WO2001007913A1

WO2001007913A1 - Procede d'analyse et d'essai d'un polluant

Info

Publication number: WO2001007913A1
Application number: PCT/JP2000/004957
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Goda; Ayako Kobayashi; Katsuji Fukuda
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2001-02-01
Also published as: EP1207393A4; JP2001041958A; EP1207393A1; CA2379127A1

Description

明細書環境汚染物質の免疫学的測定分析法技術分野

本発明は、環境汚染物質またはその分解物の免疫学的測定方法、分析方法およびそれらに用いるためのキットに関する。背景技術

近年、環境汚染物質である合成洗剤用界面活性剤化合物や内分泌攪乱物質による環境汚染が問題となっている。そこで、環境中の環境汚染物質やその分解物を測定、分析して、その結果を環境保全に役立たせることが必要となる。

このような環境汚染物質や、その分解物を測定、分析する方法としては、従来から種々の方法が知られている。例えば、上水、河川水、湖沼水または下水中の環境汚染物質および分解物を定量測定するための高速液体ク口マトグラフィー

(HPLC) 、ガスクロマトグラフィー（GC) 、ガスクロマトグラフィ一一高分解能マススぺクトロメトリー（GC— HRMS) 、高速液体クロマトダラフィ一一高分解能マススぺタトロメトリー（HPLC— HRMS) などがある。しかしながら、これらは極微量しか存在しなレ、環境汚染物質を定量するのには必要な感度が得られないこと、また定量する為には溶媒による抽出等による高倍率の濃縮が必要であること、さらに非常に高価な機器であり操作に習熟を要することなどが問題となっている。これらの問題力ら、環境汚染物質について、従来より高感度で、迅速かつ簡単で、特異的で、低コストの高感度測定法が望まれている。

上記の問題を解決する手段として酵素免疫測定法（以下、 EL I S A法と略記することがある）が挙げられる。

EL I SA法による、様々な他の環境汚染物質に対する定量系ゃキットが構築されており、例えば、 W094 12536号には、環境における石油燃料の検出用の EL I SA法や、そのキットが開示されている。酵素と抗体で構成されるこれらの分析キットは非常に迅速に、通常、数時間で測定が完了する。また、操作は、従来の HPLC、 GC、 GC— HRMSや HP LC— HRMSなどよりも非常に簡便である。さらに、抗体、特に、モノクローナル抗体を使用することにより、非常に特異的な定量が可能になる。また、 HPLC、 GC、 GC-HRM Sや HP LC— HRMSなどは非常に高価な機器であり、そのメンテナンスにかかる費用もかなりなものであるが、 EL I S A法にはそのような問題がない。それにもかかわらず、環境汚染物質や、その分解物の検出、測定に使用できる免疫学的分析法、特に、 EL I S A法は未だ確立されていない。発明の目的

本発明の 1つの目的は、環境汚染物質や、その分解物を高感度に検出 ·測定できる免疫学的分析法を提供することにある。

本発明の他の目的は、本発明の方法に使用するキットを提供することにある。本発明のこれらの目的および他の目的ならびに効果を、添付の図面を参照して、以下に説明する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1で得られた、抗マウス I g G抗体 +抗エストロゲン抗体を固相化した担体を用いた場合のエストラジオールの標準曲線である。

図 2は、実施例 1で得られた、抗エスト口ゲン抗体を固相化した担体を用いた場合のエストラジオールの標準曲線である。

図 3は、実施例 2で得られた、抗マウス I g A抗体 +抗 PRC抗体を固相化した担体を用いた場合の B P Aの標準曲線である。

図 4は、実施例 2で得られた、抗 PRC抗体を固相化した担体を用いた場合の BP Aの標準曲線である。発明の概要

本発明者らは、環境汚染物質や、それらの分解物の免疫学的分析法、特に EL I S A法による検出、測定法を確立すべく、鋭意研究を重ねた。その結果、担体に担持された抗ィムノグロブリン抗体（抗 I g抗体）に環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体を構成成分の一つとしてなるキットを用いることにより、高感度に環境汚染物質もしくはその分解物を測定できることを見出した。力かる知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 担体に担持された抗ィムノグロプリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体を構成成分の一つとしてなることを特徴とする環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析用キット、

(2) 環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性剤化合物または内分泌攪乱物質である上記（1) 記載のキット、

(3) 合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオン界面活性剤化合物および非ィオン界面活性剤化合物からなる群から選択される化合物である上記（2) 記載のキット、

(4) 合成洗剤用界面活性剤化合物が、 C₂_₁₈アルキル硫酸、 C_{2 18}アルキノレベンゼンスノレホン酸、 C。_₁₈7ノレキノレナフタレンスノレホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン C₉_，。アルキルフ工ニルエーテル、ポリオキシエチレン c₂_₁₈アルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフエ二ルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フエニルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される化合物である上記（2) 記載のキット、

(5) 内分泌攪乱物質が、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類またはクロロフエノール類である上記（ 2 ) 記載のキット、

(6) 内分泌攪乱物質が、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、ェストリオール、アンドローゲン、テストステロン、デヒドロェピアンドロステロン、アンドロステンジオン、チロキシン、トリョードチロニン、 d_₂。アルキルフエノールエトキシレート類、 C アルキルフエノール類、ビスフエノール、 4, 4，ーェチリデンビスフエノール、ビス（p—ヒドロキシフエ-ノレ）メタン、 2, 2 ' —ビス（4—ヒドロキシフエ二ノレ）一1一プロパノーノレ、 2, 2 ' —ビス（m—メチルー p—ヒドロキシフエ二ノレ）プロパン、 4， 4，一ビス (p—ヒドロキシフエニル）ペンタン酸、 4, 4，ージアミノジフエニルメタン、 4， 4，ージヒドロキシジフエニルエーテル、 4, 4，一ジヒドロキシジフエ二ルスルフォン、 4, 4 ' —ジクロロジフエニルスルフォン、ビス [4— (2—ヒドロキシエトキシ）一 3, 5—ジブロモフエニル] スルフォン、ビス [4— (2 ーヒドロキシエトキシ）フエ二 Λ^] スノレフォン、 4, 4 ' —ジヒドロキシデフエニノレエーテノレ、 ρ , ρ ' ージヒドロキシベンゾフエノン、 4ーヒドロキシビフエニール、フタノレ酸ブチルベンジル、フタノレ酸ジブチル、フタル酸ジシクロへキシノレ、フタル酸ジェチル、フタル酸ジ（2—ェチルへキシル）、アジピン酸ジェチルへキシル、フタル酸ジへキシル、フタノレ酸ジ一 η—ペンチル、フタル酸ジプロピルならびにモノ一、ジー、トリ一、テトラ一およびペンタクロロフ工ノールからなる群から選択される物質である上記 (2) 記載のキット、

(7) 抗ィムノグロブリン抗体が抗 I gG抗体またはそれを含有する抗体混合物である上記（1) 記載のキット、

(8) (a) 検体と、（b) 担体に担持された抗ィムノグロブリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体と、（c) 標識剤で標識した環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかつた標識剤の活性を測定することを特徴とする検体内の該環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析方法、

(9) 環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性剤化合物または内分泌攪乱物質である上記 (8) 記載の方法、

(10) 合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオン界面活性剤化合物および非イオン界面活性剤化合物からなる群から選択される化合物である上記 (9) 記載の方法、

(1 1) 合成洗剤用界面活性剤化合物が、 C₂_₁₈アルキル硫酸、 C₂_₁₈アルキルベンゼンスルホン酸、 C₂— ₁₈アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン C₂_₁₈アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン ₈アルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフエニルエーテル、ポリォキシエチレンスチレンィ匕フエ二ルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される化合物である上記 (9) 記載の方法、

(12) 内分泌攪乱物質が、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類またはクロ口フエノール類である上記（9) 記載の方法、

(1 3) 内分泌攪乱物質が、エストロゲン、ェストラジオ一ル、エストロン、エストリオ一ル、アンドローゲン、テストステロン、デヒドロェピアンドロステロン、アンドロステンジオン、チロキシン、トリョードチロニン、じ ^ァノレキルフエノールエトキシレート類、 C ₂₀アルキルフエノール類、ビスフエノール A、 4, 4 ' —ェチリデンビスフエノール、ビス（p—ヒドロキシフエ二ノレ）メタン、 2, 2，一ビス（4ーヒドロキシフエニル）一1—プロパノール、 2， 2，一ビス（m—メチル一p—ヒドロキシフエニル）プロパン、 4, 4 ' - ビス（p—ヒドロキシフエニル）ペンタン酸、 4， 4 ' —ジアミノジフエニルメタン、 4, 4 ' ージヒドロキシジフエニルエーテル、 4， 4 ' ージヒドロキシジフエニノレスノレフォン、 4, 4 ' —ジクロロジフエニノレスノレフォン、ビス [4— (2—ヒドロキシエトキシ）一3, 5—ジブロモフエニル] スルフォン、ビス [4- (2—ヒドロキシエトキシ）フエニル] スルフォン、 4， 4，一ジヒドロキシデフエニノレエーテノレ、 p , p ' —ジヒドロキシベンゾフエノン、 4ーヒドロキシビフエニール、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジシクロへキシル、フタル酸ジェチル、フタル酸ジ（2—ェチルへキシル）、アジピン酸ジェチルへキシル、フタル酸ジへキシル、フタル酸ジ一n—ペンチル、フタル酸ジプロピルならびにモノー、ジー、トリ一、テトラ一およびペンタクロロフエノールからなる群から選択される物質である上記（9) 記載の方法、

(14) 抗ィムノグロブリン抗体が抗 I gG抗体またはそれを含有する抗体混合物である上記 (8) 記載の方法、

(15) 担体に担持された抗ィムノグロブリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体の、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析における使用。

( 1 6 ) 抗ィムノグロブリン抗体が抗 I g G抗体またはそれを含有する抗体混合物である上記（1 5 ) 記載の使用、

を提供する。発明の詳細な説明

本発明の対象とする環境汚染物質には、環境を汚染するいかなる物質も含まれる。

環境汚染物質としては、例えば、合成洗剤用界面活性剤化合物、内分泌攪乱物質などが挙げられる。

合成洗剤用界面活性剤化合物としては、例えば、陰イオン界面活性剤化合物、非ィオン界面活性化合物などが挙げられる。

陰イオン界面活性ィヒ合物としては、例えば、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸（以下、 L A Sと略称することがある。）、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物およびそれらの塩（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩）力らなる群から選択される化合物が挙げられる。

また、非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフエニノレエーテノレ、ポリオキシエチレンァ /レキノレエーテ^^、ポリオキシエーテノレポリスチリノレフエ二/レエーテノレ、ポリ才キシエチレンスチレンィ匕フエニノレエーテルおよびそれらの塩（例、リン酸塩、硫酸塩）からなる群から選択される化合物などが挙げられる。ここにアルキルとしては、炭素数 2〜1 8程度のものが包含される。

上記内分泌攪乱物質としては、例えば、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロ口フエノール類、その他の物質が挙げられる。女性ホルモン類としては、例えば、エストロゲン、エストラジオール（E 2 ) 、エストロン（E 1 ) 、エストリオール（E 3 ) などが、該男性ホルモン類としては、例えば、アンドローゲン、テストステロン、デヒドロェピアンドロステロン、アンドロステンジオンなどが、該甲状腺ホルモン類としては、例えば、チロキシン（T3) 、トリョードチロニン（T4) などがそれぞれ挙げられ、また、これらの生体内代謝物である抱合体（例えば、ダルクロニド、硫酸抱合体など）もこれらに包含される。

該アルキルフエノールエトキシレート類（APE) としては、例えば、式 (1) ：

[式中、 R R²および R³は同一または異なって、各々、 Hまたは炭素数 1〜2 0、好ましくは：！〜 12の直鎖または分枝鎖（含 sec—、 tert—、 iso— ) アルキル、 R⁴は、 (OC₂H₄) _mOHまたは（OC₂H₄) _nCOOH、 mは、酸化工チレン鎖の平均数:！〜 70、好ましくは 1〜15を意味する] で表されるアルキルフエノールエトキシレート類（APE) [例、 NPE (ノユルフェノールェトキシレート、例えば、 NP 2EO (平均酸化エチレン鎖数 =2) 、 NP 5EO (平均酸化エチレン鎖数 =5) 、 NP 10EO (平均酸化エチレン鎖数 = 10) 、 N

P 10 EC (平均酸化エチレン鎖数 = 10、末端 OH—カルボン酸）、 OPE (ォクチルフエノールエトキシレート）など] などが挙げられる。

アルキルフエノール類（AP) としては、例えば、式（2) ：

[式中、 R⁵、 R⁶および R⁷は、同一または異なって、各々、 Hまたは炭素数 1〜

20、好ましくは：！〜 12の直鎖または分枝鎖（含 sec―、 tert—、 iso-) アルキルを意味する] で表されるアルキルフエノール類（AP) 、 [例、 DP (4— ドデシルフェノール）、 EP (4—ェチルフエノール）、 HP (ヘプチルフエノール）、 I PP (4—イソペンチルフエノール）、 2— OP (2—ォクチルフエノール）、 4一 NP (4—ノニルフエノール）、 4— OP (4—ォクチルフエノーノレ）、 - s B P (4—sec—ブチノレフエノーノレ）、 4 - t B P (4_ t —ブチルフエノール）、 4— t PP (4— t—ペンチルフエノール）、 4_ tO P (4— t—ォクチルフエノール）など] などが挙げられる。

樹脂成分類（PRC) としては、例えば、式（3) ：

[式中、 R⁹は、 C、じ0または≤0₂、 R⁸および R^1Qは、同一または異なって、各々、 H、 OH、 NH₂または O (CH₂) ₂OH、 R¹¹および R¹²は、同一または異なって、各々、存在せず、 H、 CH₃、 CH₂OHまたは C₂H₄COOH、 R¹³、 R¹⁴、 R¹⁵および R¹⁶は、同一または異なって、各々、 H、 OH、 CH₃、 C Iまたは B rを意味する] で表される樹脂成分類 (PRC) [例、 BPA (ビスフエノール A) 、 4, 4 ' — EBP (4, 4，一ェチリデンビスフエノール）、 BH

PM (ビス（p—ヒドロキシフエニル）メタン）、 2, 2 ' — BHPP (2， 2 ' 一ビス（4ーヒドロキシフエニル）一1—プロパノール）、 2， 2， -BM HPP (2， 2 ' —ビス（m—メチル一 p—ヒドロキシフエニル）プロパン）、 4, 4' — BHPP (4, 4 ' —ビス（ p—ヒドロキシフエニル）ペンタン酸）、 4, 4 ' -DDM (4, 4 ' —ジアミノジフエニルメタン）、 4， 4，一DDE

(4, 4，一ジヒドロキシジフエニルエーテル）、 4， 4， -DOHD S (4, 4 ' ージヒドロキシジフエニルスルフォン）、 4, 4' —DC I DS (4, 4， —ジクロロジフエニルスルフォン）、 BHEDB r PS (ビス [4一（2—ヒドロキシエトキシ）一 3, 5—ジブロモフエ二ノレ] スノレフォン）、 BHEPS (ビス [4— (2—ヒドロキシエトキシ）フエ二ノレ，スルフォン）、 4, 4， -DD E (4， 4' —ジヒドロキシジフエニルエーテル）、 p、 p ' -DB P (p, p ' —ジヒドロキシベンゾフエノン）、 HBP (4—ヒドロキシビフェニーノレ）など] などが挙げられる。

樹脂可塑剤類（PP) としては、例えば、式（4) ：

[式中、 R¹⁷は、 o—フエ二レンまたはテトラメチレン、 R¹⁸および R¹⁹は、同一または異なって、各々、 H、炭素数 1〜20、好ましくは 1〜12の直鎖または分枝鎖（含 sec—、 tert—、 iso— ) アルキル、ベンジルまたはシクロへキシルを意味する] で表される樹脂可塑剤類 [例、 BBP (フタル酸ブチルベンジル）、 DBP (フタル酸ジブチル）、 DCHP (フタル酸ジシクロへキシル）、 DEP

(フタル酸ジェチル）、 DEHP (フタル酸ジ（2—ェチルへキシル））、 DE HA (アジピン酸ジェチルへキシル）、 DHP (フタル酸ジへキシル）、 DPP

(フタル酸ジ一 n—ペンチル）、 DP r P (フタル酸ジプロピル）など] などが挙げられる。

クロロフエノ一ル類 (CP) としては、例えば、式（5) ：

[式中、 R^2Q、 R²¹、 R²²、 R²³および R²⁴は、同一または異なって、各々、 Hまたは C 1を意味する] で表されるクロロフヱノール類（CP) [例、 2— CP (2 一クロロフエノ一ノレ）、 3— CP (3—クロロフエノ一ル）、 4— C P ( 4—クロロフエノール）、 2, 3— CP (2, 3—ジクロロフエノール）、 2, 4 -C P (2， 4—ジクロロフエノ一ル）、 2, 5— CP (2， 5—ジクロロフエノール）、 2, 6—CP (2, 6—ジクロロフエノール）、 2, 3, 4—CP (2, 3， 4一トリクロロフエノール）、 2, 4, 5— CP (2， 4, 5_トリクロ口フエノール）、 2, 4, 6— CP (2, 4, 6—トリクロロフエノール）、 2， 3, 4, 5—CP (2, 3, 4, 5—テトラクロ口フエノール）、 2, 3, 4， 6-CP (2, 3, 4, 6—テトラクロロフエノ一ル）、 PCP (ペンタクロロフエノール）など] などが挙げられる。

その他の物質としては、 2， 3, 7, 8—テトラクロロジベンゾ _ p—ジォキシン（TCDD) を代表とするポリクロロジベンゾー p—ジォキシン（PCD D) 、 2, 3, 7, 8—テトラクロロジベンゾフラン（TCDF) を代表とするポリクロロジベンゾフラン（PCDF) 、ポリクロロビフエニル（PCB) 、ベンゾフエノン、ベンゾピラン、クロ口ベンゼン、ブロモナフトーノレ、ニトロトノレェン、トリブチル錫、各種農薬、重金属（例えば、 Cd、 Hg、 Pbなど）、合成エストロゲン（例、セントクロマン、ェチニノレエストラジオ一ノレ、ジェチノレスチルベストロール、へキセストール、 2—ヒドロキシェストラジオ一ノレ、タモキシフェン、ラロキシフェンなど）、食品、食品添加物（例えば、 BHA (ブチルヒドロキシァニソ一ノレ）、エコーノレ、ェンテロラクトン、フイトエストロゲン、クメストロール、ホルモノネチン、ダイゼイン、ビォチニン A、ゲステニンなど）などが挙げられる。

これらは、分析する環境汚染物質や、分解物に応じて適宜選択できる。

上記において、炭素数 1〜 20の直鎖または分枝鎖アルキルの具体例としては、例えば、メチル、ェチル、プロピノレ、 i s o—プロピル、プチノレ、 i s 0 —ブチノレ、 s e cーフチノレ、 t e r tーフチノレ、 n—ペンチノレ、 i s o—ペンチノレ、 n e o—ペンチノレ、 t e r t—ペンチノレ、 n—へキシノレ、 i s o_へキシノレ、 n― ヘプチル、 n—ォクチル、 n—ノエル、 n—デシル、ゥンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、へキサデシル、ヘプタデシル、ォクタデシル、ノナデシル、ィコシルなどが挙げられる。上記の炭素数 2〜 18のアルキルの具体例としては、上記の具体例におレ、てメチル、ノナデシルぉよびィコシル以外のものが挙げられる。

本発明で用いる抗 I g抗体としては、環境汚染物質またはその分解物に対する抗体である I g (ィムノグロブリン）に対する抗体が用いられる。

該 I gとしては、例えばマウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ヒト、ネコ、ィヌ、モルモット、ゥマ、ゥシ、ブタ、ニヮトリ、シカ、カンガル一などの哺乳動物、ニヮトリ、七面鳥などの家禽類ものが好ましい。

1 _§としては1 _§0、 I gA、 I gM、 I gD、 I g Eなどが挙げられる力その部分でもよく、該部分としては例えば I gG (H+L) 、 I gG (γ鎖）、 I g G (F a b) 、 I gG (F c) 、 I gG (F a bモノマー）、 I g G (F d) 、 I gGl、 I gG2、 I gG3、 I gG4、 I gG2 a、 I gG2 b、 I gG2 c、 I gA 鎖）、 I g Al、 I g A2、 I gM 鎖）、 I gD (δ 鎖）、 I gE (ε鎖）、 κ軽鎖、、 _K (フリー）鎖、え軽鎖、え（フリー）鎖などが挙げられる。

本発明で用いられる抗 I g抗体としては、例えば、抗 I gG抗体、抗 I gA抗体、抗 I gM抗体、抗 I gD抗体、抗 I g E抗体などが挙げられる。なかでも、抗 I g G抗体が好ましく、抗 I g G抗体、抗 I g A抗体および抗 I g M抗体の混合物であってもよい。

環境汚染物質またはその分解物に対する抗体である I gの製造や、該 I gに対する抗体（すなわち抗 I g抗体）の製造は、自体公知の方法、例えば、ェンザィムィムノアツセィ、第 46頁〜 71頁および第 85頁〜 1 10頁（P. TIJSSEN著、石川栄治監訳、東京化学同人（1989) ) に記載される方法あるいはこれに準じる方法により行うことができる。

これらの方法において、動物に、抗原である環境汚染物質またはその分解物の誘導体とキヤリヤー蛋白質との複合体を接種する際のキヤリヤー蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（以下、 BSAと略す）、卵白アルブミン（以下、 O VAと略す）、スカシ貝へモシァニン（以下、 KLHと略す）、牛チログロブリン（以下、 BTGと略す）などが挙げられる。

環境汚染物質またはその分解物の誘導体とキヤリヤー蛋白質との複合体の形成は、例えば、式（6) ：

A-R (6)

(式中、 Rは、 COOH、 NH₂または SHを、 Aは、 R基の離脱により、環境汚染物質またはその類縁化合物となる基を示す。）

で表される化合物を、自体公知の方法によりキヤリヤー蛋白質に結合させることにより行うことができる。

式（6) で表される化合物も、自体公知の方法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基を形成または導入することにより、化学的に合成できる。

例えば、 Rが COOHで、 Aがポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルとなる式（6) で表される化合物は、ポリオキシアルキルフエ二ルェ一テルと無水コハク酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製造できる [キャンサ一' ノくィオケミストリー 'バイオフィジックス（Cancer Biochem. Biophys. ) ,

7， 1 7 5 (1 9 84) ] 。

Rが ΝΗ₂で、 Αがポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルとなる式 (6) で表される化合物は、ポリオキシアルキルフエニルエーテルの水酸基を塩化チォニルにより塩素化した後 [ジャーナル 'ォブ 'アメリカン 'ケミカル ' ソサエティ一（J. Am. Chem. Soc. ) , 60, 2540 (1 9 38) ] 、アンモニァで処理することにより製造できる [オーガニック ·ファンクショナル'グループ *フ°レノヽレーシヨンス (Organic Functional Group Preparations; ，第 1卷, 3 82頁] 。

Rが SHで、 Aがポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルとなる式 (6) で表される化合物は、ポリオキシアルキルフエ-ルエーテルの水酸基を塩化チォニルにより塩素化した後 [ジャーナル ·ォブ'アメリカン .ケミカル · ソサェティ一（J. Am. Chem. Soc. ) , 60, 2540 (1 938) ] 、水硫化ナトリゥムと反応させることにより製造できる [ジャーナル ·ォブ .アメリカン - ケミカル · ソサエティ一（J. Am. Chem. Soc. ) , 72, 1 843 (1 95 0) ] 。

本発明で用いる担体としては、免疫学的測定法において適常用いられるものを用いることができる。その例としては、例えば、マイクロプレート（例、 96 ウエノレマイク口プレート、 24ウエノレマイクロプレート、 1 92ウエノレマイクロプレート、 384ウェルマイク口プレートなど）、試験管（例、ガラス試験管、プラスチック試験管）、ガラス粒子、ポリスチレン粒子、修飾ポリスチレン粒子、ポリビュル粒子、ラテックス（例、ポリスチレン ' ラテックス）、ニトロセルロース膜、臭化シアン活性化濾紙、 D B M活性化濾紙、粒状固相（例、

Sepharose, Sephadex, ァガロース、セルロース、 Sephacrylなど）、鉄含有ポリカーボネート膜、マグネット含有ビーズなどが挙げられる。

担体に抗 I g抗体を担持させるには、自体公知の方法 [例、上記「ェンザィムィムノアツセィ」第2 6 8〜2 9 6頁、「ァフィニティークロマトグラフィーハンドブック」（アマシャムフアルマシアバイオテク（株）（1 9 9 8年 1 2月 2 0日発行） ] などで担持できる。

本発明における複合体を構成するもう一方の抗体は、自体公知の方法、すなわち、上記のような環境汚染物質またはその分解物の誘導体とキヤリァー蛋白質との複合体で免疫した動物から得られるポリクローナル抗体または該免疫した動物の脾細胞またはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られるモノクロ一ナル抗体を産生するハイブリドーマに産生させることにより製造することができる。

動物を免疫するには、環境汚染物質または上記で得られた複合体を動物に接種する。接種する動物としては、例えば、ャギ、ヒッジ、ゥサギ、ラット、マウス、モルモット、ニヮトリなどが用いられるが、環境汚染物質に対するモノクローナル抗体が所望の場合には、マウスが特に好ましく用いられる。

接種方法としては、通常実施される方法でよく、例えば、マウスに 1回に約 1

〜： 1 0 0 μ g、好ましくは約 5 0〜： 1 0 0 μ gを等容量（0 . 1 ml) の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバンドまたは R I B Iアジュバンドシステム™で乳ィ匕して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に 2〜3週毎に 3〜6回接種する方法がとられる。ポリクローナル抗体を得る場合には接種された動物の血清から、採取することにより行われる。モノクローナル抗体を得るには、さらに次の操作が行われる。

これらの免疫動物、例えば、マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫 3 〜5日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従って実施でき、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、 PEGと略す）や、センダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは、 PEGが用いられる。

骨髄腫細胞としては NS— 1、 P 3U1、 Sp2Z〇などが用いられ、特に P 3 U 1が好ましレ、。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は約 1： 1〜

10： 1で、これに分子量約 1， 000〜6, 000の？ E Gが約 10〜 80 %の濃度で添加され、約 20〜 37 °C、好ましくは約 30〜 37 °Cで約 3〜 10分ィンキュベートするのがよい。

所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、環境汚染物質類似化合物（ハプテン）を結合させた OVAを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、ついで、西洋わさびペルォキシダーゼ（以下、 HRPと略す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固相に結合した抗体を検出する EL I SA法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイプリドーマを直ちにクローニングに供するが、通常これは限界希釈法などで容易に実施される。

クローン化されたハイプリドーマ上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイプリドーマを選択し、目的とするモノクローナルなハイブリドーマを取得することができる。

このような方法により得られるハイプリドーマとしては、例えば、界面活性剤化合物に対するモノクローナル抗体を産生する、ハイプリドーマ GOT 930- 9 (FERM BP— 6065) 、 GOT 935-54 (FERM BP— 60 66) および MOF 3— 139 (FERM BP— 6059) (特開平 10— 1 55484号公報、 EP_A 834557号公報）、内分泌撹乱物質に対するモノクローナル抗体を産生する、ハイプリドーマ M〇F 3— 139 (FERM BP— 6059) 、 AP— 14 (F ERM BP— 6633) 、 B P 2 - 177

(FERM BP— 6634) 、 DF— 34 (FERM BP— 6635) および CP— 8 (FERM B P- 6636) ( P C TZ J P 99 Z 00684号、以下の参考例 3において示す）が挙げられる。

ハイプリドーマによるモノクローナル抗体の産生、精製も自体公知の方法で行うことができる。得られたモノクローナル抗体は、環境汚染物質、その分解物のみならず、式（6 ) で表される化合物に対する抗体となる。

抗体の産生、精製方法の具体例としては、例えば、前記「ェンザィム 'ィムノアツセィ」第 4 6〜 7 1頁、第 8 5〜： 1 1 0頁に記載され、塩折（N a ₂ S〇₄、 (N H₄) ₂ S 0₄) 、イオン交換体（D E A E、 Q A E、 CM/cellulose、

Sephadex, Sepharose, Servacelなど）、疎水クロマ卜グラフィ一（L—フエ二ルァラ二ルー Sepharoseなど）、ゲル濾過（Sephadex G- 200、 Bio-Gel P-300など）、電気泳動（ァガロースゲルによるゾーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など）、超遠心（ショ糖密度勾配遠心法）、ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一 (固定ィ匕プロテイン A (Protein A Sepharose, Protein- A superoseなど））などの方法が挙げられる。

上記で得られた担体に担持させた抗 I g抗体に上記の抗体を結合させるには、自体公知の抗原抗体反応を利用することにより行うことができる。

これらを、例えば、 E L I S A用の酵素剤や、緩衝剤等と組み合わせて、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キットまたは免疫学的濃縮用キットとすることができる。

本発明の免疫化学的分析方法においては、検体（例、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物を含有する水や土壌試料）と、既知の量の標識された環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物との、本発明のモノクローナル抗体に対する結合の量的な競合反応によって定量するいわゆる競合法が用レ、られる。競合法においては、担体上の抗 I g抗体に結合させた一定量の抗体に、未知の抗原を含む検体液および標識剤で標識した一定量の抗原を加える。担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかつた標識剤の活性を測定する。抗体と標識された抗原の添加は、ほぼ同時に行うことが望ましい。

この競合法は、サンドウイツチ法などに比べて、操作が簡便で比較的短時間での測定が可能である。

抗原を標識する標識剤としては、放射性同位元素（以下、 R I と略す、例、 ³ H、 ¹⁴C、 ¹⁵N、 ³² P、 ¹³¹ I、など）、酵素（例、ペルォキシダーゼ、 β—ガラクロシダーゼ、ァノレカリフォスファターゼ、ゥレアーゼ、グノレコースォキシダーゼ、グノレコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース _ 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、シトクロム C) 、酵素基質（例、 3, 3' , 5, 5 ' —テトラメチルベンジジン（TMBZ) 、オルソフエ二レンジァミン（OP D) 、 o—トルイジン、過酸化水素、メチルヒドロペルォキシド、ェチルヒドロペルォキシド、プロピノレヒドロペルォキシド、ウレァヒドロゲンペルォキシド、 p—ニトロペルォキシ安息香酸、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、 o—ジァミノベンゼン、グアイァコール、ベンジジン、ラクトース、 o—二トロフエニル- j3 _D_ガラクトシド、 p—二トロフエニルリン酸、 /3—D—グ^^コース、ゥレア、アンフェタミン、バビツーノレ酸、ベンゾジァゼピン、ベンゾイノレエクゴニン）、メサドン、モノレフイネ、プロポキシフェン、 L —リンゴ酸、チロキシン、モルフイネ、コディン、トリョードチロニン、テトラヒドロカンナビノール、リドカイン、フェンシクリジン、テオフィリン、ジゴキシン、コノレチゾール、フエュトイン、フエノバノレビター^/、プリミドン、ベンゾジァゼパム、カルバマゼピン、エトスクシミド、ゲンタマイシン、キニジン、プロカインアミド、メトトレキセート）、蛍光物質（例、ガラクトシルゥンベリフェリル）、発光物質（例、ルシフェラーゼ）、ピオチンなどが挙げられる。これら抗原と標識剤の結合には、マレイミド法 [ジャーナル ·ォブ .バイオケミストリー（J. Biochem. ) , 79, 233 (1976) ] 、活性化ピオチン法

[ジャーナル 'ォブ 'アメリカン 'ケミカル ' ソサエティ一（J. Am. Chem.

Soc. )ヽ 100、 3585 (1 978) ] などが用いられる。

例えば、競合法による特異的免疫化学的測定方法を実施するには、抗体を結合させた固相に未知量の環境汚染物質を含有する被検試料を加えて反応させ、同時に標識剤で標識した抗原の一定量を加えて反応させる。つぎに、通常、固相をよく洗浄し、固相上に保持されている標識剤の活性を測定する。標識剤が R Iである場合、ゥエル ·カウンターまたは液体シンチレーシヨン .カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。本発明の免疫学的測定もしくは分析の方法においては、担体に抗 I g抗体を担持させ、さらに該抗 I g抗体に環境汚染物質またはその分解物に対するモノクローナル抗体を結合させた複合体を固相として用いているので、高感度に環境汚染物質またはその分解物を測定もしくは分析することができる。

以下に参考例および実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。

上記したハイプリドーマおよび以下の参考例 3におけるハイブリドーマは、ブダぺスト条約の下、日本国茨城県つくば巿東 1一 1— 3の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（N I BH) に寄託されており、以下の表にその寄託日および受託番号を示す。

表 1

参考例 1

抗マウス I g G抗体固相化担体の製造：

抗マウス I g G抗体 [マウス I g Gを免疫原とする。 I CNファーマシューティカル社（カッペルプロダクト）コスモバイオ（株）から購入。カタログ番号 (55479) ] をダルべッコリン酸緩衝液（PBS) に 50 / g /m 1で溶解し、マイクロプレートに 100 1 Zゥエルで添力!]した。 4°Cでー晚反応させた後、 0. 05% Twe e n 20を含むリン酸バッファー（TPB S) にて洗浄後、 PBSにて 4倍稀釈したブロックエース（雪印乳業株式会社製（東京））を 150^ 1Zゥエルを添加した。 37 °C1時間以上反応させ、抗マウス I gG 抗体固相化担体を製造し、使用時まで 4 °Cで保存した。

参考例 2

抗マウス I g A抗体固相化担体の製造法：抗マウス I gA抗体 [I gAを免疫原とする。参考例 1に記載の抗体の購入先と同じカタログ番号（55478) ] をダルベッコリン酸緩衝液 (PB S) に 5 0 μ g/m lで溶解し、マイクロプレートに 100μ 1 Ζゥエルで添力□した。 4 °Cでー晚反応させた後、 0. 05% Twe e n 20を含む T PB Sにて洗浄後、 PB Sにて 4倍稀釈したブロックエースを 150 1 /ゥエルを添加した。 37°Cで 1時間以上反応させ、抗マウス I g A抗体固相化担体を製造し、使用時まで 4 °Cで保存した。

参考例 3

モノクローナル抗体の取得：

(1) 樹脂成分類抗体用ハプテンの作成

ビスフヱノ一ル A 25 gとグルタル酸無水物 12. 5 gを窒素雰囲気下、 10 0 °Cにて 18時間反応させた。反応物を酢酸ェチルに溶解し、シリカゲル力ラム、ォクタデシルシリカゲル（ODS) カラムで精製後、へキサンにて結晶化させて、ビスフエノール A -グルタル酸縮合物 2. 1 gを得た。

(2) 免疫原の調製

(1) で得られたハプテン 0. 1モル、水溶性カルボジイミド 0. 14モル、 N—ヒドロキシコハク酸ィミド 0. 14モルをジメチルスルフォキシド 2 m 1中で室温で一晩反応させて、活性化エステルを作成した。次に、牛血清アルブミン

(BSA) 10mgを 0. 13モル重炭酸ナトリウム（NaHC〇₃) 溶液に溶解し、本活性化エステル 200 1を添加後、一晩 4 °Cで反応させた。限外濾過により未反応の試薬を除去し、免疫原として凍結保存した。

(3) 免疫

(2) で得られた免疫原と B S Aの複合体を 500 g/m 1 となるように生理食塩水に溶解し、等量のフロインドアジュパンドまたは R I B Iアジュバンドに添加した。充分乳濁後、 BALB/Cマウス（メス）〖こ 100 g/マウスで皮下投与し、 2週間（フロインド）もしくは 3週間（R I B I) 間隔で追加免疫を実施した。 5〜6回の追加免疫後、最大の血清抗体価を示した個体について同じ複合体溶液（5〜： 10 z gZO. lml生理食塩水ノマウス）を静脈投与し最終免疫とした。 (4) 細胞融合

最終免疫から 3日後、マウスの腹腔中から脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を常法により調製した（約 10⁸個）。っレ、で、血清無添加培地で 3回洗浄したマゥス骨髄腫細胞（P 3U1) 2 X 10⁷個を添カ卩し、 PEG6000を用いてケーラーとミルスタインの方法 [Na t u r e, 256, 495 (1975) ] に準じて細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むいわゆる HAT培地に懸濁し、 10日間培養した。 10日間の培養期間中に脾臓由来の細胞は自然に死滅し、 HAT培地により脾細胞と融合しなかったマウス骨髄腫細胞（P 3U1) も死滅した。培地中に生存した細胞をバイプリドーマとし、以後は HAT培地からアミノプテリンを除いた HT培地にて培養を続けた。

(5) ハイブリドーマの一次選択およびクローニング

免疫原と同様の方法で作成したハプテンと O V Aの複合体（ハプテン一〇 V A) を吸着させたマイクロプレートを用いる EL I S A法によりハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。融合から 10日から 20日後にハイブリドーマの出現を認め、かつハプテン一OVAに結合する抗体の出現が認められた。特に産生抗体の結合活性が強いハイプリドーマについて、限界稀釈法によるクローニングに供した。

(6) ハイブリドーマの二次選択

(5) の方法で取得したハイプリドーマについて、対象化合物（樹脂成分類、ビスフエノール A) を培養上清に加えて、ハプテン一OVAプレートを吸着させたマイクロプレートへの結合能の阻害を調べる阻害試験を行い、対象化合物のみにより結合が阻害されるものを選択した。

以上の方法により、対象化合物に特異的に結合するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（BP 2— 1 77) を取得した。

(7) モノクローナル抗体の作成

クローン化されたハイブリドーマを、 10%ゥシ胎児血清を含むダイゴ T培地 (日本製薬東京）中、 37°C、 5%二酸化炭素濃度のインキュベーターを用いて培養し、その上清より抗体を得た。一方、多量の抗体を得るためには、予め 0. 5m 1の鉱油を腹腔内投与した B 8 〇マゥスに5 10⁶個のハイプリドーマを腹腔内接種した。細胞を接種したマゥスは約 10日後に腹水の貯留が見られた。腹水の貯留したマゥスを開腹し、腹腔内より腹水を採取した。

抗体の精製は常法により、細胞培養上清または腹水上清より 45〜 50 %飽和硫酸アンモニゥムで分画後、プロテイン Aクロマトグラフィーにて精製した。このようにして、樹脂成分類に対するモノクローナル抗体である抗 PRC抗体を得た。

(8) その他のハイブリドーマの作成

1) アルキルフエノールエトキシレート類（APE) 抗体用ハプテンおよびァルキルフエノール類（AP) 抗体用ハプテンの作成

ポリエチレングリコールモノノニルフエニルエーテル（NP 5EO) 5. 0 g をトルエン 6 Om 1に溶解し、無水コハク酸 918mg、 p—トルエンスルホン酸 16mgと、窒素雰囲気下、 80°Cにて 2時間反応させた。反応液をアルカリ条件下（ p H 12 ) でエーテル洗浄後、酸性条件下（ p H 2 ) でクロ口ホルム抽出した。抽出液を脱水、蒸発乾固して所望のハプテン 2. l gを得た。

2) 樹脂可塑剤 (PP) 抗体用ハプテンの作成

8 _ブロモオクタン酸 10 gをテトラヒドロフラン 30 Om Iに溶解後、ジフエニルァミノメタン 2 Om 1を添加し、室温でー晚反応させた。翌日、さらにジフエニルァミノメタン 2 Om 1を添加し、さらに室温でー晚反応させた。減圧濃縮後、反応物をへキサン—酢酸ェチル（9 : 1) に溶解し、シリカゲルカラムで粗精製した。

この粗精製物 20 gと、フタル酸 2. 42 g、 1, 8—ジァザビシクロウンデンセン（DBU) 2. 22 gとをベンゼン 6 Om 1中でー晚加熱還流した。翌日、 DBU2. 22 gを添加後、さらに 6時間加熱還流し、室温に冷却後、水、ク口口ホルムを加え、水洗した。クロ口ホルム層を脱水、濃縮後、へキサン一酢酸ェチル（9 ： 1) に溶解し、シリカゲルカラムにて粗精製した。

この粗精製物 4· 1 gをテトラヒドロフラン（THF) 100m lに溶解し、 10%P d/C (50%含水品） 0. 4 gを添カ卩した。 H₂吹き込み（0. 3 m 1 /分、 5時間）後、 l Oo/oPdZC l. 2 gを追加した。さらに H₂吹き込み (0. 5mlZ分、 2時間）後、触媒を除去し、減圧濃縮した。 75%メタノールに溶解後、 ODSカラムにて精製し、所望のハプテン 1. 9 gを得た。

3) クロ口フエノール類 (CP) 抗体用ハプテンの作成

5—ブロモ吉草酸 50 gとトリフエニルホスフィン 72. 5 gをトルエン 40

0m 1中で一晩加熱還流後、濾過し、固体をトルエンで洗浄し、減圧乾燥してホスホニゥム塩 1 20 gを得た。別途、 p—ヒドロキシベンズアルデヒド 25 gを酢酸 1 25m 1に溶解し（3 5°C) 、 50°Cに温度を上げ、塩素ガスを 2時間吹き込んだ。室温まで放冷し（35°C) 、白色結晶 19 gを得た。この結晶 19 g と酢酸 36 gを混合後、 80°Cに加熱し、濃厚なスラリー状になるまで塩素ガスを吹き込んだ。室温まで放冷後、析出した白色結晶をクロ口ホルムから再結晶させ、 3， 5—ジクロロー 4ーヒドロキシベンズアルデヒド 9. 3 gを得た。次に、この結晶 9 gと上記のホスホニゥム塩 3 1. 3 gおよび t—ブタノール 1 5. 5 m 1をトルエン 2 10mlに溶解し、 50 °Cまで加熱した時点で t- B u OK 23. 7 gを添加した。 55でで 5時間反応させた後、室温でさらに一晩反応させた。反応液を氷中に投入し、トルエン層を捨て、残った液の pHを 2に調整した。酢酸ェチルで抽出後、減圧乾燥し、へキサン一酢酸ェチル（9 : 1) に溶解し、シリカゲルカラムで精製し、精製物 5. 3 gを得た。この精製物 2. 5 5 g、 1 0%P ά/C (50%含水品） 0. 3 6 g、水 30m 1およびメタノール 60m 1を混合後、水素を吹き込んだ（0. 2リットル分、 20分）。触媒を除去し、減圧濃縮し、イソプロピルエーテル（I PE) で抽出した。減圧濃縮後、シリカゲルカラム、 ODSカラムで精製した。精製物をエーテルへキサンで再結晶させ、所望のハプテン 1. 7 gを得た。

これらのハプテンを用いて、上記 (2) 〜（6) と同様な方法により、ハイブリドーマ MOF 3— 1 39 (抗 APE抗体産生、 F E RM BP— 605 9) ノヽイブリドーマ AP— 1 4 (抗 A P抗体産生、 FERM BP— 6633) 、 DF —34 (抗 PP抗体産生、 FERM B P— 66 35 ) および C P— 8 (抗 CP 抗体産生、 FERM BP— 66 36) を調製した。

実施例 1 (1) 抗エストロゲンモノクローナル抗体の固定ィ匕

参考例 1で作成した抗マウス I g G固相化担体を T PB Sにて洗浄後、 P B S にて最適濃度（0. 125 z g/m l ) に稀釈した抗エストロゲンモノクローナル抗体（抗ェトストリオール 16ダルクロニドモノクローナル抗体）帝国臓器製薬（株）（東京）から購入）を 100 μ 1Zゥエル（0. 0125 /z g抗体ノウエル）で添加し、 4°Cでー晚反応させた。 TP BSにて洗浄後、 PBSにて 4倍稀釈したブロックエースを 150 μ 1 ウヱルを添加した。 37°Cで 1時間以上反応させ、担体一抗マウス I g G抗体—抗エストロゲンモノクローナル抗体複合体を得、使用時まで 4°Cで保存した。

(2) 抗エストロゲン抗体を用いたエストラジオールの測定

抗原酵素複合体（エストリオール 16グリクロニドと西洋ヮサビペルォキシダーゼを力ルポジィミド法にて結合させたもの）を 2倍濃縮 P B S ( 0. 1 % T we e n 20含有）に稀釈し、エストロゲンを含むサンプルと等量混合後、アツセィ用プレートに添加した。 60分、室温で反応度、 TPBSにて洗浄し、発色基質を添加した。 30分室温で反応後、 1Nリン酸にて発色反応を停止させ、吸光度を測定し、図 1に示す標準曲線を作成した。対照として同抗体を直接マイク口プレートに固相化（0. 5 ;u g抗体ウエル）したときの標準曲線を図 2に示す。

これらの結果から、抗マウス I gG抗体を予め固相化することにより、抗エストロゲン抗体使用量を約 1 40に低減でき、かつ、感度が約 10倍程度向上することが分かる。

実施例 2

(1) 抗樹脂成分類（PRC) モノクローナル抗体の固定化

参考例 2で作成した抗マウス I g A固相化担体を TP B Sにて洗浄後、 PBS にて最適濃度（0. 3 ^ gZm l ) に稀釈した抗 PRCモノクローナル抗体（参考例 3で製造されたもの）を 100 1 /ゥル（0. 03 z g抗体ウエル）で添加し、 4 °Cで一晩反応させた。 TPBSにて洗浄後、 PBSにて 4倍稀釈したブロックエースを 1 50 μ 1 /ゥエル添加した。 37でで 1時間以上反応させ、担体一抗マウス I g Α抗体ー抗 BP Αモノクローナル抗体複合体を得、使用時まで 4 °Cで保存した。

(2) 抗 PRC抗体を用いたビスフエノール A (BPA) の測定

抗原酵素複合体（B P Aと無水ダルタル酸のハーフエステルと西洋ヮサビペルォキシダーゼをカルボジィミ 'ド法にて結合させたもの）を 2倍濃縮 P B Sに稀釈し、 BP Aを含むサンプルと等量混合後、アツセィ用プレートに添加した。 60 分、室温で反応度、 TPBSにて洗浄し、発色基質を添加した。 30分室温で反応後、 1Nリン酸にて発色反応を停止させ、 .吸光度を測定し、図 3に示す標準曲線を作成した。対照として図 4に同抗体を直接マイクロプレートに固相化（0. 5 _§抗体ゥェル）したときの標準曲線を示す。

これらの結果から、抗マウス I g A抗体を予め固相化することにより、抗 PR C抗体使用量を約 lZl 7に低減でき、かつ、感度が 5倍程度向上することが分力る。

以上記載したごとく、担体に担持された抗 I g抗体にさらに環境汚染物質もしくはその分解物に対する抗体が結合した複合体を構成成分の 1つとして用いることによる本発明のキットを用いて免疫学的測定法を行なうと、高感度に、環境汚染物質もしくはその分解物を検出 ·測定することができる。

Claims

請求の範囲

1. 担体に担持された抗ィムノグロプリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体を構成成分の一つとしてなることを特徴とする環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析用キット。

2. 環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性剤化合物または内分泌攪乱物質である請求項 1記載のキット。

3. 合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオン界面活性剤化合物および非ィォン界面活性剤化合物からなる群から選択される化合物である請求項 2記載のキッ卜。

4. 合成洗剤用界面活性剤化合物が、 C₂_₁₈アルキル硫酸、 C₂_₁₈アルキルベンゼンスルホン酸、 C ₂— ₈アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスノレホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン c₂_₁₈アルキルフエ二ルエーテル、ポリオキシエチレン C 2^ ₈アルキルエーテル、ポリオキシェ一テノレポリスチリルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フエニルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される化合物である請求項 2記載のキット。

5. 内分泌攪乱物質が、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類またはクロロフエノール類である請求項 2記載のキット。

6. 内分泌攪乱物質が、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、アンドローゲン、テストステロン、デヒドロェピアンドロステロン、アンドロステンジオン、チロキシン、トリョードチロニン、 d— ₂。アルキルフエノールエトキシレート類、。アルキルフエノール類、ビスフエノール

A、 4, 4，一ェチリデンビスフエノール、ビス（p—ヒドロキシフエニル）メタン、 2, 2' —ビス（4—ヒドロキシフエニル）一1—プロパノール、 2， 2 ' —ビス（m—メチノレ一 p—ヒドロキシフエニル）プロパン、 4， 4，一ビス (p—ヒドロキシフエニル）ペンタン酸、 4， 4，一ジアミノジフエ-ルメタン、 4, ' —ジヒドロキシジフエニルエーテル、 4, 4，一ジヒドロキシジフエ二ルスノレフォン、 4, 4，一ジクロロジフエニルスルフォン、ビス [4— (2—ヒドロキシエトキシ）一3, 5—ジブロモフエニル] スルフォン、ビス [4一（2 ーヒドロキシエトキシ）フエニル] スルフォン、 4， 4' —ジヒドロキシデフエニノレエーテノレ、 p , p ' ージヒドロキシベンゾフエノン、 4ーヒドロキシビフエ二一ノレ、フタル酸ブチルベンジル、フタノレ酸ジブチル、フタル酸ジシクロへキシノレ、フタル酸ジェチル、フタル酸ジ（2—ェチルへキシル）、アジピン酸ジェチルへキシル、フタル酸ジへキシル、フタル酸ジ一n—ペンチル、フタル酸ジプロピルならぴにモノー、ジ一、トリ一、テトラ一およびペンタクロロフヱノールからなる群から選択される物質である請求項 2記載のキット。

7. 抗ィムノグロブリン抗体が抗 I g G抗体またはそれを含有する抗体混合物である請求項 1記載のキット。

8. (a) 検体と、（b) 担体に担持された抗ィムノグロブリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体と、（c) 標識剤で標識した環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする検体内の該環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析方法。

9. 環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性剤化合物または内分泌攪乱物質である請求項 8記載の方法。

10. 合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオン界面活性剤化合物および非ィォン界面活性剤化合物からなる群から選択される化合物である請求項 9記載の方法。

1 1. 合成洗剤用界面活性剤化合物が、 C₂— ₁₈アルキル硫酸、 C₂_₁₈アルキノレベンゼンスルホン酸、 Cs— i ₈アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン C₂_₁₈アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン ₈アルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フエニルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される化合物である請求項 9記载の方法。

12. 内分泌攪乱物質が、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類またはクロロフエノール類である請求項 9記載の方法。

13. 内分泌攪乱物質が、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、ェストリオ一ノレ、アンド口—ゲン、テストステロン、デヒドロェピアンドロステロン、アンドロステンジオン、チロキシン、トリヨ一ドチロニン、じ ^アルキノレフエノールエトキシレート類、アルキルフエノール類、ビスフエノール八、 4， 4 ' ーェチリデンビスフエノール、ビス（p—ヒドロキシフエ-ル）メタン、 2, 2，一ビス（4—ヒドロキシフエニル）一1—プロパノーノレ、 2,

2，一ビス（m—メチル一p—ヒドロキシフエニル）プロパン、 4, 4 ' —ビス (p—ヒドロキシフエニル）ペンタン酸、 4, 4' ージアミノジフエニルメタン、 4， 4，一ジヒドロキシジフエニルエーテル、 4, 4 ' ージヒドロキシジフエ二ノレスノレフォン、 4， 4 ' —ジクロロジフエニノレスノレフォン、ビス [4— (2—ヒドロキシエトキシ）一3, 5—ジブロモフエニル] スルフォン、ビス [4— (2 ーヒドロキシエトキシ）フエ二ノレ] スノレフォン、 4, 4，一ジヒドロキシデフエニルエーテノレ、 p , p ' —ジヒドロキシベンゾフエノン、 4—ヒドロキシビフエニール、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジシクロへキシル、フタル酸ジェチル、フタル酸ジ（2—ェチルへキシル）、アジピン酸ジェチルへキシル、フタル酸ジへキシル、フタル酸ジ _ n—ペンチル、フタル酸ジプロピルならびにモノー、ジー、トリー、テトラーおよびペンタクロロフエノールからなる群から選択される物質である請求項 9記載の方法。

14. 抗ィムノグロプリン抗体が抗 I g G抗体またはそれを含有する抗体混合物である請求項 8記載の方法。

15. 担体に担持された抗ィムノグロブリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体が結合した複合体の、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析における使用。

16. 抗ィムノグロブリン抗体が抗 I gG抗体またはそれを含有する抗体混合物である請求項 15記載の使用。