FR2796393A1 - Modele d'etude de la progression de metastases pulmonaires spontanees, et son utilisation dans le criblage de medicaments - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes :- elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente,- elle est stable pour ladite protéine,- elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes,- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable,pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.

Description

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MODELE D'ETUDE DE LA PROGRESSION DE METASTASES PULMONAIRES SPONTANEES, ET SON UTILISATION POUR LE CRIBLAGE DE MEDICAMENTS.

La présente invention a pour objet un modèle d'étude de la progression de métastases pulmonaires spontanées, et son utilisation pour le criblage de médicaments.

Actuellement, les études sur le cancer du poumon représentent un axe de recherche thérapeutique important, dû à la fréquence de cette pathologie. Les avancées majeures dans la recherche sur le cancer proviennent d'études dirigées vers le développement de nouvelles thérapies contre les métastases.

Ainsi, l'obtention de modèles d'études in vivo appropriés, mimant le développement de métastases pulmonaires, représente des avantages importants pour ces études. Le problème majeur rencontré dans les modèles d'études actuels, réside dans la difficulté de détection des micrométastases. Des études colorimétriques utilisant le gène lacZ donnent de bons résultats pour cette visualisation [1,2, 3]. Cependant, cette technique nécessite beaucoup plus de temps, car la détection de lacZ requiert une préparation histologique importante, les résultats sont souvent difficiles à interpréter, en raison de l'activité p-galactosidase endogène de certaines cellules. Par conséquent, il est souvent difficile de compter le nombre total de métastases présentes dans le poumon.

Des travaux [4,5, 6] ont déjà décrit l'utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que gène rapporteur dans des tissus hôtes.

Le gène codant pour une protéine fluorescente issue de la méduse Aequorea victoria, la protéine fluorescente verte (green fluorescent protein ou GFP) [7], est connu. La GFP est une protéine ayant 238 acides aminés et une masse moléculaire de
27000. Elle acquiert ses propriétés de fluorescence par un mécanisme autocatalytique de formation du fluorophore. L'expression, endogène ou hétérologue, de la GFP ne requiert qu'un gène et ne nécessite l'addition d'aucun groupe prosthétique. La GFP a été exprimée de manière hétérologue dans des cellules et organismes aussi divers que les bactéries, les levures, les cellules eucaryotes animales et végétales.

S'agissant de l'utilisation de la GFP, les auteurs Chishima et al. [4, 5] ont (a) transfecté la lignée cellulaire d'adénocarcinome pulmonaire humain, dénommée ANIP
973, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique (ADNc)

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codant la protéine GFP (b) injecté le clone stable exprimant la protéine GFP à des souris immunodéficientes (souris nude, Swiss), et (c) montré que l'expression de ladite protéine GFP permettait de détecter des métastases dans le tissu desdites souris à l'échelle microscopique.

La GFP a également été utilisée dans les travaux menés par Yang et al. [6], qui consistent (a) à transfecter la lignée cellulaire de cancer pulmonaire humain, dénommée NCI-H460, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique (ADNc) codant la protéine GFP, (b) à injecter le clone ainsi obtenu, dénommé H460-GFP, à des souris nude, et (c) à montrer que l'expression de ladite protéine GFP permettait de détecter des métastases dans le tissu desdites souris.

Cependant, les modèles in vivo décrits par ces auteurs [4,5, 6] présentent des limitations dues notamment à la nécessité d'une implantation orthotopique chez les souris nude, nécessitant dans un premier temps d'injecter, par voie intraveineuse, ou sous-cutanée aux souris nude, les cellules de carcinome pulmonaire humain (ANIP
973 ou NCI-H460) transfectées par le gène de la GFP, d'attendre environ 4 semaines pour détecter dans le flanc des souris une grosse tumeur visible à l'#il nu, et nécessitant dans un deuxième temps de prélever la tumeur et d'implanter un fragment de ladite tumeur dans les poumons d'autres souris nude.

Au bout d'une période d'environ 6 semaines après le début de la première injection, les cellules tumorales humaines sont visibles et sont présentes dans le poumon de la souris en quantité suffisante.

Ainsi, l'implantation orthotopique, effectuée en deux étapes, nécessite : - une intervention chirurgicale, et donc un personnel compétent en chirurgie, - un temps d'étude assez long.

Ainsi, le temps nécessaire à l'apparition et à la détection de métastases pulmonaires est également assez long : ainsi à titre d'exemple, selon le modèle de Yang et al. [6], très peu de métastases apparaissent et sont détectables avant l'implantation orthotopique, et il faut attendre au moins 41 jours pour déceler des métastases pulmonaires.

D'autres inconvénients des modèles actuels décrits ci-dessus [4, 5, 6] résident notamment dans : - l'impossibilité d'établir une corrélation entre la croissance de la tumeur primaire et le nombre de métastases obtenues,

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- l'incapacité d'analyser l'effet de l'agent anticancéreux sur l'évolution des métastases après ablation de la tumeur primaire, - la difficulté d'effectuer une étude statistique sur la cinétique d'apparition des métastases, ce qui affaiblit l'étude de l'impact d'un agent anticancéreux sur le développement de métastases pulmonaires.

Les auteurs Corti et al. [8], ont décrit et étudié la lignée cellulaire H460M, dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460 de carcinome pulmonaire humain, et ont montré que ladite lignée cellulaire H460M produit un nombre élevé de métastases pulmonaires spontanées après injection sous-cutanée à des souris nude. Cependant, le modèle expérimental in vivo décrit dans cette publication ne permet pas la détection de micrométastases.

La présente invention permet de remédier à l'ensemble des inconvénients décrits ci-dessus.

L'un des buts de l'invention est de fournir un modèle in vivo mimant le développement de métastases pulmonaires, et permettant notamment de ne pas avoir recours à l'implantation orthotopique.

Un autre but de l'invention est de fournir un modèle in vivo permettant d'étudier les toutes premières étapes du développement et de la progression des métastases (micro-et macrométastases) pulmonaires.

L'invention a également pour but de fournir un modèle in vivo permettant une évaluation rapide et sensible (exacte) de l'efficacité d'agents thérapeutiques in vivo.

De façon générale, l'invention concerne une lignée cellulaire hautement métastasiante intégrant un gène rapporteur facilement détectable, et son utilisation pour fournir un modèle in vivo particulièrement approprié pour l'étude de la progression de métastases pulmonaires lors du cancer du poumon.

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable vis-à-vis de ladite protéine, - elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes,

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- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.

Par lignée cellulaire , on entend une culture de cellule(s) immortalisée (s).

Par carcinome on entend une tumeur épithéliale maligne.

Par lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain , on entend une culture de cellule(s) épithéliale(s) pulmonaire (s) maligne (s) immortalisée (s) d'origine humaine.

La lignée cellulaire NCI-H460, décrite dans un premier temps comme une lignée cellulaire d'adénocarcinome (tumeur maligne développée au dépens d'un épithélium glandulaire), s'est révélée être une lignée de carcinome pulmonaire à larges cellules avec des propriétés neuroendocrines. Ladite lignée a été obtenue à partir d'un liquide pleural d'un patient atteint d'un cancer du poumon à larges cellules.

Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, qui exprime de façon constitutive une protéine fluorescente signifie que le gène codant ladite protéine est intégré dans le génome de la cellule et est transmis de génération en génération. Le terme constitutif est utilisé à l'opposé de transitoire.

Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain est stable vis-à-vis de la protéine fluorescente qu'elle exprime, lorsque des cellules provenant de la lignée cellulaire de cancer humain du poumon ont été transfectées de façon stable par le gène codant ladite protéine fluorescente.

Un test permettant de vérifier la stabilité de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain vis-à-vis de la protéine fluorescente consiste à cultiver la ligné pendant plusieurs passages in vitro (environ 15passages pour une période d'environ 90 jours), sans antibiotique (géniticine, G418 sulfate, Life technologies) et vérifier régulièrement l'expression de la protéine GFP au microscope à fluorescence et la présence de l'ARNm de ladite protéine par le transfert d'ARN (Northem-blot).

La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de
NCI-H460, exprimant une protéine fluorescente, est désigné dans ce qui suit soit par clone , soit par cellule transfectée par le gène de la protéine fluorescente .

Par métastase , on désigne les foyers secondaires d'une affection (par exemple telle que les cancers), disséminés par voie lymphatique ou sanguine à partir d'un foyer primitif. Selon l'invention, le terme métastase englobe les métastases présentes dans les différentes phases de développement d'une affection telle que le cancer et désigne aussi bien les micrométastases que les macrométastases.

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Lors du développement d'une affection il y a, dans un premier temps, formation de micrométastases, puis dans un deuxième temps, formation de macrométastases : cellule (micrométastase) se multiplie pour donner une macrométastase (jusqu'à plusieurs millions de cellules).

Par micrométastases , on désigne plus particulièrement des métastases invisibles à l'oeil nu.

Par macrométastases , on désigne plus particulièrement des métastases visibles à l'#il nu.

Dans ce qui suit, on désigne de façon avantageuse, par micrométastases les métastases ayant des tailles variant d'environ 1 à 1000 cellules, et par macrométastases les métastases ayant des tailles variant d'environ 1000 à plusieurs milliers de cellules.

Par métastases pulmonaires , on désigne les métastases présentes au niveau du poumon. Cependant, les métastases d'origine pulmonaire peuvent également être présentes au niveau d'autres organes tels que le foie, les intestins, le c#ur etc....

Par métastases pulmonaires spontanées , on entend les métastases qui se forment spontanément dans le poumon après injection chez un animal, de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain.

Les métastases pulmonaires spontanées sont fluorescentes car la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain transfectée par la protéine fluorescente les produisant, est stable pour ladite protéine.

De même, il est possible de détecter une seule micrométastase présente chez l'animal, car la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain transfectée par la protéine fluorescente, est stable pour ladite protéine et la quantité présente de ladite protéine est suffisante pour la détection d'une seule micrométastase.

Par l'expression pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires , il faut comprendre que le temps nécessaire à l'étude de l'effet d'un médicament sur la formation et la détection des métastases pulmonaires spontanées, varie d'environ 13 à environ 28 jours, ce qui représente un temps relativement court.

Ainsi selon l'invention, il sera possible de détecter, après injection à un animal de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus :

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- quelques métastases pulmonaires dès le treizième jour après l'injection, - de 9 à 107 métastases pulmonaires dès le vingtième jour après l'injection, et notamment dès le vingt huitième jour.

A titre d'exemple, selon les travaux de YANG et al. précédemment cités [6], étudiant la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain NCI-H460 transfectée par le gène de la GFP : - il est impossible de détecter des métastases dans les 15jours qui suivent l'injection, - il est nécessaire de recourir à une implantation orthotopique 28 jours après l'injection, - le temps minimum nécessaire à l'étude de l'effet d'un médicament sur la formation et la détection des métastases pulmonaires spontanées, est d'environ 41 jours après injection de ladite lignée cellulaire chez un animal.

Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l'invention, de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présente les propriétés suivantes : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable pour ladite protéine, - elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal, - elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.

Le terme animal utilisé selon l'invention, désigne des mammifères, notamment des souris, et notamment des souris athymiques immunodéficientes appelées souris nude (Swiss).

Les injections de cellules selon l'invention provenant de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain exprimant une protéine fluorescente, sont effectuées selon l'invention par voie sous-cutanée. De façon avantageuse selon l'invention, seules des injections par voie sous-cutanée sont nécessaires, lesdites cellules transfectées selon l'invention migrant de façon naturelle vers les poumons de l'animal.

Le nombre de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes peut atteindre dans les valeurs supérieures, environ 400 à environ 700, ce qui correspond à un

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nombre important de métastases par rapport aux nombres de métastases produites par les lignées cellulaires actuellement connues.

Par l'expression un temps court il faut entendre environ 14 jours.

L'invention a encore pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M, exprimant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP) [9,10], la protéine fluorescente bleue (BFP) [11], la protéine fluorescentejaune (RSGF ou EGFP) [12, 13], GFPUV [14, 13], ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence.

L'expression carcinome pulmonaire humain à grandes cellules peut être remplacée par carcinome pulmonaire humain indifférencié à grandes cellules et désigne des cellules tumorales, généralement de reconnaissance aisée, qui sont de très grande taille, dotées d'un noyau volumineux, fréquemment polylobé, monstrueux, nucléolé.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus et exprimant la protéine fluorescente verte GFP.

La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, sera dénommée clone H460MGFP , lignée cellulaire H460MGFP , ou H460MGFP .

Les cellules provenant de la lignée cellulaire H460M pourront être dénommées cellules H460M .

Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention, est telle que déposée auprès de la Collection Nationale de
Microorganismes (C. N.C.M) à Paris, le 23 juin 1999, sous le numéro I. 2242.

La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M, présente la particularité de métastasier de manière importante et spontanée dans les souris nude : ces métastases miment exactement le tropisme de celles observées chez l'homme au cours de cette pathologie.

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Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l'invention de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant notamment la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle est : - stable pendant au moins 90 jours in vitro et pendant au moins 49 jours in vivo, - capable de former des métastases pulmonaires spontanées fluorescentes.

Le test in vitro permettant de vérifier la stabilité de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain vis-à-vis de la protéine fluorescente est tel que décrit précédemment.

Le test in vivo permettant de vérifier la stabilité consiste à injecter H460MGFP, en une quantité d'environ 5.106 cellules, de façon sous-cutanée dans chaque flanc des souris nude athymique , à sacrifier lesdites souris à des temps variables, à exciser les tumeurs primaires, à récupérer et observer les poumons au microscope inversé à fluorescence. L'intensité de l'expression de la GFP permet de suivre la stabilité du gène de la GFP dans les cellules.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l'invention de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle : - exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - est stable pour ladite protéine, - est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal, - exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.

De façon avantageuse, la quantité de cellules injectées exprimant une protéine fluorescente, notamment H460MGFP, est d'environ 107 cellules par animal.

La présente invention a également pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre au moins une protéine thérapeutique, notamment choisie dans le groupe constitué par les inhibiteurs de protéases tels que les protéines de la famille de l'inhibiteur inter-a de la trypsine, les protéines de la famille des métalloprotéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des cystéines protéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des aspartates protéases et leurs inhibiteurs, les protéines liant l'acide

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hyaluronique (hyaladérines), ou dans le groupe des facteurs intervenant dans la néovascularisation et/ou la croissance tumorale, ou dans le groupe des protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire.

Les inhibiteurs de protéases jouent un rôle protecteur important au cours de l'invasion tumorale en empêchant la protéolyse de dégrader la matrice extracellulaire (MEC). De ce fait, l'invasion tumorale est moins importante, ce qui limite la formation des métastases.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus, pour fournir un modèle : - permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes chez un animal, ledit nombre variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court variant d'environ 2 à environ 7 semaines après injection chez ledit animal de cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus, - permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13ème jour, notamment dès le 14ème jour suivant l'injection à un animal de cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus, - ne nécessitant pas d'implantation orthotopique, pour cribler de façon précoce, des médicaments ciblés contre les cellules cancéreuses pulmonaires, et notamment contre les propriétés d'adhésion, d'invasion et de prolifération desdites cellules cancéreuses.

La quantité de cellules injectées exprimant une protéine fluorescente, notamment H460MGFP, permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes est la même que celle définie ci-dessus.

De même, la quantité de protéine fluorescente exprimée est la même que celle définie ci-dessus, ladite quantité permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13ème jour.

Le modèle selon l'invention permet de détecter et de compter exactement le nombre de micro- et macrométastases présentes dans le poumon d'un animal et, de détecter une seule micrométastase très rapidement après l'injection de cellules H460MGFP par voie sous-cutanée chez l'animal.

La présente invention a encore pour objet un procédé de détection de métastases (micro- et macrométastases) pulmonaires caractérisé en ce que :

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- on injecte, par voie sous-cutanée, à un animal des cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie ci-dessus, notamment en une quantité d'environ 107 cellules/animal, - on récupère entre environ 13 et environ 49 jours après ladite injection, l'un au moins des organes choisis dans le groupe constitué par le foie, les intestins, le c#ur et les poumons dudit animal, - on détermine le nombre total de métastases (micro- et macrométastases) présents dans lesdits organes, à l'aide de moyens physiques appropriés.

Les moyens physiques appropriés pour déterminer le nombre total de métastases sont par exemple le microscope inversé à fluorescence.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce que : (a) on transfecte les cellules provenant de la lignée cellulaire dénommée H460M, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique codant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence, (b) on met lesdites cellules transfectées en présence d'un milieu de sélection permettant de sélectionner les cellules ayant intégré un gène de résistance à un antibiotique, et notamment le gène de résistance à la géniticine, (c) on récupère des colonies fluorescentes environ 14 jours après l'étape a) de transfection, (d) on maintient éventuellement en culture lesdites colonies fluorescentes sous pression de sélection.

L'étape d) de maintien sous pression de sélection permet de faire exprimer le gène de résistance à l'antibiotique porté par le vecteur, afin de vérifier que le gène de la
GFP est intégré dans le génome de la cellule et est transmis aux générations suivantes.

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Le modèle in vivo selon l'invention est particulièrement approprié pour l'étude de la fonction des protéines de la famille des inhibiteurs de protéase dans l'invasion tumorale, la formation de métastases et le maintien de la matrice extracellulaire (MEC). Ces études contribuent à la compréhension du phénomène métastatique qui représente un objectif capital dans la recherche en cancérologie permettant de déboucher sur des méthodes diagnostiques et thérapeutiques et de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses à potentialité métastatique.

A titre d'exemple d'inhibiteur de protéase, l'inhibiteur inter-a de la trypsine (ITI) constitue un modèle original de régulation de synthèse protéique impliqué dans la MEC et l'invasion tumorale. En effet, l'ITI est impliqué dans l'invasion tumorale, en tant qu'antiprotéase par le biais de la bikunine (possédant deux domaines inhibiteurs de protéases de type Kunitz), et comme stabilisateur de la MEC grâce à ses chaînes lourdes.

Une étude récente [15] a démontré in vitro que l'UTI ( Urinary trypsine inhibitor ), dérivé urinaire de l'ITI composé de la bikunine, bloque l'invasion tumorale en inactivant le récepteur de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPAR).

L'implication de l'ITI dans l'invasion tumorale est mieux comprise en utilisant le modèle in vivo selon l'invention.

Dans un premier temps, on prépare les cellules H460MGFP .

Les vecteurs exprimant les différentes chaînes (ADNc) de l'ITI sont ensuite transfectés de façon stable dans les cellules H460MGFP , sous contrôle d'un promoteur viral.

Afin d'appréhender les potentialités invasives et métastatiques des cellules tumorales et le retentissement de l'expression des différents ADNc de l'ITI sur la capacité invasive, plusieurs tests sont mis au point : ils ont pour but de mimer les interrelations tumeurs/hôte.

Le retentissement de l'expression des différents ADNc de l'ITI sur la capacité invasive de ces cellules est étudié in vitro en mesurant la mobilité cellulaire à travers une membrane composée d'un gel matriciel (membrane de Matrigel, commercialisée par Becton Dickinson).

On réalise également des tests in vitro de chimiotactisme, d'adhésion et de croissance cellulaire afin de déterminer l'impact de ces différentes chaînes de l'ITI sur ces paramètres.

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L'étude in vitro est complétée par une étude in vivo en injectant, à des souris nude, les cellules H460MGFP exprimant les différentes chaînes de l'ITI, et en comparant leur potentiel métastatique avec celui observé en injectant les cellules H460MGFP non transfectées par les différentes chaînes de l'ITI. Le test d'invasion in vivo permet d'étudier in vivo l'impact de l'ITI sur l'invasion tumorale.

Ce test d'invasion in vivo peut être lié au test de tumorigénicité. L'injection souscutanée de cellules tumorales à ces animaux immunodéprimés permet de tester le pouvoir tumorigène de ces cellules au site d'injection, et leur potentialité métastatique, par l'apparition de foyers tumoraux au niveau des poumons. Ces animaux sont autopsiés : les tumeurs primaires sont prélevées, pesées et les organes cibles sont examinés par examen microcospique. Les poumons sont prélevés et analysés par examen sous microscopie à fluorescence. Cette méthode permet de dénombrer la totalité des métastases pulmonaires.

Le modèle selon l'invention, mimant l'invasion tumorale in vivo permet de mieux comprendre le rôle des inhibiteurs de protéase, et notamment de l'ITI, et leur implication dans les étapes de ce phénomène complexe non reproductible dans son intégralité in vitro.

Description des figures
Figures la et lb : elles représentent l'expression stable de la GFP dans les cellules provenant de la lignée cellulaire H460M. Les cellules H460M sont transfectées avec le vecteur pEGFP-Cl. Les cellules transfectées avec le gène codant la GFP sont repiquées dans un milieu contenant 400 g/ml de généticine (G418 sulfate, Life technologies) et observées en microscopie photonique (Figure la) ou sous microscopie de fluorescence (UV) (Figure lb).

Figure 2: elle représente les courbes de croissance de la lignée cellulaire parentale H460M et de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.

L'axe des abscisses représente le temps (en jours), et l'axe des ordonnées le nombre de cellules. Chaque point représente la moyenne de trois essais ~ la déviation standard (SD Standard Déviation ).

Le cercle noir (#) correspond à la lignée cellulaire H460M, et le cercle blanc (o) correspond à la lignée cellulaire H460MG#P.

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Figure 3 : elle représente respectivement, de gauche à droite sur l'axe des abscisses, le chimiotactisme, l'invasion cellulaire et l'adhésion cellulaire pour la lignée cellulaire parentale H460M et pour la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.

L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules par champ.

Les données sont exprimées comme la moyenne + SD de 30 champs choisis au hasard, obtenus à partir de 3 expériences indépendantes.

L'histogramme noir (#) correspond à la lignée cellulaire H460M, et l'histogramme blanc ( D ) correspond à la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.

Figures 4a, 4b et 4c : représentent l'expression de la GFP dans les micro- et macrométastases pulmonaires de souris nude. Des cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP, à raison de 1,0 X 107, sont injectées par voie sous-cutanée à des souris. Les poumons frais sont prélevés à différents temps après l'injection et sont observés directement sous un microscope de fluorescence. Les résultats obtenus 35 jours après l'injection sont présentés.

La Figure 4a représente une seule micrométastase présente dans le(s) tissus frais de l'hôte.

La Figure 4b représente 3 colonies de micrométastases présentes dans le (s) frais de l'hôte.

La Figure 4c représente une (les) macrométastase (s) présente (s) dans le(s) tissus frais de l'hôte.

Figure 5a et 5b : elles représentent la cinétique de formation de métastases pulmonaires après injection de 1,0 X 107 cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention à des souris nude.

La Figure 5a représente le pourcentage de souris avec des métastases détectées sous microscopie de fluorescence (0) ou macroscopiquement (# et # ).

L'axe des abscisses représente le temps après l'inoculation (en jours), et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de souris avec des métastases.

Plus particulièrement, le symbole du cercle blanc (0), représente les métastases détectées sous microscopie de fluorescence (UV) après injection de cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP.

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Le carré blanc ( #) correspond à des métastases détectées macroscopiquement (à l'oeil nu) après injection de cellules provenant de la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention.

Le triangle noir (#) correspond à des métastases détectées macroscopiquement (à l'oeil nu) après injection de cellules provenant de la lignée cellulaire H460M.

La Figure 5b représente la médiane du nombre de métastases par souris.

Les symboles du rond blanc, du carré blanc et du triangle noir ont les mêmes significations que celles décrites ci-dessus pour la Figure 5a.

L'axe des abscisses représente le temps après l'inoculation (en jours), et l'axe des ordonnées représente la médiane des métastases.

Tableau 1 : le tableau 1 ci-dessous correspond au nombre de métastases comptées sur une période de 49 jours.

<tb>
<tb>

Temps <SEP> après <SEP> Détection <SEP> UV
<tb> inoculation <SEP> (jours) <SEP> macroscopique
<tb> 14 <SEP> 0 <SEP> 1-22
<tb> 21 <SEP> 0 <SEP> 10-16 <SEP>
<tb> 28 <SEP> 0-16 <SEP> 9-107 <SEP>
<tb> 35 <SEP> 0-2 <SEP> 6-143
<tb> 42 <SEP> 0-40 <SEP> 41-622 <SEP>
<tb> 49 <SEP> 8-70 <SEP> 70-400
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Matériels et Méthodes
I. Culture cellulaire
1. La lignée cellulaire H460M
La lignée cellulaire H460M dérive de la lignée NIH-H460, établie à partir d'un carcinome pulmonaire à larges cellules d'un patient non traité. Cette dernière devient métastatique au niveau pulmonaire chez la souris nude après injection sous-cutanée.

Une série d'injections sous-cutanée de cellules de métastases pulmonaires obtenues avec NIH-H460 a permis la sélection de la lignée H460M. Celle-ci est caractérisée par une

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augmentation de son potentiel métastatique comparé à celui de la lignée parentale NIH-H460.

2. Condition de culture a- Milieux de culture
Le milieu de culture complet est composé de milieu RPMI 1640 ( Roswell Park Memorial Institue ) (Life Technologies) contenant 10% (v/v) de sérum de veau f#tal (SVF) (Roche) et 2 mM de L-glutamine (Sigma).

Le milieu de culture sélectif est composé de RPMI 1640 contenant 10% (v/v) de SVF, 2mM de L-glutamine et 400 g/ml-1 de généticine (G418 sulfate, Life Technologies).

Le milieu de culture utilisé pour les expériences in vitro est composé de RPMI 1640 contenant 2 mM de L-glutamine et 0,1% (p/v) d'albumine de sérum bovin (BSA).

Le milieu activé (ou chimioattractant) est obtenu à partir de cellules H460M cultivées pendant 4 à 5 jours dans du milieu RPMI 1640 contenant 2 mM de Lglutamine et 0,1% (p/v) BSA. Ce milieu est collecté, centrifugé à 12000 rpm (sigma 2 kl5, rotor n 12145) à 4 C pendant 10 minutes et le surnageant est conservé à -20 C. b- Culture
Les lignées H460M et H460MGFP sont manipulées dans une enceinte stérile à flux laminaire vertical (Hotte cytair 125, Flufrance) et cultivées dans un incubateur à 37 C sous une atmosphère contrôlée : 5% C02, 95% air atmosphérique, 90% d'hygrométrie (incubateur MCO 175, Sanyo). Ces lignées adhérentes sont cultivées dans du milieu
RPMI 1640 complet. Les techniques d'entretien indispensables sont le changement de milieu, consistant à éliminer le milieu appauvri, et le repiquage, permettant le transfert des cellules recouvrant toute la surface du support dans de nouveaux flacons.

3. Repiquage des cellules
Le détachement des cellules adhérents au support est réalisé par action enzymatique de la trypsine. Le tapis cellulaire est rincé deux fois dans une solution de

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tampon phosphate (PBS) (xl) (Life Technologies) dépourvue en ions calcium et magnésium afin d'éliminer toute trace de SVF inhibant la trypsine. Pour un flacon de 75 cm2, 1 ml de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) 10 mM (Sigma) préchauffée à 37 C permet le décrochage des cellules de leur support plastique en 1 à 2 minutes. L'action de la trypsine est stoppée par ajout de 10 ml de milieu de culture complet. Les cellules ainsi récupérées sont pipetées à plusieurs reprises afin d'obtenir une suspension de cellules isolées. Les cellules d'un flacon à 100% de confluence sont repiquées au 1/10 dans un nouveau flacon puis incubées à 37 C. Le milieu de culture est changé dès le lendemain du repiquage.

4. Congélation
Les cellules d'un flacon de 75 cm2 à 80% de confluence sont lavées puis soumises à l'action de la trypsine comme décrit dans le paragraphe précédent. Elles sont reprises dans 10 ml de milieu de culture complet, centrifugées 5 minutes à 1200 rpm (C3-12, Jouan) à température ambiante. Le culot cellulaire est resuspendu dans 1,8 ml de milieu RPMI 1640 contenant 2mM de L-glutamine et 30% de SVF. Cette suspension est répartie dans deux tubes de congélation puis 0,9 ml de milieu complet contenant 20% de DMSO (diméthylsulfoxyde) (Sigma) sont ajoutés goutte à goutte. Les cryotubes sont placés dans une boîte à congélation permettant une diminution de température de 1 C.minute-' jusqu'à -80 C, puis placés directement dans l'azote liquide (-180 C) afin d'y être conservés.

5. Remise en culture de cellules congelées
Une décongélation rapide permet de ne pas abîmer les cellules congelées en présence du DMSO cryoprotecteur qui peut s'avérer être toxique pour les cellules. La suspension cellulaire est diluée dans 2 ml de milieu RPMI 1640 contenant 2mM de L- glutamine et 20% de SVF. Elle est délicatement agitée à la pipette, ajustée à un volume final de 15 ml puis les cellules sont ensemencées dans un flacon de culture de 75 cm2.

Après une incubation d'une nuit à 37 C, le milieu de culture est remplacé par du milieu
RPMI 1640 complet.

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II. Transfection au phosphate de calcium des cellules H460M
1. Principe
L'ADN, par ses groupements phosphates, complexe les ions Ca++ en formant un fin précipité. Lorsqu'un tel précipité, fraîchement préparé, est mis en contact de la cellule en culture, une internalisation du complexe dans la cellule est observée. Cette internalisation semble résulter d'une phagocytose des grains d'ADN-calcium. Quelques cellules seulement intègrent cet ADN au hasard dans leur génome de manière spontanée. Il en résulte une modification dite stable qui se transmettra aux cellules filles.

2. Tampons et solutions
Le tampon HEPES (x2) (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthane sulfonique) comprenant 40 mM d'HEPES, 270 mM de NaCl, 10 mM de KCI, 7 mM de Na2HP04, 12 H2O et 11 mM de D-glucose est filtré sur un filtre de 0,22 m (millipore) puis conservé à 4 C.

La solution de CaClz est préparée à une concentration de 2 M, filtrée, aliquotée puis gardée à -20 C. La solution de glycérol se compose de 15% (v/v) de glycérol en tampon HEPES (xl).

Le tampon TE 10/1 (Tris-HCl 10 mM/EDTA 1 mM) se compose du 10 mM TrisHCl, pH = 8, et de l'EDTA 1mM, pH = 8.

3. Transfection
La veille de la transfection, les cellules H460M sont ensemencées à 2.106 cellules dans une boîte de Pétri de 60 mm de diamètre. Le mélange de transfection est réalisé dans un tube stérile en plaçant 10 g d'ADN en tampon TE 10/1dont le volume final est complété avec de l'eau stérile à 440 l, additionné de 500 l de tampon HEPES (x2). Le mélange est agité vigoureusement puis incubé 10 minutes à température ambiante. 60 l de CaClz 2 M sont mélangés au milieu réactionnel. L'ADN est ensuite laissé au contact du CaCl2 pendant 10 minutes à température ambiante, et ce mélange réactionnel est

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agité doucement toutes les 2 à 3 minutes . Le milieu de culture est ensuite aspiré puis, le précipité formé par les groupements phosphates de l'ADN et les ions Ca++ est réparti de façon homogène sur le tapis cellulaire toutes les 10 minutes pendant 30 minutes. Après chaque addition, les cellules sont incubées à 37 C. Passé ce temps d'incubation, 5 ml de milieu DMEM ( Dulbecco's Modified Eagle Medium ) contenant 10% de SVF sont ajoutés dans chaque boîte puis les cellules sont incubées de nouveau pour une durée de 4 à 6 h à une température de 37 C. Le milieu et le précipité sont éliminés et le rendement de la transfection est optimisé par un choc au glycérol : 2 ml d'une solution de glycérol à 15%, préalablement chauffé à 37 C, sont mis au contact des cellules pendant 2 minutes. Le glycérol est remplacé par 10 ml de milieu RPMI complet. Les cellules sont ensuite incubées pendant 24 h à 37 C.

La variation de la morphologie des cellules peut être observée au microscope photonique inversé (CK2, Olympus).

Résultats
I. Sélection de clones stables
Le gène de résistance à la généticine porté par le vecteur pEGFP-Cl (Invitrogen) introduit dans les cellules H460M, leur confère la propriété de pousser dans un milieu sélectif contenant cet antibiotique.

24 h après la transfection, les cellules sont soumises à la trypsine puis repiquées au 1/10 dans du milieu RPMI 1640 complet contenant 400 g/ml-1 de généticine (G418 sulfate, Life Technologies). Ce milieu sélectif est renouvelé tous les 3 à 4 jours. Après environ une semaine, des clones résistants au G418 sulfate commencent à apparaître.

Quand ces clones forment des colonies composées d'environ 1.103 cellules (visibles à l'#il nu), les cellules sont lavées avec 2 x 5 ml de PBS dépourvu en ions calcium et magnésium . Une goutte de 5 l de trypsine-EDTA lOmM est déposée sur des colonies cellulaires, pipetée plusieurs fois afin de décoller les cellules de la boîte. Chaque clone est aussitôt transféré dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml de milieu sélectif. A
100% de confluence, elles sont repiquées dans une plaque de 6 puits dans 4 ml de milieu sélectif. La présence du gène de la Green Fluorescen Protein (GFP) est détectée au microscope à fluorescence (Axiovert 10, Zeiss, filtre d'excitation BP450-490, filtre de suppression LP520).

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Parmi les clones cellulaires positifs, le clone intitulé H460MGFP a été sélectionné (Figure 1). Ce clone exprime la GFP avec une très forte intensité. La mise en culture de ce clone en milieu RPMI complet et sans pression de sélection pendant 90 jours (15 passages), montre une grande stabilité de l'expression du gène de la GFP.

II. Etude in vitro
Les expériences ci-dessous ont été effectuées afin de déterminer si les cellules transfectées provenant de la lignée cellulaire H460MGFP, ont subi des altérations de leurs propriétés biologiques, par rapport aux cellules non transfectées provenant de la lignée cellulaire H460M.

1. Croissance cellulaire
La croissance cellulaire est déterminée en ensemençant 6.104cellules dans un flacon de 25 cm2. De façon quotidienne, un flacon de culture est soumis à l'action de la trypsine et les cellules sont récupérées dans 2 x 5 ml de milieu RPMI 1640 complet. Les cellules sont centrifugées 5 minutes à 1200 rpm (C3-12, Jouan), puis le surnageant est aspiré. Le culot cellulaire est repris dans 1 à 5 ml de milieu RPMI 1640 complet et les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre appelé la cellule de Malassez.

Le temps de doublement est déterminé sur la courbe de croissance (Figure 2) tracée à l'aide de ces données. Chaque point de la courbe représente la moyenne de trois expériences différentes et indépendantes.

Aucune différence n'est observée dans la morphologie cellulaire (données non montrées) ou dans les taux de prolifération cellulaire entre la lignée cellulaire parentale H460M et la lignée cellulaire H460MGFP. Le temps de doublement est de 18 à 24 heures pour les deux lignées cellulaires.

2. Invasion
L'invasivité des cellules est déterminée par utilisation d'un système de Boyden modifié [16, 17], commercialisé sous le nom de Transwell (Coming Costar, réf. 3428).

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a- Tampon et solutions
Le mélange alcool-acide acétique 2% est composé de 98% (v/v) d'éthanol 95 et de 2% d'acide acétique.

La solution de Crystal-violet est constituée d'eau contenant 0,1% (p/v) de colorant Crystal-violet (Sigma). b- Le gel matriciel (Matrigel)
Le gel matriciel, commercialisé sous le nom de Matrigel Basemont Membrane Matrix (Collaborative Research Product) est une préparation de membrane basale d'un sarcome de souris riche en protéines de la matrice extracellulaire. L'enrobage de la membrane par le gel matriciel est effectué sur de la glace avec du matériel froid (cônes, pipettes, ...) afin d'éviter une gélification trop rapide de celui-ci.

Le système de Boyden modifié, permettant d'étudier l'invasion cellulaire (Transwell, Corning Costar) a une membrane en polycarbonate de 24 mm, à pore de 8 m de diamètre, et est recouvert avec 0,1 g.mm-2 de gel matriciel (Becton Dickinson).

La plaque est placée à 37 C pendant 30 minutes, puis séchée stérilement sous hotte toute la nuit. Le gel matriciel est réhydraté durant lh à température ambiante avec 1 ml de RPMI 1640, puis la membrane est lavée deux fois avec 1 ml de ce milieu afin d'éliminer tout trace de gel matriciel non lié qui pourrait interférer avec les cellules. c- Test d'invasion
400 l d'une suspension cellulaire à 1.106 cellules.ml-1 de milieu RPMI 1640 à
0,1% de BSA et 2 mM de L-glutamine sont répartis de façon homogène sur la membrane. Le puits est rempli par 1,8 ml de milieu activé. Après 24h d'incubation à
37 C, le milieu du compartiment supérieur de la membrane est prélevé et les cellules sont fixées en plaçant le système de Boyden modifié (Transwell) dans le bain alcool- acide acétique 2% pendant 15minutes. Les cellules non invasives du compartiment supérieur ainsi que le gel matriciel sont délicatement retirés à l'aide d'un coton fixé sur un cure dent. Le système de Boyden modifié (Transwell) est ensuite rincé à l'eau avant d'être séché à l'air libre. Les cellules invasives sur la surface inférieure de la membrane sont colorées. La coloration est réalisée en plaçant le système de Boyden modifié

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(Transwell) dans une solution de colorant Crystal-violet pendant 30 minutes à lh. Celuici est lavé 2 à 3 fois à l'eau pendant 5 minutes. La surface supérieure de la membrane est à nouveau délicatement nettoyée à l'aide d'un coton tige jusqu'à ce que toute trace de colorant ait disparue.

Le nombre de cellules invasives est déterminé sous microscopie en lumière blanche.

La capacité d'invasion à travers le gel matriciel est la même pour les deux lignées cellulaires H460M et H460MGFP.

3. Migration
La migration des cellules est effectuée de la même manière que le test d'invasion hormis la présence de Matrigel.

La capacité de migrer est également la même pour les deux lignées cellulaires H460M et H460MGFP.

4. Adhésion
Les cellules sont ensemencées à 1.105 cellules.ml-1 dans une plaque à 6 puits de 35 mm de diamètre. Après 2h à 37 C, les cellules non attachées sont éliminées par deux lavages en PBS. Les cellules sont ensuite fixées et colorées comme décrit précédemment pour le test d'invasion puis dénombrées.

On n'observe pas de différence significative entre les deux lignées cellulaires H460M et H460MGFP quant à leurs propriétés d'adhérence.

5. Conclusion
Les données ci-dessus indiquent que la machinerie cellulaire responsable de l'adhérence, du chimiotactisme et de l'invasion, n'est pas altérée par l'expression de la
GFP (Figure 3).

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III. Etude in vivo
L'étude in vivo a pour but de mimer la formation de métastases pulmonaires spontanées.

Afin de tester la capacité des cellules H460MGFP à produire des métastases fluorescentes spontanées, ces cellules sont injectées chez des souris nude par voie souscutanée.

1. Les souris
Les animaux utilisés pour ces expériences sont des souris femelles Swiss homozygotes nulnu âgées de 5 à 7 semaines. Ces animaux sont maintenus sous conditions stériles durant tout le temps de l'expérience.

2. Injection et dénombrement des métastases
200 l de milieu RPMI 1640 contenant 5.106 cellules H460MGFP sont injectées de façon sous-cutanée dans chaque flanc des souris Swiss. A des temps variables, les souris sont sacrifiées puis autopsiées. Les tumeurs primaires sont excisées puis pesées. Les poumons sont récupérés, lavés en PBS, puis aplatis entre deux lames de verre liées entre elles par du film adhésif. L'épaisseur du poumon entre celles-ci est inférieure à 1 mm.

Les métastases sont dénombrées sous microscope inversé à fluorescence (Axiovert 10, Zeiss) équipé d'un filtre FITC (Fluorescein Isothiocyanate).

Le nombre total de métastases est obtenu en observant la totalité du poumon.

Après deux semaines, on observe, sous microscope à fluorescence, des micrométastases chez 100% des animaux, présentes au niveau des nodules lymphatiques (données non montrées) et du tissu pulmonaire (Figure 4). Par contre, au même moment, aucune métastase n'a pu être observée sous lumière blanche des mêmes organes. Les autres organes ne présentent pas de métastases fluorescentes. Ces données montrent la capacité de colonisation sélective du poumon par les cellules H460MGFP chez les souris nude.

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3. Cinétique de formation des métastases pulmonaires
La cinétique de formation des micro- et macrométastases pulmonaires, est illustrée par la Figure 5.

Seules deux semaines ont été nécessaires pour observer des métastases fluorescentes chez 100% des animaux. Par contre, le temps nécessaire pour détecter des métastases sous lumière blanche chez 50 % des animaux varie entre 33 et 42 jours pour les lignées cellulaires H460 et H460MGFP respectivement (Figure Sa). De plus, le nombre de métastases fluorescentes détectables augmente fortement après 35 jours, tandis que le nombre de métastases qui pourraient être détectées sous lumière blanche augmente lentement durant ce temps pour les deux lignées cellulaires (Figure 5b). L'étendue comparative des métastases obtenues sous lumière blanche ou UV illustre l'intérêt de l'expression de la GFP pour déterminer le nombre de métastases. Après 49 jours, le nombre et la taille des macrométastases pourrait gêner la détermination du nombre total de métastases fluorescentes (Tableau 1).

IV Conclusion
On n'observe aucune altération significative des caractéristiques morphologiques et biologiques, telles que la prolifération, le chimiotactisme, l'adhésion et l'invasion cellulaire, pour la lignée cellulaire H460MGFP comparée à la lignée H460M. La lignée H460MGFP sélectionnée, conserve sa capacité de former des métastases pulmonaires, et permet la détection précoce de micrométastases exclusivement dans le poumon, ce qui montre une affinité spéciale de ces cellules pour l'endothélium pulmonaire. La fluorescence de la GFP ne requiert aucune préparation et peut être visualisée dans les tissus frais sans interférence avec la GFP endogène. La quantité significative de métastases fluorescentes pulmonaires obtenues en utilisant le modèle selon l'invention, démontre in vivo que la lignée cellulaire H460MGFP est stable à long terme vis-à-vis de la GFP, et montre que sa capacité à former des métastases pulmonaires n'a pas été modifiée.

L'utilisation de la GFP augmente considérablement la capacité à détecter des métastases pulmonaires au niveau microscopique. Le modèle selon l'invention permet de détecter les micrométastases pulmonaires chez 100% des animaux après deux semaines suivant l'injection de H460MGFP aux dits animaux.

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Le modèle selon l'invention permet donc d'étudier facilement les cinétiques de formation des métastases pulmonaires, et représente ainsi une méthode in vivo rapide, reproductible et facile à utiliser pour détecter la variation du nombre de métastases.

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[17] MIGNATTI et al., Cell, 47,489-498 (1986).

Claims (11)

REVENDICA TIONS

1. Utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable pour ladite protéine, - elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes, - elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.

2. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460 présentant les propriétés suivantes : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable pour ladite protéine, - elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal, - elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.

3. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M, exprimant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou

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- des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence.

4. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon la revendication 3, exprimant la protéine fluorescente verte GFP (dénommée H460MGFP).

5. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est : - stable pendant au moins 90 jours in vitro et pendant au moins 49 jours in vivo, - capable de former des métastases pulmonaires spontanées fluorescentes.

6. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable pour ladite protéine, - elle est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal, - elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.

7. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre au moins une protéine thérapeutique, notamment choisie dans le groupe constitué par les protéines de la famille de l'inhibiteur inter-a de la trypsine, les protéines de la famille des métalloprotéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des cystéines protéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des aspartates protéases et leurs inhibiteurs, les protéines liant l'acide hyaluronique (hyaladérine), ou dans le groupe des facteurs intervenant dans la néovascularisation et/ou la croissance tumorale, ou dans le groupe des protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire.

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8. Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, dénommée H460MGFP, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, telle que déposée auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C. N.C.M) à Paris, le 23 juin 1999, sous le numéro I- 2242.

9. Utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, pour fournir un modèle : - permettant d'engendrer la formation d'un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes chez un animal, ledit nombre variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court variant d'environ 2 à environ 7 semaines après injection chez ledit animal de cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, - permettant de déceler la présence d'au moins 1 à environ 20 micrométastases dès le 13ème jour, notamment dès le 14ème jour suivant l'injection à un animal de cellules provenant de la lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, - ne nécessitant pas d'implantation orthotopique, pour cribler de façon précoce des médicaments ciblés contre les propriétés d'adhésion, d'invasion et de prolifération de cellules cancéreuses.

10. Procédé de détection de métastases (micro- et macrométastases) pulmonaires caractérisé en ce que : - on injecte, par voie sous-cutanée, à un animal des cellules provenant de la lignée cellulaire telle que définie selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, notamment en une quantité d'environ 1.107 cellules/animal, - on récupère entre environ 13 et 49 jours après ladite injection, l'un au moins des organes choisis dans le groupe constitué par le foie, les intestins, le c#ur et les poumons dudit animal, - on détermine le nombre total de métastases (micro- et macrométastases) présents dans lesdits organes, à l'aide de moyens physiques appropriés.

11. Procédé de préparation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que

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(a) on transfecte les cellules provenant de la lignée cellulaire dénommée H460M, par un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique codant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente bleue (BFP), la protéine fluorescente jaune (RSGF ou EGFP), GFPUV, ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence, (b) on met lesdites cellules transfectées en présence d'un milieu de sélection permettant de sélectionner les cellules ayant intégré le gène de résistance à un antibiotique, et notamment le gène de résistance à la généticine, (c) on récupère des colonies fluorescentes environ 14 jours après l'étape a) de transfection, (d) on maintient éventuellement en culture lesdites colonies fluorescentes sous pression de sélection.