WO2000057706A1 - Nueva cepa de la bacteria pantoea agglomerans, (erwinia herbicola) y su utilizacion como agente de control biologico de las enfermedades fungicas de frutas - Google Patents

Nueva cepa de la bacteria pantoea agglomerans, (erwinia herbicola) y su utilizacion como agente de control biologico de las enfermedades fungicas de frutas Download PDF

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WO2000057706A1
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fruits
cect
antagonist
penicillium
control
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PCT/ES2000/000101
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Inmaculada Viñas Almenar
Josep Usall I Rodie
Carla Alexandra Alves Afonso Nunes
Neus Teixido I Espasa
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Institut De Recerca I Tecnologia Agroalimentaries (Irta)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a new strain of the bacterium Pantoea agglomerans and its use as an antagonist for the biological control of fruit infections in order to prevent rot of the fruit.
  • Postharvest diseases of fruits produce annual losses in agriculture that are estimated, worldwide, in an amount of the order of 15% to 20% of total harvests.
  • the most used system to combat fungi causing fruit rot is chemical control, by treating them with fungicidal products.
  • the use of fungicides is widespread worldwide and is estimated to account for up to 26% of pesticides in the European and Asian markets and, in the case of the North American market, up to 6%.
  • Bacillus pumil us as a post-harvest biocontrol agent to combat green mold (Penicillium di gi ta tum) in citrus fruits.
  • bacterial agents are of particular interest as biocontrol agents, since they are easy and fast to grow and apply and because a series of formulations for bacteria that allow them to increase their survival once well known to the expert are well known. Applied
  • US-A-4045910 describes a strain of Erwinia herbicola, ananus variety, named by its inventors M232A, and deposited in the American Type Culture Collection with the identification number ATCC 31225, as well as its use to reduce the risk of freezing of plants.
  • the object of the present invention is to provide a substantially pure biological culture of a new strain of the bacterium Pantoea agglomerans (Erwinia herbicola) capable of acting as a highly effective antagonist for the biological control of pathogenic fungi responsible for rotting. the fruit of pre and post harvest and that maintains its effectiveness in conditions of low temperature and in atmosphere depleted in oxygen.
  • Pantoea agglomerans Erwinia herbicola
  • Another object of the present invention is the use of said antagonist, by itself or together with other antifungal agents and / or adjuvants, to prevent rot of the fruit collected during storage.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for the best preservation of the fruit harvested under different storage conditions, as regards temperature and atmosphere of oxygen and carbon dioxide.
  • Figure 1 is a graphical representation of the growth curves of strain CECT-4920, in NYDB medium and peptone medium, under storage conditions at 1 ° C.
  • Figure 2 is a graphical representation of the growth curves of strain CECT-4920, in NYDB medium and peptone medium, under storage conditions at 30 ° C.
  • Figure 3 is a graphic representation of the evolution of the population of strain CECT-4920, applied to wounds of 3 x 3 x 3 mm 3 in "Golden Delicious” apples, in conservation conditions at 20 ° and 30 ° C.
  • Figure 4 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Rocha” pears, inoculated with Botrytis cinerea 10 3 , 10 4 and 10 5 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist . Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • Figure 5 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Blanquilla” pears, inoculated with Peni cilli um expansum 10 3 , 10 4 and 10 5 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • Figure 6 is a three-dimensional bar chart representation of the percentages of rot in "Conferance" pears, inoculated with Rhizopus stolonifer 10 3 , 10 4 Y 10 5 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • Figure 7 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rotten fruits in "Valencia Late" oranges, inoculated with Penicillium digita tum 10 5 and 10 6 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • Figure 8 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rotten fruits in "Valencia Late" oranges, inoculated with Penicillium i talicum 10 5 and 10 6 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • Figure 9 is a three-dimensional bar diagram representation of the percent rot reduction in "Early Red One" apples, inoculated with Penicillium expansum, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 30 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 10 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction, in apple "Fuji” inoculated with Penicillium expansum, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 30 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 11 is a three-dimensional bar diagram representation of the ports. rotting percentages in "Alejandrina” pears, inoculated with Penicilli um expansum, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 30 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 12 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Decana de Comice” pears, inoculated with Penicillium expansum, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 30 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 13 is a three-dimensional bar diagram representation of the percent rot reduction in "Golden Delicious” apples, inoculated with Botrytis cinerea, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 30 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 14 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Golden Delicious” apples, inoculated with Penicillium expansum, caused by the fruit bathing with the CECT-4920 antagonist.
  • Figure 15 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentage of total rot reduction in "Valencia Late" oranges, without artificial pathogen inoculation, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 60 days of incubation at 3.5 ° C and different conditions of controlled atmosphere 1.5% 0 2 - 1.5% C0 2 ; 3% 0 2 - 3% C0 2 ; 5% 0 2 - 3% C0 2; and 8% 0 2 - 5% C0 2 .
  • Figure 16 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Blanquilla” pears, inoculated with Penicilli um expansum, caused by the fruit bath with the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 90 days of incubation in conventional cold.
  • Figure 17 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Golden Delicious" apples, inoculated with Botrytis cinerea, caused by the fruit bathing with the CECT-4920 antagonist. Data obtained after 90 days of incubation in a controlled atmosphere: 1% 0 2 - 1% C0 2 .
  • Figure 18 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rot reduction in "Rocha” pears, inoculated with Penicillium expansum, caused by immersion in 8 x 10 7 cfu / ml of the CECT-4920 antagonist and by the application of the chemical fungicide Imazalil at a commercial dose. Comparative data obtained after 5.5 months of incubation at 1 ° C temperature.
  • Figure 19 is a three-dimensional bar diagram representation of the percentages of rotten fruits in "Valencia Late" oranges, inoculated with Penicilli um digi ta tum 10 5 and 10 6 cfu / ml, caused by inoculation of the CECT-4920 antagonist and the food additive, baking soda dico. Data obtained after 7 days of incubation at 20 ° C.
  • the strain of the present invention has been isolated from the surface of apples, by washing with sterile water followed by an ultrasonic bath with phosphate buffer, and a culture thereof has been deposited, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the recognition of the deposit of microorganisms for the purpose of the patent procedure, in the international deposit authority Spanish Collection of Type Crops, domiciled at the Faculty of Biological Sciences, University of Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) Spain, which has assigned the deposit number CECT-4920.
  • CECT-4920 has been identified as Pantoea agglomerans and after its isolation, it was grown in the solid medium peptone-agar, consisting of peptone, starch, dextrose and agar, in the liquid medium peptone consisting of peptone, starch and dextrose and in the NYDB liquid medium, consisting of broth of yeast extract and dextrose.
  • strain CECT-4920 forms yellow, round, well-defined colonies and is mobile. It has aerobic growth in peptone-agar medium at 30 ° C, and anaerobic growth in Thioglycolate medium at 30 ° C, and presents the biochemical characteristics detailed in Tables I and II:
  • TDA Tryptophan
  • INO Inositol Fermentation / oxidation (4) w
  • the inoculation of the microorganism on the surface of the fruit shows a great growth under conditions of controlled atmosphere of 3% oxygen and 3% carbon dioxide at a temperature of 1 ° C, which are typical of the conditions of long storage in the fruit and vegetable plants.
  • the CECT-4920 isolate can be obtained, both at the laboratory level and for industrial use, by cultivation in an appropriate medium, using conventional techniques sufficiently known to the expert. For example, it can be obtained by culturing the original strain in NYDB medium, at pH 7, in a vessel provided with aeration and stirring, at temperatures between 1 and 37 ° C, for periods of the order of 20 to 50 hours. The maximum population (6 x 10 9 cfu / ml) for the NYDB medium at 30 ° C, in a 6-liter container, is reached after 24 hours. Once the incubation period is over, the microorganisms are separated from the culture medium by conventional sedimentation, centrifugation or filtration techniques, and the culture can be preserved, for example, by freezing in cryoballs.
  • the CECT-4920 antagonist can be applied to the surface of the fruits by any conventional technique.
  • it can be prepared a dispersion of the crop in water and proceed to spray or shower the fruit in the field, before harvesting, or to carry out the treatment during the process of handling the collected fruit, before proceeding to storage, in which case the Treatment can also be performed by immersion.
  • the effective concentrations of the CECT-4920 antagonist in the dispersion of application for the treatment of fruits can be variable, depending on factors such as the type of fruit, the maturity of the fruit, the concentration of the pathogenic fungus in the fruit, the temperature and conservation humidity, etc.
  • the range of effective concentrations is 10 7 -2xl0 8 cfu / ml (colony forming units per milliliter), which for bacteria is considered a low concentration, but this margin should not be considered as limiting the object of the present invention.
  • CECT-4920 is very effective in the biological control of different species of pathogenic fungi of fruits that include, but are not limited to, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum and Rhizo-pus stolonifer. Its effectiveness in preventing fruit rot is not limited to its storage under ambient temperature and oxygen concentration conditions but, due to the characteristics of the microorganism already discussed above, its use also gives excellent results in storage conditions for frigoconservation and controlled atmosphere, widely used by fruit and vegetable plants.
  • the effectiveness of the CECT-4920 isolate in the control of pathogenic fungi is comparable to that of the Imazalil fungicide, chemical derived from imidazole (l- [2- (2,4-dichlorophenyl) -2- (2- propenyloxy) ethyl] -IH-imidazole), one of the fungicides most used in the world in post-harvest of fruits, which means that the isolate CECT-4920 constitutes an effective alternative for said chemical, with the advantage of lacking the toxicity characteristics of the same.
  • the CECT-4920 antagonist can be applied together with other antifungal agents and / or adjuvants, waxes, food additives, for example sodium bicarbonate, and low toxicity substances.
  • the CECT-4920 antagonist can be used only, as a biological control agent for fruit pathogenic fungi, or it can be used in combination with other synthetic antifungal agents and / or biological antagonists, for example with yeasts of the species Candida sa - ke, such as those described in Spanish patent ES-2089981 and in US patent application US-7-745796, cited above.
  • the isolated CECT-4920 can be used effectively to combat the rot of all kinds of fruits, both those of pepita, such as apples, pears and quince, in any of its varieties, such as citrus fruits, such as oranges, lemons and tangerines , in any of its varieties, and also those of bone, such as peaches, apricots, cherries and plums, in any of its varieties. Examples
  • Example 1 Obtaining an aqueous dispersion of CECT-4920.
  • the CECT-4920 antagonist was seeded in a test tube with peptone-agar medium and incubated at
  • the equivalence between the transmittance and the concentration of microorganisms was effected by counting the viable Petri dish in peptona-agar medium. For each case, the concentrations are expressed in cfu / ml (colony forming units per milliliter).
  • Example 2. Effectiveness of CECT-10897 in seeds of seeds stored at room temperature.
  • the test was carried out in 3 varieties of pears ("Blanquilla”, “Conference” and “Rocha") healthy that were cleaned with water and allowed to dry and in which two perforations per fruit, of dimensions 3 x 3 x 3 mm were made 3 approximately.
  • the two incisions were located on the same face of the pear, located one at the top and one at the bottom.
  • the sample unit consisted of three pears and for each treatment three repetitions were performed.
  • the three fungal species tested were Botrytis cinérea, Penicillium expansum and Rhizopus stolonifer and the titration of spore suspensions was made from young crops of 5-7 days, sown in PDA medium (potato, dextrose and agar ), and incubated at a temperature of 25 ° C, by scraping the colonies in sterile water with Tween 80. The spores were then counted in a Thoma chamber, fixing the desired concentration, expressed in cfu / ml.
  • the reading data of the diameter of the different repetitions were subjected to a statistical analysis consisting in carrying out an analysis of the variance and, once it was verified that said analysis of the variance was significant ( ⁇ ⁇ 0.01 to ⁇ ⁇ 0.05), a separation of means was made according to the Duncan Multiple Range Test, the results of which are expressed with the lowercase alphabet letters (a, b, c, d, ...), so that treatments with the same letter they are statistically the same and treatments with different letters are statistically different.
  • Table III shows the results obtained in the case of the biological control of Botrytis cinerea in the variety "Rocha”, in table IV in that of Penicilli um expansum in the variety “Blanquilla”, and in table V in Rhizopus stoloni fer in the "Conference" variety.
  • Healthy beats that were cleaned with water, then disinfected with a solution of sodium hypochlorite at a concentration of 0.5% chlorine, washed again with water and allowed to dry. Once the fruits were dried, an incision was made , For each orange, of dimensions 5 mm long and 2 mm deep approximately. The incision was located in the equatorial zone of the orange. The sample unit consisted of five oranges and for each treatment four repetitions were performed.
  • the two fungal species tested were Penicillium digitatum and Penicillium italicum and the titration of spore suspensions was performed following the work method explained in example 2.
  • Example 4 Control of Peni cilli um expansum in fruits stored at the temperature of the refrigerator. Following the work method explained in example 2, tests with ten fruits were carried out cough per repetition and three repetitions per treatment. This essay was conducted on apples of the varieties, “Early Red One” and “Fuji”, and pears of the varieties “Blanquilla”, “Rocha”, “Decana de Comice” and “Alejandrina”.
  • 25 ⁇ l of aqueous dispersion of the CECT-4920 antagonist were inoculated, at two concentrations 8 x 10 7 and 1 x 10 8 cfu / ml, and 20 ⁇ l of inoculum of Penici lli um expansum, at the concentration of 10 4 cfu / ml. All treated fruits were placed in alveoli for incubation at 1 ° C, with 90-98% relative humidity, for 30 days. After said incubation period, the results were read, measuring the rot diameters of all the perforations performed.
  • Example 5 Control of Botrytis cinérea in fruits stored at the temperature of the refrigerator. A test was carried out, under the same conditions as in example 4, using 20 ⁇ l of cinematic Botrytis inoculum as a inoculum of pathogenic fungus at the concentration of 10 4 cfu / ml.
  • the CECT-4920 antagonist was seeded in a test tube with peptone-agar medium and incubated at
  • Example 1 6,000 ml of NYDB medium and incubated at 30 ° C for 24 hours. The content of the fermenter was then centrifuged at 7,500 rpm for 10 minutes and the supernatant was discarded. The sediment was dispersed in sterile water and, from said dispersion, the desired concentrations of the antagonist were prepared in the same manner as in Example 1.
  • Apples were treated with the CECT-4920 antagonist, by immersing the fruits in baths containing antagonist dispersions at concentrations of 2 x 10 7 and 8 x 10 7 cfu / ml. A batch of forty-five untreated fruits that constituted the control test was used. Then the apples, once dried, were submerged in a bath with a titled suspension of Penicilli um expansum at the concentration of 10 4 cfu / ml.
  • Example 7 Control of rot in citrus stored at low temperature and different atmospheres of oxygen and carbon dioxide. The test was carried out on "Valencia Late" oranges, collected in the field, which without any previous cleaning were drilled as explained in example 3. The sample unit consisted of forty fruits and for each treatment three repetitions were performed.
  • the large-scale CECT-4920 antagonist was prepared, following the method explained in example 6. The fruits were treated with the antagonist for 1 minute by immersing the fruits in a bath containing the dispersion of the CECT-4920 microorganism to a concentration of 1 x 10 8 cfu / ml. A control test was prepared, where the antagonist bath was replaced with a water bath.
  • the antagonist CECT-4920 has a high efficiency in the control of the pathogenic fungi of citrus fruits in various conditions of controlled atmosphere, thus allowing to achieve one of the most important objectives in the citrus sector. , which is to extend the conservation period, a very limited objective in conservation in conditions of conventional cold.
  • Example 8 Control of pathogenic fungi in medium-scale trials.
  • the antagonist dispersion was prepared on a large scale, following the method explained above.
  • the test was performed on pear "Blanquilla” and "Golden Delicious” apple, which were treated as explained in example 6.
  • the sample unit was made up of 20 fruits and for each treatment four repetitions were performed.
  • the two fungal species tested were Botrytis cinerea and Penicillium expansum at the concentration of 10 4 cfu / ml.
  • table XV shows the result of the control of Penicillium expansum in "Blanquilla” pears stored in a controlled atmosphere
  • table XVI the control of cinematic Botrytis in "Golden Delicious” apples stored in conventional cold. Its graphic representation is shown in figures 16 and 17.
  • Example 9 Comparison with the fungicide Imazalil.
  • the test was carried out with pear "Rocha" following the methodology explained in example 6.
  • the sample unit consisted of ten fruits, and for each treatment four repetitions were performed.
  • Both the CECT-4920 antagonist and the Imazalil fungicide were applied by bathing the fruits in solutions or dispersions thereof.
  • the antagonist was applied at the concentration of 8 x 10 7 cfu / ml and Imazalil at the dose recommended in the commercial product and then the pears were inoculated with the pathogen of the species Penici-llium expansum, by means of a bath to a concentration of 10 4 cfu / ml.
  • the fruits were incubated under conventional cold conditions for 5.5 months, after which the results were read and statistically treated.
  • Example 10 Effectiveness of the combined treatment of the CECT-4920 antagonist with a food additive in the control of citrus fruits stored at room temperature.
  • the fruits were prepared following the method explained in example 3, and the tests were carried out with twenty "Valencia Late" oranges per repetition and three repetitions per treatment.
  • the food additive selected was sodium bicarbonate (NaHC0 3 ) at a concentration of 2%.
  • the oranges were inoculated with 25 ⁇ l of the Penicillium digi ta tum titrated suspension at the concentration of 10 6 cfu / ml. Subsequently the inoculated fruits were immersed in the sodium bicarbonate solution for 2.5 minutes. Once the fruits were dried, they were submerged in the solution of the CECT-4920 antagonist, at the concentration of 1 x 10 8 cfu / ml, for 1 minute.
  • the three control tests were prepared, which consisted of immersing the fruit in the following solutions: 2% sodium bicarbonate for 2.5 minutes; CECT-4920 antagonist, at the concentration of 1 x 10 8 cfu / ml, for 1 minute; running water for 1 minute. After drying the fruits, they were placed in alveoli for incubation at 20 ° C, with 80% relative humidity, for 7 days. After that period, the results were read as explained in the previous examples.
  • the deposit of the microorganism has been made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the recognition of the deposit of microorganisms for the purpose of the patent procedure, in the international deposit authority Spanish Collection of Type Crops (CECT), with residence in the Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, University of Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) Spain. The deposit is made on July 11, 1997, and the CECT assigned the deposit number CECT-4920.

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Abstract

Se describe un cultivo biológico substancialmente puro de una cepa bacteriana de la especie Pantoea agglomerans, también conocida como Erwinia herbicola, depositada con el número CECT-4920, y su utilización como antagonista para el control biológico de los hongos responsables de la podredumbre de la fruta. La efectividad de dicho antagonista resulta ser muy elevada y es comparable a los productos fungicada más utilizados. Dicha actividad se manifiesta con especial intensidad cuando se producen condiciones de almacenamiento a bajas temperaturas. El antagonista resulta efectivo para combatir la podredumbre causada por, entre otros microorganismos, los hongos de las especies Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum y Rhizopus stolonifer.

Description

D E S C R I P C I ÓN
NUEVA CEPA DE LA BACTERIA PANTOEA AGGLOMERANS, (ERWINIA HERBICOLA) Y SU UTILIZACIÓN COMO AGENTE DE CONTROL BIOLÓGICO DE LAS ENFERMEDADES FÚNGICAS DE FRUTAS.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una nueva cepa de la bacteria Pantoea agglomerans y a su utilización como antagonista para el control biológico de las infecciones de la fruta con el objetivo de prevenir la podredumbre de la misma.
Estado de la técnica
Las enfermedades de postcosecha de las frutas producen pérdidas anuales en la agricultura que se estiman, a nivel mundial, en una cantidad del orden de un 15% a un 20% del total de las cosechas. En la actualidad, el sistema más utilizado para combatir a los hongos causantes de la podredumbre de las frutas es el control químico, mediante tratamiento de las mismas con productos fungicidas. El empleo de los fungicidas está bastante extendido a nivel mundial y se estima que supone hasta el 26% de los pesticidas de los mercados europeo y asiático y, en el caso del mercado norteamericano, hasta el 6%.
La utilización masiva de dichos productos fungicidas ha generado una serie de problemas, tales como la aparición de cepas patogénicas resistentes - lo que repercute en el incremento progresivo de los costes de los tratamientos y en el aumento de los niveles de pérdidas por podredumbre - y el incremento de residuos de fungicidas en los frutos que provoca problemas de tipo sanitario y dificulta las exportaciones a los paises que poseen una reglamenta- ción sanitaria restrictiva sobre el tema.
Ante dicho problema y la creciente demanda de productos libres de residuos por parte de los consumidores, se ha comenzado a desarrollar, hace relativamente pocos años, una actividad investigado- ra con el fin de encontrar nuevos métodos alternativos para el control de las enfermedades de los frutos, siendo una de las alternativas más prometedoras el control biológico de los hongos causantes de la podredumbre mediante el uso de microorganismos. Di- cho control biológico se fundamenta en la acción inhibidora de algunos microorganismos sobre el crecimiento y acción de los hongos patógenos. Asi, Jani- sie icz .J. and Marchi, A., Plant Disease 76:555 (1992) , describen la utilización de Pseudo onas sy- ringae como agente de biocontrol de postcosecha para combatir la podredumbre de las peras; Huang, Y.; ild, B.L. and Morris, S.C., Annals Applied Biological 120:367-372 (1992), describen la utilización de Bacillus pumil us como agente de biocontrol de post- cosecha para combatir el moho verde ( Penicillium di gi ta tum) en cítricos.
Se ha descrito también el empleo de diferentes cepas de levaduras como agentes de control biológico de enfermedades de postcosecha de los fru- tos. Por ejemplo, Viñas, I./ Usall, J. / Teixidó, N. and Sanchis, V., International Journal of Food Mi- crobiology 40:9-16 (1998), han descrito la utilización de Candida sake como agente de control biológico de los principales hongos patógenos en posteóse- cha de manzanas, y en las solicitudes de patente WO- 92/18009 y WO-96/30495, esta última equivalente de la patente española ES-2089981, y en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796, publicada como documento NTIS (National Technical Information Service) número PB92-102334, también se describe la utilización de cepas del género Candida con el mencionado objetivo.
Sin embargo, los agentes bacterianos re- sultán de particular interés como agentes de biocontrol, pues son de fácil y rápido crecimiento y aplicación y porque resultan bien conocidas para el experto una serie de formulaciones para bacterias que permiten aumentar la supervivencia de las mismas una vez aplicadas.
Los autores de la presente invención no conocen que hasta el momento se haya propuesto la utilización de cepas bacterianas de Pantoea agglomerans (Erwinia herbicola) como agentes de control biológico de las enfermedades fúngicas de las frutas.
En la patente US-A-4045910 se describe una cepa de Erwinia herbicola , variedad ananus, denominada por sus inventores M232A, y depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de identificación ATCC 31225, asi como su empleo para reducir el riesgo de congelación de las plantas.
Por su parte, en la patente US-A-4569841 se describe una cepa de E. herbi cola , denominada por los inventores EHO-10, y depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de identificación ATCC 39368, asi como su empleo para combatir enfermedades bacterianas en las plantas y en es- pecial el Fuego bacteriano, no para combatir las enfermedades fúngicas de la fruta.
Objeto de la invención El objeto de la presente invención es proporcionar un cultivo biológico substancialmente puro de una nueva cepa de la bacteria Pantoea agglomerans (Erwinia herbicola) capaz de actuar como antagonista altamente efectivo para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de la fruta de pre y postcosecha y que mantiene su efectividad en condiciones de baja temperatura y en atmósfera empobrecida en oxigeno.
Otro objeto de la presente invención con- siste en la utilización de dicho antagonista, por si solo o junto a otros agentes antifúngicos y/o adyuvantes, para prevenir la podredumbre de la fruta recolectada, durante su almacenamiento.
Todavía otro objeto de la presente inven- ción consiste en proporcionar un método para la mejor conservación de la fruta recolectada en diferentes condiciones de almacenamiento, en lo que respecta a temperatura y atmósfera de oxigeno y dióxido de carbono.
Breve descripción de los dibujos
Se adjuntan a la presente descripción, para una mejor comprensión de la misma, pero sin efectos limitativos, 10 hojas con dibujos de los que, a continuación, se expone una breve descripción. Debe entenderse que cuando se hace referencia a conservación en condiciones de frió convencional hay que entender condiciones de temperatura igual o inferior a 5° C y una concentración de oxigeno propia de la atmósfera ambiental sin modificar.
La figura 1 es una representación gráfica de las curvas de crecimiento de la cepa CECT-4920, en medio NYDB y medio peptona, en condiciones de conservación a 1° C.
La figura 2 es una representación gráfica de las curvas de crecimiento de la cepa CECT-4920, en medio NYDB y medio peptona, en condiciones de conservación a 30° C.
La figura 3 es una representación gráfica de evolución de la población de la cepa CECT-4920, aplicado en heridas de 3 x 3 x 3 mm3 en manzanas "Golden Delicious", en condiciones de conservación a 20° y 30° C.
La figura 4 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en peras "Rocha", inoculadas con Botrytis cinérea 103, 104 y 105 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 7 dias de incubación a 20° C.
La figura 5 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcen- tajes de reducción de podredumbre en peras "Blanquilla", inoculadas con Peni cilli um expansum 103, 104 y 105 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 7 dias de incubación a 20° C. La figura 6 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en peras "Confe- rence", inoculadas con Rhizopus stolonifer 103, 104 y 105 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 7 dias de incubación a 20° C.
La figura 7 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con Penicillium digita tum 105 y 106 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 7 dias de in- cubación a 20° C.
La figura 8 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con Penicillium i talicum 105 y 106 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 7 dias de incubación a 20° C.
La figura 9 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcen- tajes de reducción de podredumbre en manzanas "Early Red One", inoculadas con Penicillium expansum, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30 dias de incubación en frió convencional. La figura 10 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre, en manzana "Fuji" inoculadas con Penicillium expansum, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos ob- tenidos después de 30 dias de incubación en frió convencional.
La figura 11 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los por- centajes de reducción de podredumbre en peras "Alejandrina", inoculadas con Penicilli um expansum, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30 dias de incubación en frió convencional.
La figura 12 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en peras "Decana de Comice", inoculadas con Penicillium expansum, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30 dias de incubación en frió convencional.
La figura 13 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los por- centajes de reducción de podredumbre en manzanas "Golden Delicious" , inoculadas con Botrytis cinérea , causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30 dias de incubación en frió convencional. La figura 14 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en manzanas "Golden Delicious", inoculadas con Penicillium expansum, causados por el baño de los frutos con el antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 90 dias de incubación en atmósfera controlada: 1% 02 - 1% C02; 2% 02 - 1% C02; 2% 02 - 2% C02; 2% 02 - 4% C02; 2% 02 - 6% C02; 3% 02 - 3% C02; 3% 02 - 6% C02.
La figura 15 es una representación en for- ma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción del total de podredumbres en naranjas "Valencia Late", sin inoculación artificial de patógeno, causados por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 60 dias de incubación a 3,5° C y diferentes condiciones de atmósfera controlada 1,5% 02 - 1,5% C02; 3% 02 - 3% C02; 5% 02 - 3% C02; y 8% 02 - 5% C02.
La figura 16 es una representación en for- ma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en peras "Blanquilla", inoculadas con Penicilli um expansum, causados por el baño de los frutos con el antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 90 dias de in- cubación en frió convencional.
La figura 17 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de podredumbre en manzanas "Golden Delicious", inoculadas con Botrytis cinérea , causados por el baño de los frutos con el antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 90 dias de incubación en atmósfera controlada: 1% 02 - 1% C02.
La figura 18 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los por- centajes de reducción de podredumbre en peras "Rocha", inoculadas con Penicillium expansum, causados por la inmersión en 8 x 107 ufc/ml del antagonista CECT-4920 y por la aplicación del fungicida químico Imazalil a una dosis comercial. Datos comparativos obtenidos después de 5,5 meses de incubación a 1° C de temperatura.
La figura 19 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con Penicilli um digi ta tum 105 y 106 ufc/ml, causados por inoculación del antagonista CECT-4920 y el aditivo alimentario, bicarbonato só- dico. Datos obtenidos después de 7 dias de incubación a 20° C.
Descripción de la invención Los autores de la presente invención han logrado aislar una nueva cepa de la especie actualmente reconocida como Pantoea agglomerans (Beije- rinck, 1988) Gavini, Mergaert, Beji, Mielcarek, Izard, Kersters y De Ley, 1989, pero también conoci- da por sus sinónimos Erwinia herbicola (Lóhnis, 1911) Dye 1964, Enterobacter agglomerans (Beije- rinck, 1988) Ewing y Fife, 1972 y Erwinia milletiae (Kawakami y Yoshida, 1920) Magrou 1937, que muestra una efectividad muy elevada como antagonista de las especies de hongos causantes de las enfermedades de las frutas antes y después de su cosecha (pre y postcosecha) , en una amplia gama de temperaturas y atmósferas de oxigeno, lo que permite su utilización industrial para el control biológico de dichas espe- cies fúngicas y prevenir la podredumbre de la fruta. La cepa de la presente invención se ha aislado de la superficie de manzanas, mediante un lavado con agua estéril seguido de un baño en ultrasonidos con tampón fosfato, y se ha depositado un cultivo de la misma, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo, con domicilio en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) España, que le ha asignado el número de depósito CECT-4920. El aislado de CECT-4920 ha sido identificado como Pantoea agglomerans y tras su aislamiento, se cultivó en el medio sólido peptona-agar, consistente en peptona, almidón, dextrosa y agar, en el medio liquido peptona consistente en peptona, almidón y dextrosa y en el medio liquido NYDB, consistente en caldo de extracto de levadura y dextrosa.
Morfológicamente, la cepa CECT-4920 forma colonias de color amarillo, redondas, bien definidas y es móvil. Tiene crecimiento aeróbico en medio peptona-agar a 30° C, y crecimiento anaerobio en medio Tioglicolato a 30° C, y presenta las características bioquímicas que se detallan en las tablas I y II:
Tabla I.- Resultados después de 24 y 48 h a 30° C del API 20 E - Sistema de identificación para Enterobacteriaceae y otros bacilos Gramil egativos.
Substratos (TESTS) Reacciones/enzimas Resultados
OriDnitrOfenol-galactosido (ONPG) β-galactosidasa ++
Arginina (ADH) Arginina dehidrolasa -
Usina (LDC) Usina descarboxilasa _
Omitiría (ODC) Omitina descarboxilasa _
Citrato sódico (CIT) Utilización del citrato +
Tiosulfato sódico (H2S) Producción de H2S -
Urea (URE) Ureasa -
Triptófano (TDA) Triptófano desaminasa -
Triptófano (IND) Producción del indol -
Piruvato sódico (VP) Producción de acetoína +
Gelatina de Kohn (GEL) Gelatinasa +
Glucosa (GLU) Fermentación / oxidación (4) ++
Manitol (MAN) Fermentación / oxidación (4) ++
Inositol (INO) Fermentación / oxidación (4) w
Sorbitol (SOR) Fermentación / oxidación (4) -
Ramnosa (RHA) Fermentación / oxidación (4) ++
Sacarosa (SAC) Fermentación / oxidación (4) ++ Melibiosa (MEL) Fermentación / oxidación (4) ++ Amigdalina (AMY) Fermentación / oxidación (4) ++ Arabinosa (ARA) Fermentación/oxidación (4) ++ sobre papel de filtro (OX) Citocromo oxidasa Tubo de GLU (N03) Producción de N02 Tubo de GLU (N02) Reducción a gas N2 API Mó microscopía (MOB) Movilidad + Medio Mac Conkey (McC) Crecimiento + Glucosa (OF/O) Abierto: oxidación + Glucosa (OF/F) Cenado: fermentación +
(+ positivo - negativo w débil)
Tabla II.- Resultados después de 24 h a 30° C del BIOLOG GN MICROPLATE - Ensayos de utilización de 95 fuentes de carbono para microorganismos Gram-negativos.
Substratos Resultados Substratos Resultados
Agua Acido p-hidroxifenilacético α-cictodextrina Acido itacónico
Dextrina + Acido α-cetobutfrico
Glicógeno + Acido α-cetoglutárico tween 40 + Acido α-cetovalérico tween 80 + Acido D,L- láctico +
N-acetil-D-galactosamina / Acido malónico +
N-acetil-D-glucosamina + Acido propiónico
Adonitol Acido quinico +
L-arabinosa + Acido D-sacárico +
D-arabitol + Acido sebácico
Celobiosa / Acido succínico + meso-eritrita Acido bromosucctnico +
D-fructosa + Acido succinámico
L-fucosa Glucuronamida +
D-galactosa + Alaninamida
Gentibiosa + D-alanina + α-D-glucosa + L-alanina + m-inositol + L-alanil-glicina + α-D-lactosa L-asparagina +
Lactulosa Acido L-aspártico + Maltosa + Acido L-glutámico +
D-manitol + Acido glicil-L-aspártico +
D-manosa + Acido glicil-L-glutámico +
D-melibiosa + L-histidina + β-metil-D-glucósido + L-hidroxiprolina
D-psicosa + L-leucina
D-rafinosa L-ornitina
L-ramnosa L-fenilalanina
D-sorbitol L-prolina
Sacarosa Acido L-piroglutámico
D-trehalosa D-serina /
Turanosa L-serina +
Xilitol L-treonina
Piruvato de metilo + D,L-carnitina
Succinato de mono-metil + Acido γ-aminobutírico +
Acido acético + Acido urocánico +
Acido cis-aconltico + Inosina +
Acido cítrico Uridina
Acido fórmico Timidina
Lactonadel Feniletilamina Acido D-galactónico
Acido D-galacturónico + Putrescina
Acido D-glucónico + 2-aminoetanol
Acido D-glucosamínico / 2,3-butanodiol
Acido D-glucurónico + Glicerol +
Acido α-hidroxibutírico / D.L^rcerof-fosfato +
Acido β-hidroxibutírico Glucosa-1 -fosfato +
Acido γ-hidroxibutírico Glucosa-6-fosfato +
(+ positivo / dudosamente positivo w débil en blanco: negativo)
El crecimiento in vi tro del microorganismo de la cepa CECT-4920, en medio NYDB y medio peptona, a pH inicial de 7, se produce en condiciones aeróbi- cas, a temperaturas de incubación de 1 y 30° C. Como se observa en las figuras 1 y 2 el microorganismo presenta un crecimiento similar en los dos medios de cultivo, y el máximo poblacional a 1° C se alcanza a los 15 dias de incubación, y a 30° C a las 30 horas de incubación, ambos en el medio peptona. En el gráfico de la figura 3, se muestra el elevado crecimiento de la cepa CECT-4920 en heridas artificiales en la fruta, que es donde el antagonista tiene que actuar, pues la mayoría de los hongos patógenos de la fruta necesitan una herida para iniciar el proceso de infección. Se observa un crecimiento similar a 20° C y a 30° C.
La inoculación del microorganismo en la superficie de la fruta muestra un gran crecimiento en condiciones de atmósfera controlada de 3% de oxigeno y de 3% de dióxido de carbono a temperatura de 1° C, que son propias de las condiciones de largo almacenamiento en las centrales hortofruticolas .
El aislado CECT-4920 se puede obtener, tanto a nivel de laboratorio como para su uso industrial, mediante su cultivo en un medio apropiado, empleando técnicas convencionales suficientemente conocidas por el experto. Por ejemplo, se puede obtener mediante el cultivo de la cepa original en me- dio NYDB, a pH 7, en un recipiente provisto de aireación y agitación, a temperaturas comprendidas entre 1 y 37° C, durante periodos del orden de 20 a 50 horas. El máximo poblacional (6 x 109 ufc/ml) para el medio NYDB a 30° C, en un recipiente de 6 litros, se alcanza después de 24 horas. Una vez finalizado el periodo de incubación, se procede a separar los microorganismos del medio de cultivo mediante técnicas convencionales de sedimentación, centrifugación o filtrado, y el cultivo se puede conservar, por ejemplo, mediante congelación en criobolas.
El antagonista CECT-4920 se puede aplicar a la superficie de los frutos mediante cualquier técnica convencional. Por ejemplo, se puede preparar una dispersión del cultivo en agua y proceder a la pulverización o ducha del fruto en el campo, antes de la recolección, o bien efectuar el tratamiento durante el proceso de manipulación del fruto reco- lectado, antes de proceder al almacenamiento, en cuyo caso el tratamiento se puede realizar también por inmersión.
Las concentraciones efectivas del antagonista CECT-4920 en la dispersión de aplicación para el tratamiento de las frutas pueden ser variables, en función de factores tales como el tipo de fruto, la madurez del mismo, la concentración del hongo patógeno en el fruto, la temperatura y humedad de conservación, etc. Habitualmente el rango de concentráciones efectivas se encuentra en 107-2xl08 ufc/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro) , lo que para bacterias es considerada una concentración baja, pero dicho margen no debe ser considerado como limitativo del objeto de la presente invención. El aislado de CECT-4920 es muy efectivo en el control biológico de diferentes especies de hongos patógenos de las frutas que incluyen, pero no se limitan, a Botrytis cinérea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum y Rhizo- pus stolonifer. Su efectividad en la prevención de la podredumbre de la fruta no se limita al almacenamiento de la misma en condiciones de temperatura y concentración de oxigeno ambientales sino que, debido a las características del microorganismo ya co- mentadas anteriormente, su empleo da también excelentes resultados en condiciones de almacenamiento de frigoconservación y atmósfera controlada, muy utilizadas por las centrales hortofruticolas . La efectividad del aislado CECT-4920 en el control de los hongos patógenos es comparable a la del fungicida Imazalil, producto químico derivado del imidazol (l-[2-(2, 4-diclorofenil) -2- (2- propeniloxi) etil] -IH-imidazol) , uno de los fungicidas más empleado en el mundo en postcosecha de frutos, lo que supone que el aislado CECT-4920 constituye una alternativa eficaz para dicho producto químico, con la ventaja de carecer de las caracteristi- cas de toxicidad del mismo.
El antagonista CECT-4920 se puede aplicar junto a otros agentes antifúngicos y/o adyuvantes, ceras, aditivos alimentarios, por ejemplo bicarbonato sódico, y sustancias de baja toxicidad. El antagonista CECT-4920 puede ser utilizado sólo, como agente de control biológico de los hongos patógenos de las frutas, o puede ser utilizado en combinación conjuntamente con otros agentes antifúngicos sintéticos y/o antagonistas biológicos, por ejemplo con levaduras de la especie Candida sa - ke, tales como las descritas en la patente española ES-2089981 y en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796, anteriormente citadas.
El aislado CECT-4920 puede ser empleado con efectividad para combatir la podredumbre de todo tipo de frutos, tanto los de pepita, tales como manzanas, peras y membrillo, en cualquiera de sus variedades, como los cítricos, tales como naranjas, limones y mandarinas, en cualquiera de sus varieda- des, y también los de hueso, tales como melocotones, albaricoques, cerezas y ciruelas, en cualquiera de sus variedades . Ejemplos
Los ejemplos que se exponen a continuación se deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión de la invención y no como li ita- ciones al objeto de la misma.
Ejemplo 1.- Obtención de una dispersión acuosa de CECT-4920. Se sembró el antagonista CECT-4920 en un tubo de ensayo con medio peptona-agar y se incubó a
27° C durante 24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un matraz Erlen- meyer con 50 mi de medio NYDB que se incubó en un agitador orbital a 150 rpm y a 30° C durante 24 ho- ras. A continuación se centrifugó el contenido del matraz a 7.500 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en 50 mi de agua destilada estéril y, a partir de dicha dispersión se preparon las concentraciones deseadas del antagonista mediante el cálculo de la transmitancia de la suspensión microbiana en el espectofotómetro, como medida indirecta de la concentración del antagonista. La equivalencia entre la transmitancia y la concentración de microorganismos se efectuó mediante recuento de viables en placa Petri en medio peptona- agar. Para cada caso, las concentraciones se expresan en ufc/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro) .
Ejemplo 2.- Efectividad de CECT-10897 en frutos de pepita almacenados a temperatura ambiente . El ensayo se realizó en 3 variedades de peras ("Blanquilla", "Conference" y "Rocha") sanas que fueron limpiadas con agua y dejadas secar y en las que se realizaron dos perforaciones por fruto, de dimensiones 3 x 3 x 3 mm3 aproximadamente. Las dos incisiones se situaron en la misma cara de la pera, localizadas una en la parte superior y otra en la parte inferior. La unidad de muestra estaba formada por tres peras y por cada tratamiento se reali- zaron tres repeticiones.
Las tres especies fúngicas ensayadas fueron Botrytis cinérea , Penicillium expansum y Rhizopus stolonifer y la titulación de las suspensiones de esporas de las mismas se realizó a partir de cul- tivos jóvenes de 5-7 dias, sembrados en medio PDA (patata, dextrosa y agar) , e incubadas a 25° C de temperatura, mediante el raspado de las colonias en agua estéril con Tween 80. A continuación se procedió al recuento de esporas en cámara Thoma, fijándo- se la concentración deseada, expresada en ufc/ml.
Lotes de tres peras preparadas como se ha explicado anteriormente se inocularon con 25 μl de la suspensión de antagonista CECT-4920, a las concentraciones de 2 x 107, 8 x 107 y 1 x 108 ufc/ml. Una vez secas las frutas, se procedió a la inoculación de 20 μl de las suspensiones tituladas de patógeno de las tres especies seleccionadas, a las concentraciones de 103, 104 y 105 ufc/ml. Paralelamente se preparó la prueba control en donde se sustituyó la suspensión del antagonista por agua destilada estéril .
Todas las frutas tratadas se colocaron en alvéolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su incubación a 20° C, con 80% de humedad relativa, durante 7 dias. El periodo de incubación se fijó en base al tiempo que se precisa para que las peras control presenten diámetros de podredumbre grandes. Tras dicho periodo de incubación, se procedió a la lectura de los resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de todas las perforaciones realizadas.
Los datos de lectura del diámetro de po- dredumbre de las diferentes repeticiones se sometieron a un análisis estadístico consistente en efectuar un análisis de la varianza y, una vez comprobado que dicho análisis de la varianza resultaba significativo (α<0,01 a α<0,05), se efectuó una separáción de medias de acuerdo con la Prueba de Rango Múltiple de Duncan, cuyos resultados se expresan con las letras del alfabeto minúsculas (a, b, c, d, ... ) , de manera que tratamientos con la misma letra son estadísticamente iguales y tratamientos con letras diferentes son estadísticamente diferentes.
En la tabla III se exponen los resultados obtenidos en el caso del control biológico de Botrytis cinérea en la variedad "Rocha", en la tabla IV en el de Penicilli um expansum en la variedad "Blan- quilla", y en la tabla V en el de Rhizopus stoloni fer en la variedad "Conference" .
La expresión gráfica de los resultados de dichas tablas se encuentra, respectivamente, en las figuras 4, 5 y 6. Tabla III. Control de CECT 4920 sobre B. cinérea en pera "Rocha"
Figure imgf000021_0001
Tabla IV. Control de CECT 4920 sobre P. expansum en pera "Blanquilla"
Figure imgf000021_0002
Tabla V. Control de CECT 4920 sobre R. stolonifer en pera "Conference"
Figure imgf000022_0001
Los datos recogidos en las mencionadas tablas III, IV y V, asi como su representación gráfica en las figuras 4, 5 y 6, muestran en tres variedades de pera la alta efectividad del antagonista CECT- 4920 en el control de las tres especies de hongos patógenos ensayados y, en consecuencia, en la prevención de la podredumbre de las frutas.
Ejemplo 3.- Efectividad de CECT-4920 en frutos cítricos almacenados a temperatura ambiente. El ensayo se realizó en naranjas "Valencia
Late" sanas que fueron limpiadas con agua, a continuación desinfectadas con una solución de hipoclori- to sódico a una concentración de 0,5% de cloro, vueltas a lavar con agua y dejadas secar. Una vez secos los frutos, se realizó una incisión, por cada naranja, de dimensiones de 5 mm de longitud y de 2 mm de profundidad aproximadamente. La incisión se situó en la zona ecuatorial de la naranja. La unidad de muestra estaba formada por cinco naranjas y por cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones.
Las dos especies fúngicas ensayadas fueron Penicillium digitatum y Penicillium italicum y la titulación de las suspensiones de esporas de las mismas se realizó siguiendo el método de trabajo ex- plicado en el ejemplo 2.
Lotes de cinco naranjas preparadas como se ha explicado anteriormente se inocularon con 25 μl de la suspensión titulada de patógeno de las dos especies seleccionadas, a las concentraciones de 105 ufc/ml y 106 ufc/ml. Una vez secas las frutas, se procedió a la pulverización durante 5 segundos de la suspensión de antagonista CECT-4920, a las concentraciones de 4 x 107 y 3 x 108 ufc/ml. Paralelamente se preparó la prueba control en donde se sustituyó la suspensión del antagonista por agua destilada estéril.
Todas las frutas tratadas se colocaron en alvéolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su incubación a 20° C, con 80% de humedad rela- tiva, durante 7 dias. Tras dicho periodo de incubación se procedió a la lectura de los resultados, contando el número de frutas podridas.
Los datos de lectura del número de frutas podridas de las diferentes repeticiones se sometie- ron a un análisis estadístico de la misma manera que en el ejemplo 2 y se exponen en las tablas VI y VII. La expresión gráfica de los resultados de dichas tablas se encuentra, respectivamente, en las figuras 7 y 8. Tabla VI. Control de CECT 4920 sobre P. digitatum en naranja "Valencia Late"
Figure imgf000024_0001
Tabla VIL Control de CECT 4920 sobre P. italicum en naranja "Valencia
Late"
Figure imgf000024_0002
Los datos recogidos en las mencionadas tablas VI y VII, asi como su representación gráfica en las figuras 7 y 8, muestran la alta efectividad del antagonista CECT-4920 en el control de las principales especies de hongos patógenos en cítricos, Peni - cillium digi ta tum y Penicillium i talicum .
Ejemplo 4. - Control de Peni cilli um expansum en frutos almacenados a temperatura de frigoconservación. Siguiendo el método de trabajo explicado en el ejemplo 2, se efectuaron ensayos con diez fru- tos por repetición y tres repeticiones por tratamiento. Este ensayo se realizó sobre manzanas de las variedades, "Early Red One" y "Fuji", y peras de las variedades "Blanquilla", "Rocha", "Decana de Comice" y "Alejandrina".
Se inocularon 25 μl de dispersión acuosa del antagonista CECT-4920, a dos concentraciones 8 x 107 y 1 x 108 ufc/ml, y 20 μl de inoculo de Penici lli um expansum, a la concentración de 104 ufc/ml. Todas las frutas tratadas se colocaron en alvéolos para su incubación a 1° C, con 90-98% de humedad relativa, durante 30 dias. Tras dicho periodo de incubación se procedió a la lectura de los resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de todas las perforaciones realizadas.
Los resultados obtenidos se exponen en las tablas VIII, IX, X y XI .
Tabla VIII. Control de CECT 4920 sobre P. expαnsum en manzanas "Early Red One"
Figure imgf000025_0001
Tabla IX. Control de CECT 4920 sobre P. expansum en manzanas "Fuji"
Figure imgf000026_0001
Tabla X. Control de CECT 4920 sobre P. expansum en pera
"Alejandrina"
Figure imgf000026_0002
Tabla XI. Control de CECT 4920 sobre P. expansum en pera "Decana de Comice"
Figure imgf000026_0003
Como se observa en las tablas anteriores y en las figuras 9 , 10 , 11 y 12 , los resultados obte- nidos muestran un elevado grado de eficacia , en con- diciones de frigoconservación, en el control de Penicillium expansum, en las diferentes variedades de pera y manzana, algunas de ellas incorporadas recientemente en el mercado fruticola europeo.
Ejemplo 5.- Control de Botrytis cinérea en frutos almacenados a temperatura de frigoconservación. Se efectuó un ensayo, bajo las mismas con- diciones del ejemplo 4, utilizando como inoculo de hongo patógeno 20 μl de inoculo de Botrytis cinérea a la concentración de 104 ufc/ml.
Los resultados obtenidos, después del tratamiento estadístico ya mencionado, se exponen en la tabla XII, y la expresión gráfica de estos resultados se presenta en la figura 13.
Tabla XII. Control de CECT 4920 sobre B. cinérea en manzana
"Golden Delicious"
Figure imgf000027_0001
Los resultados de reducción del diámetro de podredumbre fueron satisfactorios, principalmente para la concentración del antagonista CECT-4920 de 8 x 107 ufc/ml. Ejemplo 6. - Efectividad de CECT--4920 contra Peni - ciJJ ium expansum en frutos almacena- dos a baja temperatura y diferentes atmósferas de oxigeno y dióxido de carbono.
Para este ensayo la dispersión de antagonista se preparó, a mayor escala, de la siguiente manera:
Se sembró el antagonista CECT-4920 en un tubo de ensayo con medio peptona-agar y se incubó a
27° C durante 24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un fermentador, provisto de agitador y sistema de aireación, con
6.000 mi de medio NYDB y se incubó a 30° C durante 24 horas. A continuación se centrifugó el contenido del fermentador a 7.500 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en agua estéril y, a partir de dicha dispersión, se prepararon las concentraciones deseadas del antago- nista de la misma manera que en el ejemplo 1.
Se utilizaron quince manzanas "Golden Delicious" por repetición y tres repeticiones por tratamiento. En cada manzana se realizaron dos perforaciones con un punzón. Las dos perforaciones se si- tuaron en caras opuestas del fruto, localizadas en la zona ecuatorial.
Las manzanas se trataron con el antagonista CECT-4920, mediante la inmersión de los frutos en baños que contenían dispersiones de antagonista a concentraciones de 2 x 107 y 8 x 107 ufc/ml. Se utilizó un lote de cuarenta y cinco frutas sin tratar que constituyó la prueba control. A continuación, las manzanas, una vez secas, se sumergieron en un baño con una suspensión titulada de Penicilli um expansum a la concentración de 104 ufc/ml.
Todas las frutas se pusieron en alvéolos, y se dividieron en siete lotes distintos, que se almacenaron durante 90 dias a 1° C en microcámaras con las siguientes condiciones de gases: 1% 02 - 1% C02; 2% 02 - 1% C02; 2% 02 - 2% C02; 2% 02 - 4% C02; 2% 02 - 6% C02; 3% 02 - 3% C02; y 3% 02 - 6% C02.
Los resultados se leyeron y trataron estadísticamente, tal como se ha explicado anteriormente, y se exponen en la tabla XIII. Su representación gráfica se expone en la figura 14.
Tabla XIII. Control de CECT 4920 sobre P. expαnsum en manzana "Golden Delicious" a diferentes condiciones de atmósfera controlada.
Figure imgf000029_0001
El análisis de los resultados, indica que el antagonista CECT-4920 mantiene su efectividad en el control de Penicillium expansum en las más variadas condiciones de atmósfera controlada.
Ejemplo 7.- Control de podredumbres en cítricos almacenados a baja temperatura y diferentes atmósferas de oxígeno y dióxido de carbono. El ensayo se realizó sobre naranjas "Valencia Late", recogidas en campo, que sin cualquier limpieza previa se perforaron como se explicó en el ejemplo 3. La unidad de muestra estaba formada por cuarenta frutos y por cada tratamiento se realizaron tres repeticiones.
En este ensayo no se inocula ningún hongo; se trata de inoculación natural, pues en los frutos cítricos los hongos patógenos provienen en su mayoría del campo. Se preparó el antagonista CECT-4920 a gran escala, siguiendo el método explicado en el ejemplo 6. Los frutos se trataron con el antagonista durante 1 minuto mediante la inmersión de los frutos en un baño que contenía la dispersión del microorganismo CECT-4920 a una concentración de 1 x 108 ufc/ml. Se preparó una prueba control, donde se sustituyó el baño del antagonista con un baño de agua.
Todas las frutas se pusieron en alvéolos, y se dividieron en cinco lotes distintos, que se al- macenaron durante 60 días a 3,5° C en microcámaras con las siguientes condiciones de gases: 1,5% 02 - 1,5% C02; 3% 02 - 3% C02; 5% 02 - 3% C02; y 8% 02 - 5% C02. Los resultados se leyeron y trataron estadísticamente como ya se ha explicado y se exponen en la tabla XIV . Su representación gráfica se expone en la figura 15.
Tabla XIV. Efectividad de CECT 4920 en el control de las podredumbres de cítricos a diferentes condiciones de atmósfera controlada. (Ensayo sin inoculación artificial de patógenos).
Figure imgf000031_0001
Del análisis de los resultados se puede concluir que el antagonista CECT-4920 presenta una elevada eficacia en el control de los hongos patógenos de los cítricos en diversas condiciones de atmósfera controlada, permitiendo así lograr uno de los objetivos más importantes en el sector citríco- la, que es el de alargar el período de conservación, objetivo muy limitado en conservación en condiciones de frío convencional.
Ejemplo 8 Control de hongos patógenos en ensayos a mediana escala. Para este ensayo la dispersión de antagonista se preparó a gran escala, siguiendo el método explicado anteriormente.
El ensayo se realizó en pera "Blanquilla" y manzana "Golden Delicious" que se trataron como se explicó en el ejemplo 6. La unidad de muestra estaba formada por 20 frutos y por cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones.
Una vez tratadas las frutas en los baños que contenían la dispersión del antagonista CECT- 4920 a concentraciones de 2 x 107 y 8 x 107 ufc/ml e inoculadas con el hongo patógeno, mediante un baño con la suspensión titulada de esporas, se separaron en dos lotes y se almacenaron durante 90 días: un lote en frío convencional (1° C y oxígeno ambiente) y otro en condiciones de atmósfera controlada (pera: 0,5° C y 3% de oxígeno; manzana: 1°C y 1% de oxígeno) .
Las dos especies fúngicas ensayadas fueron Botrytis cinérea y Penicillium expansum a la concentración de 104 ufc/ml.
Los resultados se leyeron y trataron de la misma manera que en los ejemplos anteriores. Como exemplos, en la tabla XV se expone el resultado del control de Penicillium expansum en peras "Blanquilla" almacenadas en atmósfera controlada, y en la tabla XVI el control de Botrytis cinérea en manzanas "Golden Delicious" almacenadas en frío convencional. Su representación gráfica se expone en las figuras 16 y 17. Tabla XV. Control de CECT 4920 sobre P. expansum en pera "Blanquilla" conservada en atmósfera controlada
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Tabla XVI. Control de CECT 4920 sobre B. cinérea en manzana "Golden Delicious" conservada en frío normal
Figure imgf000033_0002
Como se observa en las tablas anteriores y en las figuras 16 y 17, los resultados obtenidos muestran un elevado grado de eficiencia en el control de los hongos patógenos, Penicillium expansum y Botrytis cinérea en condiciones de conservación en atmósfera baja en oxigeno, y también en atmósfera convencional, durante un largo período de tiempo. Ejemplo 9.- Comparación con el fungicida Imazalil.
El ensayo se efectuó con pera "Rocha" siguiendo la metodología explicada en el ejemplo 6. La unidad de muestra estaba formada por diez frutos, y por cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones .
Tanto el antagonista CECT-4920 como el fungicida Imazalil se aplicaron mediante baño de los frutos en soluciones o dispersiones de los mismos. El antagonista se aplicó a la concentración de 8 x 107 ufc/ml y el Imazalil a la dosis recomendada en el producto comercial y, a continuación, las peras se inocularon con el patógeno de la especie Penici - llium expansum, mediante un baño a una concentración de 104 ufc/ml.
Los frutos se incubaron en condiciones de frío convencional durante 5,5 meses, al cabo de los cuales se procedió a la lectura de los resultados y a su tratamiento estadístico.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla XVII y su representación gráfica en la figura 18.
Tabla XVII. Control de P. expαnsum, comparación con Imazalil
Figure imgf000034_0001
Se observa que la efectividad del antagonista CECT-4920 y la del Imazalil es estadísticamente igual después de 5,5 meses en frigoconservación.
Ejemplo 10. - Efectividad del tratamiento combinado del antagonista CECT-4920 con un aditivo alimentario en el control de po- dredumbres de cítricos almacenados a temperatura ambiente. Los frutos se prepararon siguiendo el método explicado en el ejemplo 3, y los ensayos se efectuaron con veinte naranjas "Valencia Late" por repetición y tres repeticiones por tratamiento.
El aditivo alimentario seleccionado fue el bicarbonato sódico (NaHC03) a una concentración del 2%.
Las naranjas se inocularon con 25 μl de la suspensión titulada de Penicillium digi ta tum a la concentración de 106 ufc/ml. Posteriormente los frutos inoculados se sumergieron en la solución de bicarbonato sódico durante 2,5 minutos. Una vez secas las frutas, se procedió a sumergirlas en la solución del antagonista CECT-4920, a la concentración de 1 x 108 ufc/ml, durante 1 minuto.
Paralelamente, después del inoculo del patógeno, se prepararon las tres pruebas control, que consistieron en la inmersión de la fruta en las si- guientes soluciones: bicarbonato sódico al 2% durante 2,5 minutos; antagonista CECT-4920, a la concentración de 1 x 108 ufc/ml, durante 1 minuto; agua corriente durante 1 minuto. Después de secas las frutas, se colocaron en alvéolos para su incubación a 20° C, con 80% de humedad relativa, durante 7 dias. Tras dicho período se realizó la lectura de los resultados como se explicó en los ejemplos anteriores.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla XVIII y su representación gráfica en la figura 19.
Tabla XVIII. Control de CECT 4920 combinado con bicarbonato sódico sobre P. digitatum en naranja "Valencia Late"
Figure imgf000036_0001
De los resultados se puede observar la elevada eficacia del antagonista CECT-4920, que además se ve significativamente mejorada cuando el tratamiento del antagonista se hace conjuntamente con el aditivo alimentario.
Información sobre el depósito de la cepa CECT-4920
El depósito del microorganismo se ha efectuado de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del deposito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , con residencia en el Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) España. El depósito se efectuó el 11 de julio de 1997, y el CECT le asignó el número de depósito CECT-4920.
El depósito está a disposición del público, bajo las condiciones previstas en el mencionado Tratado de Budapest, si bien dicha disponibilidad no se puede interpretar como una licencia para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los derechos del solicitante de la presente patente.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- El cultivo biológico substancialmente puro de la cepa de la especie Pantoea agglomerans, depositada con el número CECT-4920.
2.- La utilización del cultivo CECT-4920 de la reivindicación 1 como antagonista para el con- trol biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre en los frutos.
3.- La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los hongos pató- genos pertenecen a cualquiera de las especies Botrytis cinérea , Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium i talicum y Rhizopus stolonifer.
4.- La utilización, de acuerdo con la rei- vindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los conocidos como de pepita, especialmente manzanas, peras y membrillos, en cualquiera de sus variedades .
5.- La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los conocidos como cítricos, especialmente naranjas, limones y mandarinas, en cualquiera de sus variedades .
6.- La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los conocidos como de hueso, especialmente meló- cotones, albaricoques, cerezas y ciruelas, en cualquiera de sus variedades.
7.- Un método para prevenir la podredumbre de los frutos de postcosecha caracterizado porque la fruta se trata, antes o después de su recolección, con un preparado del cultivo CECT-4920 de la reivindicación 1.
8. - Un método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento se efectúa por medio de la pulverización, mojado o inmersión de los frutos en o con una dispersión acuosa del antagonista CECT-4920.
9.- Un método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento se efectúa con aditivos alimentarios en conjunto con una dispersión acuosa del antagonista CECT-4920.
10.- Un método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento se efectúa con una mezcla de una dispersión acuosa del antagonista CECT-4920 y uno o más microorganismos antagonistas de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de los frutos.
11.- Un método, de acuerdo con las reivindicación 8, caracterizado porque la concentración del antagonista CECT-4920 en la dispersión acuosa está comprendido entre 107 y 2xl08 ufc/ml.
12.- Un método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque los frutos se con- servan después de su recolección en condiciones de almacenamiento a temperatura y atmósfera de oxígeno ambientales .
13.- Un método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque los frutos se conservan después de su recolección en condiciones de almacenamiento a temperatura inferior a 5° C y atmósfera con contenido de oxigeno inferior al 8%.
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