WO2001009316A1 - Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase - Google Patents

Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase Download PDF

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WO2001009316A1
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present
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cells
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Toshio Ota
Takao Isogai
Tetsuo Nishikawa
Koji Hayashi
Kaoru Saito
Jun-Ichi Yamamoto
Shizuko Ishii
Tomoyasu Sugiyama
Ai Wakamatsu
Keiichi Nagai
Tetsuji Otsuki
Shin-Ichi Funahashi
Chiaki Senoo
Jun-Ichi Nezu
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Helix Research Institute
Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a novel human protein kinase, a protein phosphatase, and a gene encoding the protein.
  • kinase genes phosphatases
  • phosphatases a number of kinase genes, phosphatases, have been identified and have been shown to constitute very large protein families that are structurally well conserved (Semin Cell Biol 1994 Dec; 5 (6): 367-76; Cell 199 5 Jan 27; 80 (2): 225-36; Genes Cells 1996 Feb; l (2): 147-69; Trends Biochem Sci 1997 Jan; 22 (l): 18 -22; Proc Natl Acad Sci USA 1999 Nov 23; 96 (24): 13 603-10).
  • the presence of a very large number of kinases in a cell means that a large number of intracellular physiological functions are finely regulated by the kinase phosphatase.
  • drugs that act on kinase / phosphatase have the potential to control physiological functions more precisely than existing drugs, such as the receptor agonist and the receptor gonist. it is conceivable that.
  • Kinases' phosphatase agonists are undesirable It is expected that the drug can be a highly beneficial drug that can dissociate side effects from its main effect.
  • kinase / phosphatase agonist In order to develop such a kinase / phosphatase agonist, first identify the intracellular physiology involved in each of the kinases / phosphatases and determine whether their inhibition or activation has a medical benefit. Knowledge must be obtained. However, although a large number of kinase phosphatases have already been isolated and studied to date, it is expected that there will be many unidentified molecules. In addition, even for those whose genes have been isolated, knowledge about the intracellular physiological functions involved in each kinase and phosphatase is still very poor, and it can be said that most of them have not been elucidated. The identification and clarification of the physiological functions of new kinases and phosphatases are expected to provide important advances in the development of new drugs and therapeutics. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel human protein kinase and a protein phosphatase protein, a gene encoding the protein, and production and use thereof.
  • the present inventors have conducted intensive research as described below to solve the above-mentioned problems.
  • the present inventors have determined kinases from clones isolated and determined by the Helix Research Institute (hereinafter referred to as “helix clones”; Japanese Patent Application Nos. 11-248036, 2000-118776, and 2000-18 3767).
  • helix clones Japanese Patent Application Nos. 11-248036, 2000-118776, and 2000-18 3767.
  • KP clone a phosphatase-like structure
  • This helix clone can be obtained from [1] Production of a cDNA library with a high full-length ratio by the oligocap method, and [2] Evaluation system of full-length from 5'-terminal sequence This is a clone with a high probability of being full-length, which was obtained by combining with (excluding) and selecting based on evaluation by ATGpr).
  • cDNA is incorporated into an expression vector for mammalian cells. Therefore, it has the advantage that an expression experiment in cells can be performed immediately.
  • KP clone contains a full-length cDNA encoding a novel human protein.
  • Many known kinases and phosphatases are known to be involved in various signal transduction pathways in cells, and the KP clone with the kinase-phosphoase-like structure found in this study is also the same. It may be involved in some kind of signaling pathway.
  • the present inventors have found a novel kinase / phosphatase protein, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a novel human protein kinase, a protein phosphatase protein, a gene encoding the protein, and their production and use.
  • (6) a method for producing the protein or peptide according to (3), comprising culturing the host cell according to (5), and recovering the expressed protein from the host cell or a culture supernatant thereof;
  • a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary strand thereof,
  • the present invention provides human-derived genes "C-NT2RP3001938 ⁇ ” and "C-OVARC1000945" which encode a novel kinase phosphatase.
  • Human-derived gene "C-NT2RP30 01938 ” The base sequence of the cDNA is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the human-derived gene “C-OVARC1000945” cDNA is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 4.
  • C-NT2RP3001938 shown in SEQ ID NO: 1 has 0RF encoding a protein consisting of 418 amino acids
  • C-OVMC1000945 shown in SEQ ID NO: 3 encodes a protein consisting of 865 amino acids Has 0RF.
  • the ⁇ protein of the present invention was selected as a clone having a kinase-phosphatase-like structure from clones whose structure was determined by isolation from Helix Research Institute. Regulation of protein phosphorylation by kinase phosphatase plays a central role in the normal differentiation and proliferation of cells and physiology at the cellular level. Therefore, the protein of the present invention is considered to be a molecule that plays an important function in living organisms, and is useful as a target molecule in drug development. In addition, the protein of the present invention may be used as a reagent for phosphorylating and dephosphorylating proteins.
  • Helix clones are produced by a special method and are expected to contain full-length cDNA with high probability (Japanese Patent Application Nos. 11-248036, 2000-118776, and 2000-1 83767). Since is integrated into a mammalian expression vector, expression experiments in cells can be performed immediately. Therefore, by sequentially supplying these vectors to Atsushi systems using various reporter genes, information on their physiological functions can be obtained. Many of the known kinase phosphatases are known to be involved in various signaling pathways in cells, and it is thought that the KP gene of the present invention is also involved in the signaling pathways. Can be For the gene of the present invention, comprehensive screening of the possibility of being involved in various physiological functions by performing function screening using the repo all-in-one gene atsey system capable of detecting known signal transduction Is possible.
  • the Atsey system using a reporter gene is an excellent experimental system that can easily evaluate a wide variety of intracellular physiological functions using the same format. Specifically, functional screening is performed by the following reporter gene assay.
  • a vector containing the KP gene of the present invention is introduced into a host cell together with a repo overnight gene having various enhancer elements to express the KP gene. If the expression of the reporter gene is changed as compared to control cells into which the vector containing the KP gene is not introduced, it can be determined that the protein encoded by the KP gene has acted on the enhancer element. it can. By examining whether or not the KP gene of the present invention acts on various enhancer elements, it is expected that useful information on the physiological function of the KP gene of the present invention will be obtained.
  • Known stimuli include, for example, cell surface receptor ligands (interleukins, growth factors, TGF-family, TNF-family, hormones, small molecules Compounds), expression of factors involved in intracellular signal transduction (various kinases, various phosphorylases, low molecular weight G protein binding protein family 1, Smad family 1, STAT family 1, TRAF family, cell surface receptor, etc.) And stress stimuli (oxidative stress, mechanical stress, heat stress, etc.).
  • cell surface receptor ligands interleukins, growth factors, TGF-family, TNF-family, hormones, small molecules Compounds
  • factors involved in intracellular signal transduction variant kinases, various phosphorylases, low molecular weight G protein binding protein family 1, Smad family 1, STAT family 1, TRAF family, cell surface receptor, etc.
  • stress stimuli oxidative stress, mechanical stress, heat stress, etc.
  • the assay using the repo overnight gene can be performed using various commercially available kits commonly used by those skilled in the art. For example, as possible out be mentioned from Clontech Mercury ' ⁇ Pathway Profil ing Systems, Stratagene PathDetectR Trans-Reporting System, and PathDetectR Cis-Reporting System, a DEAE. In addition, standard methods described in the literature (Overview of Genetic Reporter Systems. In Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel, F. M. et al., (Wiley & Sons, NY) Unit 9.6 (1995) ); Molecular Cloning: A Laboratry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY (1989)).
  • the luciferase activity can be measured by a standard method using, for example, Dual-Luc if erase TM Reporter Assay System of Promega.
  • the repo overnight genes that can be used in the above-mentioned functional screening include, in addition to the luciferase gene, for example, a secreted alkaline phosphatase gene, a chloramphenico-l-acetyltransferase (CAT) gene, and a 5-galactosidase gene. And the like.
  • the enhancer elements used in the reporter assay include a serum-responsive element (Serum Response Element: SRE), a cAMP-responsive element (cAMP Response Element: CRE), and a TPA-responsive element (TPA Response Element: THE). , NF c B (Nuclear factor of.
  • HRE Heat shock response element
  • Glucocorticoid responsive element Glucocorticoid Respons e Element: GRE
  • API Activator protein 1: c-jun / c-fos complex
  • NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells
  • p53 binding element
  • interferon activation element Interferon Gamma Activated Sequence (GAS)
  • ISRE Interferon-Stimulated Response Element
  • E2F E2F binding element
  • STAT family binding element Smad family binding element
  • TCF / LEF binding element GATA family
  • SRE sterol regulatory element
  • IRF Interferon Regulatory Factor
  • Examples of host cells used for repo overnight are 293, HeLa, NIH3T3, CV-I, Jurkat, vascular smooth muscle cells, vascular endothelial cells, and cardiomyocytes.
  • the present invention also encompasses proteins that are functionally equivalent to human KP protein (SEQ ID NO: 2 or 4).
  • Such proteins include, for example, human KP protein mutants, homologs, variants and the like.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has a function of phosphorylating the protein and / or a function of dephosphorylating the protein, like the KP protein. Whether or not the target protein phosphorylates the protein can be determined by the following method.
  • Kinase protein and substrate protein are mixed in an appropriate reaction mixture, and the reaction is performed in the presence of ATP.
  • the phosphorylation activity can be determined by measuring the phosphorylation state of the substrate protein. it can.
  • Kinase proteins that are purified from a suitable cell line or tissue extract by a general biochemical method can be used.
  • genes that express kinase proteins are introduced into mammalian cells (C0S7, CV-1, HEK293, HeLa, Jurkat, NIH3T3, etc.), insect cells (Sf9, etc.), E. coli (E. coli), yeast, etc.
  • a kinase protein expressed in a large amount can be used.
  • Such as - [ ⁇ 32 P] ATP by using a labeled with a radioactive isotope ATP, the phosphorylation state of group quality protein, the liquid scintillator one Shiyonkaun evening one or can be measured by Otoraji O Photography .
  • the phosphorylation state of the substrate protein can be measured by an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or a Western blot method using a phosphorylated protein-specific antibody or the like.
  • a substrate protein a protein specific to a specific kinase can be used, and it is known that it is non-specifically phosphorylated by various kinases such as casein, histone, and myelin basic protein (MBP). Can be used.
  • a synthetic peptide having a phosphorylated sequence can be used.
  • the phosphorylation activity can also be determined by measuring the phosphorylation (autophosphorylation) of the kinase protein itself. More specifically, it can be carried out according to a general method described in a written book such as Protein Phosphorylation: A Practical Approach. First Edition (Hardie DG. Et al., Oxford University Press., 1993).
  • Whether or not the target protein dephosphorylates the protein can be determined by the following method.
  • the dephosphorylation activity can be determined by measuring.
  • the phosphatase protein those prepared in the same manner as in the above-mentioned determination of the phosphorylation activity can be used.
  • the substrate protein the same protein as used in the above-mentioned determination of phosphorylation activity can be used.
  • phosphorylase, phosphorylase kinase and the like can also be used as substrate proteins.
  • phosphorylase kinase, protein kinase, and EGF receptor Phosphorylation may be performed by a suitable kinase such as tyrosine kinase.
  • the phosphorylation state of the substrate protein can be measured by the same method as in the above-mentioned determination of phosphorylation activity. More specifically, it can be carried out according to a general method described in a written book such as Protein Phosphorylation: AP Practice Approach. First Edition (Hardie DG. Et al., Oxford University Press., 1993).
  • identification of substrate proteins that are phosphorylated and dephosphorylated by the test protein is performed by expressing a cDNA expression library using a phage vector or the like, and the protein expressed from each clone is used as a substrate for the test protein.
  • the substrate protein can be identified by judging whether or not the above is satisfied. More specifically, the method can be performed with reference to the method described in EMBO J. (1997) 16: 1921-1933. Further, the substrate protein can be identified by identifying a protein that binds to the test protein by a yeast hybrid screening method or the like. More specifically, the method can be performed with reference to the method described in EMBO J. (1997) 16: 1909-1920.
  • a method for introducing a mutation into a protein is known.
  • those skilled in the art can use site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods.Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA ( l985) Proc Natl Acad Sci USA.
  • amino acids of human KP protein SEQ ID NO: 2 or 4
  • a protein functionally equivalent to the protein By introducing a mutation, a protein functionally equivalent to the protein can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature.
  • the amino acid sequence of the human KP protein (SEQ ID NO: 2 or 4) has one or more amino acids mutated, Proteins functionally equivalent to quality are also included in the proteins of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated in such a mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • the properties of amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W ⁇ Y, V), and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with side chains containing hydroxyl groups (S, T, Y), containing sulfur atoms
  • Amino acids having side chains C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, NsE , Q), base-containing amino acids having side chains (R, K, ⁇ ), aromatic Amino acids having a containing side chain (H, F, Y, W) can be mentioned (all brackets indicate one letter of amino acids).
  • Proteins in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of human KP protein include fusion proteins containing human KP protein.
  • the fusion protein is a fusion of the human KP protein and another peptide or protein, and is included in the present invention.
  • the fusion protein can be prepared by ligating the DNA encoding the human KP protein (SEQ ID NO: 2 or 4) with the DNA encoding the other peptide or protein so that the frames match, and ligating the expression vector. And expression in a host, and a method known to those skilled in the art can be used. Departure Other peptides or proteins to be fused with the light protein are not particularly limited.
  • peptides to be fused with the protein of the present invention include, for example, FLAG
  • 6 x His consisting of 6 His (histidine) residues, 10 x His, influenza agglutinin (HA), and human c-myc Fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, hy-tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, etc. Can be used.
  • proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (Glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region,?- Galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like.
  • a fusion protein can be prepared by fusing a commercially available DNA encoding the peptide or protein with a DNA encoding the protein of the present invention, and expressing the fusion DNA prepared thereby.
  • proteins functionally equivalent to a protein include the hybridization technology (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 198 9). That is, those skilled in the art can isolate a DNA highly homologous thereto based on a DNA sequence encoding human KP protein (SEQ ID NO: 1 or 3) or a part thereof, and Isolation of proteins that are functionally equivalent to proteins can also usually be done.
  • the present invention includes proteins encoded by DNA that hybridizes with DNA encoding human KP protein and functionally equivalent to human KP protein.
  • Hybridization conditions for isolating a DNA encoding a protein functionally equivalent to the human KP protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the conditions for hybridization include, for example, low stringent conditions.
  • the low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C, 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C, 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS in washing after hybridization.
  • More preferable conditions for hybridization include high stringency conditions. High stringency conditions include, for example, 65 ° O. lx SSC and 0.1% SDS.
  • a gene amplification method using primers synthesized based on the sequence information of DNA (SEQ ID NO: 1 or 3) encoding human KP protein for example, polymerase chain reaction (PCR) It is also possible to isolate using the method.
  • Proteins functionally equivalent to human KP protein encoded by DNA isolated by these hybridization and gene amplification techniques usually have high homology in amino acid sequence to human KP protein (SEQ ID NO: 2 or 4). It has.
  • the protein of the present invention is functionally equivalent to human KP protein and has high homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Quality is also included.
  • High homology usually means at least 65% identity, preferably 75% or more identity, more preferably 85% or more identity, and even more preferably 95% or more identity at the amino acid level. .
  • the algorithm described in the literature may be used.
  • the protein of the present invention may vary in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell or host producing the protein or the purification method described below. However, as long as the obtained protein has a function equivalent to that of the human KP protein, it is included in the present invention.
  • the protein of the present invention when expressed in prokaryotic cells, for example, Escherichia coli, a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original protein.
  • the proteins of the present invention also include such proteins.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or as a natural protein by methods known to those skilled in the art.
  • a DNA encoding the protein of the present invention (for example, MA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3) is inserted into an appropriate expression vector, and this is introduced into an appropriate host cell.
  • chromatography such as ion exchange, reverse phase, or gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column Or by combining a plurality of these columns.
  • the protein of the present invention when expressed in a host cell (for example, an animal cell or Escherichia coli) as a fusion protein with the glutathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added.
  • the expressed recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column. After purifying the fusion protein, if necessary, Regions other than the target protein in the protein can also be removed by cutting with thrombin or factor-1Xa.
  • the protein is a natural protein, a method known to those skilled in the art, for example, an antibody to which an antibody that binds to the protein of the present invention binds to an extract of a tissue or cell expressing the protein of the present invention, which will be described later. Isolation can be achieved by using a two-tea column for purification.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 7 amino acids or more, preferably 8 amino acids or more, and more preferably 9 amino acids or more.
  • the partial peptide can be used, for example, for preparing an antibody against the protein of the present invention, screening for a compound that binds to the protein of the present invention, and for screening for a promoter or inhibitor of the protein of the present invention. In addition, it can be an antagonist of the protein of the present invention or a competitive inhibitor.
  • the partial peptide of the present invention can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the peptide may be synthesized by, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for in vivo or in vitro production of the protein of the present invention as described above, and is also caused by, for example, an abnormality in a gene encoding the protein of the present invention. It is also conceivable to apply the present invention to gene therapy for diseases that can be treated or diseases that can be treated with the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, or the like.
  • DNAs having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code are included as long as they can encode the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it is prepared by preparing a cDNA library from cells expressing the protein of the present invention and performing hybridization using a part of the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1 or 3) as a probe. it can.
  • the cDNA library may be prepared, for example, by the method described in the literature (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), or using a commercially available DNA library. Is also good.
  • oligo DNA is synthesized based on the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1 or 3).
  • SEQ ID NO: 1 or 3 can be prepared by performing a PCR reaction using this as a primer and amplifying a cDNA encoding the protein of the present invention.
  • Genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, and organs that express the protein of the present invention.
  • the isolation of mMA can be performed by a known method, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ⁇ AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Prepare all MA using Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) and purify mRNA from total A using mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can also be performed using the AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Sai-Dai Gakurinashi, etc.) Also, using the primers described in this specification, etc., the 5,5-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and polymerase chain reaction (polymer 5, RACE method using ase chain reaction (PCR) (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic According to Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), cDNA can be synthesized and amplified.
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nuclear Acids Research ( 1981) 9, r43-74).
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of the modification include digestion with a restriction enzyme, insertion of a synthetic oligonucleotide, an appropriate DNA fragment, addition of a linker, insertion of an initiation codon (ATG) and / or a termination codon (TM, TGA, or TAG). No.
  • the DNA of the present invention includes a DNA consisting of base A at position 366 to base C at position 1619 in the base sequence of SEQ ID NO: 1. It also includes a DNA consisting of base A at position 33 to A at position 2627 in the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the DNA of the present invention is also an MA which hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and which encodes a DNA functionally equivalent to the above-described protein of the present invention. Including. Those skilled in the art can appropriately select the conditions in the hybridization, and specifically, the conditions described above can be used. Under these conditions, MA with higher homology can be obtained as the temperature is increased.
  • the above hybridizing DNA is preferably a naturally occurring DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted. The vector of the present invention is useful for retaining the MA of the present invention in a host cell or expressing the protein of the present invention.
  • E. coli when E. coli is used as a host, the vector is amplified in E. coli (e.g., JM109, DH5, HB101, XLlBlue), etc.
  • E. coli e.g., JM109, DH5, HB101, XLlBlue
  • ori an ori and a transformed gene of Escherichia coli (for example, a drug resistance gene that can be distinguished by any drug (Ambicillin-tetracycline, lynamycin, chloramphenicol)).
  • vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the host can be used in a host such as JM109, DH5 or HB10 XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in Escherichia coli for example, lacZ promoter one-night (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422) -2427), the araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or the T7 promoter.
  • lacZ promoter one-night Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422) -2427
  • the araB promoter Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043
  • T7 promoter include PGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host is T7 RNA) BL21 expressing a polymerase is preferred).
  • the vector may also include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for protein secretion the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) should be used.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed, for example, using a chloride solution method or an electroporation method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) or pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), expression vector derived from insect cells (e.g., ⁇ Bac-to-BAC baculovairus expression systemj
  • pBacPAK8 plant-derived expression vectors
  • plant-derived expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pV pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vectors eg, pZIPneo
  • Yeast-derived expression vectors eg, “Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01
  • Bacillus subtilis-derived expression vectors eg, pPL608, pKTH50.
  • the promoter necessary for expression in the cells such as the SV40 promoter overnight (Mulligigan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR Promo Overnight, EF1 Hipromo Overnight-(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CV Promo Overnight, etc.
  • Indispensable genes to select for cell transformation such as the SV40 promoter overnight (Mulligigan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR Promo Overnight, EF1 Hipromo Overnight-(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CV Promo Overnight, etc.
  • Indispensable genes to select for cell transformation such as the SV40 promoter overnight (Mulligigan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR Promo Overnight, EF1 Hipromo Overnight-(Mizushim
  • vectors having such characteristics include p band, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV ⁇ p0P13, and the like.
  • a vector having the DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell is used. (For example, pCHOI) and methotrexate
  • the origin of SV40 replication can be determined using COS cells that have a gene that expresses the SV40 T antigen on the chromosome. Transformation with one vector (eg pcD) is available.
  • the replication origins include poliovirus, adenovirus, —Mavirus (BPV) and other sources can also be used.
  • the expression vector can be used as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, and E. coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (A.C. Ecogpt) gene and dihydrofolate reductase (dhfr) gene.
  • the DM of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, by a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method, an adenovirus method, or the like.
  • a retrovirus method for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method, an adenovirus method, or the like.
  • the vector to be used include, but are not limited to, adenovirus vector (eg, pAdexlcw) and retrovirus vector (eg, pZIPneo).
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • animal cells mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, African Megafrog Oocytes (Val le, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21 and Tn5 are known.
  • CH0 cells DHfr-CH0 (Proc. Natl. Acad. Scad.
  • the vector can be introduced into the host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using catonic ribosome D0TAP (manufactured by Boehringer Mannheim), the electroporation method, or the lipofection method. Is possible.
  • a cell derived from Nicotiana tabacum is known as a protein production system, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger. 0 is known
  • E. coli Escherichia coli
  • JM109 JM109
  • DH5 DH5
  • HB101 Bacillus subtilis
  • the protein is obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • a culture solution of animal cells for example, DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using an animal and a production system using a plant.
  • the target DNA is introduced into these animals or plants, and proteins are produced and recovered in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, bushes, higgies, mice, and mice can be used (Vicki Glasser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target protein can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may optionally be used in transgenic goats to increase the amount of milk containing proteins produced by the transgenic goats (Ebert, .M. Et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus containing DNA encoding the protein of interest (Susumu, M. et al. ., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the protein of interest is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. .
  • a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • tobacco for example, Nicotiana tabacum
  • the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of the host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein may be performed by the separation and purification methods used in ordinary protein purification, and are not limited at all. For example, chromatography chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS_polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc.
  • the proteins can be separated and purified by selecting and combining as appropriate.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed-phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification). and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
  • chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention also encompasses highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by reacting the protein with a suitable protein modifying enzyme before or after purification.
  • a suitable protein modifying enzyme for example, tribcine, chymotrypsin, lysylendopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like are used.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody.
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal, such as a human, a mouse or a rat, and particularly preferably a protein derived from a human. .
  • a human-derived protein can be obtained using the gene sequence or amino acid sequence disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • partial peptides of proteins include amino (N) terminal fragments and carboxy (C) terminal fragments of proteins.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the host cell described herein is transformed with the vector. Fragments may be obtained by a known method, and these may be used as a sensitizing antigen. Alternatively, a cell expressing the protein, a lysate thereof, or a chemically synthesized protein of the present invention may be used as the sensitizing antigen. It is preferable that the short peptide is appropriately bound to a carrier protein such as keyhole limpet mosaicin, pepsin serum albumin, and ovalbumin to form an antigen.
  • a carrier protein such as keyhole limpet mosaicin, pepsin serum albumin, and ovalbumin to form an antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, rodents are used. Eyes, egrets, and primates are used.
  • mice for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • a heronoid animal for example, a heron is used.
  • a primate animal for example, a monkey is used.
  • monkeys monkeys of the lower nose (old world monkeys), for example, cynomolgus monkeys, macaques, baboons, chimpanzees, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method. As a general method, a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • a sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is administered to mammals. Further, thereafter, it is preferable to administer the sensitizing antigen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant several times every 4 to 21 days.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen. Immunization is performed in this manner, and an increase in the desired antibody level in the serum is confirmed by a conventional method.
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • the serum is separated from the blood by a known method.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used.
  • a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from the serum and used. For example, using an affinity column to which the protein of the present invention is coupled, a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained, and this fraction is further purified using a protein A or protein G column.
  • immunoglobulin G or M can be prepared.
  • the immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include splenocytes, in particular.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a mammalian myeloma cell, and more preferably a myeloma cell that has acquired the properties for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be performed according to it.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is continued for a time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody.
  • a human lymphocyte for example, a human lymphocyte infected with an EB virus is sensitized in vitro with a protein, a protein-expressing cell or a lysate thereof
  • the sensitized lymphocytes may be fused with human-derived myeloma cells having permanent cleavage ability, for example, U266, to obtain a hybridoma producing a desired human antibody having a protein binding activity (Japanese Patent Application Laid-Open No. -17688 publication).
  • the obtained hybridomas are transplanted into a mouse intraperitoneal cavity, ascites is collected from the mice, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein and protein G columns, DEAE ion exchange chromatography, and the present invention. It can be prepared by purifying the protein using a coupled affinity column or the like.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an agonist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes is immunized with a protein serving as an antigen, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain an antibody-producing cell, which is then fused with a myeloma cell.
  • a human antibody against a protein can be obtained using a mouse (see International Publication Nos. W092-03918, W093-2227, W094-02602, W094-25585, W096-33735 and W096-34096).
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies are immortalized with oncogenes may be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be obtained as a recombinant antibody produced using a genetic recombination technique (for example, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United States). Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding them from immunized cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes that produce the antibodies, incorporating the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host.
  • the present invention includes this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • antibody fragments Fab, F (ab 5) 2, Fv or single chain Fv (scFv) in which the Fv of H chain and L chain were ligated via a suitable linker one (Hus ton, JS et al. , Proc Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the antibody is treated with an enzyme, for example, papain or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and, after introducing this into an expression vector, an appropriate host cell (For example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better,. And Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121 , 663-669; Bird, RE and Walker, BW, Trends Biotechnol. (1991) 9, 13-137).
  • an enzyme for example, papain or pepsin
  • the modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention also includes these modified antibodies. To obtain such a modified antibody, it is necessary to chemically modify the obtained antibody. And can be obtained by: These methods are already established in this field.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a chimeric antibody comprising a non-human antibody-derived variable region and a human antibody-derived constant region or a non-human antibody-derived CDR (complementarity determining region) and a human It can be obtained as a humanized antibody consisting of antibody-derived FR (framework region) and constant region.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, if chromatography chromatography columns such as affinity chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. are appropriately selected and combined, Antibodies can be separated and purified (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but are not limited thereto.
  • the concentration of the antibody obtained as described above can be measured by measuring absorbance or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • columns using a protein A column include Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia), and the like.
  • Examples of chromatography other than affinity chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization). A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) c. These chromatography methods can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and MA (radiation). Immunoassay) or a fluorescent antibody method can be used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • MA radiation
  • Immunoassay or a fluorescent antibody method can be used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the protein of the present invention is added to a plate on which the antibody of the present invention has been immobilized, and then a sample containing the target antibody, for example, a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • a secondary antibody that recognizes the enzyme for example, an antibody labeled with alkaline phosphatase, incubate the plate, wash the plate, and then add an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate to measure the absorbance.
  • an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate
  • a protein fragment for example, a fragment comprising the C-terminus thereof may be used.
  • BIAcore Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with the sample contained in the sample which is expected to contain the protein of the present invention, and an immune complex of the antibody and the protein is formed.
  • the method for detecting or measuring the protein of the present invention which comprises detecting or measuring, can be carried out. Since the protein detection or measurement method of the present invention can specifically detect or measure a protein, it is useful for various experiments and the like using proteins.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to DNA encoding human KP protein (SEQ ID NO: 1 or 3) or its complementary strand.
  • the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably Should have at least 95% homology on the base sequence.
  • the algorithm described in the present specification may be used as an algorithm for determining homology.
  • nucleic acids include probes and primers used for detection and amplification of MA encoding the protein of the present invention, probes and primers for detecting expression of the DNA, and control of the expression of the protein of the present invention. (For example, antisense oligonucleotides and ribozymes, or DNAs encoding the same). Such a nucleic acid can also be used for producing a DNA chip.
  • the region on the 3 ′ side is complementary, and a restriction enzyme recognition sequence, evening DNA, etc. can be added to the 5 ′ side.
  • antisense oligonucleotide examples include an antisense oligonucleotide that hybridizes at any position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • This antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide for at least 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. More preferably, it is an antisense oligonucleotide in which at least 15 or more consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.
  • the antisense oligonucleotide derivatives and modifications thereof can be used.
  • the modified product include a modified lower alkyl phosphonate such as a methyl phosphonate type or an ethyl phosphonate type, a phosphorothioate modified product, a phosphoroamidate modified product, and the like.
  • Antisense oligonucleotides include not only those whose nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA are all complementary sequences, but also those having DNA or mRNA and an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or 3. As long as it can specifically hybridize to the nucleotide sequence, it includes those having a mismatch of one or more nucleotides.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts on cells producing the protein of the present invention to bind to DNA or mRNA encoding the protein.
  • suppressing the expression of the protein of the present invention by inhibiting its transcription or translation or accelerating the degradation of mRNA, it has the effect of suppressing the action of the protein of the present invention.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be mixed with a suitable base material which is inactive against the derivative to prepare an external preparation such as a liniment or a poultice.
  • excipients may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, Injectables, liquids, nasal drops, etc., as well as freeze-dried agents. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied directly to an affected area of a patient, or is applied to a patient so as to be able to reach the affected area as a result of intravenous administration or the like.
  • an antisense-encapsulated material that enhances durability and membrane permeability can be used.
  • ribosome, poly-L-lysine, lipid, cholesterol, ribofectin or derivatives thereof can be mentioned.
  • the dosage of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be appropriately adjusted according to the condition of the patient, and a preferred amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to: 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the protein of the present invention, and is therefore useful in suppressing the biological activity of the protein of the present invention.
  • the expression inhibitor containing the antisense oligonucleotide of the present invention is useful in that it can suppress the biological activity of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is useful for screening for a compound that binds to the protein. That is, the present invention comprises bringing a protein of the present invention into contact with a test sample expected to contain a compound that binds to the protein, and selecting a compound having an activity of binding to the protein of the present invention. Used in a method for screening a compound that binds to a protein.
  • the protein of the present invention used for screening may be a recombinant protein or a naturally-occurring protein. It may be a partial peptide. It may also be in the form expressed on the cell surface or as a membrane fraction.
  • the test sample is not particularly limited and includes, for example, a cell extract, a cell culture supernatant, a fermented microorganism product, a marine organism extract, a plant extract, a purified or crude protein, a peptide, and a non-peptide compound. , Synthetic low molecular weight compounds and natural compounds.
  • the protein of the present invention to be brought into contact with the test sample may be, for example, a purified protein, a soluble protein, a form bound to a carrier, a fusion protein with another protein, or a form expressed on a cell membrane.
  • the sample can be brought into contact with a test sample as a membrane fraction.
  • a method for using the protein of the present invention to screen for example, a protein that binds to the protein
  • many methods known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, it can be performed as follows.
  • the gene encoding the protein of the present invention is inserted into a vector for expression of a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I, pCD8 or the like, whereby the gene is expressed in animal cells or the like.
  • Promoters used for expression include SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, London, p.
  • EF-1 promot er Kim Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704) (1987), SR a promoter ( Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p. 66 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Pro Natl. A cad. Sci. USA 84 3 P.3365 -3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet.
  • any commonly used promoters such as the HSV TK promoter may be used.
  • electroporation method Choporation method
  • calcium phosphate method Choen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-275 2 (1987)
  • DEAE dextran method Lipata, MA et al. Nucl. Acids Res.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein having a monoclonal antibody recognition site by introducing a recognition site (epitope) of the monoclonal antibody of which specificity is known to the N-terminal or C-terminal of the protein of the present invention. It can be done.
  • a commercially available epitope antibody system can be used (Experimental Medicine 1 ⁇ , 85-90 (1995)).
  • Commercially available vectors that can express fusion proteins with galactosidase, maltose binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. through a multicloning site .
  • a method for preparing a fusion protein by introducing only a small epitope portion consisting of several to dozens of amino acids in order to minimize the properties of the protein of the present invention by changing it into a fusion protein has been reported.
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin HA human c-myc
  • FLAG Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • VSV-GP Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • T7 gene 10 protein T7 gene 10 protein
  • T7-tag human simple herpes
  • Epitopes such as subviral glycoproteins (HSV-tags) and E-tags (ebiptops on monoclonal phages) and monoclonal antibodies that recognize them are used for screening proteins that bind to the protein of the present invention.
  • immunoprecipitation an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant.
  • This immune complex comprises the protein of the present invention, a protein capable of binding thereto, and an antibody.
  • immunoprecipitation can be performed using an antibody against the protein of the present invention.
  • Antibodies against the protein of the present invention include, for example, introducing a gene encoding the protein of the present invention into an appropriate E. coli expression vector, expressing the gene in E. coli, purifying the expressed protein, It can be prepared by immunizing rats, goats, and chickens. Alternatively, it can be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of the protein of the present invention.
  • the immune complex can be precipitated using, for example, Protein A Sepharose or Protein G Sepharose if the antibody is a mouse IgG antibody.
  • protein A Sepharose or Protein G Sepharose if the antibody is a mouse IgG antibody.
  • an epitope such as GST
  • a substance specifically binding to these epitopes such as glutathione-Sepharose 4B is used to prepare the protein of the present invention.
  • an immune complex can be formed.
  • SDS-PAGE is generally used for analysis of immunoprecipitated proteins.
  • proteins bound by the molecular weight of the protein can be analyzed.
  • the protein bound evening protein of the present invention since it is difficult to detect a Coomassie one dyeing and such silver staining of the proteins conventional staining method, a radioactive isotope 35
  • the target protein can be directly purified from the SDS-polyacrylamide gel and its sequence can be determined.
  • Examples of a method for isolating a protein that binds to the protein using the protein of the present invention include a West Western plotting method (Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83-90). It can be performed using: That is, a cDNA library is prepared from a cell, tissue, or organ (eg, liver or kidney) predicted to express a protein that binds to the protein of the present invention, using a phage vector—Ugtll, ZAP, or the like. The protein expressed on LB-agarose and expressed on a filter is immobilized, purified and labeled, and the protein of the present invention is reacted with the filter of the present invention to bind to the protein of the present invention.
  • a West Western plotting method Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83-90. It can be performed using: That is, a cDNA library is prepared from a cell, tissue, or organ (eg, liver or kidney) predicted
  • the plaque expressing can be detected by labeling.
  • the method for labeling the protein of the present invention include a method using the binding property between biotin and avidin, and a method for specifically binding to the protein of the present invention or a peptide or polypeptide (for example, GST or the like) fused to the protein of the present invention.
  • the method include a method using an antibody, a method using a radioisotope, and a method using fluorescence.
  • a 2-hybrid system using cells Yields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 10, 286-292) , Dalton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response e complement.Cell 68, 597-612, ⁇ MATCHMAKER Two-Hybrid Systemj, '' Mammalian M A method using ATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kitj, “MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (both made by Krontech), and“ HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj ”(manufactured by Straugene).
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is fused with the SRF DNA binding region or GAL4 DNA binding region and expressed in yeast cells, and the protein that binds to the protein of the present invention is expressed.
  • VP16 Other GAL4 transcriptional activity A cDNA library that is expressed in a form fused with the activating region is prepared, introduced into the above yeast cells, and the cDNA derived from the library is isolated from the positive clones detected (in the yeast cells, When the protein that binds to the protein is expressed, the binding of the two activates the reporter gene, and a positive clone can be confirmed).
  • the protein encoded by the cDNA can be obtained by introducing the isolated cDNA into Escherichia coli for expression.
  • reporter gene used in the 2-hybrid system include, for example, the HI S3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) gene, and the like. Not limited to Screening by the two-hybrid method can be performed using mammalian cells in addition to yeast.
  • Screening for a compound that binds to the protein of the present invention can also be carried out using affinity mouth chromatography.
  • the protein of the present invention is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample which is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied here.
  • the test sample in this case include a cell extract, a cell lysate, and the like. After applying the test sample, the column is washed, and the protein bound to the protein of the present invention can be prepared.
  • the obtained protein is analyzed for its amino acid sequence, oligo DNA is synthesized based on the amino acid sequence, and a cDNA library is screened using the DNA as a probe to obtain a DNA encoding the protein.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring the bound compound.
  • Surface plasmon A biosensor utilizing resonance phenomena uses surface plasmon to detect the interaction between the protein of the present invention and a test compound using a trace amount of protein and without labeling. It can be observed in real time as a resonance signal (for example, manufactured by BIAcore Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the protein of the present invention and the test compound by using a biosensor such as BIAcore.
  • the method for isolating not only proteins but also compounds that bind to the protein of the present invention includes, for example, immobilized proteins of the present invention, synthetic compounds, natural product banks, Alternatively, a method of screening a molecule that binds to the protein of the present invention by acting a random phage peptide display library, or a screening method using high throughput by combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R;
  • Kashyap AK Kashyap AK
  • Barbone FP Mulcahy LS
  • Johnson DL Barrett RW
  • Jolliffe LK Jolliffe LK
  • the compound that can be isolated by the screening of the present invention is a candidate for a drug for regulating the activity of the protein of the present invention, and is a disease caused by abnormal expression or functional abnormality of the protein of the present invention, or a disease of the protein of the present invention.
  • Application to the treatment of diseases that can be treated by controlling the activity can be considered.
  • Substances that can be partially isolated using the screening method of the present invention and which are converted by addition, deletion and / or substitution of a part of the structure of the compound are also included in the compounds that bind to the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention or a compound that can be isolated by the screening of the present invention can be obtained from human animals, such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, chicks, cats, dogs, sheep, pus, monkeys, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • human animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, chicks, cats, dogs, sheep, pus, monkeys, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • Sugar-coated tablets, capsules, elixirs and microcapsules as needed, orally or as a sterile solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, It may be formulated by combining with preservatives, binders, etc. as appropriate and mixing in the unit dosage form required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Suitable leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the preparation unit form is forcepsel, the above materials may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents. It may be used in combination with an agent, for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 ( TM ), or HC0-50.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with dissolution aids such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, proforce hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to patients can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. It can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the protein of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, and administration method. For example, in the case of an injection, an adult (with a body weight of 60 kg) usually takes 1 day. It is considered to be about 100 ig to 20m per.
  • the dose of the compound that binds to the protein of the present invention or the compound that modulates the activity of the protein of the present invention varies depending on the symptoms. However, in the case of oral administration, in general, for an adult (assuming a body weight of 60 kg), 1 It is considered to be about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, and administration method.
  • it is usually 1 dose for adults (with a body weight of 60 kg).
  • it may be convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day, by intravenous injection.
  • the amount can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • Retinoic acid treatment of teratocarcinoma cells derived from human fetal testis NT-2 neural progenitor cells purchased from Stratagene capable of differentiating into cells can be obtained by culturing NT-2 cells according to the attached manual, inducing by adding retinoic acid, and culturing for 2 weeks.
  • NT-2 neural progenitor cells purchased from Stratagene
  • mRNA was extracted from human ovarian cancer tissue (0VARC1) by the method described in the literature (J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989). Furthermore, poly (A) + RNA was purified using oligo dT cellulose.
  • a cDNA library was prepared from each poly (A) + RNA by the oligocap method [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)].
  • Ol igo-cap 1 inker agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg / rooster 3 system (J number: 5)
  • Oligo dT p rimer gcggctgaag acggcctatg tggccttttttttttttttttttttttttttttttttttttt t / rooster sequence number: 6
  • the literature [Suzuki, Sugano, Protein Nucleic acid enzyme, 41: 197-201 (1996), Y.
  • a full length cDNA library of NT2RP3 cDNA library was prepared using PME18SFL3, an expression vector capable of expression in eukaryotic cells.
  • the SR Promoter and the SV40 small it intron are incorporated upstream of the closing site, and the SV40 polyA addition signal sequence is inserted downstream.
  • the pME18SFL3 cloning site is an asymmetric Drall site, and a complementary Sfil site is added to the end of the cDNA fragment. Is introduced in a one-way direction downstream of. Therefore, in a clone containing full-length cDNA, the gene can be transiently expressed by directly introducing the obtained plasmid into COS cells. That is, it is very easy to experimentally analyze the protein as a gene product or its biological activity.
  • the total length of the 5, -terminal of each clone of the human cDNA library prepared by the oligocap method was determined by the following method. For all clones where the known human mRNA and 5'-terminal sequence in the public database match, the 5'-terminal is longer or the 5'-terminal is shorter than the known mRNA sequence in the public database. Were judged to be “full length” if they had a translation initiation codon, and "non-full length” if they did not contain a translation initiation codon.
  • ATGpr is a program developed by AA Salamov, T. Nishikaa, MB Swindells of the Helix Institute to predict whether or not a translation initiation codon from the characteristics of the sequence around the ATG codon (AA Salamov, T. Nishikawa, MB Swindells, Bioinformatics, 14: 384-390 (1998); http://www.hri.co.jp/atgpr/) 0
  • the result is the expected value that the ATG is the true start codon (Hereinafter sometimes referred to as ATGprl) (0.05-0.94).
  • ATGprl the expected value that the ATG is the true start codon (Hereinafter sometimes referred to as ATGprl) (0.05-0.94).
  • the sensitivity and specificity of the analysis results without considering whether it is the 5, -end of the cDNA of this program are both evaluated as 66%.
  • ESTiMateFL is a method developed by Helix Research Institute's Nishikawa and Ota et al. To select clones with a high possibility of full-length cDNA by comparing with 5'-terminal sequence or 3'-terminal sequence of EST in public database. It is.
  • the clone is judged to be "probably not full-length". It is systemized so that it can process a large amount. If the 5'-end is longer than the EST sequence in the public data base, or a clone with a shorter 5'-end, the difference is less than 50 bases for convenience. Not all Length. In the case of the 5'-terminal sequence of a clone hit with a known mRNA, about 80% of the sequence estimated to be full-length by EST is the entire length even when the 5'-terminal sequence of the known mRNA is evaluated.
  • ESTiMateFL is a particularly effective method for evaluating the full length of the 3'-terminal sequence of cDNA of human unknown mRNA having an appropriate number of EST entries in public databases.
  • C-0VARC1000945 is identical to the human EST sequence at least at either the terminal sequence or the 3 ′ terminal sequence, or both, because of the high probability of being full-length. It was a new clone.
  • C-NT2RP3001938 is a full-length, 5, 20 or less human EST sequence identical in terminal sequence (at least 5 ′ terminal sequence or 3 ′ terminal sequence, or both human EST sequences (Excluding clones that have the same number of human EST sequences in both the 5'-terminal sequence and the 3'-terminal sequence as 1 to 5), and are still novel clones.
  • Example 4 Selection of clone having kinase-phosphatase-like sequence A clone having kinase-phosphatase-like sequence was selected from the helix clones.
  • the amino acid sequence of 31 known kinases' phosphatase (including phospholipid kinase) shown below is used as a query, and NCBI TBLASTN2.
  • Query sequence used for homology search, its sequence number, and GenBank Accession numbers are as follows ⁇ Query sequence name Sequence number GenBank access number hLKBl 9 gi 13024670 hVRKl 1 0 gi 14507903 hCDC2 1 1 gi 14502709
  • hATM 2 0 gi 14502267 hc-src 2 1 gi 14758078 hJAKl 2 2 ref
  • clones “C-NT2RP3001938” and “C-0VARC1000945”, which do not overlap, were selected as clones having a kinase-phosphatase-like structure (KP clones).
  • the clone encodes a novel human protein, and it was inferred that the protein functions as protein kinase and / or protein phosphatase.
  • Example 5 Gene expression analysis by hybridization using high-density DNA filter DNA for nylon membrane spots was prepared as follows. In other words, E. coli was cultured in each well of a 96-well plate (37 ° C, 16 hours in LB medium), and a part of the culture was suspended in sterilized water dispensed in 10 1 wells of a 96-well plate. After treatment at 10 ° C for 10 minutes, it was used as a sample for PCR reaction. PCR is TaKaRa PCR Amplification Kit
  • the PCR reaction was performed with GeneAmp System9600 (manufactured by PE Biosystems) at 95 ° C for 5 minutes, followed by 10 cycles of 95 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 1 minute, and further for 98 ° C for 20 seconds and 60 ° C for 3 minutes. Twenty cycles were performed at 72 ° C for 10 minutes.
  • the plasmid containing the cDNA insert was extracted by alkali extraction (J Sambrook, EF Fritsh, T Mania tis, Molecular Cloning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Was prepared.
  • DNA was dispensed into each well of a 384-well plate.
  • DNA spotting on a nylon membrane was performed using a 384-pin tool of Biomek 2000 Laboratory Automated System (Beckman Cole Yuichi). That is, a 384-well plate containing DNA was set.
  • the DNA solution was simultaneously immersed in 384 independent pins of a pin tool, and the DNA was applied to the needles. By gently pressing the needle against the nylon membrane, the DNA attached to the needle was spotted on the nylon membrane.
  • the denaturation of the spotted DNA and the fixation to the nylon membrane are carried out by a conventional method (J Sambrook, EF Fritsh, T Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory) Press, 1989).
  • Hybridization of the radioisotope-labeled probe to the DNA array was carried out according to a standard method (J Sambrook, EF Fritsh, T Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Washing is performed by washing the nylon membrane three times for 20 minutes at room temperature (about 26 ° C) in Washing Solution 1 (2X SSC, 1% SDS), and then Washing Solution 2 (0.1X SSC, 1% SDS) In the chamber, washing was performed three times at 65 ° C for 20 minutes. The autoradiogram was obtained using an image plate of BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • the hybridized nylon film was wrapped in Saran wrap, brought into close contact with the photosensitive surface of the image plate, placed in a cassette for radioisotope exposure, and allowed to stand in a dark place for 4 hours.
  • the radioisotope activity recorded on the image plate was analyzed using BAS2000 and converted electronically as an autoradiogram image file and recorded.
  • the detection sensitivity of gene expression analysis was estimated by preparing a probe complementary to the DNA spotted on a nylon membrane and examining the increase in the signal intensity of spots in the hybridization depending on the probe concentration. .
  • PLACE1008092 (identical to GenBank Accession No. AF107253) was used as DNA.
  • a PLACE1008092 DM array was prepared by the method described above.
  • PLACE 1008092 mRNA was synthesized in vitro, and this RNA was used as type II to synthesize and use a 1st strand cDNA labeled with a radioisotope in the same manner as in the probe preparation method described above.
  • PLACE100 8092 mRNA in vitro a plasmid was constructed in which the 5 'end of PLACE1008092 was linked to the T7 promoter side of pBluescript SK (-). That is, PLACE1008092 incorporated into the restriction enzyme Drall recognition site of pME18SFL3 was cut with the restriction enzyme Xhol to cut out PLACE1008092.
  • pBluescript SK (-) cut with Xhol and PLACE1008092 cut out were ligated using DNA ligation kit ver.2 (Takarasha).
  • Table 2 shows the expression of each cDNA in normal human tissues (heart, lung, pituitary, thymus, brain, kidney, liver, spleen). The expression level was shown as a numerical value from 0 to 10,000. ⁇ C-NT2RP300 “1938” and “C-0VARC1000945” were each expressed in at least one tissue.
  • Non-enzymatic protein saccharification reactions have been attributed to various chronic complications of diabetes. Therefore, genes whose expression is specifically increased or decreased in glycated protein are genes related to glycemic complications caused by glycated protein. It is the cells of the blood vessel wall that are affected by glycated proteins present in the blood. Non-enzymatic protein saccharification products include the mildly glycated protein Amadori compound (glycated protein) and the severely glycated protein advanced glycosylation endproduct. Therefore, it was examined whether or not the expression of the KP gene of the present invention changes specifically in these endothelial cells in these proteins.
  • the endothelial cells were cultured in the presence or absence of glycated protein to extract mRNA, and hybridized with the above DNA array using a 1st strand cDNA probe labeled with a radioisotope to obtain each of the RNAs.
  • the signal of the mouse was detected by BAS2000 and analyzed by ArrayGauge (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • ⁇ serum albumin (manufactured by sigma) is incubated in a 50 mM Glucose phosphate buffer at 37 ° C for 8 weeks, and the browned BSA is added to the phosphate buffer. Dialysis was performed.
  • Normal human pulmonary artery endothelial cells (manufactured by Cell Applications) were prepared using a tissue culture dish (manufactured by Falcon) using endothelial cell growth medium (Cell Applica- tion). In tions Co.) in, Inkyube Isseki one (37 ° C, 5% C0 2, placed in a humidified), and cultured. When the cells became confluent on the dish, add serum albumin (Sigma), saccharified serum albumin (Sigma) or serum albumin terminally glycated substance (250 ⁇ g / ml) and incubate for 33 hours. did. Extraction of mRNA from the cells was performed using FastTrack ( TM ) 2.0 kit (manufactured by Invitrogen). Labeling of a probe for hybridization was carried out in the same manner as described above using this mRNA.
  • TM FastTrack
  • Table 3 shows the expression of each cDNA of human pulmonary artery endothelial cells cultured in a medium containing ⁇ serum albumin, saccharified ⁇ serum albumin or advanced glycated substance ⁇ serum albumin. "C-NT2RP3001938 I was expressed in endothelial cells.
  • Ultraviolet rays are known to have considerable effects on health. In recent years, there has been an increasing number of opportunities to be exposed to UV damage due to the destruction of the ozone layer, and it has been recognized as a risk factor for skin cancer (United States Environmental Protection Age ncy: Ozone Depletion Home Page, http: // www epa. gov / ozone /) 0 Genes whose expression changes when UV light acts on skin epidermal cells are considered to be related to UV damage to the skin. Primary cultured skin-derived fibroblasts irradiated with ultraviolet light were cultured to examine whether or not the expression of the KP gene of the present invention changes.
  • the mean (M 132 ) and the sample variance (s! 2 , s 2 2 ) of the signal value were determined for each gene of the cell, and the composite sample variance s 2 was determined from the sample variance of the two cells to be compared.
  • t (M, - M 2 ) / s / (l / 3 + l / 3) was determined 1/2.
  • t-values of 0.05 and 0.01 which are the significance levels P in the t-distribution table with 4 degrees of freedom, if the value is large, P + 0.05 or P-0.01, respectively, will affect the gene expression in both cells. It was determined that there was a difference.
  • the mean value of the signal increased (+) or decreased (-) compared to undifferentiated cells.
  • a novel human protein kinase / protein phosphatase protein and a gene encoding the protein are provided. Regulation of the phosphorylation state of proteins by kinase-phosphatase plays a central role in the normal differentiation and growth of cells and physiology at the cellular level. Since the novel kinase / phosphatase of the present invention is also considered to be deeply involved in intracellular physiology, the protein of the present invention is useful as a drug target molecule in drug development. In addition, the drug acting on the protein of the present invention is expected to be an effective drug that can more precisely regulate intracellular physiological functions than drugs represented by conventional receptor agonists and angiogonists. Is done.

Description

明細書 プロティンキナーゼ ·プロティンフォスファタ一ゼをコ一ドする新規遺伝子 技術分野
本発明は、 新規なヒトプロテインキナーゼ、 およびプロテインフォスファタ一 ゼ、 および該タンパク質をコ一ドする遺伝子に関する。 背景技術
細胞が正常に分化 ·増殖し、さらに組織レベルでの機能を発揮していくためには、 その必要に応じて細胞が持つ様々な生理機能が正しく調和して制御されなければ ならない。 そのような制御機構の多くにおいて、 タンパク質リン酸化酵素/プロ ティンキナーゼ（以下キナーゼ）、及びタンパク質脱リン酸化酵素/プロティンフ ォスファターゼ （以下フォスファターゼ） によるタンパク質のリン酸化状態の調 節は、 中心的な役割を果たしていることがよく知られている。
現在までに多数のキナーゼ遺伝子、 フォスファターゼが同定されており、 それ らは構造的によく保存された非常に大きいタンパク質フアミリーを構成している ことが明らかとなっている (Semin Cell Biol 1994 Dec ; 5(6 ) :367-76 ; Cel l 199 5 Jan 27;80(2 ) :225-36; Genes Cells 1996 Feb; l (2) : 147-69 ; Trends Biochem Sci 1997 Jan; 22( l ) : 18-22 ; Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Nov 23; 96(24) : 13 603-10)。細胞中に非常に多数のキナーゼ 'フォスファ夕一ゼが存在するというこ とは、 すなわち、 それだけ多数の細胞内生理機能がキナーゼ · フォスファターゼ により細かく制御されているということを意味する。 従って、 キナーゼ · フォス ファタ一ゼに作用する薬剤は、 レセプ夕ーァゴニストゃレセプ夕一アン夕ゴニス トなどに代表される既存の薬剤よりも、 より緻密に生理機能を制御し得る可能性 を持つものと考えられる。 キナーゼ ' フォスファタ一ゼ作用薬は、 望ましくない 副作用を主作用からより解離させることが可能な、 有益性の高い医薬品となり得 ることが期待される。
このようなキナーゼ · フォスファターゼ作用薬を閧発するためにはまず、 それ それのキナーゼ · フォスファタ一ゼが関わる細胞内生理機能を特定し、 その抑制 あるいは活性化が医療上の有益性を持つかどうかについての知見が得られなけれ ばならない。 しかし、 現在までに既に多数のキナーゼ ' フォスファタ一ゼが単離 され研究されているものの、未だ同定されていない分子も多数存在するものと予 想される。また、遺伝子が単離されているものについても、 それぞれのキナーゼ · フォスファターゼが関わる細胞内生理機能についての知識は未だ非常に乏しく、 そのほとんどは解明されていない状態であると言える。 新たなキナーゼ · フォス ファタ一ゼを同定し、その生理機能を解明することにより、新たな医薬品の開発や 治療法の開発に重要な進展がもたらされることが期待される。 発明の開示
本発明は、 新規なヒトプロテインキナーゼ、 およびプロテインフォスファタ一 ゼタンパク質、 並びに該タンパク質をコードする遺伝子、 加えてそれらの製造お よび用途の提供を課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために下記の如く鋭意研究を行った。 まず 本発明者らは、ヘリックス研究所によって単離され構造が決定されたクローン（以 下、 ヘリックスクローン； 特願平 11-248036、 特願 2000-118776、 特願 2000-18 3767) からキナーゼ ' フォスファタ一ゼ様構造を持つクローン （K Pクローン） を選択することを試みた。 このへリックスクローンは、 [ 1 ] オリゴキヤップ法に よる全長率の高い cDNAラィブラリ一の作製、 および [2] 5'末端側の配列からの 全長性の評価システム（ESTに対して非全長でないものを除いた上で、 ATGprによ る評価に基づいて選択） との組み合わせによって取得された、 全長である確率の 高いクローンである。 また、 cDNAは哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込まれて いるため、 直ちに細胞における発現実験を行うことが可能である等の利点を有す る。
本発明者らは既知のキナーゼ ·フォスファタ一ゼのアミノ酸配列をクエリーと したホモロジ一検索を全ヘリヅクスクローンに対して行うことにより、 2 個のク ローン「C- NT2RP3001938」、 「C-0VARC1000945」 （以下、 K Pクローン）を選択した。 この K Pクローンには、ヒト新規タンパク質をコードする全長 cDNAが含まれてい る。 既知のキナーゼ ·フォスファタ一ゼは、 その多数が細胞内の様々なシグナル 伝達経路に関わっていることが知られており、 今回見出したキナーゼ · フォスフ ァ夕ーゼ様構造を持つ K Pクローンも同様に、 何らかのシグナル伝達経路に関わ つている可能性が考えられる。 これらの K Pクローンを様々なレポーター遺伝子 を用いたアツセィ系において評価していくことにより、 その生理機能を類推し、 創薬標的分子としてのポテンシャルを探ることが可能であると考えられる。
上記の如く本発明者らは、 新規なキナーゼ · フォスファタ一ゼタンパク質を見 出し、 本発明を完成させた。
即ち本発明は、 新規なヒトプロテインキナーゼ、 およびプロテインフォスファ 夕一ゼタンパク質、 並びに該タンパク質をコードする遺伝子、 加えてそれらの製 造および用途に関し、 より具体的には、
〔1〕 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA、
( a ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード する DNAo
( b ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有し、 配列 番号： 2または 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質をコ一ドする DNA。 ( d ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列から なるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする DNA。
〔2〕 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分 ぺプチドをコードする DNA、
〔3〕 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNAによりコードされるタンパク質または ぺプチド、
〔4〕 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNAが挿入されたベクター、
〔5〕 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNAまたは 〔4〕 に記載のベクターを保持 する宿主細胞、
〔6〕 〔5〕 に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質または ぺプチドの製造方法、
〔7〕 〔3〕 に記載のタンパク質に結合する抗体、
〔8〕 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖 に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
〔9〕 〔3〕 に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であ つて、
( a ) 該タンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触させる工程、
( b ) 該タンパク質またはその部分べプチドと被検試料との結合活性を検出する 工程、
( c ) 該夕ンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選 択する工程、 を含む方法を提供するものである。 本発明は、新規なキナーゼ ·フォスファターゼをコ一ドするヒト由来遺伝子「C -NT2RP3001938 ι 、 「C- OVARC1000945」 を提供する。 ヒト由来遺伝子 「C- NT2RP30 01938」 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 該 cDNAによりコードされるタンパク 質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。 ヒト由来遺伝子 「C- OVARC1000945」 cD NAの塩基配列を配列番号： 3に、 該 cDNAによりコードされるタンパク質のアミ ノ酸配列を配列番号： 4に示す。
配列番号： 1に示す 「C- NT2RP3001938」 は、 418アミノ酸からなるタンパク質 をコードする 0RFを有し、 また配列番号： 3に示す 「C- OVMC1000945」 は、 865 アミノ酸からなるタンパク質をコ一ドする 0RFを有する。
本明細書において、 特に断りがない限り、 本発明の上記遺伝子 「C-NT2RP30019 38」 および 「C-OVMC1000945」 をまとめて 「K P遺伝子」 、 それぞれの遺伝子に よってコードされるタンパク質をまとめて 「Κ Ρタンパク質」 と表記する。
本発明の Κ Ρタンパク質は、 ヘリックス研究所によって単離され、 構造が決定 されたクローンから、 キナーゼ ·フォスファターゼ様の構造を有するクローンと して選択された。 キナーゼ ·フォスファターゼによるタンパク質のリン酸化状態 の調節は、 細胞の正常な分化 '増殖、 および細胞レベルでの生理機能にとって中 心的な役割を担っている。 従って、 本発明のタンパク質は、 生体において重要な 機能を担う分子であると考えられ、医薬品開発の上で標的分子として有用である。 また、 本発明の Κ Ρタンパク質は、 タンパク質をリン酸化、 脱リン酸化するため の試薬として用いることも考えられる。
ヘリックスクローンは、 特殊な方法により作製されており、 高確率で全長鎖の cDNAを含むことが期待され （特願平 11-248036、 特願 2000- 118776、 特願 2000-1 83767) 、 該 cDNAは哺乳類用発現ベクターに組み込まれているため、 直ちに細胞 における発現実験を行うことが可能である。 従って、 これらベクターを様々なレ ポーター遺伝子を用いたアツセィ系に順次供していくことによって、 その生理的 機能に関する情報を得ることが可能である。 既知のキナーゼ ·フォスファタ一ゼ は、 その多数が細胞内の様々なシグナル伝達経路に関わっていることが知られて おり、 本発明の K P遺伝子も同様にシグナル伝達経路に関わっていることが考え られる。 本発明の遺伝子について、 既知のシグナル伝達を検出することが可能な レポ一夕一遺伝子アツセィ系を用い、機能スクリーニングを行うことにより、様々 な生理機能に関与する可能性を網羅的に検索することが可能である。
レポーター遺伝子を用いたアツセィ系は、 多種多様の細胞内生理機能を、 同一 のフォーマツ卜によって簡便に評価することができる優れた実験系である。 具体 的には、次のようなレポーター遺伝子ァッセィにより機能スクリーニングを行う。 本発明の K P遺伝子を含むベクターを、 各種ェンハンサーエレメントを持つレポ 一夕一遺伝子と共に宿主細胞に導入し、 K P遺伝子を発現させる。 K P遺伝子を 含むベクターを導入しない対照細胞と比較して、 レポーター遺伝子の発現が変化 した場合、 ェンハンサーエレメントに対して該 K P遺伝子によってコ一ドされる タンパク質が作用したものと判断することができる。 種々のェンハンサーエレメ ントについて、 本発明の K P遺伝子が作用するか否かを検討することにより、 本 発明の K P遺伝子の生理機能について有益な情報が得られることが期待される。 多数のェンハンサーエレメン卜について、 該エレメン卜に作用するシグナル伝達 系、 およびそのェンハンサーエレメントによって調節を受けている機能遺伝子等 に関する大量の情報が既に知られている。 従って、 被検 K P遺伝子があるェンハ ンサ一エレメントに対して作用することが示されれば、 そのェンハンサ一エレメ ントに関する既知の情報から、 その K P遺伝子が関わる生理機能を類推すること が可能である。
機能スクリーニングにおいては、 K P遺伝子を単独で発現させた場合の作用と 共に、 何らかの刺激を加え、 その作用に対する K P遺伝子の及ぼす影響を調べる ことも有益である。 すなわち、 K P遺伝子単独では作用を示さない場合において も、 既知の刺激による特定のエレメントの活性化に対して、 共発現させた K P遺 伝子が、 その活性化作用をさらに促進、 あるいは抑制する可能性が考えられる。 既知の刺激としては、 例えば、 細胞表面レセプ夕一のリガンド （インターロイキ ン類、 増殖因子類、 TGF- ?ファミリ一、 TNF-ひファミリー、 ホルモン類、 低分子 化合物等） 、 細胞内シグナル伝達に関わる因子 （各種キナーゼ、 各種フォスファ 夕一ゼ、 低分子量 Gタンパク質結合タンパクファミリ一、 Smadファミリ一、 STAT ファミリ一、 TRAFフアミリー、 細胞表面レセプ夕一等） の発現、 およびストレス 刺激 （酸化ストレス、 機械的ス トレス、 熱ストレス等） などを挙げることができ 。
レポ一夕一遺伝子を用いたアツセィは、 当業者によって一般的に使用される巿 販の各種キットを用いて実施することができる。 例えば、 Clontech社の Mercury 'Μ Pathway Profil ing Systems、 Stratagene PathDetectR Trans-Reporting System、および PathDetectR Cis-Reporting System等のキットを挙げることがで きる。 また、 文献に記載されている標準的な方法 （Overview of Genetic Report er Systems. In Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel, F . M. et al.， (Wiley & Sons, NY) Unit 9.6 ( 1995 ) ; Molecular Cloning: A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY ( 1989) )に従って実施することができる。
レポ—ター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合、 このルシフエ ラーゼ活性の測定は、 例えば、 Promega社の Dual- Luc if erase™ Reporter Assay Systemなどを用いた標準的な方法によって測定することができる。
上記機能スクリーニングにおいて使用できるレポ一夕一遺伝子としては、 ルシ フェラーゼ遺伝子の他、 例えば、 分泌性アルカリフォスファターゼ遺伝子、 クロ ラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ （CAT) 遺伝子、 および5 -ガラク トシダ一ゼ遺伝子等を挙げることができる。 また、 レポーターアツセィに用いる ェンハンサーエレメントとしては、 血清反応性エレメント （Serum Response Ele ment : SRE)、 cAMP反応性エレメント （cAMP Response Element: CRE)、 TPA反応 性エレメント （TPA Response Element : THE) 、 NF c B (Nuclear factor of . B cell) 結合エレメント、 熱ショック反応性エレメント （Heat shock Response El ement: HRE) 、 グルココルチコィ ド反応性エレメント (Glucocorticoid Respons e Element: GRE) 、 API (Activator protein 1 : c-jun/c-fos複合体） 結合エレ メント、 NFAT (Nuclear Factor of Activated T- cells) 結合エレメント、 p53結 合エレメント、 インターフェロンァ活性化エレメント ( Interferon Gamma Act iv ated Sequence: GAS) 、 インターフェロン反応性エレメント （ Interferon- Stimu lated Response Element: ISRE) 、 E2F結合エレメント、 STATフアミリ一結合ェ レメント、 Smadフアミリー結合エレメント、 TCF/LEF結合エレメント、 GATAファ ミリー結合エレメント、 ステロール調節エレメント （Sterol Regulatory Elemen t： SRE) 、 IRF ( Interferon Regulatory Factor) フアミリ一結合エレメント、 P PARァ結合エレメント、 および AhR結合エレメントを例示することができる。
また、 レポ一夕一アツセィに用いる宿主細胞としては、 293、 He la, NIH3T3, C V-l、 Jurkat、 血管平滑筋細胞、 血管内皮細胞、 および心筋細胞を例示することが できる。
本発明は、 また、 ヒト K Pタンパク質 （配列番号： 2または 4 ) と機能的に同 等なタンパク質を包含する。 このようなタンパク質には、 例えば、 ヒ ト K Pタン パク質の変異体、 ホモログ、 バリアント等が含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となるタンパク質が K Pタンパク質と同様に、 タンパク質をリン酸化 する機能および/またはタンパク質を脱リン酸化する機能を有することを指す。 目的のタンパク質が、 タンパク質をリン酸化するか否かは以下の手法により判定 することができる。
キナーゼ夕ンパク質と基質夕ンパク質を適当な反応液中で混合し、 ATP存在下 で反応を行った後、 基質タンパク質のリン^化状態を測定することによりリン酸 化活性を判定することができる。 キナーゼタンパク質は適当な細胞株や、 組織の 抽出物から一般的な生化学的な方法により精製したものを使用することができる。 また、 哺乳動物細胞 (C0S7、 CV-1、 HEK293, HeLa、 Jurkat、 NIH3T3など） や、 昆 虫細胞 （Sf9など） 、 大腸菌 （E. col i) 、 酵母などにキナーゼタンパク質を発現 する遺伝子を導入し、大量発現させたキナーゼタンパク質を用いることもできる。 [ァ - 32P] ATPなどの、 放射性同位元素で標識された ATPを用いることにより、 基 質タンパクのリン酸化状態を、 液体シンチレ一シヨンカウン夕一や、 オートラジ ォグラフィーなどにより測定することができる。
また、 リン酸化タンパク特異的抗体などを用い、 ELISA (enzyme- linked immun osorbent assay) や、 ウエスタンブロット法などにより基質タンパクのリン酸化 状態を測定することができる。 基質タンパクとしては、 特定のキナーゼに特異的 なタンパク質を用いることもできるし、 カゼインや、 ヒストン、 ミエリン塩基性 タンパク（MBP) といった様々なキナーゼにより非特異的にリン酸化されることが 知られているタンパク質を用いることもできる。 あるいは、 リン酸化される配列 を持つ合成べプチドなども用いることができる。
また、 キナーゼタンパク質自身のリン酸化 （自己リン酸化） を測定することに よってもリン酸化活性を判定することもできる。 より具体的には、 Protein Phos phorylation: A Practical Approach. First Edition (Hardie DG.等 著、 Oxf ord University Press.、 1993)などの成書に記載の一般的な方法に従って行うこ とができる。
目的のタンパク質が、 タンパク質を脱リン酸化するか否かは以下の手法により 判定することができる。
フォスファタ一ゼタンパク質とあらかじめリン酸化された基質タンパク質を適 当な反応液中で混合し反応を行い、 基質タンパクのリン酸化程度の減少を測定す ること、 あるいは基質タンパク質より遊離したリン酸の量を測定することにより 脱リン酸化活性を判定することができる。フォスファタ一ゼタンパク質としては、 上記のリン酸化活性の判定の場合と同様にして調製したものを使用することがで きる。 基質タンパク質としては、 上記のリン酸化活性の判定の場合と同じものを 使用することができる。 また、 ホスホリラーゼ、 ホスホリラ一ゼキナーゼなども 基質夕ンパクとして使用することができる。 基質夕ンパク質をあらかじめリン酸 化するためには、 ホスホリラーゼキナ一ゼ、 プロテインキナーゼ 、 EGFレセプ夕 一などのチロシンキナーゼなどの適当なキナーゼによりリン酸化すればよい。 基 質夕ンパク質のリン酸化状態は、 上記のリン酸化活性の判定の場合と同様の方法 により測定することができる。 より具体的には、 Protein Phosphorylation: A P ractical Approach. First Edition (Hardie DG.等 著、 Oxford University P ress.、 1993) などの成書に記載の一般的な方法に従って行うことができる。
また、 被検タンパク質によってリン酸化、 脱リン酸化される基質タンパク質の 同定は、 ファージベクタ一などを用いた cDNA発現ライブラリ一を発現させ、それ それのクローンから発現されるタンパク質が被検タンパク質の基質となるかどう かを判定することにより基質タンパクを同定することができる。より具体的には、 EMBO J. ( 1997) 16 : 1921-1933.に記載の方法を参考に行うことができる。 また、 酵母ッ一ハイブリツドスクリーニング法などにより、 被検タンパク質と結合する タンパク質を同定することにより、 基質タンパクを同定することができる。 より 具体的には、 EMBO J. ( 1997) 16 : 1909- 1920.に記載の方法を参考に行うことがで きる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、 当業者によく 知られた方法としては、 タンパク質に変異を導入する方法が知られている。 例え ば、 当業者であれば、 部位特異的変異誘発法 （Hashimoto-Gotoh, T. et al . ( 19 95 ) Gene 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M. ( 1983) Methods Enzymol . 100, 468-500、 Kramer, W. et al . ( 1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、 Kramer W， and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol . 154, 350-367、 Kunkel,TA( l 985 ) Proc Natl Acad Sci USA. 82， 488-492, Kunkel ( 1988) Methods Enzymol . 85, 2763- 2766)等を用いて、 ヒト K Pタンパク質 （配列番号： 2または 4 ) のァ ミノ酸に適宜変異を導入することにより、 該タンパク質と機能的に同等なタンパ ク質を調製することができる。 また、 アミノ酸の変異は自然界においても生じう る。 このように、 ヒト K Pタンパク質 （配列番号： 2または 4 ) のアミノ酸配列 において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、 該夕ンパク 質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 このよう な変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 50アミノ酸以内であり、 好ま しくは 30アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内 （例えば、 5 アミノ酸以内） であると考えられる。
変異するァミノ酸残基においては、 ァミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 Wヽ Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 T、 Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、 M) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 Ns E、 Q) 、 塩基含有 側鎖を有するアミノ離（R、 K、 Η)、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す） 。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加および/ または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク 質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F . et a 1. , Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1984) 81， 5662-5666 、 Zoller, M. J. & Sm ith, M. Nucleic Acids Research ( 1982) 10, 6487-6500 、 Wang, A. et al. , S cience 224, 1431-1433 Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl . Acad. Sci. USA ( 1982) 79, 6409-6413 ) 。
ヒト K Pタンパク質のァミノ酸配列に複数個のァミノ酸残基が付加されたタン パク質には、 ヒト K Pタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。 融合タンパ ク質は、 ヒト K Pタンパク質と他のぺプチド又はタンパク質とが融合したもので あり、 本発明に含まれる。 融合タンパク質を作製する方法は、 ヒト K Pタンパク 質 （配列番号： 2または 4 ) をコードする DNAと他のペプチド又はタンパク質を コ一ドする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入 し、 宿主で発現させればよく、 当業者に公知の手法を用いることができる。 本発 明のタンパク質との融合に付される他のぺプチド又はタンパク質としては、 特に 限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、 例えば、 FLAG
(Hopp, T. P. et al .， BioTechnology ( 1988) 6， 1204-1210 )、6個の His (ヒ スチジン） 残基からなる 6 xHis、 10 xHis、 インフルエンザ凝集素 （HA) 、 ヒ卜 c -mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T 抗原の断片、 lck tag, ひ- tubul inの断片、 B- tag、 Protein C の断片等の公知 のペプチドを使用することができる。 また、 本発明のタンパク質との融合に付さ れる他のタンパク質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一S—トランスフェラ —ゼ） 、 HA (インフルエンザ凝集素） 、 ィムノグロブリン定常領域、 ?—ガラク トシダーゼ、 MBP (マルト一ス結合タンパク質）等が挙げられる。市販されている これらぺプチドまたはタンパク質をコードする DNAを本発明のタンパク質をコ一 ドする DNAと融合させ、これにより調製された融合 DNAを発現させることにより、 融合タンパク質を調製することができる。
また、 あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知 られた他の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Sambrook,J et al .， M olecular Cloning 2nd edリ 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 198 9) を利用する方法が挙げられる。即ち、 当業者であれば、 ヒト K Pタンパク質を コードする DNA配列 （配列番号： 1または 3 ) もしくはその一部を基に、 これと 相同性の高い DNAを単離して、 該 DNAからヒト K P夕ンパク質と機能的に同等な タンパク質を単離することも通常行いうることである。 本発明には、 ヒト K P夕 ンパク質をコードする DNAとハイブリダィズする DNAがコードし、 ヒト K Pタン パク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。このようなタンパク質としては、 例えば、 ヒトおよび他の哺乳動物のホモログ（例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシなどがコードするタンパク質） が挙げられる。 ヒト K Pタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離する ためのハイブリダイゼーションの条件は、 当業者であれば適宜選択することがで きる。 ハイブリダィゼ一シヨンの条件としては、 例えば、 低ストリンジェン卜な 条件が挙げられる。 低ストリンジェン卜な条件とは、 ハイブリダィゼーシヨン後 の洗浄において、例えば 42°C、 2 X SSC、 0.1 % SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 2 X SSC 、 0.1%SDSの条件である。 より好ましいハイブリダィゼ一シヨンの条件 としては、 高ストリンジェントな条件が挙げられる。 高ストリンジェントな条件 とは、 例えば 65° O. l x SSC及び 0.1%SDSの条件である。 これらの条件におい て、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待で きる。 但し、 ハイブリダィゼ一シヨンのストリンジエンシーに影響する要素とし ては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜 選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。 ハイブ リダィゼ一シヨンの条件に関するさらなる指針は、 例えば Seunbrookら（1989, o lecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. )、 および Ausubel ら ( 1995， Current Protocols in Molecular Biology, John Wile y & Sons, N. Y. )にュニッ ト 2.10により、当技術分野において容易に入手可能で ある。
また、 ハイブリダィゼーシヨンにかえて、 ヒト K Pタンパク質をコードする DN A (配列番号： 1または 3 )の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子 増幅法、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)法を利用して単離することも可能 である。
これらハイプリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAが コードする、 ヒト K Pタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、 通常、 ヒト K Pタンパク質 （配列番号： 2または 4 ) とアミノ酸配列において高い相同性を有 する。 本発明のタンパク質には、 ヒト K Pタンパク質と機能的に同等であり、 か つ配列番号： 2または 4に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク 質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも 65% 以上の同一性、好ましくは 75%以上の同一性、 さらに好ましくは 85%以上の同一 性、 さらに好ましくは 95%以上の同一性を指す。 タンパク質の相同性を決定する には、文献（Wi lbur, W. J. and Lip腿， D. J. Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1 983) 80， 726-730) に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法 により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 しかしながら、 得られたタンパク質が、 ヒト K Pタンパク質と同等の機能を有し ている限り、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明のタンパク質を原核細胞、 例え ば大腸菌で発現させた場合、 本来のタンパク質のアミノ酸配列の N末端にメチォ ニン残基が付加される。本発明のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。 本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 組み換えタンパク質とし て、 また天然のタンパク質として調製することが可能である。 組み換えタンパク 質であれば、 本発明のタンパク質をコードする DNA (例えば配列番号： 1または 3 に記載の塩基配列を有する MA)を、 適当な発現ベクターに組み込み、 これを適当 な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー、 あるいは本発明のタンパク質に対す る抗体をカラムに固定したァフィ二ティ一クロマトグラフィーにかけることによ り、 または、 さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、 調製 することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグル夕チオン S-トランスフェラーゼタンパク質と の融合タンパク質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパ ク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、 発現させた組み換え夕ンパク質はグル夕チオンカラムあるいは二ヅケルカラムを 用いて精製することができる。 融合タンパク質の精製後、 必要に応じて融合タン パク質のうち、 目的のタンパク質以外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xa などにより切断し、 除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本発明のタンパク 質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、 後述する本発明のタンパク質に結 合する抗体が結合したァフィ二ティーカラムを作用させて精製することにより単 離することができる。 抗体はポリク口ーナル抗体であつてもモノクローナル抗体 であってもよい。
本発明は、 また、 本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部 分ペプチドは、 少なくとも 7アミノ酸以上、 好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに 好ましくは 9アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分べプチドは、例えば、 本発明の夕ンパク質に対する抗体の作製、 本発明の夕ンパク質に結合する化合物 のスクリーニングや、 本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに 利用し得る。 また、 本発明のタンパク質のアン夕ゴニストや競合阻害剤になり得 る。 本発明の部分ペプチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成法、 ある いは本発明のタンパク質を適切なぺプチダーゼで切断することによって製造する ことができる。 ペプチドの合成は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれに よってもよい。
本発明のタンパク質をコードする DNAは、 上述したような本発明のタンパク質 の in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、 例えば、 本発明のタンパ ク質をコ一ドする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療 可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の タンパク質をコ一ドしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから 合成された cDNAであるか、ゲノム DNAであるか、化学合成 DNAであるかなどを問 わない。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づ く任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。 本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明のタンパク質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明 の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1または 3 ) の一部をプローブにしてハイブ リダィゼーシヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリーは、 例えば、 文献 (Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning、 Cold Spring Harbor Laborat ory Press ( 1989)) に記載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAライブラ リーを用いてもよい。 また、 本発明のタンパク質を発現している細胞より MAを 調製し、 逆転写酵素により cDNAを合成した後、 本発明の DNAの配列 （例えば、 配 列番号： 1または 3 ) に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプライマ一として 用いて PCR反応を行い、本発明のタンパク質をコ一ドする cDNAを増幅させること により調製することも可能である。
また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳 領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、 得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNA ライブラリーをスクリーニングする ことにより、 ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明のタンパク質を発現する細 胞、 組織、 臓器から、 mRNAを単離する。 mMAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グ ァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al.， Biochemistry ( 1979) 18, 5294-52 99) ヽ AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi , N.， Anal . Biochem. ( 1987) 162, 156-159) 等により全 MAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を 使用して全 Aから mRNAを精製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕学ェ梨 等 用いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマ一等を用いて、 5 ，- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）およびポリメラーゼ連鎖反応 （polymer ase chain reaction ； PCR)を用いた 5， - RACE法（Frohman, M. A. et al .， Proc . Natl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al .， Nu cleic Acids Res. ( 1989) 17， 2919-2932 ) に従い、 cDNAの合成および増幅を行 うことができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の方 法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチヱインターミネーシヨン法により確認す ることができる。
また、 本発明の MAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al .， Nucel ic Acids Research ( 1981 ) 9， r43- 74 )。 また、 本発明の DNAは、 巿 販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、 制限酵素による消化、合成ォリゴヌクレオチドゃ適当な DNAフラグメントの挿入、 リンカ一の付加、 開始コドン （ATG) および/または終止コドン （TM、 TGA、 又は TAG) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 366位の塩基 A から 1619位の塩基 Cからなる DNAを包含する。 また、 配列番号： 3の塩基配列に おいて 33位の塩基 Aから 2627位の Aからなる DNAを包含する。
本発明の DNAはまた、 配列番号： 1または 3に示す塩基配列からなる DNAとハ ィブリダイズする MAであり、 且つ上記本発明の夕ンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質をコードする DNAを含む。 ハイプリダイゼ一シヨンにおける条件は当業 者であれば適宜選択することができるが、 具体的には上記した条件を用いること ができる。 これらの条件において、 温度を上げる程に高い相同性を有する MAを 得ることができる。上記のハイプリダイズする DNAは、 好ましくは天然由来の DN A、 例えば cDNA又は染色体 DNAである 。 本発明は、 また、 本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。 本発明のベ クタ一としては、 宿主細胞内において本発明の MAを保持したり、 本発明のタン パク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101、 XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために、 大腸菌で増幅されるための「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸菌 の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンビシリンゃテトラサイクリン、 力 ナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系べク 夕一、 pBR322、 pBluescript, pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAのサブ クローニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM -T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的におい てベクターを使用する場合には、 特に、 発現べクタ一が有用である。 発現べクタ 一としては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクターが大腸菌で 増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB10 XLl-Blu eなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるようなプロ モー夕一、 例えば、 lacZプロモ一夕一 （Wardら， Nature ( 1989) 341, 544-546； FASEB J. ( 1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーター (Betterら， Science ( 19 88) 240, 1041-1043 ) 、 または T7プロモー夕一などを持っていることが不可欠 である。 このようなベクタ一としては、 上記べクタ一の他に PGEX-5X- 1 (フアル マシア社製） 、 「QIAexpress system」 （キアゲン社製） 、 pEGFP、 または pET (こ の場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい）などが挙げ られる。
また、 ベクターには、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei， S. P. et al J. Bacteriol . ( 1987) 169， 4379 ) を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩化力 ルシゥム法、 エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明のタンパク質を製造するためのベクターとし ては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18( 17) , p5322), pEF 、 pCDM8 ) 、 昆虫細 胞由来の発現べク夕一 (例えば 「Bac - to - BAC baculovairus expression systemj
(ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 p V pAdexLcw ) 、 レトロゥ ィルス由来の発現べクタ一 （例えば、 pZIPneo)、 酵母由来の発現ベクター （例え ば、 「Pichia Expression Kit」 （インビトロゲン社製） 、 pNVll 、 SP-Q01)、枯 草菌由来の発現ベクター （例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモ一夕一.、 例えば SV40プロモ一夕一 （Mul liganら， Nature ( 1979) 277, 108)、 MMLV- LTRプロモ一夕一、 EF1ひプロモ一夕 ― (Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990) 18, 5322)、 C Vプロモー夕一な どを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子
(例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺 伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば、 p匪、 pDR2、 pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSVヽ p0P13などが挙げられる。 さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DH FR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ ト トレキセート
( TX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的と する場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクタ一 （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 —マウィルス （BPV)等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は選択マーカーとして、 アミノグリ コシドトランスフェラーゼ （APH)遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸 菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジ ヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DM を適当なベクタ一に組み込み、 例えば、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチ ォニックリボソーム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。 これにより、 本発明の K P遺伝子の変異に起因する疾患に対する 遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクターとしては、 例えば、 ァ デノウィルスべクタ一 （例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクタ一（例えば pZ IPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一への本発明の DNA の挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能である （Mole cular Cloning , 5.61-5.63) 。 生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vi vo法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクタ一が導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々 の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発 明の夕ンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 タン パク質製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivo の産生系がある。 in vi troの産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系 が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. ( 1995) 108, 945)、 COS、 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney )、 HeLa、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカヅメガエル卵母細胞（Val le， et al .， Nature ( 1981 ) 291, 358-340 ) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9 、 Sf21、 Tn5 が知られている。 CH0 細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞であ る dhfr-CH0 (Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1980) 77, 4216-4220 )や CHO K-1 (Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1968) 60， 1275) を好適に使用することができ る。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラ ン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用いた 方法、 エレクトロボ一レ一シヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが 可能である。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ ·夕バカム （Nicotiana tabacum ) 由 来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス （Saccharomyces ) 属、 例え ば、 サヅカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae ) 、 糸状菌、 例え ば、 ァスペルギルス （Aspergillus ) 属、 例えば、 ァスペルギルス '二ガ一 （As pergillus niger ) が知られている 0
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、 大腸菌 （E. coli ) 、 例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯 草菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in V itroで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、 公知の方法に従い行 うことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液 を併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8で あるのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応 じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。 一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用す る産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に 的と する DNAを導入し、 動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。 本 発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glas er， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 ) 。 また、 哺乳類動物を用い る場合、 トランスジェニヅク動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ カゼインのような乳汁中に固有に産生され るタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この 融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する 乳汁から、 目的のタンパク質を得ることができる。 トランスジエニックャギから 産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトラン スジエニックャギに使用してもよい （Ebert, .M. et al .， Bio/Technology ( 19 94) 12, 699-702 )。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的のタンパク質をコ一ドする DNAを揷入したバキュロウィルスをカイコに 感染させることにより、 このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることがで きる (Susumu, M. et al .， Nature ( 1985) 315, 592-594 )。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例 えば pMON 530に挿入し、 このべクタ一をァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens ) のようなバクテリアに導入する。 このパクテリ ァをタバコ、例えば、 ニコチアナ ·夕バカム （Nicotiana tabacum )に感染させ、 本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K. -C. Ma et al .， Eur. J. Immunol. ( 1994) 24， 131-138) 。
これにより得られた本発明のタンパク質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地な ど）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。 タンパク質の分離、 精製は、 通常のタンパク質の精製で使用されている分離、 精 製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラ フィ一力ラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫 沈降、 SDS_ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶 等を適宜選択、 組み合わせればタンパク質を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換ク口マトグラフィ一、 疎水性ク口マトグラフィ一、 ゲル濾過、 逆相ク口 マトグラフィ一、 吸着クロマトグラフィ一等が挙げられる （Strategies for Pro tein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 。 こ れらのクロマトグラフィ一は、 液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の 液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方 法を用い、 高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、 夕ンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ ることにより、任意に修飾を加えたり部分的にぺプチドを除去することもできる。 夕ンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリブシン、 キモトリプシン、 リシルェ ンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。 本発明は、 また、 本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗 体の形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体 も含まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た 抗血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 さら にヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、 その由来となる 動物種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラット由来のタンパ ク質が好ましく、 特にヒト由来のタンパク質が好ましい。 ヒト由来のタンパク質 は、 本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができ る。
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 完全なタンパク質 であってもよいし、 また、 タンパク質の部分ペプチドであってもよい。 タンパク 質の部分ペプチドとしては、 例えば、 タンパク質のアミノ基（N)末端断片やカル ボキシ （C)末端断片が挙げられる。本明細書で述べる 「抗体」 とはタンパク質の 全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現べクタ一系 に挿入し、 該ベクターによって本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿 主細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感 作抗原として用いればよい。 また、 タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あ るいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。 短いペプチドは、 キーホールリンペットへモシァニン、 ゥシ血清アルブミン、 卵 白アルブミンなどのキヤリアタンパク質と適宜結合させて抗原とすることが好ま しい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、 例えば、力二クイザル、 ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。 感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法に従って行われる。 一般的方法と しては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感作抗 原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁し たものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全アジュ バントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フロイン ト不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21日毎に数回投与するこ とが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。 こ のように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。 ここで、 本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、 血清中 の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血 液を取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクローナル 抗体としては、 ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じ この血清からポリクロ一ナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用して もよい。 例えば、 本発明のタンパク質をカップリングさせたァフィ二ティーカラ ムを用いて、 本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分を プロテイン Aあるいはプロティン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫 グロプリン Gあるいは Mを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好 ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選別 のための特性を獲得したミエ口一マ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Galfre, G. and Milstein, C.， Methods Enzymol . ( 198 1 ) 73, 3-46 ) 等に準じて行うことができる。 細胞融合により得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリ ド —マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 継続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイブリ ドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒト リンパ球、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒ卜由来の永久分 裂能を有するミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性 を有する所望のヒト抗体を産生するハイプリ ドーマを得ることもできる （特開昭 63- 17688号公報) 。
次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテインお プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のタンパク質 をカツプリングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製するこ とが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製、 検出に用いられ る他、 本発明のタンパク質のァゴニストやアン夕ゴニストの候補になる。 また、 この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考え られる。 得られた抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるため、 ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジヱニック動物に抗 原となるタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細 胞を取得し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ド一マを用いてタンパ ク質に対するヒト抗体を取得することができる （国際公開番号 W092- 03918、 W093 -2227、 W094-02602, W094-25585, W096-33735および W096- 34096参照) 。 ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子 （oncogene) により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。 組換え型抗体は、 それをコードする DNAをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免 疫細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し 産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質に結合する限り、 その抗体断片 や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab5 )2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Hus ton, J. S. et al. , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol . ( 1994) 152, 2968-2976 ； Better, . and Horwitz, A. H. , Methods Enzymol. ( 1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol . ( 1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol . ( 1986) 121， 652-663 ； Rousseaux, J. et al . , Methods Enzymol . ( 1986 ) 121 , 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol . ( 1991 ) 9， 1 32-137参照）。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗 体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立されて いる。
また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒト 型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等のクロマトグ ラフィーカラム、 フィル夕一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精 製することができる (Antibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるもので はない。 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検 定法（Enzyme- linked immunosorbent assay； ELISA)等により行うことができる。 ァフィ二ティークロマトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F . F . (Pharmacia) 等が挙げられる。 ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィ一、 疎水性ク口マトグラフィ一、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies fo r Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )c これらのクロマトグラフィ一は HPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて 行うことができる。 また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay； EL ISA)、 EIA (酵素免疫測定法） 、 MA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 ELISAを用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明 のタンパク質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の 培養上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で標 識した抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次 いで洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定す ることで抗原結合活性を評価することができる。 タンパク質としてタンパク質の 断片、 例えばその C 末端からなる断片を使用してもよい。 本発明の抗体の活性評 価には、 BIAcore( Pharmacia製） を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の 夕ンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該夕ンパク質 との免疫複合体を検出又は測定することからなる、 本発明のタンパク質の検出又 は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、 タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、 タンパク質を用いた 種々の実験等に有用である。
本発明はまた、 ヒト K Pタンパク質をコードする DNA (配列番号： 1または 3 ) またはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチ ドを提供する。
ここで 「相補鎖」 とは、 A:T (ただし RNAの場合は U)、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なく とも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70% 、 好ましくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90% 、 さらに好 ましくは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するため のアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。 このような核酸には、 本発明のタンパク質をコードする MAの検出や増幅に用 いるプローブやプライマ一、 該 DNAの発現を検出するためのプローブやプライマ 一、 本発明のタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド 誘導体 （例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザィム、 またはこれら をコードする DNA等） が含まれる。 また、 このような核酸は、 DNAチップの作製 に利用することもできる。
プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認 識配列や夕グなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号： 1または 3の 塩基配列中のいずれかの箇所にハイプリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオ チドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号： 1または 3の塩基配列中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに対す るアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好ましくは、 連続する少なく とも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌク レオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、 ホスホロチォェ一ト修飾体 又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成するヌ クレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、 DNA または mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1または 3に示される塩基配列 に特異的にハイブリダィズできる限り、 1 又は複数個のヌクレオチドのミスマツ チが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明のタンパク質の産 生細胞に作用して、 該タンパク質をコードする DNA 又は mRNAに結合することに より、 その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNA の分解を促進したりして、 本発明の タンパク質の発現を抑制することにより、 結果的に本発明のタンパク質の作用を 抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 頼粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する か、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L- リジン、 リピヅド、 コレステロール、 リボフヱクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1 〜： I00mg/kg、 好ましくは 0. l〜50mg/kgの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害 し、 従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ る。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。 本発明のタンパク質は、これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。 すなわち、 本発明のタンパク質と、 該タンパク質に結合する化合物を含むと予想 される被検試料とを接触せしめ、 そして本発明のタンパク質に結合する活性を有 する化合物を選択する、 ことからなる本発明のタンパク質に結合する化合物をス クリーニングする方法において使用される。 スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であって も、 天然由来のタンパク質であってもよい。 また部分ペプチドであってもよい。 また細胞表面に発現させた形態、 または膜画分としての形態であってもよい。 被 検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生 物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製タンパク質、 ぺプ チド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被検 試料を接触させる本発明のタンパク質は、 例えば、 精製したタンパク質として、 可溶型タンパク質として、 担体に結合させた形態として、 他のタンパク質との融 合タンパク質として、 細胞膜上に発現させた形態として、 膜画分として被検試料 に接触させることができる。
本発明の夕ンパク質を用いて、 例えば該夕ンパク質に結合するタンパク質をス クリーニングする方法としては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能 である。 このようなスクリーニングは、 例えば、 免疫沈降法により行うことがで きる。 具体的には、 以下のように行うことができる。 本発明のタンパク質をコー ドする遺伝子を、 pSV2neo, pcDNA I， pCD8 などの外来遺伝子発現用のベクターに 挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプロモー 夕一としては SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed. ), Genetic Eng ineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83 - 141(1982) ), EF-1 promot er (Kimら Gene 91, p.217-223 (1990))， CAG promoter (Niwa et al. Gene 10 8, p.193-200 (1991))， RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152， p.684-704 (1987)， SR a promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p. 66 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Pro Natl. A cad. Sci. USA 843 P.3365-3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and F iers J. Mol. Appl. Genet. 1, .385-394 (1982)), Adenovirus late promote r (Kaufman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter等 の一般的に使用できるプロモー夕一であれば何を用いてもよい。 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、 エレク トロポレーシヨン法 （Chu， G. et al. ucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987))、 リン酸カルシウム法 （Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-275 2 (1987))、 DEAEデキストラン法 （Lopata， M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. , 164 2-1643 (1985))、リポフエクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993))等の方法があるが、 いずれの方法によっても よい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位 （ェピトープ） を 本発明のタンパク質の N末または C末に導入することにより、モノクローナル抗 体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させるこ とができる。 用いるェピト一プ一抗体系としては市販されているものを利用する ことができる （実験医学 1^， 85-90 (1995))。マルチクローニングサイ トを介し て、 ガラクトシダーゼ、 マルト一ス結合タンパク質、 グル夕チオン S-トラン スフエラ一ゼ、 緑色蛍光タンパク質（GFP)などとの融合タンパク質を発現するこ とができるベクターが市販されている。
融合タンパク質にすることにより本究明のタンパク質の性質をできるだけ変化 させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなェピトープ 部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、 ポリヒスチジン （His-tag) 、 インフルエンザ凝集素 HA、 ヒト c- myc、 FLAG, Ves icular stomatitis ウィルス糖タンパク質（VSV-GP)、 T7 gene 10 タンパク質（T 7- tag)、 ヒト単純へルぺスウィルス糖タンパク質 （HSV-tag)、 E-tag (モノクロ ーナルファージ上のェビト一プ） などのェピトープとそれを認識するモノクロ一 ナル抗体を、 本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリ一ニングのため のェピトープ—抗体系として利用できる （実験医学 13， 85-90 (1995))。 免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。 この免疫複合体は本 発明のタンパク質、 それと結合能を有するタンパク質、 および抗体からなる。 上 記ェピトープに対する抗体を用いる以外に、 本発明のタンパク質に対する抗体を 利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現べクタ一に 導入して大腸菌内で発現させ、 発現させたタンパク質を精製し、 これをゥサギや マウス、 ラット、 ャギ、 ニヮトリなどに免疫することで調製することができる。 また、 合成した本発明のタンパク質の部分べプチドを上記の動物に免疫すること によって調製することもできる。
免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharo se や Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。 また、 本発明の タンパク質を、 例えば、 GSTなどのェピトープとの融合タンパク質として調製し た場合には、 グル夕チオン- Sepharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結 合する物質を利用して、 本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、 免 疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献（Harlow, E. and Lane, D. : Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York ( 1988) ) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。
免疫沈降されたタンパク質の解析には SDS- PAGEが一般的であり、 適当な濃度 のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析 することができる。 また、 この際、 一般的には本発明のタンパク質に結合した夕 ンパク質は、 クマシ一染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出 することは困難であるので、放射性同位元素である 35 S-メチォニンや35 S -システ インを含んだ培養液で細胞を培養し、 該細胞内のタンパク質を標識して、 これを 検出することで検出感度を向上させることができる。 タンパク質の分子量が判明 すれば直接 SDS-ポリアクリルアミ ドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配 列を決定することもできる。
また、 本発明のタンパク質を用いて、 該タンパク質に結合するタンパク質を単 離する方法としては、 例えば、 ウェストウエスタンプロッティング法（Skolnik, E. Y. et al . ,Cell ( 1991 ) 65, 83-90) を用いて行うことができる。 すなわち、 本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞、 組織、 臓器 (例えば、 肝臓や腎臓） よりファージベクタ一 Ugtll, ZAPなど） を 用いた cDNAライブラリーを作製し、 これを LB-ァガロース上で発現させフィル夕 —に発現させたタンパク質を固定し、 精製して標識した本発明のタンパク質と上 記フィル夕一とを反応させ、 本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現す るプラークを標識により検出すればよい。 本発明のタンパク質を標識する方法と しては、 ビォチンとアビジンの結合性を利用する方法、 本発明のタンパク質又は 本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド （例えば GSTなど） に 特異的に結合する抗体を利用する方法、 ラジオァイソト一プを利用する方法又は 蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた 2-ハイ ブリヅドシステム （Fields, S.， and Sternglanz, R. , Trends. Genet. ( 1994) 1 0, 286-292、 Dalton S, and Treisman R ( 1992)Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response e lement. Cell 68, 597-612、 「MATCHMAKER Two-Hybrid Systemj , 「Mammalian M ATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kitj， 「MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (いずれ もクロンテツク社製）、 「HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj (ストラ夕ジーン 社製）） を用いて行う方法が挙げられる。 2-ハイブリツ ドシステムにおいては、 本 発明のタンパク質またはその部分べプチドを SRF DNA結合領域または GAL4 DNA 結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、 本発明のタンパク質と結合する タンパク質を発現していることが予想される細胞より、 VP16または GAL4転写活 性化領域と融合する形で発現するような cDNAライブラリーを作製し、これを上記 酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来 cDNAを単離す る （酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、 両者 の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認できる） 。 単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、 該 cDNAがコードする タンパク質を得ることができる。 これにより本発明のタンパク質に結合するタン パク質またはその遺伝子を調製することが可能である。 2-ハイプリッドシステム において用いられるレポーター遺伝子としては、 例えば、 HI S3遺伝子の他、 Ade2 遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、 ルシフヱラーゼ遺伝子、 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel)遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。 2ハイブリッド法によるスクリーニングは、 酵母の他、 哺乳動物細胞などを使つ て行うこともできる。
本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、 ァフィ二テイク口 マトグラフィ一を用いて行うこともできる。 例えば、 本発明のタンパク質をァフ ィニティ一カラムの担体に固定し、 ここに本発明のタンパク質と結合するタンパ ク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。 この場合の被検試料 としては、 例えば細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用した 後、 カラムを洗浄し、 本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製すること ができる。
得られたタンパク質は、 そのアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNAを 合成し、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリ一をスクリーニングすることに より、 該タンパク質をコードする DNAを得ることができる。
本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイォセンサーを使用することもできる。 表面ブラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサ一は、 本発明のタンパク質と被検化合物との間 の相互作用を微量の夕ンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン 共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えば BIAcore Pharmacia製）。 したがって、 B IAcore等のバイオセンサ一を用いることにより本 発明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、 タンパク質に限らず、 本発明のタンパク質に結合する化合物 （ァゴニス トおよびアン夕ゴニストを含む） を単離する方法としては、 例えば、 固定した本 発明のタンパク質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージぺ プチドディスプレイライブラリ一を作用させ、 本発明のタンパク質に結合する分 子をスクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミストリー技術によるハイ スループットを用いたスクリ一ニング方法（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R;
Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK;
Dower WJ Small peptides as potent mimetics of the protein hormone ery thropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64 Verdine G L. , The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996 384 pll - 13 Hogan JC Jr. , Directed combinatorial chemistry. Nature ( ENGLA ND) Nov 7 1996, 384 pl7-9) が当業者に公知である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、 本発明のタンパク質の活 性を調節するための薬剤の候補となり、 本発明のタンパク質の発現異常や機能異 常などに起因する疾患や本発明のタンパク質の活性を制御することにより治療可 能な疾患の治療への応用が考えられる。 本発明のスクリーニング方法を用いて単 離しうる化合物の構造の一部を、 付加、 欠失および/または置換により変換され る物質も、 本発明の夕ンパク質に結合する化合物に含まれる。
本発明のタンパク質、 または本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物 をヒトゃ動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒヅジ、 プ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用 する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。 例えば、 必 要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤 として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌 性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上 許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化 剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 ぺヒクル、 防腐剤、 結合剤 などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態 で混和することによって製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効 成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはェ夕ノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコ一ル、 ポリエチレングリコール、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM)、 HC0-50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ペンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。 患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクタ一に組込 み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。 本発明の夕ンパク質の投与量は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、 投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人 (体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 100 igから 20m であると考えられる。
本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を調節する 化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体 重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1.0か ら 50mg、 より好ましくは約 1.0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 通常、 1 日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 よ り好ましくは約 0. 1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると 考えられる。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面 積あたりに換算した量を投与することができる。 発明を実施するための最良の形態
次に、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明は下記実施例 に限定されるものではない。
[実施例 1 ] オリゴキヤヅプ法による cDNAラィブラリ一の作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により神経細 胞に分化可能な NT- 2神経前駆細胞 （Stratagene社より購入） を、 添付のマニュ アルにしたがって NT- 2細胞を培養後、 レチノイン酸を添加して誘導後、 2週間培 養したものを用いた。
次に培養細胞をそれぞれ集めて、 文献 （J. Sambrook, E. F . Fritsch & Τ· Ma niatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press 1989) 記載の方法により mRNAを抽出した。 さらに、 オリゴ dTセルロース で poly(A)+ RNAを精製した。
同様に、 ヒ ト卵巣癌組織（0VARC1) より、 文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Labo ratory Press, 1989) 記載の方法により mRNAを抽出した。 さらに、 オリゴ dTセ ルロースで poly(A)+ RNAを精製した。
それぞれの poly(A)+ RNAよりオリゴキヤプ法 [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 ( 1994)]により cDNAライブラリーを作成した。 Ol igo- cap 1 inker (agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg/酉 3歹 (J番号： 5 )ヽ および Oligo dT p rimer (gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt/酉己列番号： 6 ) を用 いて文献 [鈴木 ·菅野， 蛋白質 核酸 酵素， 41 : 197-201 ( 1996 )、 Y. Suzuki e t al .， Gene, 200 : 149-156 ( 1997) ]に書いてあるように BAP (Bacterial Alkali ne Phosphatase) 処理、 TAP (Tobacco Acid Phosphatase) 処理、 RNAライゲーシ ヨン、 第一鎖 cDNAの合成と RNAの除去を行った。 次いで、 5' (agcatcgagt cggc cttgtt g/配列番号： 7 ) と 3' (gcggctgaag acggcctatg t/配列番号： 8 ) の P CRプライマ一を用い PCR (polymerase chain reaction)により 2本鎖 cDNAに変換 し、 Sfi lで切断した。 次いで、 Drai nで切断したベクタ一 pUC19FL3、 または pME 18SFL3 (GenBank AB009864, Expression vector) (NT2RP3, 0VARC1)に cDNAの方 向性を決めてクローニングし、 cDNAライブラリ一を作成した。 これらより得たク ローンのプラスミ ド DNAについて、 cDNAの 5'端または 3'端の塩基配列を DNAシ ーケンシング試薬 (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit、 または BigD ye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems 社 製） を用い、 マニュアルに従ってシーケンシング反応後、 DNAシーケンサー （ABI
PRISM 377, PE Biosystems社製） で DNA塩基配列を解析した。 得られたデータ をデータベース化した。 ·
NT2RP3のォリゴキヤヅプ高全長率 cDNAラィブラリ一は、 真核細胞での発現が 可能な発現べクタ一 PME18SFL3を用いて作製した。 pME18SFL3にはクロ一ニング部 位の上流に SRひプロモー夕一と SV40 smal l tイントロンが組み込まれており、 またその下流には SV40 ポリ A付加シグナル配列が挿入されている。 pME18SFL3 のクローン化部位は非対称性の Dral l lサイ 卜となっており、 cDNA断片の末端に はこれと相補的な Sfil部位を付加しているので、 クローン化した cDNA断片は SR ひプロモ一夕一の下流に一方向性に揷入される。 したがって、全長 cDNAを含むク ローンでは、 得られたプラスミ ドをそのまま COS細胞に導入することにより、 一 過的に遺伝子を発現させることが可能である。 すなわち、 非常に容易に、 遺伝子 産物である蛋白質として、 あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析す ることが可能である。
[実施例 2 ] オリゴキヤヅプ法で作製した cDNA ライブラリ一からのクローン の 5' -末端の全長性の評価
ォリゴキヤップ法で作製したヒト cDNAラィブラリ一の各クローンの 5， -末端の 全長率を次の方法で求めた。公共データベース中のヒト既知 mRNAと 5' -末端配列 がー致する全クローンについて、公共デ一夕ベース中の既知 mRNA配列より長く 5 ，-末端が伸びている場合、 または 5，-末端は短いが翻訳開始コドンは有している 場合を 「全長」 と判断し、 翻訳開始コドンを含んでいない場合を 「非全長」 と判 断した。各ライブラリーでの cDNAクローンの 5' -末端の全長率 [全長クローン数 / (全長クローン数十非全長クローン数） ] をヒト既知 mRNAと比較することによ りだした。 この結果、 5' -末端の全長率は、 63.5%であった。 この結果より、 オリ ゴキヤップ法で取得したヒト cDNAクローンの 5' -端配列の全長率が非常に髙いこ とが分かった。
[実施例 3 ] ATGprと ESTiMateFLでの cDNAの 5' -末端の全長率の評価
ATGpr は、 ATG コドンの周辺の配列の特徴から翻訳開始コドンであるかどうか を予測するためにへリックス研究所の A. A. Salamov, T. Nishika a, M. B. Sw indel ls により開発されたプログラムである（A. A. Salamov, T. Nishikawa, M. B. Swindells, Bioinformatics, 14: 384-390 ( 1998) ; http://www. hri . co. jp/ atgpr/)0 結果は、 その ATGが真の開始コドンである期待値 （以下 ATGprl と記載 することもある） で表した （0.05-0.94)。 尚、 このプログラムの cDNAの 5，-末端 であるかどうかを考慮しない場合の解析結果の感度と特異性はともに 66%と評価 している。 一方、 このプログラムを全長率 65%のオリゴキャップ法で作製したラ ィブラリーからの cDNAクローンの 5' -末端配列に適用して ATGprl値を 0.6以上 でクローンを選択した場合、 全長クローン （0RFの N-末端までもつクローン） 評 価の感度と特異性はともに 82〜83%まで上昇した。 NT2RP3001938および 0VARC100 0945の 5'末端配列の最大 ATGprl値は、 それぞれ 0.32、 0.74であった。
次に、 ESTiMateFLによるクローンの評価を行った。 ESTiMateFLは、 公共データ ペース中の ESTの 5' -末端配列や 3' -末端配列との比較による全長 cDNAの可能性 の高いクローンを選択するヘリックス研究所の西川 ·太田らにより開発された方 法である。
この方法は、 ある cDNAクローンの 5' -末端や 3' -末端配列よりも、 長く伸びた EST が存在する場合には、 そのクローンは 「全長ではない可能性が高い」 と判断 する方法で、 大量処理可能なようにシステム化されている。 公共デ一夕ベース中 の EST配列より長く 5' -末端が伸びている場合、あるいは 5' -末端が短いクローン でも、その差が 50塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全 長とした。 既知の mRNAとヒットしたクローンの 5' -末端配列の場合、 ESTで全長 と評価した配列のうちの約 80%が既知の mRNAに対する 5' -末端配列の評価でも全 長となっており、 ESTで 5' -末端配列が非全長と評価した配列のうち約 80%が既知 の mRNAに対する評価でも 5' -末端配列が非全長となっていた。 ESTとの比較によ る完全長らしさの評価では、 比較対照とする ESTの数が多ければ予測精度は高ま るが、 対象 ESTが少ない場合には予測結果の信頼性が低くなる欠点はある。 この 方法は、 5， -末端配列での全長率が約 60%のォリゴキヤップ法による cDNAクロー ンから全長ではない可能性の高いクローンを排除するのに使えば有効である。 ま た、 ESTiMateFLは、 公共データベースへの EST登録が適当数あるヒト未知 mRNA の cDNAの 3' -末端配列の全長性を評価するには、 特に有効な方法である。
上記の全長性の評価の結果、 「C-0VARC1000945」は、 完全長である確率が高いう えに、少なくとも 5，末端配列あるいは 3'末端配列のいずれか、あるいは両方でヒ ト EST配列と同一でなレ、新規なクローンであった。
また、 「C- NT2RP3001938」は、 全長であり、 5，末端配列において同一であるヒト EST配列数が 2 0以下 （少なくとも 5'末端配列あるいは 3'末端配列のいずれか、 あるいは両方でヒト EST配列と同一でないクローン、 5'末端配列、 3'末端配列の 両方で同一であるヒト EST配列数が 1以上 5以下のクローンを除く） と依然とし て新規なクローンである。
[実施例 4 ] キナーゼ ·フォスファターゼ様の配列を有するクローンの選択 ヘリヅクスクローンの中からキナーゼ · フォスファタ一ゼ様の配列を有するク ローンの選択を行った。以下に示す 31個の既知のキナーゼ 'フォスファターゼの アミノ酸配列 （リン脂質リン酸化酵素も含む） をクエリーとし、 NCBI TBLASTN2.
0により全ヘリックスクローンに対するホモロジ一検索を試みた。期待値（Expec t) が 1.0e-05以下を示すクローンのみを選択した。
ホモロジ一検索に使用したクエリ一配列、 その配列番号、 および GenBankァク セス番号は次の通りである < クエリー配列名 配列番号 GenBankアクセス番号 hLKBl 9 gi 13024670 hVRKl 1 0 gi 14507903 hCDC2 1 1 gi 14502709
MuroraKl 1 2 gb |AAC12708.1 hAuroraK2 1 3 gi 14759178 hIKKA 1 4 gb |AAC51662.1 腹 K3 1 5 gb |MB橘 53.1 hERKl 1 6 pir |A48082 .
hRAFl 1 7 gi 14506401 hAKT 1 8 gi 14885061 hPIKP85 1 9 sp |P27986
hATM 2 0 gi 14502267 hc-src 2 1 gi 14758078 hJAKl 2 2 ref |NP_002218.1 hFLTl 2 3 gb|AAC16449.1 hPP2A 2 4 gi 14506017 hMKP2 2 5 gb|AAC50452.1 hVHR 2 6 gi 14758208 hPTP-SL 2 7 gi 14506325 hSTEP 2 8 sp | P54829
hPTEN 2 9 gi 14506249
CdcHBl 3 0 gb |AAD15415.1
DUSP12 3 1 gi 16005956 AK000449 3 2 gi 18923413
DUS7 3 3 sp | Q16829
calcineurin A alpha 3 4 gi 16715568
PNP1 3 5 emb | CAA56124.1
TPTE 3 6 gi 17019559
PPP1CC 3 7 gi 14506007
PP-1 gamma 3 8 gb lAAAl 9823.1
PP2A 3 9 gi 14506017 相同性検索の結果を表 1に示す
(表 1
Figure imgf000047_0001
その結果、 重複しない 「C-NT2RP3001938」 および 「C- 0VARC1000945」 の 2クロ ーンを、 キナーゼ 'フォスファタ一ゼ様構造を持つクローン （K Pクローン） と して選択した。 該クローンはヒト新規タンパク質をコードしており、 該夕ンパク 質は、 プロティンキナーゼおよび/またはプロテインフォスファターゼとして機 能していることが推察された。
[実施例 5 ] 高密度 DNAフィル夕一を用いた、 ハイブリダィゼ一シヨンによる 遺伝子発現解析 ナイロン膜スポット用の DNAは以下のように調製した。 すなわち、 大腸菌を 96 穴プレートの各ゥヱルに培養し（ LB培地で 37°C、 16時間）、その培養液の一部を、 96穴プレートの 10 1ずつ分注した滅菌水中に懸濁し、 100°Cで 10分間処理した 後、 PCR反応のサンプルとして使用した。 PCRは TaKaRa PCR Ampl ification Kit
(宝社製） を用い、 プロトコールに従って 1反応 20 1の反応溶液で行った。 プ ラスミ ドのィンサート cDNAを増幅するために、プライマ一はシークェンシング用 のプライマー ME761FW (5，tacggaagtgttacttctgc3，/配列番号： 4 0 )と ME1250RV
(5，tgtgggaggttttttctcta3，/配列番号： 4 1 )のペア一、 または M13M4 (5，gttt tcccagtcacgac3， /配列番号： 4 2 )と M13RV (5， caggaaacagctatgac3， /配列番 号： 4 3 )のペア一を使用した。 PCR反応は、 GeneAmp System9600 (PEバイオシス テムズ社製） で、 95°C 5分間処理後、 95°C10秒、 68°C1分間で 10サイクルし、 さ らに 98°C20秒間、 60°C3分間で 20サイクル行い、 72°C10分間で行った。 PCR反 応後、 2 / 1の反応液を 1%ァガロースゲル電気泳動して、 臭化工チジゥムで DNA を染色し、 増幅した cDNAを確認した。 増幅できなかったものは、 その cDNAイン サートをもつプラスミ ドを、 アルカリ抽出法 （J Sambrook, EF Fritsh, T Mania tis, Molecular Cloning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring H arbor Laboratory Press, 1989) で調製した。
DNAアレイの作製は以下のように行った。 384穴プレートの各ゥエルに DNAを分 注した。 ナイロン膜 （ベーリンガー社製） への DNAのスポッティングは、 Biomek 2000ラボラトリ一オートメ一シヨンシステム （ベックマンコール夕一社製） の 3 84ピンツールを用いて行った。 すなわち、 DNAの入った 384穴プレートをセット した。 その DNA溶液に、 ピンツールの 384個の独立した針を同時に浸潰し、 DNA を針にまぶした。 その針を静かにナイロン膜に押し当てることによって、 針に付 着した DNAをナイロン膜にスポヅティングした。スポヅ トした DNAの変性および、 ナイロン膜への固定は定法 （J Sambrook, EF Fritsh, T Maniatis, Molecular C loning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に従って行った。
ハイプリダイゼーシヨンのプローブとしては、 ラジオアイソトープでラベリン グした 1st strand cMAを使用した。 1st strand cDNAの合成は Thermoscript(TM)
RT-PCR System (G IBC0社製） を用いて行った。 すなわち、 ヒ卜の各組織由来 mR NA (Clontech社製） の 1. 5 jug と、 1 〃1 50 μΆ Ol igo ( dT )20 を用いて、 50 〃Ci [ a 3P] dATPを添加して付属のプロトコールに従って 1st strand cDNAを合 成した。 プローブの精製は、 ProbeQuant(TM) G-50 micro column (アマシャムファ ルマシアバイオテック社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。次に、 2 units E. col i RNase Hを添加して、 室温で 10分間インキュベートし、 さらに 100 〃gヒト COT- 1 DNA (GIBC0社製） を添加して、 97°Cで 10分間インキュベー ト後、 氷上に静置してハイブリダィゼーシヨン用のプローブとした。
ラジオアイソトープラベルしたプローブの、 DNA アレイへのハイブリダィゼー シヨンは、 定法 (J Sambrook, EF Fritsh, T Maniatis, Molecular C loning, A laboratory manual / 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19 89) に従って行った。 洗浄は、 ナイロン膜を洗浄液 1 (2X SSC, 1% SDS) 中で、 室温 （約 26°C ) で 20分間のインキュベートを 3回洗浄した後、 洗浄液 2 (0. 1X SSC， 1% SDS)中で、 65°Cで 20分間の洗浄を 3回行った。ォー卜ラジォグラムは、 BAS2000 (富士写真フィルム社製）のイメージプレートを用いて取得した。 すなわ ち、 ハイブリダィゼーシヨンしたナイロン膜をサランラップに包み、 イメージプ レー卜の感光面に密着させて、 ラジオアイソトープ感光用のカセッ卜に入れて、 暗所で 4時間静置した。イメージプレートに記録したラジオァイソトープ活性は、 BAS2000 を用いて解析し、 オートラジオグラムの画像ファイルとして電子的に変 換して記録した。 各 DNAスポットのシグナル強度の解析は、 Visage High Densit y Grid Analysis Systems (ジエノミヅクソリユーソンズ社製） を用いて行い、 シ グナル強度を数値データ化した。 データは Dupl icateで取得し、 その再現性は 2 つの DNAフィルターを 1つのプローブでハイブリダイゼーシヨンして、 両フィル 夕一で対応するスポッ 卜のシグナル強度を比較した。 全スポッ 卜の 95%が、 相当 するスポッ トに対して 2倍以内のシグナル値であり、 相関係数は r=0. 97である。 デー夕の再現性は十分といえる。
遺伝子発現解析の検出感度は、 ナイロン膜にスポットした DNAに相補的なプロ —ブを作製し、 ハイブリダィゼーシヨンにおける、 プローブ濃度依存的なスポッ 卜のシグナル強度の増加を検討して見積もった。 DNAとしては、 PLACE1008092 (G enBank Access ion No. AF107253と同一） を使用した。 前述の方法で PLACE100809 2の DMアレイを作製した。 プローブとしては、 PLACE 1008092の mRNAを in vitr o合成し、 この RNAを錶型として、 前述のプローブ作製法と同様にして、 ラジオ アイソトープでラベリングした 1st strand cDNAを合成して使用した。 PLACE100 8092の mRNAを in vitro合成するために、 pB luescript SK ( - )の T7プロモーター 側に PLACE1008092の 5'末端が結合されるように組み替えたプラスミ ドを造成し た。 すなわち、 pME18SFL3の制限酵素 Dral l l認識部位に組み込まれた PLACE1008 092を、 制限酵素 Xholで切断して PLACE 1008092を切り出した。次に Xholで切断 してある pBluescript SK ( - )と、 切り出した PLACE1008092を DNA l igation kit ver.2 (宝社製） を用いてライゲ一シヨンした。 pBluescript SK ( - )に組み替えた PLACE 1008092の mRNAの in vitro合成は、 Ampl iscribe(TM) T7 high yie ld trans cription kit (Epicentre technologies社製） を用いて行った。 ハイブリダイセ' —シヨンおよび各 DNAスポッ卜のシグナル値の解析は、 前述の方法と同様に行つ た。 プローブ濃度が lxl07 zg/ml以下では、 プローブ濃度に比例したシグナル増 加が無いことから、 この濃度域でのシグナルの比較は困難と考えられ、 シグナル 強度が 40以下のスポットは一様に低レベルのシグナルとした。 lxl07〜0. 1 jug/ mlの範囲でプローブ濃度依存的なシグナル値の増加があり、検出感度としてはサ ンプルあたり発現量比が 1： 100, 000の mRNAの検出感度である。
ヒト正常組織 （心臓、 肺、 下垂体、 胸腺、 脳、 腎臓、 肝臓、 脾臓） における、 各 cDNAの発現を表 2に示す。 発現量は 0〜10， 000の数値で示した。 「C- NT2RP300 1938」 および 「C-0VARC1000945」 は、 それぞれ少なくとも 1つの組織で発現が認 められた。
(表 2 )
Figure imgf000051_0001
[実施例 6 ] 疾患関連遺伝子の解析
非酵素的蛋白糖化反応は各種糖尿病慢性合併症の原因とされている。 したがつ て糖化蛋白質特異的に発現の上昇または減少する遺伝子は、 糖化蛋白質による糖 尿病合併症に関する遺伝子である。 血液中に存在する糖化蛋白によって影響を受 けるのは、 血管壁の細胞である。 非酵素的タンパク質糖化反応物には、 軽度の糖 化タンパク質であるアマドリ化合物 （glycated protein) と、 重度の糖化タンパ ク質である終末糖化物質（advanced glycosylation endproduct)がある。 そこで 内皮細胞において、本発明の KP遺伝子の発現がこれらタンパク質特異的に、変化 するか否かを検討した。
内皮細胞を糖化蛋白質存在下または非存在下で培養して mRNAを抽出し、ラジオ アイソトープでラベルした 1st strand cDNAプローブを用いて、 前記の DNAァレ ィとハイブリダィゼーシヨンして、 各スポヅ卜のシグナルを BAS2000で検出して ArrayGauge (富士写真フィルム社製） で解析した。
終末糖化物質ゥシ血清アルブミンの調製は、 ゥシ血清アルブミン （sigma社製） を 50mM Glucoseのリン酸バッファ一中で 37°C、8週間ィンキュベ一トして褐色化 した BSAを、 リン酸バッファーに対して透析して行った。
正常ヒト肺動脈内皮細胞 （Cel l Applications 社製） は、 組織培養用のディッ シュ (Falcon社製) を用いて、 endothel ial cel l growth medium (Cell Applica tions社製） 中で、 ィンキュベ一夕一（37°C、 5% C02、 加湿） に入れ、 培養した。 細胞がディッシュにコンフルェントになったところで、 ゥシ血清アルブミン （si gma社製)、 糖化ゥシ血清アルブミン （sigma社製） または終末糖化物質血清アル ブミンを 250 ^g/ml添加して 33時間ィンキュベートした。細胞からの mRNAの抽 出は、 FastTrack(TM)2.0 kit ( Invitrogen社製） を用いて行った。 ハイブリダィゼ ーシヨン用のプローブのラベリングは、 この mRNAを用いて、前記の方法で同様に して行った。
ゥシ血清アルブミン、 糖化ゥシ血清アルブミンまたは終末糖化物質ゥシ血清ァ ルブミンを含有する培地で培養したヒト肺動脈内皮細胞の、各 cDNAの発現を表 3 に示す。 「C- NT2RP3001938 I は、 内皮細胞で発現が認められた。
(表 3 ) 糖化ゥシアルブミン 糖化ゥシアルプミン 終末糖化物質 クローン名 ゥシ血 アルブミン 終末糖化物質ゥシ 添加/ゥシ血清 ゥシ血清アルブミン 血清アルブミン アルブミン比 /ゥシ血清アルブミン比
GAP皿 (Crl ) 100.81 134.21 115. 16 1.33 1. 14 ? actin(Cr2) 1101.9 1092.57 997.36 0.99 0.91
NT2RP3001938 44.42 42.62 38. 19 0. 96 0.9
[実施例 7 ] 紫外線傷害関連遺伝子の解析
紫外線は健康に少なからず影響を及ぼすことが知られている。 近年はォゾン層 破壊に伴つて紫外線傷害にさらされる機会が多くなつており、 皮膚癌などの危険 因子として認識されてきている （United States Environmental Protection Age ncy: Ozone Depletion Home Page、 http： //www. epa. gov/ozone/)0 紫外線が皮膚 表皮細胞に作用して発現変化する遺伝子は、 皮膚の紫外線傷害に関すると考えら れる。紫外線照射した初代培養皮膚由来線維芽細胞を培養して、本発明の KP遺伝 子の発現が変化するか否かを検討した。
初代培養皮膚由来線維芽細胞 （Cell Appl ications 社製） は、 培養皿にコンフ ルェン卜に培養して、 254 nmの紫外線を 10， 000 J/cm2照射した。細胞からの m RNA の抽出は、 未照射の細胞、 照射後 4時間または 2 4時間培養した細胞を対象 に、 FastTrack™ 2.0 mRNA isolation kit ( Invitrogen社製） を用いて行った。 ハイブリダィゼーシヨン用のプローブのラベリングは、この mRNA 1.5 gを用い て、 前記の方法で同様にして行った。 データは n = 3で取得し、 紫外線刺激あり の細胞のシグナル値と、 なしの細胞のシグナル値を比較した。 比較には二標本 t 検定の統計処理を行って、 シグナル値の分布に有意に差があるクローンを、 P < 0.05で選択した。 本解析は、 シグナル値の低いクローンであっても差を統計的に 検出できる。したがって 40以下のシグナル値のクローンに対しても評価を行った。 紫外線未照射の皮膚由来線維芽細胞、 および紫外線照射した皮膚由来線維芽細 胞の、 各 cDNAの発現を表 4に示す。
それぞれ細胞の各遺伝子についてシグナル値の平均 （M13 2) と標本分散 （s!2， s2 2) を求め、 比較する 2つの細胞の標本分散から合成標本分散 s2を求めた。 t = (M, - M2)/s/( l/3+l/3)1/2を求めた。 自由度 4として t分布表の有意水準の確率 Pである 0.05と 0.01の t値と比較して、 値が大きい場合にそれぞれ Pく 0.05、 ま たは Pく 0.01で両細胞の遺伝子の発現に差があると判定した。未分化の細胞に比べ てシグナルの平均値が、 増加 （+) または減少を （-) 記した。
その結果、 「C- OVARC1000945」は、 紫外線照射によって、 4時間後または 2 4時 間後に発現の減少することが分かり、 紫外線障害に関するクローンであることが 示唆された。
(表 4 )
Figure imgf000053_0001
産業上の利用の可倉 生
本発明により、 新規なヒトプロティンキナーゼ ·プロティンフォスファターゼ タンパク質、 および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。 キナーゼ - フォスファターゼによるタンパク質のリン酸化状態の調節は、 細胞の正常な分 化 '増殖、 および細胞レベルでの生理機能にとって中心的な役割を担っている。 本発明の新規キナーゼ · フォスファターゼも細胞内生理機能に深く関わっている ものと考えられることから、 本窕明のタンパク質は、 医薬品開発の上で薬剤の標 的分子として有用である。 また、 本発明のタンパク質に作用する薬剤は、 従来の レセプ夕一ァゴニスト ·アン夕ゴニストに代表される薬剤よりも、 より緻密に細 胞内生理機能を調節し得る有効な医薬品となることが期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード する DNAo
( b ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有し、 配列 番号： 2または 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質をコ一ドする DNA。
( d ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱント な条件下でハイブリダイズし、 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列から なるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA。
2 . 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分べ プチドをコ一ドする DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質またはぺプ チド。
4 . 請求項 1または 2に記載の DNAが挿入されたベクター。
5 . 請求項 1または 2に記載の DNAまたは請求項 4に記載のベクターを保持す る宿主細胞。
6 . 請求項 5に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 3に記載の夕ンパク質また はべプチドの製造方法。
7 . 請求項 3に記載の夕ンパク質に結合する抗体。
8 . 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に 相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
9. 請求項 3に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であ つて、
(a) 該タンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触させる工程、
( b ) 該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する 工程、
(c) 該タンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選 択する工程、 を含む方法。
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