WO2001012224A1 - Verwendung cd28 spezifischer monoklonaler antikörper zur herstellung einer pharmazeutischen zusammensetzung zur behandlung von virusinfektionen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to the use of monoclonal antibodies which are specific for CD28 and which activate T-lymphocytes of several or all subgroups without occupying an antigen receptor of the T-lymphocytes and thus antigen-nonspecifically, or an analogue thereof, for the production of a pharmaceutical composition in the embodiment as A preparation or package for treating viral infections in humans or lower warm-blooded animals in which T-lymphocytes are infected, a package component with such antibodies or analogs, a method for treating viral infections using such a composition and a treatment plan using such a composition ,
  • HIV goes through a life cycle in which it can exist in different latency stages.
  • a first latent stage is called pramtegrative and means that although the HIV is imported into the host cell and possibly at least partially subjected to reverse transcription, it is not built into the cell nucleus as a provirus.
  • This pre-integrative stage of latency can remain latently functional over a number of weeks until the functionality is lost.
  • the pre-integrative latency requires that the host cell is at rest.
  • Another stage of latency is referred to as postmegegative and means that although the HIV as provirus has been merged into the cell nucleus, the host cell, for example, is at rest due to deactivation and consequently no virus replication takes place.
  • the post-integrative latency is comparatively long-term stable and continues until the host cell is activated.
  • Activation of latent (post- or pregratively) HIV-containing host cells takes place by means of various stimuli, with the result that the virus replication is also activated, the host cell being destroyed and the virus being released into the body's fluid.
  • the above explanations apply in principle to all retroviruses. Virus in a latent stage is called latency virus.
  • HAART therapy (“highly active anti-retroviral therapy”
  • This consists in the combined use of two reverse transcriptase inhibitors, eg the nucleoside analogues AZT (or Zidovud e) and 3TC (or Lamivudine), together with one or more protease inhibitors.
  • An example of a protease inhibitor is IDV (indinavir).
  • HAART therapy the substances used in it and the treatment plan, reference is made to the following references: J. Laurence, HAART Regiments: Do the effects last? in The AIDS Reader 7 (6): 84-85 (1997); RM Gulick et al. , N. Engl. J.
  • Suitable reverse transcriptase inhibitors are the nucleoside analogs d4T (Levudine), ddl (Didanosine) and ddC (Zalcitab e) as well as the non-nucleoside analogs DLV (Delavird e) and NVP (Nevirapine).
  • suitable protease inhibitors are NFV (Nelf avir), RTV (Ritonavir) and SQV (Saqumavir).
  • Literature WO 98/54225 discloses human-compatible monoclonal antibodies which are specific for human CD28 and which activate human T-lymphocytes from several to all subgroups without the occupation of an antigen receptor of the human T-lymphocytes and thus antigen-unspecific. With regard to further background information, reference is made to the citations mentioned in this reference. From this literature it is also known to use these monoclonal antibodies for the treatment of diseases with pathologically reduced CD4-T cell numbers, such as AIDS. The background to this use is that the CD4-T cell numbers can be raised again by means of these antibodies. A connection with the administration of reverse transcriptase inhibitors and possibly protease inhibitors has not been drawn. Reference WO 98/54225 is hereby expressly incorporated in its entirety.
  • the invention is based on the technical problem of developing a pharmaceutical composition or a treatment plan with which, on the one hand, at least the majority, if not all, of the HIV latency viruses are activated (and thus inhibited by virus inhibitors and ultimately) is made destructible) and on the other hand the side effects are reduced.
  • the invention teaches the use of monoclonal antibodies which are specific for CD28 and activate T-lymphocytes of several or all subgroups without occupying an antigen receptor of the T-lymphocytes and thus antigen-nonspecifically, or an analogue thereof, for the preparation of a pharmaceutical composition in the embodiment as a preparation or Package for the treatment of viral infections in humans or lower warm-blooded animals in which T-lymphocytes are infected, the pharmaceutical composition additionally containing a virus inhibitor. It is understood that the active ingredient components are used in pharmaceutically effective doses.
  • the invention further teaches a pharmaceutical composition in an embodiment as a preparation or as a preparation package, with pharmaceutically effective doses of the following active ingredient components: a) preferably human-compatible monoclonal antibodies which are specific for CD28, preferably human-CD28 and T-lymphocytes, preferably human Activate -T-lymphocytes, several or all subgroups without occupying an antigen receptor of the T-lymphocytes and thus antigen-nonspecifically, or an analogue to this, b) a virus inhibitor, preferably a reverse transknase inhibitor, c) optionally a reverse of b) Transcriptase inhibitor, d) optionally a protease inhibitor, e) optionally a protease inhibitor different from d).
  • active ingredient components further active ingredients and / or substances which are expedient or necessary for the pharmaceutical preparation can be contained.
  • the invention further teaches a package component of a preparation package according to the invention containing the active ingredient component a).
  • the invention further teaches a method for the treatment of viral infections with lentivirus, in particular HIV, wherein a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a human body infected with the virus infection or a body of a lower warm-blooded animal, or a method for the treatment of viral infections with lentivirus, in particular HIV
  • a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a human body infected with the virus infection or a body of a lower warm-blooded animal, or a method for the treatment of viral infections with lentivirus, in particular HIV
  • active ingredient components of a pharmaceutically effective dose are given to a human body or a body of a lower warm-blooded animal: a) preferably human-compatible monoclonal antibodies which are specific for CD28, preferably human-CD28, and T-lymphocytes, preferably human-T-lymphocytes , activate several or all subgroups without occupying an antigen receptor of the T lymphocytes and thus antigen-specifically, or an ana
  • the invention teaches the use of a preferably human-compatible monoclonal antibody a) which is specific for CD28, preferably human CD28, and T lymphocytes, preferably human T lymphocytes, from several to all subgroups without occupying an antigen receptor of the T lymphocytes and thus activated antigen-nonspecifically, or an analog thereto, and a virus inhibitor b), preferably a reverse transcriptase inhibitor, in the form of a mixture or of spatially separate compositions, one of which is the active ingredient component a) and the other of which Active substance component b) contains, as an agent for use in the treatment of viral infections with lentiviruses, in particular AIDS, in humans or lower warm-blooded animals according to a treatment plan which comprises one or more cycles, the treatment plan consisting of the following steps: 1) first the active substance component b) presented in a pharmaceutically effective dose, 11) after a predetermined duration of stage 1), the active ingredient component a) is administered in a pharmaceutically effective dose with continued administration of
  • the invention is initially based on the knowledge that by activating a large part of the T-lymphocytes also resting (latency) virus is activated and thus by virus inhibitors, in particular reverse transcriptase inhibitors
  • the invention is based on the further surprising finding that the parallel use of (toxic) reverse transcriptase inhibitors, for example the (toxic) HAART therapy, activates the T-
  • Lymphocytes not counteracted. As a result, this has a double meaning and consequently a synergistic effect.
  • the activation of the majority of the T-lymphocytes is guaranteed despite the parallel HAART therapy, with the result that virtually the entire latency virus reservoir is destroyed by the HAART therapy.
  • the already pathologically reduced number of T-lymphocytes is increased again, with the result of a stabilization of the immune system.
  • CD4 T cells can indeed be stimulated to proliferate. Only a subpopulation of CD8 T lymphocytes that do not express CD28 cannot be activated by activating CD28-specific reagents. However, this is also not an essential reservoir of HIV, since the primary receptor for HIV is the CD4 molecule.
  • Monoclonal antibodies are antibodies that are produced by hybrid cell lines (so-called hybridomas), which are produced by the fusion of an antibody-producing B cell animal or human origin with a suitable myeloma tumor cell.
  • hybridomas which are produced by the fusion of an antibody-producing B cell animal or human origin with a suitable myeloma tumor cell.
  • the expression of the monoclonal antibodies also includes their derivatives.
  • CD28 is a cell surface molecule of known ammosaic sequence expressed on T-lymphocytes of human and animal origin, which was given the abbreviation CD28 during the international "Human Leukocyte Typing Workshops”.
  • T-lymphocytes Activation of T-lymphocytes means the increase in metabolic activity, enlargement of the cell volume, synthesis of immunologically important molecules and entry into the cell division (proliferation) of T-lymphocytes to an external stimulus. For example, these processes are triggered by occupation of the CD28 molecule on T cells by special CD28-specific monoclonal antibodies.
  • the activation of T-lymphocytes with the described side effects is part of the physiological immune reaction, but can get out of control in pathological situations (lymphoproliferative diseases) or be insufficient (immune deficiency).
  • Constant components of an antibody are areas that are not important for antigen recognition, in contrast to the variable areas that define the antigen specificity of an antibody.
  • constant components differ in the case of antibodies of different types and consequently also animals and humans.
  • the constant ranges of an antibody must correspond to those of antibodies of an organism that is to be treated with the antibodies in order to be contractual.
  • Derivatives of monoclonal antibodies are to be understood as meaning modifications of the monoclonal antibody which have been generated by biological biochemical or genetic engineering manipulations. This is the case, for example, with the humanization of a mouse monoclonal antibody by partially replacing structural (constant) components of the mouse antibody with those of a human.
  • Derivatives are furthermore monoclonal antibodies which, although chemically modified, nevertheless perform the functions explained in the context of the invention.
  • the common criterion is always the CD28 specificity with a stimulatory effect.
  • Analogs are substances which are not monoclonal antibodies, but which perform the functions explained in the context of the invention. Examples of this are "tailored" highly specific synthetic proteins or RNA or DNA molecules (e.g. aptamers, in particular aptamers or RNA or DNA molecules stabilized against nucleic acid-cleaving enzymes).
  • the common criterion is always the CD28 specificity with a stimulatory effect.
  • a determinant is to be understood as the region of a molecule which is defined by the specificity of one or more antibodies.
  • the expression of the therapeutically active dose denotes a dose which leads to a significant reduction in the amount of replication-capable virus from a defined period after the virus inhibitors have been administered to a patient or in a test system compared to the amount of replicable virus after the same period and same initial amount of replicable virus, but without any administration.
  • the expression of the therapeutically active dose denotes in connection with antibodies used according to the invention a dose which leads to a significant increase in the CD4 T cell numbers and / or the expression of serologically detectable activation markers (CD25, CD45R0, CD71) after a defined period in an organism or Test system to which the antibodies were given, compared with respective values after the same period and the same initial values, but without any administration.
  • Human contract means antibodies that are humanized. It may be noted here that antibodies which are not humanized and consequently do not fall under the definition of human-contracted antibodies made here can certainly be used for therapy in humans. To this extent, all antibodies can be used in human therapy which do not trigger any undesired immune reactions over a certain period of time, as can be demonstrated, for example, by determining anti-immunoglobulin antibodies as a termination criterion.
  • a virus inhibitor is any active ingredient that interferes directly or indirectly with any stage in the life cycle of a virus.
  • reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors there are also questions, for example, inhibitors of the cell surface receptors to which a virus docks, or inhibitors of all positive regulatory proteins or processes of a virus, including inhibitors of cellular positive regulatory substances that respond to the long term al repeats of a virus Act.
  • active substances are also considered which are not inhibitors but instead induce negative regulatory proteins or processes of a virus; such active substances are also included in the expression virus inhibitor.
  • continuous administration of an active ingredient component b) and / or c) and / or d) and / or e) means that a (possibly discontinuous) treatment sub-plan to be used for this component is continued continuously.
  • the expression of continuous administration for example in the case of HAART therapy, also includes a variation and individual adjustment of the active ingredient components or their dosage, tracking the continuous administration.
  • the use according to the invention is preferred for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases in which CD4 T lymphocytes, in particular human CD4 T lymphocytes, are infected, the monoclonal antibodies being specific for human CD28 and the monoclonal antibodies optionally being in a human contract are.
  • the antibodies human CD28 In the treatment of infections of human CD4 lymphocytes, that is to say of humans, the antibodies human CD28 must be specific, but not necessarily in a human contract.
  • the invention can be used, for example, if the virus infection is an infection with retrovirus, in particular lentivirus, for example HIV.
  • the virus inhibitor is a reverse transcriptase inhibitor, a nucleoside analogue Pyrimidm- preferably, insectstvorzug mecanic 3 '-Az ⁇ do-3' -desoxythymi- din (AZT or Zidovud), and optionally further addition of other nucleoside analogues thereof different, preferably 3TC, in the pharmaceutical composition are holding.
  • the pharmaceutical composition can additionally contain a protease inhibitor and optionally further additional, different protease inhibitors.
  • HAART therapy works with a combination of active ingredients comprising at least two reverse transcriptase inhibitors and optionally at least one protease inhibitor.
  • Monoclonal antibodies used in accordance with the invention can be obtained in a wide variety of ways.
  • a usable embodiment according to the exemplary embodiments is obtainable by A) producing hybrid cell cells capable of producing monoclonal human CD28-specific animal antibodies by immunization with non-T tumor cell lines on which human CD28 is exposed, B) optionally humanization of the monoclonal animal antibodies obtainable from hybrid dome cells according to stage A by biochemical or genetic engineering replacement of constant components of the animal antibodies by analogous constant components of a human antibody or replacement of the components of genes of the hybrid dome cells corresponding to the components, C) secretion of the monoclonal antibodies in hybridoma cell cultures and isolation of the monoclonal antibodies therefrom or production of the monoclonal antibodies by injection of the hybridoma cells into animals, for example mice, and isolation of the monoclonal antibodies from the body fluid of the animals.
  • the hybrid domains capable of producing monoclonal human CD28-specific animal antibodies can be obtained by a) creating a plasmid by inserting human CD28 cDNA in the pH ⁇ APr-1-neo vector after excision of the Sall-HindIII fragment and production of protoplasts from Es - chenchia coli (MC1061), which carry the plasmid, b) fusion of the protoplasts with mouse A20J and / or L929 tumor cells using polyethylene glycol, c) cultivation of the transfected cells obtained in step b, d) screening of the transfected mouse A20J and / or L929 Cells on the Expression of human CD28 and selection of human CD28-expressing mouse A20J and / or L929 cells, e) immunization of BALB / c mice with the human CD28 expressing mouse A20J and / or L929 cells, f) removal of spleen cells from the so immunized mice and fusion of the spleen cells with
  • the pHßAPr-1-neo vector is freely available from the stops of the literature Gunning, P, et al., 1987, "A human ß-actm expression vector system directs high-level accumulation of antisense transc ⁇ pts", Proc. Natl. Acad. Be. USA, 84: 4831. "neo” stands for neomycm resistance. Step c) is therefore carried out in the presence of neomycin.
  • the cell lines and / or microorganisms mentioned above are freely available and can be purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • Eschenchia coli (MC1061) is supplementary to the literature Meissner, PS, et al., 1987, "Bacteriophage gamma cloning system for the construction of directional cDNA libraries ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4171.
  • hybrid dome cells for humanization and for the production of monoclonal antibodies from (humanized) hybrid dome cells are well known to the person skilled in the art and need not be explained in more detail here.
  • all known, freely available cell lines that are customary, in particular for the production of the hybrid domes, can be used.
  • the recombinant expression which is well known to the person skilled in the art can in principle be used to produce the monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies that can be used are also accessible in other ways.
  • the immunization in stage A) can be carried out against soluble or dissolved recombinant human CD28. Humanization can be made unnecessary by using animals in the production of the hybrid domains that are genetically modified so that the antibodies formed already have the human constant components.
  • a completely different approach to the production of monoclonal antibodies is that the antigen binding domains (eg human) antibodies are genetically expressed in a highly complex bacterophage library, from which suitable binding domains can be isolated by their affinity for CD28 and supplemented to complete antibodies ,
  • the active ingredient components b) to e) can be selected, dosed and prepared in accordance with the HAART therapy.
  • all existing and future developed variants of HAART therapy or another therapy can be used, as long as not one or more Active ingredient components the activating effect of the monoclonal antibodies is (over) compensated.
  • the drug component b) is a nucleoside analogue Pyrimidm, vorzug- irri 3 '-Az ⁇ do-3' -desoxythymidin, and / or
  • Active ingredient component c) is 3TC, and / or the active ingredient component d) is compulsory.
  • active ingredient components b) to e) form part of a first package component and
  • Active ingredient component a) are part of a second package component.
  • the active ingredient components b) to e) can be selected, dosed and administered in accordance with the HAART therapy, the active ingredient component a) being administered before, together or after the active ingredient components b) to e).
  • the active ingredient components b) to e) can be borrowed continuously and the active ingredient component a) once or several times at intervals with breaks.
  • the active ingredient component b) can be a pyrimide nucleoside analog, preferably 3'-azido-3-deoxythymidine, and / or the active ingredient component c) can be 3TC, and / or the active ingredient component d) can be compulsory.
  • the active ingredient component b) can be administered as part of a treatment sub-plan, which is the HAART therapy.
  • HAART therapy can be individually adapted to the patient (by choosing or exchanging and combining the reverse transcriptase inhibitors and / or the protease inhibitors and the respective dosages).
  • a preferably iv injection of antibodies in a dosage of 0.1 to 50, preferably 0.5 to 20, most preferably 0.5 to 5 mg / kg body weight can then take place while maintaining the HAART therapy.
  • the above dose can be administered all at once or in 2 to 10, preferably 2 to 5, portions over a period of 1 hour to 1 month, preferably 1 day to 5 days, evenly or unevenly distributed.
  • a subsequent rest while maintaining HAART from 1 day to 6 months, preferably 0.5 to 2 months, for example 1
  • CMY-2 obtainable from hybrid dome cells according to the deposit DSM ACC2353, or the one commercially available from ALEXIS GmbH, D-35305 Grunberg and available from Ancell Corporation, USA, can be used in the context of the invention. produced clone ANC28.1 / 5D10 or a preferably humanized or human-contracted variant of clone ANC28.1 / 5D10.
  • Monoclonal antibodies used according to the invention can in particular have specificity for determinants of the human CD28 molecule which are difficult to access on the naturally expressed CD28 molecule and whose occupation by the monoclonal antibodies leads to the activation of the T cells.
  • additional active ingredients can optionally be present or used, which are different from the active ingredients mentioned above and used according to the basic concept of the invention.
  • additional active ingredients are, for example, active ingredients which counteract any side effects.
  • Additional active ingredients are still active ingredients, which can be helpful in connection with the expansion of the immune system.
  • the proliferation of CD8 cells can be induced or increased by administration of IL-2.
  • immunomodulating active substances can be used as additional active substances in accordance with the immunological (detailed or secondary) process which is expediently required (or inhibited) in connection with the invention. Examples of this are oligonucleotides containing CpG motifs (D. Klmman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 2879-2883 (1996)).
  • CMY-2 Human CD28 from a cDNA library was A20J and / or L929 recombinantly expressed.
  • a plasmid was first created by inserting human CD28 cDNA into the pH ⁇ APr-1-neo vector after excision of the Sall-HindIII fragment.
  • Protoplasts carrying the plasmid were produced from Eschenchia coli (MC1061). The protoplasts were then fused with mouse A20J and / or L929 tumor cells using polyethylene glycol. The transfected cells thus obtained were cultivated in the usual way.
  • the transfected mouse A20J and / or L929 cells were then screened for the expression of human CD28 and the selection of human CD28-expressing mouse A20J and / or L929 cells.
  • the A20J human CD28 cell line was used to immunize BALB / c mice.
  • Cell fusion and screenmg were carried out as follows: l) Immunization of BALB / c mice with the mouse CD20-expanding mouse A20J cells (injections 6 x l.p. and then 1 x i.V.). n) removal of spleen cells from the immunized mouse and fusion of the spleen cells with cells of the cell lines X63-Ag 8.653 using polyethylene glycol. in) Selection of the hybrid domains thus obtained with the proviso that the supernatant of selected hybrid dom cells contains antibodies which bind to mouse A20J and / or L929 cells expressing human CD28.
  • FIG. 2 shows that the monoclonal antibody CMY-2 isolated in this way distinguishes transfected and untranslated cells by different fluorescence intensity.
  • Differential screening for antibodies against human CD28 was as follows. 50 ⁇ l of supernatant from cultured cell hybridomas were removed and incubated with a mixture of L929 cells and L929-CD28 transfectants 15 mm. After washing, the cells were stained with DaMIg-PE. Part A shows the negative control. The cells were incubated with DaMIg-PE only. Part B shows staining with a supernatant that was slightly positive but showed no difference in either cell. Part C shows the cells stained with a supernatant from CMY-2.
  • CMY-2 is a human CD28-specific antibody.
  • CMY-2 was then tested for classical costimulatory and "direct" stimulating activity with human T-lymphocytes enriched from approximately 80% of peripheral blood. T cell proliferation was measured by incorporating ⁇ -thymidm between the 2nd and 3rd days of culture. The following results were achieved:
  • Ant ⁇ -CD3 ensures T cell receptor
  • CMY-2 was used in the form of an unpurified culture supernatant (50 final volumes).
  • the effective mAb concentration to be expected is suboptimal for direct activation, but sufficient for costimulation.
  • the experiment shows that CMY-2 has direct activating properties.
  • Hybrid domains that produce CMY-2 are from DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, under the number DSM ACC2353 (20.05.1998).
  • Fig. 3 shows the proliferative response of unseparated rat lymph node cells to the "directly" stimulating CD28-specific monoclonal antibody (JJ316) and the lack of such a response when using a "classic" CD28-specific monoclonal antibody (JJ319).
  • the cells were exposed to 0.2 ml medium (RPMI 1640, available from GIBCO / BRL, containing 5% FCS [fetal calf serum]) for two days in the presence or absence of the indicated additives at a density of 1 million cells per ml cultivated in the fumigated incubator.
  • FIG. 4 shows this for lymph nodes of the rat which had received 1 mg on day 0 of the "directly" stimulating CD28-specific monoclonal antibody (JJ316) or of the "classic" CD28-specific monoclonal antibody (JJ319).
  • JJ316 the "directly" stimulating CD28-specific monoclonal antibody
  • JJ319 the "classic" CD28-specific monoclonal antibody
  • Example 2 Use of the antibody compound used according to the invention with the HAART therapy
  • cells were cultivated in 0.2 ml of medium (RPMI 1640, available from GIBCO / BRL, containing 5% human AB serum) at a density of 1 million cells per ml in the fumigated incubator.
  • medium RPMI 1640, available from GIBCO / BRL, containing 5% human AB serum
  • PBMC peripheral blood lymphocytes and / or monocytes
  • FIG. 5 shows experiments to measure the activation of proliferation of CD4 T cells.
  • the detection was carried out by immunofluorescence and flow cytophotomet ⁇ e (FACS) on day four after stimulation of the cells in vitro.
  • 10a shows so-called "dot plots", the CD4 T cells being defined by a gate (R2) (they express CD3 and CD4).
  • FIG. 10b shows a histogram of the staining of these CD4 T cells with a monoclonal antibody against the transfere receptor (CD71). The Expression of this surface receptor characterizes proliferating cells. It can be seen that in a large part, namely> 90%, of CD4 + T lymphocytes, proliferation is (directly) induced by aCD28.
  • the investigations were carried out
  • FIG. 7 shows that the proliferation of unseparated PBMC from uninfected human donors, measured by the incorporation of J H-labeled Tymidms, is stronger by aCD28 than by IL-2. This shows that more cells are addressed using aCD28 than in the in vivo therapy with HAART and IL-2 according to the prior art.
  • the cultivation was carried out in the presence of 5 ⁇ g / ml aCD28 or 20 IU / l IL-2 in 96-well round-bottom plates.
  • IL-2 preferentially stimulates CD8T lymphocytes for proliferation, while CD4 T cells are particularly addressed by aCD28.
  • Table I PBMC of an HIV-infected patient was stimulated with IL-2 or aCD28 for three or 10 days.
  • FIG. 8A shows the activating effect of aCD28 on the proliferation of PBMC from HIV-1 infected persons
  • FIG. 8B correspondingly for PBMC from SlV-infected rhesus monkeys.
  • An amount of 5 ⁇ g / ml aCD28 was used.
  • strong proliferation could be induced, but this was the least in the case of massive HIV infection. This is presumably related to the associated massive induction of virus multiplication and the associated T cell destruction, which is avoided in the case of treatment according to the invention when HAART active substances are administered together (see also Example 2.6a and Fig. 10).
  • PBLs from an HIV-1 infected person were not treated with HAART active substances (zidovudine + didanosme + saqumavir; 0, I ⁇ M) alone, with aCD28 (5 ⁇ g / ml) all or both. After 6 days the proliferation was measured.
  • HAART active substances zidovudine + didanosme + saqumavir; 0, I ⁇ M
  • aCD28 5 ⁇ g / ml
  • PBMC from an HIV-1 infected patient was stimulated as described above. Proliferation was measured from day 3 to day 4. As sometimes observed in infected patients, IL-2 induces a greater proliferation than CD28, which, however, mainly affects the CD8 T cells not exposed to HIV (see Table I). This is not influenced by HAART, while the aCD28-mduz ⁇ erte is improved by HAART (see Fig. 10)
  • Virus replication in PBMC of HIV-1 infected persons was examined. At weekly intervals, free supernatant was examined for the presence of p24Gag (virus protein) by means of ELISA. HAART was used as in Example 2.5. "+" here and below means use of the concerned
  • Active ingredient component "-" absence. It can be seen in FIG. 11 that aCD28 stimulation also induces massive virus production. With HAART at the same time, virus production is completely suppressed. PHA is Phytohamagglutmm for comparison.
  • PBMC being treated by an HIV-1 infected person up to day 6 in accordance with the table. From day 6 to day 9, a pure HAART treatment followed, followed by treatment with aCD28 (also called ComMCD28) from Day 9 to day 14. The results confirm those from Example 2.7, since accordingly even after renewed stimulation of cell cultures of HIV-infected PBMC no virus production is observed after the end of the HAART therapy.
  • aCD28 also called ComMCD28
  • PBMC which were isolated from an HIV-1 infected person were cultivated according to the table and treated in vitro (active substances and quantities of active substances as in Example 2.5).
  • An HIV-1 specific DNA PCR was carried out on the 11th day of cultivation:
  • YES gaa ggc ttt cag ccc aga ag JA7 (gagl615-1596): tct cct act ggg ata ggt gg Annealmg Temp .: 47 ° C; 42 cycles
  • FIG. 13 shows that proviral HIV DNA can no longer be detected when combined with HAART and monoclonal antibodies used according to the invention, whereas in the other cases of the table, proviral HIV DNA was always present. This demonstrates in a test system that comes very close to the situation of the whole organism that the invention also successfully destroyed the reservoir of proviral structures.

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Abstract

Die Erfindung lehrt die Verwendung monoklonaler Antikörper, welche für CD28 spezifisch sind und T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder eines Analogen hierzu zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in der Ausführungsform als Präparat oder Präparatepaket zur Behandlung von Virusinfektionen beim Menschen oder niedrigeren Warmblütern, bei welchen T-Lymphozyten infiziert sind, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen Virus Inhibitor enthält, eine entsprechend pharmazeutische Zusammensetzung und einen Behandlungsplan unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung.

Description

VERWENDUNG CD28 SPEZIFISCHER MONOKLONALER ANTIKÖRPER ZUR
HERSTELLNUNG EINER PHARMAZEUTISCHEN ZUSAMMENSETZUNG ZUR
BEHANDLUNG VON VIRUSINFEKTIONEN
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung monoklonaler Antikörper, welche für CD28 spezifisch sind und T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezi- fisch aktivieren, oder ein Analog hierzu, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in der Ausfuhrungsform als Präparat oder Praparatepaket zur Behandlung von Virusin- fektionen beim Menschen oder niedrigeren Warmblutern, bei welchen T-Lymphozyten infiziert sind, eine Paketkomponente mit solchen Antikörpern oder Analogen, ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen unter Verwendung einer solchen Zusammensetzung und einen Behandlungsplan unter Verwendung einer solchen Zusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung
Das HIV durchlauft einen Lebenszyklus, in welchem es in verschiedenen Latenzstadien vorliegen kann. Ein erstes La- tentzstadium wird als pramtegrativ bezeichnet und meint, daß das HIV zwar in die Wirtszelle importiert und ggf. zumindest teilweise der reversen Transkription unterzogen, jedoch nicht m den Zellkern als Provirus eingebaut ist. Dieses pramtegrative Latenzstadium kann latent funktional bleiben über eine Mehrzahl von Wochen bis zur Einbußung der Funktions- fahigkeit. Die pramtegrative Latenz erfordert, daß die Wirtszelle ruht. Ein weiteres Latenzstadium wird als postm- tegrativ bezeichnet und meint, daß das HIV als Provirus zwar in den Zellkern mtergriert worden ist, die Wirtzelle jedoch beispielsweise aufgrund von Deaktivierung ruht und folglich keine Virusreplikation stattfindet. Die postintegrative Latenz ist vergleichsweise langzeitstabil und halt bis zu einer Aktivierung der Wirtszelle an. Eine Aktivierung von latentem (post- oder pra tegrativ) HIV enthaltenden Wirtzellen er- folgt durch verschiedene Stimuli mit der Folge der Aktivierung auch der Virusreplikation, wobei die Wirtszelle zerstört und Virus in die Korperflussigkeit freigesetzt wird. Die vorstehenden Erläuterungen gelten grundsatzlich für alle Retroviren. Virus m einem latenten Stadium wird folgend La- tenzvirus genannt.
Bisherige Therapieansatze mit Reverse Transkriptase Inhibitoren und ggf. Protease Inhibitoren unterdrucken die Virusvermehrung nach Aktivierung des Latenzvirus. Somit verschwindet zwar freies HIV unter Therapie aus der Zirkulation, ruhende Leukozyten enthalten jedoch weiterhin Latenzvirus (T.W. Chun et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:13193-13197 (1997); D. Finzi et al., Science, 278:1295-1300 (1997); J.K. Wong et al . , Science, 278:1291-1295 (1997)). Die Folge ist ein Wiedererscheinen replikationsfahiger Viren bei Unterbrechung der Therapie (M.D. de Jong et al . , AIDS, 11.F79-84 (1997)) und Fortschreiten der Erkrankung. Die Therapie mit Reverse Transkriptase Inhibitoren und ggf. Protease Inhibitoren ist jedoch toxisch und eine insofern notwendige lebenslange Behandlung hat daher ihre Grenzen bzw. Bedenken. Zudem ist die Behandlung mit Reverse Transkriptase Inhibitoren und ggf. Protease Inhibitoren mit beachtlichen Kosten verbunden.
Stand der Technik
Als Konsequenz aus der vorstehenden grundsätzlichen Problematik wurde vorgeschlagen, latentes HIV der Therapie mit Reverse Transkriptase Inhibitoren und Protease Inhibitoren durch gleichzeitige Behandlung mit immunstimulierenden Agen- tien, die das latente HIV aktivieren, zugänglich zu machen ("flush out"; O.J. Cohen et al . , J. Am. Med. Assoc, 280:87-88 (1998); J. Cohen, Science, 279:1854-1855 (1998); D.D. Ho, Science, 280:1866-1867 (1998); L.K. Schräger et al . , J. Am. Med. Assoc, 280:67-71 (1998)). Konkret zeigt die Literaturstelle T.W. Chun et al . , Nature Medicme, Volume 5, Number 6, pp . 651-655 (1999), daß durch Einsatz des T- Zellwachstumsfaktors Interleukin 2 (IL-2) zusammen mit der HAART Therapie (siehe hierzu unten) eine signifikante Reduktion der Menge an replikationskompetentem HIV in den ruhenden T-Lymphozyten gefunden wird. Allerdings expnmiert der größte Teil ruhender CD4 T-Lymphozyten keine Rezeptoren für den Wachstumsfaktor IL-2. Diese Zellen und damit das darin en- thaltene latente HIV können deshalb durch die Darreichung von IL-2 nicht erreicht werden. Die grundsätzliche vorstehende Problematik bleibt daher bestehen und ist allenfalls geringfügig abgemildert. Hinzu kommt, daß die Darreichung von IL-2 mit beachtlich störenden Nebenwirkungen verbunden ist, welche den Erfolg dieser Strategie noch weiter relativieren.
Die verbreitetste Therapie unter Verwendung von Reverse Transkriptase Inhibitoren ist die HAART Therapie ("hochaktive anti-retrovirale Therapie"). Diese besteht in der kombinier- ten Anwendung von zwei Reverse Transkriptase Inhibitoren, z.B. die Nukleosidanaloge AZT (bzw. Zidovud e) und 3TC (bzw. Lamivudine) , zusammen mit einem oder mehreren Protease Inhibitoren. Ein Beispiel für einen Protease Inhibitor ist IDV (Indinavir). Bezüglich der HAART Therapie, der darin verwen- deten Substanzen und des Behandlungsplans wird auf die folgenden Literaturstellen verwiesen: J. Laurence, HAART Regiments: Do the effects last? in The AIDS Reader 7(6):84-85 (1997); R.M. Gulick et al . , N. Engl . J. Med., 337:734-739 (1997); S.M. Hammer et al . , N. Engl. J. Med., 337:725-733 (1997); und F.J. Jr . Palella et al . , N. Engl. J. Med., 338:853-860 (1998). Weitere Beispiele für geeignete Reverse Transkriptase Inhibitoren sind die Nukleosidanaloge d4T (Sta- vudine) , ddl (Didanosine) und ddC (Zalcitab e) sowie die nicht-Nukleosidanaloge DLV (Delavird e) und NVP (Nevirap- ine) . Weitere Beispiele für geeignete Protease Inhibitoren sind NFV (Nelf avir) , RTV (Ritonavir) und SQV (Saqumavir) .
Aus der Literaturstelle WO 98/54225 sind humanvertragliche monoklonale Antikörper, welche für Human-CD28 spezifisch sind und Human-T-Lymphozyten mehrer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der Human-T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, bekannt. Bezüglich weiterer Hintergrundinformation wird auf die m dieser Literaturstelle genannten Zitate verwiesen. Aus dieser Litera- turstelle ist es auch bekannt, diese monoklonalen Antikörper zur Behandlung von Erkrankungen mit pathologisch erniedrigten CD4-T-Zellzahlen, wie beispielsweise AIDS, zu verwenden. Hintergrund dieser Verwendung ist, daß mittels dieser Antikörper die CD4-T-Zellzahlen wieder angehoben werden können. Eine Verbindung mit der Darreichung von Reverse Tranksriptase Inhibitoren und ggf. Protease Inhibitoren ist nicht gezogen. Die Literaturstelle WO 98/54225 wird hiermit ausdr cklich vollumfanglich in Bezug genommen.
Aufgabe der Erfindung
Gegenüber dem nachstliegenden Stand der Technik gemäß T.W. Chun et al . , Nature Medicme, Volume 5, Number 6, pp . 651-655, liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung bzw. einen Behandlungsplan zu entwickeln, womit einerseits zumindest der größte Teil der HIV Latenzviren, wenn nicht alle, aktiviert (und damit durch Virus Inhibitoren hemmbar und letzlich zerstörbar gemacht) wird und andererseits die Nebenwirkungen reduziert werden.
Grundzuge der Erfindung
Die Erfindung lehrt die Verwendung monoklonaler Antikörper, welche für CD28 spezifisch sind und T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder ein Analog hierzu, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung m der Ausfuhrungsform als Präparat oder Praparatepaket zur Behandlung von Virusinfektionen beim Menschen oder niedrigeren Warmblutern, bei welchen T- Lymphozyten infiziert sind, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusatzlich einen Virus Inhibitor enthalt. Es versteht sich, daß die Wirkstoffkomponenten in pharmazeutisch wirksamen Dosen eingesetzt werden.
Die Erfindung lehrt weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer Ausfuhrungsform als Präparat oder als Praparatepaket, mit pharmazeutisch wirksamen Dosen der folgenden Wirkstoffkomponenten : a) vorzugsweise humanvertragli- chen monoklonalen Antikörpern, welche für CD28, vorzugsweise Human-CD28 spezifisch sind und T-Lymphozyten, vorzugsweise Human-T-Lymphozyten, mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder einem Analog hierzu, b) einem Virus Inhibitor, vorzugsweise einem Reverse Transknp- tase Inhibitor, c) optional einem von b) verschiedenen Reverse Transkriptase Inhibitor, d) optional einem Protease Inhibitor, e) optional einem von d) verschiedenen Protease Inhibitor. Neben den vorstehenden Wirkstoffkomponenten können noch weitere Wirkstoffe und/oder für die galenische Herrich- tung zweckmäßige oder notwendige Stoffe enthalten sein. Die Erfindung lehrt weiterhin eine Paketkomponente eines er- fmdungsgemaßen Praparatepakets enthaltend die Wirkstoffkomponente a) .
Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen mit Lentivirus, insbesondere HIV, wobei eine erfmdungsgemaße pharmazeutische Zusammensetzung einem von der Virusinfektion befallenen menschlichen Korper oder einem Korper eines niedrigeren Warmbluters dargereicht wird, bzw. ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen mit Lentivirus, insbesondere HIV, wobei einem menschlichen Korper oder einem Korper eines niedrigeren Warmbluters folgende Wirkstoffkomponenten pharmazeutisch wirksamer Dosis dargereicht werden: a) vorzugsweise humanvertragliche monok- lonale Antikörper, welche für CD28, vorzugsweise Human-CD28, spezifisch sind und T-Lymphozyten, vorzugsweise Human-T- Lymphozyten, mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenun- spezifisch aktivieren, oder ein Analog hierzu, b) ein Virus Inhibitor, vorzugsweise ein Reverse Transkriptase Inhibitor, c) optional ein von b) verschiedener Reverse Transkriptase Inhibitor, d) optional ein Protease Inhibitor, e) optional ein von d) verschiedener Protease Inhibitor.
Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung eines vorzugsweise humanvertraglichen monoklonalen Antikörpers a) , welcher für CD28, vorzugsweise Human-CD28, spezifisch ist und T-Lymphozyten, vorzugsweise Human-T-Lymphozyten, mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktiviert, oder eines Analogen hierzu, und eines Virus Inhibitors b) , vorzugsweise eines Reverse Transkriptase Inhibitors, in Form einer Mischung oder von raumlich getrennten Zusammensetzungen, von denen die eine die Wirkstoffkomponente a) und die andere die Wirkstoffkomponente b) enthalt, als Mittel zur Anwendung bei der Behandlung von Virusinfektionen mit Lentiviren, insbesondere AIDS, bei Menschen oder niedrigeren Warmblutern nach einem Behandlungsplan, der einen oder mehrere Zyklen umfaßt, wobei der Behandlungsplan aus folgenden Schritten besteht: 1) zunächst wird die Wirkstoffkomponente b) in einer pharmazeutisch wirksamen Dosis dargereicht, 11) nach einer vorgegebenen Dauer der Stufe 1) wird die Wirkstoffkomponente a) einer pharmazeutisch wirksamen Dosis dargereicht bei fort- fahrender Darreichung der Wirkstoffkomponente b) , m) optional wird Stufe n) nach einer vorgegebenen Ruhepause bei fortfahrender Darreichung der Wirkstoffkomponente b) einmal oder mehrmals wiederholt. Im Rahmen dieser Verwendung kann der Stufe I) eine Darreichung der Wirkstoffkomponente a) vorgeschaltet sein.
Die Erfindung beruht zunächst auf der Erkenntnis, daß durch die Aktivierung eines Großteils der T-Lymphozyten auch ruhendes (Latenz-) Virus aktiviert und so durch Virus Inhibi- toren, insbesondere Reverse Transkriptase Inhibitoren
(und/oder Protease Inhibitoren) , zerstörbar gemacht wird. Hieran anschließend beruht die Erfindung auf der weiteren überraschenden Erkenntnis, daß die parallele Anwendung von (toxischen) Reverse Transkriptase Inhibitoren, beispielsweise der (toxischen) HAART Therapie, die Aktivierung der T-
Lymphozyten nicht konterkariert. Dies hat im Ergebnis eine doppelte Bedeutung und folglich synergistische Wirkung. Einerseits ist so die Aktivierung des Großteils der T- Lymphozyten trotz paralleler HAART Therapie mit der Folge der Vernichtung praktisch des gesamten Latenzvirus-Reservoirs durch die HAART Therapie gewährleistet. Andererseits wird gleichzeitig die ohnehin pathologisch erniedrigte Anzahl der T-Lymphozyten wieder angehoben mit der Folge einer Stabilisierung des Immunsystems . Hinzu kommt noch, daß mit den er- fmdungsgemaßen Mitteln vermutlich auch nicht-T-Zell Reservoire für Latenzviren (z.B. Makrophagen) indirekt durch die starke generelle Stimulierung des Immunsystems bzw. der T-Zellen mit der entsprechenden Zytokinfreisetzung aktiviert werden und so auch diese Latenzviren aktiviert und zerstört werden können; eine weitere Synergie.
Letztendlich wird erreicht, daß nicht nur das freie Virus praktisch vollständig ausgeschaltet wird, sondern auch praktisch das ganze Latenzvirus Reservoir durch Aktivierung der Zerstörung zugänglich gemacht wird. Dadurch braucht die HAART Therapie nicht mehr lebenslang, zumindest jedoch nur noch in sehr großen Zeitabstanden, eingesetzt zu werden. Ein weiterer überraschender Vorteil gegenüber dem nachstliegenden Stand der Technik ist, daß die erfmdungsgemaß eingesetzten An- tikorper nach ersten Untersuchungen Tiermodellen keine Nebenwirkungen zu erzeugen scheinen. Insgesamt wird eine wesentlich effektivere Ausschaltung des Virus in Verbindung mit einer beachtlich verbesserten Befindlichkeit des Patienten bereits wahrend der Therapie erreicht.
In diesen Zusammenhangen mag angemerkt werden, daß mit den erfmdungsgemaß eingesetzten monoklonalen Antikörpern der Tat samtliche CD4 T-Zellen zur Proliferation angeregt werden können. Nur eine Subpopulation von CD8 T-Lymphozyten, die CD28 nicht exprimieren, kann nicht durch aktivierende CD28-spezιfische Reagenzien aktiviert werden. Allerdings stellt diese auch kein wesentliches Reservoir von HIV dar, da der primäre Rezeptor für HIV das CD4 Molekül ist.
Definitionen
Als monoklonale Antikörper sind Antikörper bezeichnet, die von Hybrid-Zellmien (sog. Hybridomen) produziert werden, die αurch Fusion einer Antikörper produzierenden B-Zelle tierischer oder menschlicher Herkunft mit einer geeigneten Myelom Tumorzelle entstanden sind. Im Rahmen dieser Beschreibung sind mit dem Ausdruck der monoklonalen Antikörper auch deren Derivate umfaßt.
Als CD28 wird ein auf T-Lymphozyten menschlicher und tierischer Herkunft exprimiertes Zelloberflachenmolekul bekannter Ammosauresequenz bezeichnet, dem im Rahmen der internationalen "Human Leukocyte Typing Workshops" das Kürzel CD28 gegeben wurde.
Mit Aktivierung von T-Lymphozyten ist die Vermehrung der Stoffwechselaktivitat, Vergrößerung des Zellvolumens, Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt m die Zellteilung (Proliferation) von T-Lymphozyten auf einen äußeren Reiz hm gemeint. Beispielsweise werden diese Vorgange durch Besetzung des CD28-Molekuls auf T-Zellen durch besondere CD28-spezιfische monoklonale Antikörper ausgelost. Die Aktivierung von T-Lymphozyten mit den beschriebenen Begleiterscheinungen ist Teil der physiologischen Immunreaktion, kann dort aber in pathologischen Situationen außer Kontrolle geraten (lymphoproliferative Erkrankungen) , oder unzureichend sein ( Immundeflzienz) .
Konstante Komponenten eines Antikörpers sind Bereiche, die nicht für die Antigenerkennung bedeutsam sind, im Gegensatz zu den variablen Bereichen, die die Antigenspezifitat eines Antikörpers definieren. Konstante Komponenten unterscheiden sich jedoch bei Antikörpern verschiedener Arten und folglich auch Tieren und Menschen. Die konstanten Bereiche eines Antikörpers müssen jenen von Antikörpern eines Organismus entsprechen, der mit den Antikörpern behandelt werden soll, um vertraglich zu sein. Unter Derivaten von monoklonalen Antikörpern sind Modifikationen des monoklonalen Antikörpers zu verstehen, die durch uoliche biochemische oder gentechnische Manipulationen erzeugt wurden. Dies ist beispielsweise gegeben mit der Hu- manisierung eines monoklonale Antikörpers der Maus durch partiellen Ersatz struktureller (konstanter) Komponenten des Maus-Antikorpers durch solche eines menschlichen. Derivate sind weiterhin monoklonale Antikörper, welche zwar chemisch verändert sind, jedoch dennoch die im Rahmen der Erfindung erläuterten Funktionen ausüben. Gemeinsames Kriterium ist stets die CD28 Spezifitat mit stimulatorischem Effekt.
Analoge sind Substanzen, die keine monoklonalen Antikörper sind, jedoch die im Rahmen der Erfindung erläuterten Funk- tionen ausüben. Beispiele hierfür sind "geschneiderte" hochspezifische synthetische Proteine oder RNA bzw. DNA Moleküle (z.B. Aptamere, insbesondere gegen Nukle saure- spaltende Enzyme stabilisierte Aptamere bzw. RNA oder DNA Moleküle) . Gemeinsames Kriterium ist stets die CD28-Spezιfitat mit stimulatorischem Effekt.
Unter einer Determinante ist der Bereich eines Moleküls zu verstehen, der durch die Bmdungsspezifitat eines oder mehrerer Antikörper definiert wird.
Der Ausdruck der therapeutisch aktiven Dosis bezeichnet im Zusammenhang mit Virus Inhibitoren, beispielsweise Reverse Transkriptase Inhibitoren (und ggf. Protease Inhibitoren), eine Dosis, die zu einer signifikanten Verringerung der Menge an replikationsfahigem Virus ab einem definierten Zeitraum nach Darreichung der Virus Inhibitoren an einen Patienten oder m einem Testsystem fuhrt, verglichen mit der Menge an replikationsfahigem Virus nach gleichem Zeitraum und gleicher Anfangsmenge an replikationsfahigem Virus, jedoch ohne irgendeine Darreichung. Der Ausdruck der therapeutisch aktiven Dosis bezeichnet im Zusammenhang mit erfmdungsgemaß eingesetzten Antikörpern eine Dosis, die zu einer signifikanten Erhöhung der CD4 T- Zellzahlen und/oder der Expression von serologisch nachweisbaren Aktivierungsmarkern (CD25, CD45R0, CD71) nach einem definierten Zeitraum in einem Organismus oder Testsystem, welchem die Antikörper dargereicht wurden, verglichen mit respektiven Werten nach gleichem Zeitraum und gleicher An- fangswerte, jedoch ohne irgendeine Darreichung.
Humanvertraglich bezeichnet Antikörper, welche humanisiert sind. Es mag hier angemerkt werden, daß nicht humanisierte und folglich nicht unter die hier getroffene Definition der humanvertraglichen Antikörper fallende Antikörper durchaus zur Therapie beim Menschen angewandt werden können. Bei der Therapie des Menschen können insofern alle Antikörper eingesetzt werden, welche über einen bestimmten Zeitraum keine unerwünschten Immunreaktionen auslosen, wie beispielsweise durch Bestimmung von anti-Immunglobulm Antikörper als Abbruchkriterium nachweisbar.
Als Virus Inhibitor ist jeder Wirkstoff bezeichnet, welcher in eine beliebige Stufe des Lebenszyklus eines Virus direkt oder indirekt hemmend eingreift. Hierfür kommen neben Reverse Transkriptase Inhibitoren und Protease Inhibitoren beispielsweise auch Inhibitoren der Zelloberflachenrezeptoren Frage, an welche ein Virus andockt, oder Inhibitoren aller positiv regulatorischen Proteine bzw. Prozesse eines Virus, einschließlich Inhibitoren zellularer positiv regulatorischer Substanzen, welche auf die long term al repeats eines Virus wirken. Grundsätzlich kommen auch Wirkstoffe in Frage, welche keine Inhibitoren sind, sondern negativ regulatorische Proteine bzw. Prozesse eines Virus induzieren; solche Wirkstoffe sind von dem Ausdruck Virus Inhibitor ebenfalls umfaßt. Der Begriff der kontinuierlichen Darreichung einer Wirkstoffkomponente b) und/oder c) und/oder d) und/oder e) meint, daß ein zu dieser Komponente anzuwendender ( sich ggf. diskontinuierlicher) Behandlungsunterplan kontinuierlich fortgeführt wird. Insofern schließt der Ausdruck der kontinuierlichen Darreichung beispielsweise bei der HAART Therapie auch ein Variation und individuelle Anpassung der Wirkstoffkomponenten bzw. deren Dosierung Verfolg der kontinuierlichen Darreichung ein.
Detaillierte Darstellung der Erfindung
Folgend werden zweckmäßige oder bevorzugte Ausfuhrungsformen der Erfindung angegeben und naher erläutert.
Bevorzugt ist die erf dungsgemaße Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, wobei CD4 T-Lymphozyten, insbesondere Human-CD4 T-Lymphozyten, infiziert sind, wobei die monoklonalen Antikörper für Human-CD28 spezifisch sind und wobei die monoklonalen Antikörper optional humanvertraglich sind. Bei der Behandlung von Infektionen von Human-CD4-Lymphozyten, also des Menschen, müssen die Antikörper Human-CD28 spezifisch sein, nicht jedoch notwendigerweise humanvertraglich . Die Erfindung ist beispielsweise anwendbar, wenn die Virusmfek- tion eine Infektion mit Retrovirus, insbesondere Lentivirus, beispielsweise HIV, ist.
Zweckmäßig ist es, wenn der Virus Inhibitor ein Reverse Trankriptase Inhibitor, vorzugsweise ein Pyrimidm- Nukleosidanalog, hochstvorzugsweise 3 ' -Azιdo-3 ' -desoxythymi- din (AZT oder Zidovud ) , ist und optional weiterhin zusätzlich andere hiervon verschiedene Nukleosidanaloge, vor- zugsweise 3TC, in der pharmazeutischen Zusammensetzung ent- halten sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusätzlich einen Proteaseinhibitor enthalten und optional weiterhin zusatzlich andere, hiervon verschiedene Proteasein- hibitoren. Mit einer Wirkstoffkombmation aus zumindest zwei Reverse Transkriptase Inhibitoren und optional zumindest einem Protease Inhibitor arbeitet die HAART Therapie.
Erfmdungsgemaß eingesetzte monoklonale Antikörper sind auf die verschiedensten Weisen erhaltlich. Eine verwendbare Aus- fuhrungsform gemäß der Ausfuhrungsbeispiele ist erhältlich sind durch A) Herstellung von zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikorpern befähigten Hybri- domzellen im Wege einer Immunisierung mit nicht-T- Tumorzelllmien, auf welchen Human-CD28 expπmiert ist, B) ggf. Humanisierung der aus Hybndomzellen gemäß Stufe A erhältlichen monoklonalen Tier-Antikorper durch biochemischen oder gentechnologischen Austausch konstanter Komponenten der Tierantikorper gegen analoge konstante Komponenten eines menschlichen Antikörpers bzw. Austausch den Komponenten ent- sprechender Gene der Hybndomzellen, C) Sezernierung der monoklonalen Antikörper in Hybridomzell-Kulturen und Isolierung der monoklonalen Antikörper daraus oder Produktion der monoklonalen Antikörper durch Injektion der Hybndomzellen in Tiere, beispielsweise Mause, und Isolierung der monok- lonalen Antikörper aus der Korperflussigkeit der Tiere. Die zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier- Antikorpern befähigten Hybndomzellen sind erhältlich durch a) Schaffung eines Plasmids mittels Insertion von Human-CD28 cDNA m den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall- Hindlll Fragments und Herstellung von Protoplasten aus Es- chenchia coli (MC1061), welche das Plasmid tragen, b) Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol, c) Kultivierung der in Stufe b erhaltenen transfektierten Zellen, d) Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und Selektion von Human-CD28 ex- primierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, e) Immunisierung von BALB/c Mausen mit den Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, f) Entnahme von Milzzellen der so lmmu- nisierten Mause und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol, g) Se- lektierung der so erhaltenen Hybndomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybndomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zellen binden und h) Kultivierung/Subclonierung der in Stufe g erhaltenen selektierten Hybndomzellen. Anstelle der Stufen a) bis d) können selbstverständlich aber auch andere dem Fachmann gelaufige Expressionsysteme eingesetzt werden. Human-CD28 cDNA ist frei erhältlich von Dr. A. Aruffo und Dr. B. Seed, die die Sequenz und auch folgende Literaturstelle veröffentlicht haben: Aruffo, A., and Seed, B, 1987, "Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high effi- ciency COS cell expression System", Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 84:8573. Dieser Literaturstelle ist daher im einzelnen die Herstellung der Human-CD28 cDNA entnehmbar. Daruberhmaus kann unschwer jeder Fachmann mit Hilfe der in der Genbank deponierten Sequenz und der Polymerasekettenreaktion sehr einfach und schnell einen Human-CD28 cDNA Klon herstellen. Der pHßAPr-1-neo Vector ist frei erhältlich von den Aufhören der Literaturstelle Gunning, P, et al., 1987, "A human ß- actm expression vector system directs high-level accumula- tion of antisense transcπpts", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4831. "neo" steht dabei für Neomycm-Resistenz . Die Stufe c) wird daher in Anwesenheit von Neomycin durchgeführt. Die vorstehend angesprochenen Zellmien und/oder Mikroorganismen sind frei verfugbar und kauflich erwerbbar bei der American Type Culture Collection (ATCC) . Bezuglich Eschenchia coli (MC1061) wird ergänzend auf die Literaturstelle Meissner, P.S., et al., 1987, "Bacteriophage gamma cloning system for the construction of directional cDNA libraries", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4171, verwiesen.
Die grundsatzliche Vorgehensweise bei der Herstellung von Hybndomzellen, bei der Humanisierung sowie bei der Produktion der monoklonalen Antikörper aus (humanisierten) Hybndomzellen ist dem Fachmann gut vertraut und braucht hier nicht naher erläutert zu werden. Grundsatzlich sind alle insbesondere für die Herstellung der Hybndomzellen üblichen, bekannten und frei verfugbaren Zellmien einsetzbar. Zur Herstellung der monoklonalen Antikörper kommt grundsätzlich neben der folgend beschriebenen Vorgehensweise die dem Fachmann im Detail gut geläufige rekombmante Expression in Frage.
Einsetzbare monoklonale Antikörper sind aber auch auf anderen Wegen zugänglich. So kann beispielsweise die Immunisierung in Stufe A) gegen losliches bzw. gelöstes rekombmantes Human-CD28 erfolgen. Die Humanisierung kann entbehrlich gemacht werden, indem bei der Herstellung der Hybndomzellen Tiere eingesetzt werden, die gentechnisch so verändert sind, daß die gebildeten Antikörper bereits die humanen konstanten Komponenten aufweisen. Ein völlig anderer Ansatz zur Herstellung monoklonaler Antikörper besteht darin, daß die Antigen- Bmdungsdomanen (z.B. menschlicher) Antikörper m einer hochkomplexen Baktenophagen-Bibliothek gentechnisch exprim- lert werden, aus welcher geeignete Bindungsdomanen durch ihre Affinitat für CD28 isoliert und zu vollständigen Antikörpern ergänzt werden können.
Hinsichtlich der pharmazeutischen Zusammensetzung können die Wirkstoffkomponenten b) bis e) entsprechend der HAART Therapie ausgewählt, dosiert und darreichungsfertig hergerichtet sind. Grundsatzlich sind alle bestehenden und zukunftig entwickelten Varianten der HAART Therapie oder einer anderen Therapie brauchbar, solange nicht durch eine oder mehrere Wirkstoff omponenten die aktivierende Wirkung der monoklonalen Antikörper (über-) kompensiert wird. Im Rahmen derzeitiger Therapieansatze ist oft erfolgversprechend, wenn die Wirkstoffkomponente b) ein Pyrimidm-Nukleosidanalog, vorzug- sweise 3 '-Azιdo-3 ' -desoxythymidin, ist und/oder die
Wirkstoffkomponente c) 3TC ist, und/oder die Wirkstoffkomponente d) zwingend eingerichtet ist. In Hinblick auf eine Variante eines erfindungsgemaßen Behandlungsplans kann es zweckmäßig sein, wenn die Wirkstoffkomponenten b) bis e) Bestandteil einer ersten Paketkomponente und die
Wirkstoffkomponente a) Bestandteil einer zweiten Paketkomponente sind.
Bei der Anwendung der Erfindung m einem Behandlungsverfahren können die Wirkstoffkomponenten b) bis e) entsprechend der HAART Therapie ausgewählt, dosiert und dargereicht werden, wobei die Wirkstoffkomponente a) vor, zusammen oder nach den Wirkstoffkomponenten b) bis e) dargereicht werden. Im einze- lenen können die Wirkstoffkomponenten b) bis e) kontinuier- lieh und die Wirkstoffkomponente a) einmal oder mehrmals in zeitlichen Abstanden mit Ruhepausen, dargereicht werden. Die Wirksto fkomponente b) kann ein Pyrimidm-Nukleosidanalog, vorzugsweise 3'-Azιdo-3 -desoxythymidin, und/oder die Wirkstoffkomponente c) kann 3TC, und/oder die Wirkstoffkompo- nente d) kann zwingend eingerichtet sein.
Im Rahmen eines erfindungsgemaßen Behandlungsplans kann die Darreichung der Wirkstoffkomponente b) im Rahmen eines Behandlungsunterplans erfolgen, welcher die HAART Therapie ist. Zunächst erfolgt die HAART Grundtherapie über eine Dauer von 1 bis 12 Monate, vorzugsweise 2 bis 6 Monate, hochstvorzug- sweise 2 bis 4 Monate, beispielsweise 3 Monate (1 Monat = 30 Tage) . Wahrend dieser Zeit können CD4 T-Zellzahlen und/oder Virusbelastung und/oder Latenzvirus (beispielsweise gemäß der Literaturstelle T.W. Chun et al., Nature, 387:183-188 ( 1997) ) regelmäßig überprüft werden und kann auf Basis dieser Ergebnisse die HAART Therapie individuell auf den Patienten angepaßt werden (durch Wahl bzw. Austausch und Kombination der Reverse Transkriptase Inhibitoren und/oder der Protease Inhibitoren sowie der jeweiligen Dosierungen). In einem ersten Zyklus kann dann eine vorzugsweise l.v. Injektion von Antikörpern m einer Dosierung von 0,1 bis 50, vorzugsweise 0,5 bis 20, hochstvorzugsweise 0,5 bis 5 mg/kg Korpergewicht erfolgen unter Aufrechterhaltung der HAART Therapie. Die vor- stehende Dosis kann auf einmal oder in 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 5, Teilmengen über einen Zeitraum von lh bis 1 Monat, vorzugsweise 1 Tag bis 5 Tage, gleichmaßig oder ungleichmäßig verteilt verabreicht werden. In einer hieran anschließenden Ruhepause (unter Aufrechterhaltung von HAART) von 1 Tag bis 6 Monaten, vorzugsweise 0,5 bis 2 Monaten, beispielsweise 1
Monat, kann eine Überwachung der vorstehend zur Grundtherapie genannten Werte und/oder des Blutbildes und/oder der Blutwerte und/oder klinisch internistischer Befunde und/oder der Bildung von anti-Immunglobulm Antikörpern (anti-Tier Ig bei nicht humanisierten Antikörpern, anti-idiotypisch nach Human- lsierung) erfolgen. Nach Ablauf der Ruhepause kann bei Bedarf der Zyklus beginnend mit der Darreichung des Antikörpers wiederholt werden. Wenn PBMC (Lymphozyten plus Monozyten) virus- und latenzvirus- bzw. provirusfrei sind, kann bei E - Verständnis des Patienten eine Lymphknotenbiopsie zur Verifizierung durchgeführt werden. Bei positivem Ergebnis (positiv = Detektion von Virus bzw. Latenzvirus bzw. Provirus) können weitere Zyklen der vorstehend beschriebenen Art angeschlossen werden. Bei negativem Ergebnis kann die Dar- reichung von HAART Wirkstoffen und von Antikörpern abgesetzt werden. Es empfiehlt sich, nach Absetzung weiter Kontrolluntersuchungen der vorstehenden Art m bestimmten zeitlichen Abstanden durchzufuhren, um ggf. die Behandlung wieder aufzunehmen. Die vorstehenden Ausfuhrungen gelten ent- sprechend für ein Behandlungsverfahren. Eingesetzt werden können im Rahmen der Erfindung beispielsweise der monoklonale Antikörper CMY-2, erhältlich aus Hybndomzellen gemäß Hinterlegung DSM ACC2353, oder der käuflich von der Firma ALEXIS Deutschland GmbH, D-35305 Grun- berg, erhältliche und von der Firma Ancell Corporation, USA, hergestellte Klon ANC28.1/5D10 oder eine vorzugsweise humanisierte bzw. humanvertragliche Variante des Klons ANC28.1/5D10.
Erfmdungsgemaß eingesetzte monoklonale Antikörper können insbesondere Spezifitat für Determinanten des menschlichen CD28-Molekuls aufweisen, die auf dem natürlicherweise exprim- lerten CD28-Molekul schwer zugänglich sind und deren Be- setzung durch die monoklonale Antikörper zur Aktivierung der T-Zellen fuhrt.
Die galenische Herrichtung von Wirkstoffkomponenten oder von Mischungen daraus für die verschiedenen Verabreichungsformen ist dem Fachmann gut bekannt und braucht hier nicht naher erläutert zu werden.
Zu einer Anspruchskategorie getroffene Erläuterungen gelten für die Gegenstande der anderen Anspruchskategorien entsprechend.
Im Rahmen der Erfindung können optional noch zusätzliche Wirkstoffe präsent sein oder verwendet werden, welche von den vorstehend genannten und gemäß der Grundkonzeption der Er- findung eingesetzten Wirkstoffen verschieden sind. Solche zusätzliche Wirkstoffe sind beispielsweise Wirkstoffe, welche eventuellen Nebenwirkungen entgegenwirken. Lediglich beispielhaft seien anti-TNF-Antikorper (TNF = Tumor Nekrose Faktor) im Falle einer pro flammatorischen TNF Reaktion genannt. Zusätzliche Wirkstoffe sind weiterhin Wirkstoffe, welche im Zusammenhang mit der Expansion des Immunsystems hilfreich sein können. So kann beispielsweise durch Gabe von IL-2 die Proliferation von CD8-Zellen induziert bzw. verstärkt werden. Generell können als zusatzliche Wirkstoffe immunmodulierende Wirkstoffe eingesetzt werden nach Maßgabe des immunologischen (Detail- bzw. Neben-) Prozesses welcher im Zusammenhang mit der Erfindung zweckmaßigerweise gefordert (oder gehemmt) wird. Beispiel hierfür sind Oligonukleotide enthaltend CpG Motive (D. Klmman et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:2879-2883 (1996)).
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausfuhrungsbei- spielen naher erläutert. U.a. wird die Herstellung er- fmdungsgemaß eingesetzter monoklonaler Antikörper beschrie- ben. In diesen Ausfuhrungsbeispielen werden auch
Screenmgverfahren im einzelnen deutlich, mit welchen er- fmdungsgemaße monoklonale Antikörper bzw. zugrundeliegende Hybndomzellen selektiert werden können. Aus den folgenden Beispielen werden auch die therapeutischen Wirkungen deutlich.
Beispiel 1: Herstellung und Wirkung eines ersten erfmdungsgemaß verwendbaren monoklonalen Antikörpers.
1.1 Allgemeine Informationen.
Die dargestellten Experimente bzw. die Beispiele zu den Wirkungen von "direkten" CD28-spezιfischen monoklonalen Antikörpern wurden im Tiermodell der Ratte durchgeführt, wobei als Beispiel für einen "klassischen" CD28-spezιfischen Antikörper der monoklonale Antikörper JJ319 und als Beispiel für einen "direkt" aktivierenden der monoklonale Antikörper JJ316 eingesetzt wird. Beide Antikörper sind frei verfugbar und käuflich erwerbar von der Firma Pharmmgen, San Diego, USA. JJ319 und JJ316 Antikörper sind im übrigen erhältlich gemäß der Literaturstelle M. Tacke et al . , xmmunology, 1995, 154: 5121-5127, auf welche hiermit ausdrucklich Bezug genommen wird, auch im Hinblick auf Details der Herstellung von Hybndomzellen und monoklonalen Antikörpern.
1.2: Herstellung monoklonaler Antikörper
In diesem Beispiel wird die Herstellung erfindungsgemaßer, d.h. human-CD28-spezιfιscher monoklonaler Antikörper naher erläutert. Diese werden folgend auch als CMY-2 bezeichnet. Human CD28 aus einer cDNA Bibliothek wurde A20J und/oder L929 Zellmien rekomb ant exprimiert. Zunächst wurde hierzu ein Plasmid mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall-Hindlll Fragments geschaffen. Aus Eschenchia coli (MC1061) wurden Protoplasten hergestellt, welche das Plasmid tragen. Dann erfolgte eine Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol . Die so erhaltenen transfektierten Zellen wurden auf übliche Weise kultiviert. Anschließend erfolgte ein Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und Selektion von Human-CD28 expri ierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen.
Der Nachweis der erfolgreichen Expression erfolgte mit Hilfe eines konventionellen, kommerziell erhaltlichen fluoreszenzmarkierten Antikörpers mit Spezifitat für Human CD28 ( 9.3-Phykoerythrm) . Als Negativkontrolle wurden nicht trans- fizierte A20J- bzw. L929-Zellen mit dem gleichen Antikörper gefärbt. Die Transfektanten (A20J-CD28 und L929-CD28) zeigten eine höhere Fluoreszenz tensitat . Da nicht alle Zellen CD28 positiv waren, wurden CD28-posιtιve Zellen subkloniert und zur Immunisierung verwendet. Wie in Fig. 1 an der Ver- Schiebung der Punktwolken nach oben den beiden rechten Diagrammen erkennbar, reagierten diese Zellen mit dem käuflichen Antikörper, druckten also Human CD28 an ihrer Oberflache aus.
Die A20J Human-CD28 Zellime wurde zur Immunisierung von BALB/c Mausen verwendet. Zellfusion und screenmg wurden wie folgt durchgeführt: l) Immunisierung von BALB/c Mausen mit den Human-CD28 expnmierenden Maus A20J Zellen (Injektionen 6 x l.p. und anschließend 1 x i.V.). n) Entnahme von Milzzellen der so immunisierten Mause und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellime X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol . in) Selektierung der so erhaltenen Hybndomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybndomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zellen binden.
Als read-out diente die Anfarbung einer Mischung aus CD28 transflzierten und untransflzierten Maus L929 Tumorzellen. Fig. 2 zeigt, daß der auf diesem Weg isolierte monoklonale Antikörper CMY-2 transflzierte und untransflzierte Zellen durch unterschiedliche Fluoreszenzmtensitat unter- scheidet. Das differentielle Screenmg auf Antikörper gegen Human-CD28 erfolgte wie folgt. Je 50 μl Überstand von kultivierten Zeilhybridomen wurden entnommen und mit einem Gemisch aus L929-Zellen und L929-CD28-Transfektanten 15 mm mkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit DaMIg-PE angefärbt. Teil A zeigt die Negativkontrolle. Die Zellen wurden nur mit DaMIg-PE mkubiert. Teil B zeigt die Färbung mit einem Überstand, der leicht positiv war, aber keinen Unterschied bei beiden Zellen zeigt. Teil C zeigt die mit einem Überstand von CMY-2 gefärbten Zellen.
In nicht dargestellten Experimenten wurden peπphere Blutzellen des Menschen mit dem neu isolierten CMY-2 und dem "klassischen" CD28-spezιfischen Antikörper 9.3 gefärbt. Es wurde ein identisches Expressionsmuster auf den Subpopula- tionen menschlicher Blutzellen gefunden.
Zusammengefaßt zeigen die Experimente, daß CMY-2 ein human CD28-spezιfischer Antikörper ist.
CMY-2 wurde sodann mit aus peripherem Blut auf circa 80 % angereicherten menschlichen T-Lymphozyten auf klassische kostimulierende und auf "direkt" stimulierende Aktivität getestet. Die T-Zellproliferation wurde durch Einbau von Η-Thymidm zwischen dem 2. und 3. Tag der Kultur gemessen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
Kostimulation:
Unstimulierte Zellen 276 cpm
CD3-spezιfιscher Antikörper 3111 cpm
CD3-spezιfιscher Antikörper + CMY-2 51676 cpm
Direkte Stimulation:
Solid-phase anti-mouse Ig 379 cpm
Solid-phase anti-mouse Ig + Kontroll-mAk 258 cpm
Solid-phase anti-mouse Ig plus CMY-2 19115 cpm
Zur Erläuterung: Antι-CD3 sorgt für T-Zellrezeptor-
Stimulation (CD3 ist Teil des TCR-Komplexes) . CMY-2 wurde in Form eines nicht aufgereinigten Kulturuberstandes (50 Endvolumen) verwendet. Erfahrungsgemäß ist die dabei zu erwartende effektive mAk-Konzentration suboptimal für eine direkte Aktivierung, aber ausreichend für die Kostimulation. Das Experiment zeigt, daß CMY-2 direkt aktivierende Eigenschaften hat.
Hybndomzellen, welche CMY-2 produzieren, sind bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, unter der Nummer DSM ACC2353 (20.05.1998) hinterlegt worden.
1.3 Proliferative Antwort auf den Antikörper aus 1.2.
Fig. 3 zeigt die proliferative Antwort ungetrennter Lymphknotenzellen der Ratte auf den "direkt" stimulierenden CD28-spezιfischen monoklonalen Antikörper (JJ316) und das Ausbleiben einer solchen Antwort bei Einsatz eines "klassischen " CD28-spezιfιschen monoklonalen Antikörpers (JJ319) . Die Zellen wurden zwei Tage lang m 0,2 ml Medium (RPMI 1640, erhältlich von GIBCO/BRL, enthaltend 5 % FCS [fetal calf serum] ) in An- oder Abwesenheit der angegebenen Zusätze bei einer Dichte von 1 Mio. Zellen pro ml im begasten Brutschrank kultiviert. Die Zellteilungsaktivitat wurde durch den Einbau radioaktiv markierten Thymidms (1 μCi/Ansatz für 16 Std., lCi = 37GBq, Bestimmung mit ß-Detektor) bestimmt.
Im Gegensatz zu veröffentlichten Resultaten (Siefken et al . , Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65) zeigt dieses Ergebnis, daß es für die T-Zell-Aktivierung durch direkt aktivierende CD28-spezιfische monoklonale Antikörper nicht notwendig ist, diese artifiziell durch einen zweiten Antikörper miteinander zu vernetzen. Vielmehr reicht die Anwesenheit von nicht-T- Zellen aus lymphoiden Organen, nämlich von B-Lymphozyten und sogenannten akzessorischen Zellen, um eine direkte Aktivierung durch loslich zugegebene CD28-spezιfische monoklonale Antikörper zu ermöglichen. Wahrscheinlich geschieht dies durch Bindung der monoklonale Antikörper an sogenannte Fc-Rezeptoren dieser nicht-T-Zellen. Dieses Ergebnis ist eine wichtige Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz "direkt" stimulierender CD28-spezιfischer monoklonale Anti- korper, m dem eine artifizielle Vernetzung mit anti-Immun- globul Antikörpern im Gesamtorganismus nicht praktikabel
"Direkt" aktivierende CD28-spezιfische monoklonale Antikörper fuhren zu einer Erhöhung der CD4 T-Zellzahl im intakten
Organismus. Fig. 4 zeigt dies für Lymphknoten der Ratte, die am Tag 0 1 mg des "direkt" stimulierenden CD28-spezιfischen monoklonale Antikörpers (JJ316) oder des "klassischen" CD28- spezifischen monoklonalen Antikörpers (JJ319) erhalten hatten. Mit erfindungsgemaßen direkt aktivierenden monoklonalen Antikörpern mit Spezifitat für Human-CD28, und deren Fähigkeit, die Vermehrung von T-Lymphozyten zu stimulieren, werden ganz analoge Effekte erreicht. Im vorliegenden Beispiel ist die CD4 T-Zellzahl nur vorübergehend erhöht; das liegt daran, daß gesunde Tiere mit normalen CD4 T-Zellzahlen behandelt wurden. Die aufgrund der Proliferationsstimulierung "übersch ssigen" Zellen werden durch homoostatische Mechanismen abgebaut.
Die vorstehend im einzelnen erläuterten Ergebnisse zeigen, daß eine Aktivierung der T-Lymphozyten erfolgt, und zwar ohne die Notwendigkeit weiterer Wirkstoffe.
Beispiel 2: Verwendung erfmdungsgemaß eingesetzter Antikörper Verbindung mit der HAART Therapie
2.1: Allgemeine Informationen.
In den folgend beschriebenen Versuchen wurde anstelle des Beispiel 1 beschriebenen monoklonalen Antikörpers der Antikörper Klon ANC28.1/5D10 der Firma Ancell Corporation, USA, vertrieben von der Firma ALEXIS Deutschland GmbH, Giessener Str. 12, D-35305 Grunberg, eingesetzt. Von diesen Antikörpern ist bekannt, daß sie m CD28 positiven Zellen IL-2 induzieren. Eine proliferationsmduzierende Aktivität dieses Antikörpers ist jedoch bislang nicht beschrieben worden. Dieser Antikörper wird folgend kurz als "aCD28" bezeichnet. In den folgenden Versuchen wird zu Vergleichszwecken ein monoklonaler Antikörper verwendet, welcher nicht "direkt" stimulierend ist, nämlich CD28.2.
Die Versuche wurde, sofern nicht anders angegeben, in humanen PBL oder in PBL von Rhesusaffen durchgeführt. Dieser Zellkulturansatz kommt der Situation im Gesamtorganismus nahe, weil der stimulierende Antikörper, wie für eine Therapie vorgesehen, in löslicher Form zugesetzt wird.
Bei allen Proliferationsexpenmenten wurde gemessen durch einen Puls von lμCi 3 H-Tymidin für 16 Stunden zwischen Tag 3 und Tag 4 und Detektion mittels ß-Detektor.
Sofern nicht anders angegeben wurden Zellen in 0,2 ml Medium (RPMI 1640, erhältlich von GIBCO/BRL, enthaltend 5% menschliches AB Serum) bei einer Dichte von 1 Mio. Zellen pro ml im begasten Brutschrank kultiviert.
2.2: Induktion von T-Zellproliferation m penpheren Blut- Lymphozyten und/oder Monozyten (PBMC) durch aCD28.
In der Fig. 5 sind Versuche zum Maß der Aktivierung der Pro- liferation von CD4 T-Zellen dargestellt. Der Nachweis erfolgte durch Immunfluoreszenz und Durchflußzytophotometπe (FACS) am Tage vier nach Stimulation der Zellen vitro. Fig. 10a zeigt sogenannte "dotplots", wobei durch ein Gate (R2) die CD4 T-Zellen definiert werden (sie exprimieren CD3 und CD4) . In der Fig. 10b ist einem Histogramm die Anfar- bung dieser CD4 T-Zellen mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Transfeπnrezeptor (CD71) dargestellt. Die Expression dieses Oberflachenrezeptors charakterisiert pro- lifeπerende Zellen. Man erkennt, daß m einem Großteil, nämlich >90%, der CD4+ T-Lymphozyten die Proliferation durch aCD28 (direkt) induziert wird. Die Untersuchungen erfolgten
Figure imgf000027_0001
In der Fig. 6 sind entsprechende Darstellungen, jedoch ohne Stimulation, als Negativkontrollen gezeigt.
2.3: Vergleich der Stimulation der Proliferation von ungetrennten PBMC durch aCD28 und IL-2.
Die Figur 7 zeigt, daß die Proliferation ungetrennter PBMC von nicht infizierten menschlichen Spendern, gemessen am Einbau J H-markierten Tymidms, durch aCD28 starker ist als durch IL-2. Dies zeigt, daß mehr Zellen mittels aCD28 angesprochen werden als bei der in vivo Therapie mit HAART und IL-2 gemäß dem Stand der Technik. Die Kultivierung erfolgte in Gegenwart von 5μg/ml aCD28 bzw. 20 I.U./ l IL-2 in 96-well Rundboden Platten.
Wichtig ist darüber hinaus, daß IL-2 praferentiell CD8T-Lymphozyten zur Proliferation stimuliert, wahrend durch aCD28 besonders CD4 T-Zellen angesprochen werden. Dies ist aus den Daten der Tabelle I ersichtlich: PBMC eines HIV infizierten Patienten wurden drei oder 10 Tage mit IL-2 bzw. aCD28 stimuliert. Durch IL-2, nicht aber durch aCD28 erfolgte eine deutliche Verschiebung zu Gunsten der CD8 T-Zellen.
Tabelle I
nach 3 Tagen nach 10 Tagen .CD4 %CD8 cCD4 °CD8 Medium 51 49 50 50
IL-2 46 54 27 73 aCD28 57 43 62 38
2.4: Stimulation der Proliferation von PBMC aus Virus- mfizierten Organismen.
Figur 8A zeigt die aktivierende Wirkung von aCD28 auf die Proliferation von PBMC aus HIV-1 infizierten Personen, Figur 8B Entsprechendes für PBMC aus SlV-infizierten Rhesusaffen. Eingesetzt wurde eine Menge von 5μg/ml aCD28. In allen Fallen konnte starke Proliferation induziert werden, die bei massiver HIV-Infektion jedoch am geringsten ausfiel. Dies hangt vermutlich mit der damit einhergehenden massiven Induktion der Virusvermehrung und damit einhergehender T-Zellzerstorung zusammen, die bei erfmdungsgemaßer Behandlung bei gemeinsamer Darreichung von HAART Wirkstoffen vermieden wird (siehe auch Beispiel 2.6a und Fig. 10).
2.5: Aktivierung der Proliferation in Gegenwart von HAART-Wirkstoffen.
PBLs einer HIV-1 infizierten Person wurden nicht, mit HAART Wirkstoffen (Zidovudine + Didanosme + Saqumavir; 0, IμM) allein, mit aCD28 (5μg/ml) allem oder mit beidem behandelt. Nach 6 Tagen wurde die Proliferation gemessen.
Mann erkennt in der Figur 9, in welcher die Ergebnisse dargestellt sind, daß die Induktion der Proliferation mittels aCD28 durch Anwesenheit von HAART nicht berührt ist. 2.5a Forderung der CD28-, nicht jedoch der IL-2-ιnduzιerten T-Zellproliferation.
PBMC eines HIV-1 infizierten Patienten wurden wie vorstehend beschrieben stimuliert. Die Proliferation wurde von Tag 3 zu Tag 4 gemessen. Wie bei infizierten Patienten bisweilen beobachtet, induziert IL-2 eine stärkere Proliferation als CD28, die jedoch vorwiegend die nicht HIV belasteten CD8 T-Zellen betrifft (siehe Tabelle I). Diese wird nicht durch HAART bee- mflußt, wahrend die aCD28-mduzιerte durch HAART verbessert wird, (siehe Fig. 10)
2.6: Einfluß von aCD28/HAART auf die Virusreplikation.
Untersucht wurde die Virusreplikation in PBMC von HIV-1 infizierten Personen. In Wochenabstanden wurde freier Überstand mittels ELISA auf die Gegenwart von p24Gag (Virusprotein) untersucht. HAART wurde wie Beispiel 2.5 verwendet. "+" bedeutet hier und folgend Einsatz der betreffenden
Wirkstoffkomponente, "-" Abwesenheit. Man erkennt m der Fig. 11, daß die aCD28 Stimulation auch eine massive Virusproduk- tion induziert. Bei gleichzeitiger HAART ist die Virusproduk- tion jedoch vollständig unterdruckt. PHA ist Phytohamagglutmm zum Vergleich.
2.7: Verlust der HIV-1 Produktion nach Behandlung mit aCD28 und HAART.
In der Figur 12 sind Ergebisse einer Versuchsreihe dargestellt, wobei PBMC von einer HIV-1 infizierten Person bis zum Tag 6 gemäß der Tabelle behandelt wurden. Vom Tag 6 bis zum Tag 9 erfolgte eine reine HAART Behandlung, gefolgt von einer Behandlung mit aCD28 (auch ComMCD28 genannt) vom Tag 9 bis zum Tag 14. Die Ergebnisse bestätigen jene aus Beispiel 2.7, da demgemäß auch nach erneuter Stimulation von Zellkulturen HlV-inflzierter PBMC nach Beendigung der HAART Therapie keine Virusproduktion beobachtet wird.
2.8: Verlust auch proviraler HIV DNA nach Behandlung mit aCD28 und HAART.
PBMC welche von einer HIV-1 infizierten Person isoliert wurden, wurden entsprechend der Tabelle kultiviert und m vitro behandelt (Wirkstoffe und Wirkstoffmengen wie m Beispiel 2.5). Am 11. Tag der Kultivierung wurde eine HIV-1 spezifische DNA-PCR durchgeführt:
a) extern; pπmer:
JA (gagl319-1338) : gaa ggc ttt cag ccc aga ag JA7 (gagl615-1596) : tct cct act ggg ata ggt gg Annealmg Temp.: 47°C; 42 Zyklen
b) nested; pπmer: JA5(gagl446-1465) acc atc aat gag gaa gct gc JA6(gagl577-1558) tat ttg ttc ctg aag ggt ac Annealmg Temp.: 45°C; 25 Zyklen.
In der Figur 13 hierzu erkennt man, daß provirale HIV DNA bei kombinierter Behandlung mit HAART und erfmdungsgemaß eingesetzten monoklonalen Antikörpern nicht mehr nachweisbar ist, wahrend in den anderen Fallen der Tabelle stets provirale HIV DNA präsent war. Dies demonstriert m einem der Situation des Gesamtorganismus sehr nahe kommenden Testsystem die erfolgreiche Zerstörung auch des Reservoirs an proviralen Strukturen durch die Erfindung.

Claims

Patentansprüche :
1. Verwendung monoklonaler Antikörper, welche für CD28 spezi- fisch sind und T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder eines Analogen hierzu zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in der Ausfuhrungsform als Präparat oder Praparatepaket zur Behandlung von Virusin- fektionen beim Menschen oder niedrigeren Warmblutern, bei welchen T-Lymphozyten infiziert sind, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen Virus Inhibitor enthalt .
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei CD4 T-Lymphozyten, insbesondere Human-CD4 T-Lymphozyten infiziert sind, wobei die monoklonalen Antikörper für Human-CD28 spezifisch sind und wobei die monoklonalen Antikörper optional humanver- traglich sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Virus fek- tion eine Infektion mit Retrovirus, insbesondere Lentivirus, beispielsweise HIV, ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Virus Inhibitor ein Reverse Trankriptase Inhibitor, vorzugsweise ein Pyrimidm-Nukleosidanalog, hochstvorzugs- weise 3 -Azιdo-3 -desoxythymidin (AZT oder Zidovud e) , ist und optional weiterhin zusätzlich andere hiervon verschiedene Nukleosidanaloge, vorzugsweise 3TC, in der phar- mazeutischen Zusammensetzung enthalten sind.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen Prote- ase hibitor enthalt und optional weiterhin zusätzlich andere, hiervon verschiedene Proteasemhibitoren.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung m einer Aus fuhrungsform als Präparat oder als Praparatepaket, mit pharmazeutisch wirksamen Dosen der folgenden Wirkstoffkomponenten :
a) vorzugsweise humanvertraglichen monoklonalen Antikörpern, welche für CD28, vorzugsweise Human-CD28 spezi- fisch sind und T-Lymphozyten, vorzugsweise
Human-T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder einem Analog hierzu
b) einem Virus Inhibitor, vorzugsweise einem Reverse Transkriptase Inhibitor,
c) optional einem von b) verschiedenen Reverse Transk ip- tase Inhibitor,
d) optional einem Protease Inhibitor,
e) optional einem von d) verschiedenen Protease Inhibitor.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Wirkstoffkomponenten b) bis e) entsprechend der HAART Therapie ausgewählt, αosiert und darreichungsfertig hergerichtet sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, wobei
die Wirkstoffkomponente b) ein Pyrimidm-Nukleosidanalog, vorzugsweise 3 ' -Azιdo-3 ' -desoxythymidin, ist und/oder
die Wirkstoffkomponente c) 3TC ist, und/oder
die Wirkstoffkomponente d) zwingend eingerichtet ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Wirkstoffkomponenten b) bis e) Bestandteil einer ersten Paketkomponente und die Wirkstoffkomponente a) Bestandteil einer zweiten Paketkomponente sind.
10. Paketkomponente eines Praparatepakets nach einem der Ansprüche 6 bis 9 enthaltend die Wirkstoffkomponente a) .
11. Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen mit Retrovirus, insbesondere Lentivirus, beispielsweise HIV, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 einem von der Virusinfektion befallenen menschlichen Korper oder einem Korper eines niedrigeren Warmbluters dargereicht wird.
12. Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen mit
Retrovirus, insbesondere Lentivirus, beispielsweise HIV, wobei einem menschlichen Korper oder einem Korper eines niedrigeren Warmbluters folgende Wirkstoffkomponenten in pharmazeutisch wirksamer Dosis dargereicht werden:
a) vorzugsweise humanvertragliche monoklonale Antikörper, welche für CD28, vorzugsweise Human-CD28, spezifisch sind und T-Lymphozyten, vorzugsweise Human-T- Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, oder em Analog hierzu,
b) em Virus Inhibitor, vorzugsweise em Reverse Transkriptase Inhibitor,
c) optional em von b) verschiedener Reverse Transkriptase Inhibitor,
d) optional em Protease Inhibitor,
e) optional em von d) verschiedener Protease Inhibitor.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirkstoffkomponenten b) bis e) entsprechend der HAART Therapie ausgewählt, dosiert und dargereicht werden und wobei die
Wirkstoffkomponente a) vor, zusammen oder nach den Wirkstoffkomponenten b) bis e) dargereicht werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die
Wirkstoffkomponenten b) bis e) kontinuierlich und die Wirkstoffkomponente a) einmal oder mehrmals m zeitlichen Abstanden mit Ruhepausen, dargereicht werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprucne 12 bis 14, wobei
die Wirkstoffkomponente b) ein Pyrimidm-Nukleosidanalog, vorzugsweise 3 ' -Azιdo-3 ' -desoxythymidin, ist und/oder
die Wirkstoff omponente c) 3TC ist, und/oder
die Wirkstoffkomponente d) zwingend eingerichtet ist.
16. Verwendung eines vorzugsweise humanvertraglichen monoklonalen Antikörpers a) , welcher für CD28, vorzugsweise Human-CD28, spezifisch ist und T-Lymphozyten, vorzugsweise Human-T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergrup- pen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der
T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktiviert, oder eines Analogen hierzu und eines Virus Inhibitors b) , vorzugsweise eines Reverse Transkriptase Inhibitors, in Form einer Mischung oder von raumlich getrennten Zusam- mensetzungen, von denen die eine die Wirkstoffkomponente a) und die andere die Wirkstoffkomponente b) enthalt, als Mittel zur kontinuierlichen und/oder unterbrochenen Anwendung bei der Behandlung von Virusinfektionen mit Retrovirus, insbesondere Lentiviren, beispielsweise von AIDS, bei Menschen oder niedrigeren Warmblutern nach einem Behandlungsplan, der einen oder mehrere Zyklen umfaßt, wobei der Behandlungsplan aus folgenden Stufen besteht:
l) zunächst wird die Wirkstoffkomponente b) einer pharmazeutisch wirksamen Dosis kontinuierlich dargereicht,
n) nach einer vorgegebenen Dauer der Stufe l) wird die Wirkstoff omponente a) einer pharmazeutisch wirksamen Dosis dargereicht bei fortfahrender Darreichung der Wirkstoffkomponente b)
m) optional wird Stufe 11) nach einer vorgegebenen Ruhepause bei fortfahrender Darreichung der Wirkstoffkomponente b) einmal oder mehrmals wiederholt .
10 17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Darreichung der
Wirkstoffkomponente b) im Rahmen eines Behandlungsunterplans erfolgt, welcher die HAART Therapie ist.
15 18. Verwendung, pharmazeutische Zusammensetzung, Paketkomponente oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der monoklonale Antikörper CMY-2, erhältlich aus Hybndomzellen gemäß Hinterlegung DSM ACC2353, oder Klon ANC28.1/5D10 oder eine vorzugsweise humanisierte bzw.
20 humanvertragliche Variante des Klons ANC28.1/5D10 ist.
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