WO2000056897A1 - Promoteur inductible comtii, gene chimere le comprenant et plantes transformees - Google Patents

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WO2000056897A1
WO2000056897A1 PCT/FR2000/000714 FR0000714W WO0056897A1 WO 2000056897 A1 WO2000056897 A1 WO 2000056897A1 FR 0000714 W FR0000714 W FR 0000714W WO 0056897 A1 WO0056897 A1 WO 0056897A1
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promoter
plants
sequence
plant
nucleic acid
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Bernard Fritig
Valérie TOQUIN
Pierrette Geoffroy
Michel Legrand
Serge Kauffmann
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Definitions

  • COMTII inducible promoter chimeric gene comprising it and transformed plants
  • the present invention relates to a new promoter regulatory sequence inducible in response to an injury, mechanical or chemical, or in response to aggression by a pathogenic agent, in particular bacterial, fungal or viral, or by an insect or a nematode.
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) comprising the promoter regulatory sequence according to the invention which controls the expression of a heterologous coding sequence, heterologous meaning here a coding sequence different from the native coding sequence.
  • the present invention also relates to a host organism comprising said chimeric gene, the transformed plants comprising it and the seeds (seeds) of said transformed plants.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • HMG HMG-CoA reductase
  • PI proteinase inhibitors
  • 5,670,349 is also known, as the promoter of apple beta-galactosidase (ABG1) or the promoter of apple amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) described in patent application WO 98/45445.
  • the present invention relates to a new nucleic acid fragment, in particular isolated, comprising an inducible plant promoter (or promoter regulatory sequence), said inducible promoter consisting of the promoter of a plant O-methyltransferase class II gene (hereinafter COMT II).
  • Class II O-methyltransferase genes including the class II caffeic acid-O- methyltransferase gene, from plants are silent (inactive) in the absence of any aggression since non-aggressed plants do not express it , or at least at levels undetectable by the usual methods of analysis.
  • the COMT II messenger is undetectable by the "Northern blot" technique in different tissues of a healthy untreated plant, such as tobacco (Pellegrini & al., 1993).
  • This COMTII and its promoter are activated (or induced) by injuries, viral infections, aggressions to UV rays, or to chemical aggressions by different products like benzothiazole (BTH), methyl jasmonate or elicitors of vegetable origin like pectin.
  • BTH benzothiazole
  • methyl jasmonate or elicitors of vegetable origin like pectin.
  • the isolated nucleic acid fragment according to the invention consists of a plant COMTII promoter.
  • COMTII of plant is meant according to the invention any OMT of plant which is not expressed in healthy untreated plants, but which is it following a mechanical, chemical attack by a pathogen, an insect or a nematode.
  • COMTII plant of origin is meant according to the invention any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, whether it is monocotyledon or dicotyledonous, such as for example rice, wheat, barley, sunflower, corn, tobacco, rapeseed, soybeans or Arabidopsis thaliana.
  • COMT II is a COMT of a dicotyledonous plant, preferably tobacco.
  • promoter is meant according to the invention the non-coding region of a gene involved in the binding with AR polymerase and other factors which are responsible for the initiation and modulation of transcription leading to the production of 'an RNA transcript. It is more particularly any sequence 5 ′ to the translation initiation site or “start” codon (ATG) of the COMTII coding sequence allowing the transcription and expression of said coding sequence.
  • the promoter according to the invention advantageously comprises a sequence of more than 600 nucleotides upstream of the ATG of COMT II, preferably of more than 700, of more than 800 or even more than 900 nucleotides upstream of ATG, more preferably more than 1000 nucleotides upstream of the ATG, even more preferably more than 1200 nucleotides upstream of the ATG. Promoters comprising more than 1500 nucleotides upstream of the COMTII ATG are also part of the present invention.
  • the promoter includes a transcription initiation site.
  • the transcription initiation site is generally located less than 100 nucleotides upstream of the ATG, advantageously approximately 90 nucleotides upstream.
  • the 3 ′ end of the COMTII promoter according to the invention is located between the transcription initiation site and the ATG.
  • the 3 ′ end of the COMTII promoter is located between 10 and 50 nucleotides downstream from the transcription initiation site, more preferably between 20 and 40 nucleotides downstream, even more preferably between 20 and 30 nucleotides downstream.
  • the COMTII promoter according to the invention also comprises at least one TATA box and at least one CAT box.
  • the TATA box is generally located less than 50 nucleotides upstream from the transcription initiation site, about 40 nucleotides upstream.
  • the CAT box is generally located less than 100 nucleotides upstream from the transcription initiation site, preferably about 100 nucleotides and / or 80 nucleotides upstream.
  • the promoter comprises two CAT boxes.
  • the promoter according to the invention also comprises regulatory elements involved in the expression of genes for the metabolism of phenylpropanoids and defense-associated genes, in particular at least one A box and / or at least one L box and / or at least an inverted L box and / or at least one P box and / or at least one inverted W box.
  • Box A includes the following sequence CCGTCC. It is generally located less than 410 nucleotides from the site of initiation of transcription.
  • Box L includes the following sequence CTTCAACAACCAACC. It is generally located less than 180 nucleotides from the site of initiation of transcription.
  • the first reverse L box includes the following sequence GTTAGGTGAAG. It is generally located less than 1000 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • the promoter according to the invention comprises two inverted L boxes, one at approximately 970 nucleotides upstream from the transcription initiation site and the other at approximately 440 nucleotides upstream.
  • the second inverted L box comprises the following sequence TGTTAGGTGTGTTT.
  • the P box includes the following sequence CACACCAACTCCCA. It is generally located less than 750 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • the reverse W box includes the following sequence GGTCAA. It is generally located less than 1200 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • the promoter according to the invention comprises two inverted W boxes, one at approximately 1110 nucleotides upstream and the other at approximately 210 nucleotides upstream.
  • the promoter according to the invention also comprises at least one E box and / or at least one G box and / or at least one GT box.
  • Box E includes the following sequence TTCCATC AAG. It is generally located less than 110 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • Box G includes the following sequence CCACGT. It is generally located less than 600 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • the GT box includes the following sequence GGTTAA. It is generally located less than 450 nucleotides upstream from the transcription initiation site.
  • the promoter according to the invention comprises two GT boxes, one at approximately 400 nucleotides upstream and the other at approximately 280 nucleotides upstream.
  • the promoter according to the invention consists of the tobacco COMTII promoter defined by the nucleotide sequence upstream of the ATG represented by the sequence identifier 1 (SEQ ID NO 1) .
  • the tobacco COMTII promoter comprises the sequence between nucleotides 557 and 1795 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to said sequences and their homologous sequences.
  • the COMTII tobacco promoter comprises the sequence between nucleotides 557 and 889 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to said sequences and their homologous sequences.
  • the COMTII inducible tobacco promoter is activated by wounds, viral infections, attacks by UV rays, or chemical attacks by various products such as benzothiazole (BTH), methyl jasmonate or eliciters of plant origin such as pectin. .
  • BTH benzothiazole
  • methyl jasmonate methyl jasmonate
  • eliciters of plant origin such as pectin.
  • the functional study of the promoter made it possible to identify the regions involved in the induction of the promoter under different conditions.
  • the fragment comprising the sequence between nucleotides 698 to 1365 is necessary and sufficient to confer sensitivity and induction by injury, by VMT, megaspermine, pectin and chitin.
  • the COMTII tobacco promoter therefore comprises the sequence between nucleotides 698 and 1365 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to said sequences and their homologous sequences.
  • This fragment can be associated with another promoter to induce the expression of a gene by injury, by VMT, megaspermine, pectin or chitin.
  • This fragment can thus be associated with the minimum promoter of the RNA 35S of CaMV.
  • the present invention therefore therefore also relates to a chimeric promoter comprising the sequence between nucleotides 698 and 1365 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to said sequences and their homologous sequences.
  • the tobacco COMTII promoter therefore comprises the sequence between nucleotides 815 and 1795 of SEQ ID NO 1, the sequences capable of hybridizing selectively to said sequences and their homologous sequences.
  • sequence capable of hybridizing selectively is meant according to the invention the sequences which hybridize with the above sequences at a level higher than the background noise significantly.
  • the background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other cDNAs present in a cDNA library.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of hybridizing selectively and the sequences defined by the above sequence ID according to the invention is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of l interaction of other DNA sequences generating background noise.
  • the level of interaction can be measured, for example, by labeling the probe with radioactive elements, such as 32P.
  • Selective hybridization is generally obtained by using very severe environmental conditions (for example 0.03 M NaCl and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C-60 ° C).
  • the hybridization can of course be carried out according to the usual methods of the prior art (in particular Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning: A Labratory Manual).
  • homologous sequence is meant according to the invention any sequence comprising more than 70% homology, preferably more than 80% homology, even more preferably more than 90% homology, and which retains the functional elements of COMTII giving it its properties as an inducible promoter.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • the isolation and cloning of a COMT II gene is done by analysis of a genomic library prepared from the DNA of the plant of interest.
  • the genomic DNA is cut by one or more appropriate restriction enzymes and introduced into a suitable vector to constitute, by methods known to those skilled in the art, a library containing all of the genomic DNA of the plant (Ausubel et al ., 1998; Sambrook et al., 1989).
  • the clone (s) containing a COMT II gene is (are) isolated with a nucleotide probe.
  • the probe sequence is. either deduced from the protein sequence if the enzyme has been purified (by monitoring its activity, for example), or prepared from a cDNA clone from a library.
  • This cDNA library is prepared from mRNA extracted from treated tissues so as to induce expression of the COMT II gene (by injury, infection or chemical treatment as described in the examples or Figures 1-5).
  • the cDNA library is then screened by antibodies directed against a COMT II protein (for example from tobacco) or by a nucleotide probe deduced from the COMT II protein of the plant in question or deduced from the sequences conserved in the COMTs of plants.
  • the cDNA thus isolated is characterized by its nucleotide sequence or by the enzymatic activity of the recombinant protein obtained after expression of the cDNA in a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the non-coding cDNA sequences (3 ′ and / or 5 ′) are used to select, by PCR, under very selective conditions, the genomic clone (s) containing the COMT II gene expressed during the processing used to construct the cDNA library.
  • the Promoter sequences are then isolated by PCR or any other suitable method well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) functional in plant cells and plants comprising, in the direction of transcription, a 5 'regulatory sequence, a coding sequence and a 3' regulatory sequence, the 5 ′ regulatory sequence comprising a COMT II promoter according to the invention defined above.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant according to the invention means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco, cotton, etc.
  • the COMTII promoter according to the invention can be used alone or associated with at least part of a promoter of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter expressing in particular in the leaves of plants, such as, for example, so-called promoters of bacterial, viral or plant origin or also so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit of plant or any known suitable promoter that can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • the promoters of a plant virus gene mention will be made of that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the circovirus promoter (AU 689 31 1).
  • the COMTII promoter according to the invention can also be used in combination with at least part of a promoter specific for particular regions or tissues plants, and more particularly promoters specific to seeds ([22] Datla, R. & al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), in particular promoters of napine (EP 255 378), phaseoline, glutenin, heliantinin (WO 92/17580), albumin (WO 98/45460) or oelosin (WO 98/45461). According to the invention, it is also possible to use, in association with the promoter
  • transcription activators such as for example the translational activator of the mosaic virus of the tobacco (VMT) described in application WO 87/07644, or the tobacco etch virus (VET) described by Carrington & Freed.
  • any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the nos terminator of Agrobacterium tumefaciens, or of plant origin, such as for example a histone terminator as described in EP 0 633 317.
  • the coding sequence of the chimeric gene according to the invention comprises a coding sequence for a reporter gene, such as the GUS coding sequence, or a coding sequence for a protein of interest.
  • the protein of interest is advantageously a protein which confers on plants resistance properties to diseases or insects.
  • chitinases glucanases, oxalate oxidase
  • all these proteins and their coding sequences being widely described in the literature, or even antibacterial peptides and / or antifungals, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly lytic peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising amino acids basic, in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, deposited on August 18, 1998) or drosomicine (PCT / FR98 / 01462, deposited on July 8, 1998).
  • the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al., 1993; Panab restaurants & al., 1995).
  • the fungal elicitor peptide is megaspermine. Megaspermine and its coding sequence is represented by sequence identifier No. 13 (SEQ ID 13).
  • the chimeric gene according to the invention comprising, in the direction of transcription, a 5 ′ regulatory sequence comprising a COMT II promoter and a coding sequence for megaspermine comprises the DNA sequence represented by the identifier of sequence n ° 14 (SEQ ID 14).
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) functional in plant cells and plants comprising, in the direction of transcription, a 5 'regulatory sequence, a coding sequence for an elicitor and a regulatory sequence in 3 ', the 5' regulatory sequence comprising an inducible promoter.
  • the elicitor is an elicitin, more preferably megaspermine as defined above.
  • the inducible promoter is advantageously chosen from the promoters of phenylalanine ammonia lyase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), chitinases, glucanases, proteinase inhibitors (PI), genes of the PR1 family, nopaline synthase (nos) or the vspB gene (US 5,670,349, Table 3), the HMG2 promoter (US 5,670,349), the apple beta-galactosidase (ABG1) promoter or the amino cyclopropane promoter apple carboxylate syntase (ACC synthase) (WO 98/45445).
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • HMG HMG-CoA reductase
  • PI proteinase inhibitors
  • genes of the PR1 family nopaline synthase (nos) or the vspB gene
  • the HMG2 promoter US 5,670,
  • the present invention also relates to a cloning and / or expression vector for the transformation of plant cells or plants containing at least one chimeric gene as defined above.
  • This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, at least one origin of replication.
  • This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention.
  • transformation vectors are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • it will in particular be a virus which can be used for the transformation of developed plants and containing in addition its own elements of replication and expression.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the chimeric gene according to the invention can be used in association with a selection marker gene, either in the same vector, the two genes being associated in a convergent, divergent or collinear manner, or alternatively in two vectors used simultaneously for the transformation of the host organism.
  • selection marker gene either in the same vector, the two genes being associated in a convergent, divergent or collinear manner, or alternatively in two vectors used simultaneously for the transformation of the host organism.
  • antibiotic resistance genes there may be mentioned antibiotic resistance genes, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells.
  • herbicide tolerance genes biashos, glyphosate or isoxazoles
  • genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS
  • genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • the subject of the invention is also a method of transforming plant cells by integrating into the genome of said plant cells at least one chimeric gene as defined above, transformation which can be obtained by any suitable known means, fully described in the specialized literature and in particular the references cited in the present application, more particularly by the vector according to the invention.
  • a series of methods involves bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods can be used such as micro injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular the plant cell or the plant.
  • the present invention also relates to plant cells or transformed plants containing a chimeric gene defined above.
  • the present invention also relates to plants containing transformed cells, in particular plants regenerated from transformed cells.
  • the regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the following patents and patent applications may be mentioned: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752 , US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253,175 EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • the present invention may be mentioned: US
  • the transformed plants which can be obtained according to the invention can be of the monocotyledon type such as for example cereals, sugar cane, rice and corn or dicotyledons such as for example tobacco, soybeans, rapeseed, cotton, sunflower, beet, clover, etc.
  • the plants transformed according to the invention may contain other genes of interest, conferring on plants new agronomic properties.
  • genes conferring new agronomic properties on transformed plants there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring tolerance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases.
  • Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • Mention may also be made of the genes modifying the constitution of the modified plants, in particular the content and quality of certain essential fatty acids (EP 666 918) or also the content and quality of proteins, in particular in the leaves and / or seeds. of said plants.
  • genes of interest can be combined with the chimeric gene according to the invention either by conventional crossing of two plants each containing one of the genes (the first the chimeric gene according to the invention and the second the gene coding for the protein d 'interest) or by transforming plant cells of a plant containing the gene coding for the protein of interest with the chimeric gene according to the invention.
  • Example 1 Isolation of the COMT class II gene Screening of a tobacco genomic library made it possible to isolate 6 different clones containing COMT class II genes (COMTII). The latter were first characterized by their restriction profiles which revealed a certain heterogeneity among the different clones.
  • COMTIIs form a multigene family composed of six to seven genes, only one of which is transcribed in defense reactions since only one type of cDNA has been characterized in a library made from leaves inoculated with the tobacco mosaic virus. (VMT) (Pellegrini & al. 1993).
  • VMT tobacco mosaic virus
  • PCR reactions were carried out using primers derived from the 3 'non-coding region of the cDNA. Under conditions of high selectivity, a single clone is then amplified. The amplification products were sequenced. The sequences obtained showed perfect homology with those of the 3 'non-coding regions of the cDNA.
  • the selected genomic clone was subcloned into a bacterial vector (pue 18) and represents a 14 kb insert of which 9 kb are located upstream of the ATTI of the COMTII gene.
  • the transcription initiation site was determined by the primer extension technique and is located 90 nucleotides from the translation initiation site.
  • the promoter was sequenced over a length of 1771 kilobases. Non-specific elements common to the eukaryotic genes involved in the initiation of transcription such as the TATA box and the CAT box were found in the promoter
  • COMTII (SEQ ID NO 1). Regulation sites have been identified by comparison of the promoter sequences of the COMTII gene with those of genes involved in defense mechanisms.
  • the COMTII promoter contains specific elements of the phenylpropanoid metabolism genes involved in the stress response, such as the three boxes P, A, L (initially identified in the gene
  • PAL parsley (SEQ ID NO 1). These three boxes are involved in the response to elicitors and the P and L boxes are also involved in the response to UV.
  • the COMTII promoter also has elements playing an important role in the induction of PR genes by elicitors such as the W box (SEQ ID NO 1).
  • General regulatory elements are found in the COMTII promoter such as the G, GT boxes and the activating element of the simian virus SV4O (SEQ ID NO 1).
  • Box G is an element present in a wide variety of plant promoters.
  • the G box associated with specific cis elements, is involved in the regulation of many genes responding to different physiological and environmental signals.
  • the promoter region responsible for the regulation of genes by methyl jasmonate, consists of a G box associated with sequences rich in nucleotides C.
  • a similar organization is found at the level of the promoter of genes specifically induced during the injury.
  • the L boxes, present in the COMTII promoter could be involved in this kind of interactions because they are motifs rich in nucleotides C.
  • GT boxes represented several times in promoters, seem to play a role in modulating the expression of certain plant genes, either as an activator or as a repressor.
  • the functional analysis of the COMTII promoter was carried out by transgenesis in stable expression.
  • the transgene was obtained by transcriptional fusion between the promoter and a reporter gene, the GUS gene ( ⁇ -glucuronidase).
  • GUS gene ⁇ -glucuronidase
  • the GUS activity was tested in these plants under different conditions of induction of defense reactions, by a fungal elicitor injected into the leaves (megaspermine), or after exposure to UV. The results obtained are reported in Tables 1 and 2 below.
  • the GUS activity is expressed in pmol MU / min. mg.
  • the control (T) consists of the infiltration of water into the leaves of the transformed plants.
  • Control plants transformed with an empty vector had an activity of about 10-30 pmol / min.mg.
  • the control (T) corresponds to the basal GUS activity in the untreated plants.
  • the size of the promoter must be greater than 600 bp, in this case 1239 bp to allow induction and high expression of the GUS gene.
  • the deletions of the promoter corresponding to the constructs (-420 to +24), of (-313 to +24) and of (-121 to +24) cause a complete loss of the expression of the GUS gene under all the conditions tested.
  • the activity of the GUS gene under the control of the 1239 bp promoter is 1000 times greater than that observed for the other constructions. Activation of the COMTII promoter by the wound and methyl jasmonate and by elicitors of various origins and types.
  • Transgenic plants with the COMTII (- 1215 to +24) / GUS construction have been treated with various chemicals, regulators of defense reactions, with salicylic acid (SA) and methyl-2-6-dichloroisonicotinic (INA) , by fungal elicitors such as glucans or chitin fragments and a plant-based elicitor such as pectin.
  • SA salicylic acid
  • INA methyl-2-6-dichloroisonicotinic
  • the GUS activity was measured in the sheets 16 h after infiltration of these compounds and the results reported in Table 3 below.
  • the GUS activity is expressed in pmole MU / min.mg.
  • the control (T) corresponds to the basal GUS activity in the untreated transformed plants.
  • GUS activity (of the order of 3) is obtained in plants infiltrated with pectic fragments compared to the control.
  • the induction of the 1239 bp promoter has been studied during injury or after treatment with methyl jasmonate (a molecule which plays a role in signaling defense responses during injury) and with benzothiadiazole (BTH) (chemical inducer of RAD).
  • BTH benzothiadiazole
  • the GUS activity is measured 16 hours after treatment. The results are reported in Table 4 below. Table 4 - Induction of GUS activity by different compounds and stress
  • the control (T) corresponds to the GUS activity of the untreated plants.
  • the promoter is activated by the various treatments.
  • Induction factors range from 2.5 (BTH) to 14.5 (methyl jasmonate).
  • Activation of the COMTII promoter during viral infection The inoculation of VMT in tobacco requires the production of micro-wounds on the leaves allowing the entry of the virus and its multiplication.
  • GUS activity and COMTII activity were measured in injured leaves and in leaves inoculated by the virus.
  • the results show that the GUS gene under the control of the COMTII promoter has an induction kinetics identical to that of the endogenous COMTII gene, followed by the measurement of the catalytic activity of the corresponding proteins.
  • the COMTII promoter is induced early by the injury and exhibits maximum activity at 4 p.m.
  • the same peak of activity is observed at 4 p.m. during the viral infection and is due to the leaf injury caused by the inoculation of the virus.
  • the GUS activity is strongly stimulated from the 3rd day and progresses until the 7th day.
  • the local and systemic induction of the promoter during viral infection was measured at 3 and 7 days after inoculation of VMT.
  • the GUS activities, expressed in pmol MU / min.mg, are reported in Table 5 and represent an average of the values obtained in 9 transformants.
  • the control T corresponds to the GUS activity of the untreated plants.
  • the histochemical test carried out on leaves from 35S / GUS transgenic plants is the positive control of the experiment. Cross sections of injured leaves also show that all cell types are induced by the injury.
  • the functional analysis of these different constructions was carried out on transgenic tobacco in stable expression.
  • the studies were first carried out on a population of around 20 vitroplants, allowing the selection of 3 to 7 lines per construction which analyzed at the age of 20 to 45 days after transfer to the greenhouse.
  • Table 7 Induction by injury, methyl jasmonate, UV and VMT of GUS activity in tobacco vitroplants transformed by the various COMTII / GUS constructs.
  • vitroplant leaves (4 to 6 weeks old after transplanting) were injured with forceps and the GUS histochemical activity was revealed 16 hours after injury.
  • the fragment (- 1073 to - 406) allows the induction of the reporter gene by the different treatments mentioned above, the proximal part of the promoter between -406 and +24 is therefore not essential for the promoter activity.
  • the fragment -1071 to - 406 bp therefore appears to be necessary and sufficient to confer sensitivity to the inducers studied.
  • elicitin genes such as those of parasiticin and cryptogein have shown that these genes code for a preprotein (Kamoun et al., 1993; Panab restaurants et al., 1995).
  • the coding sequence of these elicitins comprises a signal peptide of 20 amino acids, allowing their excretion in the extracellular medium followed by a sequence of 98 amino acids corresponding to the mature protein.
  • Amplification reactions were carried out on reverse transcripts of Phytophthora megasperma using a sense primer derived from the nucleotide sequence of cryptogeine and oligodT as antisense primer. An amplified fragment of approximately 450 nucleotides was obtained. This fragment was cloned into a bacterial vector in order to be sequenced.
  • the nucleotide sequence corresponding to the signal peptide also has 100% identity with that of cryptogeine.
  • the native cDNA of ⁇ megaspermine was fused on the one hand to the COMT II promoter and on the other hand to the 35S promoter.
  • the COMT II promoter of 1239 bp was used because it has all the regulatory elements necessary for its induction.
  • transgenic tobacco Nicotiana tabacum Samsun NN tobacco plants were transformed with the two constructs via Agrobacterium tumefaciens. Six primary transformants for each construction were regenerated and self-fertilized. Plants from the second generation have a normal phenotype except certain individuals with the ⁇ -megaspermine gene under the control of the 35S promoter. These plants have a growth delay and also have a poorly developed root system. However, no tissue necrosis reminiscent of that developed by leaf infiltration and which can be linked to the expression of elicitin is observed in transgenic plants.
  • ⁇ megaspermine was analyzed in the leaves of transgenic plants having the cDNA of elicitin under the control of the 35S promoter by Western-Blot (FIG. 2A) and by Northern-Blot (FIG. 2B). Surprisingly, ⁇ megaspermine is undetectable in all of the transformants analyzed ( Figure 2A). The transcription level of elicitin was therefore examined in these plants by Northern-Blot ( Figure 2B). Transcripts could be detected and the level of expression varies from one transformant to another. It appears that in 2 types of plants (E and F) the size of the transcripts is smaller than the size of the complete messenger. In this case, the absence of protein could be explained by the fact that the cDNA is truncated.
  • the size of the transcripts corresponds to that of the elicitin expressed by the fungus and the rate of transcripts is not negligible, except for plant B showing a very small proportion of transcripts. Plants A which have the highest transcript levels also show growth retardation. Subsequently, only the transformants having the complete transcripts of ⁇ megaspermine were tested for their resistance.
  • the expression of ⁇ -megaspermine under the control of the COMT II promoter was analyzed by Western-Blot in the leaves of transgenic tobacco (FIG. 3).
  • the expression was studied in healthy untreated plants to determine the basic level of expression of elicitin and after injury to analyze the level of induction obtained.
  • untreated tissue the level of ⁇ megaspermine is undetectable.
  • elicitin is detected in very small quantity in injured tissues. This is due to activation of the COMT II promoter by the injury.
  • the accumulation of COMT II was also examined in the same transgenic plants using anti-COMT II antibodies.
  • COMT II is detected at a non-negligible level in untreated tissue, whereas normally only a very weak COMT II activity is detected in healthy plants not transformed or transformed with the chimeric COMT II :: GUS gene (Collendavelloo et al, 1981; Pellegrini et al., 1993). COMT II is also produced in larger amounts in injured tissue compared to similarly injured control plants.
  • the COMT II promoter allows an induced expression of elicitin in transgenic tobacco. This was verified for the 6 transformants. However, the amount of elicitin detected in plants after induction is very low. The presence of COMT II in untreated plants suggests that a very small amount of elicitin (not detected by the method used) is produced in the healthy plant and that this synthesis is sufficient to induce the endogenous COMT II gene. In addition, it would appear that an induced expression of elicitin during the injury also allows greater induction of the endogenous COMT II gene.
  • VMT Tobacco Mosaic Virus
  • Processed tobacco has the N resistance gene and therefore reacts with HR during inoculation with VMT.
  • resistance to the virus is quantified by measuring the size of the lesions 7 days after infection, when they have reached their almost final size. The greater the resistance developed by the plant, the smaller the size of the lesions, thus illustrating a greater confinement of the pathogen at the site of infection.
  • the promoter of the COMT II gene being strongly induced around lesions during HR at VMT, it should allow a strong expression of ⁇ megaspermine at the site of infection.
  • transgenic plants a, b, c, d, e and f expressing elicitin under the control of the COMT II promoter and the transformants A, B, C, D having the cDNA of ⁇ -megaspermine under the control of the 35S promoter were inoculated by VMT.
  • the control plants are transgenic plants for the chimeric gene "COMT II promoter :: GUS”.
  • FIG. 4 represents the distribution of the size of the lesions measured on the control plants and for a line expressing elicitin under the control of the promoter 35S (plants A) and a line expressing elicitin under the control of the promoter COMT II (plants b). This distribution follows a Gaussian curve which allows the statistical analysis of the results.
  • the control plants have a size of lesions, the average of which is 3.3 + 0.5 mm.
  • the average lesion size obtained for plants A was not significantly different from that of the controls (3.1 ⁇ 0.6 mm), on the other hand, that obtained for plants b was significantly smaller than the controls (1.4 ⁇ 0.6 mm).
  • the results obtained for each independent line are grouped in FIG. 5 and show that all of the transformants (plants A, B, C and D) having the cDNA for ⁇ -megaspermine under the control of the 35S promoter exhibit a size of lesions which does not differ not that of the witnesses.
  • all the plants expressing elicitin under the control of the COMT II promoter have a size mean lesions significantly lower than that of control plants. This reduction is more or less significant depending on the transformants.
  • the plants expressing ⁇ -megaspermine under the control of the COMT II promoter chosen for this test correspond to line b which has a high level of resistance to VMT.
  • Plants A possessing the cDNA of ⁇ -megaspermine under the control of the 35S promoter were also inoculated as were control plants COMT II :: GUS.
  • For each transgenic line 5 plants were inoculated.
  • Transgenic plants A show a mosaic similar to the control plants. On the other hand, a reduction in these symptoms is observed in the transgenic plants b.
  • the viral load was examined in the systemic leaves of the same level (3 rd leaf above the inoculated leaf). This analysis was carried out by Western-Blot using antibodies directed against the protein shell of the virus (FIG. 6). The amount of virus present in the different transgenic plants is evaluated relative to the amount of virus present in the control plants. The results obtained show that the plants expressing ⁇ megaspermine under the control of the promoter 35S have 10 to 15 times less virus than the control plants. This reduction in the amount of virus may seem significant. Be aware, however, that the amounts of virus produced in wild plants can vary by the same amount. In contrast, the transgenic plants expressing megaspermine under the control of the COMT II promoter contain 1,000 to 10,000 times less virus than the control plants. This represents a considerable and very significant reduction in viral load.
  • Antifungal resistance We examined whether elicitin production in planta induced resistance to a soil fungus, Phytophthora parasitica vav.nicotianae. This fungus infects tobacco plants through the roots invading the root and then the vascular system, thus causing sclerosis of the conducting vessels. Symptoms of infection result in black rot at the neck. This mode of infection is difficult to implement because it requires an adequate concentration of zoospores and meets strict conditions of temperature and humidity. An "artificial" mode of inoculation consists in applying, after decapitation of tobacco, the mycelium of the fungus at the level of the severed stem. After 7 days the stems are removed and the symptoms of infection are examined inside the stems.
  • the inoculation was carried out on 7 COMT II :: GUS control plants.
  • 7 COMT II GUS control plants.
  • Plants A, B, C and D having the "35S-megaspermine promoter" construct were tested.
  • the lines a and b having a high increased resistance to VMT were chosen as well as the line e having a lower level of resistance.
  • the progression of symptoms measured in the stems of control plants reached an average length of 5.3 cm. A slowing down of the symptoms of infection is observed in the stems of transgenic plants expressing ⁇ -megaspermine under the 35S promoter control.
  • the progression of the fungus is also greatly slowed down in the stems of transgenic plants expressing ⁇ megaspermine under the control of the COMT II promoter.
  • the stems of the COMT II were induced during infection with P. parasitica.
  • the stems of the COMT II : meg transformants a, b and e are infected over a length of 0.7 cm, 1 cm and 3.5 cm respectively.
  • Plants a and b are the most resistant to infection by P. nicotianae and also correspond to the plants with the highest resistance to VMT.
  • the resistance levels induced in these plants are related to the expression rate of elicitin.
  • An analysis of the levels of transcripts by Northern-Blot could perhaps confirm this hypothesis, knowing the difficulty of detecting the protein by Western-Blot.
  • a tobacco genomic DNA library (Nicotiana tabacum var. Xanthi) constructed in ⁇ - ⁇ MBL3 (Clontech) was screened with a radioactive COMT II cDNA probe (Pellegrini & al., 1993).
  • Six positive genomic clones were isolated after four rounds of purification. These purified clones were tested by PCR to identify the one which comprises the COMT gene expressed during the hypersensitivity (HR) response of tobacco leaves to VMT.
  • the 5 ′ and 3 ′ primers for the PCR analysis are represented by the oligonucleotides 1 and 2 below (S ⁇ Q ID NO 4 and S ⁇ Q ID NO 5 respectively):
  • Olig ⁇ l 5 'CGTTTCGCAA TGTGATTTGA TC 3'
  • Oligo2 5 'CTCAAAATGA CATCCTTTCA TAC 3'
  • the clone COMT II genome was purified on Quiagen tip according to the protocol described by the manufacturer and subcloned into the SalI restriction site of the pue 18 plasmid vector. DNA sequencing.
  • DNA sequencing was carried out on denatured double-stranded DNA according to the method of Sallger & al. (1977) using the “rhodamin dye terminator cycle ready” kit with ampliPaq FS DNA polymerase (Perkin-Elmer, P / N402078) and an Applied Biosystems 373 sequencer (Perkin-Elmer). The sequence was determined on both strands with overlaps using primers synthesized from already determined sequences. Analysis of primer extension products.
  • the primer extension reaction was carried out on total RNA according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology (Trienzenberg, 1992).
  • RNA isolated from tobacco leaves infected with VMT and from uninfected tobacco leaves was hybridized to the following oligonucleotide (SEQ ID NO 6), complementary to COMT II mRNA and labeled with 1 'end 5':
  • Oligo3 5 'CTGAAGATGT CAATAGTTGC ATGGC 3'
  • the extension product was separated on a 6% polyacrylamide gel.
  • the location of the transcription initiation site was determined on the basis of the comigration of the extension products with the sequence scale of the obtained from the corresponding region of the gene (Sallger & al., 1977). Construction of plasmids.
  • the truncated versions of the COMTII promoter were amplified by PCR using the primers PAS1 in 3 'and PSI, PS2, PS3 and PS4 in 5' represented below (SEQ ID NO 7 to 11 respectively), leading respectively to amplification nucleotide fragments of the following lengths: -1215 / + 24, (new constructs greater than 600 bp) -420 / + 24, -313 / + 24 and -121 / + 24 (numbering relating to the site of initiation of transcription) .
  • PAS1 5 GGTCTAGAGG GCCTTTTAGA GTGTTTTTGT TAG 3'
  • PS4 5 'TTTAAGCTTA AAGAGAACCA GACAATATT 3' The built -1728 / + 24, -1471 / + 24, -956 / + 24, -937 / + 24, -882 / + 24, -746 / + 24, - 676 / + 24, -560 / + 24, -435 / + 24, were obtained with the primers PAS2 in 3 'and respectively the primers PS5, PS6, PS7, PS8, PS9, PS10, PSI 1, PS12 and PS13 in 5' presented below (SEQ ID NO 15 to 24 respectively): PAS2: 5 'CGCGGATCCC CTTTTAGAGT GTTTTTGTTA GGC 3'
  • PS5 5 'ACGCGTCGAC GTTAGGGACA ATCTATAGTG TCAC 3'
  • PS ⁇ 5 'ACGCGTCGAC GCTCCGAGGA TTTGGCTGTC GCGG 3'
  • PS7 5 'ACGCGTCGAC GCTGGTTAGG TGAAGTAAAG CATG 3'
  • PS 8 5 'ACGCGTCAGATAG CGC 3 '
  • PS 10 5 'ACGCGTCGAC GACTTTAACA CACCAACTCC C 3' PS11: 5 'ACGCGTCGAC CGGATCTAGA ATTTGGGTTC ATTC 3' PS 12: 5 'ACGCGTCGAC GTGTATACTC CACGTCTCCG GATAC 3' PS 13: 5 'ACGCGTCGTTTGTGT3GTGT3 which was placed upstream of the minimum 35S promoter was obtained by using the 3 'primer PAS3 and the 5' primer PS14 (SEQ ID NO 25 and 26):
  • PAS3 5 'CGCGGATCCG CTTAACACCA AACACACCTA ACATTG 3'
  • PS 14 5 'ACGCGTCGAC CAGTGGTGAG TTTAGCTGTC 3'
  • the amplification was carried out for 30 cycles with an initial step of 4 min at 95 ° C and a final step of 5 min at 72 ° C, using the genomic clone as template. Each cycle consists of 1 min at 95 ° C followed by 1 min of hybridization and then
  • the hybridization step is carried out at 54 ° C, 59 ° C, 55 ° C, and 50 ° C to amplify, respectively, the fragments -1215 / + 24, - 420 / + 24, -313 / + 24 and -121 / + 24.
  • the hybridization temperature is
  • the promoter fragment -1215 / + 24 is digested with Sali and Xbal, the corresponding sites being present in the primers PSI and PSA1 respectively.
  • the promoter fragments of 420, 313 and 121 base pairs are digested with HindIII and Xbal (the site for HindIII is present in the primers PS2, PS3 and PS4, and the site Xbal in the primer PAS1). / + 24, -1471 / + 24, -956 / + 24, -937 / + 24, -
  • the construct consisting of the CaMV 35S promoter upstream of the megaspermine gene was obtained by replacing the Gus gene with the megaspermine gene (SEQ ID NO 12) in the plasmid pBil 21 (Clontech).
  • RNA 10 mg is used as a matrix for the synthesis of the first strand.
  • the total RNAs are heated for 3 min at 65 ° C, cooled on ice, and incubated for 2 h at 42 ° C in 50 ml of reverse transcription buffer (50 mM Tris-HCL pH 8.3 - 15 mM MgCl2 - 75 mM KCL - 1 mM DTT) containing 1 mM of each dNTP, 40 pmol of antisense primer corresponding to oligodT, and 20 U of reverse transcriptase of AMV (avian myeloblastosis virus). The mixture is heated to 94 ° C to stop the reaction.
  • reverse transcription buffer 50 mM Tris-HCL pH 8.3 - 15 mM MgCl2 - 75 mM KCL - 1 mM DTT
  • AMV avian myeloblastosis virus
  • the pellet After precipitation of the reaction mixture with ethanol, the pellet is dissolved in sterile distilled water. The synthesis of the second strand is initiated by Taq DNA polymerase. 1/20 of the reverse transcript is used for PCR amplification in 50 ml of buffer (10 mM Tris-HCL pH 8.3 - 50 mM KCL - 1.5 mM MgCl2 - 0.01% BSA), 200 mM dNTP, 0.1 mM sense and antisense primers and 1 unit of Taq.
  • the primer sense (5 '
  • the antisense primer corresponds to the oligodT having the restriction sites
  • reaction mixture is heated for 3 min at 94 ° C, then is subjected to 30 reaction cycles each comprising 3 steps: 1 min at 94 ° C, 1 min at 49 ° C and 1 min at 72 ° C. After the last cycle, the elongation is continued for 10 min at 72 ° C.
  • the amplification product obtained is then cloned into the vector pGEM (Promega) in order to be sequenced.
  • the different COMTII-GUS promoter constructs obtained previously in the plasmid pBHO1 are introduced into a strain of Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM6000) (Rossi & al., 1993) by electroporation (Nagel & al., 1990).
  • Tobacco plants (Nicotiana tabacum cv Samsun NN) are transformed by infiltration of Agrobacterium on 10-day plants (Rossi & al., 1993).
  • the plants are regenerated on a Murashige & Skoog (MS) medium (GIBCO BRL) supplemented with sucrose (30 g / 1 for stem formation and 15 g / 1 for root formation), 6-benzylaminopurine (Serva) (2 mg / ml), and naphthalene acetic acid (Serva) (0 , 05 mg / ml).
  • MS Murashige & Skoog
  • Serva 6-benzylaminopurine
  • Serva naphthalene acetic acid
  • Kanamycin 150 mg / ml
  • Control plants were prepared by transformation with the empty vector pBHO1 or the vector p min GUS (containing the reporter gene GUS under control of the minimum promoter of the RNA 35 S of CaMV). Seven to 20 independent transformants are regenerated for each construct. The primary transformants are self-fertilized and the FI seeds are germinated on an MS medium comprising 300 mg / l of kanamycin
  • the histochemical localization of GUS in transgenic plants is carried out according to the method described by Jefferson & al. (1987).
  • the histochemical reaction is incubated in the dark at 37 ° C for 12 hours.
  • the tissues are rinsed, first with a 50 mM phosphate buffer to terminate the reaction, then several times with 70% to 90% ethanol to remove the pigmentation from the tissues.
  • the tissues are rinsed in 70% ethanol> and are included in a fixing historesin (Jung) for cross sections of leaves.
  • the blocks of historesins are cut with a microtome and photographs are taken at a magnification of 10 to 40 times by a binocular microscope.
  • the COMTII and GUS activities were assayed on 100 mg of tissue.
  • the tissue is homogenized in a 100 mM sodium phosphate buffer at pH 7.5 and 10 mM DTT after addition of polyclar AT (Serva) and quartz.
  • the crude extracts are clarified by centrifugation and by filtration on glass wool.
  • GUS and COMTII activities are measured on the same raw extracts.
  • an aliquot of the protein extract is added to 1 ml of phosphate buffer comprising 100 ⁇ M of catechol, 50 ⁇ M of tritiated S-adenosyl-L-methionine (1.5 ⁇ 10 5 cpm / ml) and incubated for 3 hours at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by adding 100 ⁇ l of 9M sulfuric acid.
  • the radioactive product of the reaction ferulic acid
  • an NA scintillation solution Beckman
  • the fluorimetric measurement of the GUS activity is carried out on the same samples according to the procedure of Jefferson & al. (1987). Protein content is determined by the method of Bradford (1976) using the Biorad reagents.
  • the vector pGEM Promega not having the cloning sites compatible with those of pBHO1, a step of subcloning in the vector Bluescript (pSK) was necessary.
  • the vector pBil01 CO T // - G £ / S previously constructed and corresponding to the promoter -1215 / + 24 fused to the reporter gene GUS was used to obtain the chimeric gene comt II-meg.
  • the GUS gene is excised by digestion of the binary plasmid with BamHI and Sstl. A SnabI site present in the GUS gene makes it possible to cut the latter and prevents it from religating with the binary plasmid since no step of purification of the vector is carried out. Restriction enzymes are inactivated by heat.
  • the digested DNA is extracted with a phenol: chloroform (1: 1) mixture, then chloroform: isoamilic alcohol (24: 1) and precipitated with ethanol.
  • the digested DNA is resuspended in sterile water and ligated with the insert.
  • the vector pBil21 (Clontech) carrying the 35S-GUS gene was used to obtain the 35S-meg chimeric gene. Cloning is carried out according to the method described above.
  • Transgenic tobacco plants are cultivated in vitro under a 12h (24 ° C) / 12 (20 ° C) light cycle for 5 weeks after germination. They are propagated on an MS medium with the addition of kanamycin
  • the tissues are finely ground in liquid nitrogen, then in 1 to 2 volumes of extraction buffer (0.2 M sodium borate pH 9 - 30 mM EGTA - SDS 1% - 5 mM DTT).
  • extraction buffer 0.2 M sodium borate pH 9 - 30 mM EGTA - SDS 1% - 5 mM DTT.
  • the mixture is poured into a tube containing 1 volume of phenol / chloroform (1: 1), vortexed, then centrifuged for 10 min at 5000 g.
  • a second Phenol / chloroform extraction (1: 1) is performed, followed by a third with chloroform / isoamyl alcohol (24: 1).
  • the RNAs present in the supernatant are specifically precipitated by adding 1 volume of a solution of LiCl (4 M) EDTA (10 mM) overnight at 0 ° C.
  • RNAs are assayed by measuring the absorbance of a solution diluted to 260 (1 unit DO260 ⁇ 40 ⁇ g / ml of RNA), and their integrity is checked by migration on a non-denaturing agarose gel stained with BET. Electrophoresis
  • RNAs are separated on a denaturing agarose gel prepared in a MOPS xl buffer containing 16% formaldehyde. 1.2% agarose (w / v) gels were used.
  • the RNA samples are denatured for 15 min at 65 ° C. in the presence of 3 volumes of denaturation solution (MOPS ⁇ 5 lO ⁇ l, formamide 50 ⁇ l, formaldehyde 16 ⁇ l) per volume of RNA, and quickly cooled in ice.
  • Load buffer is added (MOPSxl, glycerol 50%, bromophenol blue 0.05%>) at a rate of 1/10 of the volume.
  • MOPSxl glycerol 50%, bromophenol blue 0.05%>
  • the gel can be stained with BET (0.5 ⁇ g / ml) for 1 to 2 min, then washed thoroughly with sterile water. The RNAs are then visualized under UV light.
  • RNA size marker (Promega) deposited on the edge of the gel.
  • the gel is rinsed with sterile water in order to remove the excess formaldehyde.
  • the migration band corresponding to the size marker is cut, colored with BET and photographed.
  • the RNAs are transferred by capillary action for 5 h on a positively charged nylon membrane (Hybond N + , Amersham) with SSC x20 buffer. After transfer, the membrane is rinsed in SSC x2 buffer and the RNAs are fixed so covalent on the nylon membrane by exposure to ultraviolet light (1200 J, UV Stratalinker 2400, Stratagene). The membrane is hybridized to a radioactive probe and treated as described in Sambrook et al.
  • Extraction can be done immediately after harvest or on frozen samples.
  • 150 g of leaf tissue are ground in a mortar in 0.5 M sodium acetate buffer pH 5.2 containing 2- ⁇ -mercaptoethanol (15 mM) and activated carbon. The volume of buffer is adjusted so as to obtain a fine and homogeneous ground material. This is then filtered on gauze and then centrifuged for 30 min at 15,000 g. The supernatant constituting the crude extract is then analyzed. Protein determination
  • the protein concentration of the crude extracts is determined by the method of Bradford (1976) in microtitration plates: to 10 ⁇ l of an extract to be tested are added 200 ⁇ l of Bradford reagent xl (Biorad). 2 ⁇ l of raw leaf extract are supplemented to 10 ⁇ l with buffer. Each sample is tested three times. After 5 to 10 min, the plate is read with a spectrophotometer MR 700 (Dynatech) with filter 5 (660 nm). The blank consists of 10 ⁇ l of buffer and the values are compared to a standard range produced with bovine serum albumin (SAB, Sigma).
  • SAB bovine serum albumin
  • the gel analysis makes it possible to determine the molecular mass of the proteins by comparing their relative mobility with those of proteins of known molecular mass.
  • 20% (v / v) loading buffer 60 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% (v / v) 2- ⁇ -mercaptoethanol, 10% (v / v) glycerol, 0.01 % (v / v) bromophenol blue,
  • the samples are heated at 100 ° C for 1 min before being deposited.
  • the gels (0.75 mm x 7 cm x 9 cm) are poured between a glass plate and an alumina plate.
  • the electrophoresis buffer is composed of 192 mM glycine, 25 mM Tris and
  • Protein transfer and immunodetection on nitrocellulose After electrophoretic migration on acrylamide gel, the proteins can be transferred, in a liquid medium in the transfer buffer (0.16 M Tris - 1.20 M glycine), onto a nitrocellulose or nylon PVDF type membrane (Immobilon, Millipore) . Before the transfer, the gel is balanced in the transfer buffer. The PVDF membrane is activated for 1 min in methanol and then equilibrated in the transfer buffer. The electrotransfer takes place for 90 min at 150 mA.
  • Immunodetection was carried out using specific antibodies directed against megaspermine or the VML shell protein. The revelation is carried out by chemiluminescence with the ECL kit (Amersham).
  • Plant treatment Before treatment, the plants are conditioned for a few days in an air-conditioned cubicle at 22 ° C ⁇ 1 ° C, under a brightness of 5000 lux and a photoperiod D / N of 16h / 8h. These conditions are maintained during infection, with the exception of infection with Erwinia carotovora.
  • VMT Tobacco Mosaic Virus
  • the leaves of tobacco plants, 6 weeks old, are rubbed using a glass spatula soaked in a buffer solution containing viral RNA (1 to 5 ⁇ g / ml) and an abrasive, celite (10 mg / ml).
  • the inoculum per leaf (for a plant) corresponds to
  • the mycelium of P. p. nicotianae is cultivated on a Petri dish containing a solid medium (oat medium: 100 g of crushed oat seeds are suspended in 1 l of distilled water. The medium is filtered through gauze. The medium is autoclaved after addition of 15 g of agar).
  • the inoculation was carried out after decapitation of the tobacco plants.
  • the stem of 10-week-old tobacco plants is cut under the apical bud.
  • a pellet of mycelium from P. p. nicotianae is taken at the periphery of a 7-day culture on oat medium and is deposited on the section of the stem.
  • the rod brought into contact with the mycelium pellet is encapsulated in aluminum foil to avoid too rapid drying of the tissues at the inoculation site.
  • the Erwinia carotovora strain is cultured overnight at 28 ° C in LB medium. After centrifugation, the bacterial pellet is taken up in a solution of
  • Treatment by an elicitor Solutions are infiltrated by a syringe fitted with a fine needle into the mesophyle of the leaves. The infiltrated areas are delimited with a "felt-tip” marker. The infiltrated areas are harvested 16 hours after treatment.
  • the leaves are treated with a solution of ⁇ -megaspermine, a protein elicitor purified from a culture medium of Phytophthora megasperma (Kauffmann & al., 1993), or of oligosaccharides such as chitin oligomers (100 ⁇ g / ml), fragments of glucan (200 ⁇ g / ml), and fragments of pectins (200 ⁇ g / ml). Control plants are infiltrated with water.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle séquence de régulation promotrice COMTII inductible en réponse à une blessure, mécanique ou chimique, ou en réponse à une agression par un agent pathogène, notamment bactérien, fongique ou viral, ou par un insecte ou un nématode. Elle concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant la séquence de régulation promotrice selon l'invention qui contrôle l'expression d'une séquence codante hétérologue et un organisme hôte comprenant ledit gène chimère, les plantes transformées le comprenant et les semences (graines) desdites plantes transformées.

Description

Promoteur inductible COMTII, gène chimère le comprenant et plantes transformées
La présente invention concerne une nouvelle séquence de régulation promotrice inductible en réponse à une blessure, mécanique ou chimique, ou en réponse à une agression par un agent pathogène, notamment bactérien, fongique ou viral, ou par un insecte ou un nématode.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant la séquence de régulation promotrice selon l'invention qui contrôle l'expression d'une séquence codante hétérologue, hétérologue signifiant ici une séquence codante différente de la séquence codante native.
La présente invention concerne également un organisme hôte comprenant ledit gène chimère, les plantes transformées le comprenant et les semences (graines) desdites plantes transformées.
Il est connu de l'état de la technique que certains gènes, silencieux en l'absence d'agression, ne sont activés que par une agression tant mécanique que chimique et/ou en réponse à une agression par un agent pathogène, un insecte ou un nématode. De tels gènes et leurs facteurs d'activation sont notamment décrits dans le brevet US 5 670 349.
Ces différents modes de défense sont généralement liés à une régulation de l'expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de défense des plantes par induction de leurs séquences de régulation promotrices. On connaît plusieurs séquences de régulation inductibles comme les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB, tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US 5 670 349. On connaît également le promoteur HMG2 décrit dans ce même brevet US 5 670 349, comme le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme décrits dans la demande de brevet WO 98/45445. La présente invention concerne un nouveau fragment d'acide nucléique, en particulier isolé, comprenant un promoteur de plante (ou séquence de régulation promotrice) inductible, ledit promoteur inductible étant constitué par le promoteur d'un gène d'O-méthyltransférase de classe II (ci-après COMT II) de plante.
Les gènes d'O-méthyltransférase de classe II, dont le gène d'acide caféique-O- méthyltransférase de classe II, de plantes sont silencieux (inactifs) en l'absence de toute agression puisque les plantes non agressées ne l'expriment pas, ou pour le moins à des niveaux indétectables par les méthodes d'analyse usuelles. Ainsi, le messager de la COMT II est indétectable par la technique de " Northern blot " dans différents tissus d'une plante saine non traitée, comme par exemple le tabac (Pellegrini & al., 1993). Cette COMTII et son promoteur sont activés (ou induits) par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, ou aux agressions chimiques par différents produits comme le benzothiazole (BTH), le méthyle jasmonate ou des éliciteurs d'origine végétale comme la pectine.
De manière avantageuse, le fragment d'acide nucléique isolé selon l'invention est constitué par un promoteur de COMTII de plante.
Par COMTII de plante, on entend selon l'invention toute OMT de plante qui n'est pas exprimée dans les plantes saines non traitées, mais qui l'est à la suite d'une agression mécanique, chimique, par un pathogène, un insecte ou un nématode.
Par plante d'origine de la COMTII, on entend selon l'invention tout organisme pluricellulaire différencié capable de photosynthèse, qu'elle soit monocotylédone ou dicotylédone, comme par exemple le riz, le blé, l'orge, le tournesol, le maïs, le tabac, le colza, le soja ou Arabidopsis thaliana.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la COMT II est une COMT de plante dicotylédone, de préférence de tabac.
Par promoteur, on entend selon l'invention la région non codante d'un gène impliqué dans la liaison avec l'AR polymérase et d'autres facteurs qui sont responsables de l'initiation et de la modulation de la transcription conduisant à la production d'un transcrit d'ARN. Il s'agit plus particulièrement de toute séquence en 5' du site d'initiation de la traduction ou codon " start " (ATG) de la séquence codante de la COMTII permettant la transcription et l'expression de ladite séquence codante.
Le promoteur selon l'invention comprend avantageusement une séquence de plus de 600 nucléotides en amont de l'ATG de la COMT II, de préférence de plus de 700, de plus de 800 voire de plus de 900 nucléotides en amont de l'ATG, plus préférentiellement de plus de 1000 nucléotides en amont de l'ATG, encore plus préférentiellement de plus de 1200 nucléotides en amont de l'ATG. Les promoteurs comprenant plus de 1500 nucléotides en amont de l'ATG de la COMTII font également partie de la présente invention.
Le promoteur comprend un site d'initiation de la transcription. Le site d'initiation de la transcription est généralement situé à moins de 100 nucléotides en amont de l'ATG, avantageusement à environ 90 nucléotides en amont.
De manière avantageuse, l'extrémité 3' du promoteur COMTII selon l'invention est située entre le site d'initiation de la transcription et l'ATG. De préférence, l'extrémité 3' du promoteur COMTII est située entre 10 et 50 nucléotides en aval du site d'initiation de la transcription, plus préférentiellement entre 20 et 40 nucléotides en aval, encore plus préférentiellement entre 20 et 30 nucléotides en aval.
Le promoteur COMTII selon l'invention comprend également au moins une boite TATA et au moins une boite CAT. La boite TATA est généralement située à moins de 50 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, à environ 40 nucléotides en amont. La boite CAT est généralement située à moins de 100 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, de préférence à environ 100 nucléotides et/ou 80 nucléotides en amont. De manière avantageuse, le promoteur comprend deux boites CAT.
Le promoteur selon l'invention comprend également des éléments régulateurs impliqués dans l'expression de gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes et des gènes associés à la défense, en particulier au moins une boite A et/ou au moins une boite L et/ou au moins une boite L inversée et/ou au moins une boite P et/ou au moins une boite W inversée. La boite A comprend la séquence suivante CCGTCC. Elle est généralement située à moins de 410 nucléotides du site d'initiation de la transcription. La boite L comprend la séquence suivante CTTCAACAACCAACC. Elle est généralement située à moins de 180 nucléotides du site d'initiation de la transcription. La première boite L inversée comprend la séquence suivante GTTAGGTGAAG. Elle est généralement située à moins de 1000 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites L inversées, l'une à environ 970 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription et l'autre à environ 440 nucléotides en amont. La deuxième boite L inversée comprend la séquence suivante TGTTAGGTGTGTGTTT. La boite P comprend la séquence suivante CACACCAACTCCCA. Elle est généralement située à moins de 750 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite W inversée comprend la séquence suivante GGTCAA. Elle est généralement située à moins de 1200 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites W inversées, l'une à environ 1110 nucléotides en amont et l'autre à environ 210 nucléotides en amont.
Le promoteur selon l'invention comprend également au moins une boite E et/ou au moins une boite G et/ou au moins une boite GT. La boite E comprend la séquence suivante TTCCATC AAG. Elle est généralement située à moins de 110 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite G comprend la séquence suivante CCACGT. Elle est généralement située à moins de 600 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. La boite GT comprend la séquence suivante GGTTAA. Elle est généralement située à moins de 450 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Avantageusement, le promoteur selon l'invention comprend deux boites GT, l'une à environ 400 nucléotides en amont et l'autre à environ 280 nucléotides en amont.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le promoteur selon l'invention est constitué par le promoteur COMTII de tabac défini par la séquence nucléotidique en amont de l'ATG représentée par l'identificateur de séquence 1 (SEQ ID NO 1). De préférence le promoteur COMTII de tabac comprend la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 1795 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. Préférentiellement le promoteur COMTII de tabac comprend la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 889 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. Le promoteur inductible COMTII de tabac est activé par par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, ou aux agressions chimiques par différents produits comme le benzothiazole (BTH), le méthyle jasmonate ou des éliciteurs d'origine végétale comme la pectine. L'étude fonctionnelle du promoteur a permis d'identifier les régions impliquées dans l'induction du promoteur dans différentes conditions. Le fragment comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 698 à 1365 est nécessaire et suffisant pour conférer la sensibilité et l'induction par blessure, par le VMT, la mégaspermine, la pectine et la chitine. Préférentiellement le promoteur COMTII de tabac comprend donc la séquence comprise entre les nucléotides 698 et 1365 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. Ce fragment peut être associé à un autre promoteur pour induire l'expression d'un gène par blessure, par le VMT, la mégaspermine, la pectine ou la chitine. Ce fragment peut ainsi être associé au promoteur minimum du RNA 35S du CaMV. La présente invention a donc également pour objet un promoteur chimère comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 698 et 1365 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues. L'analyse de la réponse du promoteur vis à vis du méthyl jasmonate et les UV indique que le fragment comprenant la séquence comprise entre les nucléotides 815 et 1795 de la SEQ ID NO 1 est fonctionnel. Dans un mode de réalisation avantageux, le promoteur COMTII de tabac comprend donc la séquence comprise entre les nucléotides 815 et 1795 de la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybridiser de manière sélective aux dites séquences et leurs séquences homologues.
Par « séquence capable de s'hybridiser de manière sélective », on entend selon l'invention les séquencesqui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridiqtion d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les séquence ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).
Par séquence homologue, on entend selon l'invention toute séquence comprenant plus de 70 % d'homologie, préférentiellement plus de 80 % d'homologie, encore plus préférentiellement plus de 90 % d'homologie, et qui conserve les éléments fonctionnels du COMTII lui conférant ses propriétés de promoteur inductible. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al, 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
L'isolement, le clonage et la caractérisation des promoteurs COMT II à partir des gènes de COMT II se fait selon les méthodes expérimentales usuelles de l'homme du métier pour isoler, cloner et caractériser un promoteur, abondamment décrites dans la littérature.
L'isolement et le clonage d'un gène COMT II se fait par analyse d'une banque génomique préparée à partir de l'ADN de la plante d'intérêt. L'ADN génomique est coupée par une ou plusieurs enzymes de restriction appropriées et introduit dans un vecteur adéquat pour constituer, par des méthodes connues de l'homme du métier, une banque contenant l'ensemble du DNA génomique de la plante (Ausubel et al., 1998; Sambrook et al., 1989).
Le ou les clones renfermant un gène COMT II est (sont) isolé(s) grâce à une sonde nucléotidique. La séquence de la sonde est. soit déduite de la séquence protéique si l'enzyme a été purifiée (en suivant son activité, par exemple), soit préparée à partir d'un clone de cDNA issu d'une banque. Cette banque de cDNA est préparée à partir de mRNA extrait de tissus traités de façon à induire l'expression du gène COMT II (par la blessure, l'infection ou un traitement chimique comme décrit dans les exemples ou les figures 1-5). La banque de cDNA est ensuite criblée par des anticorps dirigés contre une protéine COMT II (de tabac par exemple) ou par une sonde nucléotidique déduite de la protéine COMT II de la plante considérée ou déduite des séquences conservées chez les COMT de plantes. Le cDNA ainsi isolé est caractérisé par sa séquence nucléotidique ou par l'activité enzymatique de la protéine recombinante obtenue après expression du cDNA dans un organisme procaryote ou eucaryote. Les séquences non codantes du cDNA (3' et/ou 5') sont utilisées pour sélectionner, par PCR, en conditions très sélectives, le ou les clones génomiques renfermant le gène COMT II exprimé lors du traitement utilisé pour construire la banque cDNA. Les séquences promotrices sont alors être isolées par PCR ou toute autre méthode appropriée bien connue de l'homme du métier.
Sur la base des informations contenues dans la présente demande de brevet pour le promoteur COMTII de tabac, l'homme du métier sera à même d'identifier d'autres promoteurs COMTII d'autres espèces végétales une fois le gène COMTII identifié et clone selon les méthodes usuelles, notamment celles décrites ci-dessus.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', la séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur COMT II selon l'invention défini auparavant.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences. On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc. Comme séquence de régulation en 5', on peut utiliser le promoteur COMTII selon l'invention seul ou associé à au moins une partie d'un promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 31 1).
On peut encore utiliser le promoteur COMTII selon l'invention en association avec au moins une partie d'un promoteur spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ([22] Datla, R.& al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460) ou de l'oélosine (WO 98/45461). Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec le promoteur
COMTII selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (VET) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. La séquence codante du gène chimère selon l'invention comprend une séquence codante pour un gène rapporteur, comme la séquence codante GUS, ou une séquence codante pour une protéine d'intérêt. Au regard du mode d'induction du promoteur selon l'invention, blessure, infection virale ou réponse à des éliciteurs, la protéine d'intérêt est avantageusement une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes.
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérrêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995). De manière préférentielle, le peptide éliciteur fongique est la mégaspermine. La mégaspermine et sa séquence codante est représentée par l'identificateur de séquence n° 13 (SEQ ID 13). De manière plus préférentielle, le gène chimère selon l'invention comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur COMT II et une séquence codante pour la mégaspermine comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n° 14 (SEQ ID 14).
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante pour un éliciteur et une séquence de régulation en 3', la séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur inductible.
De manière préférentielle, l' éliciteur est une élicitine, plus préférentiellement la mégaspermine telle que définie ci-dessus.
Le promoteur inductible est avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349, Tableau 3), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445). La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation des cellules végétales ou des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, le gène chimère selon l'invention peut être employé en association avec un gène marqueur de sélection, soit dans un même vecteur, les deux gènes étant associés de manière convergente, divergente ou colinéaire, ou encore dans deux vecteurs employés simultanément pour la transformation de l'organisme hôte. De tels gènes marqueurs et leur utilisation pour la transformation des plantes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103. L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration au génome des dites cellules végétales d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales ou plantes transformés et contenant un gène chimère défini ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128. La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, le tournesol, la betterave, le trèfle, etc.
Les plantes transformées selon l'invention peuvent contenir d'autres gènes d'intérêt, conférant aux plantes de nouvelles propriétés agronomiques. Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une tolérance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies . De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128. On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés ([1]; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998.
Ces autres gènes d'intérêt peuvent être combinés au gène chimère selon l'invention soit par croisement conventionnel de deux plantes contenant chacune l'un des gènes (la première le gène chimère selon l'invention et la seconde le gène codant pour la protéine d'intérêt) soit en effectuant la transformation de cellules végétales d'une plante contenant le gène codant pour la protéine d'intérêt avec le gène chimère selon l'invention.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989.
Description de la figure 1 : Cinétiques d'activités GUS (1A) correspondant à la construction promoteur COMTII(-1215 à +24VGUS et COMTII (1B) au cours d'une infection virale (VMT) ou lors d'une blessure.
Exemple 1 : Isolement du gène COMT de classe II Le criblage d'une banque génomique de tabac a permis d'isoler 6 clones différents contenant des gènes de COMT de classe II (COMTII). Ces derniers ont d'abord été caractérisés par leurs profils de restriction qui ont révélé une certaine hétérogénéité parmi les différents clones.
Les COMTII forment une famille multigénique composée de six à sept gènes dont un seul est transcrit dans les réactions de défense puisqu'un seul type d'ADNc a été caractérisé dans une banque élaborée à partir de feuilles inoculées par le virus de la mosaïque du tabac (VMT) (Pellegrini & al. 1993). Afin d'identifier le ou les clones renfermant le gène exprimé lors des réactions de défense, des réactions PCR ont été réalisées en utilisant des amorces dérivées de la région 3' non codante de l'ADNc. Dans des conditions de sélectivité élevée un seul clone est alors amplifié. Les produits d'amplifications ont été séquences. Les séquences obtenues ont présenté une homologie parfaite avec celles des régions 3' non codantes de l'ADNc.
Exemple 2 : Analyse des séquences du promoteur de gène de la COMT de classe II
Le clone génomique retenu a été sous-cloné dans un vecteur bactérien (pue 18) et représente un insert de 14 kb dont 9 kb sont situés en amont de l'ATG du gène COMTII. Le site d'initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce et il se place a 90 nucléotides du site d'initiation de la traduction.
Le promoteur a été séquence sur une longueur de 1771 kilobases. Des éléments non spécifiques et communs aux gènes eucaryotes impliqués dans l'initiation de la transcription tels la TATA box et la CAT box ont été retrouvés dans le promoteur
COMTII (SEQ ID NO 1). Des sites de régulation ont été mis en évidence par comparaison des séquences promotrices du gène COMTII avec celles de gènes intervenant dans les mécanismes de défense. Le promoteur COMTII contient des éléments spécifiques des gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes impliqués dans la réponse au stress comme les trois boîtes P, A, L (initialement identifiées dans le gène
PAL de persil) (SEQ ID NO 1). Ces trois boîtes sont impliquées dans la réponse aux éliciteurs et les boîtes P et L sont également impliquées dans la réponse aux UV. La boîte E initialement identifiée dans le gène de la CCoAOMT de persil et extrêmement conservée dans les gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes joue aussi un rôle dans la réponse aux éliciteurs.
Le promoteur COMTII possède également des éléments jouant un rôle important dans l'induction de gènes PR par les éliciteurs telle la boîte W (SEQ ID NO 1). Des éléments régulateurs généraux sont retrouvés dans le promoteur de la COMTII telles les boîtes G, GT et l'élément activateur du virus simiens SV4O (SEQ ID NO 1). La boîte G est un élément présent dans une grande variété de promoteurs végétaux. La boîte G, associée à des éléments cis spécifiques, est impliquée dans la régulation de nombreux gènes répondant à différents signaux physiologiques et environnementaux. La région promotrice, responsable de la régulation de gènes par le méthyle jasmonate, est constituée d'une boîte G associée à des séquences riches en nucléotides C. Une organisation similaire est retrouvée au niveau du promoteur de gènes spécifiquement induits lors de la blessure. Les boîtes L, présentes dans le promoteur de la COMTII, pourraient intervenir dans ce genre d'interactions car ce sont des motifs riches en nucléotides C.
Les boîtes GT, représentées plusieurs fois dans les promoteurs, semblent jouer un rôle dans la modulation de l'expression de certains gènes végétaux, soit en tant qu'activateur ou en tant que répresseur.
Exemple 3 : Analyse fonctionnelle des régions promotrices du gène COMTII
L'analyse fonctionnelle du promoteur COMTII a été réalisée par transgénèse en expression stable. Le transgène a été obtenu par fusion transcriptionnelle entre le promoteur et un gène rapporteur, le gène GUS (β-glucuronidase). Quatre constructions correspondant à différentes délétions du promoteur ont été réalisées afin de préciser la nature des séquences promotrices importantes responsables de la régulation du gène.
Ces constructions correspondent aux séquences promotrices de -1215 à +24 paires de bases (bp), de -420 à +24 bp, de -313 à +24bp et de -121 à +24 bp (par rapport au site
+1 de la transcription), 557 à 1795, 1352 à 1795, 1459 à 1795 et 1651 à 1795 respectivement sur la SEQ ID NO 1 introduites en amont du gène GUS dans le vecteur pBilOl (Clontech).
Les différentes constructions ont été introduites via Agrobacterium tumefaciens dans le génome des plantes. Une population d'une dizaine de plants de tabac transformés a été régénérée pour chaque construction. Le niveau d'expression du transgène a été déterminé par dosage de l'activité enzymatique et par des tests histochimiques. Parallèlement l'expression des gènes COMTII a été analysée par mesure de l'activité des enzymes correspondantes. Résultats:
L'activité GUS a été testée dans ces plantes dans différentes conditions d'induction des réactions de défense, par un éliciteur fongique injecté dans les feuilles (mégaspermine), ou après exposition aux UV. Les résultats obtenus sont rapportés dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous. L'activité GUS est exprimée en pmole MU/min. mg. Pour le Tableau 1, le témoin (T) est constitué par l'infiltration d'eau dans les feuilles des plantes transformées. Des plantes contrôles transformées avec un vecteur vide avaient une activité d'environ 10-30 pmoles/min.mg. Pour le Tableau 2, le témoin (T) correspond à l'activité GUS basale dans les plantes non traitées. Tableau 1 - Expression de l'activité GUS correspondant aux différentes constructions COMT II/GUS : induction par la mégaspermine
Figure imgf000017_0001
Tableau 2 - Expression de l'activité GUS correspondant aux différentes constructions COMT II/GUS : induction aux UV
Figure imgf000017_0002
Ces résultats montrent que la taille du promoteur doit être supérieure à 600pb, en l'occurrence 1239 bp pour permettre l'induction et une forte expression du gène GUS. Les délétions du promoteurs correspondant aux constructions (-420 à +24), de (-313 à +24) et de (-121 à +24) provoquent une perte complète de l'expression du gène GUS dans toutes les conditions testées. L'activité du gène GUS sous le contrôle du promoteur de 1239 pb est 1000 fois supérieure à celle observée pour les autres constructions. Activation du promoteur de la COMTII par la blessure et le méthyle jasmonate et par des éliciteurs d'origine et de nature variées.
Les plantes transgéniques possédant la construction COMTII(- 1215 à +24)/GUS ont été traitées avec différents produits chimiques, régulateurs des réactions de défense, par l'acide salicylique (SA) et le méthyl-2-6-dichloroisonicotinique (INA), par des éliciteurs fongiques comme des glucanes ou des fragments de chitine et un éliciteur d'origine végétale comme la pectine. L'activité GUS a été mesurée dans les feuilles 16h après infiltration de ces composés et les résultats rapportés dans le Tableau 3 ci-dessous. L'activité GUS est exprimée en pmole MU/min.mg. Le témoin (T) correspond à l'activité GUS basale dans les plantes transformées non traitées.
Tableau 3 - Induction de l'activité GUS par des éliciteurs
Figure imgf000018_0001
L'augmentation la plus forte de l'activité GUS (de l'ordre de 3) est obtenue dans les plantes infiltrées par des fragments pectiques par rapport au contrôle. L'induction du promoteur de 1239 pb a été étudiée lors de la blessure ou après traitement par le méthyle jasmonate (molécule jouant un rôle dans la signalisation des réponses de défense lors de la blessure) et par le benzothiadiazole (BTH) (inducteur chimique de la SAR). L'activité GUS est mesuré 16h après traitement. Les résultats sont rapportés sur le Tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 - Induction de l'activité GUS par différents composés et stress
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
Le témoin (T) correspond à l'activité GUS des plantes non traitées. Le promoteur est activé par les différents traitements.
Les facteurs d'induction varient de 2,5 (BTH) à 14,5 (méthyle jasmonate). Activatîon du promoteur de la COMTII lors de l'infection virale. L'inoculation du VMT chez le tabac nécessite la production de micro blessures au niveau des feuilles permettant l'entrée du virus et sa multiplication. L'activité GUS et l'activité COMTII ont été mesurées dans les feuilles blessées et dans les feuilles inoculées par le virus. Les résultats (figure 1) montrent que le gène GUS sous le contrôle du promoteur COMTII a une cinétique d'induction identique à celle du gène COMTII endogène, suivie par la mesure de l'activité catalytique des protéines correspondantes. Le promoteur COMTII est induit précocement par la blessure et présente un maximum d'activité à 16h. Le même pic d'activité est observé à 16h au cours de l'infection virale et est dû à la blessure des feuilles provoquée par l'inoculation du virus. Dans les feuilles inoculées, l'activité GUS est fortement stimulée à partir du 3ème jour et progresse jusqu'au 7ème jour. L'induction locale et systémique du promoteur lors de l'infection virale a été mesurée à 3 et 7 jours après l'inoculation du VMT. Les activités GUS exprimées en pmol MU/min.mg, sont rapportées dans le Tableau 5 et représentent une moyenne des valeurs obtenues dans 9 transformants. Le témoin T correspond à l'activité GUS des plantes non traitées.
Tableau 5 - Induction locale et systémique (SAR) de l'activité GUS
Figure imgf000020_0001
Ces résultats montrent une induction de 1100% du promoteur à 7 jours dans les feuilles inoculées. L'activité GUS mesurée à 7 jours dans les feuilles SAR est plus faible mais très significative. Cependant, dans les feuilles non inoculées les facteurs d'induction calculés à partir des activités GUS sont plus fortes que celles obtenues à partir des activités COMTII (Tableau 6). Ceci est dû, d'une part au fait que le test d'activité GUS est plus sensible que celui de la COMTII et, d'autre part au fait que la protéine GUS est extrêmement stable et que l'activité GUS mesurée correspond à une accumulation de cette protéine après le traitement. La comparaison des activités GUS et COMTII est rapportée dans le Tableau 6 ci-dessous. Les feuilles non inoculées où se développe la résistance systémique acquise sont appelées " feuilles SAR " .
Tableau 6 -Facteurs d'induction des activités GUS et COMTII 3 et 7 jours après inoculation par le VMT dans les feuilles infectées et les feuilles SAR
Figure imgf000020_0002
Analyse histochimique de l'activité GUS lors d'une infection virale et après blessure.
Une analyse histochimique de l'activité GUS dans des feuilles inoculées par le VMT, 7 jours après virose, montre que l'expression du gène GUS est localisée dans les cellules entourant le site d'infection. Des coupes transversales des feuilles au niveau des lésions ont été réalisées afin de déterminer les types cellulaires impliqués et, montrent que l'induction du gène GUS n'est pas tissu spécifique mais concerne toutes les cellules autour des lésions.
L'analyse histochimique de l'expression du gène GUS dans des feuilles blessées, 2 jours après traitement, montre une induction du gène GUS dans les tissus non blessés entourant les sites de blessure par piqûres ou à l'aide de forceps. Ces résultats impliquent qu'un signal est émis à partir des tissus blessés vers les tissus intacts induisant une expression systémique du gène GUS. Le méthyle jasmonate synthétisé dans les tissus blessés pourrait induire à distance le gène GUS, car une application exogène de méthyle jasmonate induit une activité GUS. Le test histochimique réalisé sur des feuilles issues de plantes transgéniques 35S/GUS est le contrôle positif de l'expérience. Des coupes transversales de feuilles blessées montrent également que tous les types cellulaires sont induits par la blessure.
Activité de fragments du promoteur de taille variable et compris entre les bases -1215 et - 406.
Liste des construits possédant le gène rapporteur GUS sous contrôle des séquences promotrices comprises entre -1215 et - 406 (par rapport au site + 1 d'initiation de la transcription) :
Constructions contrôles :
Gène rapporteur GUS dépourvu de promoteur
Gène rapporteur GUS sous le contrôle du promoteur minimum du RNA 35 S du CaMV (p min).
Constructions COMTII / GUS utilisées :
COMT II - 956 à + 24
COMT II - 937 à + 24
COMT II - 882 à + 24 COMT II - 746 à + 24
COMT II - 676 à + 24
COMT II - 560 à + 24
COMT II - 435 à + 24
COMT II - 1073 à - 406 + promoteur minimum du RNA 35 S du CaMV (p min). Ces constructions correspondent respectivement aux fragments 815 à 1795, 834 à 1795, 889 à 1795, 1025 à 1795, 1095 à 1795, 1211 à 1795, 1336 à 1795 et 698 à 1365 de la SEQ ID NO 1. L'analyse fonctionnelle de ces différentes constructions a été réalisée sur des tabacs transgéniques en expression stable.
Les études ont d'abord été réalisées sur une population d'environ 20 vitroplants ayant permis la sélection de 3 à 7 lignées par construction qui ont analysés à l'âge de 20 à 45 jours après transfert en serre.
Tableau 7 : Induction par la blessure, le méthyl jasmonate, les UV et le VMT de l'activité GUS dans des vitroplants de tabac transformés par les différentes constructions COMTII / GUS.
Figure imgf000022_0001
Pour tester la réponse à la blessure, des feuilles de vitroplants (âgées de 4 à 6 semaines après repiquage) ont été blessées à l'aide de pinces et l'activité histochimique GUS a été révélée 16 heures après blessure.
Pour tester la réponse à l'infection, des feuilles de vitroplants ont été inoculées avec une solution de VMT, et l'activité GUS a été révélé 7 jours après inoculation.
Les traitements par les UV et le méthyl jasmonate ainsi que le contrôle non induit ont été effectués sur des feuilles de vitroplants mises en survie dans de l'eau pendant 16 heures. Tableau 8 : Induction de l'activité GUS par les fragments de pectine, chitine ou par la mégaspermine dans des plantes de tabac cultivées en serre et transformées par les différentes constructions COMTII / GUS
Figure imgf000023_0001
Les délétions correspondant aux constructions (-882 à + 24), (- 746 à + 24), (-
676 à + 24), (- 560 à + 24) et (- 435 à + 24) entraînent une perte complète de l'inductibilité du promoteur COMTII pour l'ensemble des stress étudiés dans les tableaux 7 et 8. Ceci indique que les séquences nécessaires à l'activité du promoteur se situent entre les bases - 1215 et - 882 par rapport au site d'initiation de la transcription. Dans les cas de l'induction du promoteur par la blessure, le VMT, la mégaspermine, ainsi que par les fragments de pectine et de chitine, seuls les fragments de promoteur (- 956 à + 24), (- 937 à + 24) et (- 1073 à - 406) permettent l'expression de l'activité GUS. De plus, le fragment ( - 1073 à - 406) permet l'induction du gène rapporteur par les différents traitements cités ci-dessus, la partie proximale du promoteur comprise entre -406 et +24 ne s'avère donc pas indispensable à l'activité du promoteur. Le fragment -1071 à - 406 pb apparaît donc nécessaire et suffisant pour conférer la sensibilité aux inducteurs étudiés.
L'analyse de la réponse du promoteur vis à vis du méthyl jasmonate et des UV indique que seul le fragment promoteur de - 956 à + 24 pb est fonctionnel. En effet, lorsque le fragment (- 1073 à - 406) est analysé hors du contexte du promoteur total (- 1215 à + 24 pb), aucune induction n'est observée. Il existe donc plusieurs régions nécessaires à l'inductibilité du promoteur COMTII par le méthyl jasmonate et les UV : la région comprise entre -956 et - 937 pb ainsi qu'une ou plusieurs régions situées dans la partie plus proximale du promoteur.
Exemple 4 : Activité anti-infectieuse de COMTII/mégaspermine dans le tabac
4.1. Clonage d'un ADNc codant pour la β mégaspermine.
Le clonage de gènes d'élicitine tels que ceux de la parasiticéine et de la cryptogéine ont montré que ces gènes codaient pour une préprotéine (Kamoun et al., 1993 ; Panabières et al., 1995). La séquence codante de ces élicitines comprend un peptide signal de 20 acides aminés, permettant leur excrétion dans le milieu extracellulaire suivi d'une séquence de 98 acides aminés correspondant à la protéine mature.
La séquence protéique de la β mégaspermine, préalablement déterminée (Kauffmann S., résultats non publiés), montre une forte homologie avec celle de la cryptogéine (Kamoun et al., 1993). Nous avons émis l'hypothèse que les séquences nucléotidiques des gènes correspondants pouvaient être très proches. Des amorces dérivées de la séquence nucléotidique du gène de la cryptogéine ont été synthétisées afin d'isoler par PCR un ADNc codant pour la β mégaspermine. Ces amorces se placent au niveau de la séquence codant pour le peptide signal et contiennent le codon d'initiation de la traduction. Des réactions d'amplification ont été effectuées sur les reverse transcrits de Phytophthora megasperma en utilisant une amorce sens dérivée de la séquence nucléotidique de la cryptogéine et l'oligodT comme amorce antisens. Un fragment amplifié d'environ 450 nucléotides a été obtenu. Ce fragment a été clone dans un vecteur bactérien afin d'être séquence.
L'analyse des séquences a révélé que le clone ainsi obtenu code pour une préprotéine comprenant une séquence signal de 20 acides aminés et une séquence de 98 acides aminés correspondant à la β mégaspermine (SEQ ID NO 12). La séquence nucléotidique correspondant au peptide signal présente par ailleurs 100% d'identité avec celle de la cryptogéine.
L'ADNc natif de la β mégaspermine a été fusionné d'une part au promoteur COMT II et d'autre part au promoteur 35S. Le promoteur COMT II de 1239 pb a été utilisé car il possède tous les éléments régulateurs nécessaires à son induction.
4.2. Obtention des tabacs transgéniques Des plants de tabac Nicotiana tabacum Samsun NN ont été transformés avec les deux constructions via Agrobacterium tumefaciens. Six transformants primaires pour chaque construction ont été régénérés et autofécondés. Les plantes issues de la seconde génération présentent un phénotype normal excepté certains individus possédant le gène de la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S. Ces plantes présentent un délai de croissance et ont également un système racinaire peu développé. Cependant aucune nécrose tissulaire rappelant celle développée par l'infiltration foliaire et pouvant être liée à l'expression de l'élicitine n'est observée dans les plantes transgéniques.
4.3. Analyse de l'expression de la β mégaspermine dans les tabacs transgéniques.
L'expression de la β mégaspermine a été analysée dans les feuilles des plantes transgéniques possédant l'ADNc de l'élicitine sous le contrôle du promoteur 35S par Western-Blot (figure 2A) et par Northern-Blot (figure 2B). De façon surprenante, la β mégaspermine est indétectable dans tous les transformants analysés (figure 2A). Le niveau de transcription de l'élicitine a donc été examinée dans ces plantes par Northern- Blot (figure 2B). Les transcrits ont pu être détectés et le niveau d'expression varie d'un transformant à l'autre. Il apparaît que dans 2 types de plantes (E et F) la taille des transcrits est plus petite que la taille du messager complet. Dans ce cas, l'absence de protéine pourrait être expliquée par le fait que l'ADNc est tronqué. Pour les plantes A, B, C, D la taille des transcrits correspond à celle de l'élicitine exprimée par le champignon et le taux de transcrits n'est pas négligeable, sauf pour la plante B montrant une très faible proportion de transcrits. Les plantes A qui possèdent les niveaux de transcrits les plus élevés montrent également un retard de croissance. Par la suite, seuls les transformants présentant les transcrits complets de β mégaspermine ont été testés pour leur résistance.
De la même manière, l'expression de la β mégaspermine sous contrôle du promoteur COMT II a été analysée par Western-Blot dans les feuilles des tabacs transgéniques (figure 3). L'expression a été étudiée dans les plantes saines non traitées pour déterminer le niveau de base d'expression de l'élicitine et après blessure pour analyser le niveau d'induction obtenu. Dans les tissus non traités, le niveau de la β mégaspermine est indétectable. Par contre, l'élicitine est détectée en très faible quantité dans les tissus blessés. Ceci est dû à l'activation du promoteur COMT II par la blessure. L'accumulation de la COMT II a été également examinée dans les mêmes plantes transgéniques en utilisant des anticorps anti-COMT II. De façon surprenante la COMT II est détectée à un niveau non négligeable dans les tissus non traités, alors que normalement seule une très faible activité COMT II est détectée dans les plantes saines non transformées ou transformées avec le gène chimérique COMT II:: GUS (Collendavelloo et al, 1981 ; Pellegrini et al., 1993). La COMT II est également produite en quantité plus grande dans les tissus blessés par comparaison aux plantes contrôles blessées de la même façon.
Le promoteur COMT II permet une expression induite de l'élicitine dans les tabacs transgéniques. Ceci a été vérifié pour les 6 transformants. Cependant la quantité d'élicitine détectée dans les plantes après induction est très faible. La présence de COMT II dans les plantes non traitées laisse supposer qu'une très faible quantité d'élicitine (non détectée par la méthode utilisée) est produite dans la plante saine et que cette synthèse est suffisante pour induire le gène COMT II endogène. De plus, il semblerait qu'une expression induite de l'élicitine lors de la blessure permette également une plus forte induction du gène COMT II endogène.
Par ailleurs, l'analyse de la β mégaspermine sur gel dénaturant montre une migration électrophorétique inférieure à celle de la β mégaspermine mature purifiée (figure 3). Cette différence de migration a été évaluée à 3 kD ce qui correspond à la taille du peptide signal. Ce résultat semble indiquer que le peptide signal n'a pas été clivé. Cependant il est possible que la protéine mature soit produite en plus petite quantité par les cellules végétales et que cette quantité se situe en dessous du seuil de détection sur ce Western-Blot.
L'étude de l'expression de la β mégaspermine dans des tabacs transgéniques semble indiquer qu'une expression constitutive d'élicitine ne soit pas tolérée par les plantes et par conséquent ne permette pas son accumulation dans les cellules végétales.
Seule une expression induite permet une synthèse de la β mégaspermine à un niveau détectable. Ces résultats pourraient être liés au caractère toxique de la protéine.
4.4. Analyse du niveau de résistance des plantes transgéniques vis à vis de différents agents pathogènes.
Résistance antivirale. a) Résistance vis à vis du Virus de la Mosaïque du Tabac (VMT). Les tabacs transformés possèdent le gène de résistance N et réagissent donc par une HR lors de l'inoculation par le VMT. Dans ces expériences la résistance au virus est quantifiée par la mesure de la taille des lésions 7 jours après infection, lorsqu'elles ont atteint leur taille presque définitive. Plus la résistance développée par la plante est grande, plus les tailles des lésions sont petites, illustrant ainsi un confinement plus important du pathogène au site d'infection. Le promoteur du gène COMT II étant fortement induit autour des lésions lors de la HR au VMT, il devrait permettre une forte expression de la β mégaspermine au site d'infection. Pour le vérifier, les plantes transgéniques a,b,c,d,e et f exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II et les transformants A, B, C, D possédant l'ADNc de la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ont été inoculés par le VMT. Les plantes témoins sont des plantes transgéniques pour le gène chimérique "promoteur COMT II:: GUS".
Sept jours après virose, les lésions développées sur les plantes exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ne semblent pas différentes de celles des plantes témoins. Par contre des lésions plus petites sont observées sur les plantes transgéniques exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II par rapport à celles obtenues sur les plantes témoins.
Une analyse statistique de la taille des lésions a été effectuée en mesurant le diamètre de 100 à 150 lésions chez les plantes témoins et chez les plantes transgéniques pour la β mégaspermine. La figure 4 représente la distribution de la taille des lésions mesurées sur les plantes témoins et pour une lignée exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur 35S (plantes A) et une lignée exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II (plantes b). Cette distribution suit une courbe de Gauss ce qui autorise l'analyse statistique des résultats. Les plantes témoins présentent une taille de lésions dont la moyenne est de 3,3+0,5 mm. La moyenne de la taille des lésions obtenue pour les plantes A n'est pas significativement différente de celle des témoins (3,1 ±0,6 mm) par contre celle obtenue pour les plantes b est fortement inférieure au témoins (1,4±0,6 mm). Les résultats obtenus pour chaque lignée indépendante sont regroupés sur la figure 5 et montrent que tous les transformants (plantes A, B, C et D) possédant l'ADNc de la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S présentent une taille de lésions ne différant pas de celle des témoins. En revanche, toutes les plantes exprimant l'élicitine sous le contrôle du promoteur COMT II présentent une taille moyenne de lésions significativement inférieure à celle des plantes témoins. Cette diminution est plus ou moins importante selon les transformants. Une forte réduction, d'environ 60%, de la taille des lésions est obtenue pour les transformants COMT II::meg a, b, et f et la plus faible observée est de 36% et correspond au transformant COMT II::meg e.
L'ensemble des résultats obtenus montrent que les plantes exprimant la b mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S présentent un niveau de résistance antiviral équivalent à celui des plantes témoins. Par contre, une résistance accrue au VMT est obtenue pour les tabacs transgéniques exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II. Cependant tous les lignées transgéniques ne présentent pas le même niveau de résistance. Ceci pourrait être lié à des niveaux d'expression différents de la β mégaspermine dans ces différentes plantes transgéniques, b) Résistance au Virus de la Mosaïque de la Luzerne (VML). Nous avons testé la résistance des tabacs transgéniques COMT II "mégaspermine vis à vis d'un autre virus, le VML, qui infecte le tabac de façon systémique. Une dizaine de jours après virose, le VML s'est propagé dans toute la plante et produit au niveau des feuilles non inoculées des symptômes de mosaïque.
Les plantes exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II choisies pour ce test correspondent à la lignée b qui présente un niveau de résistance élevé au VMT. Les plantes A possédant l'ADNc de la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ont été également inoculées ainsi que des plantes témoins COMT II::GUS. Pour chaque lignée transgénique, 5 plantes ont été inoculées. Nous avons examiné le phénotype des différentes plantes quinze jours après traitement. A ce stade les symptômes de mosaïque sont bien développés sur les plantes COMT IL: GUS. Les plantes transgéniques A montrent une mosaïque similaire aux plantes témoins. Par contre, une réduction de ces symptômes est observée dans les plantes transgéniques b.
La charge virale a été examinée dans les feuilles systémiques de même niveau (3 ème feuille au dessus de la feuille inoculée). Cette analyse a été effectuée par Western- Blot en utilisant des anticorps dirigés contre la coque protéique du virus (figure 6). La quantité de virus présente dans les différentes plantes transgéniques est évaluée par rapport à la quantité de virus présente dans les plantes témoins. Les résultats obtenus montrent que les plantes exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S ont de 10 à 15 fois moins de virus que les plantes témoins. Cette réduction de la quantité de virus peut paraître importante. Il faut savoir cependant que les quantités de virus produites dans les plantes sauvages peuvent varier dans les mêmes proportions. Par contre les plantes transgéniques exprimant la mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II contiennent 1000 à 10000 fois moins de virus que les plantes témoins. Ceci représente une réduction considérable et très significative de la charge virale.
Ces résultats suggèrent que seules les plantes transformées avec la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur inductible COMT II sont moins sensibles vis à vis d'une infection systémique virale. Ceci montre également une corrélation entre la réduction des symptômes d'infection et la diminution de la charge virale dans ces feuilles.
Résistance antifongique. Nous avons examiné si la production d'élicitines in planta conférait une résistance induite vis à vis d'un champignon du sol, Phytophthora parasitica vav.nicotianae. Ce champignon infecte les plants de tabac par les racines envahissant le système racinaire puis vasculaire provoquant ainsi une sclérose des vaisseaux conducteurs. Les symptômes d'infection se traduisent par une pourriture noire au niveau du collet. Ce mode d'infection est difficile à mettre en oeuvre car il nécessite une concentration en zoospores adéquate et répond à des conditions strictes de température et d'humidité. Un mode "artificiel" d'inoculation consiste à appliquer après décapitation des tabacs le mycélium du champignon au niveau de la tige sectionnée. Après 7 jours les tiges sont prélevées et les symptômes d'infection sont examinés à l'intérieur des tiges.
L'inoculation a été effectuée sur 7 plantes témoins COMT II::GUS. Pour chaque lignée transgénique pour la β mégaspermine, cinq plantes ont été inoculées. Les plantes A, B, C et D possédant la construction "promoteur 35S-mégaspermine" ont été testées. Pour les plantes possédant le gène de la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II, les lignées a et b présentant une forte résistance accrue au VMT ont été choisies ainsi que la lignée e présentant un niveau plus faible de résistance. La progression des symptômes mesurée dans les tiges des plantes témoins atteint une longueur moyenne de 5,3 cm. Un ralentissement des symptômes d'infection est observé dans les tiges des plantes transgéniques exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur 35S. Cette diminution est variable d'un génotype à l'autre (figure 7). La progression du champignon est fortement ralentie dans les plantes 35S::meg A (d=0,8cm) et plus faiblement dans les plantes 35S::meg B (d=3,8cm) par rapport au plantes témoins (d=5,3cm). Les plantes A correspondent aux plantes qui présentent la plus forte proportion de transcrits de β mégaspermine, alors que les plantes B ont un taux très faible de transcrits codant pour l'élicitine. Ceci pourrait suggérer une corrélation entre les niveaux de transcrits d'élicitine détectés (et sans doute les niveaux de β mégaspermine produits même si ceux ci restent sous le seuil de détection) et le niveau de résistance antifongique induit. La progression du champignon est également fortement ralentie dans les tiges des plantes transgéniques exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II. Nous avons montré par ailleurs que le promoteur COMT II était induit lors de l'infection par P. parasitica. Les tiges des transformants COMT II::meg a, b et e sont respectivement infectées sur une longueur de 0,7 cm, 1 cm et de 3,5 cm. Les plantes a et b sont les plus résistantes à l'infection par P. nicotianae et correspondent également aux plantes présentant la plus forte résistance au VMT. Ainsi, il apparaît que les mêmes niveaux de résistance relatifs sont détectés avec les deux agents pathogènes testés. Nous pouvons supposer que les niveaux de résistance induits dans ces plantes sont liés au taux d'expression de l'élicitine. Une analyse des niveaux de transcrits par Northern-Blot permettrait peut être de confirmer cette hypothèse, sachant la difficulté de détecter la protéine par Western-Blot.
Ces résultats montrent que l'expression constitutive ou induite de β mégaspermine dans des tabacs transgéniques permet de conférer un niveau de résistance accru vis à vis de d'une infection fongique. Résistance antibactérienne
Nous avons également testé la résistance des plantes transgéniques exprimant la β mégaspermine sous le contrôle du promoteur COMT II vis à vis d'une bactérie, Erwinia carotovora. Cette bactérie est un agent pathogène bien connu de la pomme de terre et est capable de macérer les tissus végétaux par la synthèse d'enzymes pectinolytiques. Cependant elle peut également infecter d'autres plantes tel le tabac.
Pour ce test, une suspension d'E. carotovora a été infiltrée dans les feuilles des plantes transgéniques COMT II::mégaspermine ainsi que dans les feuilles des plantes contrôles (correspondant aux plantes transgéniques pour le gène chimérique COMT II::GUS). Une population de 7 plantes a été inoculée pour chacun des transformants. Deux jours après inoculation des bactéries, 60% des plantes contrôles (4 plantes sur 7) présentent des symptômes d'infection sévères, les feuilles inoculées sont entièrement macérées et l'infection tend à se propager au niveau de la plante entière. A l'inverse 85% des plantes transgéniques exprimant la β mégaspermine sous Je contrôle du promoteur COMTII (6 plantes sur 7) sont résistantes à l'infection bactérienne.
Ces résultats montrent que l'expression induite de l'élicitine accroît fortement la résistance vis à vis d'E. carotovora. Nous avons précédemment montré que le promoteur COMT II était inductible par des éliciteurs secondaires parmi lesquels les fragments pectiques. Ainsi nous pouvons supposer que les fragments pectiques produits lors de la lyse des tissus végétaux induisent le promoteur COMT II et par conséquent la synthèse de β mégaspermine. Cependant le mécanisme permettant la mise en place de la résistance antibactérienne reste encore à déterminer.
Matériel et méthodes
Criblage d'une banque génomique et identification du clone correspondant au gène exprimé pendant la réponse de défense.
Une banque d'ADN génomique de tabac (Nicotiana tabacum var. Xanthi) construite dans λ-ΕMBL3 (Clontech) a été criblée avec une sonde radioactive d'ADNc de COMT II (Pellegrini & al., 1993). Six clones génomiques positifs ont été isolés après quatre tours de purification. Ces clones purifiés ont été testés par PCR pour identifier celui qui comprend le gène COMT exprimé pendant la réponse d'hypersensibilité (HR) des feuilles de tabac au VMT. Les amorces 5' et 3' pour l'analyse PCR sont représentés par les oligonucléotides 1 et 2 ci-dessous (SΕQ ID NO 4 et SΕQ ID NO 5 respectivement) :
Oligθl:5' CGTTTCGCAA TGTGATTTGA TC 3' Oligo2:5' CTCAAAATGA CATCCTTTCA TAC 3'
Ils sont dérivés de la région non traduite en 3' de l'ADNc de COMT II. L'analyse PCR est effectuée à 62 °C (température de fusion théorique) de manière à promouvoir une hybridation spécifique. Un seul clone permet l'amplification du fragment attendu de
400 paires de bases comme le fait l'ADNc employé comme contrôle positif. Le clone génomique de COMT II a été purifié sur Quiagen tip selon le protocole décrit par le fabriquant et sous clone dans le site de restriction Sali du vecteur plasmide pue 18. Séquençage de l'ADN.
Le séquençage de l'ADN a été effectué sur l'ADN double brin dénaturé selon la méthode de Sânger & al. (1977) en employant le le kit " rhodamin dye terminator cycle ready " avec l'ADN polymérase FS ampliPaq (Perkin-Elmer, P/N402078) et un séquenceur Applied Biosystems 373 (Perkin-Elmer). La séquence a été déterminée sur les deux brins avec des recouvrements en employant des amorces synthétisées à partir de séquences déjà déterminées. Analyse des produits d'extension d'amorces.
La réaction d'extension des amorces a été effectuée sur l'ARN total selon la méthode décrite dans Current Protocols in Molecular Biology (Trienzenberg, 1992).
L'ARN total isolé de feuilles de tabacs infectées par le VMT et de feuilles de tabacs non infectées (comme contrôle négatif) a été hybride à Foligonucléotide suivant (SEQ ID NO 6), complémentaire de l'ARNm du COMT II et marqué à l'extrémité 5' :
Oligo3:5' CTGAAGATGT CAATAGTTGC ATGGC 3'
Le produit de l'extension a été séparé sur un gel de polyacrylamide à 6 %. La localisation du site d'initiation de la transcription a été déterminée sur la base de la comigration des produits d'extension avec l'échelle de séquence de la obtenue à partir de la région correspondante du gène (Sânger & al., 1977). Construction des plasmides.
Les versions tronquées du promoteur COMTII ont été amplifiés par PCR en employant les amorces PAS1 en 3' et PSI, PS2, PS3 et PS4 en 5' représentés ci-après (SEQ ID NO 7 à 11 respectivement), conduisant respectivement à l'amplification des fragments nucléotidiques de longueurs suivantes : -1215/+24, (nouveaux construits dupérieurs à 600 bp) -420/+24, -313/+24 et -121/+24 (numérotation relative au site d'initiation de la transcription).
PAS1 5' GGTCTAGAGG GCCTTTTAGA GTGTTTTTGT TAG 3'
PSI 5' AAAGTCGACC GTCCACCTGT GCCAACAAT 3'
PS2 5' TGTTTGGTGT TATGCTTCCG TCCT 3'
PS3 5' AAAAAGCTTT TTTAGGATGG AGTACAGCC 3'
PS4 5' TTTAAGCTTA AAGAGAACCA GACAATATT 3' Les construits -1728/+24, -1471/+24, -956/+24, -937/+24, -882/+24, -746/+24, - 676/+24, -560/+24, -435/+24, ont été obtenus avec les amorces PAS2 en 3' et respectivement les amorces PS5, PS6, PS7, PS8, PS9, PS10, PSI 1, PS12 et PS13 en 5' présentées ci après (SEQ ID NO 15 à 24 respectivement): PAS2 : 5 ' CGCGGATCCC CTTTTAGAGT GTTTTTGTTA GGC 3 '
PS5 : 5 ' ACGCGTCGAC GTTAGGGACA ATCTATAGTG TCAC 3 ' PS β : 5 ' ACGCGTCGAC GCTCCGAGGA TTTGGCTGTC GCGG 3 ' PS7 : 5 ' ACGCGTCGAC GCTGGTTAGG TGAAGTAAAG CATG 3 ' PS 8 : 5 ' ACGCGTCGAC GCATGTTATA TGAGGAAAGT ACG 3 ' PS 9 : 5 ' ACGCGTCGAC GCAGCCAGCA CAAGCAAATT CGC 3 '
PS 10 : 5 ' ACGCGTCGAC GACTTTAACA CACCAACTCC C 3 ' PS11 : 5 ' ACGCGTCGAC CGGATCTAGA ATTTGGGTTC ATTC 3 ' PS 12 : 5 ' ACGCGTCGAC GTGTATACTC CACGTCTCCG GATAC 3 ' PS 13 : 5 ' ACGCGTCGAC GTTCAATGTT AGGTGTGTTT GG 3 ' La séquence -1073/-406 qui a été placée en amont du promoteur 35S minimum a été obtenue en utilisant l'amorce PAS3 en 3' et l'amorce PS14 en 5' (SEQ ID NO 25 et 26):
PAS3 : 5 ' CGCGGATCCG CTTAACACCA AACACACCTA ACATTG 3 '
PS 14 : 5 ' ACGCGTCGAC CAGTGGTGAG TTTAGCTGTC 3 ' L'amplification a été effectuée pendant 30 cycles avec une étape initiale de 4 min à 95°C et une étape finale de 5 min à 72°C, en utilisant le clone génomique comme matrice. Chaque cycle consiste en 1 min à 95°C suivie d' 1 min d'hybridation puis de
1,5-2 min à 72°C.L'étape d'hybridation est réalisée à 54°C, 59°C, 55°C, et 50°C pour amplifier ,respectivement,les fragments -1215/+24, -420/+24, -313/+24 et -121/+24. Pour tous les autres fragments du promoteur, la température d'hybridation est de
60°C. Après sous-clonage dans le plasmide pGEM-T (Promega) et amplification dans E.
Coli, le fragment de promoteur -1215/+24 est digéré par Sali et Xbal, les sites correspondants étant présents dans les amorces PSI et PSA1 respectivement. Les fragments de promoteur de 420, 313 et 121 paires de bases sont digérés avec HindlII et Xbal (le site pour HindlII est présent dans les amorces PS2, PS3 et PS4, et le site Xbal dans l'amorce PASl).Les fragments -1768/+24, -1471/+24,-956/+24, -937/+24, -
882/+24, -746/+24, -676/+24, -560/+24 et -435/+24 sont digérés par BamHl présent dans PAS2 et PAS3 et par Sali présent dans les amorces PS5 à PS 14. Tous les fragments sont clones dans le plasmide pBHOl (Qiagen) de façon à créer une fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS. Tous les construits sont séquences pour confirmer leur structure et les frontières de jonction.
Le construit constitué du promoteur 35S du CaMV en amont du gène de la mégaspermine a été obtenu en remplaçant le gène Gus par le gène de la mégaspermine (SEQ ID NO 12) dans le plasmide pBil 21 (Clontech).
Clonage de l'ADNc de Phytophthora megasperma
10 mg d'ARN totaux de Phytophthora megasperma sont utilisés comme matrice pour la synthèse du premier brin. Les ARN totaux sont chauffés 3 min à 65°C, refroidis sur glace, et incubés 2 h à 42°C dans 50 ml de tampon de transcription inverse (50 mM Tris-HCL pH 8,3 - 15 mM MgCl2 - 75 mM KCL - 1 mM DTT) contenant 1 mM de chaque dNTP, 40 pmol d'amorce anti-sens correspondant à l'oligodT, et 20 U de transcriptase inverse d'AMV (virus de la myéloblastose aviaire). Le mélange est chauffé a 94°C pour stopper la réaction. Après précipitation du mélange réactionnnel à l'éthanol, le culot est dissous dans de l'eau stérile distillée. La synthèse du second brin est initiée par la Taq ADN polymérase. 1/20 du produit de transcription inverse est utilisé pour l'amplification par PCR dans 50 ml de tampon (10 mM Tris-HCL pH 8,3 - 50 mM KCL - 1,5 mM MgCl2 - 0,01% BSA), 200 mM de dNTP, 0,1 mM d'amorces sens et anti-sens et 1 unité de Taq. L'amorce sens (5'
ATGAACTTCACCGCTCTGCT 3') dérive de la séquence nucléotidique de la cryptogéine, l'amorce anti-sens correspond à l'oligodT possédant les sites de restriction
Sstl-EcoRI-HindIII à son extrémité 5'. Le mélange réactionnel est chauffé pendant 3 min à 94°C, puis est soumis à 30 cycles de réaction comprenant chacun 3 étapes : 1 min à 94°C, 1 min à 49°C et 1 min à 72°C. Après le dernier cycle, l'élongation est poursuivie 10 min à 72°C. Le produit d'amplification obtenu est ensuite clone dans le vecteur pGEM (Promega) afin d'être séquence.
Transformation des plantes
Les différents construits promoteur COMTII-GUS obtenus précédemment dans le plasmide pBHOl sont introduits dans une souche d'Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM6000) (Rossi & al., 1993) par électroporation (Nagel & al., 1990). Les plants de tabac (Nicotiana tabacum cv Samsun NN) sont transformés par infiltration d'Agrobacterium sur des plants de 10 jours (Rossi & al., 1993). Les plantes sont régénérées sur un milieu Murashige & Skoog (MS) (GIBCO BRL) supplémenté avec du saccharose (30 g/1 pour la formation des tiges et 15 g/1 pour la formation des racines), de la 6-benzylaminopurine (Serva) (2 mg/ml), et de l'acide naphtalène acétique (Serva) (0,05 mg/ml). La kanamycine (150 mg/ml) est employée comme agent de sélection durant les étapes de régénération in vitro et de propagation. Des plantes contrôles ont été préparées par transformation avec le vecteur vide pBHOl ou le vecteur p min GUS (contenant le gène rapporteur GUS sous contrôle du promoteur minimum du RNA 35 S du CaMV). Sept à 20 transformants indépendants sont régénérés pour chaque construit. Les transformants primaires sont auto fécondés et les graines FI sont germées sur un milieu MS comprenant 300 mg/1 de kanamycine. Essais enzymatiques
La localisation histochimique du GUS dans les plantes transgéniques est effectuée selon la méthode décrite par Jefferson & al. (1987). La réaction histochimique est incubée dans l'obscurité à 37°C pendant 12 heures. Les tissus sont rincés, d'abord avec un tampon phosphate 50 mM pour terminer la réaction, puis plusieurs fois avec de l'éthanol de 70% à 90% pour éliminer la pigmentation des tissus. Après la réaction histochimique, les tissus sont rincés dans l'éthanol à 70%> et sont inclus dans une historésine de fixation (Jung) pour des sections transversales de feuilles. Les blocs d'historésines sont coupés avec un microtome et des photographies sont prises à un grossissement de 10 à 40 fois par un microscope binoculaire. Le dosage des activités COMTII et GUS a été effectué sur lOOmg de tissus. Le tissu est homogénisé dans un tampon phosphate de sodium lOOmM à pH 7,5 et 10 mM de DTT après addition de polyclar AT (Serva) et de quartz. Les extraits bruts sont clarifiés par centrifugation et par filtration sur de la laine de verre. La mesure des activités GUS et COMTII est effectuée sur les même extraits bruts. Pour la mesure de l'activité COMTII, un aliquote de l'extrait protéique est ajouté à 1 ml de tampon phosphate comprenant lOOμM de catéchol, 50μM de S-adénosyl-L-méthionine tritiée (1,5 105 cpm/ml) et incubé pendant 3 heures à 37°C. La réaction est stoppée par addition de lOOμl d'acide sulfurique 9M. Le produit radioactif de la réaction, l'acide ferulique, est extrait par 5 ml d'une solution NA de scintillation (Beckman) et la radioactivité est comptée sur un appareil Beckman LS 9000. La mesure fluorimétrique de l'activité GUS est effectuée sur les mêmes échantillons selon la procédure de Jefferson & al. (1987). Le contenu protéique est déterminé par la méthode de Bradford (1976) en employant les réactifs Biorad.
Construits COMTII-meg et 35S-meg
Le vecteur pGEM (Promega) ne possédant pas les sites de clonage compatibles ceux du pBHOl, une étape de sous clonage dans le vecteur Bluescript (pSK) a été nécessaire. L'insert BamHI/SstI provenant du pSK::mégaspermine a été purifié pour le clonage dans le vecteur binaire pBilOl (Clontech).
Le vecteur pBil01 ::CO T //-G£/S précédemment construit et correspondant au promoteur -1215/+24 fusionné au gène rapporteur GUS a été utilisé pour obtenir le gène chimérique comt II-meg. Le gène GUS est excisé par digestion du plasmide binaire par BamHI et Sstl. Un site SnabI présent dans le gène GUS permet de couper celui-ci et évite qu'il se religue avec le plasmide binaire puisque aucune étape de purification du vecteur n'est effectuée. Les enzymes de restriction sont inactivées par la chaleur. L'ADN digéré est extrait par un mélange phénol : chloroforme (1 : 1), puis chloroforme : alcool isoamilique (24 : 1) et précipité à l'éthanol. L'ADN digéré est remis en suspension dans de l'eau stérile et ligué avec l'insert.
Le vecteur pBil21 (Clontech) portant le gène 35S-GUS a été utilisé pour obtenir le gène chimérique 35S-meg. Le clonage est effectué selon la méthode décrite précédemment.
Les constructions ont été ensuite vérifiées par séquençage. Plants de tabac.
Les plants de tabac transgéniques (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont cultivés in vitro sous un cycle de lumière de 12h(24°C)/12(20°C) pendant 5 semaines après la germination. Ils sont propagés sur un milieu MS avec addition de kanamycine
(150 mg/1) comme agent de sélection. Ils sont ensuite transférés en serre et cultivés en sol sous un cycle de lumière 16h/8h à 22°+2°C.
Analyse des ARN de plantes par Northern Extraction des ARN totaux
Les tissus sont finement broyés dans de l'azote liquide, puis dans 1 à 2 volumes de tampon d'extraction (0,2 M borate de sodium pH 9 - 30 mM EGTA - SDS 1% - 5 mM DTT). Le mélange est versé dans un tube contenant 1 volume de phénol/chloroforme (1 :1), vortexé, puis centrifugé 10 min à 5000g. Une deuxième extraction au phénol/chloroforme (1 :1) est réalisée, suivie d'une troisième au chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Les ARN présents dans le surnageant sont spécifiquement précipités par addition de 1 volume d'une solution de LiCl (4 M) EDTA (10 mM) pendant une nuit à 0°C. Le tout est centrifugé 30 min à 10000g et le culot est lavé avec une solution de LiCl (2 M), EDTA (5 mM). Les ARN totaux sont repris dans de l'eau et à nouveau précipités à l'éthanol 70%, NaCl (0,2 mM). Après centrifugation 30 min à 10000 g, le culot est lavé deux fois à l'éthanol 70%, puis repris dans 50 μl d'eau. Les ARN sont dosés en mesurant l'absorbance d'une solution diluée à 260 (1 unité DO260 ~ 40 μg/ml d'ARN), et leur intégrité est vérifiée par migration sur un gel d'agarose non dénaturant coloré au BET. Electrophorèse
Les ARN sont séparés sur gel d'agarose dénaturant préparé dans un tampon MOPS xl contenant 16% de formaldéhyde. Des gels de 1,2%) d'agarose (p/v) ont été utilisés. Les échantillons d'ARN sont dénaturés 15 min à 65°C en présence de 3 volumes de solution de dénaturation (MOPS x5 lOμl, formamide 50μl, formaldéhyde 16μl) par volume d'ARN, et refroidis rapidement dans la glace. Du tampon de charge est ajouté (MOPSxl, glycérol 50 % , bleu de bromophénol 0,05 %>) à raison de 1/10 du volume. Après migration dans du tampon MOPS xl, le gel peut être coloré au BET (0,5 μg/ml) 1 à 2 min, puis abondamment lavé à l'eau stérile. Les ARN sont alors visualisés sous lumière UV.
"Northern Blot"
La technique du "Northern-blot" permet de détecter, parmi les ARN totaux, les messagers homologues à une sonde d'ADN radioactive. Celle ci est réalisée à l'aide du kit de "Random Priming" (Amersham) en suivant le protocole fourni. 10 μg d'ARN totaux de tige ou de feuille sont déposés sur gel d'agarose 1,2%
(p/v) dénaturant ainsi qu'un marqueur de taille d'ARN (Promega) déposé en bordure du gel. Après migration, le gel est rincé à l'eau stérile afin d'enlever l'excès de formaldéhyde. La bande de migration correspondant au marqueur de taille est découpée, colorée au BET et photographiée. Les ARN sont transférés par capillarité pendant 5 h sur une membrane de Nylon positivement chargée (Hybond N+, Amersham) avec du tampon SSC x20. Après transfert la membrane est rincée dans le tampon SSC x2 et les ARN sont fixés de façon covalente sur la membrane de nylon par exposition à la lumière ultraviolette (1200 J, UV Stratalinker 2400, Stratagene). La membrane est hybridée à une sonde radioactive et traitée comme décrit dans Sambrook et al..
Analyse des protéines de plantes par Western
Extraction des protéines foliaires
L'extraction peut se faire immédiatement après la récolte ou sur des échantillons congelés. 150 g de tissus foliaires sont broyés au mortier dans du tampon acétate de sodium 0.5 M pH 5.2 contenant du 2-β-mercaptoéthanol (15 mM) et du charbon actif. Le volume de tampon est ajusté de manière à obtenir un broyât fin et homogène. Celui- ci est ensuite filtré sur gaze puis centrifugé pendant 30 min à 15 000 g. Le surnageant constituant l'extrait brut est alors analysé. Dosage des protéines
La concentration protéique des extraits bruts est dosée par la méthode de Bradford (1976) dans des plaques de microtitration : à 10 μl d'un extrait à tester sont ajoutés 200 μl de réactif de Bradford xl (Biorad). 2 μl d'extrait brut de feuille sont complétés à 10 μl par du tampon. Chaque échantillon est testé trois fois. Après 5 à 10 min, la plaque est lue au spectrophotomètre MR 700 (Dynatech) avec le filtre 5 (660 nm). Le blanc est constitué de 10 μl de tampon et les valeurs sont comparées à une gamme étalon réalisée avec de la sérum-albumine bovine (SAB, Sigma).
Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant
L'analyse sur gel permet de déterminer la masse moléculaire des protéines en comparant leur mobilité relative à celles de protéines de masse moléculaire connue. A l'extrait protéique est ajouté 20% (v/v) de tampon de charge (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% (v/v) 2-β-mercaptoéthanol, 10% (v/v) glycérol, 0.01% (v/v) bleu de bromophénol,
1% SDS). Les échantillons sont chauffés à 100°C pendant 1 min avant d'être déposés.
Les gels (0.75 mm x 7 cm x 9 cm) sont coulés entre une plaque de verre et une plaque d'alumine. Le tampon d'électrophorèse est composé de 192 mM glycine, 25 mM Tris et
0.1% SDS. La migration verticale est réalisée dans une cuve d'électrophorèse Hoeffner à une intensité de 20 mA par gel pour une tension de 100 à 160 V.
Transfert et immunodétection des protéines sur nitrocellulose (Western-Blot) Après migration électrophorétique sur gel d'acrylamide, les protéines peuvent être transférées, en milieu liquide dans le tampon de transfert (0,16 M Tris - 1,20 M glycine), sur membrane de type nitrocellulose ou nylon PVDF (Immobilon, Millipore). Avant le transfert le gel est équilibré dans le tampon de transfert. La membrane PVDF est activée 1 min dans le méthanol puis équilibrée également dans le tampon de transfert. L'électrotransfert s'effectue pendant 90 min à 150 mA.
L'immunodétection a été réalisée grâce à des anticorps spécifiques dirigés contre la mégaspermine ou la protéine de coque du VML. La révélation est effectuée par chimioluminescence avec le kit ECL (Amersham).
Traitement des plantes. Avant le traitement, les plantes sont conditionnées quelques jours dans une logette climatisée à 22°C ± 1°C, sous une luminosité de 5000 lux et une photopériode J/N de 16h/8h. Ces conditions sont maintenues durant l'infection, à l'exception de l' infection par Erwinia carotovora.
Inoculation du virus de la mosaïque du tabac (VMT)
Les feuilles de plants de tabac cultivées en serre et âgées de 6 semaines, sont frottées à l'aide d'un coton préalablement imbibé dans une suspension de VMT purifié (souche commune Ul 0,1 à 1 μg/ml) contenant un abrasif, la célite (10 mg/ml). Les feuilles de vitroplants de tabac, âgés de 6 à 7 semaines après repiquage, sont frottées à l'aide d'une spatule en verre fritte préalablement immergée dans une suspension de VMT purifié (souche commune Ul à 4 μg/ml, filtrée sur membrane de 0,45 μm) et un abrasif, la célite (10 mg / ml). Après quelques minutes de contact, les feuilles sont rincées à l'eau pour enlever l'excès de célite et de particules virales. Inoculation du virus de la mosaïque de la luzerne (VML)
Les feuilles de plants de tabac, âgés de 6 semaines, sont frottées à l'aide d'une spatule en verre trempée dans une solution tampon contenant l'ARN viral (1 à 5 μg/ml) et un abrasif, la célite (10 mg/ml). L'inoculum par feuille (pour une plante) correspond à
200 ml de solution tampon : Kpi , pH 7,2, 0,04M, 1 ml RNAsine, DTT ImM final, Macaloïd (0,05%), ARN total de levure 0,25 mg/ml, ARN viral (1 à 5 μg/ml) Inoculation de Phytophthora parasitica var. nicotianae
Le mycélium de P. p. nicotianae est cultivé sur boîte de Pétri contenant un milieu solide (milieu avoine : 100 g de graines d'avoine broyées sont mises en suspension dans 1 1 d'eau distillée. Le milieu est filtré sur gaze. Le milieu est autoclave après addition de 15 g d'agar).
L'inoculation a été effectuée après décapitation des plants de tabac. La tige de plants de tabac âgés de 10 semaines est sectionnée sous le bourgeon apical. Une pastille de mycélium de P. p. nicotianae est prélevée en périphérie d'une culture de 7 jours sur milieu d'avoine et est déposée sur la section de la tige. La tige mise en contact avec la pastille de mycélium est en capsulée dans une feuille d'aluminium afin d'éviter une dessiccation trop rapide des tissus au site d'inoculation.
Inoculation d'Erwinia carotovora
La souche d'Erwinia carotovora est mise en culture toute une nuit à 28°C dans du milieu LB. Après centrifugation, le culot bactérien est repris dans une solution de
7 MgSθ4 ( 1 OmM) pour obtenir une concentration bactérienne approximative de 1.10 cfu
(colony-forming unitsVml. Les feuilles de plants de tabac âgés de 4 à 5 semaines sont infiltrées par cette suspension bactérienne. Un seul site est inoculé par feuille, en infiltrant à l'aide d'un pipette-man 50 ml de la suspension bactérienne. Les plantes sont placées ensuite en logettes en condition d'humidité élevée et à une température de 26°C ± 1 °C pendant l'infection.
Traitement par un éliciteur : Des solutions sont infiltrées par un seringue équipée d'une aiguille fine dans le mésophyle des feuilles. Les zones infiltrées sont délimitées avec un marqueur " felt-tip ". Les zones infiltrées sont récoltées 16 heures après le traitement. Les feuilles sont traitées avec une solution de β-mégaspermine, un éliciteur protéique purifié d'un milieu de culture de Phytophthora megasperma (Kauffmann & al., 1993), ou d'oligosaccharides comme les oligomères de chitine (100 μg/ml), des fragments de glucane (200 μg/ml), et des fragments de pectines (200 μg/ml). Les plantes témoins sont infiltrées avec de l'eau.
Blessure : Des feuilles totalement développées sont blessées avec un hémostat ou percées avec des aiguilles. Les feuilles blessées sont ensuite récoltées 16 ou 24 heures après blessure pour les analyses fluorimétriques ou histochimiques.
Traitement UV : La partie supérieure de plantes transgéniques âgées de 5 semaines est exposée aux rayons UV (l=254nm) pendant 10 minutes puis les plantes sont placées dans l'obscurité jusqu'à la collecte des tissus 16 heures suivant le traitement.
Traitements chimiques : (1) Des solutions de SA (ImM) ou de INA (50mM) sont infiltrées dans les feuilles de tabac en employant le protocole décrit pour le traitement par des éliciteurs. (2) Sous des conditions de culture identiques, on pulvérise sur les plantes transgéniques des solutions de SA (lOmM), INA (ImM) ou BTH (50mM). Les tissus sont recueillis 16 heures après traitement. Les plantes traitées avec de l'eau sont utilisées comme témoin. (3) Des plantes âgées de sept semaines ou des feuilles de vitroplants en survie sur de l'eau sont transférées dans des boites transparentes et hermétiques et soumises à une atmosphère de 3,5mM de MeJa (Serva). Les tissus sont prélevés à différents temps suivant le traitement. Les plantes témoins sont placées dans les même boites sans MeJa.
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Claims

Revendications
1. Fragment d'acide nucléique comprenant un promoteur de plante inductible, caractérisé en ce que ledit promoteur inductible est constitué par le promoteur d'un gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante.
2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un promoteur de COMT II de plante.
3. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le promoteur est activé par les blessures, les infections virales, les agressions aux rayons UV, les agressions chimiques, ou les agressions par pathogène, un insecte ou un nématode
4. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la COMTII de plante est une COMT de plante qui n'est pas exprimée dans les plantes saines non traitées, mais qui est exprimée à la suite d'une agression mécanique, chimique, ou par un pathogène, un insecte ou un nématode.
5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la plante est une plante monocotylédone ou dicotylédone, en particulier choisie parmi le riz, le blé, l'orge, le tournesol, le maïs, le tabac, le colza, le soja ou Arabidopsis thaliana.
6. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la plante est une plante dicotylédone, de préférence le tabac.
7. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence en 5' du site d'initiation de la traduction ou codon " start " (ATG) de la séquence codante de la COMTII permettant la transcription et l'expression de ladite séquence codante.
8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1 à 7, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de plus de 600 nucléotides en amont de l'ATG de la COMTII, de préférence de plus de 1000 nucléotides en amont de l'ATG, plus préférentiellement de plus de 1200 nucléotides en amont de l'ATG.
9. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le promoteur comprend un site d'initiation de la transcription situé à moins de 100 nucléotides en amont de l'ATG, avantageusement à environ 90 nucléotides en amont.
10. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'extrémité 3' du promoteur est située entre le site d'initiation de la transcription et l'ATG.
11. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé ce que l'extrémité 3' du promoteur est située entre 10 et 50 nucléotides en aval du site d'initiation de la transcription, plus préférentiellement entre 20 et 40 nucléotides en aval, encore plus préférentiellement entre 20 et 30 nucléotides en aval.
12. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il est constitué par le promoteur COMTII de tabac défini par la séquence nucléotidique en amont de l'ATG représentée par l'identificateur de séquence 1 (SEQ ID NO 1), les séquences capables de s'hybrider de manière sélective à ladite séquence et les séquences homologues.
13. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 12, caractérise en ce qu'il est constitué, par la séquence comprise entre les nucléotides 557 et 1796 de l'identificateur de séquence n° 1
14. Gène chimère (ou cassette d'expression) fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', caractérisé en ce que la séquence de régulation en 5' comprend le fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
15. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence codante comprend une séquence codante pour un gène rapporteur ou une séquence codante pour une protéine d'intérêt.
16. Gène chimère selon la revendication 15, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes.
17. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine ou peptide d'intérrêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines.
18. Gène chimère selon la revendication 17, caractérisé en ce que le peptide éliciteur fongique est la mégaspermine.
19. Gène chimère selon la revendication 18, caractérisé en ce que la mégaspermine est représentée par l'identificateur de séquence n° 13 (SEQ ID 13).
20. Gène chimère selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n° 14 (SEQ ID 14).
21. Gène chimère fonctionnel dans les cellules végétales et les plantes caractérisé en ce qu'il comprend dans le sens de la transcription une séquence de régulation en 5' comprenant un promoteur inductible, une séquence codante pour un éliciteur et une séquence de régulation en 3'.
22. Gène chimère selon la revendication 21, caractérisé en ce l'éliciteur est défini dans les revendications 17 à 19.
23. Gène chimère selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que le promoteur inductible est choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB, le promoteur HMG2, le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme.
24. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon les revendications 14 à 23.
25. Procédé de transformation des cellules végétales, caractérisé en ce qu'il consiste à intégrer au génome des dites cellules végétales au moins un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 23.
26. Cellules végétales transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 23.
27. Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un gène chimère selon les revendications 14 à 23.
28. Plantes, caractérisées en ce qu'elles contiennent des cellules transformées selon la revendication 26 ou obtenues par le procédé selon la revendication 25.
29. Plantes selon la revendication 28, caractérisées en ce qu'elles sont régénérées à partir des cellules transformées selon la revendication 19 ou obtenues par le procédé selon la revendication 18.
30. Plantes issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 29.
31. Plantes selon l'une des revendications 27 à 30, caractérisées en ce qu'elles sont du type monocotylédones, en particulier les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs, ou dicotylédones, en particulier le tabac, la soja, le colza, le coton, le tournesol, la betterave, le trèfle.
32. Graines des plantes selon l'une des revendications 27 à 31.
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