WO2001004339A1

WO2001004339A1 - Procede de production d'acide gras hydroxyle et de delta-lactone

Info

Publication number: WO2001004339A1
Application number: PCT/JP2000/004535
Authority: WO
Inventors: Chiaki Saitoh; Yukiko Masuda; Atsushi Yashiro; Hiroki Ishiguro
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2001-01-18
Also published as: EP1197560A1; JP4474082B2; US6777211B1; CA2378968A1; EP1197560A4; AU5850000A; US20040197882A1

Description

明細書

水酸化脂肪酸および <5—ラク卜ン類の製造方法技術分野

本発明は、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸から [η— 6 ] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸の製造方法に関する。また、本発明は、該脂肪酸から 6—ラクトン類の製造方法および δ—ラクトン類を含有する組成物の製造方法に関する。背景技術

ラクトン類はフルーツ香やミルク香といった好ましい香気を付与するので多くの食品中に添加され使用されている重要な化合物である。しかし、ラクトン類は天然原料中には低濃度でしか存在しないことから、一般的には化学合成品が使用されている。

ラクトン類の微生物による生産方法としては、乳酸菌およびビフィズス菌 [ ガストロェンテロジー（Gastroenterology) ， 62, 430 (1972) ] 、コリネパクテリゥム属細菌 [ァグリカルチュラル ·アンド 'バイオロジカル · ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry) ， 45， 2025 ( 1981) ] 、シユードモナス属細菌 [アチーブス ·ォブ ·バイオケミストリィ—— ·アン卜、 ·ノィ才フィジクス (Archives of Biochemistry and Biophysics ) , 9_9^, 249 (1962) ] などの微生物がォレイン酸からァ—ドデカラクトン前駆体である 10—ヒドロキシォク夕デ力ン酸を生成させる方法が知られている。また、 10—ヒドロキシォクタデカン酸、ひまし油中のリシノール酸などの水酸化された脂肪酸を酵母によってァーラクトン類に変換することが知られている（特開昭 60— 66991号公報、特開昭 60— 100508号公報）

ラクトン類を生産する酵母であるスポロポロマイセス ·ォドルス（

Sporobolomyces odorus) がリノール酸から δ—デカラクトンを生産することが知られている。 1 3—ヒドロキシー9， 1 1—ォクタデセン酸（13- hydroxy - 9Z, HE-octadecadienoic acid) [コリオ一ル酸 (coriol ic acid) ] から δ— デカラクトンが生産されることから、その中間体として酵母がコリオール酸を生産することが推測されている [エー ·シー ·エス ·シンポジウム ·シリーズ，フレバー ·プレカーサ一ズ（ACS SYMPOSIUM SERIES, flavor Precursors) , _4 90， 46 (1 992) ] 。

リノ一ル酸を光酸素化あるいはダイズ · リポキシゲナーゼ処理して得られるヒドロペルォキシドを還元処理して得られるコリオール酸を前駆体にして、クラドスポリゥム属細菌や酵母によって δ—デカラクトンに変換する方法（特開平 3— 187387号公報）は知られている。また、コリアリア 'ネパレンシスの種子油に含まれるコリオール酸やメキシカン ·ャラップの根から抽出した 1 1ーヒドロキシパルミチン酸を前駆体にして、クラドスポリゥム属細菌 [ジャ一ナル ·ォブ ·オルガニック ·ケミストリー（Journal of Organic Chemistry ) ， 4979 (1989) ] や酵母 [ジャーナル ·ォブ ·オルガニック 'ケミストリー（Journal of Organic Chemistry) ， 57 , 1954 (199 2) 、特開平 3_ 219886号公報] によって δ—デカラクトンに変換する方法は知られている。

しかしながら、微生物によってそれぞれリノール酸と α—リノレン酸から 1 3—ヒドロキシー 9ーォク夕デセン酸（13- hydroxy- 9- octadecenoic acid) と 13—ヒドロキシ _ 9， 15—ォク夕デカジエン酸（13- hydroxy-9, 15 - octadecadienoic acid) を生成させそれぞれ <5—デカラクトンとジャスミンラクトンを製造する方法は知られていない。発明の開示

本発明の目的は、微生物により n (nは 1 0以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸から [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を製造する方法を提供することである。また本発明の目的は、微生物により該脂肪酸から δ—ラクトン類を製造する方法および d—ラクトン類を含有する組成物を提供することである。

本発明は、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸の、 [n— 5 ] にヒドロキシを [n— 6] 位に水素を導入し [n— 6] 位を単結合とする活性を有する微生物（以下、第一の微生物という）の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含有する組成物に作用させ、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を生成させ、生成した [n— 6] 位が単結合の [n_5] —ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特徴とする [n— 6] 位が単結合の [n— 5] — ヒドロキシ脂肪酸の製造方法に関する。

また、本発明は、式（I)

で表される 13—ヒドロキシ— 6， 9ーォク夕デカジエン酸（13-hydroxy - 6, 9-octadecadienoic acid) に関する。

また、本発明は、第一の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n - 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含む組成物に作用させ [n - 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸生成させ、次いで、 [n— 6] 位が単結合の [n_ 5] —ヒドロキシ脂肪酸を 3酸化する活性を有する微生物（以下、第二の微生物という）の菌体、培養液またはそれらの処理物を作用させ、生成する δ—ラクトン類を採取することを特徴とする、 δ—ラクトン類の製造方法に関する。

また、本発明は、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸を含有する組成物に、第一の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を作用させ、該組成物中に [ n— 6 ] 位が単結合の [ n— 5 ] —ヒドロキシ脂肪酸を形成させ、次いで第二の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を作用させることを特徴とする <5—ラクトン類を含有する組成物の製造方法に関する。

さらに、本発明は、上記の製造方法で製造される δ—ラクトン類または δ— ラクトン類を含有する組成物を食品に添加することを特徴とする、 <5—ラクトン類を含有する食品の製造方法に関する。

本発明において [ η— m] 位が二重結合であるとは、 [ n— m] 位と [ n— (m- 1 ) ] 位との間が二重結合であることを意味する。

本発明の、 n ( nは 1 0以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [ n— 6 ] 位が二重結合である脂肪酸としては、 [ n- 6 ] 位が二重結合、好ましくはシス体の二重結合である、モノエン脂肪酸、ジェン脂肪酸、トリェン脂肪酸等があげられる。

ジェン脂肪酸、トリェン脂肪酸等のポリェン脂肪酸としては、非共役ポリェン脂肪酸であることが好ましく、 [ n— 9 ] 位が二重結合、特にシス体の二重結合を有していることが好ましい。また、 nが 1 2以上の場合、 δ _ラクトン類を生成させるためには、 [ n— 1 0 ] 位以下は単結合の脂肪酸であることが好ましい。

nは 1 0以上の偶数であれば上限は特にないが、 1 0以上 3 2以下が好ましく、 1 2以上 2 6以下がより好ましく、 1 6以上 2 2以下が特に好ましい。モノエン脂肪酸としては、例えばデセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、へキサデセン酸、ォク夕デセン酸、ィコセン酸、ドコセン酸、テトラコセン酸、へキサコセン酸、ォクタコセン酸、トリアコンテン酸、ドトリアコンテン酸、テトラトリアコンテン酸等があげられる。

ジェン脂肪酸としては、例えばデカジエン酸、ドデカジエン酸、テトラデカジェン酸、へキサデカジエン酸、ォク夕デカジエン酸、ィコサジェン酸、ドコサジェン酸、テトラコサジェン酸、へキサコサジェン酸、ォク夕コサジェン酸、トリアコン夕ジェン酸、ドトリアコン夕ジェン酸、テトラトリアコン夕ジェン酸等があげられる。

卜リエン脂肪酸としては、例えば、デカトリェン酸、ドデカトリェン酸、テトラデカトリェン酸、へキサデカトリェン酸、ォク夕デカトリェン酸、ィコサトリェン酸、ドコサトリェン酸、テトラコサトリェン酸、へキサコサトレェン酸、ォク夕コサトリェン酸、トリアコンタトリエン酸、ドトリアコタトリエン酸、テトラ卜リアコン夕トリェン酸等があげられる。

これら脂肪酸としては、例えば 4—デセン酸、 7， 10—へキサデカジエン酸、 6, 10 _へキサデカジエン酸、 12—ォク夕デセン酸、リノール酸、 α —リノレン酸、了一リノレン酸、 1 1， 14—ィコサジェン酸、 5， 1 1， 1 4—ィコサトリェン酸、 8， 1 1， 14—ィコサトリェン酸、ビスホモ—ァ— リノレン酸、 1 1， 14， 17—^ Γコサトリェン酸、 6， 9, 12， 15—ォクタデカテトラェン酸、 13， 16—ドコサジェン酸、 7, 10， 13， 16 —ドコサンテトラエン酸およびァラキドン酸があげられるが、リノール酸、 a —リノレン酸およびァ一リノレン酸が好ましく、リノール酸およびひ一リノレン酸がより好ましい。

本発明では、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸を含有する組成物も用いられる。該組成物としては、天然油脂、食品またはこれらの加水分解物等があげられる。

天然油脂としては、例えば東柏油、月見草種子油、大豆油、コーン油、サフラヮー油、小麦胚芽油、米油、ごま油、なたね油、ォリーブ油、あまに油、乳脂、牛脂、豚油、卵黄油、魚油、海草、藻類、糸状菌類、シダ類、原生動物類等があげられる。

食品としては、豆乳等、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸を含有する食品の他、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸を含有しない食品に、該脂肪酸を添加して得られる食品があげられる。

天然油脂または食品の加水分解物は、天然油脂または食品に加水分解酵素等を処理することにより得られる。

加水分解酵素としては、リパーゼ等があげられる。組成物中の n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸の含量は、特に制限はないが、好ましくは 0. 01〜99重量％、より好ましくは 0. 1〜 90重量％である。

本発明における δ—ラクトン類としては、例えば δ—デカラクトンまたはジヤスミンラクトン等、式（II)

(式中、 Rは η—ペンチルまたは η—ペンテニルを表す）で表される <5—ラクトン類があげられる。

本願発明で用いられる第一の微生物としては、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合、好ましくはシス体の二重結合である脂肪酸の、 [η— 5] 位にヒド口キシを [η_6] 位に水素を導入し [η— 6] 位を単結合とする活性を有する微生物であればいずれも用いられるが、リノール酸、ひ—リノレン酸またはァ—リノレン酸の 13位にヒドロキシを 12位に水素を導入し 12位を単結合とする活性を有する微生物であることが好ましい。

第一の微生物としては、例えば乳酸菌およびビフィズス菌があげられる。乳酸菌としては、例えばべディォコッカス ·ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus) 等、ぺディォコッカス属に属する微生物があげられる。ビフィズス菌としては、例えばビフィドバクテリゥム · ビフィダム (Bifidobacterium bifidum) 等、ビフィドバクテリゥム属に属する微生物があげられる。第一の微生物としては、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891、ぺディォコッカス ·エスピー（Pediococcus sp. ) I F〇 3778、ビフイドバクテリウム · ビフィダム J CM7002等が好適に用いられる。本願発明で用いられる第二の微生物としては、 [n— 6] 位が単結合の [n 一 5] —ヒドロキシ脂肪酸を /3酸化する活性を有する微生物であれば、酵母等、いかなる微生物でも用いられる。

酵母としては、例えばクリベロマイセス属、ザィゴサッカロマイセス属、パフィァ属またはサッカロマイセス属に属する微生物等があげられる。

クリベロマイセス属に属する微生物としては、例えばクリベロマイセス ·マキシアンス（Kluyveromyces marxianus) 、クリベロマイセス ·サーモトレランス (Kluyveromyces thermotolerans) 、クリベロマイセス ·ゥイツケラミィ Kluyveromyces wickerhami i) 等、ザィゴサッカロマイセス属に属する微生物としては、例えばザィゴサッカロマイセス ·ルキシ一（Zygosaccharomvces rou u ) 、ザィゴサッカロマイセス ·バイリ一（Zygosaccharomyces bailii) 、ザィゴサッカロマイセス 'シードリ (Zygosaccharomyces cidri) 等、パフィァ属に属する微生物としては、例えばパフィァ ·ジャジ二一（Pichia jadinii) 等、サッカロマイセス属に属する微生物としては、例えばサッカロマイセス ·セレビシ X(Saccharomyces cerevisiae)等があげられる。第二の微生物としては、例えば、クリベロマイセス ·マキシアンス I F〇 1090、クリベロマイセス，サーモトレランス ATCC 24177、クリベロマイセス 'ウイッケラミィ、 A TCC 24178、ザィゴサッカロマイセス 'ルキシ一 NFR 2007、ザィゴサッカロマイセス ·バイリー ATCC 8766 、ザィゴサッカロマイセス · シードリ ATCC46819、パフィァ ·ジャジ二一 I F〇 0987、サッカロマイセス 'セレビシェ協会 701号（清酒酵母）等が好適に用いられる。これら微生物は、いずれも単独でまたは混合して用いることができる。

これらの微生物を人工的変異法、例えば紫外線照射、 X線照射、変異誘起剤処理、遺伝子操作などで変異させて得られる変異株あるいは自然に変異した変異株でも、上述の活性を有する微生物であれば、本発明に用いることができる。これらの微生物の培養に用いられる培地としては、乳酸菌、ビフィズス菌または酵母等の培養に通常用いられる培地であれば、炭素源、窒素源、無機物、微量成分などを含有する合成培地、天然培地等、いずれも用いることができる。炭素源としては、澱粉、デキストリン、シュクロース、グルコース、マンノース、フルク！ス、ラフイノース、ラムノース、イノシトール、ラク！ ^一ス、キシロース、ァラビノース、マンニトール、糖蜜、ピルビン酸などがあげられこれらを単独または組合せて用いることができる。使用量は 1〜20 gZLが好ましい。

窒素源としては、塩^:アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥムなどのアンモニゥム塩、硝酸ナトリゥム、硝酸カリウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽ェキス、コーン ·スティープ · リカ一、カゼイン分解物、大豆粉、野菜ジュース、カザミノ酸、尿素、などの窒素含有有機物などがあげられ、これらを単独または組合せて用いることができる。使用量は 1〜20 g/Lが好ましい。

無機物としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシゥム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などがあげられ、これらを単独または組合せて用いることができる。使用量は 0. l〜2gZ Lが好ましい。

微量成分としては、ピオチン、サイァミン、ニコチン酸等のビタミン類、 i3 —ァラニン、グルタミン酸等のアミノ酸類などがあげられ、これらを単独または組合せて用いることができる。使用量は 0. 0001〜2 gZLが好ましい。培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が好ましい。培地は、 p H2〜l l、好ましくは pH3〜10、より好ましくは pH4〜 8に調整し、 10〜80°C、好ましくは 10〜60 ：、特に好ましくは 20〜40でで、通常 6時間〜 7日間培養する。培地の pH調整にはアンモニア水や炭酸アンモニゥム溶液などが用いられる。

本発明に用いる培養液の処理物としては、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸の、 [n— 5] にヒドロキシを [n— 6] 位に水素を導入し

[n— 6] 位を単結合とする活性を有する微生物の菌体、該微生物を含有する培養液またはそれらの処理物等があげられる。

該微生物の菌体処理物としては、該微生物の菌体の乾燥物、冷凍物、冷蔵物、凍結乾燥物、加熱物、加圧物、超音波破砕物、界面活性剤または有機溶剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体から抽出または精製して得られる酵素等があげられる。

菌体から酵素を抽出または精製する方法としては、タンパク質の一般的な抽出、精製方法を用いることができる。酵素は、例えば菌体をホモジナイザ一、ガラスビーズ、アンモニア溶解、酵素法などを用いて抽出し、ろ過、遠心分離、塩析、有機溶媒沈殿、免疫沈降などの方法を用いる他、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、電気泳動法、吸着剤、ァフィ二ティー吸着体、分子篩などを用いたクロマトグラフィー法、液相分配法、イオン交換法、バッチ法、結晶化法などの手法を単独または組み合わせて用いて精製することができる。

該微生物を含有する培養液としては、培養終了後に得られる培養液をそのまま用いてもよいが、濃縮、乾燥、冷凍、冷蔵、凍結乾燥、加熱、加圧、超音波破砕、界面活性剤もしくは有機溶媒処理、または溶菌酵素処理などの手法を単独または組合せて処理物を取得し、これを用いてもよい。

次に、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸の製造方法および δ—ラクトン類の製造方法について述べる。

第一の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含む組成物に作用させ、生成する [η— 6] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を採取することにより、 [η— 6] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を製造することができる。具体的には、以下の様にして製造することができる。

該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物と、 η (ηは 10以上の偶数 ) 個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含む組成物とを、必要に応じて水等の水性媒体を加えた上で、 10〜80°C、好ましくは 20〜40°C、 pH2 〜1 1、好ましくは pH3〜l 0、より好ましくは pH5〜8で、 6時間〜 7 日間、好ましくは 1〜4日間反応させる。

反応液中には、必要に応じて、緩衝液、界面活性剤、有機溶剤、抗酸化剤等を添加してもよい。

緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、クェン酸緩衝液等をあげることができる。緩衝液の濃度は 0. 0 l〜lmo 1 ZLが好ましい。

界面活性剤としては、例えばショ糖脂肪酸エステル、ソルビ夕ン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等をあげることができる。界面活性剤の濃度としては、 0. ：!〜 5%が好ましい。

有機溶剤としては、エタノール等をあげることができる。有機溶剤の濃度としては、：！〜 50 g/Lが好ましい。

抗酸化剤としては、食品に利用可能な抗酸化剤があげられ、例えばひ一トコフエロール、ビタミン E、ブチルヒドロキシァ二ソ一ル（BHA) 、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT) 、脱脂粉乳等があげられる。抗酸化剤の濃度としては、 0. 01〜50 gZLが好ましい。

微生物の菌体を用いる場合は、第一の微生物を炭素源、窒素源等を含有する 5〜5 OmLの培地に 1〜3白金耳植菌し、 1〜 5日間静置培養して得られる種培養液を、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であつて、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含有する組成物に 0. ：!〜 5%植菌し、静置または低速で攪拌培養を行う。培養温度は、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸に変換可能な温度であれば、第一の微生物は増殖してもしなくてもよく、好ましくは、 5〜40でである。培養時間は条件により異なるが、通常 1〜4日間程度である。

反応液中または培養物中に含まれる、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸から変換される [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を抽出および検出する方法としては、通常の脂質の抽出方法および薄層クロマトグラフィー（TLC) による脂質の検出方法を用いることができる。すなわち、約 0. 2〜 1 Om lの反応液に約 30〜80重量％のクロ口ホルム Z メタノール（2 ： 1, v/v) などの溶媒を添加して 10分間振とうした後、遠心分離を行って溶媒層を脂質抽出液として分取する。分取した脂質抽出液 1 〜20 Atlをシリカゲルプレコート TLCプレートにスポットして適当な溶媒系を用いて展開後、適当な発色剤により発色させる。プレート上の発色により、 [n-6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を検出することができる。

TLCプレートとしては、例えば TLCガラスプレート 60 (No. 572 1、メルク社製）等が用いられる。

反応液または培養物から [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を単離、精製するには、脂質を単離、精製するための通常の方法が用いられる。すなわち、ろ過、遠心分離などによる菌体除去、ジェチルェ一テル Zトルェン（15 ： 85〜 60 : 40， vZv) などの溶媒による脂質抽出、吸着樹脂、シリカゲル、逆相シリカゲル、酸化アルミニウム、セルロース、ゲイ藻土、ゲイ酸マグネシウム、ゲル濾過剤、イオン交換樹脂などを用いるカラムクロマトグラフィーもしくは薄層ク口マトグラフィ一による脂質の吸脱着処理、または適当な溶媒系による分配などを行うことによって、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を単離、精製することができ、純度が約 90 〜 100 %のものを得ることができる。

[n-6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸は、上述の方法で薄層クロマトグラフィ一を行うことにより検出することができる。

また、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸は、例えば以下の条件で高速液体クロマトグラフィーを行うことにより、定量することがでさる。

装置： SPD - 1 OA (島津製作所製）

カラム： TSK— ge l ODS— 80T s (東ソ一製）、

移動相： A液：ァセトニトリル Z水 Z酢酸

(28 : 72 : 0. 02， v/v/v)

B液：ァセトニトリル Z水 Z酢酸

(52 : 48 : 0. 02， v/v/v)

A液（10分）、 A液→B液（60分直線濃度勾配）、 B液（30分）流量： 2ml Z分、温度： 40° (：、検出： UV— 200 nm [n-6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸は、食品添加物等として有用な δ—ラクトン類の製造に用いることができる。

以下に、 [η— 6] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸から δ—ラクトン類の製造方法について述べる。

第二の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物と、上述の方法により製造される [η— 6] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を含有する反応液、該反応液処理物または該反応液から単離した [η— 6] 位が単結合の [ n-5] —ヒドロキシ脂肪酸とを、必要に応じて水等の水性媒体を加えた上で、 10〜80°C、好ましくは 20〜50°C、 pH2〜9、好ましくは pH3〜8、より好ましくは pH4〜7の条件下で 12時間〜 7日間、より好ましくは 1〜 4日間、特に好ましくは 2〜 3日間反応させる。

[n-6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を含有する反応液処理物とは、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を含有する反応液を単離、精製する過程で得られる [n— 6] 位が単結合の [n— 5] - ヒドロキシ脂肪酸を含有する処理物をいう。

反応液には、必要に応じてさらに前述の緩衝液、界面活性剤、有機溶剤、抗酸化剤等を添加することができる。

微生物の菌体を用いる場合は、第二の微生物を炭素源、窒素源等を含有する 5〜5 OmLの培地に 1〜3白金耳植菌し、 1〜5日間静置培養して得られる種培養液、または 100111 〜1しの培地に該種培養液を1〜5%植菌して1 〜 5日間静置培養して得られる種培養液を、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5 ] —ヒドロキシ脂肪酸を含有する反応液に 0. 1〜50%植菌し、通気攪拌等により好気的条件下で培養を行う。通気攪拌条件には特に限定はないが、通気は 0. 01〜3 V vm、攪拌は 200〜： L 200 r pmであることが好ましい。培養温度は、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を δ—ラクトン類に変換可能な温度であれば微生物が成育しない温度でもよく、好ましくは 5〜35°Cである。培養時間は条件により異なるが、通常 12時間〜 7日間である。

第二の微生物との反応または培養終了後、反応液または培養物を p H 1〜 6、好ましくは pH3〜5に調整し、さらに 5〜80°C、好ましくは 20〜35 で 30分以上反応させると、 δ—ラクトン類の生成量を増大させることができる。該方法は、例えばサッカロマイセス ·セレピシェゃクリベロマイセス ·マキシアンス等を第二の微生物とした場合に、好適に用いられる。

反応液または培養物から <5—ラクトン類を単離、精製するには、通常の溶媒抽出法等を用いることができる。すなわち、約 0. 2〜10mlの反応液または培養液に約 20〜60重量％のペンタン Zエーテル混合溶媒（5 ： 95〜80 : 20， vZv) と 20〜60重量％の飽和食塩水を添加して 10分間振とうした後、遠心分離して得られる上清を分取することにより、 δ—ラクトン類を単離、精製することができる。

(5—ラクトン類は、例えば以下の条件でガスクロマトグラフィーを行うことにより、定量することができる。

装置：ガスクロマトグラフ質量分析計 G CMS— QP 5000 (島津製作所製）

カラム： TC一 WAX 60m 0. 25mmX 0. 25 rn,

ヘリウム流量： 0. 5ml /分、

カラム温度： 40°C (0. 5分）一 5°CZ分一 240°C (69. 5分）圧力： 50Kp a (0分）一 5Kp aZ分一 30 OKp a (60分） δ—ラクトン類標準標品： δ—デカラクトン（アルドリッチ社製）、ジャスミンラクトン（日本ゼオン社製）

上記方法によって得られる、 δ—ラクトン類を含有する反応液または培養物は、そのまま、または必要により殺菌した後、もしくはろ過で固形物を除去した後、食品等に添加することができる。また、 δ—ラクトン類を精製した後、これを食品等に添加することができる。

δ—ラクトン類はいずれの食品に添加してもよい力例えば乳飲料、乳加工品、畜産加工品、洋菓子、アイスクリーム、スナック等の菓子類、ホワイトソース、チーズソース、ドレッシング等の調味料類などに好適に添加される。

δ—ラクトン類は、食品における濃度が、約 0. 1〜100 ppm、好ましくは約 0. 25〜20 p pmとなるように、通常配合される。以下に、本発明の実施例、比較例および試験例を示す。発明を実施するための最良の形態

以下の実施例において、 F A Bマススぺクトル測定および高分解能 FABマススペクトル測定は、 J MS—HXZHX 1 1 0 A (日本電子社製）を、 NM R測定は J NM— A40 0 (日本電子社製）を用いて、常法に従い行った。実施例 1 ヒドロキシ脂肪酸の生成

リノール酸、アーリノレン酸、ひ一リノレン酸、シス一 1 1，シス一 1 4一ィコサジェン酸、シス _ 8，シス— 1 1，シス— 14—ィコサトリェン酸、シス一 1 1, シス— 14, シス— 1 7 Γコサトリェン酸、シス一 1 3, シス— 1 6—ドコサジェン酸、シス— 1 2—才ク夕デセン酸（以上、シグマ社製）を、各々 0. 5 gずつ 1 00m 1の栄養培地（酵母エキス 0. 1 8 g、ポリぺプトン 0. 42 g、 60 %液体グルコース 0. 6 2m l、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィーミックス 8 0 (ェ一ザィ製）を 0. 02m l、分散剤として脱脂粉乳を 2 g添加して、ぺディォコッカス ·ペントサセウス (Pediococcus pentosaceus) I F〇 3 8 9 1の種培養液を 3 m 1植菌し、 2 5 °Cで 2日間、 8 0 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、各々の培養液 0. 5m lに、等量のクロ口ホルム Zメタノール (2 : 1， v/v) 溶媒を加えて脂質を抽出し、得られた脂質抽出液を 5 1 ずつ TLCガラスプレート 'シリカゲル 6 0 (No. 5 7 2 1、メルク社製）にスポットした。第 1段回目の展開として、トルエン Zジェチルエーテルエ夕ノール Z酢酸（5 0 ： 40 ： 2 ： 0. 2, vZvZvZv) を用いて 2 0分間展開した後、プレートを乾燥させた。第 2段回目の展開として、へキサンジェチルエーテル（94 ： 6, v/v) を用いて 3 5分間展開した後、プレートを乾燥させた。発色剤として、 6 gZl 0 0m l酢酸銅を含む 8 % (w/w ) りん酸溶液を適量展開面に噴霧し、 1 40°Cで 2 5分間加熱した。

結果を第 1表に示す。丄 2¾

第 1表に示されるとおり、いずれの脂肪酸を用いた場合でも、ヒドロキシ脂肪酸が、その R f値として期待される位置である R f値 =0. 13〜0. 22 の位置に、褐色のスポットとして検出された。

実施例 2 リノール酸の水酸化物の製造

リノール酸 5 gを 100 Om 1の栄養培地（酵母エキス 1. 8 g、ポリぺプトン 4. 2 g、 60%液体グルコース 6. 2mlを含む、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィーミックス 80を 0. 2ml、分散剤として脱脂粉乳を 20 g添加して、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891の種培養液を 3 Oml植菌し、 25 で 2日間、 80 r pmで攪拌培養した。

得られた約 1000mlの培養液に約 120重量％のジェチルエーテル Zトルェン（4 ： 5, v/v) 混合溶媒を添加して約 20分間振とうした後、遠心分離して上清を分取し、これを脂質抽出液とした。脂質抽出液をロータリ一ェバポレー夕一で約 5 Omlに濃縮した後、約 80 gのシリカゲル（Wa k o g e l C— 2000) の入った内径 3. 14 c mx 50 c mのガラス管を用い、以下の方法により、カラムクロマトグラフィーを行った。カラムを上記の混合溶媒 300m 1で洗浄した後、濃縮した脂質抽出液を添加し、上記の混合溶媒 50 Om 1を 3m 1ノ分の速度で流し、 5m lずつの画分に分けて溶出した。各溶出画分の脂質を、シリカゲルプレコート TLCプレ —ト上で展開し、 13—ヒドロキシー 9ーォク夕デセン酸（13- hydroxy-9- octadecenoic acid) を検出、取得した。

[13—ヒドロキシー 9—ォクタデセン酸の理化学的性質]

( 1 ) 分子式： C 0₃

(2) FABマススペクトル： m/z 299 (M+H) ⁺

(3) 高分解能 FABマススペクトル： m/z 299.2592 (M+H)⁺, C₁₈H₃₅0₃としての計算値 = 299.2586

(4) '³C— NMRスペクトル（100MHz, CDC1₃)： δ ppm (多重度）， 179.2(s), 130.5(d), 129.3(d), 71.9(d), 37.4(t)， 37.3(t), 34.0(t), 31.9(t), 29.7(t), 28.9(t), 28.9(t), 28.9(t), 27.1 (t), 25.3(t), 24.7(t), 23.6(t), 22.6(t), 14.0(q)

( 5 ) Ή一 NMRスぺクトル（400MHz, CDC1₃)： δ ppm (積分、多重度、結合定数 J (Hz) ) ， 5.38 (1H, m), 5.38 (1H, m), 3.63 (1H, m), 2.33 (2H, t, 7.4), 2.12(2H, m), 2.0 (2H, q, 6.5), 1.63 (2H, m), 1.52 (2H, m), 1.52 (2H, m), 1.44 (2H, m),

1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 0.89 (3H, t, 6.8)

実施例 3 ひ一リノレン酸の水酸化物 (13- hydroxy- 9， 15- octadecadienoic acid) の製造

リノール酸を _α—リノレン酸に代える以外は実施例 2と同様に行い、 13 - ヒドロキシ— 9， 15—ォク夕デカジエン酸（13-hydroxy-9， 15 - octadecadienoic acid) 取 ί寻し 7こ。

[13—ヒドロキシー 9, 15—ォク夕デカジエン酸の理化学的性質]

( 1 ) 分子式： C₁₈H₃₂0₃

(2) FABマススペクトル： m/z 297 (M+H) ⁺

(3) 高分解能 FABマススペクトル： m/z 297.2421 (M+H)⁺, C_1SH₃₃0₃としての計算値 = 297.2430

(4) ¹³C— NMRスペクトル（100MHz, CDC1₃)： (5 ppm (多重度)， 178.3(s), 135.2(d), 130.6(d), 129.2(d), 124.4(d), 71.3(d), 36.7(t), 35.3(t)， 33.9(t), 29.5(t), 28.9(t), 28.9(t), 28.9(t), 27. l(t), 24.7(t), 23.7(t), 20.7(t), 14.3 (q) (5) Ή— NMRスぺクトル（400MHz, CDC1₃)： <5ppm (積分、多重度、結合定数 KHz) ) , 5.56(lH,m), 5.38 (1H, m), 5.37(1H, m), 5.37 (1H, m), 3.65 (1H, m),

2.34 (2H, t, 7.4), 2.23 (2H, t, 7.1), 2.15(2H, m), 2.07 (2H, m), 2.03 (2H, m), 1.64 (2H, m, 7.1), 1.54(2H, m), 1.32 (2H, m), 1.32 (2H, m), 1.32 (2H, i),

1.32 (2H, m), 0.97 (3H, t, 7.4)

実施例 4 丁一リノレン酸の水酸化物 (13-hydroxy-6, 9-octadecadienoic acid ) の製造

リノール酸をアーリノレン酸に代える以外は実施例 ₂と同様に行い、 1₃一ヒドロキシ— 6， 9ーォクタデカジエン酸（13- hydroxy- 6， 9- octadecadienoic acid) を得た。

[13 _ヒドロキシ— 6， 9—ォクタデカジエン酸の理化学的性質]

( 1 ) 分子式： C,₈H₃₂0₃

(2) FABマススペクトル： m/z 297 (M+H) +

(3) 高分解能 FABマススペクトル： m/z 297.2426 (M+H)⁺, C,₈H₃₃0₃としての計算値 = 297.2430

(4) '³C— NMRスペクトル（100MHz, CDC1₃)： δ ppm (多重度）， 178.6(s), 129.6(d), 129.4(d), 128.4(d), 128.4(d), 71.8(d), 37.4(t), 37.1 (t), 33.9(t), 31.9(t), 28.9(t), 26.8(t), 25.6(t), 25.3(t), 24.4(t), 23.6(t), 22.6(t), 14.0(q)

(5) 'H— NMRスぺクトル（400MHz, CDC1₃)： δ ppm (積分、多重度、結合定数 J (Hz) ) ， 5.38 (1H, m), 5.38 (1H, m), 5.38 (1H, m), 5.38 (1H, m), 3.64 (2H, m),

2.80 (2H, t, 5.6), 2.35 (2H, t, 7.3), 2.18(2H, m), 2.09 (2H, q, 7.5), 1.67 (2H, m), 1.55 (2H, m, ), 1.45 (2H, m), 1.45 (2H, m), 1.42 (2H, m), 1.31 (2H, m), 1.31 (2H, m), 0.89 (3H, t, 6.8)

実施例 5

リノ一ル酸を 0. 5 gを 10 Omlの栄養培地（酵母エキス 0. 18 g、ポリペプトン 42 g、 60%液体グルコース 0. 62ml、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィ一ミックス 80を 0. 02mし分散剤として脱脂粉乳を 2 g添加して、第一の微生物としてべディォコッカス ·ペントサセウス I F〇3891の種培養液を 3m 1植菌し、 25 ：で 2日間、 80 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、培養液 0. 5mlに、等量のクロ口ホルム Zメタノール（2 ： 1, v/v) 溶媒を加えて脂質を抽出し、得られた脂質抽出液を 5 1ずつ T LCガラスプレート ·シリカゲル 60に 5 1スポットした。第 1段回目の展開として、トルエン/ジェチルエーテルノエ夕ノール Z酢酸（50 : 40 : 2 ： 0. 2， v/v/v/v) を用いて 20分間展開した後、プレートを乾燥させた。第 2段回目の展開溶媒として、へキサンジェチルエーテル（94 : 6， v/v) を用いて 35分間展開した後、プレートを乾燥させた。発色剤として、 6 gZl 00ml酢酸銅を含む 8% (w/w) りん酸溶液を適量展開面に噴霧し、 1401：で 25分間加熱した。

その結果、リノール酸から変換されたヒドロキシ脂肪酸が、値=0. 1 9の位置に、褐色のスポットとして検出された。

実施例 6

α—リノレン酸 0. 5 gを 100m 1の栄養培地（酵母エキス 0. 18 g、ポリペプトン 0. 42 g、 60%液体グルコース 0. 62ml、 pH 6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィーミックス 80を 0. 02ml、分散剤として脱脂粉乳を 2 g添加して、第一の微生物としてべディォコッカス ·ベントサセゥス I F03891の種培養液を 3m 1植菌し、 25でで 2日間 80 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、実施例 1と同様にして培養液からの脂質抽出および薄層クロマトグラフィーを行い、 a—リノレン酸から変換されたヒドロキシ脂肪酸の検出を行った。

その結果、 R f値 =0. 16の位置に、ヒドロキシ脂肪酸が褐色のスポットとして検出された。

実施例 7

アーリノレン酸 0. 5 gを 10 Om 1の栄養培地（酵母エキス 0. 18 g、ポリペプトン 0. 42 g、 60%液体グルコース 0. 62m l、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィーミックス 80を 0. 02ml、分散剤として脱脂粉乳を 2 g添加して、第一の微生物としてべディォコッカス ·ベントサセゥス I F03891の種培養液を 3m 1植菌し、 25°Cで 2日間 80 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、実施例 1と同様にして培養液からの脂質抽出および薄層クロマトグラフィ一を行い、アーリノレン酸から変換されたヒドロキシ脂肪酸の検出を行った。

その結果、 R f値 =0. 17の位置に、ヒドロキシ脂肪酸が褐色のスポットとして検出された。

実施例 8

リノール酸 5 gを 1 Lの栄養培地（酵母エキス 1. 8 g、ポリペプトン 4. 2 g、 60%液体グルコース 6. 2m 1、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィ一ミックス 80を 0. 2m 1、分散剤として脱脂粉乳を 20 g添加して、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F〇3891の種培養液を 3 Om 1植菌し、 25 で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス ·マキシアンス

(Kluyveromyces marxianus) I F〇 1090の種培養液を 30 m 1植菌し、 2 5 で 4日間、 900 r pm、 1 v vmで通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 245 p pmの <5 _デカラクトンが得られた。

実施例 9

α—リノレン酸 5 gを 1 Lの栄養培地（酵母エキス 1. 8 g、ポリペプトン 4. 2 g、 60%液体グルコース 6. 2m 1、 pH6. 5) に添加し、抗酸化剤としてィ一ミックス 80を 0. 2ml、分散剤として脱脂粉乳を 20 g添加して、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F〇3891の種培養液を 3 Om 1植菌し、 25 で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス 'マキシアンス

(Kluyvejomvces marxianus) I F O 1090の種培養液を 30 m 1植菌し、 2 5でで 4日間、 900 r pm、 1 v vmで通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 103 p pmのジャスミンラクトンが得られた。実施例 1 o

930mlの水にコーン油（味の素社製）を 40m l添加し、抗酸化剤としてィーミックス 80を 0. 2ml、加水分解酵素リパーゼ MY (名糖産業社製 ) を 0. 4g添加して、 40 で 24時間加水分解処理をした。得られた加水分解コーン油に、脱脂粉乳 20 g、酵母エキス 1. 8 g、ポリペプトン 4. 2 g、 60%液体グルコース 6. 2mlを添加した後、 pHを 6. 5に調整し、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F〇 3891の種培養液を 3 Om 1植菌し、 25 で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。

(Kluyveromyces marxianus) I F〇 1090の種培養液を 30 m 1植菌し、 2 5Tで 4日間、 900 r pm、 1 v vmで通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 392 p pmの —デカラクトンが得られた。

実施例 1 1

■ 実施例 10と同様にして調製された加水分解コーン油を含有する培地に、ぺディォコッカス ·エスピー（Pediococcus sp. ) I FO 3778の種培養液を 3 0ml植菌し、 25 で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス ·マキシアンス I FO 10 90の種培養液を 30m 1植菌し、 25 °Cで 4日間、 900 r pm、 1 v vm で通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 173 p pmの δ—デカラクトンが得られた。

実施例 12

実施例 10と同様にして調製された加水分解コーン油を含有する培地に、ビフイドバタテリゥム ' ビフィダム (Bifidobacterium bifidum) J CM7002 の種培養液を 30m 1植菌し、 25°Cで 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス ·マキシアンス I FO 10 90の種培養液を 30m 1植菌し、 25°Cで 4日間、 900 r pm、 l vvm で通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 115 p pmの δ—デカラクトンが得られた。

実施例 13 実施例 10と同様にして調製された加水分解コーン油を含有する培地に、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891の種培養液を 30m 1植菌し、 25 で 2日間 400 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、得られた培養液にサッカロマイセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae)協会 701号の種培養液を 3 Oml植菌し、 25でで 4日間、 90 0 r pm、 1 v vmで通気攪拌培養を行った。

その結果、培養液中に 23 ppmの <5-デカラクトンが得られた。さらに、培養液に 90%乳酸（（株）武蔵野化学研究所製）を添加して pH3に調整した後、 25°C、 30分間静置して反応させた。その結果、反応液中に 197 p p mの <5 -デカラクトンが得られた。

実施例 14

実施例 10と同様にして調製された加水分解コーン油を含有する培地に、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891の種培養液を 30m 1植菌し、 25 で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。

培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス 'マキシアンス I F〇l 0 90の種培養液を 3 Om 1植菌し、 25でで 4日間、 900 r pm、 1 v vm で通気攪拌培養を行った。

その結果、培養液中に 378 p pmの 0-デカラクトンが得られた。さらに、培養液に 90%乳酸を添加して ρΗ 3に調整した後、 25°C、 30分間静置して反応させた。

その結果、反応液中に 783 p pmの δ-デカラクトンが得られた。

実施例 15

465mlの水にコーン油（味の素社製）を 2 Oml添加し、抗酸化剤としてィーミックス 80を 0. lmし加水分解酵素リパーゼ MY (名糖産業社製 ) を 0. 2 g添加して 40°Cで 24時間加水分解処理をした。得られた加水分解コーン油に、脱脂粉乳を 10 g、酵母エキス 0. 9 g、ポリペプトン 2. 1 g、 60%液体グルコース 3. 1mlを添加し、 pHを 6. 5に調整し、ぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891の種培養液を 15ml植菌し、 25 ：で 2日間、 400 r pmで攪拌培養した。培養終了後、得られた培養液に栄養培地で 2日間培養したクリベロマイセス •マキシアンス I FO 1090の種培養液 500mlを混合し、 25°Cで 2日間、 900 r pm、 1 v vmで通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 502 p pmの δ—デカラクトンが得られた。

実施例 16

実施例 10で得られた培養物を 85で、 1分間の殺菌処理した後、 0. 6m 1を市販のコーンクリームスープ 200 gに添加した。このスープ中の δ—デカラクトンの濃度は 1. 18 p pmであった。 δ—デカラクトンを含有させた結果、まろやかなミルク感のあるコーンクリームスープとなった。

実施例 17

実施例 10で得られた培養物を 85で、 1分間の殺菌処理した後、 0. 3m 1を市販の低脂肪乳 200m lに添加した。低脂肪乳中の δ—デカラクトン濃度は 0. 59 ppmであった。 δ—デカラクトンを含有させた結果、粉乳臭がマスキングされ、ミルク香の改善された低脂肪乳となった。

実施例 18

豆乳 500m 1に乳酸菌としてべディォコッカス ·ペントサセウス I F03

891を 15ml植菌し、 25 °Cで 1日間静置培養した。

培養終了後、得られた培養液にクリベロマイセス ·マキシアンス I F〇 10

90を 15ml植菌し、 25^で 2日間、 900 r pm、 l vvmで通気攪拌培養を行なった。

その結果、培養物中に 2. 7 p pmの δ—デカラクトンが得られた。また、該培養物は青臭がマスキングされ、風味の改善された発酵豆乳となった。産業上の利用可能性

本発明により、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸から [η 一 6] 位が単結合の [η— 5] —ヒドロキシ脂肪酸の製造方法が提供される。また、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [η— 6] 位が二重結合である脂肪酸から [η— 6] 位が単結合の [ n— 5 ] —ヒドロキシ脂肪酸を経て δ—ラクトン類を製造する方法が提供される。さらに、 η ( ηは 1 0以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [ η— 6 ] 位が二重結合である脂肪酸を含有する組成物から δ—ラクトン類を含有する組成物の製造方法が提供される。本発明によれば、微生物の菌体、培養液またはこれらの処理物により安価な食品原料に由来するリノ一ル酸、 α—リノレン酸およびァ一リノレン酸等の脂肪酸から工業的に有用な <5—ラクトン類を大量かつ容易に製造することができる。

Claims

請求の範囲

1. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸の、 [n— 5] 位にヒドロキシを [n— 6] 位に水素を導入し [n— 6] 位を単結合とする活性を有する微生物（以下、第一の微生物という）の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含有する組成物に作用させ、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を生成させ、生成した [n— 6] 位が単結合の [n_5] —ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特徴とする [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸の製造方法。

2. [n- 6] 位の二重結合がシス体である、請求の範囲 1記載の方法。

3. 第一の微生物がリノール酸、 α—リノレン酸またはアーリノレン酸の 1 3位にヒドロキシを 12位に水素を導入し 12位を単結合とする活性を有する微生物である、請求の範囲 1または 2記載の方法。

4. 第一の微生物が乳酸菌またはビフィズス菌である、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の方法。

5. 第一の微生物がぺディォコッカス（Pediococcus) 属またはビフイドバクテリゥム（Bifidobacterium) 属に属する微生物である、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の方法。

6. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus) またはビフィドバクテリゥム ·ビフィダム (Bifidobacterium bifidum) である、請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の方法。

7. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウス I F〇3891、ぺディォコッカス ·エスピー (Pediococcus sp. ) I FO 3778またはビフィドバクテリゥム ·ビフィダム J CM7002である、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の方法。

8. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6]位が二重結合である脂肪酸がリノール酸であり、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸が 13—ヒドロキシ— 9—ォク夕デセン酸（13- hydroxy_9- octadecenoic acid) である請求の範囲 1 〜 7のいずれかに記載の方法。

9. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸がひ一リノレン酸であり、 [n— 6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸が 13—ヒドロキシ一 9, 15—ォク夕デカジエン酸（13- hydroxy- 9， 15-octadecadienoic acid ) である請求の範囲 1〜7のいずれかに記載の方法。

10. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸がアーリノレン酸であり、 [n— 6] 位が単結合の [n_5] —ヒドロキシ脂肪酸が 13—ヒドロキシ— 6， 9—ォクタデカジエン酸（13 - hydroxy - 6, 9 - octadecadienoic acid

) である請求の範囲 1〜7のいずれかに記載の方法。

11. 式（I)

で表される 13—ヒドロキシー 6， 9一才ク夕デカジエン酸。

12. 第一の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [ n-6] 位が二重結合である脂肪酸または該脂肪酸を含む組成物に作用させ [ n-6] 位が単結合の [n— 5] —ヒドロキシ脂肪酸を生成させ、次いで、 [ n-6] 位が単結合の [II一 5] —ヒドロキシ脂肪酸を /3酸化する活性を有する微生物（以下、第二の微生物という）の菌体、培養液またはそれらの処理物を作用させ、生成する δ—ラクトン類を採取することを特徴とする、 <5—ラク卜ン類の製造方法。

13. δ—ラクトン類が式（Π)

(式中、 Rは n—ペンチルまたは n—ペンテニルを表す）で表される δ—ラクトン類である、請求の範囲 12記載の方法。

14. δ—ラクトン類が δ—デカラクトンまたはジャスミンラクトンである、請求の範囲 12記載の方法。

15. [η - 6] 位の二重結合がシス体である、請求の範囲 12〜 14のいずれかに記載の方法。

16. 第一の微生物がリノール酸、 α_リノレン酸またはアーリノレン酸の 1 3位にヒドロキシを 12位に水素を導入し 12位を単結合とする活性を有する微生物である、請求の範囲 12〜15のいずれかに記載の方法。

17. 第一の微生物が乳酸菌またはビフィズス菌である、請求の範囲 12〜1 5のいずれかに記載の方法。

18. 第一の微生物が、ぺディォコッカス属またはビフイドパクテリゥム属に属する微生物である、請求の範囲 12〜15のいずれかに記載の方法。

19. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウスまたはビフィドバクテリゥム ·ビフィダムである、請求の範囲 12〜15のいずれかに記載の方法。

20. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウス I F03891、ぺディォコッカス ·エスピー I F〇3778またはビフィドバクテリゥム ·ビフィダム J CM7002である、請求の範囲 12〜15いずれかに記載の方法。

21. 第二の微生物が酵母である、請求の範囲 12〜20のいずれかに記載の方法。

22. 第二の微生物がクリベロマイセス（Kluyveromyces) 属、ザィゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces) 属、パフィァ（Pichia) 属またはサッカロマイセス（Saccharomyces)属に属する微生物である、請求の範囲 12〜20のいずれかに記載の方法。

23. 第二の微生物がクリベロマイセス ·マキシアンス（Kluyveromyces marxianus) 、クリベロマイセス ·サ一モトレランス (Kluyveromyces thermotolerans) 、クリべロマイセス ·ウイッケラミィ (Kluyveromyces wickerhami i) 、ザィコサッカロマイセス · レ干シ——(Zygosaccharomyces rouxi i ) 、ザィゴサッカロマイセス .ノヾイリ一 (Zygosaccharomyces bailii) 、ザィコサッカロマイセス ·シ一ドリ（Zygosac ha^myces cidri) 、ハ。フィァ ·ジャジ二一（Pichia j adini 0 、サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) である、請求の範囲 12〜 20のいずれかに記載の方法。

24. 第二の微生物がクリベロマイセス 'マキシアンス I FO 1090、クリベロマイセス ·サ一モトレランス ATCC 24177、クリベロマイセス ·ゥイツケラミィ、 ATCC 24178、ザィゴサッカロマイセス ·ルキシ一 NF R 2007、ザィゴサッカロマイセス ·バイリ一ATCC 8766 、ザィゴサッカロマイセス ·シードリ ATCC46819、パフィァ ·ジャジニー I FO 0987、サッカロマイセス ·セレピシェ協会 701号である、請求の範囲 1 2〜 20のいずれかに記載の方法。

25. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6]位が二重結合である脂肪酸がリノール酸であり、 <5—ラクトン類が <5—デカラクトンである、請求の範囲 12〜24のいずれかに記載の方法。

26. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸が α—リノレン酸であり、 δ—ラクトン類がジャスミンラクトンである、請求の範囲 12〜24のいずれかに記載の方法。

27. 組成物が天然油脂または天然油脂の加水分解物である、請求の範囲 12 〜26のいずれかに記載の方法。

28. 第一の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を、 η (ηは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [ η-6] 位が二重結合である脂肪酸を含有する組成物に作用させ、該組成物中に [ n— 6 ] 位が単結合の [ n _ 5 ] —ヒドロキシ脂肪酸を生成させ、次いで、第二の微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を作用させることを特徴とする、 δ—ラクトン類を含有する組成物の製造方法。

29. δ—ラクトン類が式（I I)

(式中、 Rは η—ペンチルまたは η _ペンテニルを表す）で表される <5—ラクトン類である、請求の範囲 2 8記載の方法。

30. δ —ラクトン類が δ —デカラクトンまたはジャスミンラクトンである、請求の範囲 2 9記載の方法。

31. [ η— 6 ] 位の二重結合がシス体である、請求の範囲 2 8〜3 0のいずれかに記載の方法。

32. 第一の微生物がリノール酸、ひ—リノレン酸またはアーリノレン酸の 1 3位にヒドロキシを 1 2位に水素を導入し 1 2位を単結合とする活性を有する微生物である、請求の範囲 2 8〜3 1のいずれかに記載の方法。

33. 第一の微生物が乳酸菌またはビフィズス菌である、請求の範囲 2 8〜3 1のいずれかに記載の方法。

34. 第一の微生物が、ぺディォコッカス属またはビフイドバクテリウム属に属する微生物である、請求の範囲 2 8〜3 1のいずれかに記載の方法。

35. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウスまたはビフイドパクテリゥム ·ビフィダムである、請求の範囲 2 8〜3 1のいずれかに記載の方法。

36. 第一の微生物がぺディォコッカス ·ペントサセウス I F 0 3 8 9 1、ぺディォコッカス ·エスピー I F〇3 7 7 8またはビフィドバクテリゥム ·ビフィダム J C M 7 0 0 2である、請求の範囲 2 8〜3 1いずれかに記載の方法。

37. 第二の微生物が酵母である、請求の範囲 2 8〜 3 6のいずれかに記載の方法。

38. 第二の微生物がクリベロマイセス（Kluyveromyces) 属、ザィゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces) 属、パフィァ（Pichia) 属またはサッカロマイセス（Saccharomyces)属に属する微生物である、請求の範囲 28〜36のいずれ力に記載の方法。

39. 第二の微生物がクリベロマイセス ·マキシアンス（Kluyveromyces mar ianus) 、クリベロマイセス ·サ一モトレランス (Kluyveromyces thermotolerans) 、クリベロマイセス ·ウイッケラミィ (Kluyveromyces wickerhami i) 、サイゴサッカロマイセスりレキシー (Zygosaccharomyces rouxi i ) 、ザィゴサッカロマイセス .ゾイリ一（Zygosaccharomyce bailii) 、ザィゴサッカロマイセス ·シ一ドリ (Zygosaccharomyces cidri) 、ノヽ⁰フィァ 'シャシニー（Pichia jadinii) 、サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) である、請求の範囲 28〜 36のいずれかに記載の方法。

40. 第二の微生物がクリベロマイセス 'マキシアンス I F〇 1090、クリベロマイセス ·サーモトレランス AT CC 241 77、クリベロマイセス ·ゥイツケラミィ、 ATCC241 78、ザィゴサッカロマイセス ·ルキシ一 NF R 2007、ザィゴサッカロマイセス ·バイリー ATCC 8766、ザィゴサッカロマイセス ·シードリ ATCC468 19、パフィァ 'ジャジ二一 I FO 0987、サッカロマイセス 'セレピシェ協会 701号である、請求の範囲 2 8〜 36のいずれかに記載の方法。

41. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6]位が二重結合である脂肪酸がリノール酸であり、 5—ラウトン類が <5—デカラクトンである、請求の範囲 28〜40のいずれかに記載の方法。

42. n (nは 10以上の偶数）個の炭素数よりなる直鎖脂肪酸であって、少なくとも該脂肪酸の [n— 6] 位が二重結合である脂肪酸が α—リノレン酸であり、（5—ラクトン類がジャスミンラクトンである、請求の範囲 28〜40のいずれかに記載の方法。

43. 組成物が食品である、請求の範囲 28〜42のいずれかに記載の方法。

44. 請求の範囲 1 2〜2 7のいずれかに記載の方法で製造される (5 _ラクトン類または請求の範囲 2 8〜 4 2のいずれかに記載の方法で製造される <5—ラクトン類を含有する組成物を食品に添加することを特徴とする、 δ—ラクトン類を含有する食品の製造方法。