IT201900015713A1 - Procedimento per la produzione di dodecalattoni e decalattoni naturali mediante biotrasformazione di oli vegetali - Google Patents
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Description
PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DI DODECALATTONI E DECALATTONI NATURALI MEDIANTE BIOTRASFORMAZIONE DI OLI VEGETALI
Settore della tecnica
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per la produzione di dodecalattoni e decalattoni naturali mediante biotrasformazione di oli vegetali.
Sfondo dell'invenzione
I lattoni (e in particolare i dodecalattoni e i decalattoni d'interesse per l'invenzione) sono composti volatili presenti in natura in molti prodotti alimentari, quali frutta, carni e prodotti lattiero-caseari, di cui costituiscono un componente dell'aroma. Essi sono quindi utilizzati per la produzione di aromi per l'industria alimentare ed anche per la produzione di fragranze per l'industria cosmetica.
I lattoni sono abitualmente prodotti per sintesi chimica o mediante processi di biotrasformazione. Tra questi ultimi, i più usati si basano sulla conversione microbica di acidi grassi idratati (idrossi-derivati di acidi grassi). La sintesi chimica è una soluzione economicamente conveniente ed è comunemente adottata per i lattoni destinati all'industria cosmetica. Invece, per i lattoni destinati all'uso alimentare, questa soluzione presenta l'inconveniente che gli aromi utilizzanti lattoni prodotti con questa tecnica non possono essere definiti "aromi naturali" secondo le legislazioni vigenti nella maggior parte dei paesi industrializzati. Ciò è invece possibile, secondo le legislazioni di molti paesi (tra cui gli USA) dove l'uso di aromi nell'industria alimentare è molto diffuso, se i lattoni sono ottenuti mediante processi di biotrasformazione di precursori di origine naturale (quali appunto gli acidi grassi idratati). Tenuto conto che i consumatori dimostrano di preferire i prodotti naturali a quelli di sintesi, è molto importante per l'industria la ricerca di processi microbiologici per la produzione di lattoni con elevate rese e bassi costi di produzione.
Sono noti diversi esempi di procedimenti microbiologici per la produzione di lattoni, in generale a partire da acidi grassi (p. es. acido oleico, acido linoleico e acido linolenico) o dai rispettivi idrossi-derivati (idrossi-acidi). Esempi sono descritti nei documenti brevettuali EP 0578388A2 e US 7037672B2 e nell'articolo "Production of δ-decalactone from linoleic acid via 13-hydroxy-9(Z)-octadecenoic acid intermediate by one-pot reaction using linoleate 13-hydratase and whole Yarrowia lipolytica cells", Kang, W. R.; Seo, M. J.; An, J. U.; Shin, K. C.; Oh, D. K., Biotechnol. Leti. 2016, 38, 817-823. Un problema generale di queste soluzioni note è che esse richiedono l'uso di microorganismi potenzialmente pericolosi per la salute umana (EP 05783 88A2, che fa uso di microorganismi Pseudomonas sp.), o di microorganismi geneticamente modificati (OGM) quali biocatalizzatori nella fase di idratazione (Kang e altri, che usa Escherichia coli modificato contenente il gene dell'idratasi di Lactobacillus acidophilus, oppure l'idratasi stessa, ottenuta comunque da E. coli modificato geneticamente). In più, molto spesso, si fa l'uso di reattori separati per le varie fasi (idratazione degli acidi grassi in idrossi-acidi e degradazione microbiologica degli idrossi-acidi in lattoni).
E' anche noto produrre lattoni a partire da oli vegetali naturali, p. es. olio di girasole (EP 0578388A2) o olio di cartamo (v. l'articolo "Gamma-dodecelactone production from safflower oil via 10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid intermediate by whole cells of Candida boidinii and Stenotrophomonas nitritireducens" , Jo, Y. S.; An, J. U.; Oh, D. K., J. Agr. Food Chem. 2014, 62, 6736-6745). Va però fatto notare che molti microorganismi che sono in grado di idratare i doppi legami isolati di acidi grassi non riescono ad effettuare la stessa biotrasformazione sui rispettivi gliceridi: ne consegue che la reazione di idratazione deve essere preceduta da una reazione di idrolisi per ottenere gli acidi grassi dai gliceridi. EP 0578388A2 non entra nei dettagli di come si ottenga l'acido grasso. L'articolo di Yo e altri descrive l'uso di reattori separati per le varie fasi e, in più, descrive l'uso di organismi geneticamente modificati ( Escherichia coli modificato contenente il gene dell'idratasi di Stenotrophomonas nitritireducens) .
Descrizione dell ’ Invenzione
Scopo della presente invenzione è di fornire un procedimento per trasformare direttamente olii vegetali in miscele di lattoni naturali da utilizzarsi come aromi e/o fragranze, in cui non si fa uso di microorganismi potenzialmente pericolosi per la salute umana o di microorganismi geneticamente modificati quali biocatalizzatori nella fase di idratazione.
Un procedimento di questo tipo comprende le fasi di:
- idrolisi dei gliceridi presenti negli olii nei corrispondenti acidi grassi mediante enzimi idrolitici (lipasi);
- idratazione del doppio legame degli acidi grassi biocatalizzata mediante fermentazione batterica con l’uso di microorganismi che esprimono enzimi idratasi; e
- degradazione microbiologica a lattone con l'uso di lieviti, preferibilmente oleaginosi; e, secondo l'invenzione, i microorganismi che esprimono gli enzimi idratasi e catalizzano l'idratazione degli acidi grassi sono microorganismi probiotici ad uso umano, e le fasi di idrolisi, idratazione e degradazione microbiologica sono effettuate in uno stesso bioreattore.
Preferibilmente, i microrganismi probiotici appartengono ai generi Lactobacillus , Bifidobacterium , Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus e Leuconostoc .
Preferibilmente, la combinazione dell'olio vegetale di partenza e del microrganismo probiotico è scelta in modo da produrre:
- γ-dodecalattone
dairy lattone (γ-dodecenolide o lattone dell'acido (Z)-4-idrossi-6-dodecenoico)
- tuberosa lattone (γ-dodecadienolide o lattone dell'acido (Z,Z)-4-idrossi-6,9-dodecadienoico
δ-decalattone
e miscele degli stessi.
Questi lattoni preferiti rientrano nella lista FEMA (Flavor and Extract Manufacturers Association of the United States) delle sostanze GRAS (Generally Recognized As Safe = generalmente riconosciute come sicure), e quindi il loro uso in alimenti è ammesso.
Preferibilmente, i lieviti sono scelti tra Yarrowia lipolytica, Candida boidinii, Cryptococcus curvatus, Sporidiobolus johnsonii, Starmerella bombicola , Waltomyces lipofer , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Yarrowia lipolytica essendo il lievito maggiormente preferito. Questi lieviti appartengono alla classe biologica di sicurezza 1 e sono ritenuti quindi sicuri per la salute umana.
Vantaggiosamente, dette fasi di idrolisi e di idratazione prevedono le operazioni di: - stabilire un'atmosfera anaerobia/microaerofila nel bioreattore contenente un brodo di coltura per il microorganismo utilizzato, mantenendo una temperatura di 37°C;
- introdurre un inoculo del microorganismo;
- aggiungere sequenzialmente l'olio naturale e l'enzima lipasi;
e il microorganismo probiotico è portato a contatto con l'olio durante la prima parte della fase di crescita esponenziale del microorganismo stesso.
La biodegradazione degli idrossi-acidi in lattoni è poi ottenuta insufflando aria nel bioreattore, riducendo la temperatura a 26 - 30°C ed aggiungendo un inoculo del lievito. Alla scomparsa della miscela di acidi grassi idratati, si interrompe la biodegradazione mediante aggiunta di un acido e riscaldamento ad una temperatura compresa fra circa 90°C e circa 100°C.
Descrizione Sintetica delle Figure
Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferita di realizzazione fatta a titolo esemplificativo e non limitativo con riferimento alla figura allegata, che mostra un esempio di realizzazione del procedimento secondo l’invenzione.
Descrizione di una Forma Preferita di Realizzazione
Con riferimento alla figura, un processo di biotrasformazione diretta di olii vegetali in lattoni prevede tre fasi che, secondo l’invenzione, si svolgono sequenzialmente all’interno di un singolo bioreattore (procedimento one-pot), e precisamente:
- idrolisi dei gliceridi presenti negli olii nei corrispondenti acidi grassi (in particolare acido oleico, acido linoleico e acido linolenico);
- idratazione del doppio legame degli acidi grassi mediante fermentazione batterica con l’uso di microorganismi probiotici;
- degradazione microbiologica degli acidi grassi idratati (idrossi-acidi) a lattone con l’uso di lieviti, preferibilmente lieviti oleaginosi.
L’idrolisi dei gliceridi nei rispettivi acidi grassi è necessaria perché i microorganismi probiotici utilizzati secondo l’invenzione (preferibilmente appartenenti ai generi Lactobacillus , Bifidobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus e Leuconostoc ), che sono in grado di idratare i doppi legami isolati di acidi grassi, non riescono ad effettuare la stessa biotrasformazione sui gliceridi. Per questa idrolisi si utilizzano enzimi idrolitici (lipasi). A questo riguardo si fa presente che gli enzimi in questione sono enzimi inducibili, cioè il microorganismo in grado di esprimerli li produce solo dopo essere venuto in contatto con i rispettivi acidi grassi. La tempistica dell’aggiunta dell’acido è cruciale per l’efficienza del processo. Studi degli inventori [v. l'articolo "Use of Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53103) as Whole-Cell Biocatalyst for the Regio- and Stereoselective Hydration of Oleic, Linoleic, and Linolenic Acid", S. Serra e D. De Simeis, Catalysts 2018, 8(3), 109] hanno permesso di stabilire che un’aggiunta troppo precoce dell’acido grasso inibisce la crescita del microorganismo, mentre un’aggiunta tardiva non porta all’ idratazione dello stesso. In particolare, secondo l'invenzione, l’acido è fatto entrare in contatto con il batterio probiotico durante la prima parte della fase esponenziale di crescita dello stesso. Da un punto di vista sperimentale si attende quindi che la fermentazione entri nella fase esponenziale di crescita, poi si aggiunge l’olio seguito dall’aggiunta di una sospensione della lipasi in acqua sterile. La reazione di idrolisi avviene all’interno del bioreattore dove si libera l’acido grasso a partire dall’olio. La quantità di lipasi (nonché il tipo e la sua attività) è scelta in modo da permettere l’idrolisi completa del gliceride in poche ore.
La reazione di idratazione sfrutta a sua volta la capacità dei batteri oggetto della presente invenzione di esprimere gli enzimi idratasi di interesse, p. es. oleato e linoleato idratasi. La reazione di idratazione avviene in ambiente anaerobio/microaerofilo (assicurato mediante la creazione di un’atmosfera di azoto all’interno del bioreattore).
La successiva reazione di degradazione dell’idrossi-acido a lattone è mediata, come detto, da lieviti, quali ad esempio Yarrowia lipolytica, Candida boidinii, Cryptococcus curvatus , Sporidiobolus johnsonii, Starmerella bombicola, Waltomyces lipofer , Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces boulardii. Tra questi si preferisce Yarrowia lipolytica (un lievito oleaginoso), che ha dato i migliori risultati in termini di resa in prove sperimentali (v. Esempi che seguono). Questi lieviti necessitano di ossigeno per effettuare la biotrasformazione e, a questo scopo, il passaggio dalla reazione di idratazione a quella di formazione dei lattoni è effettuato semplicemente insufflando aria nel bioreattore, ri ducendo la temperatura a 26 - 30°C ed aggiungendo un inoculo del lievito. La modifica delle condizioni alTinterno del bioreattore blocca la crescita del batterio probiotico e contemporaneamente attiva la crescita del lievito e la biotrasformazione dei prodotti idratati. Non è quindi necessaria la procedura di isolamento degli idrossi-derivati degli acidi.
I ceppi batterici probiotici possono essere chemoselettivi, cioè possono preferire un acido grasso rispetto ad un altro. La Tabella 1 che segue mostra alcuni esempi dei ceppi batterici probiotici utilizzabili secondo l’invenzione e le loro diverse capacità di idratazione degli acidi grassi.
TABELLA 1
Sfruttando questa chemoselettività, è possibile combinare la selezione del ceppo batterico probiotico con la scelta dell’ olio vegetale di partenza per ottenere in maniera preferenziale un lattone particolare o una particolare miscela di lattoni.
Preferibilmente, la combinazione del ceppo probiotico e dell'olio è tale da dare origine ai seguenti lattoni o a loro miscele:
1) γ-dodecalattone (Numero CAS 2305-05-7; Numero FEMA2400)
2) dairy lattone (Numero CAS: 18679-18-0; Numero FEMA: 3780)
3) tuberosa lattone (Numero CAS: 153175-57-6; Numero FEMA: 4067)
4) δ-decalattone (Numero CAS: 705-86-2; Numero FEMA: 2361)
Come detto, i lattoni suddetti rientrano nella lista FEMA delle sostanze generalmente riconosciute come sicure, quindi ammesse in alimenti.
Le proprietà e i possibili usi in aromi e fragranze di questi lattoni preferiti sono descritti p. es. in Fenaroli’s Handbook of Flavor Ingredients, Sixth Editi on, CRC Press.
Infine, con riferimento all’idratazione degli acidi grassi e alla biotrasformazione degli idrossi-acidi, la figura 1 fa vedere che i ceppi batterici probiotici possono idratare la posizione 10 e/o 13 dell’acido grasso: l’idratazione della posizione 10 porta all’ottenimento di γ-dodecalattone, dairy lattone e tuberosa lattone, secondo l'olio e il batterio scelto; l’idratazione della posizione 13 porta invece all’ottenimento di δdecalattone.
Esempio 1
In questo esempio, l’uso di un olio ricco in acido oleico (olio di oliva, composizione: 15% di acidi grassi saturi, 75% di acido oleico e 10% di acidi grassi poiinsaturi) in combinazione con l’idratazione mediata dal batterio Bifidobacterium animalis subsp. lactis (ceppo probiotico BB-12) che, come si vede in Tabella 1, è in grado di idratare efficacemente l’acido oleico ma non gli acidi linoleico e linolenico, permette di ottenere una miscela di lattoni costituita essenzialmente dal solo γ-dodecalattone.
Più in dettaglio, si sterilizza anaerobi cam ente il fermentatore, contenente 2 1 di brodo di coltura MRS o brodo di coltura per Bifidobacterium , e lo si flussa con azoto per circa 1 ora. Si regola il pH a 6,4 e si mantiene il sistema sotto azoto a 37°C. Si introduce quindi un inoculo di Bifidobacterium animalis subsp. lactis (ceppo probiotico BB-12; circa 20 miliardi di UFC) e si agita la miscela a 160 giri/min. Quando la quantità di acido lattico sviluppato (misurata mediante la quantità di ammoniaca aggiunta per compensare la variazione del pH) indica l’ingresso nella fase esponenziale di crescita (corrispondente al consumo di circa un quinto del glucosio presente nel mezzo di coltura), si aggiungono sequenzialmente olio di oliva sterile (12 mi) e lipasi da Candida rugosa (CRL tipo VII, Sigma, 1449 unità/mg, 0,2 g). Si agita quindi il sistema (210 giri/min) a 37°C per altri quattro giorni.
A questo punto, il fermentatore contiene tracce di gliceridi, acidi grassi liberi e una miscela di 10-idrossiderivati degli acidi grassi. Si abbassa allora la temperatura a 28°C e si rimuove l’atmosfera di azoto introducendo un flusso continuo di aria (circa 2 l/min). Si aggiunge poi Yarrowia lipolytica (4 g di lievito umido) ottenuto per centrifugazione di una coltura attiva dello stesso lievito, fatto crescere usando olio di oliva come unica fonte di carbonio. Si sospende il lievito in 5 mi di soluzione fisiologica sterilizzata e lo si aggiunge immediatamente al bioreattore. Dopo alcune ore, il pO2 diminuisce a causa della crescita del lievito. Entro 48 ore dall’aggiunta del lievito si osserva la scomparsa della miscela di idrossi-derivati degli acidi grassi. Si interrompe quindi la biotrasformazione mediante aggiunta di un acido (per esempio acido citrico naturale) e riscaldamento (5 min) a circa 95 - 100°C. A questo punto, l’analisi GC-MS (del prodotto grezzo indica la formazione di circa 1,2 g/l di una miscela di lattoni (misurata usando γ-undecalattone come standard interno). Il rapporto relativo dei lattoni nella miscela è il seguente:
- γ-dodecalattone (95%)
- dairy lattone (3%)
- lattoni non identificati (2%).
L’isolamento della miscela di lattoni avviene poi per distillazione in corrente di vapore o per estrazione con acetato di etile seguita da purificazione cromatografica.
Esempio 2
Nell’esempio 2 si utilizzano olio di girasole (composizione: 11% acidi grassi saturi, 28% acido oleico e 61% acidi grassi poiinsaturi) ed il batterio Lactobacillus plantarum, che è in grado di idratare gli acidi oleico, linoleico e linolenico con identica selettività e velocità (vedi Tabella 1). A fine processo si ottiene una miscela di lattoni composta principalmente da γ-dodecalattone (derivante dall’acido oleico, monoinsaturo) e dairy lattone (derivante dall’acido linoleico che è il componente principale degli acidi poiinsaturi presenti nell’ olio di girasole), con una prevalenza di quest'ultimo.
Più in dettaglio, si sterilizza anaerobi cam ente il fermentatore, contenente 2 1 di brodo di coltura MRS, e lo si flussa con azoto per circa 1 ora. Si regola il pH a 6, 1 e si mantiene il sistema sotto azoto a 37°C. Si introduce quindi un inoculo di Lactobacillus plantarum (ceppo probiotico 299v; circa 10 miliardi di UFC) e si agita la miscela a 160 giri/min. Quando la quantità di acido lattico sviluppato (misurata mediante la quantità di ammoniaca aggiunta per compensare la variazione del pH) indica l’ingresso nella fase esponenziale di crescita (corrispondente al consumo di circa un quinto del glucosio presente nel mezzo di coltura), si aggiungono sequenzialmente olio di girasole sterile (20 ml) e lipasi da Candida rugosa (CRL tipo VII, Sigma, 1449 unità/mg, 0,2 g). Si agita quindi il sistema (210 giri/min) a 37°C per altri quattro giorni.
A questo punto, il fermentatore contiene tracce di gliceridi, acidi grassi liberi e una miscela di 10-idrossiderivati degli acidi grassi. Si abbassa allora la temperatura a 28°C e si rimuove l’atmosfera di azoto introducendo un flusso continuo di aria (circa 2 l/min). Si aggiunge poi Yarrowia lipolytica (5 g di lievito umido) ottenuto per centrifugazione di una coltura attiva dello stesso lievito, fatto crescere usando olio di girasole come unica fonte di carbonio. Si sospende il lievito in 5 mi di soluzione fisiologica sterilizzata e lo si aggiunge immediatamente al bioreattore. Dopo alcune ore, il pO2 diminuisce a causa della crescita del lievito. Entro 48 ore dall’aggiunta del lievito si osserva la scomparsa della miscela di idrossi-derivati degli acidi grassi. Si interrompe quindi la biotrasformazione mediante aggiunta di un acido (per esempio acido citrico naturale) e riscaldamento (5 min) a circa 90°C. A questo punto, l’analisi GC-MS del prodotto grezzo indica la formazione di circa 1,5 g/1 di una miscela di lattoni (misurata usando γ-undecalattone come standard interno). Il rapporto relativo dei lattoni nella miscela è il seguente:
- γ-dodecalattone (36%)
- dairy lattone (62%)
- lattoni non identificati (2%).
L’isolamento della miscela di lattoni avviene poi per distillazione in corrente di vapore o per estrazione con acetato di etile seguita da purificazione cromatografica.
Esempio 3
Nell’esempio 3 si utilizza ancora olio di girasole, ma l’idratazione in questo caso è mediata dal batterio Lactobacillus rhamnosus che è in grado di idratare gli acidi oleico, linoleico e linolenico (vedi Tabella 1), ma che è maggiormente efficace nel trasformare l’acido oleico. Di conseguenza, a fine processo, si ottiene nuovamente una miscela di lattoni composta prevalentemente da γ-dodecalattone e dairy lattone, però con una prevalenza del primo (che, come detto, è ottenuto per trasformazione dell'acido oleico).
Più in dettaglio, si sterilizza anaerobi cam ente il fermentatore, contenente 2 1 di brodo di coltura MRS, e lo si flussa con azoto per circa 1 ora. Si regola il pH a 6, 1 e si mantiene il sistema sotto azoto a 37°C. Si introduce quindi un inoculo di Lactobacillus rhamnosus (ceppo probiotico ATCC 53103; circa 20 miliardi di UFC) e si agita la miscela a 160 giri/min. Quando la quantità di acido lattico sviluppato (misurata mediante la quantità di ammoniaca aggiunta per compensare la variazione del pH) indica l’ingresso nella fase esponenziale di crescita (corrispondente al consumo di circa un quinto del glucosio presente nel mezzo di coltura), si aggiungono sequenzialmente olio di girasole sterile (12 mi) e lipasi da Candida rugosa (CRL tipo VII, Sigma, 1449 unità/mg, 0,2 g). Si agita quindi il sistema (210 giri/min) a 37°C per altri quattro giorni.
A questo punto, il fermentatore contiene tracce di gliceridi, acidi grassi liberi e una miscela di 10-idrossiderivati degli acidi grassi. Si abbassa allora la temperatura a 28°C e si rimuove l’atmosfera di azoto introducendo un flusso continuo di aria (circa 2 l/min). Si aggiunge poi Yarrowia lipolytica (4 g di lievito umido) ottenuto per centrifugazione di una coltura attiva dello stesso lievito, fatto crescere usando olio di girasole come unica fonte di carbonio. Si sospende il lievito in 5 mi di soluzione fisiologica sterilizzata e lo si aggiunge immediatamente al bioreattore. Dopo alcune ore il pO2 diminuisce a causa della crescita del lievito. Entro 60 ore dall’aggiunta del lievito si osserva la scomparsa della miscela di idrossi-derivati degli acidi grassi. Si interrompe quindi la biotrasformazione mediante aggiunta di un acido (per esempio acido citrico naturale) e riscaldamento (5 min) a circa 90°C. A questo punto, l’analisi GC-SM del prodotto grezzo indica la formazione di circa 1,1 g/1 di una miscela di lattoni (misurata usando γ-undecalattone come standard interno). II rapporto relativo dei lattoni nella miscela è il seguente:
- γ-dodecalattone (57%)
- dairy lattone (39%)
- lattoni non identificati (4%).
L’isolamento della miscela di lattoni avviene poi per distillazione in corrente di vapore o per estrazione con acetato di etile seguita da purificazione cromatografica.
Esempio 4
Nell’esempio 4 si utilizza olio di semi di lino (composizione: 8% acidi grassi saturi, 22% acido oleico, 17% acido linoleico e 52% linolenico) e lo stesso batterio Lactobacillus rhamnosus dell’Esempio 3. A fine processo, si ottiene una miscela di lattoni composta prevalentemente, oltre che da γ-dodecalattone e dairy lattone (derivanti rispettivamente dagli acidi oleico e linoleico), da tuberosa lattone (derivante dall’ acido linolenico).
Più in dettaglio, si sterilizza anaerobi cam ente il fermentatore, contenente 2 1 di brodo di coltura MRS, e lo si flussa con azoto per 1 ora. Si regola il pH a 6,2 e si mantiene il sistema sotto azoto a 37°C. Si introduce quindi un inoculo di Lactobacillus rhamnosus (ceppo probiotico ATCC 53103; circa 20 miliardi di UFC) e si agita la miscela a 160 giri/min. Quando la quantità di acido lattico sviluppato (misurata mediante la quantità di ammoniaca aggiunta per compensare la variazione del pH) indica l’ingresso nella fase esponenziale di crescita (corrispondente al consumo di circa un quinto del glucosio presente nel mezzo di coltura), si aggiungono sequenzialmente olio di semi di lino sterile (12 mi) e lipasi da Candida rugosa (CRL tipo VII, Sigma, 1449 unità/mg, 0,3 g). Si agita quindi il sistema (210 giri/min) a 37°C per altri quattro giorni.
A questo punto, il fermentatore contiene tracce di gliceridi, acidi grassi liberi e una miscela di 10-idrossiderivati degli acidi grassi. Si abbassa allora la temperatura a 28°C e si rimuove l’atmosfera di azoto introducendo un flusso continuo di aria (circa 2 l/min). Si aggiunge poi Yarrowia lipolytica (4 g di lievito umido) ottenuto per centrifugazione di una coltura attiva dello stesso lievito, fatto crescere usando olio di semi di lino come unica fonte di carbonio. Si sospende il lievito in 5 mi di soluzione fisiologica sterilizzata e lo si aggiunge immediatamente al bioreattore. Dopo alcune ore, il pO2 diminuisce a causa della crescita del lievito. Entro 60 ore dall’aggiunta del lievito si osserva la scomparsa della miscela di idrossi-derivati degli acidi grassi. Si interrompe quindi la biotrasformazione mediante aggiunta di un acido (per esempio acido citrico naturale) e riscaldamento (5 min) a circa 90°C. A questo punto, l’analisi GC-MS del prodotto grezzo indica la formazione di circa 1,0 g/1 di una miscela di lattoni (misurata usando γ-undecalattone come standard interno). Il rapporto relativo dei lattoni nella miscela è il seguente:
- γ-dodecalattone (34%)
- dairy lattone (12%)
- tuberosa lattone (48%)
- lattoni non identificati (6%).
L’isolamento della miscela di lattoni avviene poi per distillazione in corrente di vapore o per estrazione con acetato di etile seguita da purificazione cromatografica.
Esempio 5
Nell’esempio 5 si utilizza ancora olio di girasole, però in combinazione con il batterio Lactobacillus acidophilus che è in grado di idratare l’acido oleico in posizione 10 e di idratare l’acido linoleico prevalentemente in posizione 13 (vedi Tabella 1) ed anche in posizione 10. Il 13-idrossi derivato viene trasformato in δ-decalattone mentre i 10-idrossi derivati vengono trasformati in γ-dodecalattone e dairy lattone. A fine processo, si ottiene una miscela di lattoni composta prevalentemente da δ-decalattone (derivante dall’acido linoleico idratato in posizione 13) e γ-dodecalattone (derivante dall’acido oleico), oltre che da una percentuale non trascurabile di dairy lattone (derivante dall’acido linoleico idratato in posizione 10).
Più in dettaglio, si sterilizza anaerobi cam ente il fermentatore, contenente 2 1 di brodo di coltura MRS, e lo si flussa con azoto per 1 ora. Si regola il pH a 6,2 e si mantiene il sistema sotto azoto a 37°C. Si introduce quindi un inoculo di Lactobacillus acidophilus (ceppo probiotico La-14 ATCC SD5212); circa 20 miliardi di UFC) e si agita la miscela a 160 giri/min. Quando la quantità di acido lattico sviluppato (misurata mediante la quantità di ammoniaca aggiunta per compensare la variazione del pH) indica l’ingresso nella fase esponenziale di crescita (corrispondente al consumo di circa un quinto del glucosio presente nel mezzo di coltura), si aggiungono sequenzialmente olio di girasole sterile (12 mi) e lipasi da Candida rugosa (CRL tipo VII, Sigma, 1449 unità/mg, 0,2 g). Si agita quindi il sistema (210 giri/min) a 37°C per altri tre giorni.
A questo punto, il fermentatore contiene tracce di gliceridi, acidi grassi liberi e una miscela di 10- e 13-idrossiderivati degli acidi grassi. Si abbassa allora la temperatura a 28°C e si rimuove l’atmosfera di azoto introducendo un flusso continuo di aria (circa 2 l/min). Si aggiunge poi Yarrowia lipolytica (4 g di lievito umido) ottenuto per centrifugazione di una coltura attiva dello stesso lievito, fatto crescere usando olio di girasole come unica fonte di carbonio. Si sospende il lievito in 5 mi di soluzione fisiologica sterilizzata e lo si aggiunge immediatamente al bioreattore. Dopo alcune ore, il pO2 diminuisce a causa della crescita del lievito. Entro 48 ore dall’aggiunta del lievito si osserva la scomparsa della miscela di idrossi-derivati degli acidi grassi. Si interrompe quindi la biotrasformazione mediante aggiunta di un acido (per esempio acido citrico naturale) e riscaldamento (5 min) a circa 90°C. A questo punto, Tanalisi GC-MS del prodotto grezzo indica la formazione di circa 0,9 g/1 di una miscela di lattoni (misurata usando γ-undecalattone come standard interno). Il rapporto relativo dei lattoni nella miscela è il seguente:
- δ-decalattone (46%)
- γ-dodecalattone (43%)
- dairy lattone (8%)
- lattoni non identificati (3%).
L’isolamento della miscela di lattoni avviene poi per distillazione in corrente di vapore o per estrazione con acetato di etile seguita da purificazione cromatografica.
E' evidente che quanto descritto è dato unicamente a titolo di esempio non limitativo e che varianti e modifiche sono possibili senza uscire dal campo di protezione dell'invenzione come definito nelle rivendicazioni allegate. In particolare, anche se si sono indicati alcuni generi di batteri probiotici preferiti, il processo descritto si adatta a tutti i batteri probiotici in grado di idratare gli acidi grassi
Claims (10)
- Rivendicazioni 1. Procedimento per la produzione di dodecalattoni e decalattoni naturali mediante biotrasformazione di oli vegetali, comprendente le fasi di: - idrolisi dei gliceridi presenti negli olii nei corrispondenti acidi grassi mediante enzimi idrolitici (lipasi); - idratazione del doppio legame degli acidi grassi biocatalizzata mediante fermentazione batterica con l’uso di microorganismi che esprimono enzimi idratasi; e - degradazione microbiologica a lattone con l'uso di lieviti; caratterizzato dal fatto che i microorganismi che esprimono gli enzimi idratasi e biocatalizzano l'idratazione degli acidi grassi sono microorganismi probiotici ad uso umano e dal fatto che dette fasi di idrolisi, di idratazione e di degradazione microbiologica sono effettuate in uno stesso bioreattore.
- 2. Procedimento secondo la riv. 1, in cui la combinazione dell'olio vegetale di partenza e del microorganismo probiotico è scelta in modo da produrre: - γ-dodecalattonedairy lattone (γ-dodecenolide o lattone dell'acido (Z)-4-idrossi-6-dodecenoico)- tuberosa lattone (γ-dodecadienolide o lattone dell'acido (Z,Z)-4-idrossi-6,9-dodecadienoico)δ-decalattonee miscele degli stessi.
- 3. Procedimento secondo la riv. 2, in cui l'olio vegetale di partenza è scelto tra quelli comprendenti, come acidi grassi, acido oleico e/o acido linoleico e/o acido linolenico.
- 4. Procedimento secondo la riv. 3, in cui il microorganismo probiotico è scelto tra i microorganismi appartenenti ai generi Lactobacillus , Bifidobacterium , Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus e Leuconostoc.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui i lieviti sono scelti tra Yarrowia lipolytica, Candida boidinii, Cryptococcus curvatus, Sporidiobolus johnsonii, Starmerella bombicola , Waltomyces lipofer , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii.
- 6. Procedimento secondo la riv. 5, in cui i lieviti sono lieviti oleaginosi, preferibilmente Yarrowia lipolytica.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette fasi di idrolisi e di idratazione prevedono le operazioni di: - stabilire un'atmosfera anaerobia/microaerofila nel bioreattore contenente un brodo di coltura per uno dei microorganismi probiotici suddetti, mantenendo una temperatura di 37°C; - introdurre un inoculo del microorganismo; - aggiungere sequenzialmente l'olio naturale e l'enzima lipasi.
- 8. Procedimento secondo la riv. 7, in cui il microorganismo probiotico è portato a contatto con l'olio durante una prima parte di una fase di crescita esponenziale del microorganismo stesso.
- 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui, per la biodegradazione degli acidi grassi idratati in lattoni, si insuffla aria nel bioreattore, ri ducendo la temperatura a 26 - 30°C, ed aggiungendo un inoculo del lievito.
- 10. Procedimento secondo la riv. 9, in cui si interrompe la biodegradazione, alla scomparsa della miscela di acidi grassi idratati, mediante aggiunta di un acido e riscaldamento ad una temperatura compresa fra circa 90°C e circa 100°C.
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP0578388A2 (en) | 1992-06-25 | 1994-01-12 | INTERNATIONAL FLAVORS & FRAGRANCES INC. | Fermentation process for preparing 10-hydroxy-C18-carboxylic acid and gamma-dodecalactone derivatives |
| JPH07327689A (ja) * | 1994-06-07 | 1995-12-19 | Nikka Uisukii Kk | γ−ドデカラクトン又はγ−デカラクトンを含有する液体組成物の製造方法 |
| EP1197560A1 (en) * | 1999-07-07 | 2002-04-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing hydroxylated fatty acid and delta-lactone |
| US7037672B2 (en) | 1998-05-29 | 2006-05-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing a bran pickles flavoring solution |
-
2019
- 2019-09-06 IT IT102019000015713A patent/IT201900015713A1/it unknown
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