ES2201174T3 - Nueva cepa de la levadura candida sake (saito y ota) van uden y buckley y su utilizacion como antagonista para el control biologico de las infecciones fungidas de la fruta recolectada. - Google Patents

Nueva cepa de la levadura candida sake (saito y ota) van uden y buckley y su utilizacion como antagonista para el control biologico de las infecciones fungidas de la fruta recolectada.

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ES2201174T3 ES96906776T ES96906776T ES2201174T3 ES 2201174 T3 ES2201174 T3 ES 2201174T3 ES 96906776 T ES96906776 T ES 96906776T ES 96906776 T ES96906776 T ES 96906776T ES 2201174 T3 ES2201174 T3 ES 2201174T3
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Abstract

SE DESCRIBE UNA NUEVA CEPA DE LA LEVADURA CANDIDA SAKE (SAITO Y OTA) VAN UDEN Y BUCKLEY Y SU USO COMO AGENTE DE CONTROL BIOLOGICO EN ENFERMEDADES FUNGICAS DE FRUTAS POST-COSECHADAS. DICHA CEPA, DEPOSITADA CON EL NUMERO CECT-10817, SE UTILIZA COMO ANTAGONISTA DE HONGOS RESPONSABLES DEL PUDRIMIENTO DE LA FRUTA DESPUES DE HABER SIDO RECOGIDA Y DURANTE EL PERIODO DE ALMACENAMIENTO. LA EFECTIVIDAD DE DICHO ANTAGONISTA ES MUY ALTA Y ES COMPARABLE A LA DE LOS PRODUCTOS QUIMICOS ANTIFUNGICOS AMPLIAMENTE UTILIZADOS. DICHA ACTIVIDAD ES INTENSIVAMENTE PRODUCIDA PARTICULARMENTE EN CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO A BAJA TEMPERATURA Y EN ENTORNOS CON POCO OXIGENO. EL ANTAGONISTA ES EFICAZ PARA COMBATIR EL PUDRIMIENTO CAUSADO POR, ENTRO OTROS MICRO-ORGANISMOS, LOS HONGOS DE LAS ESPECIES BOTRYTIS CINEREA, PENICILLIUM EXPANSUM Y RHIZOPUS NIGRICANS.

Description

Nueva cepa de la levadura Candida sake (saito y ota) van Uden y Buckley y su utilización como antagonista para el control biológico de las infecciones fúngicas de la fruta recolectada.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una nueva cepa de la levadura Candida sake y a su utilización como antagonista para el control biológico de las infecciones fúngicas de la fruta recolectada, con el objeto de prevenir la podredumbre de la fruta en condiciones de almacenamiento.
Estado de la técnica
Las enfermedades de postcosecha de las frutas producen pérdidas anuales en la agricultura que se estiman, a nivel mundial, en una cantidad del orden de un 15% a un 20% del total de las cosechas.
En la actualidad, el sistema más utilizado para combatir a los hongos causantes de la podredumbre de las frutas después de su recolección es el control químico, mediante tratamiento de las cosechas con productos fungicidas. El empleo de los fungicidas está bastante extendido a nivel mundial y se estima que supone hasta el 26% de los pesticidas de los mercados europeo y asiático y, en el caso del mercado norteamericano, hasta el 6%.
La utilización masiva de dichos productos fungicidas ha generado una serie de problemas, tales como la aparición de cepas patogénicas resistentes - lo que repercute en el incremento progresivo de los costes de los tratamientos y en el aumento de los niveles de pérdidas por podredumbre - y el incremento de residuos de fungicidas en los frutos que provoca problemas de tipo sanitario y dificulta las exportaciones a los países que poseen una reglamentación sanitaria restrictiva sobre el tema.
Ante dicho problema se ha comenzado a desarrollar, hace relativamente pocos años, una actividad investigadora con el fin de encontrar nuevos métodos alternativos para el control de las enfermedades de los frutos en su etapa de postcosecha, siendo una de las vías de desarrollo más destacadas el control biológico de los hongos causantes de la podredumbre. Dicho control biológico se fundamenta en la acción inhibidora de algunos microorganismos sobre el crecimiento y acción de los hongos patógenos. Así, Janisiewicz, W.J., Phytopathology 77:481-485 (1987), ha descrito un tratamiento de control biológico del moho azul de las manzanas; Janisiewicz, W.J. and Roitman, J., Phytopathology 77:1776 (1987), describen la utilización de Pseudomonas cepacia como agente de biocontrol postcosecha para combatir la podredumbre de las manzanas; Janisiewicz, W.J. and Roitman, J., Phytopathology 78:1697-1700 (1988), describen la utilización de Pseudomonas cepacia como agente de biocontrol postcosecha para combatir los mohos gris y azul de las manzanas y las peras.
Entre los antagonistas de los hongos causantes de la podredumbre de la fruta, resultan de particular interés las levaduras, que pueden colonizar la superficie del fruto durante largos períodos de tiempo, produciendo polisacáridos extracelulares que potencian su supervivencia y que limitan los lugares de colonización y la germinación de los propágulos fúngicos, debido a que utilizan más rápidamente los nutrientes disponibles. Así, McLaughlin, R.J. et al., Phytopathology 80:456-461 (1990), describen los efectos de la concentración de las levaduras Candida sp. en el control biológico de las enfermedades de postcosecha de la manzana; la solicitud de patente PCT WO- 91/1641 describe la utilización, como agentes para el control biológico de enfermedades de postcosecha de productos vegetales, de varias levaduras, entre ellas cepas o aislados pertenecientes a la especie Candida guilliermondii. Dichos aislados muestran actividad contra, entre otras, las siguientes especies de hongos patogénicos: Penicillium italicum, Penicillium digitatum, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Geotrichum candidum, Penicillium expansum y Alternaria alternata. La patente norteamericana US- 5041384, que proviene de la misma prioridad que la mencionada solicitud de patente PCT, se centra en la actividad de tres cepas concretas de Candida guilliermondii.
Jijakli, M.H. et al Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 58/3b,p.1349- 1358 (1993) describe una llamada cepa "O", inicialmente definida como una cepa de Candida sake, escogida en razón de su actividad protectora contra B.cinerea y Penicillium sp en manzanas "Golden Delicious" dañadas. Sin embargo, la actividad antagonista es fuertemente dependiente del tiempo de incubación anterior a la inoculación de patógenos y de la relación de concentraciones entre patógeno y antagonista, lo que sugiere que la colonización de las zonas dañadas en un prerrequisito de protección.
La solicitud de patente PCT WO-92/18009 describe también el empleo de levaduras como agentes de control biológico de enfermedades de postcosecha en frutos, citando concretamente aislados de las especies Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Candida parapsilopis y Candida guilliermondii. Por último, Wilson, C.L., en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796, publicada como documento NTIS (National Technical Information Service) número PB92-102334, describe el empleo como agentes de control biológico, contra las enfermedades postcosecha de frutos tales como manzanas, melocotones y naranjas, de tres cepas concretas de Candida sake, aisladas de la piel de tomates, depositadas, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest, en The Northern Regional Research Center U.S. Department of Agriculture, Peoria Illinois 61604, con los números de depósito NRRL Y-18844, NRRL Y-18845 y NRRL Y-18846.
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No obstante las grandes diferencias de actividad antifúngica que se pueden dar entre aislados o cepas diferentes de levaduras de la misma especie -y la falta de datos sobre la efectividad de los mismos en las diferentes condiciones de almacenamiento de los frutos recolectados, hacen que se plantee la necesidad de seguir investigando con el fin de encontrar agentes de control biológico, cada vez más eficaces y de acción más duradera, que sean capaces de ejercer su acción preventiva en condiciones extremas de almacenamiento.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar una nueva cepa de la levadura Candida sake capaz de actuar como antagonista altamente efectivo para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de la fruta de postcosecha y que mantiene su efectividad en condiciones de baja temperatura y en atmósfera empobrecida en oxígeno.
Otro objeto de la presente invención consiste en la utilización de dicho antagonista para prevenir la podredumbre de la fruta recolectada, durante su almacenamiento.
Todavía otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para la mejor conservación de la fruta recolectada en diferentes condiciones de almacenamiento.
Breve descripción de los dibujos
Se adjuntan a la presente descripción, para una mejor comprensión de la misma, pero sin efectos limitativos, siete hojas con dibujos de los que, a continuación, se expone una breve descripción.
La figura 1 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, en condiciones de baja temperatura.
La figura 2 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, a las temperaturas de 15ºC, 26ºC y 30ºC.
La figura 3 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, a las temperaturas de 34ºC y 37ºC.
La figura 4 es una representación gráfica del desarrollo de la población de la cepa CECT-10817 sobre manzana "Golden Delicious" a 25ºC de temperatura.
La figura 5 es una representación gráfica del desarrollo de la población de la cepa CECT-10817 sobre manzana "Golden Delicious" en condiciones de frigoconservación: en frío convencional (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%); en atmósfera controlada (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 3%),y en atmósfera controlada a ultrabajo oxígeno (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 1%).
La figura 6 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Botrytis cinerea, causados por la inoculación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de seis días de incubación a 20ºC.
La figura 7 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Penicillium expansum, causados por la inoculación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de siete días de incubación a 20º C.
La figura 8 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Rhizopus nigricans, causados por la inoculación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de seis días de incubación a 20ºC.
La figura 9 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Penicillium expansum, causados por la inoculación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de sesenta días de incubación en condiciones de frigoconservación: en frío convencional (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%) ; en atmósfera controlada (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 3%); en atmósfera controlada a ultrabajo oxígeno (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 1%).
La figura 10 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Botrytis cinerea, causados por la inoculación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de sesenta días de incubación en condiciones de frío convencional (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%).
La figura 11 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Penicillium expansum, causados por el baño de los frutos con el antagonista CECT-10817. Datos obtenidos después de sesenta días de ensayo a gran escala en condiciones de frío convencional (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%) .
La figura 12 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Penicillium expansum, causados por la pulverización con 7 x 10^{6} u.f.c./ml del antagonista CECT-10817 y por la aplicación del fungicida químico Imazalil a una concentración del 7,5%. Datos comparativos obtenidos después de ocho días de incubación a 20ºC de temperatura.
La figura 13 es una representación gráfica de la evolución de la población del antagonista CECT-10817 sobre manzana "Golden Delicious", aplicado en el campomediante pulverización, a lo largo del proceso de recolección, manipulación y conservación en condiciones de frío convencional (a 1ºC de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%).
Descripción de la invención
Los autores de la presente invención han logrado aislar una nueva cepa de la especie Candida sake (Saito and Ota) van Uden and Buckley que muestra una efectividad muy elevada como antagonista de las especies de hongos causantes de las enfermedades de las frutas de postcosecha, en una amplia gama de temperaturas y atmósferas de oxígeno, lo que permite su utilización industrial para el control biológico de dichas especies fúngicas y prevenir la podredumbre de la fruta en condiciones de almacenamiento.
La cepa objeto de la presente invención se ha aislado de la superficie de manzanas, mediante repetidos lavados con agua estéril, y se ha depositado un cultivo de la misma, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo, con domicilio en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) España, que le ha asignado el número de depósito CECT-10817.
El aislado de CECT-10817 fue identificado como Candida sake por el "Centraalbureau voor Schimmelcultures" de Holanda y, tras su aislamiento, se cultivó en el medio NYDA, consistente en extracto de levadura, dextrosa y agar, y en el medio NYDB, consistente en caldo de extracto de levadura y dextrosa. El aislado de CECT-10817 forma colonias de color blanco-cremoso, redondas, bien definidas, con borde liso y con una ligera elevación central, observándose pseudohifas en los cultivos.
La cepa CECT-10817 presenta las características bioquímicas que se detallan en las tablas I y II.
TABLA I Ensayos de oxidación
Gentibiosa +(F) Ac. D-Glucónico - N-Acetil-D-Glucosa -
mina
Melibiosa +(F) Dextrina - alfa-D-Glucosa -
L-Prolina + Inulina - D-Galactosa -
Furanosa + Celibiosa - D-Psicosa -
Salicina + Maltosa - L-Sorbosa -
Ac. Acético - Maltotriosa - D-Manitol -
Ac. Fumárico - Melezitosa - D-Sorbitol -
Ac. propiónico - Palatinosa - D-Arabitol -
Ac. succínico - D-Rafinosa - Xylitol -
Metil succinato - Stachyosa - Glycerol -
Ac. L-Aspártico - Sucrosa -
Ac. L-Glutámico - Trehalosa -
+(F) : coloración intensa + : coloración - : ausencia de coloración
TABLA II Ensayos de asimilación
Maltotriosa + Inulina - Salicina -
Sucrosa + Cellobiosa - Maltitol -
Trehalosa + Gentibiosa - D-Sorbitol -
Furanosa + Melezitosa - i-Eritritol -
Manitol + Melibrosa - Glycerol -
D-Arabitol + Palatinosa - L-Arabinosa -
Metil Succinato + Rafinosa - D-Arabinosa -
Ac. Málico + Stachyosa - D-Ribosa -
Maltosa + Turanosa - Metil succinato + -
D-Xylosa
Adonitol + N-acetil-D-Glucosa- - Ac.Quínico + D- -
mina Xylosa
Xylitol + D-glucosamina - Ac. D-glucurónico + -
D-xylosa
Xylosa + alfa-D-Glucosa - Dextrina + D-Xylosa -
Ac. Fumárico - D-Galactosa - alfa-D-Lactosa + -
D-Xylosa
Ac. Bromosuccínico - D-Psicosa - alfa-D-Melibiosa + -
D-Xylosa
Ac. L-Glutámico - L-Manosa - D-Galactosa + -
D-Xylosa
Ac. alfa- - L-Sorbosa - m-Inositol + D-Xylosa -
aminobutírico
Ac. alfa-Ketoglutárico - Alfa-metil-D- - 1,2-propanodiol +
Glucósido D-Xylosa
Ac. 2-Keto-D- - beta-metil-D- - Acetoina + D-Xylosa -
glucónico Glucósido
Ac. D-glucónico - Amygdalina -
Dextrina - Arbutina -
+: coloración - : ausencia de coloración
Además, la cepa CECT-10817 resulta resistente al antibiótico sulfato de estreptomicina, a una concentración de 0,5 g/ml.
El crecimiento in vitro del microorganismo de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, a pH 7, se produce, en condiciones aeróbicas, en un amplio margen de temperaturas de incubación, mostrando un crecimiento satisfactorio a las temperaturas comprendidas entre 1ºC y 34ºC. Como se observa en las figuras 1, 2 y 3, el máximo poblacional se alcanza a 1º C, siendo éste muy superior al producido en cualquiera de las otras temperaturas estudiadas.
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Tal como muestran los gráficos de las figuras 4 y 5, la inoculación del microorganismo en fruta muestra un gran crecimiento en condiciones aeróbicas, tanto a temperatura ambiente (25ºC) como a la temperatura de 1ºC, ya sea en atmósfera ambiente (21% de oxígeno) o en atmósfera controlada de 3% de oxígeno y de 1% de oxígeno (ultra bajo oxígeno), que son propias de las condiciones de almacenamiento en las centrales hortofrutícolas.
El aislado CECT-10817 se puede obtener, tanto a nivel de laboratorio como para su uso industrial, mediante su cultivo en un medio apropiado, por medio de técnicas convencionales suficientemente conocidas por el experto. Por ejemplo, se puede obtener mediante el cultivo de la cepa original en medio NYDB, a pH 7, en un recipiente provisto de agitación y aireación, a temperaturas comprendidas entre 1ºC y 34ºC, durante períodos de tiempo del orden de 20 a 50 horas. El máximo poblacional, para el medio NYDB, se alcanza a las 37 horas a 25ºC. Una vez finalizado el período de incubación, se procede a separar los microorganismos del medio de cultivo mediante técnicas convencionales de sedimentación, centrifugación o filtrado, y el cultivo se puede conservar, por ejemplo, mediante congelación con gel de sílice.
El antagonista CECT-10817 se puede aplicar a la superficie de los frutos mediante cualquier técnica convencional. Por ejemplo, se puede preparar una dispersión del cultivo en agua y proceder a la pulverización o ducha del fruto en el campo antes de la recolección, o bien efectuar el tratamiento durante el proceso de manipulación del fruto recolectado, antes de proceder al almacenamiento, en cuyo caso el tratamiento se puede realizar también por inmersión.
Tal como se observa en la figura 13, cuando el tratamiento de los frutos se efectúa mediante pulverización de los mismos en el árbol, el aislado de CECT-10817 mantiene su viabilidad e incluso aumenta su población en la superficie del fruto a lo largo del proceso de recolección y almacenamiento.
Las concentraciones efectivas del antagonista CECT10817 en la dispersión de aplicación para el tratamiento de las frutas pueden ser variables en función de factores tales como el tipo de fruto, la madurez del mismo, la concentración del hongo patógeno en el fruto, el tipo de herida o lesión que afecte al fruto, la temperatura y humedad de la conservación, etc. Habitualmente el rango de concentraciones efectivas oscila entre 10^{5} y 10^{7} u.f.c./ml (unidades formadoras de colonias por mililitro), pero dichos márgenes no deben ser considerados como limitativos del objeto de la presente invención.
El aislado de CECT-10817 es muy efectivo en el control biológico de un gran número de especies de hongos patógenos de las frutas que incluyen, pero no se limitan, a Botrytis cinerea, Penicillium expansum y Rhizopus nigricans. Su efectividad en la prevención de la podredumbre de la fruta no se limita al almacenamiento de la misma en condiciones de temperatura y concentración de oxígeno ambientales, sino que, debido a las características del microorganismo ya comentadas anteriormente, su empleo da también excelentes resultados en condiciones de almacenamiento de frigoconservación y atmósfera controlada, habitualmente utilizadas por las centrales hortofrutícolas industriales.
La efectividad del aislado CECT-10817 en el control de los hongos patógenos es comparable a la del fungicida Imazalil, producto químico derivado del imidazol(1-[2-(2,4-diclorofenil)-2-(2-propeniloxi)etil]-1H-imidazol), uno de los fungicidas más empleado en el mundo en postcosecha de frutos, lo que supone que el aislado CECT-10817 constituye una alternativa eficaz para dicho producto químico, con la ventaja de carecer de las características de toxicidad del mismo.
El aislado CECT-10817 puede ser empleado con efectividad para combatir la podredumbre de todo tipo de frutos en cualquiera de sus variedades, especialmente los frutos de pepita, tales como manzanas, peras y membrillos; los cítricos, tales como naranjas, limones y mandarinas; los de hueso, tales como melocotones, albaricoques y ciruelas; y otros frutos tales como, por ejemplo, las fresas.
Los autores de la presente invención no tienen conocimiento de que, hasta la presente invención, se hubiera descrito ningún agente de control biológico antagonista específico contra los hongos patógenos de la especie Rhizopus nigricans. Dicha especie resulta muy agresiva en términos patológicos, ya que posee enzimas pectinolíticos que le permiten degradar el tejido del fruto sin que la infección precise de heridas o lesiones para iniciarse. Por ello puede ser causa de podredumbre en frutos sanos en caso de contacto de los mismos con frutos afectados (efecto nido). Además, la podredumbre que causa dicha especie es de desarrollo rápido y se caracteriza porque los tejidos del fruto se vuelven muy acuosos y blandos por lo que, al desprenderse un gran volumen de líquido contaminado, la infección se extiende con facilidad al resto de cajas almacenadas. Por estos motivos, la presencia de Rhizopus nigricans en una cámara frigorífica industrial produce unos porcentajes de podredumbre muy elevados. Por otra parte, tampoco existe, que conozcan los autores de la presente invención, ningún fungicida químico específico contra Rhizopus nigricans.
Esta situación hace que, por ejemplo en España, país con una elevada producción hortofrutícola, los hongos de la especie Rhizopus nigricans se estén convirtiendo en unos de los patógenos más peligrosos, causantes de graves pérdidas en la postcosecha de frutas de pepita.
Es de resaltar, en consecuencia, que el antagonista CECT-10817, objeto de la presente invención, constituye el primer tratamiento eficaz descrito para combatir los efectos perniciosos producidos por los hongos de la mencionada especie Rhizopus nigricans.
Ejemplos
Los ejemplos que se exponen a continuación se deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.
Ejemplo 1 Obtención de una dispersión acuosa de CECT10817
Se sembró el antagonista CECT-10817 en un tubo de ensayo con medio NYDA y se incubó a 25ºC durante
24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un matraz Erlenmeyer con 50 ml de medio NYDB que se incubó en un agitador orbital a 150 rpm y a 25ºC durante 24 horas. A continuación se centrifugó el contenido del matraz a 6.000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en 50 ml de agua destilada estéril y, a partir. de dicha dispersión, se prepararon las concentraciones deseadas del antagonista mediante el cálculo de la transmitancia de la suspensión microbiana en un espectrofotómetro, como medida indirecta de la concentración del antagonista. La equivalencia entre la transmitancia y la concentración de microorganismos se efectuó mediante una cámara Thoma de recuento de microorganismos. Las concentraciones se expresan en u.f.c./ml (unidades formadoras de colonias por mililitro).
Ejemplo 2 Efectividad de CECT-10817 en frutos almacenados a temperatura ambiente
El ensayo se realizó en manzanas "Golden Delicious" sanas que fueron limpiadas con agua y dejadas secar y en las que se realizaron dos perforaciones por cada manzana de dimensiones 3x3x3 mm aproximadamente. Las dos incisiones se situaron en la misma cara de la manzana, localizadas una en la parte superior y otra en la inferior. La unidad de muestra estaba formada por tres manzanas y por cada tratamiento se realizaron tres repeticiones.
Las tres especies fúngicas.patógenas ensayadas fueron Botrytis cinerea, Penicillium expansum y Rhizopus nigricans y la titulación de las suspensiones de esporas de las mismas se realizó a partir de cultivos jóvenes de 5-7 días, sembrados en medio PDA (patata, dextrosa y agar), e incubados a 28ºC de temperatura, mediante el raspado de las colonias en agua destilada estéril con Tween 80. A continuación se procedió al recuento de esporas en cámara Thoma, fijándose la concentración deseada, expresada en u.f.c./ml.
Lotes de tres manzanas preparadas como se ha explicado anteriormente se inocularon con 25 \mul de la suspensión de antagonista CECT-10817, a las concentraciones de 2,62 x 10^{6} u.f.c./ml, 7,0 x 10^{6} u.f.c./ml 1,15 x 10^{7} u.f.c./ml. Una vez secas las frutas, se procedió a la inoculación de 20 \mul de las suspensiones tituladas de patógenos de las tres especies seleccionadas, a las concentraciones de 10^{3} u.f.c. /ml, 10^{4} u.f.c. /ml y 10^{5} u.f.c. /ml. Paralelamente se preparó la prueba control en donde únicamente se inocularon manzanas con la suspensión titulada de patógeno y agua destilada estéril.
Todas las frutas tratadas se colocaron en alvéolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su incubación a 20ºC, en atmósfera ambiente. Para las frutas inoculadas con Penicillium expansum el tiempo de incubación fue de siete días, para Botrytis cinerea de 6 días y para Rhizopus nigricans- de 5 días. El período de incubación se fijó en base al tiempo que se precisa para que las manzanas control presenten diámetros de podredumbre grandes. Tras dicho período de incubación se procedió a la lectura de los resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de todas las perforaciones realizadas.
Los datos de lectura del diámetro de podredumbre de las diferentes repeticiones se sometieron a un análisis estadístico consistente en efectuar un análisis de la varianza y, una vez comprobado que dicho análisis de varianza resultaba significativo (a<0,01 a a<0,05), se efectuó una separación de medias de acuerdo con la Prueba de Rango Múltiple de Duncan, cuyos resultados se expresan con las letras del alfabeto minúsculas (a, b, c, d, ...), de manera que tratamientos con la misma letra son estadísticamente iguales y tratamientos con letras diferentes son estadísticamente diferentes.
En la tabla III se exponen los resultados obtenidos en el caso del control biológico de Botrytis cinerea, en la tabla IV en el de Penicillium expansum, y en la V en el de Rhizopus nigricans.
La expresión gráfica de los resultados de dichas tablas se encuentran, respectivamente, en las figuras 6, 7 y 8.
TABLA III Control de CECT-10817 sobre B. cinerea
Concentrac. Dosis CECT-10817
u.f.c./ml Medida u.f.c./ml.
Botyris cinerea Control 0 2,62 . 10^{6} 7,0 . 10^{6} 1,15 . 10^{7}
10^{3} Diámet. medio 0,14 0,00 0,00 0,00
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 100% 100% 100%
podredumbre
10^{4} Diámet. medio 1,29 0,00 0,00 0,00
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 100% 100% 100%
podredumbre
10^{5} Diámet.medio 2,08 0,58 0,00 0,00
podredumbre (cm) a b c c
% Reducción
diámetro - 72,18% 100% 100%
podredumbre
TABLA IV Control de CECT-10817 sobre P. expansum
Concentrac. Dosis CECT-10817
u.f.c./ml Medida u.f.c./ml.
Penicillium expansum Control
0 2,62 . 10^{6} 7,0 . 10^{6} 1,15 . 10^{7}
10^{3} Diámet.medio 1,64 0,11 0,00 0,00
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 93,25% 100% 100%
podredumbre
10^{4} Diamet.medio 2,34 1,08 0,45 0,64
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 53,70% 80,76% 72,68%
podredumbre
10^{5} Diámet. medio 2,65 1,74 0,73 0,76
podredumbre (cm) a b c c
% Reducción
diámetro - 34,38% 72,53% 71,28%
podredumbre
TABLA V Control de CECT-10817 sobre R. nigricans
Concentrac. Dosis CECT-10817
u.f.c./ml Medida u.f.c./ml.
Rhizopus nigricans Control
0 2,62 . 10^{6} 7,0 . 10^{6} 1,15 . 10^{7}
10^{3} Diámet. medio 6,05 0,22 0,00 0,00
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 96,41% 100% 100%
podredumbre
10^{4} Diamet.medio 7,38 1,58 0,20 0,00
podredumbre (cm) a b b b
% Reducción
diámetro - 78,63% 97,29% 100%
podredumbre
10^{5} Diamet. medio 8,07 2,01 0,10 0,22
podredumbre (cm) a b c c
% Reducción
diámetro - 75,09% 98,76% 97,31%
podredumbre
Los datos recogidos en las mencionadas tablas III, IV y V, así como su representación gráfica en las figuras 6, 7 y 8, muestran la alta efectividad del antagonismo CECT-10817 en el control de las tres especies de hongos patógenos ensayados y, en consecuencia, en la prevención de la podredumbre de las frutas.
Si se efectúa una comparación de los resultados obtenidos con lo descrito en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796 (Wilson), anteriormente mencionada, resulta especialmente significativo el hecho de que la eficacia de la cepa de Candida sake CECT-10817 resulta ser claramente superior, en el caso del control de las especies Botrytis cinerea y Penicillium expansum , a la mostrada por las cepas de Candida sake NRRL Y-18844, NRRL Y-18845 y NRRL Y-18846 descritas en dicha solicitud de patente.
Ejemplo 3 Efectividad de CECT-10817 en frutos almacenados a bajas temperaturas y diferentes atmósferas de oxígeno
Siguiendo el método de trabajo explicado en el ejemplo 2, se efectuaron ensayos con veinte manzanas "Golden Delicious" por repetición y tres repeticiones por tratamiento.
Se inocularon 25 \mul de dispersión acuosa del antagonista CECT-10817, a las tres concentraciones empleadas en el ejemplo 2, y 20 \mul de inóculo de Penicillium expansum, a la concentración de 10^{4} u.f.c./ml. A continuación se separaron tres lotes de manzanas inoculadas, y se almacenaron durante sesenta días: un lote en condiciones de frío convencional (1ºC y oxígeno ambiente), otro lote en condiciones de atmósfera controlada (1ºC y 3-º6 de oxígeno) y el último lote en condiciones de ultrabajo oxígeno (1ºC y 1 1 de oxígeno).
Los resultados se leyeron y trataron estadísticamente de la misma manera que en el ejemplo 2 y se exponen en las tablas VI, VII y VIII. Su representación gráfica conjunta se expone en la figura 9.
\newpage
TABLA VI Almacenamiento a 1ºC y 21% O_{2}
Medida Dosis CECT-10817 u.f.c./ml
Control 0 2,62.10^{6} 7,0.10^{6} 1,15.10^{7}
Diámet. medio 3,92 2,01 1,45 1,11
podredumbre(cm) a b bc c
% Reducción
diámetro - 48,59% 62,96% 71,74%
podredumbre
TABLA VII Almacenamiento a 1ºC y 3% O_{2}
Medida Dosis CECT-10817 u.f.c/ml
Control 0 2,62.10^{6} 7,0.10^{6} 1,15.10^{7}
Diámetro medio 4,13 0,89 0,42 0,10
podredumbre(cm) a b c d
% Reducción
diámetro - 78,30% 89,79% 97,45%
podredumbre
TABLA VIII Almacenamiento a 1ºC y 1% O_{2}
Medida Dosis CECT-10817 u.f.c/ml
Control 0 2,62.10^{6} 7,0.10^{6} 1,15.10^{7}
Diámetro medio 2,87 1,30 0,84 0,62
podredumbre (cm) a b bc c
% Reducción 64,05% 70,05% 78,43%
diámetro -
podredumbre
Como se observa en las tablas anteriores y en la figura 9, los resultados obtenidos muestran un elevado grado de eficacia en el control de P. expansum en condiciones de frío convencional y dicha eficacia todavía se ve sensiblemente aumentada cuando los ensayos se efectúan en almacenamiento a baja temperatura y condiciones de atmósfera baja en oxígeno.
Ejemplo 4 Control de B. cinerea en condiciones de frío convencional
Se efectuó un ensayo, bajo las mismas condiciones del ejemplo 3, utilizando como inóculo de hongo patógeno 20 \mul de inóculo de Botrytis cinerea, a la concentración de 10^{4} u.f.c./ml. El ensayo se realizó en condiciones de almacenamiento de frío convencional (1ºC y oxígeno ambiente).
Los resultados obtenidos, después del tratamiento estadístico ya mencionado, se exponen en la tabla IX y su representación gráfica en la figura 10.
TABLA IX Control de B. cinerea a 1ºC y 21% O_{2}
Medida Dosis CECT-10817 u.f.c/ml
Control 0 7.10^{5} 7,0.10^{6}
Diámet. medio 1,30 0,39 0,14
podredumbre a b b
(cm)
% Reducción
diámetro - 77,7% 89,2%
podredumbre
Los resultados de reducción del diámetro de podredumbre fueron excelentes, sobre todo a una concentración de inhibidor CECT-10817 de 7 x 10^{6} u.f.c./ml.
Ejemplo 5 Control de Penicillium expansum en ensayo a gran escala
Para este ensayo la dispersión de antagonista se preparó, en una escala mayor, de la siguiente manera:
Se sembró el antagonista CECT-10817 en un tubo de ensayo con medio NYDA y se incubó a 25ºC durante 24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un fermentador, provisto de agitador y sistema de aireación, con 2.000 ml de medio NYDB y se incubó a 25ºC durante 37 horas. A continuación se centrifugó el contenido del fermentador a 6.000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en agua destilada estéril y, a partir de dicha dispersión, se prepararon las concentraciones deseadas del antagonista de la misma manera que en el ejemplo 1.
Se utilizó una caja de manzanas "Golden Delicious" (70 frutos) por repetición y cuatro repeticiones por tratamiento. Las manzanas recogidas en el campo fueron perforadas en su zona ecuatorial (4 heridas por manzana) con un bisturí y se trataron con el antagonista CECT10817, mediante la introducción de las cajas con los frutos en baños que contenían dispersiones de antagonista a concentraciones de 7 x 10^{5} y 7 x 10^{6} u.f.c./ml. Se utilizó también un lote control sin tratar. A continuación, una vez secas las manzanas, las cajas se introdujeron en un baño con una dispersión titulada de esporas de Penicillium expansum a la concentración de 10' u.f.c./ml.
Las cajas de manzanas se almacenaron durante sesenta días en condiciones de frío convencional (1ºC y oxígeno ambiente), al cabo de los cuales se procedió a la lectura de los resultados en las mismas condiciones y con el mismo tratamiento estadístico que en los ejemplos anteriores.
Los resultados se exponen en la tabla X y su representación gráfica en la figura 11.
TABLA X Control de P. expansum a gran escala
Medida Dosis CECT-10817 u.f.c/ml
Control 0 7,0.10^{5} 7,0.10^{6}
Diámetro medio 1,20 0,51 0,14
podredumbre a b c
(cm)
% Reducción - 57,5% 88,0%
diámetro
podredumbre 
\newpage
Como se observa en la tabla y figura mencionadas, el ensayo a gran escala permite confirmar los excelentes resultados de control de P. expansum obtenidos en los ensayos anteriores. Es de destacar que la reducción del diámetro de podredumbre es prácticamente del 90% cuando se utiliza una concentración de antagonista CECT-10817 de 7 x 10^{6} u.f.c./ml.
Ejemplo 6 Comparación con el fungicida Imazalil
El ensayo se efectuó con veinte manzanas "Golden delicious" por repetición y tres repeticiones por tratamiento y en cada fruto se efectuaron cinco perforaciones.
Tanto el antagonista CECT-10817 como el fungicida Imazalil se aplicaron mediante baño de los frutos en soluciones o dispersiones de los mismos. El antagonista se aplicó a una concentración de 7 x 10^{6} u.f.c./ml y el Imazalil a una concentración del 7,5% en peso.
A continuación las manzanas se inocularon con el patógeno de la especie Penicillium expansum a una concentración de 10' u.f.c./ml. En un lote de las manzanas tratadas con el antagonista la inoculación del patógeno se efectuó 24 horas después del tratamiento.
Los frutos se incubaron a 20ºC durante ocho días, al cabo de los cuales se procedió a la lectura de los resultados y a su tratamiento estadístico.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla XI y su representación gráfica en la figura 12.
TABLA XI Control de P. expansum, comparación con Imazalil
Medida Tratamiento
Control Imazalil CECT-10817 CECT-10817
(dosis=7,5%) (7,0. 10^{6} u.f.c/ml) +24 horas
(7,0.10^{8} u.f.c/ml)
Diamet.medio 2,489 0,046 1,046 0,041
podredumbre(cm) a c b c
% Reducción
diámetro - 98,15% 59,42% 98,30%
podredumbre
Se observa que, cuando la inoculación del patógeno se produce a las 24 horas del tratamiento, la efectividad del antagonista CECT-10817 y del imazalil son prácticamente iguales.
Información sobre el depósito de la cepa CECT-10817
El depósito del microorgasnismo se ha efectuado,de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con residencia en el Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia). El depósito se efectuó el 6 de julio de 1994 y el CECT le asignó el número de depósito CECT-10817.
El depósito está a disposición del público, bajo las condiciones previstas en el mencionado Tratado de Budapest, si bien dicha disponibilidad no se puede interpretar como una licencia para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los derechos del solicitante de la presente patente.

Claims (12)

1. El cultivo biológico substancialmente puro de la cepa de la especie Candida sake, depositado con el número CECT-10817.
2. La utilización del cultivo de la reivindicación 1 como antagonista para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de los frutos de postcosecha.
3. La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los hongos patógenos pertenecen a cualquiera de las especies Botrytis cinerea, Penicillium expansum y Rhizopus nigricans.
4. La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los conocidos como de pepita, especialmente, manzanas, peras y membrillos, en cualquiera de sus variedades.
5. La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son cítricos, especialmente naranjas, limones y mandarinas, en cualquiera de sus variedades.
6. La utilización, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son fresas o de los conocidos como de hueso, especialmente, melocotones, albaricoques y ciruelas, en cualquiera de sus variedades.
7. La utilización del cultivo de la reivindicación 1 como antagonista para el control biológico de los hongos patógenos de los frutos antes de la recolección.
8. Un método para prevenir la podredumbre de la fruta, caracterizado porque el producto es tratado, antes o después de la recolección, con una preparación del cultivo CECT-10817 de la reivindicación 1.
9. Un método tal y como se reivindica en la reivindicacion 8, caracterizado porque el tratamiento se lleva a cabo mediante pulverización, mojado o inmersión de los frutos en o con una dispersion acuosa del antagonista CECT-10817.
10. Un método, tal y como se reivindica en la reivindicación 8 y 9, caracterizado porque la concentración del antagonista CECT-10817 en la dispersión acuosa se halla situada entre 10^{5} y 10^{7} c.f.u./ml.
11. Un método, según se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque las condiciones de almacenamiento de los frutos son de temperatura y oxigeno ambientes.
12. Un método, tal y como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque las condiciones de los frutos son una temperatura inferior a 5ºC y una atmósfera con un contenido de oxígeno inferior al 5%.
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