いて上記と同様の操作を行 うことにより、 ストップコドンを除いた/?ーラクタマ一ゼをコードする DNAを 含む転写用錶型を作成した。
このようにして作成したストヅプコドンを有する ラク夕マーゼをコ一ドす る DNA、 及びストップコドンを除去した/?—ラク夕マーゼをコ一ドする DNA は、 RNA合成キッ 卜 (Ribomax Large Scale RNA Production System: Promega 社製) を用いて転写し、 RNAとした。 合成効率を上げるためにキャップアナ口 グ(RNA capping Analogue :GibcoBRL社製)を用い、 m腿の 5,末端を修飾した。 キヤップアナログ及び過剰の基質(NTP)を除去するためにプライマ一リム一バ一
(Edge Biosystems社製) を使ってエタノール沈殿を行った。
(2) 蛍光ラベル化試薬の調製
ピューロマイシン(Puromyc in: SIGMA社製)を 3 m 1の乾燥ピリジンに溶解し、 減圧下で蒸発させ、脱水させた。この操作を 3回繰り返した。これに 5 mlの 4% テトラゾ一ル /ァセトニニトリル溶液とフルォレダイ ト(6- N- carboxy-di-O- pivaloyl-f luorescein-hexyl-0-(2-cyanoethyl)-(N,N' - diisopropyl) - phosphoamidite:日本パーセブティブ社製)を加え、 室温で攪拌した。反応はシリ 力ゲルの薄層クロマトグラフィー(TLC、 展開溶媒、 クロロフオルム:メタノール = 9 : 1) でモニターした。 通常、 反応は 2時間で終了する。 反応後、 溶媒を減
圧下で追い出し、 これに 0. 1Mのヨウ素をテトラヒドロフラン/ピリジン/水 = 80 : 40 : 2に溶解した溶液 2mlを添加し、 室温で攪拌しながら生成した フォスファイ トトリエステルを酸化させた。 90分後、 溶媒を減圧下で除去し、 残部をクロロフオルムで抽出した。 抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥 させた後、 減圧下で溶媒を除去した。 これをシリカゲル TLCに供し、 クロロフォ ルム /メタノール =90 : 10で溶出させた。 保護基のついたフルォレセ二ルビ ュ一ロマイシン (Fluorpur) はシリカゲル TLCでクロロフオルム /メタノール = 90 : 10で溶出させた場合、 RfO. 26の分画に溶出された。
溶出された保護基のついた Fluorpurを濃アンモニア水/エタノール = 2: 1の 混合溶液 lmlに加え、 ーシァノエチル基を除去した。 この反応により
Fluorpurが 7 mg得られた。 合成品が Fluorpurであることは、 その pH9の溶 液の紫外可視吸収スペクトルが 272 nm (ピューロマイシン部由来) と 494 nm (フルォレセィン部由来) に現れること、 MALDI/T0Fマススぺクトロメ トリ —で [M+H] +の分子イオンが m/zl010に現れることから同定された。
(3) C末端ラベル化タンパク質の作成
上記 (1)で作成した mRNAはゥサギ網状赤血球無細胞翻訳系 (Rabit
Reticulocyte Lysate Systems, Nucleease Treated:Promega社製)、 及び小麦胚芽 無細胞翻訳系 (Wheat Germ Extract :Promega社製) を用い、 上記 (2) で作成し た Fluorpurを最終濃度 16 Mになるように加え、それそれの至適反応温度(ゥ サギ網状赤血球無細胞翻訳系: 30°C、 小麦胚芽無細胞翻訳系: 25 C) で 60 分反応させた。
(4) タンパク質のラベル化の確認
上記 ( 3 ) の各無細胞翻訳系反応液を SDSポリアクリルァミ ド電気動
(SDS- PAGE)で Schaggerらの方法(Schagger, H. and von Jagow, G., Anal. Biochem. 166, 368- 379(1987))により 20V定電圧にて 90分電気泳動したゲルを蛍光ィメ —ジングアナライザ一 (Fluor Imager 595 -.Molecular Dy腿 ics社製) で笛光量 を測定することにより行った。
最も効率よく蛍光ラベル化された/?—ラク夕マ一ゼタンパク質は、 ストップコ ドンを削除した/?ーラク夕マ一ゼ mRNAを用いて小麦胚芽無細胞翻訳系により作 成したものであった。 同様の系でストヅプコドンのある/?—ラク夕マ一ゼをコ一 ドする DNAから転写した Aを用いた場合に加え、 ラベル化効率は 10倍以上 であった。
またゥサギ網状赤血球無細胞翻訳系においてもストップコドンを削除した/?一 ラク夕マ一ゼをコードする DNAから転写した RNAを用いた場合、 ストップコド ンのあるものよりもラベル化効率が 3〜 4倍高かった。 幸施例 2 钳^ ΰ 消法》田い Cま端ラベルイ hプロテイン Aの一 Ώ卜'メイ ン ヒト T gG の ffl百作 fflの解析
(1) Bドメインをコードする DNA断片の構築とその mRNAの構築
転写効率の高い大腸菌ウィルス T 7の RN Aポリメラーゼによって認識される DNA配列 (T 7プロモーター配列) と翻訳の際に真核細胞のリボソームによつ て認識されやすい配列(Ko z a kコンセンサス配列) と原核細胞のリボソーム によって認識されやすい配列 (シャイン ·ダルガーノ配列: Shine-Dalgarno) を 有し、 その下流にプロテイン Aの Bドメインをコードした DNA断片を、 次のよ うにして構築した。
まず、 T 7プロモー夕一配列と Ko z a kコンセンサス配列及びシャイン ·ダ ルガーノ配列を有する領域と Bドメインをコ一ドする配列を有する領域の DN A を独立して作成した。 T 7プロモー夕一配列(Rosenberg, A.H., etal., Gene, 125-135 (1987)) と K o z a kコンセンサス配列及びシャイン ·ダルガーノ配列 を含む 1本鎖 DNA (配列番号 7) を有機合成し、 DNAプライマ一 (配列番号 8) と Bドメインの一部をコードしたプライマ一 (配列番号 9) によってポリメ ラ一ゼ連鎖反応(P CR)を行った。 DNA合成酵素は、 TaKaRaEx Taq Polymerase (宝 酒造社製)を用いた。
一方、 プロテイン A遺伝子を載せた pR I T 2 Tプラスミ ド (New England
Biolab.社製)を錡型として配列番号 8のアンチセンスプライマー(配列番号 10 ) と DNAプライマ一 (配列番号 1 1) を用いてポリメラ一ゼ連鎖反応を行うこと により、 Bドメインをコードする DNA領域を増幅した。 これらの 2つの P CR 産物を重複伸長 (Overlap extension ) 法(Horton R.M., et al., Gene 77, 61-68 (1989)) に従って、 結合させ、 2つの DNAプライマ一 (配列番号 8及び配列番号 1 1)で PCR することにより Bドメインをコードする DN A断片を作成した。 い ずれの PCRにおいても DNA合成酵素は、 TaKaRaEx Taq Polymerase (宝酒造社製) を用いた。
上記した方法で作成した DNA を、 反応液 100 l 当たり 10〃g加え、 RNA合 成キヅ卜 Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega社製) を使つ て mRNA に転写した。 翻訳効率を上げるためにキャップアナログ (RNA capping Analog; Gibco BRL社製) を最終濃度が 7.2 mMになるように加え、 mRNAの 5'側 を修飾した。 キャップアナログ及び過剰の NTP (ヌクロォチド 3リン酸) を除去 するために、 プライマ一除去剤 (Primer Remover:Edge Biosystems社製) を使つ てエタノール沈殿を行った。
(2) 光ラベレイ匕試薬 Fluorescein—puromycin (Fluorpur)c 調製
ビューロマイシン (puromycin: Sigma社製)、 26mg (48 UEOI) を 3ml の 乾燥ピリジンに溶かし、 減圧下で蒸発させ、 脱水させた。 この操作を 3回繰り返 した。 これに 5 ml の 4% テトラゾール / ァセトニトリル溶液とフルォレダイ ト (6 - N - carboxy - dト 0-pivaloyト fluorescein - hexyト 0 - (2 - cyanoethyl) - (N,N, - diisopropyl)-phosphoamidite: 日本パ一セブティブ社製)を加え、 室温で攪拌さ せた。 反応はシリカゲルの薄層クロマトグラフィー (TLC 、 展開溶媒: クロロホ ルム:メタノール = 9:1)でモニターした。 通常、 反応は 2時間で終了する。 反応 後、 溶媒を減圧下で追い出し、 これに 0.1M のヨウ素をテトラヒドロフラン/ ピ リジン/ 水 = 80 : 40 : 2に溶かした溶液 2mlを加え、 室温で攪拌させながら 生成したホスフアイ ト一トリエステルを酸化させた。
1時間半後、 溶媒を減圧下で除去し、 残部をクロロフオルムで抽出した。 抽出
液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させ、 溶媒を除去した。 これをシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー (メルク社製) にかけ、 クロ口ホルム/ メタノール
= 9 0 : 1 0で溶出させた。 保護基のついた Fluorpur はシリカゲル TLC (展閧 溶媒:クロ口ホルム :メタノール = 9 : 1 ) で Rf 0.26のところに溶出された。 次に保護基の脱保護を行なった。
保護基のついた Fluorpur を濃アンモニア水/ エタノール = 2 : 1の混合溶液 l mlに加え、 ?—シァノエチル基を除去すると Fluorpur が 7mg得られた。合成 品が Fluorpur であることは、その pH 9の溶液の紫外可視吸光スぺクトルが 272nm
(ピューロマイシン部由来) と 494 nm (フルォレセイン部由来) に現れること ならびに、 MALDI/T0F マススぺクトロメ トリーで、 分子イオンが m/z 1010に現れ ることから同定された。
( 3 ) C末端ラベル化タンパク質の作成
作成した mRNAは、 無細胞翻訳キット E. coli S30抽出物 (Promega社製) を用 いた翻訳系において、 フルォニルビユ一口マイシン(Fluorpur) の最終濃度が 16 mMになるように加え、 37°Cで 6 0分反応させた。 未反応の Fluorpur を取り除く ために、 25 mlの TBS 緩衝液 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)で平衡化 した PD-10 カラム (BIO- RAD 社製) で溶出した。 最初の 1.6 mlのフラクション にラペル化された Bドメインが溶出した。 電気泳動で確認するためには、 さらに Centricon 3 (アミコン社製) で遠心し、 1 3 0〃1 程度まで濃縮した。
( 4 ) タンパク質のラベル化の確認
上記(3 )の各無細胞翻訳系反応液を SDSポリアクリルアミ ド電気動(SDS-PAGE) で Schaggerらの方法 (Schagger, H. and von Jagow, G. , Anal Biochem. , 166, 368-379 ( 1987) )により 2 O V定電圧にて 9 0分電気泳動したゲルを蛍光イメージ ングアナライザー (Fluorlmager 595 : Molecular Dynamics社製) で蛍光量を測 定することにより行った。
さらに、 pH.9の溶液中で 494 nmの吸光度から求めたフルォレセインを指標と して、 蛍光分光光度計 (R F— 5 0 2 :島津社製) を使用してラベル化された B
'質の濃度を測定した。
(5) 蛍光偏光解消測定装置による Bドメインとヒト IgG との相互作用の解析 ラベル化された Bドメインタンパク質濃度を 0.1 から InM程度にして、 ヒト IgG (SIGMA社製) を 10段階に希釈することで、 0.01 nM から 10〃Mの濃度の サンプルを作成し、 これに加えた。 30分、 室温で静置した後、 蛍光偏光解消測 定装置 (BEAC0N2000, PanVera社) によって、 その偏光度を測定した。 各ヒト IgG の濃度に対する偏光度の結果を第 4図に示した。 この測定値に基づき、 解離 定数をもとめた結果、 KD=6.4xlO—8であった。 これは、 既知のデ一夕と良く一致 した。 荬施例 3 ピオチン化タンパク暂のストレブトアビジンメンプレンへの^ 化 ( 1) GFPuv4をコードする DNA断片の構築とその mRNAの構築
T7プロモー夕一配列と Kozakコンセンサス配列及びシャイン ·ダルガーノ配列 を含む 1本鎖 DNAを錶型として、 プライマー DNA (配列番号 8) と GFPuv4の一 部をコードしたプライマ一(配列番号 12 )によってポリメラ一ゼ連鎖反応(PCR) を行った。 DNA合成酵素は、 KOD Polymerase (東洋紡社製)を用いた。
一方、 GFPuv4 (Ito, Υ·, etal., Biochem Biophys Res. Co腿 un, 2M(2), 556-60 (1999)) をコードする DNAを錶型として配列番号 12のアンチセンスプライマ 一(配列番号 13) と GFP遺伝子の 3, 末端プライマ一 (配列番号 14) を用い てポリメラ一ゼ連鎖反応を行うことにより、 GFPuv4をコードした DNA領域を増幅 した。
これらの 2つの PCR産物を重複伸長(Overlap extension)法(HortonR.M., etal., Gene, 77, 61-68 (1989)) に従って結合させ、 2つの DNAプライマー (配列番号 8及び配列番号 14) を用いて PCRを行うことにより T7プロモーターの下流に GFPuv をコードする DNAが結合した DNA鎖を作成した。いずれの PCRにおいても DNA合成酵素は、 KOD Polymerase (東洋紡社製) を用いた。
上記した方法で作成した DNA を、 反応液 100 μ.\ 当たり 10 g加え、 RNA合
成キッ卜 Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega社製) を使つ て mRNA に転写した。 翻訳効率を上げるためにキャップアナログ (RNA capping Analog; Gibco BRL社製) を最終濃度が 7.2 mMになるように加え、 mRNAの 5'側 を ί彦飾した。 キャップアナログ及び過剰の ΝΤΡ (ヌクロォチド 3リン酸) を除去 するために、 プライマー除去剤 (Primer Remover: Edge Biosystems 社製) を使 つてェ夕ノ一ル沈殿を行つた。
( 2 ) ビォチンラベル化試薬 Motin-puromycin (Biotin-Puro) の調製
ァミノ基と 5 '水酸基をそれそれトリフルォロアセチル基とジメ トキシトリチル 基で保護したビューロマイシン (SIGMA社製) を 3, 水酸基を介して固相担体
(NovasYn TG amino resin LL: Nova Biochem社製) に結合させ、 ホスホアミダ ィ ド法により、核酸合成機(ABI 3498:Perkin Elmer社製)上で Biotin (Biotin TEG Phosphoramidide :グレンリサーチ社)、 あるいは PEGスぺーサ一(Spacer 18:グレ ンリサーチ社製) を結合させた後に脱保護を行った。
( 3 ) タンパク質のラベル化
作成した mRNA 2 Ai gは、無細胞翻訳キット小麦胚芽抽出物 (Promega社製) を 用いた翻訳系において、 500〃Mピオチンビュー口マイシン(Biotin-puro) 2〃 1、 又は 500 / Mポリエチレングリコ一ルビユ一ロマイシン (PEG-puro) 2 1をそ れそれ加え、 2 6 °Cで 6 0分反応させた。 未反応の Biotin- puro 又は PEG- puro を取り除くために、 25 1111の183 緩衝液 (10 mM Tris- HC1 , 150 mM NaCl, pH 8.0) で平衡化した PD-10 カラム (BIO- RAD社製) で溶出した。
( 4 ) タンパク質のラベル化の確認
ピオチンビューロマイシン(Bi otin-puro ) でラベル化されたタンパク質の確認 は、 上記のサンプルを各 1 5〃1取り、 SAM2 Biotin Capture Membrane (Promega 社製)にスポットし、 1 0分間静置した後、 このメンブレンを TBS 緩衝液 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)で洗浄した。 この TBS緩衝液の洗浄の前及び後 に、 FluoroImagerFX (Bio- Rad社製) を用いてメンブレン上の蛍光強度をィメ一 ジした。 この結果を第 5図に示す。 TBS緩衝液で洗浄する前は、 Biotin-puroと
PEG-puroのそれそれが同様の強度を示したが、 洗浄後は PEG- puroでラベルされ た GFPuv4は洗い流されていた。一方 Biotin- puroによってラベル化された GFPuv4 はメンブレンにピオチンにより固定ィ匕された。 施. W 光ィ メージアナライザー》用い ピオチンィ プロティ、ノ Ώ ' イン ヒト 1 の相?作用の解析
( 1)プロティン A、 : Bドメイン及び GFPuv4をコードする DNA断片の構築とそ の RMの構築
T7プロモー夕一配列と Kozakコンセンサス配列及びシャイン ·ダルガーノ配列 を含む 1本差 DNA (配列番号 7) を銪型としてプライマー DNA (配列番号 8) とブ ロティ ン八、 B ドメイ ンの一部をコードした塩基配列及びリンカー配列 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser をコードする塩基配列) を含むプライマ一 (配列番号 1 5 ) によってポリメラ一ゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 DNA 合成酵素は、 K0D Polymerase (東洋紡社製)を用いた。
一方、 GFPuv4 (Ito, Yつ etal., Biochem Biophys Res. Co腿 un, 2), 556-60 (1999)) をコードする DNAを铸型として配列番号 1 5のリンカ一配列のアンチ センス配列及び GFPuv4の一部をコードする塩基配列を含むプライマ一(配列番号 16) と GFPをコードする DNAの 3, 末端プライマ一 (配列番号 14) を用い てポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、 5, 末端にリンカ一配列が結合した GFPuv4をコードする DNA領域を増幅した。
これらの 2つの PCR産物を重複伸長(Overlap extension )法(Horton R.M., et al. Gene, 77, 61-68 (1989)) に従って、 結合させ、 2つの DNAプライマ一 (配列番 号 8及び配列番号 14)を用いて PCRを行うことにより T7プロモーターの下流に プロテイン A、 Bドメインをコードする DNA、 及びリンカ一配列を介して GFPuv4 をコードする DNAが結合した DNA鎖を作成した。 いずれの PCRにおいても DNA合 成酵素は、 KOD Polymerase (東洋紡社製) を用いた。
上記した方法で作成した DNA を、反応液 100 j l 当たり 10 g 加え、 A合
成キット Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega社製) を使つ て mRNA に転写した。 翻訳効率を上げるためにキャップアナログ (RNA capping Analog; Gibco BRL社製) を最終濃度が 7.2 mMになるように加え、 mRNAの 5'側 を修飾した。 キャップアナログ及び過剰の NTP (ヌクロォチド 3リン酸) を除去 するために、 プライマ一除去剤 (Primer Remover: Edge Biosystems社製) を使つ てェ夕ノ一ル沈殿を行った。
(2) ピオチンラベル化試薬 Biotin- puromycin ( Biotin-Puro) の調製
ァミノ基と 5 ' 水酸基をそれそれトリフルォロアセチル基とジメ トキシトリチ ル基で保護したピューロマイシン (SIGMA社製) を 3, 水酸基を介して固相担体
(NovasYn TG amino resin LL: Nova Biochem社製) に結合させ、 ホスホアミダ ィ ド法により、 核酸合成機 (ABI 3498:Perkin Elmer社製) 上で PEGスぺーサー
( Spacer Phosphoramidide 18:グレンリサーチ社製)、 Biotin (Biotin TEG Phosphoramidide:グレンリサーチ社)、 を順次結合させた後に脱保護を行った。
(3) タンパク質のラベル化
作成した mRNA 2 / gは、 無細胞翻訳キット小麦胚芽抽出物 (Promega社製) を用いた翻訳系において、 500 /Mピオチンピュー口マイシン(Biotin-puro) 2 j 1を加え、 2 6°Cで 6 0分反応させた。未反応の Biotin- puroを取り除くために、 Bio-spinカラム (BI0-RAD社製) でゲル濾過を行った。
(4) C末端ピオチンラベル化 Bドメイン一 GFPuv 4結合タンパクの固定化 上記 (3) で作成した C末端ピオチンラベル化 Bドメイン一 GFPuv 4結合 タンパク (Biotin-DomainB-GFPuv4) を SAM2 Biotin Capture Plate(Promega社製) 各ゥエルに 5 0 1ずつ加え、 1 5分間静置した後、 各ゥエルを TBS 緩衝液 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)で洗浄した。 次に Biotinと結合しなかった プレートに接着したストレブトアビジンをコートするために、 1 mM Biotin/PBS 100 1を加えた。その後 200〃 1の TBS緩衝液で 5回ゥエルを洗浄した。次に 1 % BSA (SIGMA社製) /PBSでブロッキングした。 またコントロールとして Biotin- DomainB-GFPuv4を固定化していないゥエルも同様にブロヅキングした。
( 5 )蛍光イメージングアナライザ一による固相化 Bドメインとヒト IgG との相 互作用の解析
上記 (4 ) で作成した Biotin-DomainB-GFPuv4を固定ィ匕した、 又は固定化して いない SAM2 Biotin Capture Plateの各ゥエルに、 Bドメインと affinityの高い Monoclonal Ant i -Human IgG I Biotin Conjugate (Mouse IgG2a isotype) (SIGMA 社製)あるいは、 Bドメインと affinityの低い Biotin-Mouse Monoclonal Anti-Human IgA I (mouse IgGl isotype) (SIGMA社製)を PBS緩衝液で 5万倍に希 釈したものを加え、 1時間静置した。 この各ゥエルを TBS緩衝液で 3回洗浄した 後、 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase( SIG A社製)を加え、 1 0分間静置後、 TBS緩衝液で 3回洗浄した。 さらに Attphos substrate (Amersham pharmacia biotech社製)を加え、 室温で 2 0分反応させた。 これを蛍光イメージングアナラ ィザ一 (FluorImager FX:Bio- Rad社製) を用いてイメージングした結果を第 6図 に示した。
Biotin-DomainB-GFPuv4を固定ィ匕していないゥエルにはバックグラウンドの蛍 光しか観察されず、 Biotin-DomainB-GFPuv4を固定化した各ゥエルにおいては、 Bドメインと affinityの高い Mouse IgG2a isotypeを投入したゥエルにおける蛍 光が、 affinityの低い mouse IgGl isotypeを投入したゥエルにおける蛍光より 強くなつており、 相互作用の強度を測定、 解析することができた。 産業上の利用可能性
本発明により、 現在急速に蓄積されている遺伝子の塩基配列がコードするタン パク質の機能解析、 例えばタンパク質—タンパク質相互作用、 タンパク質—核酸 相互作用、 タンパク質一低分子化合物相互作用等の解析を迅速化するための手段 が提供される。 また、 本発明により、 タンパク質の機能解析において不可欠であ る大量のデ一夕を迅速に解析する方法 (ハイスループット化) において有力な手 段が提供される。