WO2001014560A1

WO2001014560A1 - GENES PROTEINES CODANT POUR DES PROTEINES REGULANT LE pH DE VACUOLES

Info

Publication number: WO2001014560A1
Application number: PCT/JP2000/005722
Authority: WO
Inventors: Shigeru Iida; Sachiko Tanaka; Yoshishige Inagaki
Original assignee: Suntory Limited
Priority date: 1999-08-24
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2001-03-01
Also published as: JP4596721B2; AU784725B2; EP1123977B1; ATE491792T1; CA2348025C; US6803500B1; AU6729500A; EP1123977A1; CA2348025A1; DE60045366D1; EP1123977A4; NZ511367A

Description

明細書液胞の pHを制御する蛋白質をコ一ドする遺伝子発明の技術分野

本発明は液胞の pHを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子およびその利用方法に関するものである。背景技術

花き産業においては、顕花植物の新規なあるいは多様性に富んだ新品種の開発が重要であり、なかでも、花の色は花きの最も重要な形質のひとつである。交配による従来の育種により、さまざまな色の品種が育種されてきたが、単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれであり、さまざまな色の品種開発が望まれている。花の色の主な成分は、アントシァニンと総称されるフラボノィドの一群の化合物である。植物には多様なアントシァニンが存在することは知られており、それらの多くの構造が既に決定されている。アン卜シァニンの色は、一部は、その構造に依存している。アントシァニンの生合成に関わる酵素や遺伝子に関しても研究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導入により、アントシァニンの構造を変換し、花の色を変えた例もある（Plant Cell, 7 (199 5) Holton and Cornish, p.1071 、 Plant Cell Physiol.39 (1998)

Tanaka et al, pll 19. ) 。また、アントシァニンの色は、水溶液の pHにも依存し、同じアントシァニンでも水溶液の pHが中性から弱いアルカリ性で青く見える（現代化学、（ 1998年 5 月）本田と斉藤、 P.25) 。

アン卜シァニンは細胞の液胞に存在するため、液胞の pHが花の色に大きな影響を与えることも知られている（Plant Cel 1, 7 (1995) Ho 1 ton and Cornish ， Trends Plant Sci. ό (1998) Mo 1 et a 1. p212 ) 。たとえば、アサガオ（Ipomea tricolor) においては、赤紫色のつぼみが開花したときに青くなるのは、花弁上皮細胞の液胞の 1]が6.6 から 7.7 に上昇するためであることが知られている（Na ture, 373 (1995), Yoshida et al. p291) 。

植物細胞の液胞はおもに液胞プロ卜ン輸送 ATPaseと液胞プロトン輸送ピロフォスファターゼによって制御されているとされる（The Plant Vacuole, (1997) Leigh et aし Academic Press ) 力 ^s、、これらのプロトンポンプが花の色にどのように関わっているかは明確ではない。また、ナトリウムイオン- プロトンアンチポーター（以下、 Na⁺ 一 H + アンチポーターと記載）が植物の液胞に存在すること、また、 Na+ — H + アンチポーターは、液胞の外と中のプロ卜ン濃度勾配に依存してナトリゥムイオンを液胞内に輸送し、その際プロ卜ンが液胞外に輸送され、プロトン濃度勾配が減少することが知られていた。

さらに、 Na+ — H + アンチポーターは、分子量約 17万の蛋白質であることが示唆されていた。しかしながら、液胞の pHの制御には多くの未知の要因があり、どのようにして液胞、特に花弁液胞の pHが制御されているのかは、不明確である（以上 The Plant Vacuole, (1 997) Leigh et al. Academic Press) 。また、植物液胞の pHを人為的に上昇させ、産業上有用な形質が得られたこともなく、花の色との関連も不明である。

また、分子量約 7 万の Na+ — H + アンチポ一ター遺伝子がァラビドプシスからクロ一ユングされ、この遺伝子を導入した酵母は耐塩性を獲得したことは知られているが（Pro Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) Gaxiola et ai. pl480 〜1485) 、このアンチポーターが植物細胞の液胞の pHを制御しているかどうか、あるいは花の色に関わっているかどうかは知られていない。

一方、ペチュニアには花弁の液胞の pH制御に関わつている遺伝子座が 7 種あることがわかっており、これらのうちの一つがホモの劣性になることにより花弁の液胞の pHが上昇するとされている（Plan t J. 13 (1998) van Houwel ingen et aし P39, Trends Plant Sci. 3 (1998) Mol et al. p212) 。そのうちの一つ Ph6 はすでにクローン化されていて、転写調節因子の一種であることがわかったが（ Plant Cell 5 (1993) Chuck et al. p371) 、実際にどのような生化学的な機構で液胞の pHを制御しているかは不明である。

また、アサガオ（ Ipomea nil) においては、変異体の解析から花と葉の色や形に関わる遺伝子座がいくつかあり、これらのうち 1 9 が易変異性であることが知られている（植物細胞工学シリーズ 5 (1 996) pl32,飯田ら秀潤社、 Annaし New York Acad. Sci. , (1999) I ida et al. p870) 。これらの内で、青色ではなく紫色の花を咲かせるようになった劣性の変異により規定される 1遺伝子座を Purple 退 1 十座と呼ひ、 Γ. Hagiwara (1931) The genetics of flower co 1 ours in Phrarb i t i s nil. J. Coll. Agr. Imp. Univ. Tokyo 51， 241-262. ； Y. Imai (1931) Analysis of flower col our in Pharb i tis nil. J. Genet. , 24: 203-224. ) 、紫の花弁に青いセクタ一を生じる花を咲かせる易変性変異のァリールは、 purple- mutable (pr -m) と名付けられた（J. Col 1. Agric. Imp. Univ. Tokyo, 12 (193 4) Imai, p479)。なお、 Purple遺伝子座に由来する遺伝子を Purple 遺伝子と記す。

この青い部分は劣性の purpleからの体細胞復帰突然変異により生じたと考えられ、さらに生殖細胞復帰突然変異体も分離できる。これら復帰突然変異体の復帰突然変異により生じたァリールをここでは Purp l e- r eve r tan t (Pr ）と名付ける。このような古典遺伝学的解析は、この Purp l e遺伝子に関しては行われていたが、この Purp l e遺伝子の実体や花弁液胞の pHの調節との関連等は全く不明であった。液胞の pHを改変できれば、たとえば液胞の pHを上昇させることにより、花の色を青くすることができるであろうと考えられる。青い色のない植物種の代表例として、バラ、キク、カーネーション、ガ —ベラなどがあり、これらはきわめて重要な切り花である。液胞 pH の改変の重要性は認識されてきたが、いままでに花弁の液胞の pHを制御する蛋白質の実態は不明であり、これをコードする遺伝子の単離が望まれていた。発明の開示

本発明は、植物細胞の液胞の pHを制御する蛋白質の遺伝子、好ましくは液胞でプロトンを輸送する蛋白質の遺伝子、より好ましくは Na + — H + アンチポーター遺伝子を提供しょうとするものである。本発明の遺伝子を植物に導入し、発現させることで、花色を調節し、好ましくは青色化することが可能である。

従って、本発明は、液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子は、好ましくは Na + — H ⁺ ァンチポーターをコ一ドする遺伝子であり、例えば、配列番号： 2記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、あるいは配列番号： 2 記載のァミノ酸配列に対して 1 個又は複数個のァミノ酸の付加、欠失及び Zまたは他のァミノ酸による置換により修飾されているァミノ酸配列を有し、且つ液胞の p Hを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子；配列番号： 2記載のアミノ酸配列に対して 20% 以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子；あるいは配列番号： 2 記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸の一部または全部に対して、ストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である。

本発明はまた、前記の遺伝子を含んでなるべクターを提供する。本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明はまた、前記の遺伝子によってコードされる蛋白質を提供する。

本発明はさらに、前記の宿主細胞を培養し、又は生育させ、そして該宿主細胞から液胞の P Hを制御する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法を提供する。

本発明はまた、前記の遺伝子、または前記のべクターが導入された植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫またはそれらの組織を提供する。

本発明はまた、前記の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切り花を提供する。

本発明はさらに、前記の遺伝子、または前記のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、液胞の p Hを制御する方法を提供する。

本発明はさらに、前記の遺伝子、または前記のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、植物体の花の色を調節する方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、プラスミド p SPB 6 0 7 の構造を示す図である。

図 2 は、プラスミド p SPB 6 0 8 の構造を示す図である。図 3 は、プラスミド p I NA 1 4 5 の構造を示す図である。

図 4 は、プラスミド p I NA 1 4 7 の構造を示す図である。発明の実施の形態

アサガオの遺伝子座 Purp l eは優性であると花弁の色は青で、ホモの劣性となると青い花弁が紫となる。この遺伝子座が花の色に関わつていることは明らかではあるが、その機構については不明であるまず、 pr- ra変異体とその復帰突然変異体の花弁色素を化学分析したところ、両者の色素組成に差違は認められなかった。青色花アサガオの蕾は赤紫色で開花に伴って青色に変化するのは、前述のように、花弁細胞液胞の pH変化によると考えられる。

p_r__m変異体では、開花に伴って青色に変化せず、さらに開花した花弁細胞の液胞の pHは、 pr- m変異体のほうが Pr- rに比べて低かった。それゆえ、 Purp l e遺伝子は開花時の花弁細胞液胞内の pHを制御し、花色を調節する遺伝子と考えられる。そこで、 pr- m変異体とその復帰突然変異体を用いて、トランスポゾン · ディスプレー法により、まず pr-mに特異的に存在する Purp l e遺伝子配列を含むゲノム DNA の断片を同定し、ついで Pu rp l e遺伝子を同定した。今回得られた Pu rp l e遺伝子は驚くべきことにァラビドプシスなどの Na + — H + アンチボー夕一と相同性を持ち、 pr-m変異は Purp l e遺伝子の 5'非翻訳領域中にトランスポゾンが挿入されていた。

本発明の遺伝子としては、例えば配列番号： 2 に記載するァミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のァミノ酸の付加、欠失および/または他のアミノ酸との置換によって修飾されたァミノ酸配列を有する蛋白質も、もとの蛋白質と同様の活性を維持することが知られている。従って本発明は、液胞の p H を制御する活性を有している蛋白質である限り、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列に対して 1 個または複数個のァミノ酸配列の付加、欠失および/または他のアミノ酸との置換によって修飾されたァミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。

本発明はまた、配列番号： 1 に記載の塩基配列または配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分をコードする塩基配列に対して、ス卜リンジヱントな条件下、例えば 5xSSC 、 50°Cの条件下でハイブリダィズし、且つ液胞の P H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適切なハイプリダィゼーション温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸 6個をコードする 18塩基からなる DNA フラグメントをプローブとした場合には 50°C以下の温度が好ましい。

このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えば、ペチュ二ァゃトレニァ由来の遺伝子が挙げられるが、植物以外の由来であつてもよい。また、ハイブリダィゼーシヨンによって選択される遺伝子は cDNAであつてもよく、ゲノム DNA であってもよい。

また、 Na+ — H + アンチポーター遺伝子はス一パーフアミリーを形成しており（FEBS Le t t. 424 ( 1998) Debrov e t a l . , p l ) 、アミノ酸配列で 1 0 % 以上の相同性を有する（J . B i o l . Chem. 272 ( 1997) Or 1 owsk i e t a I . , 2237d ) 。

そこで本発明はさらに配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列に対して約 20%以上、好ましくは 50%以上、例えば 60%または 70%以上、の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えば cDNAラィブラリーのスクリーユングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコ一ドする DNA は生来の塩基配列を有する DNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発や PCR 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したい DN A 断片を生来の cDNAまたはゲノム DNA の制限酵素処理によって得、これを鎊型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発または PCR 法を実施し、所望の修飾を導入した DNA 断片を得る。その後、この変異を導入した DNA 断片を目的とする酵素の他の部分をコードする DNA 断片と連結すればよい。

あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA を得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードする DNA を所望の制限酵素により切断し、その結果得られた DNA 断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなる DNA 断片を合成し、連結すればよい。

本発明はアサガオ由来の液胞の P H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のみに限定されるものではなく、起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、液胞においてプロ卜ンを汲み出す卜ポロジーを持っていればよい。

また、得られた遺伝子を大腸菌または酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、活性を測定することにより、得られた遺伝子が液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードすることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝子産物である液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物の液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をクローン化することもできる。

従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現べクター、及び当該べクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばェシヱリヒア（ Escherichia ) 属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia col i ) 、バシルス（Bacillus) 属微生物、例えばバシルス. スブシルス (Bacillus subti 1 is ) など常用の宿主を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。

酵母としては例えばサッカロミセス（Saccharorayces ) 属微生物、例えばサッカロミセス · セレヒシェ (Saccharorayces cerevisiae) 等が挙げられ、また糸状菌としてはァスペルギルス（Aspergillus ) 属微生物、例えばァスペルギルス ' ォリゼ（Aspergillus oryzae ) 、ァスペルキ"ルス. 二ガー ( Aspergi 1 lus niger ) 、ぺニシリウム（Penici Ilium ) 属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。

本発明の発現べクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモータ一およびターミネータ一、複製起点等を含有する。細菌用発現べクタ一のプロモーターとしては、常用のプロモ一ター、例えば trc プロモーター、 tac プロモーター、 lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモータ一としては、例えばグリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナ一ゼプロモー夕一、 PH05プロモー夕一等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラ一ゼプロモーター、 t rpCプロモータ一等が使用されるまた動物細胞宿主用プロモータ一としてはウィルス性プロモータ一、例えば SV40ァ一リープロモー夕一、 SV40レー卜プロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も常法に従って行うことができる。

前記の発現べクターによって形質転換された宿主細胞を培養、栽培または飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、ィォン交換ク口マトグラフィ一等により目的とするタンパク質を回収、精製することができる。

さらに本発明は、液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、具体的には、 Na + — H ⁺ アンチポーター遺伝子を導入することにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明で得た液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いると、液胞においてプロトンの細胞質への汲み出しとナ卜リゥムイオンの汲み入れを行うことができ、液胞内に蓄積しているアントシァニンを青くでき、結果として花の色を青くすることができる。

また、本発明の遺伝子の発現を抑制することにより、液胞の pHを下げることも可能である。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレツション法によって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。

形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキヨウ、フリージア、ガ一ベラ、グラジオラス、カスミソゥ、カランコェ、ユリ、ペラルゴ二ゥム、ゼラニゥム、ペチュニア、トレニァ、チューリップ、イネ、ォォムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマィモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。実施例

以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、 Molecular Cloning ( Sarabrook et al., 198

9 ) に依った。

実施例 1 . 生殖細胞復帰突然変異体の取得

生殖細胞復帰突然変異体の取得に関しては、すでに報告がある（植物細胞工学シリーズ 5 (1996) pl32, 飯田ら秀潤社、 Annal. New York Acad. Sci. , (1999) I ida et al. p870、 Plant Cel 1, 6 (1994) Inagaki et al. p 375、 Theor. Appl. Genet. 92 (1996) I nagak i et a 1. p499 ) 。

遺伝子型（Pr- r/pr- m ) を有するアサガオ（1 ida et al. p870 、 Plant Cell, 6 (1994) Inagaki et a 1. p 375、 Theor. Appl. Genet . 92 (1996) Inagaki et al. p499 ) を自家受粉し、後代の種子を蒔き、それら自殖後代の花を観察して、復帰突然変異により青花を咲かせる個体を選抜し、さらにこの生殖細胞復帰突然変異体の自殖後代で、紫花を咲かせる分離体が得られるか否かでホモかへテロかを検証し、遺伝子型（Pr- r/ Pr-r) および（pr-m/pr- m) を有するものを選択した。

実施例 1 . 復帰変異体花弁のァントシァニン

アサガオに含まれるアントシァニンはおもにへブンリブルーアントシァニンであり、その他にいくつかのアン卜シァニンが含まれる

(Phytocheraistry 31 (1992) Lu et al. P659 ) 。実施例 1 で得られた Pr- r/ Pr-r株と pr-m/pr- ra 株の開いた花弁を同様に解析したところ、両者に含まれるアントシァニンはほぼ同一であった。

セロハンテープを表側の花弁に貼り、剥がすことにより一層の上皮細胞だけを回収し、ここから細胞液をメスなどで搔き取り遠心して搾汁を得た。搾汁をホリバ B212p H メーター（株式会社堀場製作所）にて pHを測定した。 Pr- r/ Pr- r株の花弁上皮細胞の pHは約 7.1 であったのに対し、 pr- m/pr- ra 株の花弁上皮細胞の pHは約 6.5 であつた。この結果は、 purpleの変異による花色の変化は、アントシァニンの構造によるものではなく液胞の pHの変化によるものであることを示す。

実施例 3 . p r-m に特異的に存在するゲノム断片の単離

遺伝子の単離にはトランスポゾンディスプレー法（たとえば Plan t J. 13 (1998) Frey et al. 717 ， Plant J. 13 (1998) Van d en Broeck et al. pl21) あるいは類似の方法（植物細胞工学シリーズ 7 ( 1997) 、土生ら、 pl44，秀潤社）を用い、 pr- m/pr- ra 株と Pr - w/pr-m 株には存在し、 Pr- r/ Pr- r株と野性株には存在しない DN A のバンドを探した。アサガオにおいては Tpn 1関連のトランスポゾンが主に易変異性に関与していると考えられるので、ここでも Tpn 1 関連のトランスポゾンに着目した。

具体的には、 pr- m/pr-m 株から染色体 DNA を抽出し、 125ng を 20 u 1 中で Mselで消化した。消化した DNA に 80 praole の Mse【ァダプ夕― (5， -GACGATGAGTCCTGAG-3' (配列番号： 3 ) と 5' -TACTCAGGACTCA T-3' (配列番号： 4 ) をァニールしたもの）を 25^ 1 中で 20°Cで 2 時間付加した。 75°Cで 10分間保持した後、 -20 °Cで保管した。これを 10倍希釈した後、 2 1 を鐃型とし、これを 4.8 pmole の TIR プライマー（5' - TGTGCATTTTTCTTGTAGTG- 3' (配列番号： 5 ) 、トランスポゾン Tpnlの末端逆位繰り返し配列を含む）と 4.8 mole の Mselプライマ一（5' - GATGAGTCCTGAGTAA-3' ) (配列番号： 6 ) を用いて 20 u 1 中で PCR により増幅した。

PCR は、 Taq ポリメラ一ゼ（宝酒造株式会社） 9 4 °C 0.5 分、 56 t 1 分、 72°C 1 分を 1 サイクルとし、 20サイクル反応し、 10倍に希釈した。このうち 2 u 1 を銬型として、 4.8 praole の TIR +N ブライマ一（5' - TGTGCATTTTTCTTGTAGN- 3' (配列番号： 7 ) N=A, C, G または T. 混合ではなく 4 種合成する。）と 4.8 pmole の Msel+Nプライマ一（5'-GATGAGTCCTGAGTAAN-3'，（配列番号： 8 ) N=A, G または T.混合ではなく 4 種合成する。 5'端をフルォロセィンで標識（アマシャムフアルマシアバイオテク株式会社 Vistra fluorescence 5' - オリゴラベリングキットを使用））を用いて 20〃 1 中で PCR を行った。

反応はそれぞれのプライマーの組み合わせで行うため 1 6反応をおこなう。 PCR は、 94 °C 0.5 分、 65°C 1 分（1 サイクルごとに 0. 7 °Cづっ下げる）、 72°C 1 分を 1 サイクルとし、 13サイクル反応し、さらに 94°C 0.5 分、 56°C 1 分、 72°C 1 分を 1 サイクルとし、 13サィクル反応した。同様の操作を Pr- r/ Pr- r株から得た染色体 DNA についても行い、 DNA シークェンサ一 377 (ピーィ一バイオシステムズジャパン株式会社）のシークェンスゲルにて電気泳動を行い、 FM BI0II (宝酒造株式会社）を用いてバンドを検出した。

Pr-r/ Pr- Γ株と pr-m/pr- m 株由来のバンドを比較したところ、約 130bp の DNA 断片が pr-mを有する株に特異的に発現していた。この 130bp の DNA 断片を回収し、 20 praole TIRプライマーと 20 praole M se【プライマーを用いて PCR (94°C 0.5 分、 56°C 1 分、 72°C 1 分を 1 サイクルとし、 30サイクル反応）により増幅し、 pGEM - Tベクタ一 ( Promega Corporation ) にサブ、クローニングし、塩基酉己歹リを決定した。その

配列は、

5' -TGAGCATTTTTCTTGTAGTG CTGAGATTTTCCTCCATTTGTCTGMGCTCTTCATCCITCAACAC TACCCCCACATCTCACCmCAAG GTCCMTCTTTATCATTCATCT TTACTCAGGACTCATCGTC-3'

(配列番号： 9 )

であつた（ 1本下線部は使用したプライマー、 2本下線はェクソン、その他はイントロンに対応）。配列番号： 9 に記載の配列をプローブとしてノザン解析を行ったところ、 Pr- rを有するアサガオの蕾には約 2.3kb の転写産物が存在したが、 pr- m/pr- m 株には対応する転写産物は存在しなかった。従って、この 2.3kb の転写産物が Pu rp 1 e遺伝子に対応することがわかった。

実施例 4 . c DNA の単離

野生株アサガオ（Pr-w/Pr- w) 由来の cDNAライブラリー（Plant Cel 1, 6 (1994) Inagaki et al. p375)の約 600 万個クローンを 130bpD NA断片をプローブとしてスクリーニングし、 2 クローンの陽性クローンを得た。そのうち 1 クローンは、 2237 bp の cDNAを持ち、その中には 1626bpからなるオープンリ一ディングフレームが見られた（配列番号： 1 ) 。予測されるアミノ酸配列は、酵母とァラビドプシスの Na⁺ _H+ アンチポーター（それぞれ Nhxl, AtNhxl, Pro Natl . Acad. Sci. USA 96 (1999) Gaxiola et al. pl480 〜 1485) に対して 29.3 %、 73.4% の同一性を示した。

この結果からアサガオの Purple遺伝子は Na+ — H ⁺ アンチポー夕 —をコードしていることが判明した。なお、ァラビドプシスから得られた Na⁺ — H アンチポーターは、酵母において耐塩性を与えるタンパク質として注目されているが、 Na⁺ -H + アンチポーターと花の色との関連が見出されたのは今回が初めてである。実施例 5. 酵母 Na+ — H + アンチポーター変異体の相補実験アサガオの Purple遺伝子がコードする推定ァミノ酸配列は、酵母ゃァラビドプシスの Na+ — H ⁺ アンチポーターのそれらに相同性がある。そこで実際に、アサガオ Purple遺伝子産物が、 Na+ — H + ァンチポ一夕一蛋白として機能できるか酵母 Na+ — H + アンチポータ一変異体を用いた相補実験で確認した。

まず最初に、以下の 2 種類の DNA 断片を合成した。

CBSCl-Linker (22mer)5' - CGA TAG ATC TGG GGG TCG ACA T -3'

(配列番号： 12)

CSBC2- Linker (22mer) 5' - CGA TGT CGA CCC CCA GAT CTA T - 3'

(配列番号： 13) この 2つの DNA 断片からは、 Cla卜 Bgl 11- Sal卜 Clalという制限酵素部位をもつリンカ一ができる。 pYES2 ベクター（ Invitrogen Cor poration) の C I a I部位に Bg I I I サイ卜が URA3遺伝子側に位置するよう定法にしたがつて上記のリン力一を挿入し、プラスミド pINA145 を作成した（図 3 ) 。プラスミド pJJ250 (Jones and Prakash, 199 0, Yeast, 6, 363-366) を BamHI と Sa 11で消化して得られる 2kb の DNA 断片を Bgin と Sal ίで消化したプラスミド p【NA145 とライゲ一シヨンし、プラスミド p I NA147 を作成した（図 4 ) 。プラスミド p【 NA147 の GAL 1 プロモーターの制御下に Purple cDNA を連結してプラスミド plNA151 を作成した。 P1NA147 および pINA151 を Na+ - H + ァンチポーターの変異株である酵母 R101株にそれぞれ形質転換した。酵母 R101株は Na+ - H⁺ アンチポ一夕一遺伝子の変異により 400mM NaCl添加 APG 培地（Nass et al. , 1997， J. Biol. Chera. , 272, 26 145; Gaxiola et al. , 1999， 96, 1480-1485) では生育できない。 PINA147 を形質転換した RlOl株も同様に生育できなかったが、 plNA 151 を形質転換した R101株のみ 400mM NaCl添加 APG 培地でも生育が可能であった。この結果から、アサガオ Purple遺伝子産物は Na+ - H + アンチポーター機能を有していることが明らかになった。

実施例 6 . 植物での発現べクターの構築

アサガオ Purple cDNAlOng を鎊型として、合成プライマ一 PR— 5 (5' -GGGATCCAACAAAAATGGCTGTCGGG-3' ) (配列番号： 10) と PR - 3 (5' -GGGTCGACTAAGCATCAAAACATAGAGCC -3，） (配列番号： 11) を用いて PCR を行った。ポリメラ一ゼは、 Taq ポリメラ一ゼ（東洋紡績株式会社）を使用し、 95°C 45秒反応後、 95°C 45秒、 50°C 45秒、 72°C 45 秒を 1 サイクルとし、 25サイクル反応し、さらに 72度で 10分反応した。得られた約 1.6 kbの DNA 断片を pCR2.卜 Topo ( クロンテック株式会社）にライゲ一シヨンし、 pCR- purpleとした。このプラスミド上の Purple c DNA の塩基配列に PCR によるエラ一がないことを確認した。

PBE2113-GUS (Plant Cell Physiol. 37 (1996) Mitsuhara et al . p49)を Saciで消化し、平滑末端化した後、 Xholリンカ一（東洋紡績株式会社）を挿入し、得られたプラスミドを PBE2113- GUSxとした。これを EcofU と Hindin で消化して得られる約 2.7 kbの DNA 断片を pBinPLUSの Hidl I ίと EcoRi 消化物と連結し、得られたプラスミドを pBEXP とした。

一方、 PCGP484 (特表平 8 — 5 1 1 6 8 3号公報）を Hindi 11 と Xbalで消化して得られる約 1.2kb の DNA 断片と、 pCR- purp 1 eを Xba I と Saliで消化して得られる約 1.6kb の DNA 断片と、 pBEXP を HindH I と Xho 1で消化して得られる約 13kbの DNA 断片をライゲ一ションし、 pSPB607 を得た（図 1 ) 。このプラスミドは、ァグロバクテリウムによる植物の形質転換用のバイナリ一ベクターで、このプラスミド上で、 Purple cDNA は、キンギヨソゥ由来カルコンシンターゼプ口モーターと、ァグロパクテリゥム由来のノノ、。リンシン夕一ゼタ— ミネーターの制御下にある。

また、 PCGP669 (特表平 8 — 5 1 1 6 8 3号公報）を Hindl l l と BamHI で消化して得られる約 0.8kb の DNA 断片と、 pCR- purp 1 eを Ba mH【と Sailで消化して得られる約 1.6kb の DNA 断片と、 pBEXP を Ηί ndl 11 と Xho 1で消化して得られる約 13kbの DNA 断片をライゲ一ションし、 pSPB608 を得た（図 2 ) 。このプラスミドは、ァグロバクテリウムによる植物の形質転換用のバイナリーベクターで、このブラスミド上で、 Purple cDNA は、ペチュニア由来カルコンシン夕ーゼ A プロモーターと、ァグロノくクテリゥム由来のノバリンシン夕一ゼターミネータ一の制御下にある。

このようにして得られた発現ベクターを用いて植物の形質転換を行うことにより、液胞の pHを制御し、花色を調節することができる実施例 7 . Purple遺伝子のホモログの単離

ペチュニア（Petunia hybrida 品種 Old Glory Blue ) 、ニーレンベルギア（ Nierembergia hybrida品種 NB 17 ) 、トレニァ（Tore nia hybrida 品種サマーウエーブ · ブル一）の花弁由来 cDNA l ibra ryを cDNA synthesis kit ( Stratagene USA) を用いてそれぞれ作成した。作成方法は、製造者の推奨する方法に従った。それぞれ約 20 万個のクローンを定法に従って、スクリーニングした。なお、メンプレンの洗浄には、 5 SSC, 0.1% SDS 水溶液を用い、 50°Cで 10分間、 3回行った。得られた陽性クローンのうち、それぞれの最長クローンの塩基配列を決定した。ペチュニアのクローンの塩基配列及び対応するァミノ酸配列を配列番号： 1 4及び 1 5 に、ニーレンベルギアのクローンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号： 1 6及び 1 7 に、そしてトレニァのクローンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号： 1 8及び 1 9 に示す。ペチュニア、二 —レンベルギア及びトレユアの Purp 1 e遺伝子のホモログは、アサガォの Purple遺伝子に対してァミノ酸レベルでそれぞれ 75%、 76%及び 71%の同一性を示した。

アサガオ Purple遺伝子がコードする Na十一 H + アンチポー夕一とァラビドプシスの AtNhx 1 がコードする Na+ — H ⁺ アンチポー夕一のアミノ酸配列の同一性が約 73%であることから、ここで得たペチュニァ、二一レンベルギア、トレユアの Purp 1 e遺伝子のホモログは、 Na⁺ — H ⁺ アンチポー夕一をコードしていると判断される。

実施例 8 . アサガオ Purple 染色体クローンの単離

変異型アサガオ（pr- _m/_pr- _m) と復帰型アサガオ（Pr- r/Pr- r) の染色体 DNA を Bgll【で切断後、 0.8%ァガロースゲルで電気泳動し、ァサガオ Purpleの cDNAをプローブにそれぞれゲノミツクサザン解析を行った。その結果、変異型アサガオでは無く、復帰型アサガオには存在する約 7.5kbのバンドを検出した。

野性型アサガオ（Pr- w/Pr-w、 KKZSK2系統）の染色体 DNA 50 i g を Bglll で切断後、 0.8%ァガロースゲルで電気泳動し、約 7〜9kb の部分を切り出して GENECLEAN 11 I KIT (B10101) を用いて DNAを抽出した。この DNA¾rス Zap express vector ( Stratagene I A) にラィゲーシヨンし、アサガオ Purple の cDNAをプローブとしてスクリ一ユングした。得られたポジティブクローンの塩基配列を決定したところ、この約了.5kbの DNA 断片に Purpleのプロモーター上流約 6. 3kb とェキソン 3 の途中までの領域が存在した。この配列のうち Pu rple遺伝子の開始コドンまでの配列を配列番号： 2 0 に示す。

Purple遺伝子は、アサガオの開花約 24時間前にのみ強く発現が誘導されること、また、 5 ，一非翻訳領域へのトランスポゾンの挿入により、 Purple遺伝子の発現が抑制されることが判明している。このことから、得られた Purp 1 e遺伝子のプロモーター領域には、アサガオ花弁で時期特異的、器官特異的に Purp l e遺伝子を発現させるために必要な因子を含んでいる。このプロモーター領域の下流に目的遺伝子を配置すれば、時期特異的、器官特異的に目的遺伝子の発現が制御できる。産業上の利用可能性

本発明により得られた遺伝子が液胞の pHおよび花の色の調節に関わっていることがはじめて明らかとなった。また、本発明の遺伝子を花弁で発現することにより、液胞の pHを上昇させ、花の色を青く変化させることができる。また、本発明の遺伝子の発現を抑制することにより、液胞の pHを低下させ、花の色を赤く変化させることができる。液胞の pHを制御する蛋白質をコードする遺伝子としては、本発明において得られたアサガオ由来のものだけでなく、他の生物の同様な遺伝子も用いることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 植物細胞の液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。

2 . 配列番号： 2記載のアミノ酸配列を有する植物細胞の液胞の p Hを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。

3 . 配列番号： 2記載のアミノ酸配列に対して 1 個又は複数個のァミノ酸の付加、欠失及び/または他のァミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ液胞の p Hを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。

4 . 配列番号： 2記載のアミノ酸配列に対して 20% 以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする請求項 1 に記載の遺伝子。

5 . 配列番号： 2記載のアミノ酸配列に対して 70% 以上の相同性を示すァミノ酸配列を有し、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする請求項 1 に記載の遺伝子。

6 . 配列番号： 2記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸の一部または全部に対して、ストリンジヱン卜な条件下でハイブリダイズし、且つ液胞の p H を制御する活性を有する蛋白質をコードする請求項 1 に記載の遺伝子。

7 . 請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を含んでなるベクタ一。

8 . 請求項 7記載のべクターにより形質転換された宿主細胞。

9 . 請求項 1 〜 6 のいずれか 1項に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質。

1 0 . 請求項 8記載の宿主細胞を培養し、又は生育させ、そして該宿主細胞から液胞の P Hを制御する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。

1 1 . 請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子、または請求項 7記載のベクターが導入され形質転換された植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫またはそれらの組織。

1 2 . 請求項 1 1 に記載の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切り花。

1 3 . 請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子、または請求項 7記載のべクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、液胞の p Hを制御する方法。

1 4 . 請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子、または請求項 7記載のべクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、植物体の花の色を調節する方法。