WO2001005946A1 - Modele d'etude de la progression de metastases pulmonaires spontanees, et son utilisation pour le criblage de medicaments - Google Patents

Modele d'etude de la progression de metastases pulmonaires spontanees, et son utilisation pour le criblage de medicaments Download PDF

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WO2001005946A1
WO2001005946A1 PCT/FR2000/001997 FR0001997W WO0105946A1 WO 2001005946 A1 WO2001005946 A1 WO 2001005946A1 FR 0001997 W FR0001997 W FR 0001997W WO 0105946 A1 WO0105946 A1 WO 0105946A1
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WO
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gfp
cells
cell line
metastases
fluorescent protein
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/001997
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English (en)
Inventor
Maryam Diarra-Mehrpour
Sébastien PARIS
Original Assignee
I.N.S.E.R.M. Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Publication date
Application filed by I.N.S.E.R.M. Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical I.N.S.E.R.M. Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae

Definitions

  • the subject of the present invention is a model for studying the progression of spontaneous pulmonary metastases, and its use for the screening of drugs.
  • GFP green fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • GFP has been expressed heterologously in cells and organisms as diverse as bacteria, yeasts, animal and plant eukaryotic cells.
  • [6] which consist of (a) transfection of the human lung cancer cell line, called NCI-H460, with an expression vector containing a nucleotide sequence (cDNA) encoding the GFP protein, (b) injecting the clone thus obtained, called H460-GFP, from nude mice, and (c) to show that the expression of said GFP protein made it possible to detect metastases in the tissue of said mice.
  • orthotopic implantation carried out in two stages, requires:
  • the time necessary for the appearance and detection of pulmonary metastases is also quite long: thus, for example, according to the model of Yang et al. [6], very few metastases appear and are detectable before orthotopic implantation, and it is necessary to wait at least 41 days to detect pulmonary metastases.
  • One of the aims of the invention is to provide an in vivo model mimicking the development of pulmonary metastases, and in particular making it possible not to have recourse to orthotopic implantation
  • Another aim of the invention is to provide an in vivo model allowing to study the very first stages of the development and progression of metastases
  • the invention also aims to provide an in vivo model allowing a rapid and sensitive (exact) evaluation of the efficacy of therapeutic agents in vivo.
  • the invention relates to a highly metastasizing cell line integrating a reporter gene easily. detectable, and its use to provide an in vivo model particularly suitable for studying the progression of pulmonary metastases in lung cancer
  • the subject of the present invention is the use of a cell line for human pulmonary carcinoma, in particular the cell line NCI-H460. with the following properties •
  • cell line is meant an immortalized cell culture (s).
  • carcinoma is meant a malignant epithelial tumor.
  • human pulmonary carcinoma cell line is meant a culture of immortalized malignant pulmonary epithelial cell (s) of human origin.
  • the NCI-H460 cell line first described as an adenocarcinoma cell line (malignant tumor developed at the expense of a glandular epithelium), has been found to be a large cell lung carcinoma line with neuroendocrine properties. The line was obtained from pleural fluid from an untreated patient with large cell lung cancer.
  • a human lung carcinoma cell line, which constitutively expresses a fluorescent protein means that the gene encoding said protein is integrated into the genome of the cell and is transmitted from generation to generation. The constitutive term is used in contrast to transient.
  • a human pulmonary carcinoma cell line is stable with respect to the fluorescent protein which it expresses, when cells originating from the human lung cancer cell line have been stably transfected with the gene encoding said fluorescent protein.
  • a test for verifying the stability of the human lung carcinoma cell line with respect to the fluorescent protein consists in culturing the line for several passages in vitro (approximately 15 passages for a period of approximately 90 days), without antibiotic (geneticin, G418 sulfate, Life technologies, puromycin, Clontech) and regularly check the expression of the GFP protein under a fluorescence microscope or using a cytofluorimeter and the presence of the mRNA of said protein by the transfer of 'RNA (Northern-blot).
  • the human pulmonary carcinoma cell line in particular derived from
  • NCI-H460 expressing a fluorescent protein
  • clone or by "cell transfected with the gene for the fluorescent protein”.
  • Examples in accordance with the invention of human pulmonary carcinoma cell lines derived from NCI-H460 and expressing a fluorescent protein, in particular the green fluorescent protein "GFP" are:
  • H460M the large cell lung carcinoma cell line, called H460M, expressing GFP, and expressing the geneticin resistance gene
  • the cell line of human lung carcinoma with large cells called P-H460M, expressing GFP, and expressing the gene for resistance to puromycin.
  • the H460M cell line expressing GFP is derived from the Ugnea H460M.
  • the GFP-expressing P-H460M cell line is derived from the H460M line.
  • metalastasis is meant a focus of cancer cells, related to a preexisting cancer, called “primary”, but developed at a distance from it and without continuity with it. Ordinarily, it occurs by proliferation of cells originating from the primary tumor which reach a determined point in the body, either by a natural conduit (bronchus, bile duct, for example), or, much more often, by vascular route blood or lymphatic.
  • the term “metastasis” encompasses the metastases present in the various phases of development of a condition such as cancer and designates both micrometastases and macrometastases.
  • ceUule micrometastasis
  • macrometastases training ceUule (micrometastasis) is multiplied to give a macrometastasis (up to several million cells) .
  • micrometastases is meant more particularly metastases invisible to the naked eye.
  • metastases is meant more particularly metastases visible to the naked eye.
  • micrometastases denotes metastases having sizes varying from approximately 1 to 1000 cells
  • macrometastases the metastases having sizes varying from approximately 1000 to several thousand cells.
  • pulmonary metastases is meant the metastases present in the lung. However, metastases of pulmonary origin can also be present in other organs such as the liver, the intestines, the heart, etc.
  • spontaneous pulmonary metastases is meant the metastases which spontaneously form in the lung after injection into an animal, of the cell line of human pulmonary carcinoma.
  • Spontaneous lung metastases are fluorescent because the human lung carcinoma cell transfected by the fluorescent protein producing them is stable for said protein.
  • the cell line according to the invention of human pulmonary carcinoma, in particular derived from the cell line NCI-H460, has the following properties
  • animal used according to the invention designates mammals, in particular souns, and in particular athymic immunodeficient souns called sou ⁇ s nude ( Swiss)
  • the metastases obtained after subcutaneous injection bring together all the stages mimicking the formation of metastatic foci in a patient, which is not the case for metastases obtained after intravenous injection (called expenmental metastases)
  • the number of spontaneous fluorescent lung metastases can reach in the upper values. approximately 400 to approximately 700, which corresponds to a significant number of metastases compared to the numbers of metastases produced by the cellular ugnees currently known
  • the subject of the invention is also a cellular ugnea of large cell humam carcinoma of the lungs, called H460M. expressing the fluorescent proteme chosen from the group constituted by - green fluorescent protein (GFP) [9, 10], blue fluorescent protein (BFP) [11], yellow fluorescent protein (RSGF or EGFP) [12, 13], GFPUV [14, 13], or
  • the subject of the invention is also a cell line of human lung carcinoma with large cells, called P-H460M, expressing the fluorescent protein chosen from the group consisting of:
  • GFP green fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • RSGF yellow fluorescent protein
  • EGFP yellow fluorescent protein
  • GFPUV GFPUV
  • human lung carcinoma with large cells can be replaced by “undifferentiated human lung carcinoma with large cells” and designates tumor cells, generally of easy recognition, which are very large, having a large nucleus, frequently multi-lobed, monstrous, nucleolus.
  • the invention relates to a cell line of human pulmonary carcmoma called H460M and expressing the green fluorescent protein GFP.
  • the human lung carcinoma cell H460M expressing the green fluorescent protein GFP, will be called “clone H460M GFP ”, “cell line H460M GFP ”, or “H460M GFP ”.
  • H460M cells Cells from the H460M cell line may be called "H460M cells”.
  • the invention relates to a human pulmonary carcinoma cell line called P-H460M and expressing the green fluorescent protein GFP.
  • the human pulmonary carcinoma cell line P-H460M expressing the green fluorescent protein GFP, will be called “clone P-H460M GFP ", "cell line P-H460M GFP ", or "P-H460M GFP ".
  • the H460M GFP cell line according to the invention is as deposited with the National Collection of Microorganisms (CNCM) in Paris, on June 23, 1999, under the number I. 2242.
  • the P-H460M GFP cell line according to the invention is as deposited with the National Collection of Microorganisms (CNCM) in Paris, on July 4, 2000, under the number I. 2514.
  • the H460M human pulmonary carcinoma cell line presents the characteristic of metastasizing in an important and spontaneous way in nude mice: these metastases exactly mimic the tropism of those observed in humans during this pathology.
  • the human lung carcinoma cell line H460M as defined above or the human pulmonary carcinoma cell line H460M as defined above, in particular expressing the fluorescent protein GFP is characterized in that it is:
  • the in vivo test making it possible to verify the stability consists in injecting H460M GFP or P-H460M GFP , in an amount of approximately 5.10 6 cells, subcutaneously in each flank of athymic nude mice, in sacrificing said mice at times variables, to excise primary tumors, to recover and observe the lungs under an inverted fluorescence microscope.
  • the intensity of GFP expression makes it possible to follow the stability of the GFP gene in cells.
  • the cellular lung carcinoma gene H460M as defined above, expressing the fluorescent protein GFP is characterized in that it: - constitutively expresses a fluorescent protein
  • - is capable of producing, after injection into an animal and without orthotopic implantation, a large number of spontaneous fluorescent pulmonary metastases, varying from approximately 1 to approximately 700, in a relatively short time, varying from approximately 2 to approximately 7 weeks after said injection in animals,
  • the quantity of cells injected expressing a fluorescent protein in particular F £ 460M GFP or P-H460M GFP , is approximately 10 7 cells per animal.
  • the present invention also relates to a cell line for human lung carcinoma H460M such as defined above, characterized in that it additionally expresses at least one therapeutic protein, in particular chosen from the group consisting of protease inhibitors such as proteins of the inter- ⁇ trypsin inhibitor family, proteins of the metalloprotease family and their inhibitors, proteins of the cysteine protease family and their inhibitors, proteins of the aspartate protease family and their inhibitors , proteins Uant hyaluronic acid (hyaladérines), or in the group of the factors intervening in the neovascularization and / or the tumor growth, or in the group of proteins of adhesion to the extracellular matrix.
  • protease inhibitors such as proteins of the inter- ⁇ trypsin inhibitor family, proteins of the metalloprotease family and their inhibitors, proteins of the cysteine protease family and their inhibitors, proteins of the aspartate protease family and their inhibitors , proteins Uant hyaluronic acid (
  • Protease inhibitors play an important protective role during tumor invasion by preventing proteolysis from degrading the extracellular matrix (ECM). As a result, tumor invasion is less important, which limits the formation of metastases.
  • ECM extracellular matrix
  • the subject of the invention is also the use of a human lung carcinoma cell line H460M as defined above, to provide a model:
  • the quantity of cells injected expressing a fluorescent protein, in particular H460M GFP or P-H460M GFP , making it possible to generate the formation of a large number of spontaneous fluorescent pulmonary metastases is the same as that defined above.
  • the amount of expressed fluorescent protein is the same as defined above, said amount to detect the presence of at least 1 to about 20 micrometastases from the 13 th day.
  • the model according to the invention makes it possible to detect and count exactly the number of micro- and macrometastases present in the lung of an animal and to detect a single micrometastase very quickly after the injection of H460M GFP or P-H460M GFP cells. subcutaneously in animals.
  • Another subject of the present invention is a method for detecting pulmonary metastases (micro- and macrometastases) characterized in that:
  • - cells from the cell line as defined above are injected, subcutaneously, into an animal, in particular in an amount of approximately 10 ' cells / animal,
  • one recovers between approximately 13 and approximately 49 days after said injection, at least one of the organs chosen from the group consisting of the liver, the intestines, the heart and the lungs of said animal,
  • the total number of metastases (micro- and macrometastases) present in said organs is determined, using appropriate physical means.
  • the appropriate physical means for determining the total number of metastases are, for example, the inverted fluorescence microscope.
  • the subject of the invention is also a process for preparing a cell line for human pulmonary carcinoma as defined above (H460M GFP or P-H460M GFP ), characterized in that: (a) the cells from the cell line called H460M are transfected with an expression vector containing a nucleotide sequence coding for the fluorescent protein chosen from the group consisting of:
  • GFP green fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • RSGF or EGFP yellow fluorescent protein
  • GFPUV green fluorescent protein
  • transfected cells are placed in the presence of a selection medium making it possible to select the cells having integrated a gene for resistance to an antibiotic, and in particular the gene for resistance to geniticin or to puromycin, (c) one recovers fluorescent colonies approximately 14 days after step a) of transfection,
  • Step d) of “maintenance under selection pressure” makes it possible to express the gene for resistance to the antibiotic carried by the vector, in order to maintain the gene for the
  • GFP integrated into the genome of the cell and pass it on to subsequent generations.
  • the in vivo model according to the invention is particularly suitable for studying the function of proteins of the family of protease inhibitors in tumor invasion, the formation of metastases and the maintenance of the extracellular matrix (ECM). These studies contribute to the understanding of the metastatic phenomenon which represents a capital objective in cancer research allowing to lead to diagnostic and therapeutic methods and to specifically target cancer cells with metastatic potential.
  • ECM extracellular matrix
  • the inter- ⁇ trypsin inhibitor constitutes an original model of regulation of protein synthesis involved in ECM and tumor invasion.
  • the ITI is involved in tumor invasion, as an antiprotease via bikunin (having two protease inhibitor domains of Kunitz type), and as stabilizer of the ECM thanks to its heavy chains. 13
  • UTI Urokinase-type plasminogen activator receptor
  • the H460M GFP and P-H460M GFP cells are prepared.
  • the vectors expressing the various chains (cDNA) of the ITI (heavy chains H1, H2 and H3 and light chain L of the ITI) are then stably transfected in the cells H460M GFP and P-H460M GFP , under the control of 'a viral promoter.
  • the in vitro study is supplemented by an in vivo study by injecting, into nude mice, the H460M GFP cells or the P-H460M GFP cells expressing the different chains of the ITI, and by comparing their metastatic potential with that observed in injecting the H460M GFP cells and the P-H460M GFP cells not transfected by the various chains of the ITI. This makes it possible to study in vivo the impact of the ITI on tumor invasion.
  • This in vivo invasion test can be linked to the tumorigenicity test.
  • the subcutaneous injection of tumor cells into these immunocompromised animals makes it possible to test the tumorigenicity of these cells at the injection site, and their metastatic potential, by the appearance of secondary tumor foci in the lungs.
  • These animals are autopsied: the primary tumors are removed, weighed and the target organs are examined by examination under fluorescence microscopy. The lungs are removed and analyzed by examination under fluorescence microscopy. This method makes it possible to count all of the pulmonary metastases.
  • the model according to the invention mimicking tumor invasion in vivo makes it possible to better understand the role of protease inhibitors, and in particular of ITI, and their implication in the stages of this complex phenomenon which is not reproducible in its entirety in vitro. Description of the figures
  • Figures 1a and 1b they represent the stable expression of GFP in cells originating from the cell line H460M.
  • the H460M cells are transfected with the vector pEGFP-Cl.
  • the cells transfected with the gene encoding GFP (line H460M GFP ) are subcultured in a medium containing 400 ⁇ g.ml "1 of geneticin (G418 sulfate, Life technologies) and observed under light microscopy ( Figure la) or under fluorescence microscopy ( UV) ( Figure lb).
  • FIG. 2 it represents the growth curves of the parental cell line H460M and of the cell line H460M GFP according to the invention.
  • the abscissa axis represents time (in days), and the ordinate axis the number of cells. Each point represents the average of three tests + the standard deviation (SD "Standard Deviation").
  • the black circle (•) corresponds to the H460M cell line
  • the white circle (o) corresponds to the H460M GFP cell line.
  • eUe represents respectively, from left to right on the abscissa axis, chemotaxis, cell invasion and cell adhesion for the parental cell line H460M and for the cell line H460M GFP according to the invention.
  • the ordinate axis represents the number of cells per field.
  • the data are expressed as the mean + SD of 30 randomly chosen fields, obtained from 3 independent experiments.
  • the black histogram (•) corresponds to the H460M cell line
  • the white histogram (U) corresponds to the H460M GFP cell line according to the invention.
  • Figures 4a, 4b and 4c they represent the expression of GFP in the micro- and macrometastases of nude mice.
  • Cells from the cell line H460M GFP at a rate of 1.0 ⁇ 10 7 , are injected subcutaneously into mice.
  • the fresh lungs are removed at different times after the injection and are observed directly under a fluorescence microscope.
  • the results obtained 35 days after the injection are presented.
  • Figure 4a shows a single micrometastasis present in the fresh tissue (s) of the host.
  • Figure 4b shows 3 colonies of micrometastases present in the fresh tissue (s) of the host.
  • Figure 4c shows a macrometastase (s) present in the fresh tissue (s) of the host.
  • FIGS. 5a and 5b they represent the kinetics of formation of pulmonary metastases after injection of 1.0 X 10 7 cells originating from the cell line H460M GFP according to the invention in nude mice.
  • FIG. 5 a represents the percentage of mice with metastases detected under fluorescence microscopy (O) or macroscopically (D and "* • ).
  • the abscissa axis represents the time after inoculation (in days), and the ordinate axis represents the percentage of mice with metastases.
  • the symbol of the white circle (O) represents the metastases detected under fluorescence microscopy (UV) after injection of cells originating from the cell line H460M GFP .
  • the white square (D) corresponds to metastases detected macroscopically (with the naked eye) after injection of cells originating from the H460M GFP cell line according to the invention.
  • the black triangle ( • * • ) corresponds to metastases detected macroscopically (with the naked eye) after injection of cells from the H460M cell line.
  • Figure 5b shows the median number of metastases per mouse.
  • the abscissa axis represents the time after inoculation (in days), and the ordinate axis represents the median of the metastases.
  • Figure 6 it represents the analysis by RT-PCR (Reverse transcription / Polymerase chain reaction) of fluorescent cells transfected by ITI chains or by the vector alone (pIRES-Hyg or pcDNA3).
  • GAPDH oligonucleotides (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) were used as internal controls for the quantity of RNA in the transfected cell.
  • Clone L H460M FP cells transfected by the ITI light chain L;
  • H460M GFP and pIRES-Hyg controls of clone L;
  • Clone H P-H460M GFP cells transfected with one of the heavy chains (Hl, H2 or H3) of the ITI;
  • FIG. 7 it represents the analysis by cytofluorimeter (FACS “fluorescence-activated cell-sorting”) of the expression of GFP in the transfected cells after two months of culture without antibiotic.
  • Hl-203, H2-131, H3-186 clones obtained after transfection of the P-H460M GFP cell line with the heavy chains Hl, H2 and H3 of the ITI; H460M GFP and pIRES-Hyg: controls of clone L-13; P-H460M GFP and pcDNA3: controls of clones Hl-203, H2-131, H3-186.
  • Figures 8A, 8B, 8C and 8D Figures 8A and 8B represent the “box and whisker plots” of the weight of primary tumors, and Figures 8C and 8D represent the “diagram in box with scattered values "of the number of lung metastases.
  • mice studied controls, 16; clones, 8.
  • Table 1 Table 1 below corresponds to the number of metastases counted over a period of 49 days for the line H460M GFP .
  • Table 2 represents the pairs of oligonucleotides used for the amplification of the mRNAs of the light chain L, the heavy chains H1, H2, H3 or of GAPDH.
  • Table 3 represents the in vitro analysis of chemotaxis and cell attachment.
  • the average optical density (OD), obtained for the two tests from 6 independent experiments for H460M GFP or P-H460M GFP is considered as representing 100% of cell adhesion or chemotaxis.
  • the results were analyzed using the non-parametric Mann-Whitney test.
  • PIRES-Hyg controls 103 ⁇ 17.8 ns 100.2 ⁇ 6.7 ns L-13 66.7 ⁇ 8.8 * 102.3 ⁇ 6.7 ns
  • PcDNA3 controls 97 ⁇ 14.8 ns 98.9 ⁇ 6.6 ns Hl-203 98 ⁇ 8.6 ns 146.7 ⁇ 15 **
  • the human lung carcinoma line H460M GFP expressing the green fluorescent protein GFP, transfected stably by the wild-type vector pERES-Hyg (Clontech), will be named in the following:
  • the human lung carcinoma line H460M GFP expressing the green fluorescent protein GFP, stably transfected with the vector pIRES-Hyg expressing the light chain L cDNA of the ITI, will be named in the following:
  • L designates the clone number (for example “L-13” designates the clone L no. 13) (example 3).
  • the human lung carcinoma P-H460M GFP expressing the green fluorescent protein GFP, transfected stably by the wild-type vector pcDNA3 (Invitrogen), will be called in the following:
  • the human lung carcinoma P-H460M GFP expressing the green fluorescent protein GFP, transfected stably by the vector pcDNA3 expressing the cDNA of the Hl heavy chain of the ITI, will be called in the following: "H1 clone” , "P-H460M GFP cell line expressing the ITI heavy chain H1 cDNA”.
  • H1 designates the number of the clone (for example “Hl-203” designates the clone Hl no. 203) (example 3).
  • the human lung carcinoma P-H460M GFP expressing the green fluorescent proton GFP, transfected stably by the vector pcDNA3 expressing the cDNA of the heavy chain H2 of the ITI, will be called in the following:
  • H2 clone "P-H460M GFP cell line expressing the ITI H2 heavy chain cDNA”.
  • H2 designates the clone number (for example “H2-131” designates the clone H2 no 131) (example 3).
  • the human lung carcinoma P-H460M GFP expressing the green fluorescent protein GFP, stably transfected by the vector pcDNA3 expressing the H3 heavy chain cDNA of the ITI, will be called in the following:
  • H3 clone "P-H460M GFP cell line expressing the I3 heavy chain H3 cDNA”.
  • H3 denotes the clone number (for example “H3-186” denotes clone H3 n ° 186) (example 3).
  • the H460M cell line is derived from the NCI-H460 line, established from a large cell lung carcinoma of an untreated patient. Ugnea H460M was established by successive injections of cells from a pulmonary metastasis obtained after injection of NCI-H460 cells into nude mice. The H460M line becomes metastatic at the pulmonary level in nude mice after subcutaneous injection. A series of subcutaneous injections of lung metastasis cells obtained with
  • NCI-H460 allowed the selection of the H460M line. This is characterized by an increase in its metastatic potential compared to that of the parental Ugnea NCI-H460.
  • the complete culture medium is composed of RPMI 1640 medium (“Roswell Park Memorial Institute”) (Life Technologies) containing 10% (v / v) of fetal calf serum
  • the selective culture medium of example 1 below (concerning the line H460M GFP ) is composed of RPMI 1640 containing 10% (v / v) of SVF, 2mM of L-glutamine and 400 ⁇ g.ml "1 of geneticin (G418 sulfate, Life Technologies).
  • the selective culture medium of Example 2 below (relating to the P-H460M GFP line ) is composed of RPMI 1640 containing 10% (v / v) of FCS, 2 mM of L-glutamine and 1.2 ⁇ g.ml "1 of puromycin (Clontech).
  • the selective culture medium of Example 3 below (concerning the lines expressing the ITI cDNAs (clones L, H1, H2 and H3) or the wild vectors pcDNA3 and pIRES-Hyg) is composed of RPMI 1640 containing 10% (v / v) FCS, 2mM L-glutamine and:
  • the culture medium used for the in vitro experiments is composed of RPMI 1640 containing 2 mM L-glutamine and 0.1% (w / v) of bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the activated medium (or chemoattractant) is obtained from H460M cells cultivated for 4 to 5 days in RPMI 1640 medium containing 2 mM L-glutamine and 0.1% (w / v) BSA. This medium is collected, centrifuged at 12,000 rpm (sigma 2 kl5, rotor No. 12145) at 4 ° C for 10 minutes and the supernatant is stored at -20 ° C.
  • H460M and H460M GFP lines are handled in a sterile enclosure with vertical laminar flow (Cytair 125 hood, Flufrance) and cultured in an incubator at 37 ° C under a controlled atmosphere: 5% C0 2 , 95% atmospheric air, 90% humidity (MCO 175 incubator, Sanyo). These adherent lines are cultivated in complete RPMI 1640 medium.
  • the essential maintenance techniques are the change of medium, consisting in eliminating the depleted medium, and the subculturing, allowing the transfer of the cells covering the entire surface of the support into new bottles.
  • the cells thus recovered are pipetted several times in order to obtain a suspension of isolated cells.
  • the cells of a 100% confluence flask are subcultured 1/10 in a new flask and then incubated at 37 ° C.
  • the culture medium is changed the day after transplanting.
  • the cells of a 75 cm 2 flask at 80% confluence are washed and then subjected to the action of trypsin as described in the preceding paragraph. They are taken up in 10 ml of complete culture medium, centrifuged for 5 minutes at 1200 rpm (C3-12, Jouan) at room temperature. The cell pellet is resuspended in 1.8 ml of RPMI 1640 medium containing 2 mM of L-glutamine and 30% of FCS. This suspension is distributed in two freezing tubes then 0.9 ml of complete medium containing 20% of
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the cell suspension is diluted in 2 ml of RPMI 1640 medium containing 2 mM L-glutamine and 20% of FCS. It is gently shaken with a pipette, adjusted to a final volume of 15 ml and then the cells are seeded in a 75 cm 2 culture flask. After an overnight incubation at 37 ° C., the culture medium is replaced with complete RPMI 1640 medium.
  • the human ITI L light chain cDNA was cloned into the expression vector pIRES-Hyg (Clontech laboratories, Palo Alto, USA).
  • This bicistronic vector codes for the hygromycin B resistance gene (hygromycin B phosphotransferase).
  • the fragment containing this cDNA extends from 64 bp upstream of the transcription initiation codon, up to 44 bp downstream of the stop codon and encodes both ⁇ i-microglobulin and bikunin.
  • This fragment is inserted between the BamHI and BstX1 sites of the pIRES-Hyg vector. The characterization of this construction demonstrated that the synthesis and maturation of ⁇ i-microglobulin and bikunin are carried out correctly (data not shown).
  • Clones H1, H2 and H3 The constructions allowing the expression of the cDNA of the heavy chains Hl, H2 or H3 of human ITI have been previously described and characterized [31]. These cDNAs have been integrated into the expression vector pcDNA3, which also codes for the Geneticin resistance gene G418 sulfate.
  • DNA by its phosphate groups, complexes Ca ++ ions by forming a fine precipitate.
  • a freshly prepared precipitate is brought into contact with the cell in culture, internalization of the complex in the cell is observed. This internalization seems to result from a phagocytosis of the DNA-calcium grains. Only a few cells spontaneously integrate this DNA into their genome. This results in a so-called stable modification which will be transmitted to daughter cells. 2. Buffers and solutions
  • HEPES ( ⁇ 2) buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid) comprising 40 mM HEPES, 270 mM NaCl, 10 mM KC1, 7 mM Na 2 HP0 4 , 12 H 2 0 and 11 mM D-glucose was filtered through a 0.22 .mu.m filter (milUpore) and then stored at 4 ° C.
  • ⁇ 2 buffer N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid
  • the CaCl 2 solution is prepared at a concentration of 2 M, filtered, aliquoted and then kept at -20 ° C.
  • the glycerol solution consists of 15% (v / v) glycerol in HEPES buffer (xl).
  • TE 10/1 buffer Tris-HCl 10 mM / EDTA ImM consists of 10 mM Tris-
  • the H460M cells are seeded with 2.10 6 cells in a 60 mm diameter petri dish.
  • the transfection mixture is carried out in a sterile tube by placing 10 ⁇ g of DNA in TE 10/1 buffer, the final volume of which is completed with sterile water at 440 ⁇ l, supplemented with 500 ⁇ l of HEPES buffer (x2). The mixture is vigorously stirred and then incubated for 10 mm at room temperature. 60 ⁇ l of CaCl 2 2 M are mixed with the reaction medium. The DNA is then left in contact with CaCl 2 for 10 minutes at room temperature, and this reaction mixture is gently stirred every 2 to 3 minutes.
  • the culture medium is then aspirated and then the precipitate formed by the phosphate groups of the DNA and the Ca ++ ions is distributed homogeneously on the cell carpet every 10 minutes for 30 minutes.
  • the cells are incubated at 37 ° C.
  • 5 ml of DMEM medium (“Dulbecco's Modified Eagle Medium”) containing 10% FCS are added to each dish and the cells are incubated again for 4 to 6 hours at a temperature of 37 ° C.
  • the medium and the precipitate are eliminated and the transfection yield is optimized by a glycerol shock: 2 ml of a 15% glycerol solution, previously heated to 37 ° C., are brought into contact with the cells for 2 minutes.
  • the glycerol is replaced by 10 ml of complete RPMI medium.
  • the cells are then incubated for 24 h at 37 ° C.
  • the Fugene-6 technique was used for transfection:
  • H460M cells close to confluence (for the ITI light chain L cDNA and the wild pIRES-Hyg vector (Clontech)) or,
  • P-H460M GFP cells for the heavy chain H1, H2 or H3 cDNAs of the ITI and the wild-type pcDNA3 vector (Invitrogen)) using Fugene-6 (Roche, Meylan, France).
  • the cells are seeded at a density of 3 ⁇ 10 5 cells in a culture dish 35 mm in diameter (Corning Costar, Brumath, France).
  • 6 ⁇ l of the Fugene-6 reagent were diluted in 94 ⁇ l of serum-free medium. The solution is then incubated for 10 min with 2 ⁇ g of vector and then added to the cells. The cells are then trypsinized 24 hours after transfection and cultured at a ratio of 1: 10 in selective medium containing:
  • FACS cytofluorimeter
  • RNAs were extracted from the cell lines (P-H460M GFP , H460M GFP , pcDNA3, pIRES-Hyg, clones L, Hl, H2 and H3) using an RNA extraction kit (RNA Insta-Pure , Eurogentec, Belgium).
  • the sequences of the oligonucleotides used to detect the transcription of the L, Hl, H2 or H3 genes were obtained from already published human sequences [18-21] (Table 2).
  • the GAPDH oligonucleotides [22] have been used as internal control of the quality of mRNAs.
  • the cDNA was synthesized from 1 ⁇ g of total RNA using Tth DNA polymerase (Eurobio, les Ulis, France).
  • the reverse transcription (RT) reaction mixture contains:
  • RT is performed by pairing at 58 ° C for 15 min and a transcription at 70 ° C for 15 min.
  • the reaction mixture for amplification containing:
  • PCR buffer (335 mM Tris-HCl pH 8.8; 83 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 3.75 mM EGTA; 25% glycerol; 0.1% Tween 20) (Eurobio), - 1 , 5 mM MgCl 2 (Eurobio),
  • the negative control was obtained by replacing TARN with distilled water.
  • the PCR products (10 ⁇ l) were analyzed on a 2% agarose gel in Tris-acetate-EDTA buffer and visualized by staining with ethidium bromide under ultra violet illumination ( Figure 6).
  • the table below represents the number of mice studied for example 3.
  • the analysis of each mouse made it possible to obtain a value for the number of pulmonary metastases and two values for the mass of the primary tumors.
  • a 5 ⁇ l drop of 10mM trypsin-EDTA is deposited on cell colonies, pipetted several times to remove the cells from the dish. Each clone is immediately transferred to a 24-well plate containing 1 ml of selective medium. At 100% o confluence, they are subcultured in a 6-well plate in 4 ml of selective medium. The presence of the Green Fluorescen Protein (GFP) gene is detected under a fluorescent microscope scence (Axiovert 10, Zeiss, excitation filter BP450-490, suppression filter LP520).
  • GFP Green Fluorescen Protein
  • the clone entitled H460M GFP was selected (FIG. 1).
  • This clone expresses GFP with very high intensity.
  • the cultivation of this clone in complete RPMI medium and without selection pressure for 90 days (15 passages) shows great stability in the expression of the GFP gene.
  • the puromycin resistance gene carried by the vector pEGFP-fRES-Puro (Clontech) introduced into H460M cells gives them the property of growing in a selective medium containing this antibiotic, - 24 hours after transfection, the cells are subjected to trypsin and then subcultured to 1/10 in complete RPMI 1640 medium containing 1.2 ⁇ g.ml "1 of puromycin (Clontech).
  • the clone entitled P-H460M GFP was selected because it expresses GFP with very high intensity.
  • EXAMPLE 3 (lines expressing the ITI cDNAs: clones L, Hl, H2 and H3)
  • the hygromycin B resistance gene carried by the pE vector ES-Hyg (Clontech) introduced into H460M GFP cells gives them the property of growing in a selective medium containing this antibiotic, - 24 h after transfection, the cells are subjected to trypsin and then subcultured to 1/10 in complete RPMI 1640 medium containing 200 ⁇ g.ml "1 of hygromycin (Clontech) (for the selection of cells expressing the light chain L of ÎTITI) and 400 ⁇ g.mi "1 of Geneticin G418 (to maintain expression of GFP).
  • the cells are subjected to trypsin and then subcultured to 1/10 in complete RPMI 1640 medium containing 1.2 ⁇ g.ml-1 of puromycin (Clontech) (to maintain the expression of GFP) and 400 ⁇ g.ml "1 of Geneticin G418
  • Cell growth is determined by seeding 6.10 4 cells in a 25 cm 2 flask. Daily, a culture flask is subjected to the action of trypsin and the cells are recovered in 2 x 5 ml of complete RPMI 1640 medium. The cells are centrifuged for 5 minutes at 1200 ⁇ m (C3-12, Jouan), then the supernatant is aspirated. The cell pellet is taken up in 1 to 5 ml of complete RPMI 1640 medium and the cells are counted using a hemocytometer called the Malassez cell.
  • the doubling time is 18 to 24 hours for the two cell lines.
  • the invasiveness of the cells is determined by using a modified Boyden system [16, 17], marketed under the name of Transwell (Corning Costar, ref. 3428).
  • the alcohol-acetic acid 2% mixture is composed of 98% (v / v) of 95 ° ethanol and 2% of acetic acid.
  • the Crystal-violet solution consists of water containing 0.1% (w / v) of Crystal-violet dye (Sigma).
  • Matrix gel marketed under the name of “Matrigel Basemont Membrane Matrix” (Collaborative Research Product) is a preparation of the basement membrane of a mouse sarcoma rich in extracellular matrix proteins.
  • the coating of the membrane with the matrix gel is carried out on ice with cold equipment (cones, pipettes, etc.) in order to avoid too rapid gelation thereof.
  • the modified Boyden system making it possible to study cell invasion (Transwell. Corning Costar) has a 24 mm polycarbonate membrane, with a pore of 8 ⁇ m in diameter, and is covered with 0.1 ⁇ g.mm "2 matrix gel (Becton Dickinso ⁇ ). The plate is placed at 37 ° C. for 30 minutes, then dried sterile in a hood overnight. The matrix gel is rehydrated for 1 hour at room temperature with 1 ml of RPMI 1640, then the membrane is washed twice with 1 ml of this medium in order to remove any trace of unbound matrix gel which could interfere with the cells.
  • Transwell. Corning Costar has a 24 mm polycarbonate membrane, with a pore of 8 ⁇ m in diameter, and is covered with 0.1 ⁇ g.mm "2 matrix gel (Becton Dickinso ⁇ ). The plate is placed at 37 ° C. for 30 minutes, then dried sterile in a hood overnight. The matrix gel is rehydrated for 1 hour at room temperature
  • the invasion capacity through the matrix gel is the same for the two cell lines H460M and H460M GFP .
  • H460M and H460M GFP cells are carried out in the same way as the invasion test except for the presence of Matrigel.
  • the ability to migrate is also the same for the two cell lines H460M and H460M GFP .
  • the cell migration (H460M GFP , P-H460M GFP , pIRES-Hyg, pcDNA3, clones L and Hl, H2, H3) is carried out in the same way as the invasion test, disregarding the presence of Matrigel and the manner of count the cells.
  • the inco ⁇ orated dye in the migrated cells is dissolved by placing the Transwell in 1 ml of 10% (v / v) acetic acid for 5 minutes. This solution is recovered, then its optical density (OD) is determined at 588 nm.
  • the H460M and H460M GFP cells are seeded at 1.10 5 cells.mr 1 in a 6-well plate 35 mm in diameter. After 2 hours at 37 ° C., the non-attached cells are eliminated by two washings in PB S. The cells are then fixed and stained as described above for the invasion test and then counted.
  • results obtained show a statistically significant increase in cell attachment for the clones expressing the Hl heavy chain of the ITI (152 ⁇ 7%) or the H3 heavy chain of the ITI (180 ⁇ 11%), when they are compared with the controls, while the variations observed for the clones expressing the light chain
  • the chemotaxis experiments showed, while no effect is detectable with the heavy chains of ITI, that the clones expressing the light chain L of ÎTTI have a decrease in their potential for migration. It would therefore seem that bikunin (resulting from the maturation of the light chain L) can act in vivo as an inhibitor of the spread of metastases, certainly thanks to its power to inhibit proteases.
  • the cell adhesion on a reconstituted basement membrane (Matrigel) is not modified for the clones expressing the L and H2 chains, while the clones expressing the Hl and H3 chains see their adhesion increase on this matrix which can potentially prevent the dissemination of these cells in vivo.
  • the purpose of the in vivo study is to mimic the formation of spontaneous pulmonary metastases.
  • H460M GFP cells In order to test the capacity of H460M GFP cells to produce spontaneous fluorescent metastases, these cells are injected into nude mice by the subcutaneous route (example 1).
  • Example 3 being more particularly, by using Examples 1 and 2, to determine the impact of the expression of the different chains of ITI on training metastases and on the growth of primary tumors.
  • the animals used for these experiments are female Swiss homozygous nu / nu mice 5 to 7 weeks old. These animals are kept under sterile conditions during the whole time of the experiment. 2. Injection and enumeration of metastases
  • Example 1 200 ⁇ l of RPMI 1640 medium containing 5.10 6 H460M ° FP cells are injected subcutaneously into each flank of Swiss mice. At variable times, the mice are sacrificed and then autopsied. Primary tumors are excised and then weighed. The lungs are recovered, washed in PBS, then flattened between two glass slides linked together by adhesive film. The thickness of the lung between them is less than 1 mm. Metastases are counted under an inverted fluorescence microscope (Axiovert 10,
  • the total number of metastases is obtained by observing the entire lung. After two weeks, micrometastases are observed, under a fluorescence microscope, in 100%) of the animals, present at the level of the lymphatic nodules (data not shown) and of the lung tissue ( Figure 4). On the other hand, at the same time, no metastasis could be observed under white light from the same organs. The other organs do not show fluorescent metastases. These data show the capacity for selective colonization of the lung by H460M GFP cells in nude mice.
  • Example 2 The techniques used in Examples 2 and 3 are identical to that of Example 1. The only difference is that the animals were killed on a single date of 28 days. The number of lung metastases obtained is shown in Figure 8.
  • the weight of the primary tumors induced by the clones expressing the L chain is statistically lower than that of the controls (1.3-3 g).
  • the variations observed for the clones expressing the heavy chains are not significant when they are compared with the controls (FIGS. 8, A and B).
  • the interquartile represents 95% of the population studied.
  • metastases although some rare mice presenting an invasion of the proximal lymph gangs have been observed, the fluorescent cells are located in the lungs only, which reflects a very important affinity for this tissue of the cells H460M GFP and P-H460M GFP .
  • the expression of the chains of the ITI does not induce any overturning of this affinity. No gross metastasis could be detected with the naked eye or by microscopic examination under normal light. In contrast, fluorescent cells are easily detectable under a UV microscope. The estimated number of cells contained in the metastases varies from 1 to 1000.
  • the mean interquartile range is 0-14 metastases against 24-61 metastases for the controls
  • these average interquartiles are 5-19 and 8-34 respectively against 56-101 metastases for the Mleess controls.
  • the clones expressing the chain H2 do not differ from the controls (Fig.
  • Example 1 No significant alteration in the mo ⁇ hological and biological characteristics, such as proliferation, chemotaxis, adhesion and cell invasion, is observed for the H460M GFP cell line compared to the H460M line.
  • the selected H460M line retains its capacity to form pulmonary metastases, and allows the early detection of micrometastases exclusively in the lung, which shows a special affinity of these cells for the pulmonary endotheum.
  • GFP fluorescence requires no preparation and can be viewed in fresh tissue without interference from endogenous GFP.
  • the significant quantity of fluorescent pulmonary metastases obtained using the model according to the invention demonstrates in vivo that the cell line H460M GFP is stable in the long term with respect to GFP, and shows that its capacity to form pulmonary metastases has not been changed.
  • the model according to the invention makes it possible to detect pulmonary micrometastases in 100% of the animals after two weeks following the injection of H460M ° FP into said animals.
  • the model according to the invention therefore makes it possible to easily study the kinetics of formation of pulmonary metastases, and thus represents a rapid, reproducible and easy to use in vivo method for detecting the variation in the number of metastases.
  • Example 3 In contrast to the H1, H2 and H3 clones expressing the heavy chains of ITI, the clones expressing the light chain L of ITI show a very significant drop in the mass of primary tumors. This cannot be linked to a reduced proliferation of the cells since the doubling time calculated in vitro is identical for all the clones and the controls. This more likely corresponds to the ability of bikunin to inhibit the proteases secreted by cancer cells (example: plasmin [23]), which prevents the degradation of the extracellular matrix and the appearance of factors known to induce neoangiogenesis. [24]. This is in agreement with the studies carried out in vitro by Kobayashi et al. [15, 25] showing that bikunin inhibits the invasion of HOC-1 cells. In addition, the Hl, H2 and H3 chains, lacking antiprotease activity, have no effect on the growth of primary tumors.
  • the statistical analysis of the number of metastases obtained with the clones expressing the heavy chains reveals a significant drop for the clones expressing the H1 and H3 chains in comparison with the controls. This is not observed for the clones expressing the H2 chain, which exhibit as many metastases as the controls. This result imputes that the Hl and H3 chains interfere with the metastatic process as moderators of cell dissemination and can be explained in part by the increase in cell attachment to the Matrigel observed in vitro for the H1 and H3 clones.
  • results presented provide proof of the advantages of the spontaneous pulmonary metastasis model of the invention which can be used to study potential anti-oncogenes, or drugs directed against metastases, particularly thanks to its simplicity and precision. count of metastases.
  • DIARRA-MEHRPOUR et al Biochim. Biophys. Acta, 1219: 551-554 (1994).
  • DIARRA-MEHRPOUR et al J. Biol. Chem., 273: 26809-26819 (1998).

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes: elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, elle est stable pour ladite protéine, elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes, elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.

Description

MODELE D'ETUDE DE LA PROGRESSION DE METASTASES PULMONAIRES SPONTANEES, ET SON UTILISATION POUR LE CRIBLAGE DE MEDICAMENTS.
La présente invention a pour objet un modèle d'étude de la progression de métastases pulmonaires spontanées, et son utilisation pour le criblage de médicaments.
Actuellement, les études sur le cancer du poumon représentent un axe de recherche thérapeutique important, dû à la fréquence de cette pathologie. Les avancées majeures dans la recherche sur le cancer proviennent d'études dirigées vers le développement de nouvelles thérapies contre les métastases.
Ainsi, l'obtention de modèles d'études in vivo appropriés, mimant le développement de métastases pulmonaires, représente des avantages importants pour ces études. Le problème majeur rencontré dans les modèles d'études actuels, réside dans la difficulté de détection des micrométastases. Des études colorimétriques utilisant le gène lacZ donnent de bons résultats pour cette visualisation [1, 2, 3]. Cependant, cette technique nécessite beaucoup plus de temps, car la détection de lacZ requiert une préparation histologique importante, les résultats sont souvent difBciles à interpréter, en raison de l'activité β-galactosidase endogène de certaines cellules. Par conséquent, il est souvent difficile de compter le nombre total de métastases présentes dans le poumon
Des travaux [4. 5, 6] ont déjà décrit l'utilisation de la protéme fluorescente verte (GFP) en tant que gène rapporteur dans des tissus hôtes.
Le gène codant pour une protéine fluorescente issue de la méduse Aequorea Victoria, la protéine fluorescente verte (green fluorescent protein ou GFP) [7], est connu. La GFP est une protéine ayant 238 acides aminés et une masse moléculaire de
27000. Elle acquiert ses propriétés de fluorescence par un mécanisme autocatalytique de formation du fluorophore. L'expression, endogène ou hétérologue, de la GFP ne requiert qu'un gène et ne nécessite l'addition d'aucun groupe prosthétique. La GFP a été exprimée de manière hétérologue dans des cellules et organismes aussi divers que les bactéries, les levures, les cellules eucaryotes animales et végétales.
S'agissant de l'utilisation de la GFP, les auteurs CMshima et al. [4, 5] ont (a) transfectέ la lignée cellulaire d'adénocarcinome pulmonaire humain, dénommée ANTP 973 [5] ou des cellules d'ovaires de hamsters HOC-I [4], par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique (ADNc) codant la protéine GFP (b) injecté le clone stable exprimant la protéine GFP à des souris immunodéficientes (souris nude, Swiss), et (c) montré que l'expression de ladite protéine GFP permettait de détecter des métastases dans le tissu desdites souris à l'échelle microscopique. La GFP a également été utilisée dans les travaux menés par Yang et al. [6], qui consistent (a) à transfecter la lignée cellulaire de cancer pulmonaire humain, dénommée NCI-H460, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique (ADNc) codant la protéine GFP, (b) à injecter le clone ainsi obtenu, dénommé H460-GFP, à des souris nude, et (c) à montrer que l'expression de ladite protéine GFP permettait de détecter des métastases dans le tissu desdites souris.
Cependant, les modèles in vivo décrits par ces auteurs [4, 5, 6] présentent des limitations dues notamment à la nécessité d'une implantation orthotopique chez les souris nude, nécessitant dans un premier temps d'injecter, par voie sous-cutanée aux souris nude, les cellules de carcinome pulmonaire humain (ANIP 973 ou NCI-H460) transfectées par le gène de la GFP, d'attendre environ 4 semaines pour détecter dans le flanc des souris une grosse tumeur visible à l'œil nu, et nécessitant dans un deuxième temps de prélever la tumeur et d'implanter un fragment de ladite tumeur dans les poumons d'autres souris nude.
Au bout d'une période d'environ 6 semaines après le début de la première injection, les cellules tumorales humaines sont visibles et sont présentes dans le poumon de la souris en quantité suffisante.
Ainsi, l'implantation orthotopique, effectuée en deux étapes, nécessite :
- une intervention chirurgicale, et donc un personnel compétent et habilité en chirurgie animale, - un temps d'étude assez long.
Ainsi, le temps nécessaire à l'apparition et à la détection de métastases pulmonaires est également assez long : ainsi à titre d'exemple, selon le modèle de Yang et al. [6], très peu de métastases apparaissent et sont détectables avant l'implantation orthotopique, et il faut attendre au moins 41 jours pour déceler des métastases pulmonaires.
D'autres inconvénients des modèles actuels décrits ci-dessus [4, 5, 6] résident notamment dans :
- le faible potentiel métastatique des lignées utilisées après injection sous-cutanée, - l'impossibilité d'établir une corrélation entre la croissance de la tumeur primaire et le nombre de métastases obtenues,
- l'incapacité d'analyser l'effet de l'agent anticancéreux sur l'évolution des métastases après ablation de la tumeur primaire, - la difficulté d'effectuer une étude statistique sur la cinétique d'apparition des métastases, ce qui affaiblit l'étude de l'impact d'un agent anticancéreux sur le développement de métastases pulmonaires
Les auteurs Corti et al [8], ont décπt et étudié la lignée cellulaire H460M, déπvee de la lignée cellulaire NCI-H460 de carcinome pulmonaire humain, et ont montre que ladite lignée cellulaire H460M produit un nombre élevé de métastases pulmonaires spontanées après injection sous-cutanée a des souris nude Cependant, le modèle expérimental in vivo décπt dans cette publication ne permet pas la détection de micrométastases La présente mvention permet de remédier à l'ensemble des inconvénients décπts ci-dessus
L'un des buts de l'invention est de fournir un modèle in vivo mimant le développement de métastases pulmonaires, et permettant notamment de ne pas avoir recours à l'implantation orthotopique Un autre but de l'invention est de fournir un modèle in vivo permettant d'étudier les toutes premières étapes du développement et de la progression des métastases
(micro-et macrométastases) pulmonaires
L'invention a également pour but de fournir un modèle in vivo permettant une évaluation rapide et sensible (exacte) de l'efficacité d'agents thérapeutiques in vivo De façon générale, l'invention concerne une lignée cellulaire hautement metastasiante mtegrant un gène rapporteur facilement détectable, et son utilisation pour fournir un modèle in vivo particulièrement approprié pour l'étude de la progression de métastases pulmonaires lors du cancer du poumon
La présente mvention a pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment déπvee de la lignée cellulaire NCI-H460. présentant les propπétés suivantes •
- elle exprime de façon constitutive une proteme fluorescente,
- elle est stable vis-à-vis de ladite proteme, - elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes,
- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.
Par « lignée cellulaire », on entend une culture de cellule(s) immortalisée(s). Par « carcinome » on entend une tumeur épithéliale maligne. Par « lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain », on entend une culture de cellule(s) épithéliale(s) pulmonaire(s) maligne(s) immortalisée(s) d'origine humaine. La lignée cellulaire NCI-H460, décrite dans un premier temps comme une lignée cellulaire d'adénocarcinome (tumeur maligne développée au dépens d'un épithélium glandulaire), s'est révélée être une lignée de carcinome pulmonaire à larges cellules avec des propriétés neuroendocrines. Ladite lignée a été obtenue à partir d'un liquide pleural d'un patient non traité atteint d'un cancer du poumon à larges cellules. Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, qui exprime de façon constitutive une protéine fluorescente signifie que le gène codant ladite protéine est intégré dans le génome de la cellule et est transmis de génération en génération. Le terme constitutif est utilisé à l'opposé de transitoire.
Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain est stable vis-à-vis de la protéine fluorescente qu'elle exprime, lorsque des cellules provenant de la lignée cellulaire de cancer humain du poumon ont été transfectées de façon stable par le gène codant ladite protéine fluorescente.
Un test permettant de vérifier la stabilité de la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain vis-à-vis de la protéine fluorescente consiste à cultiver la lignée pendant plusieurs passages in vitro (environ 15 passages pour une période d'environ 90 jours), sans antibiotique (généticine, G418 sulfate, Life technologies, puromycine, Clontech) et vérifier régulièrement l'expression de la protéine GFP au microscope à fluorescence ou à l'aide d'un cytofluorimètre et la présence de l'ARNm de ladite protéine par le transfert d'ARN (Northern-blot). La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de
NCI-H460, exprimant une protéine fluorescente, est désignée dans ce qui suit soit par « clone », soit par « cellule transfectée par le gène de la protéine fluorescente ». Des exemples conformes à l'invention de lignées cellulaires de carcinome pulmonaire humain dérivées de NCI-H460 et exprimant une protéine fluorescente, notamment la protéine fluorescente verte « GFP » sont :
- la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M, exprimant la GFP, et exprimant le gène de résistance à la généticine,
- la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée P-H460M, exprimant la GFP, et exprimant le gène de résistance à la puromycine. La lignée cellulaire H460M exprimant la GFP est dérivée de la Ugnée H460M. De même, la lignée cellulaire P-H460M exprimant la GFP est dérivée de la lignée H460M.
Par « métastase », on désigne un foyer de cellules cancéreuses, en rapport avec un cancer préexistant, dit « primitif », mais développé à distance de ce dernier et sans continuité avec lui. Ordinairement, il se produit par prolifération de cellules provenant de la tumeur primitive qui parviennent en un point déterminé de l'organisme, soit par un conduit naturel (bronche, canal biliaire, par ex.), soit, beaucoup plus souvent, par voie vasculaire sanguine ou lymphatique. Selon l'invention, le terme « métastase » englobe les métastases présentes dans les différentes phases de développement d'une affection telle que le cancer et désigne aussi bien les micrométastases que les macrométastases. Lors du développement d'une affection il y a, dans un premier temps, formation de micrométastases, puis dans un deuxième temps, formation de macrométastases : une ceUule (micrométastase) se multiplie pour donner une macrométastase (jusqu'à plusieurs millions de cellules).
Par « micrométastases », on désigne plus particulièrement des métastases invisibles à l'œil nu.
Par « macrométastases », on désigne plus particulièrement des métastases visibles à l'oeil nu.
Dans ce qui suit, on désigne de façon avantageuse, par « micrométastases » les métastases ayant des tailles variant d'environ 1 à 1000 cellules, et par « macrométastases » les métastases ayant des tailles variant d'environ 1000 à plusieurs milUers de cellules.
Par « métastases pulmonaires », on désigne les métastases présentes au niveau du poumon. Cependant, les métastases d'origine pulmonaire peuvent également être présentes au niveau d'autres organes tels que le foie, les intestins, le cœur etc.... Par « métastases pulmonaires spontanées », on entend les métastases qui se forment spontanément dans le poumon après injection chez un animal, de la lignée ceUulaire de carcinome pulmonaire humain.
Les métastases pulmonaires spontanées sont fluorescentes car la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain transfectée par la protéine fluorescente les produisant, est stable pour ladite protéine.
De même, il est possible de détecter une seule micrométastase présente chez l'animal, car la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain transfectée par la protéine fluorescente, est stable pour ladite protéine et la quantité présente de ladite protéine est suffisante pour la détection d'une seule micrométastase.
Par l'expression « pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires », il faut comprendre que le temps nécessaire à l'étude de l'effet d'un médicament sur la formation et la détection des métastases pulmonaires spontanées, varie d'environ 13 à environ 28 jours, ce qui représente un temps relativement court.
Ainsi selon l'invention, il sera par exemple possible de détecter, après injection à un animal de la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M et exprimant la GFP :
- quelques métastases pulmonaires dès le treizième jour après l'injection, - de 9 à 107 métastases pulmonaires dès le vingtième jour après l'injection, et notamment dès le vingt huitième jour.
De même selon l'invention, il sera par exemple possible de détecter, après injection à un animal de la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes ceUules, dénommée P-H460M et exprimant la GFP, de 27 à 207 métastases pulmonaires dès le vingt huitième j our après l' inj ection.
A titre d'exemple, selon les travaux de YANG et al. précédemment cités [6], étudiant la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain NCI-H460 transfectée par le gène de la GFP :
- il est impossible de détecter des métastases dans les 15 jours qui suivent l'injection,
- il est nécessaire de recourir à une implantation orthotopique 28 jours après l' inj ection, - le temps minimum nécessaire à l'étude de l'effet d'un médicament sur la formation et la détection des métastases pulmonaires spontanées, est d'environ 41 jours après mjecnon de ladite lignée cellulaire chez un animal.
Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l' invention, de carcinome pulmonaire humain, notamment déπvee de la lignée cellulaire NCI-H460, présente les propπétés suivantes
- elle exprime de façon constitutive une proteme fluorescente,
- elle est stable pour ladite protéine,
- elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation ortho topique, un nombre de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes vanant d'environ 1 a environ 700, en un temps relativement court, vanant d'environ 2 à environ 7 semâmes après ladite inj ection chez animai,
- elle exprime la proteme fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable Le terme « animal » utihsé selon l'invention, désigne des mammifères, notamment des souns, et notamment des souns athymiques immunodéficientes appelées souπs nude (Swiss)
Les injections de cellules selon l' mvention provenant de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain expnmant une proteme fluorescente, sont effectuées selon l' mvention par voie sous-cutanee. De façon avantageuse selon l'invention, seules des injections par voie sous-cutanee sont nécessaires, lesdites cellules transfectées selon l'invention migrant de façon naturelle vers les poumons de l'animal Selon un autre mode de réaUsation avantageux de l' invention, les métastases obtenues après injection sous-cutanee (dites métastases spontanées) rassemblent l'ensemble des étapes mimant la formation des foyers métastatiques chez un patient, ce qui n'est pas le cas des métastases obtenues après injection intraveineuse (dites métastases expénmentales)
Le nombre de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes peut atteindre dans les valeurs supéπeures. environ 400 à environ 700, ce qui correspond a un nombre important de métastases par rapport aux nombres de métastases produites par les Ugnees cellulaires actuellement connues
Par l'expression « un temps court » il faut entendre environ 14 jours. L'invention a encore pour objet une Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humam à grandes cellules, dénommée H460M. expnmant la proteme fluorescente choisie dans le groupe constitue par - la protéine fluorescente verte (GFP) [9, 10], la protéine fluorescente bleue (BFP) [11], la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP) [12, 13], GFPUV [14, 13], ou
- des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou
- des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence.
L'invention a encore pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée P-H460M, exprimant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par :
- la protéine fluorescente verte (GFP) [9, 10], la protéine fluorescente bleue (BFP) [11], la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP) [12, 13], GFPUV [14, 13], ou
- des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou
- des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence. L'expression « carcinome pulmonaire humain à grandes cellules » peut être remplacée par « carcinome pulmonaire humain indifférencié à grandes cellules » et désigne des cellules tumorales, généralement de reconnaissance aisée, qui sont de très grande taille, dotées d'un noyau volumineux, fréquemment polylobé, monstrueux, nucléole. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet une lignée cellulaire de carcmome pulmonaire humain dénommée H460M et exprimant la protéine fluorescente verte GFP.
La Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, sera dénommée « clone H460MGFP », « lignée cellulaire H460MGFP », ou « H460MGFP ».
Les cellules provenant de la lignée cellulaire H460M pourront être dénommées « cellules H460M ». Selon un autre mode de réaUsation avantageux, l'invention a pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain dénommée P-H460M et exprimant la protéine fluorescente verte GFP.
La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain P-H460M, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, sera dénommée « clone P-H460MGFP », « lignée cellulaire P-H460MGFP », ou « P-H460MGFP ».
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention, est telle que déposée auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M) à Paris, le 23 juin 1999, sous le numéro I. 2242. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire P-H460MGFP selon l'invention, est telle que déposée auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M) à Paris, le 4 juillet 2000, sous le numéro I. 2514.
La Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M présente la particularité de métastasier de manière importante et spontanée dans les souris nude : ces métastases miment exactement le tropisme de celles observées chez l'homme au cours de cette pathologie.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus ou la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant notamment la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle est :
- stable pendant au moins 90 jours in vitro et pendant au moins 49 jours in vivo,
- capable de former des métastases pulmonaires spontanées fluorescentes.
Le test in vitro permettant de vérifier la stabilité de la Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire Uumain H460M vis-à-vis de la protéine fluorescente est tel que décrit précédemment.
Le test in vivo permettant de vérifier la stabilité consiste à injecter H460MGFP ou P-H460MGFP, en une quantité d'environ 5.106 cellules, de façon sous-cutanée dans chaque flanc des souris nude athymique, à sacrifier lesdites souris à des temps variables, à exciser les tumeurs primaires, à récupérer et observer les poumons au microscope inversé à fluorescence. L'intensité de l'expression de la GFP permet de suivre la stabilité du gène de la GFP dans les cellules.
Selon un autre mode de réaUsation avantageux de l'invention, la Ugnée ceUulaire de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle : - exprime de façon constitutive une protéine fluorescente,
- est stable pour ladite protéine,
- est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal,
- exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.
De façon avantageuse, la quantité de cellules injectées exprimant une protéine fluorescente, notamment F£460MGFP ou P-H460MGFP, est d'environ 107 cellules par ariimal.
La présente invention a également pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M teUe que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre au moins une protéine thérapeutique, notamment choisie dans le groupe constitué par les inhibiteurs de protéases tels que les protéines de la famille de l'inhibiteur inter-α de la trypsine, les protéines de la famille des métalloprotéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des cystéines protéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des aspartates protéases et leurs inhibiteurs, les protéines Uant l'acide hyaluronique (hyaladérines), ou dans le groupe des facteurs intervenant dans la néovascularisation et/ou la croissance tumorale, ou dans le groupe des protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire.
Les inhibiteurs de protéases jouent un rôle protecteur important au cours de l'invasion tumorale en empêchant la protéolyse de dégrader la matrice extracellulaire (MEC). De ce fait, l'invasion tumorale est moins importante, ce qui limite la formation des métastases.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, pour fournir un modèle :
- permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes chez un ariimal, ledit nombre variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court variant d'environ 2 à environ 7 semaines après injection chez ledit animal de cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus, - permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13eme jour, notamment dès le 14eme jour suivant l'injection à un animal de cellules provenant de la Ugnée cellulaire telle que définie ci-dessus,
- ne nécessitant pas d'implantation ortho topique, pour cribler de façon précoce, des médicaments ciblés contre les cellules cancéreuses pulmonaires, et notamment contre les propriétés d'adhésion, d'invasion et de prolifération desdites cellules cancéreuses.
La quantité de cellules injectées exprimant une protéine fluorescente, notamment H460MGFP ou P-H460MGFP, permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes est la même que celle définie ci-dessus.
De même, la quantité de protéine fluorescente exprimée est la même que celle définie ci-dessus, ladite quantité permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13eme jour. Le modèle selon l'invention permet de détecter et de compter exactement le nombre de micro- et macrométastases présentes dans le poumon d'un animal et, de détecter une seule micrométastase très rapidement après l'injection de cellules H460MGFP ou P-H460MGFP par voie sous-cutanée chez l'animal.
La présente invention a encore pour objet un procédé de détection de métastases (micro- et macrométastases) pulmonaires caractérisé en ce que :
- on injecte, par voie sous-cutanée, à un animal des cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus, notamment en une quantité d'environ 10' ceUules/animal,
- on récupère entre environ 13 et environ 49 jours après ladite injection, l'un au moins des organes choisis dans le groupe constitué par le foie, les intestins, le cœur et les poumons dudit animal,
- on détermine le nombre total de métastases (micro- et macrométastases) présents dans lesdits organes, à l'aide de moyens physiques appropriés.
Les moyens physiques appropriés pour déterminer le nombre total de métastases sont par exemple le microscope inversé à fluorescence.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus (H460MGFP ou P- H460MGFP), caractérisé en ce que : (a) on transfecte les cellules provenant de la lignée cellulaire dénommée H460M par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique codant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par :
- la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou
- des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou
- des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence,
(b) on met lesdites cellules transfectées en présence d'un milieu de sélection permettant de sélectionner les cellules ayant intégré un gène de résistance à un antibiotique, et notamment le gène de résistance à la géniticine ou à la puromycine, (c) on récupère des colonies fluorescentes environ 14 jours après l'étape a) de transfection,
(d) on maintient éventuellement en culture lesdites colonies fluorescentes sous pression de sélection.
L'étape d) de « maintien sous pression de sélection » permet de faire exprimer le gène de résistance à l'antibiotique porté par le vecteur, afin de maintenir le gène de la
GFP intégré dans le génome de la cellule et de le transmettre aux générations suivantes.
Le modèle in vivo selon l'invention est particulièrement approprié pour l'étude de la fonction des protéines de la famille des inhibiteurs de protéase dans l'invasion tumorale, la formation de métastases et le maintien de la matrice extracellulaire (MEC). Ces études contribuent à la compréhension du phénomène métastatique qui représente un objectif capital dans la recherche en cancérologie permettant de déboucher sur des méthodes diagnostiques et thérapeutiques et de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses à potentialité métastatique.
A titre d'exemple d'inhibiteur de protéase, rinhibiteur inter-α de la trypsine (TTI) constitue un modèle original de régulation de synthèse protéique impliqué dans la MEC et l'invasion tumorale. En effet, l'ITI est impUqué dans l'invasion tumorale, en tant qu'antiprotéase par le biais de la bikunine (possédant deux domaines inhibiteurs de protéases de type Kunitz), et comme stabilisateur de la MEC grâce à ses chaînes lourdes. 13
Une étude récente [15] a démontré in vitro que l'UTI (« Urinary trypsine inhibitor »), dérivé urinaire de ÎTTI composé de la bikunine, bloque l'invasion tumorale en inactivant le récepteur de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPAR). L'implication de l'ITI dans l'invasion tumorale est mieux comprise en utilisant le modèle in vivo selon l'invention.
Dans un premier temps, on prépare les cellules H460MGFP et P-H460MGFP. Les vecteurs exprimant les différentes chaînes (ADNc) de l'ITI (chaînes lourdes Hl, H2 et H3 et chaîne légère L de l'ITI) sont ensuite transfectés de façon stable dans les cellules H460MGFP et P-H460MGFP, sous contrôle d'un promoteur viral. Afin d'appréhender les potentialités invasives et métastatiques des cellules tumorales et le retentissement de l'expression des différents ADNc de l'ITI sur la capacité invasive, plusieurs tests sont mis au point : ils ont pour but de mimer les interrelations tumeurs/hôte.
On réalise également des tests in vitro de cliimiotactisme, d'adhésion et de croissance cellulaire afin de déterminer l'impact de ces différentes chaînes de l'ITI sur ces paramètres.
L'étude in vitro est complétée par une étude in vivo en injectant, à des souris nude, les cellules H460MGFP ou les cellules P-H460MGFP exprimant les différentes chaînes de l'ITI, et en comparant leur potentiel métastatique avec celui observé en injectant les cellules H460MGFP et les cellules P-H460MGFP non transfectées par les différentes chaînes de l'ITI. Ceci permet d'étudier in vivo l'i pact de l'ITI sur l'invasion tumorale.
Ce test d'invasion in vivo peut être lié au test de tumorigénicité. L'injection sous- cutanée de cellules tumorales à ces animaux irnmunodéprimés permet de tester le pouvoir tumorigène de ces cellules au site d'injection, et leur potentialité métastatique, par l'apparition de foyers tumoraux secondaires au niveau des poumons. Ces animaux sont autopsiés : les tumeurs primitives sont prélevées, pesées et les organes cibles sont examinés par examen sous microscopie à fluorescence. Les poumons sont prélevés et analysés par examen sous microscopie à fluorescence. Cette méthode permet de dénombrer la totalité des métastases pulmonaires.
Le modèle selon l'invention, rnimant l'invasion tumorale in vivo permet de mieux comprendre le rôle des inhibiteurs de protéase, et notamment de l'ITI, et leur implication dans les étapes de ce phénomène complexe non reproductible dans son intégralité in vitro. Description des figures
Figures la et lb : elles représentent l'expression stable de la GFP dans les ceUules provenant de la lignée cellulaire H460M. Les cellules H460M sont transfectées avec le vecteur pEGFP-Cl. Les cellules transfectées avec le gène codant la GFP (lignée H460MGFP) sont repiquées dans un milieu contenant 400 μg.ml"1 de généticine (G418 sulfate, Life technologies) et observées en microscopie photonique (Figure la) ou sous microscopie de fluorescence (UV) (Figure lb).
Figure 2 : elle représente les courbes de croissance de la lignée cellulaire parentale H460M et de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.
L'axe des abscisses représente le temps (en jours), et l'axe des ordonnées le nombre de cellules. Chaque point représente la moyenne de trois essais + la déviation standard (SD « Standard Déviation »).
Le cercle noir (•) correspond à la lignée cellulaire H460M, et le cercle blanc (o) correspond à la Ugnée cellulaire H460MGFP.
Figure 3 : eUe représente respectivement, de gauche à droite sur l'axe des abscisses, le chimiotactisme, l'invasion cellulaire et l'adhésion cellulaire pour la lignée cellulaire parentale H460M et pour la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules par champ.
Les données sont exprimées comme la moyenne + SD de 30 champs choisis au hasard, obtenus à partir de 3 expériences indépendantes.
L'histogramme noir (•) correspond à la Ugnée cellulaire H460M, et l'histogramme blanc ( U ) correspond à la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.
Figures 4a, 4b et 4c : elles représentent l'expression de la GFP dans les micro- et macrométastases pulmonaires de souris nude. Des cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP, à raison de 1,0 X 107, sont injectées par voie sous-cutanée à des souris. Les poumons frais sont prélevés à différents temps après l'injection et sont observés directement sous un microscope de fluorescence. Les résultats obtenus 35 jours après l'injection sont présentés.
La Figure 4a représente une seule micrométastase présente dans le(s) tissus frais de l'hôte. La Figure 4b représente 3 colonies de micrométastases présentes dans le(s) tissus frais de l'hôte.
La Figure 4c représente une (les) macrométastase(s) présente(s) dans le(s) tissus frais de l'hôte.
Figure 5a et 5b : elles représentent la cinétique de formation de métastases pulmonaires après injection de 1,0 X 107 cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention à des souris nude.
La Figure 5 a représente le pourcentage de souris avec des métastases détectées sous microscopie de fluorescence (O) ou macroscopiquement ( D et "*• ).
L'axe des abscisses représente le temps après l'inoculation (en jours), et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de souris avec des métastases.
Plus particulièrement, le symbole du cercle blanc (O), représente les métastases détectées sous microscopie de fluorescence (UV) après injection de cellules provenant de la lignée ceUulaire H460MGFP.
Le carré blanc ( D ) correspond à des métastases détectées macroscopiquement (à l'œil nu) après injection de cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.
Le triangle noir ( •*• ) coπespond à des métastases détectées macroscopiquement (à l'œil nu) après injection de cellules provenant de la lignée cellulaire H460M.
La Figure 5b représente la médiane du nombre de métastases par souris.
Les symboles du rond blanc, du carré blanc et du triangle noir ont les mêmes significations que celles décrites ci-dessus pour la Figure 5 a.
L'axe des abscisses représente le temps après l'inoculation (en jours), et l'axe des ordonnées représente la médiane des métastases.
Figure 6 : elle représente l'analyse par RT-PCR (Reverse transcription/Polymerase chain reaction) (Transcriptase inverse/Réaction de polymérisation en chaîne) des cellules fluorescentes transfectées par les chaînes de l'ITI ou par le vecteur seul (pIRES-Hyg ou pcDNA3). Les produits de PCR (10 μl), obtenus par ampUfication à l'aide d'oligonucléotides spécifiques (Tableau 2), ont été analysés sur gel d'agarose 2% (p/v) en tampon Tris-acétate-EDTA et visualisés sous rayonnement UV par coloration au bromure d'éthidium. Les oligonucléotides GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase) ont été utilisés comme contrôles internes de la quaUté des ARN de la cellule transfectée.
Clone L : cellules H460M FP transfectées par la cUaîne légère L de l'ITI ;
H460MGFP et pIRES-Hyg : contrôles du clone L ;
Clone H : cellules P-H460MGFP transfectées par une des chaînes lourdes (Hl, H2 ou H3) de l'ITI ;
P-H460MGFP et pcDNA3 : contrôles des clones H.
Les numéros qui suivent les lettres L ou H (Hl, H2 ou H3) conespondent aux numéros des clones.
Figure 7: elle représente l'analyse par cytofluorimètre (FACS « fluorescence- activated cell-sorting ») de l'expression de la GFP dans les cellules transfectées après deux mois de culture sans antibiotique.
L-13: clone obtenu après transfection de la lignée cellulaire H460MGFP par la chaîne légère L de l'ITI ;
Hl-203, H2-131, H3-186 : clones obtenus après transfection de la lignée cellulaire P-H460MGFP par les chaînes lourdes Hl, H2 et H3 de l'ITI ; H460MGFP et pIRES-Hyg : contrôles du clone L-13 ; P-H460MGFP et pcDNA3 : contrôles des clones Hl-203, H2-131, H3-186.
Figures 8A, 8B, 8C et 8D : les figures 8A et 8B représentent le « diagramme en boîte avec dispersion des valeurs » (« Box and whisker plots ») du poids des tumeurs primitives, et les figures 8C et 8D représentent le « diagramme en boîte avec dispersion des valeurs » du nombre de métastases pulmonaires. Les clones exprimant la chaîne légère L de l'ITI (A, C) ou une chaîne lourde H de l'ITI (B, D), aussi bien que leurs contrôles respectifs, ont été étudiés 4 semaines après l'injection sous-cutanée chez les souris nude. Les tumeurs primitives ont été excisées et pesées. Les poumons entiers ont été placés entre deux lames de verre et le nombre de métastases a été déterminé sous microscopie à fluorescence. Les résultats ont été analysés en utiUsant le test non-paramétrique de Mann-Whitney.
Différences par rapport aux contrôles : . : P < 0,05 ; .. : P < 0,01 ; ... : P < 0,001. Nombre de souris étudiées : contrôles, 16 ; clones, 8. Tableau 1 : le tableau 1 ci-dessous correspond au nombre de métastases comptées sur une période de 49 jours pour la lignée H460MGFP. Tableau 1
Figure imgf000018_0001
Le Tableau 2 ci- dessous représente les couples d'oligonucléotides utilisés pour l'ampUfication des ARNm de la chaîne légère L, des chaînes lourdes Hl, H2, H3 ou de la GAPDH.
Tableau 2
Figure imgf000019_0001
Le Tableau 3 ci-dessous représente l'analyse in vitro du chimiotactisme et de l'attachement cellulaire. La densité optique moyenne (DO), obtenue pour les deux tests à partir de 6 expériences indépendantes pour H460MGFP ou P-H460MGFP, est considérée comme représentant 100% de l'adhésion cellulaire ou du chimiotactisme. Les résultats ont été analysés à l'aide du test non paramétrique de Mann-Whitney.
Différences par rapport aux contrôles : ns, non significatif ; . , P < 0,05 ;
.. , /> < 0,01.
Tableau 3
Chimiotactisme Attachement
P P
(%) (%)
H460M°rt- 100 ± 23,5 - 100 ± 7 -
Contrôles pIRES-Hyg 103 ± 17,8 ns 100.2 ± 6,7 ns L-13 66,7 ± 8,8 * 102.3 ± 6,7 ns
L-40 67,3 ± 15,2 * 100,7 ± 6,8 ns
L-73 42,9 ± 15,9 ** 97,9 ± 7,2 ns
Clones L
L-79 51,5 ± 18,9 ** 97,7 ± 8,2 ns
L-84 52,1 ± 6,8 ** 98,8 ± 7,7 ns
L-85 44,9 ± 10,8 ** 95,6 ± 6,2 ns
P-H460Mort' 100 ± 12 100 ± 8 -
Contrôles pcDNA3 97 ± 14,8 ns 98,9 ± 6,6 ns Hl-203 98 ± 8,6 ns 146,7 ± 15 **
Clones Hl
Hl-207 101 ± 15,1 ns 153,3 ± 13 **
H2-131 103 ± 10,2 ns 96,7 ± 9 ns
Clones H2 H2-134 97 ± 16,9 ns 107,1 ± 8,6 ns
H2-138 104 ± 13,8 ns 102,2 ± 16 ns
H3-186 96 ± 16,2 ns 178 ± 18,6 **
H3-193 103 ± 17,7 ns 179,1 ± 19,7 **
Clones H3
H3-196 98 ± 16,9 ns 157,1 ± 20,7 **
H3-199 103 ± 9,6 ns 191,2 ± 16 **
La partie expérimentale ci-après concerne les «Matériels et méthodes » et les résultats obtenus respectivement pour les 3 exemples suivants :
EXEMPLE 1 : Etude de la cinétique de formation des métastases par l'utiUsation de la gnée H460MGFP.
EXEMPLE 2 : Etude de la formation des métastases à 28 jours par l'utiUsation de la Ugnée P-H460MGFP.
EXEMPLE 3 : Etude de l'effet anti-métastatique et anti-tumoral de l'ITI par l'utilisation des lignées H460MGFP et P-H460MGFP. Définition des constructions utilisées et étudiées dans les exemples 1, 2 et 3 de l'invention.
La lignée de carcinome pulmonaire humain H460MGFP exprimant la protéine fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur sauvage pERES-Hyg (Clontech), sera dénommée dans ce qui suit :
« clone pIRES-Hyg », « contrôle pIRES-Hyg », « lignée cellulaire H460MGFP exprimant le vecteur sauvage pIRES-Hyg », « lignée pIRES-Hyg » ou « pIRES-Hyg » (exemple 3).
La lignée de carcinome pulmonaire humain H460MGFP exprimant la protéine fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur pIRES-Hyg exprimant l'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI, sera dénommée dans ce qui suit :
« clone L », « lignée cellulaire H460MGFP exprimant l'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI ».
Le chiffre suivant la lettre L désigne le numéro du clone (à titre d'exemple « L- 13 » désigne le clone L n°13) (exemple 3).
La Ugnée de carcinome pulmonaire humain P-H460MGFP exprimant la protéine fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur sauvage pcDNA3 (Invitrogen), sera dénommée dans ce qui suit :
« clone pcDNA3 », « contrôle pcDNA3 », « lignée cellulaire P-H460MGFP exprimant le vecteur sauvage pcDNA3 », « lignée pcDNA3 » ou « pcDNA3 » (exemple
3).
La Ugnée de carcinome pulmonaire humain P-H460MGFP exprimant la protéine fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde Hl de l'ITI, sera dénommée dans ce qui suit : « clone Hl », « lignée cellulaire P-H460MGFP exprimant l'ADNc de la chaîne lourde Hl de l'ITI ».
Le chiffre suivant Hl désigne le numéro du clone (à titre d'exemple « Hl-203 » désigne le clone Hl n°203) (exemple 3).
La Ugnée de carcinome pulmonaire humain P-H460MGFP exprimant la proteme fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H2 de l'ITI, sera dénommée dans ce qui suit :
« clone H2 », « lignée cellulaire P-H460MGFP exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H2 de l'ITI ». Le chiffre suivant H2 désigne le numéro du clone (à titre d'exemple « H2-131 » désigne le clone H2 n°131) (exemple 3).
La Ugnée de carcinome pulmonaire humain P-H460MGFP exprimant la protéine fluorescente verte GFP, transfectée de façon stable par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H3 de l'ITI, sera dénommée dans ce qui suit :
« clone H3 », « lignée cellulaire P-H460MGFP exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H3 de l'ITI ».
Le chiffre suivant H3 désigne le numéro du clone (à titre d'exemple « H3-186 » désigne le clone H3 n °186) (exemple 3).
Par ailleurs, lors des études effectuées ci-dessous (exemple 3), les clones L seront comparés aux témoins suivants :
- Ugnée H460M^ (correspondant au témoin « lignée fluorescente non transfectée par un autre vecteur »),
- lignée pIRES-Hyg (correspondant au témoin « Ugnée fluorescente H460MGFP transfectée par le vecteur vide pIRES-Hyg »).
D'autre part, les clones Hl, H2 ou H3 seront comparés aux témoins suivants :
- Ugnée P-H460M (correspondant au témoin « lignée fluorescente non transfectée par un autre vecteur »),
- lignée pcDNA3 (correspondant au témoin « lignée fluorescente P-H460MGFP transfectée par le vecteur vide pcDNA3 »).
A titre illustratif, les liens d'affiliation des différentes lignées sont illustrés dans le diagramme ci-dessous :
Figure imgf000022_0001
La Ugnée H460M dérive de la lignée NCI-H460. H460M a été transfectée :
- d'une part par le vecteur d'expression pEGFP-Cl exprimant la GFP, aboutissant à l'obtention de la Ugnée H460MGFP,
- d'autre part, par le vecteur d'expression pEGFP-IRES-Puro exprimant la GFP, aboutissant à l'obtention de la Ugnée P-H460MGFP.
Ces deux dernières lignées fluorescentes ont été utilisées comme base pour l'exemple 3.
Matériels et Méthodes
I. Culture cellulaire
1. La Ugnée ceUulaire H460M
La Ugnée ceUulaire H460M dérive de la lignée NCI-H460, établie à partir d'un carcinome pulmonaire à larges cellules d'un patient non traité. La Ugnée H460M a été étabUe par injections successives des cellules d'une métastase pulmonaire obtenue après injection des cellules NCI-H460 à des souris nude. La lignée H460M devient métastatique au niveau pulmonaire chez la souris nude après injection sous-cutanée. Une série d'injections sous-cutanée de cellules de métastases pulmonaires obtenues avec
NCI-H460 a permis la sélection de la lignée H460M. Celle-ci est caractérisée par une augmentation de son potentiel métastatique comparé à celui de la Ugnée parentale NCI- H460.
2. Condition de culture
a- MiUeux de culture
Le milieu de culture complet est composé de milieu RPMI 1640 (« Roswell Park Mémorial Institue ») (Life Technologies) contenant 10% (v/v) de sérum de veau fœtal
(SVF) (Roche) et 2 mM de L-glutamine (Sigma).
Le milieu de culture sélectif de l'exemple 1 ci-après (concernant la lignée H460MGFP) est composé de RPMI 1640 contenant 10% (v/v) de SVF, 2mM de L- glutamine et 400 μg.ml"1 de généticine (G418 sulfate, Life Technologies). Le milieu de culture sélectif de l'exemple 2 ci-après (concernant la lignée P- H460MGFP) est composé de RPMI 1640 contenant 10% (v/v) de SVF, 2mM de L- glutamine et 1,2 μg.ml"1 de puromycine (Clontech).
Le miUeu de culture sélectif de l'exemple 3 ci-après (concernant les lignées exprimant les ADNc de l'ITI (clones L, Hl, H2 et H3) ou les vecteurs sauvages pcDNA3 et pIRES-Hyg) est composé de RPMI 1640 contenant 10% (v/v) de SVF, 2mM de L-glutamine et de :
- 200 μg.ml"1 d'hygromycine B (Clontech) pour les clones transfectés par l'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI ou par le vecteur sauvage pIRES-Hyg, - 400 μg.ml"1 de généticine pour les clones transfectés par les ADNc des chaînes lourdes Hl, H2 ou H3 de l'ITI, ou par le vecteur sauvage pcDNA3.
Le milieu de culture utilisé pour les expériences in vitro est composé de RPMI 1640 contenant 2 mM de L-glutamine et 0,1% (p/v) d'albumine de sérum bovin (BSA).
Le miUeu activé (ou chimioattractant) est obtenu à partir de cellules H460M cultivées pendant 4 à 5 jours dans du milieu RPMI 1640 contenant 2 mM de L- glutamine et 0,1% (p/v) BSA. Ce milieu est collecté, centrifugé à 12000 rpm (sigma 2 kl5, rotor n° 12145) à 4°C pendant 10 minutes et le surnageant est conservé à -20°C.
b- Culture
Les lignées H460M et H460MGFP (voir exemple 1 ci-après) sont manipulées dans une enceinte stérile à flux laminaire vertical (Hotte cytair 125, Flufrance) et cultivées dans un incubateur à 37°C sous une atmosphère contrôlée : 5% C02, 95% air atmosphérique, 90% d'hygrométrie (incubateur MCO 175, Sanyo). Ces lignées adhérentes sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 complet. Les techniques d'entretien indispensables sont le changement de milieu, consistant à éliminer le milieu appauvri, et le repiquage, permettant le transfert des cellules recouvrant toute la surface du support dans de nouveaux flacons.
Ces techniques sont identiques pour les Ugnées des exemples 2 et 3.
3. Repiquage des cellules Le détachement des cellules adhérents au support est réalisé par action enzymatique de la trypsine. Le tapis cellulaire est rincé deux fois dans une solution de tampon phosphate (PB S) (χl) (Life Technologies) dépourvue en ions calcium et magnésium afin d'éliminer toute trace de SVF inhibant la trypsine. Pour un flacon de 75 cm2, 1 ml de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) 10 mM (Sigma) préchauffée à 37°C permet le décrochage des cellules de leur support plastique en 1 à 2 minutes. L'action de la trypsine est stoppée par ajout de 10 ml de milieu de culture complet. Les cellules ainsi récupérées sont pipetées à plusieurs reprises afin d'obtenir une suspension de cellules isolées. Les cellules d'un flacon à 100% de confluence sont repiquées au 1/10 dans un nouveau flacon puis incubées à 37°C. Le milieu de culture est changé dès le lendemain du repiquage.
4. Congélation
Les ceUules d'un flacon de 75 cm2 à 80% de confluence sont lavées puis soumises à l'action de la trypsine comme décrit dans le paragraphe précédent. Elles sont reprises dans 10 ml de milieu de culture complet, centrifugées 5 minutes à 1200 rpm (C3-12, Jouan) à température ambiante. Le culot cellulaire est resuspendu dans 1,8 ml de miUeu RPMI 1640 contenant 2mM de L-glutamine et 30% de SVF. Cette suspension est répartie dans deux tubes de congélation puis 0,9 ml de milieu complet contenant 20% de
DMSO (diméthylsulfoxyde) (Sigma) sont ajoutés goutte à goutte. Les cryotubes sont placés dans une boîte à congélation permettant une diminution de température de l0C.minute"' jusqu'à -80°C, puis placés directement dans l'azote liquide (-180°C) afin d'y être conservés.
5. Remise en culture de cellules congelées
Une décongélation rapide permet de ne pas abîmer les cellules congelées en présence du DMSO cryoprotecteur qui peut s'avérer être toxique pour les cellules. La suspension cellulaire est diluée dans 2 ml de milieu RPMI 1640 contenant 2mM de L- glutamine et 20% de SVF. Elle est délicatement agitée à la pipette, ajustée à un volume final de 15 ml puis les cellules sont ensemencées dans un flacon de culture de 75 cm2. Après une incubation d'une nuit à 37°C, le miUeu de culture est remplacé par du milieu RPMI 1640 complet. II. Constructions utilisées pour la transfection des cellules (exemple 3)
Clone L
L'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI humain a été clone dans le vecteur d'expression pIRES-Hyg (Clontech laboratories, Palo Alto, USA). Ce vecteur bicistronique code le gène de résistance à l'hygromycine B (hygromycine B phosphotransférase). Le fragment contenant cet ADNc s'étend de 64 pb en amont du codon d'initiation de la transcription, jusqu'à 44 pb en aval du codon stop et code à la fois l'αi-microglobuline et la bikunine. Ce fragment est inséré entre les sites BamHÎ et BstXl du vecteur pIRES-Hyg. La caractérisation de cette construction a démontré que la synthèse et la maturation de l'αi-microglobuline et de la bikunine sont réalisées correctement (données non montrées).
Clones H1, H2 et H3 Les constructions permettant l'expression de l'ADNc des chaînes lourdes Hl, H2 ou H3 de l'ITI humain ont été précédemment décrites et caractérisées [31]. Ces ADNc ont été intégrés dans le vecteur d'expression pcDNA3, qui code également le gène de résistance à la Généticine G418 sulfate.
III. Transfection des cellules
A. Technique du phosphate de calcium : transfection des cellules H460M
1. Principe
L'ADN, par ses groupements phosphates, complexe les ions Ca++ en formant un fin précipité. Lorsqu'un tel précipité, fraîchement préparé, est mis en contact de la cellule en culture, une internalisation du complexe dans la cellule est observée. Cette intemalisation semble résulter d'une phagocytose des grains d'ADN-calcium. Quelques cellules seulement intègrent cet ADN au hasard dans leur génome de manière spontanée. Il en résulte une modification dite stable qui se transmettra aux cellules filles. 2. Tampons et solutions
Le tampon HEPES (χ2) (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthane sulfonique) comprenant 40 mM d'HEPES, 270 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 7 mM de Na2HP04, 12 H20 et 11 mM de D-glucose est filtré sur un filtre de 0,22 μm (milUpore) puis conservé à 4°C.
La solution de CaCl2 est préparée à une concentration de 2 M, filtrée, aliquotée puis gardée à -20°C. La solution de glycerol se compose de 15% (v/v) de glycerol en tampon HEPES (xl). Le tampon TE 10/1 (Tris-HCl 10 mM/EDTA ImM) se compose du 10 mM Tris-
HC1, pH = 8, et de l'EDTA ImM, pH = 8.
3. Transfection
La veille de la transfection, les cellules H460M sont ensemencées à 2.106 cellules dans une boîte de Pétri de 60 mm de diamètre. Le mélange de transfection est réaUsé dans un tube stérile en plaçant 10 μg d'ADN en tampon TE 10/1 dont le volume final est complété avec de l'eau stérile à 440 μl, additionné de 500 μl de tampon HEPES (x2). Le mélange est agité vigoureusement puis incubé 10 mmutes à température ambiante. 60 μl de CaCl2 2 M sont mélangés au milieu réactionnel. L'ADN est ensuite laissé au contact du CaCl2 pendant 10 minutes à température ambiante, et ce mélange réactionnel est agité doucement toutes les 2 à 3 minutes . Le milieu de culture est ensuite aspiré puis, le précipité formé par les groupements phosphates de l'ADN et les ions Ca++ est réparti de façon homogène sur le tapis cellulaire toutes les 10 minutes pendant 30 minutes. Après chaque addition, les cellules sont incubées à 37°C. Passé ce temps d'incubation, 5 ml de miUeu DMEM (« Dulbecco's Modified Eagle Médium ») contenant 10% de SVF sont ajoutés dans chaque boîte puis les cellules sont incubées de nouveau pour une durée de 4 à 6 h à une température de 37°C. Le miUeu et le précipité sont éliminés et le rendement de la transfection est optimisé par un choc au glycerol : 2 ml d'une solution de glycerol à 15%, préalablement chauffé à 37°C, sont mis au contact des cellules pendant 2 minutes. Le glycerol est remplacé par 10 ml de milieu RPMI complet. Les cellules sont ensuite incubées pendant 24 h à 37°C.
La variation de la morphologie des cellules peut être observée au microscope photonique inversé (CK2, Olympus). B. Technique du Fugene 6
La technique du Fugene-6 a été utilisée pour la transfection :
- de la lignée cellulaire H460MGFP par le vecteur pIRES-Hyg sauvage, ou par le vecteur pIRES-Hyg exprimant l' ADNc de la chaîne légère L de l'ITI, - de la lignée cellulaire P-H460MGFP par le vecteur pcDNA3 sauvage, ou par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde Hl de l'ITI, ou par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H2 de l'ITI, ou par le vecteur pcDNA3 exprimant l'ADNc de la chaîne lourde H3 de l'ITI.
Les transfections ont été effectuées :
GFP
- sur des cellules H460M proches de la confluence (pour l'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI et le vecteur pIRES-Hyg sauvage (Clontech)) ou,
- sur des cellules P-H460MGFP (pour les ADNc des chaînes lourdes Hl, H2 ou H3 de l'ITI et le vecteur pcDNA3 sauvage (Invitrogen)) en utilisant le Fugene-6 (Roche, Meylan, France).
Un jour avant la transfection, les cellules sont ensemencées à une densité de 3 x 105 cellules dans une boîte de culture de 35 mm de diamètre (Corning Costar, Brumath, France). Pour la transfection, 6 μl du réactif Fugene-6 ont été dilués dans 94 μl de miUeu sans sérum. La solution est ensuite incubée pendant 10 min avec 2 μg de vecteur puis ajoutée aux cellules. Les cellules sont ensuite trypsinées 24 heures après la transfection et cultivées à un ratio de 1 : 10 dans du milieu sélectif contenant :
- 200 μg.ml"1 d'hygromycine B (Clontech) pour les cellules transfectées par l'ADNc de la chaîne légère L de l'ITI et le vecteur pIRES-Hyg sauvage ou,
- 400 μg.ml"1 de généticine G418 sulfate (Life Technologies, Pontoise, France) pour les cellules transfectées par les ADNc des chaînes lourdes Hl, H2, H3 de l'ITI et le vecteur pcDNA3 sauvage.
10 à 14 jours après le début de la sélection, les colonies de cellules survivantes sont récupérées. Des Ugnées parfaitement pures sont ensuite obtenues par dilution limite. Les clones sont ensuite analysés pour l'expression des chaînes L, Hl, H2 ou H3 de l'ITI par RT-PCR (Figure 6).
Microscopie et analyse de la fluorescence par cytofluorimètre (FACS) (Exemples 1, 2 et 3 ci-après). L'évaluation microscopique de l'expression de la GFP dans les lignées cellulaires a été effectuée par observation directe des cellules en utilisant un microscope à fluorescence (Axiovert 10, Zeiss) équipé d'un filtre adapté pour le FITC (filtre d'excitation BP450-490; filtre de suppression LP520) (Fig. 1B). La fluorescence des lignées cellulaires a été analysée par FACS (FACS Calibur, Becton Dickinson, Omaha,
CA) avec une longueur d'onde d'excitation standard à 488 nm (Figure 7).
Technique d'analyse par RT-PCR (Exemples 1, 2 et 3 ci-après).
Les ARN ont été extrait des lignées cellulaires (P-H460MGFP, H460MGFP, pcDNA3, pIRES-Hyg, clones L, Hl, H2 et H3) à l'aide d'une trousse d'extraction des ARN (RNA Insta-Pure, Eurogentec, Belgium). Les séquences des oligonucléotides utiUsés pour détecter la transcription des gènes L, Hl, H2 or H3 ont été obtenues à partir de séquences humâmes déjà publiées [18-21] (Tableau 2). Les oligonucléotides de la GAPDH [22] ont été utiUsés comme contrôle interne de la qualité des ARNm.
L'ADNc a été synthétisé à partir de 1 μg d'ARN totaux en utiUsant la Tth DNA polymerase (Eurobio, les Ulis, France). Le mélange réactionnel de la transcription inverse (RT) contient :
- 5 unités de Tth, (fournie par Eurobio) - 1 μl de tampon RT (contenant 670 mM Tris-HCl pH 8,8 ; 166 mM (NH )2SO4)
(Eurobio),
- 750 nM des oligonucléotides de RT,
- 1 mM MnCl2 (Eurobio),
- 200 μM de chaque dNTP, - de l'eau distillée pour ajuster le volume à 10 μl.
La RT est réalisée par un appariement à 58°C de 15 min et une transcription à 70°C de 15 min. Le mélange réactionnel pour l'amplification, contenant :
- 10 μl de tampon PCR (335 mM Tris-HCl pH 8,8 ; 83 mM (NH4)2SO4 ; 3,75 mM EGTA ; 25% glycerol ; 0,1% Tween 20) (Eurobio), - 1,5 mM MgCl2 (Eurobio),
- 150 mM d'oUgonucléotides de PCR et,
- de l'eau distillée pour ajuster le volume à 40 μl, a été additionné aux produits de RT. 35 cycles de PCR sont effectués avec une dénaturation à 95°C de 2 min, un appariement à 58°C de 1 min, une extension à 72°C de 1 min et une étape d'extension supplémentaire à 72°C de 7 min.
Le contrôle négatif a été obtenu en remplaçant TARN par de l'eau distillée. Les produits de PCR (10 μl) ont été analysés sur un gel d'agarose à 2% en tampon Tris- acétate-EDTA et visualisés par coloration au bromure d'éthidium sous illumination ultra violette (Figure 6).
Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test non paramétrique de Mann- Whitney. La différence entre les contrôles et les groupes expérimentaux est considérée comme statistiquement significative à P < 0,05.
Le tableau ci-dessous représente le nombre de souris étudiées pour l'exemple 3. L'analyse de chaque souris a permis d'obtenir une valeur pour le nombre de métastases pulmonaires et deux valeurs pour la masse des tumeurs primitives.
Figure imgf000030_0001
Résultats
I. Sélection de clones stables
EXEMPLE 1 (Ugnée H460MGFP)
Le gène de résistance à la généticine porté par le vecteur pEGFP-Cl (Invitrogeή) introduit dans les cellules H460M, leur confère la propriété de pousser dans un milieu sélectif contenant cet antibiotique. 24 h après la transfection, les cellules sont soumises à la trypsine puis repiquées au 1/10 dans du milieu RPMI 1640 complet contenant 400 μg.ml"1 de généticine (G418 sulfate, Life Technologies). Ce milieu sélectif est renouvelé tous les 3 à 4 jours. Après environ une semaine, des clones résistants au G418 sulfate commencent à apparaître. Quand ces clones forment des colonies composées d'environ 1.103 cellules (visibles à l'oeil nu), les cellules sont lavées avec 2 x 5 ml de PBS dépourvu en ions calcium et magnésium . Une goutte de 5 μl de trypsine-EDTA lOmM est déposée sur des colonies ceUulaires, pipetée plusieurs fois afin de décoller les cellules de la boîte. Chaque clone est aussitôt transféré dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml de milieu sélectif. A 100%o de confluence, elles sont repiquées dans une plaque de 6 puits dans 4 ml de miUeu sélectif. La présence du gène de la Green Fluorescen Protein (GFP) est détectée au microscope à fluorescence (Axiovert 10, Zeiss, filtre d'excitation BP450-490, filtre de suppression LP520 ).
Parmi les clones cellulaires positifs, le clone intitulé H460MGFP a été sélectionné (Figure 1). Ce clone exprime la GFP avec une très forte intensité. La mise en culture de ce clone en milieu RPMI complet et sans pression de sélection pendant 90 jours (15 passages), montre une grande stabilité de l'expression du gène de la GFP.
EXEMPLE 2 (lignée P-H460MGFP)
La sélection de clones stables est identique à celle de l'exemple 1 aux différences près suivantes :
- le gène de résistance à la puromycine porté par le vecteur pEGFP-fRES-Puro (Clontech) introduit dans les cellules H460M, leur confère la propriété de pousser dans un milieu sélectif contenant cet antibiotique, - 24 h après la transfection, les cellules sont soumises à la trypsine puis repiquées au 1/10 dans du miUeu RPMI 1640 complet contenant 1,2 μg.ml"1 de puromycine (Clontech).
Parmi les clones cellulaires positifs, le clone intitulé P-H460MGFP a été sélectionné car il exprime la GFP avec une très forte intensité.
EXEMPLE 3 (lignées exprimant les ADNc de l'ITI : clones L, Hl, H2 et H3)
* Sélection des clones exprimant la chaîne légère L de l'ITI : La sélection de clones stables est identique à celle de l'exemple 1 aux différences près suivantes :
- le gène de résistance à l'hygromycine B porté par le vecteur pE ES-Hyg (Clontech) introduit dans les cellules H460MGFP, leur confère la propriété de pousser dans un miUeu sélectif contenant cet antibiotique, - 24 h après la transfection, les cellules sont soumises à la trypsine puis repiquées au 1/10 dans du miUeu RPMI 1640 complet contenant 200 μg.ml"1 d'hygromycine (Clontech) (pour la sélection de cellules exprimant la chaîne légère L de ÎTTI) et 400 μg.mi"1 de généticine G418 (pour maintenir l'expression de la GFP).
Plusieurs clones cellulaires résistants ont été repiqués puis analysées par RT-PCR (Figure 6).
Sélection des clones exprimant une chaîne lourde :
La sélection de clones stables est identique à celle de l'exemple 1 aux différences près suivantes : - le gène de résistance à la Généticine G418 sulfate porté par le vecteur pcDNA3
(Invifrogen) introduit dans les cellules P-H460M°FP, leur confère la propriété de pousser dans un milieu sélectif contenant cet antibiotique,
- 24 h après la transfection, les cellules sont soumises à la trypsine puis repiquées au 1/10 dans du miUeu RPMI 1640 complet contenant 1,2 μg.ml-1 de puromycine (Clontech) (pour maintenir l'expression de la GFP) et 400 μg.ml"1 de Généticine G418
(pour la sélection de cellules exprimant les chaînes lourdes Hl, H2 et H3 de l'ITI).
Plusieurs clones cellulaires résistants ont été repiqués puis analysées par RT-PCR (Figure 6). IL Etude in vitro
Les expériences ci-dessous ont été effectuées afin de déterminer si les cellules transfectées provenant de la lignée cellulaire H460MGFP (exemple 1), ont subi des altérations de leurs propriétés biologiques, par rapport aux cellules non transfectées provenant de la Ugnée cellulaire H460M.
1. Croissance cellulaire
La croissance cellulaire est déterminée en ensemençant 6.104 cellules dans un flacon de 25 cm2. De façon quotidienne, un flacon de culture est soumis à l'action de la trypsine et les cellules sont récupérées dans 2 x 5 ml de milieu RPMI 1640 complet. Les ceUules sont centrifugées 5 minutes à 1200 φm (C3-12, Jouan), puis le surnageant est aspiré. Le culot cellulaire est repris dans 1 à 5 ml de milieu RPMI 1640 complet et les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre appelé la cellule de Malassez.
Le temps de doublement est déterminé sur la courbe de croissance (Figure 2) tracée à l'aide de ces données. Chaque point de la courbe représente la moyenne de trois expériences différentes et indépendantes.
Aucune différence n'est observée dans la moφhologie cellulaire (données non montrées) ou dans les taux de prolifération cellulaire entre la Ugnée cellulaire parentale
H460M et la lignée cellulaire H460MGFP. Le temps de doublement est de 18 à 24 heures pour les deux lignées cellulaires.
Ce résultat est identique pour les lignées des exemples 2 et 3.
2. Invasion (exemple 1)
L'invasivité des cellules est déterminée par utilisation d'un système de Boyden modifié [16, 17], commercialisé sous le nom de Transwell (Corning Costar, réf. 3428).
a- Tampon et solutions
Le mélange alcool-acide acétique 2% est composé de 98% (v/v) d'éthanol 95° et de 2% d'acide acétique. La solution de Crystal-violet est constituée d'eau contenant 0,1% (p/v) de colorant Crystal- violet (Sigma).
b- Le gel matriciel (Matrigel)
Le gel matriciel, commercialisé sous le nom de « Matrigel Basemont Membrane Matrix » (Collaborative Research Product) est une préparation de membrane basale d'un sarcome de souris riche en protéines de la matrice extracellulaire. L'enrobage de la membrane par le gel matriciel est effectué sur de la glace avec du matériel froid (cônes, pipettes, ...) afin d'éviter une gélification trop rapide de celui-ci.
Le système de Boyden modifié, permettant d'étudier l'invasion cellulaire (Transwell. Corning Costar) a une membrane en polycarbonate de 24 mm, à pore de 8 μm de diamètre, et est recouvert avec 0,1 μg.mm"2 de gel matriciel (Becton Dickinsoή). La plaque est placée à 37°C pendant 30 minutes, puis séchée stérilement sous hotte toute la nuit. Le gel matriciel est réhydraté durant lh à température ambiante avec 1 ml de RPMI 1640, puis la membrane est lavée deux fois avec 1 ml de ce milieu afin d'éliminer tout trace de gel matriciel non lié qui pourrait interférer avec les cellules.
c- Test d'invasion
400 μl d'une suspension cellulaire à 1.106 cellules.mr1 de milieu RPMI 1640 à 0,1% de BSA et 2 mM de L-glutamine sont répartis de façon homogène sur la membrane. Le puits est rempli par 1,8 ml de miUeu activé. Après 24h d'incubation à 37°C, le milieu du compartiment supérieur de la membrane est prélevé et les cellules sont fixées en plaçant le système de Boyden modifié (Transwell) dans le bain alcool- acide acétique 2% pendant 15 minutes. Les cellules non invasives du compartiment supérieur ainsi que le gel matriciel sont déUcatement retirés à l'aide d'un coton fixé sur un cure dent. Le système de Boyden modifié (Transwell) est ensuite rincé à l'eau avant d'être séché à l'air libre. Les cellules invasives sur la surface inférieure de la membrane sont colorées. La coloration est réaUsée en plaçant le système de Boyden modifié
(Transwell) dans une solution de colorant Crystal-violet pendant 30 minutes à lh. Celui- ci est lavé 2 à 3 fois à l'eau pendant 5 minutes. La surface supérieure de la membrane est à nouveau déUcatement nettoyée à l'aide d'un coton tige jusqu'à ce que toute trace de colorant ait disparue. Le nombre de cellules invasives est déterminé sous microscopie en lumière blanche.
La capacité d'invasion à travers le gel matriciel est la même pour les deux lignées cellulaires H460M et H460MGFP.
3. Migration
A. Première technique (exemple 1)
La migration des cellules H460M et H460MGFP est effectuée de la même manière que le test d'invasion hormis la présence de Matrigel.
La capacité de migrer est également la même pour les deux lignées cellulaires H460M et H460MGFP.
B. Deuxième technique (exemples 1, 2 et 3)
La migration des cellules (H460MGFP, P-H460MGFP, pIRES-Hyg, pcDNA3, clones L et Hl, H2, H3) est effectuée de la même manière que le test d'invasion, honnis la présence de Matrigel et la façon de dénombrer les cellules. En effet, après avoir nettoyé la surface supérieure du Transwell à l'aide d'un coton tige, le colorant incoφoré dans les cellules ayant migré est dissous en plaçant le Transwell dans 1 ml d'acide acétique 10% (v/v) pendant 5 minutes. Cette solution est récupérée, puis sa densité optique (DO) est déterminée à 588 nm.
Les DO moyennes des lignées H460MGFP et P-H460MGFP, obtenues à partir de 6 expériences indépendantes, sont considérées comme représentant 100% de la migration cellulaire.
Les résultats obtenus montrent que, alors qu'aucune différence ne peut être observée entre les clones exprimant les chaînes lourdes et les contrôles conespondants au niveau du chimiotactisme, les clones exprimant la chaîne légère de l'ITI révèlent une baisse statistiquement significative du chimiotactisme (moyenne des clones 53,8 ± 15,7%) (Tableau 3). Ceci suggère que la chaîne L de l'ITI peut agir in vivo comme un inhibiteur de la dissémination des métastases. 4. Adhésion
A. Première technique (exemple 1)
Les cellules H460M et H460MGFP sont ensemencées à 1.105 cellules.mr1 dans une plaque à 6 puits de 35 mm de diamètre. Après 2h à 37°C, les cellules non attachées sont éliminées par deux lavages en PB S. Les cellules sont ensuite fixées et colorées comme décrit précédemment pour le test d'invasion puis dénombrées.
On n'observe pas de différence significative entre les deux Ugnées cellulaires H460M et H460MGFP quant à leurs propriétés d'adhérence.
B. Deuxième technique (exemples 1, 2 et 3)
5 x 105 cellules (H460MGFP, P-H460MGFP, pIRES-Hyg, pcDNA3, clones L et Hl, H2, H3) sont déposées dans une plaque de 6 puits de 35 mm de diamètre plate (Corning
Costar, Brumath, France) préalablement traitée par 10 μg.ml"1 de Matrigel (Becton Dickinson Labware, Bedford, NJ). Après 30 min à 37°C, les cellules non attachées sont retirées par aspiration du milieu et par deux rinçages doux en PBS (phosphate-buffered saline). Les cellules sont ensuite fixées en alcool acétique (2% (v/v) d'acide acétique dans de l'éthanol à 95°) pendant 10 min puis colorées par une solution de cristal violet à
0,1% (p/v) pendant 30 min. Les puits sont ensuite lavés trois fois pendant dix minutes dans de l'eau puis séchés à l'air libre. Le colorant est ensuite dissous durant 5 min dans 1 ml d'acide acétique à 10% (v/v) et la densité optique (DO) est mesurée à 588 nm.
Les DO moyennes des lignées cellulaires contrôles H460MGFP et P-H460MGFP, obtenues à partir de 6 expériences indépendantes, sont considérées comme représentant
100% de l'adhésion cellulaire.
Les résultats obtenus montrent une augmentation statistiquement significative pour l'attachement cellulaire pour les clones exprimant la chaîne lourde Hl de l'ITI (152 ± 7%) ou la chaîne lourde H3 de l'ITI (180 ± 11%), lorsqu'ils sont comparés aux contrôles, tandis que les variations observées pour les clones exprimant la chaîne légère
L de l'ITI (98,7 ± 6%) ou la chaîne lourde H2 de l'ITI (104 ± 15%) ne sont pas significativement différentes des contrôles (Tableau 3). 5. Conclusion
Pour l'exemple 1, les données ci-dessus indiquent que la machinerie cellulaire responsable de l'adhérence, du chimiotactisme et de l'invasion, n'est pas altérée par l'expression de la GFP (Figure 3).
Pour l'exemple 3, les expériences de chimiotactisme ont montré, alors qu'aucun n'effet n'est détectable avec les chaînes lourdes de l'ITI, que les clones exprimant la chaîne légère L de ÎTTI ont une baisse de leur potentiel de migration. Il semblerait donc que la bikunine (issue de la maturation de la chaîne légère L) peut agir in vivo comme un inhibiteur de la dissémination des métastases, certainement grâce à son pouvoir d'inhibition des protéases. L'adhésion cellulaire sur une membrane basale reconstituée (Matrigel) n'est pas modifiée pour les clones exprimant les chaînes L et H2, tandis que les clones exprimant les chaînes Hl et H3 voient leur adhérence augmenter sur cette matrice ce qui peut potentiellement empêcher la dissémination de ces cellules in vivo.
III. Etude in vivo
L'étude in vivo a pour but de mimer la formation de métastases pulmonaires spontanées.
Afin de tester la capacité des cellules H460MGFP à produire des métastases fluorescentes spontanées, ces cellules sont injectées chez des souris nude par voie sous- cutanée (exemple 1).
Il en est de même pour les exemples 2 et 3. Le but de l'exemple 3 étant plus particulièrement, par utilisation des exemples 1 et 2, de déterminer l'impact de l'expression des différentes chaînes de l'ITI sur la formation des métastases et sur la croissance des tumeurs primitives.
1. Les souris
Les animaux utilisés pour ces expériences sont des souris femelles Swiss homozygotes nu/nu âgées de 5 à 7 semaines. Ces animaux sont maintenus sous conditions stériles durant tout le temps de l'expérience. 2. Injection et dénombrement des métastases
L'injection et le dénombrement des métastases est effectuée de la manière suivante dans l'exemple 1 : 200 μl de milieu RPMI 1640 contenant 5.106 cellules H460M°FP sont injectées de façon sous-cutanée dans chaque flanc des souris Swiss. A des temps variables, les souris sont sacrifiées puis autopsiées. Les tumeurs primaires sont excisées puis pesées. Les poumons sont récupérés, lavés en PBS, puis aplatis entre deux lames de verre liées entre elles par du film adhésif. L'épaisseur du poumon entre celles-ci est inférieure à 1 mm. Les métastases sont dénombrées sous microscope inversé à fluorescence (Axiovert 10,
Zeiss) équipé d'un filtre FITC (Fluorescein Isothiocyanate).
Le nombre total de métastases est obtenu en observant la totalité du poumon. Après deux semaines, on observe, sous microscope à fluorescence, des micrométastases chez 100%) des animaux, présentes au niveau des nodules lymphatiques (données non montrées) et du tissu pulmonaire (Figure 4). Par contre, au même moment, aucune métastase n'a pu être observée sous lumière blanche des mêmes organes. Les autres organes ne présentent pas de métastases fluorescentes. Ces données montrent la capacité de colonisation sélective du poumon par les cellules H460MGFP chez les souris nude.
Les techniques utilisées dans les exemples 2 et 3 sont identiques à celle de l'exemple 1. La seule différence réside dans le fait que les animaux ont été sacrifiés à une date unique de 28 jours. Le nombre de métastases pulmonaires obtenues est indiqué à la Figure 8.
3. Cinétique de formation des métastases pulmonaires
Exemple 1 (lignée H460MGFP) :
La cinétique de formation des micro- et macrométastases pulmonaires, est illustrée par la Figure 5.
Seules deux semaines ont été nécessaires pour observer des métastases fluorescentes chez 100% des animaux. Par contre, le temps nécessaire pour détecter des métastases sous lumière blanche chez 50 % des animaux varie entre 33 et 42 jours pour les Ugnées cellulaires H460 et H460MGFP respectivement (Figure 5a). De plus, le nombre de métastases fluorescentes détectables augmente fortement après 35 jours, tandis que le nombre de métastases qui pourraient être détectées sous lumière blanche augmente lentement durant ce temps pour les deux lignées cellulaires (Figure 5b). L'étendue comparative des métastases obtenues sous lumière blanche ou UV illustre l'intérêt de l'expression de la GFP pour déterminer le nombre de métastases. Après 49 jours, le nombre et la taille des macrométastases pourrait gêner la détermination du nombre total de métastases fluorescentes (Tableau 1).
Exemples 2 et 3 : Sur la base de travaux antérieurs des Inventeurs [27], les souris ont été sacrifiées
28 jours après inoculation, ce qui permet une détermination précise du nombre de métastases par examen en microscopie à fluorescence. De plus, dans ces exemples, la masse médiane des tumeurs primitives a été calculée.
Comme décrit dans la Figure 8, le poids des tumeurs primitives induites par les clones exprimant la chaîne L (interquartile moyen : 0,1-0,5 g) est statistiquement plus faible que celui des contrôles (1,3-3 g). Inversement, les variations observées pour les clones exprimant les chaînes lourdes ne sont pas significatives lorsqu'elles sont comparées aux témoins (Fig. 8, A et B).
L' interquartile représente 95% de la population étudiée. Au niveau des métastases, bien que quelques rares souris présentant une invasion des gangUons lymphatiques proximaux aient été observées, les cellules fluorescentes sont locaUsées dans les poumons uniquement, ce qui reflète une affinité très importante pour ce tissu des cellules H460MGFP et P-H460MGFP. L'expression des chaînes de l'ITI n'induit pas de bouleversement de cette affinité. Aucune métastase macroscopique n'a pu être détectée à l'œil nu ou par examen microscopique en lumière normale. Par contre, les cellules fluorescentes sont facilement détectables sous microscope à UV. Le nombre estimé de cellules contenu dans les métastases varie de 1 à 1000. La petite taille de ces métastases permet d'éviter une supeφosition empêchant un dénombrement et une estimation correcte de celles-ci. L'étude du nombre de métastases pulmonaires (Fig. 8, C et D) a révélé une baisse statistiquement significative pour les clones exprimant les chaînes L, Hl ou H3 (lorsque ce nombre est comparé aux témoins appropriés) :
- pour les clones exprimant la chaîne légère de l'ITI, l' interquartile moyen est de 0-14 métastases contre 24-61 métastases pour les contrôles, pour les clones exprimant la chaîne lourde Hl ou H3 de l'ITI, ces interquartiles moyens sont de 5-19 et 8-34 respectivement contre 56-101 métastases pour les contrô Mleess.. D'autre part, les clones exprimant la chaîne H2 ne diffèrent pas des contrôles (Fig.
8).
IV Conclusion
Exemple 1 : On n'observe aucune altération significative des caractéristiques moφhologiques et biologiques, telles que la prolifération, le chimiotactisme, l'adhésion et l'invasion cellulaire, pour la Ugnée cellulaire H460MGFP comparée à la lignée H460M. La lignée H460M sélectionnée, conserve sa capacité de former des métastases pulmonaires, et permet la détection précoce de micrométastases exclusivement dans le poumon, ce qui monfre une affinité spéciale de ces cellules pour l'endothéUum pulmonaire. La fluorescence de la GFP ne requiert aucune préparation et peut être visualisée dans les tissus frais sans interférence avec la GFP endogène. La quantité significative de métastases fluorescentes pulmonaires obtenues en utilisant le modèle selon l'invention, démontre in vivo que la lignée cellulaire H460MGFP est stable à long terme vis-à-vis de la GFP, et montre que sa capacité à former des métastases pulmonaires n'a pas été modifiée.
L'utilisation de la GFP augmente considérablement la capacité à détecter des métastases pulmonaires au niveau microscopique. Le modèle selon l'invention permet de détecter les micrométastases pulmonaires chez 100% des animaux après deux semaines suivant l'injection de H460M°FP aux dits animaux.
Le modèle selon l'invention permet donc d'étudier facilement les cinétiques de formation des métastases pulmonaires, et représente ainsi une méthode in vivo rapide, reproductible et facile à utiliser pour détecter la variation du nombre de métastases.
Exemple 2 :
Conclusions identiques à celles de l'exemple 1.
Exemple 3 : A l'opposé des clones Hl, H2 et H3 exprimant les chaînes lourdes de l'ITI, les clones exprimant la chaîne légère L de l'ITI présentent une baisse très importante de la masse des tumeurs primitives. Ceci ne peut pas être relié à une prolifération amoindrie des cellules dans la mesure où le temps de doublement calculé in vitro est identique pour tous les clones et les témoins. Ceci correspond plus vraisemblablement à la capacité de la bikunine d'inhiber les protéases sécrétées par les cellules cancéreuses (exemple : la plasmine [23]), ce qui empêche la dégradation de la matrice extracellulaire et l'apparition de facteurs connus pour induire la néoangiogénèse [24]. Ceci est en accord avec les études réalisées in vitro par Kobayashi et al. [15, 25] montrant que la bikunine inhibe l'invasion des cellules HOC-1. De plus, les chaînes Hl, H2 et H3, dépourvues d'activité antiprotéasique, n'ont pas d'effet sur la croissance des tumeurs primitives.
Une importante chute du nombre de métastases est observée pour les ceUules exprimant la chaîne L, avec deux clones (L-79 et L-84) parmi les six testés ne présentant plus de foyer métastatique. Une telle chute du nombre de métastases est probablement la conséquence directe de la faible masse des tumeurs primitives, et de la baisse de la capacité des cellules à migrer comme observé in vitro.
Ces résultats pris dans leur ensemble correspondent à la première démonstration in situ de la capacité anticancéreuse de la bikunine, et élargissent les précédents résultats obtenus dans différents modèles par injection de bikunine purifiée [26].
D'autre part, l'analyse statistique du nombre de métastases obtenu avec les clones exprimant les chaînes lourdes, révèle une baisse significative pour les clones exprimant les chaînes Hl et H3 en comparaison avec les témoins. Ceci n'est pas observé pour les clones exprimant la chaîne H2, qui présentent autant de métastases que les témoins. Ce résultat impUque que les chaînes Hl et H3 interfèrent avec le processus métastatique en tant que modérateurs de la dissémination cellulaire et peut être expliqué en partie par l'accroissement de l'attachement cellulaire sur le Matrigel observé in vitro pour les clones Hl et H3. La forte homologie des séquences nucléiques et peptidiques des chaînes Hl et H3 [1], ainsi que leur organisation génomique particuUère [28-29], peut fournir une explication quant à leur interaction avec la matrice extracellulaire (bien que toutes les chaînes lourdes soit liées de façon covalente avec l'acide hyaluronique [30]).
Le fait que les propriétés antimétastatiques observées pour les chaînes L, Hl et H3 sont bien le fait de l'expression de ces chaînes, peut être affirmé dans la mesure où ceUes-ci sont absentes dans les témoins. De plus, il existe une bonne conélation entre les résultats observés in vitro et in vivo, et les fonctions connues des chaînes de l'ITI, c'est à dire la capacité d'inhiber des protéases et de stabiliser la matrice extracellulaire via une jonction covalente à l'acide hyaluronique.
Finalement, les résultats présentés apportent la preuve des avantages du modèle de métastases pulmonaires spontanées de l'invention qui peut être utilisé pour étudier des anti-oncogènes potentiels, ou des drogues dirigées contre les métastases, particulièrement grâce à sa simplicité et à la précision du dénombrement des métastases.
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Claims

RE VENDICA TIONS
1. Utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes :
- elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente,
- elle est stable pour ladite protéine,
- elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes,
- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.
2. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la
Ugnée cellulaire NCI-H460 présentant les propriétés suivantes :
- elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente,
- elle est stable pour ladite protéine,
- elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal,
- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.
3. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M, exprimant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par :
- la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou
- des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits vaπants, sous réserve que ces fragments conservent la propnété de fluorescence
4. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain a grandes cellules, dénommée P-H460M, expnmant la proteme fluorescente choisie dans le groupe constitué par
- la proteme fluorescente verte (GFP), la proteme fluorescente bleue (BFP), la proteme fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou - des vanants dénves de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP. la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous reserve que ces vaπants conservent la propnété de fluorescence, ou
- des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits vanants, sous réserve que ces fragments conservent la propnété de fluorescence.
5. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon la revendication 3 ou la revendication 4, expnmant la protéine fluorescente verte GFP (dénommée H460MGFP ou P-H460MGFP)
6. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une des revendications 3 à 5, caractensee en ce qu'elle est
- stable pendant au moms 90 jours in vitro et pendant au moins 49 jours in vivo,
- capable de former des métastases pulmonaires spontanées fluorescentes
7. Lignée cellulaire de carcmome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractéπsée en ce qu'elle
- elle exprime de façon constitutive une proteme fluorescente,
- elle est stable pour ladite proteme, - elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, vanant d'environ 1 a environ 700, en un temps relativement court, vanant d'environ 2 a environ 7 semâmes après ladite injection chez l'animal, - elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.
8. Lignée ceUulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre au moins une protéine thérapeutique, notamment choisie dans le groupe constitué par les protéines de la famille de l' inhibiteur inter-α de la trypsine, les protéines de la famille des métalloprotéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des cystéines protéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des aspartates protéases et leurs inhibiteurs, les protéines liant l'acide hyaluronique (hyaladérine), ou dans le groupe des facteurs intervenant dans la néovascularisation et/ou la croissance tumorale, ou dans le groupe des protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire.
9. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, dénommée H460M°FP, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, telle que déposée auprès de la Collection
Nationale de Microorganismes (C.N.C.M) à Paris, le 23 juin 1999, sous le numéro I- 2242.
10. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, dénommée P-H460MGFP, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, telle que déposée auprès de la Collection
Nationale de Microorganismes (C.N.C.M) à Paris, le 4 juillet 2000, sous le numéro 1.2514.
11. UtiUsation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, pour fournir un modèle :
- permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes chez un animal, ledit nombre variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court variant d'environ 2 à environ 7 semaines après injection chez ledit animal de cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie selon l'une quelconque des revendications 3 à 10,
- permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13emc jour, notamment dès le 14eme jour suivant l'injection à un animal de cellules provenant de la Ugnée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 3 à 10,
- ne nécessitant pas d'implantation orthotopique, pour cribler de façon précoce des médicaments ciblés contre les propriétés d'adhésion, d'invasion et de prolifération de cellules cancéreuses.
12. Procédé de détection de métastases (micro- et macrométastases) pulmonaires caractérisé en ce que :
- on injecte, par voie sous-cutanée, à un animal des cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, notamment en une quantité d'environ 1.107 cellules/animal,
- on récupère entre environ 13 et 49 jours après ladite injection, l'un au moins des organes choisis dans le groupe constitué par le foie, les intestins, le cœur et les poumons dudit animal,
- on détermine le nombre total de métastases (micro- et macrométastases) présents dans lesdits organes, à l'aide de moyens physiques appropriés.
13. Procédé de préparation d'une Ugnée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que
(a) on transfecte les cellules provenant de la lignée cellulaire dénommée H460M, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique codant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence,
(b) on met lesdites cellules transfectées en présence d'un miUeu de sélection permettant de sélectionner les cellules ayant intégré le gène de résistance à un antibiotique, et notamment le gène de résistance à la généticine ou à la puromycine,
(c) on récupère des colonies fluorescentes environ 14 jours après l'étape a) de transfection,
(d) on maintient éventuellement en culture lesdites colonies fluorescentes sous pression de sélection.
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