CN113308415A - 一种防治柑橘青霉、绿霉的生防菌 - Google Patents

一种防治柑橘青霉、绿霉的生防菌 Download PDF

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Abstract

一种防治柑橘青霉、绿霉的生防菌。本发明公开了一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2021309。该菌株可作为生防菌用于柑橘采后病害防治，尤其是青霉、绿霉等致病真菌引起的侵染性病害的防治，从而解决柑橘采后存储时间短的问题。

Description

一种防治柑橘青霉、绿霉的生防菌
技术领域
本发明涉及一种柑橘采摘后防治青、绿霉的生防菌及其应用。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，为仅次于小麦和玉米的世界第三大国际贸易农产品。中国是柑橘的重要原产地之一，柑橘资源丰富，优良品种繁多，有4000多年的栽培历史。我国作为柑橘的原产地和生产大国，近几十年来发展迅猛，据统计，截止2018年底，全国有柑橘投产面积3939万亩，产量4138万吨，全国有19个省、市、自治区有经济栽培的柑橘，主产省份有广西、湖南、湖北、江西、四川、福建等。柑橘正成为产区农民增收的支柱产业。柑橘因其营养、药用及保健价值高而深受人们的喜爱。然而柑橘在采收和运过程中相橘果实极易造成损伤，受到采后真菌的侵染，从而引起果实发病腐烂，加之我国柑橘以鲜食为主，成熟期相对集中，造成我国每年柑橘在采后贮藏、运输和销售环节的损失非常巨大，导致严重的经济损失。
在采后贮藏、运输和销售期间，除不良环境引起的生理性病害之外，由青霉、绿霉等致病真菌引起的侵染性病害是造成柑橘果实发生腐烂的最重要原因。因此，如何防止柑橘的真菌病害，延长贮藏时间，提高保鲜效果己成为柑橘产业的重大课题，是改善柑橘果实商品性状和提升经济效益的重要技术手段。长期以来，控制采后病害的主要方法是使用化学杀菌剂，如施保克、戴挫霉、百可得、甲基托布津、多菌灵等。长期和大量化学杀菌剂的使用使病原真菌产生耐药性从而降低效果以及农药残留。并且随着人们生活水平的提高，人们对绿色纯天然食品的需要越来越高，拮抗微生物及其代谢产物用于柑橘病害防治的安全无毒环保的生物防治法成了当前研究的热点。生物防治是采用微生物菌株或其代谢产物，通过喷洒或浸渍果实处理防治果实采后病害的方法。当前有许多报道表明某些酵母菌可作为生防菌用于柑橘采后病害的防治，但是总体效果不明显，且很多微生物是从其他环境中分离得到，对于柑橘自身或者对人畜是否有害未知，迫切需要从柑橘自身尤其是柑橘果实中筛选出新的高效、无害、环境友好型的生防菌，特别是对柑橘主要致病菌青霉和绿霉抑制效果较好的微生物。
伯克霍尔德菌(Burkholderia)是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能。伯克霍尔德菌能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体(Pyochenlin，Pyoverdine)、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A、CepacidineA、Cepacin A等。现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域。
CN104109645A的《用于防治果蔬采后病害的菌株及生防菌剂》告知了一种用于防治果蔬采后病害的菌株(保藏登记号为CCTCC M2014076)，与伯克氏菌(Burkholderialata)同源性为99.8％。能够很好地抑制果蔬采后灰霉病的发生。
CN103320371A的《一种与AM真菌协同促生作用的细菌及在蔬菜促生的应用》公开一种与AMF协同促生的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)CGMCCNo.6492。
CN108251328A的《一种防治蔬菜南方根结线虫病的微生物菌剂及其应用》公开了越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis P418，该微生物菌剂防治蔬菜根结线虫病的防治效果达到75％以上。
CN110699305A的《一种伯克氏菌及其该伯克氏菌的应用》Burkholderia arborisJ211；保藏编号为CCTCC NO：M 2019747，其具有明显提高大田作物抗线虫病的能力。
CN111607537A的《一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用》一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01，上清液对禾谷镰刀菌菌丝的抑制活性显著提高。
虽然上述研究表明伯克霍尔德菌属的某些种具有拮抗性能，能够抑制果蔬病虫害，但是没有关于抑制柑橘采后青霉、绿霉的报道，尤其是没有在从柑橘自身中分离到的内生菌伯克氏菌用于柑橘青绿霉防治的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种防治柑橘采摘后青、绿霉的生防菌——伯克霍尔德氏菌，该菌株可作为生防菌用于柑橘采后病害防治，尤其是青霉、绿霉等致病真菌引起的侵染性病害的防治，从而解决柑橘采后存储时间短的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种生防菌，为伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，其保藏号为：CCTCC NO:M 2021309。
本发明还同时提供了上述生防菌的用途：防治致病真菌引起的侵染性病害，特别是用于柑橘采摘后青、绿霉病的防治。
该柑橘内生菌---伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，是发明人从柑橘果实中分离到的一株细菌，经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于伯克霍尔德氏菌，将其命名为伯克霍尔德氏LG83(Burkholderi sp.LG83)。
本发明的菌株LG83的保藏信息具体如下：保藏名称：Burkholderi sp.LG83，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2021309，保藏时间2021年3月31日。
本发明的菌株LG83分离方法为：
1)、将柑橘皮经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨，梯度稀释涂布于NA固体培养基平板上，于30℃培养48小时，长出单菌落；
NA固体培养基斜面配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH＝7.2～7.4。
2)、挑取单菌落于相同的培养基(即，NA固体培养基)平板划线纯化，于28～32℃培养48小时；
3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。
本发明的柑橘内生菌——伯克霍尔德氏LG83(以下称伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M2021309)具有如下生物学特征：
1.菌落形态特征：在NA培养基上生长良好，细菌群落特征：菌落1-2mm，菌落为乳白色，圆形，边缘完整，凸起，菌落不透明。
2.菌体形态特征：杆状，革兰氏阴性。
3.主要生理生化特征：过氧化氢酶、氧化酶、触酶试验阳性反应阳性，该菌可在NA培养基上，在生长温度为20-38℃、pH值为6.0-8.0的环境中生长良好。
4.遗传学特征：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英，科学出版社，2001)，本发明的伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309形态特征上，与国内命名的伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)接近；该菌的16S rDNA序列分析表明，与包括Genbank国际数据库中在内的现有已知序列相似性高的菌株都属于伯克霍尔德氏菌，但其最高相似度在94.5％，远低于国际公认的新种的97％的标准。因此，伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309属于伯克霍尔德氏属的一个新种。
本发明的伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309在平板对峙实验中可以抑制柑橘致病菌青霉菌的生长，且伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309的发酵上清液涂布到接种了青霉菌或者绿霉菌的柑橘表皮，能有效的控制柑橘的腐烂，无农药残留，且菌株是分离自柑橘表皮的内生菌，对人畜及柑橘本身无毒无害，对环境不造成污染。可在柑橘采后存储中得到应用，产生一定的经济效益。
综上，本发明提供一株从健康的柑橘中分离得到的一株天然生防内生菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，用于柑橘采后青绿霉感染的防治。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为分离菌株与指状青霉对峙实验示意图；
图2为拮抗菌的筛选图；
图3为伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309在柑橘青霉病防治中的应用对比图；
图4伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309在柑橘绿霉病防治中的应用对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、柑橘表皮内生菌的分离培养方法，依次进行以下步骤：
1、于浙江衢州采集种植的健康柑橘，将其表皮用自来水充分清洗；
2、无菌水冲洗步骤1所得的供试材料，重复2次，然后依次用75％(v/v)的乙醇和3％(m/V)次氯酸钠溶液对供试材料进一步表面消毒，杀灭表面微生物；
3、在无菌环境中，将步骤2所得的供试材料用无菌水冲洗3次去除残留乙醇和次氯酸，取100μl最后1次冲洗所产生的无菌水冲洗液涂布接种于基础NA培养基上，30℃培养24h后，观察有无菌落产生。验证上述消毒方法是否全部杀死供试材料表面微生物。
如果无菌落产生，则进行下述的步骤4；如果有菌落产生，则重复2-3步骤至无菌落产生。
4、在超净台中，取1～2g上述处理好的柑橘皮样品，在无菌研钵中充分研磨，加入5mL无菌水，混匀，静置15min，取100μl上清液稀释涂布于NA固体培养基中，28～32℃培养1～3天(较佳30℃、48小时)；
NA固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH＝7.2～7.4。
5、挑取NA固体培养基上长出的菌种于相同培养基(即，NA固体培养基)划线纯化分离，置于28～32℃培养1～3天(较佳30℃、48小时)，挑取单菌落；
重复上述操作直至得到单菌落为止。
6、将步骤5中所得到的多个单菌落接种于NA固体培养基斜面保存于4℃冰箱中。
实施例2、平板对峙实验筛选获得伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，依次进行以下步骤：
1、将实施例1获得的多个单菌落分别转接到NA固体培养基平板中，30℃培养2天；得斜面种子；
NA固体培养基平板配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2、用接种环挑取一环步骤1所得的不同斜面菌种，接种于装有100ml NA液体培养基的250ml三角瓶中，于28℃以220r/m转速振荡培养72h，得待筛选菌发酵原液；
NA液体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
上述步骤1和步骤2均在自然光条件下培养。
3、取步骤2所得待筛选菌发酵原液，于4℃，12000rpm，离心2min，取上清过0.22μm微孔滤膜，所得滤液为待筛选菌测试液。
4、将指示菌指状青霉接种于PDA固体培养基上，放置于28℃的真菌培养箱内培养，产生孢子后，用灼烧灭菌后的刮刀蘸取适量无菌水，刮下孢子放入装有4mL无菌水的10mLEP管内，用无菌玻璃棉过滤后，加无菌水稀释，制备成浓度为104个/mL指状青霉孢子悬液。
5、将步骤3得到的待筛选菌测试液和步骤4所得的指状青霉孢子悬液如图1所述方式共同培养：中间位点滴加5μL指状青霉孢子悬液，其余3个位点滴加5μL待筛选菌株测试液，放入培养箱，28℃培养，每天观察并记录。通过观察指状青霉的生长状况，判断分离菌株对其生长的抑制作用，来评价抑菌效果，部分抑菌实验结果见图2。其中效果最好的一株菌为LG83。
6、LG83在NA培养基上生长良好，细菌群落特征：菌落1-2mm，菌落为乳白色，圆形，边缘完整，凸起，菌落不透明。菌体呈杆状，革兰染色阴性。过氧化氢酶、氧化酶、触酶试验阳性反应阳性，该菌可在NA培养基上，在生长温度为20-38℃、pH值为6.0-8.0的环境中生长良好。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英，科学出版社，2001)，本发明的LG83形态特征上，与国内命名的伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)接近；该菌的16S rDNA序列分析表明，与包括Genbank国际数据库中在内的现有已知序列相似性高的菌株都属于伯克霍尔德氏菌，但其最高相似度在94.5％，远低于国际公认的新种的97％的标准。因此，伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309属于伯克霍尔德氏属的一个新种。该菌的16S rDNA序列为SEQ ID No：1所示。
7、本发明的菌株LG83的保藏信息具体如下：保藏名称：Burkholderi sp.LG83，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2021309，保藏时间2021年3月31日。
实施例3、伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83(保藏编号为：CCTCC NO:M2021309)对青霉、绿霉的生防作用：
1、将实施例2获得的伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83转接到NA固体培养基平板中，30℃培养2天；得斜面种子；
2、用接种环挑取一环步骤1所得的伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309，接种于装有100ml NA液体培养基的250ml三角瓶中，于28℃以220r/m转速振荡培养72h，得发酵原液；
3、取步骤2所得发酵原液，于4℃，12000rpm，离心2min，取上清经0.22μm微孔滤膜过滤两次，得发酵滤液，分装至1.5ml离心管中，备用。
4、将青霉(Penicillium italicum)和绿霉(P.digitatum)接种于PDA固体培养基上，放置于28℃的真菌培养箱内培养，产生孢子后，用灼烧灭菌后的刮刀蘸取适量无菌水，刮下孢子放入装有4mL无菌水的10mL EP管内，用无菌玻璃棉过滤后，加无菌水稀释，分别制备成浓度为104个/mL青霉、绿霉孢子悬液，备用。
5、挑选管理正常的果园，选择果型大小相近，无明显机械损伤的成熟椪柑果实(柑橘主要品种之一)，将椪柑果实整体消毒后，在果实腰部中心，用已灭菌的接种针扎入果实，造成一个宽约3mm，深度为4mm的伤口。每个果实仅设置一个伤口。
6、在伤口中分别先后接入步骤3获得的10μL伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309发酵滤液及步骤4获得的青霉孢子悬液/绿霉孢子悬液10μL。阴性对照组的设置采用无菌水来代替菌液进行处理，阳性对照采用施保克500ppm进行处理(实际生产中常用化学药剂)。
各处理分别如下：
菌液处理：伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309+青霉(或绿霉)；
阳性对照：施保克+青霉(或绿霉)；
阴性对照：无菌水+青霉(或绿霉)。
将处理完成后的果实放入纸箱(平放，果实间相互无接触无挤压)，每组处理10个柑橘果实，保存在阴凉处(温度约为25℃)，每3天观察一次，记录现象，统计果实发病率。
7、20天时观察结果如下：伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309无论对柑橘青霉(图3)或者绿霉(图4)都有一定的抑制作用，对青霉的抑制率为70％(3个发病/10个柑橘)，而对绿霉的抑制率为80％(2个发病/10个柑橘)，明显好于阴性对照组(100％发病)，虽然其效果比阳性对照组略差(阳性对照组青霉的抑制率为100％、绿霉抑制率为100％)，但是本发明无农药残留，且菌株分离是分离自柑橘表皮的内生菌，对人畜及柑橘本身无毒无害，对环境不造成污染。
实施例4、将发酵上清液涂布到接种了青霉菌或者绿霉菌的柑橘表皮进行实验：
将实施例3的步骤6改成：在伤口中接入青霉孢子悬液/绿霉孢子悬液10μL，然后用伯克霍尔德氏菌CCTCC NO:M 2021309发酵滤液涂抹柑橘表皮，直至形成滴液；其余等同于实施例3。
取50个柑橘重复上述实验，伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83对青霉的抑制率约为70％左右，对绿霉的抑制率约为80％左右。
将CCTCC M2014076的菌株、Burkholderia vietnamiensis P418、Burkholderiaarboris J211参照上述案例进行检测，所得结果为：其对青霉、绿霉的抑制率均仅仅为10～30％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江佳农果蔬股份有限公司
<120> 一种防治柑橘青霉、绿霉的生防菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1456
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)
<400> 1
attgaacgct ggcggcatgc cttacacatg caagtcgacc cgcagcacgg gtgctagcac 60
ctcgtggcga gtggcgaacg ggtgagtaat acatcggacc atgtcctgta gtgggggata 120
gcccggcgaa agccggatta ataccgcata cgatctacgg atggaagcgg gggaccttcg 180
ggcctcgcgc tatagggttg gccgatggct gagtacctag ttggtggggt atagttctac 240
caaggcgacg atcagtagct ggtctgagag gccgaccagc cacactcgga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagttgc gaattatgga caatgagcga aagcctgatc 360
cagcaatgcc gcgtgtgtga agatggcctt cgggttgtta agcactgttg ttcggaaaga 420
aatccttggt tctgatatag ccgggggatg acggtaccgg aagaattagc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540
aagcgtgggc aggcggtatg ttaagggcga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact 600
gcattggtga ctggcaagct agagtatggc agtagggggt agtattgcag gtgaagaagt 660
gaaatgcata gacatgtggt ggaataccca tacctaaggc agccccctgg gccaatactg 720
atcgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag attcgctggt agtccacgcc 780
ctaaacgatg tcaactagtt gttggggaat catatcctta gtaacgtcgc taacgcgtga 840
agttgaccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaacctc aaaggaattg acggggaccc 900
gcacaagcgg tggatgatgt ggattaattc gatgcagcgc gaaatatctt acctacccat 960
gacatggtcc gaattccgct gagaggtggg agtgctcgaa agagaaccgg cgcacaggtg 1020
ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgtttcct taagtctcgc aaccagcgca 1080
actcttgtcc atagttgcta cgcaagagca ctctaaggag actgccggtg acaagccgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg ccccttatgg ttagggcttc acacgtcata 1200
caaggctcgg aacagaggct tgccaacccg caagggctag ctaatcccag aaaaccgatc 1260
gtagtccgaa ttgcactctg caactcgagt gcatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320
atcagcatgc cgcggtgtat acgttcccgg gtcatgtaca cacagcgccg tctcaccatg 1380
cgagtgggtt ttaccagaag tggctagtct aaccgtaagg aggacggtca ccacggtagg 1440
attcatgatt ggggtg 1456

Claims (4)

1.伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83，其特征在于保藏编号为：CCTCC NO:M2021309。
2.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderi sp.)LG83的用途，其特征在于：作为生防菌用于柑橘采后病害防治。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：防治致病真菌引起的侵染性病害。
4.根据权利要求3述的用途，其特征在于：防治柑橘采摘后的青霉病、绿霉病。
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