FR2889540A1 - Promoteur de proteine se fixant aux a/c de chlorophylle specifique aux feuilles - Google Patents

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Abstract

La présente invention décrit une séquence promoteur de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle à récolte légère pGWLS01 isolée de la feuille du palmier à huile. Ce promoteur permet la manipulation de feuilles de palmier à huile pour la production de produits à haute valeur ajoutée par des outils de génie génétique. Les caractéristiques nouvelles du promoteur lui-même qui régulent l'expression élevée et spécifique de gènes étrangers dans les feuilles éviteront l'interférence de nouveaux produits dans l'huile de consommation extraite de tissus de noyau et de mésocarpe. Le promoteur est, de plus, également potentiellement utile dans la production de palmier résistant aux insectes.

Description

PROMOTEUR DE PROTÉINE SE FIXANT AUX A/C DE CHLOROPHYLLE
SPÉCIFIQUE AUX FEUILLES Domaine technique de l'invention L'invention concerne un gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle de type I avec une expression abondante et spécifique dans la feuille de la famille Palmae, sa séquence de régulation, et l'utilisation de sa séquence de régulation pour contrôler l'expression de gènes étrangers pour produire des produits à haute valeur ajoutée dans les feuilles de plantes transgéniques.
Arrière-plan La présente invention concerne la séquence promoteur du gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle à récolte légère pGWLS01 qui a été isolé du génome du palmier à huile. La présence de cette séquence promoteur permettra la manipulation de feuilles de palmier à huile pour la production de produit à haute valeur ajoutée par l'introduction de gènes étrangers dans le génome du palmier à huile en utilisant des outils de génie génétique. Le promoteur est, de plus, également potentiellement utile dans la production de palmier résistant aux insectes aux fins de protection des récoltes. Les caractéristiques nouvelles du promoteur lui-même qui régulent l'expression élevée et spécifique de gènes étrangers dans les feuilles éviteront l'interférence de nouveaux produits dans l'huile de consommation extraite de tissus de noyau et de mésocarpe. La présence de feuilles dans tout le cycle de vie des plantes permettra également une récolte précoce et une fourniture continue de nouveaux métabolites.
Trois approches différentes (RT-PCR, recherche dans banque d'ADNc et 5'RACE) ont été employées dans l'isolation d'ADNc qui code pour le gène de protéine se fixant sur les a/c de chlorophylle à récolte légère (LSO1). Le RT-PCR et la recherche dans la banque d'ADNc de feuilles ont eu pour résultat l'isolation de la séquence d'ADNc LSO1 partielle avec séquence poly(A)+. La réaction 5'-RACE a produit ensuite une séquence complète de LSO1. Il a été constaté que ce clone présentait 86 % et plus d'homologie au niveau des acides aminés avec les séquences d'acides aminés déduites de Lhcbl d'ADNc de photosystème 11 isolés de 9 plantes monocotylédones et dicotylédones différentes (base de données GenBank). De plus, le CLO du gène LSO1 code, également, à la fois, pour le peptide de transit et la protéine mature. Le peptide de transit est nécessaire pour le transport du gène LSO1 dans le chloroplaste.
Le nombre de copies de gène de LSO1 a été déterminé par analyse par buvardage de Southern. La sonde spécifique au gène d'extrémité 3' utilisée dans l'analyse a été capable de distinguer le LSO1 d'autres membres de cette famille de gènes. On a trouvé une seule copie de ce gène dans le génome du palmier à huile. Dans l'analyse de Northern, l'expression du transcrit LSO1 était élevée et forte dans les feuilles vertes jeunes et matures. Comme pour les feuilles lancéolées jaunâtres, un niveau inférieur d'expression a été observé. L'expression du transcrit LSO1 n'a cependant pas été détectée dans les tissus non photosynthétiques, tels que noyau, mésocarpe, semences germées et fleur.
L'approche de la marche sur le génome a été utilisée avec succès pour isoler le promoteur LSO1. La présence d'amorces spécifiques au gène, à la fois, dans la PCR primaire et secondaire a été capable d'amplifier le clone génomique d'intérêt à partir d'un groupe d'ADN génomique lié d'adapteur et digéré. La même approche a, de plus, été utilisée pour étudier la structure du clone génomique LSO1. Il a été observé que des introns étaient absents de la séquence génomique LSO1.
La force et la spécificité du promoteur LSO1 ont été confirmées par un système d'essai transitoire et une analyse transgénique utilisant un plant modèle, Arabidopsis thaliana. Dans l'essai GUS transitoire, le promoteur LSO1 a été cloné dans le vecteur pB122I portant GUS comme gène rapporteur après élimination du promoteur CaMV 35S. Comme pour l'essai de PFV transitoire, le promoteur LSO1 a été cloné dans le vecteur sans promoteur pEGFP portant une PFV comme gène rapporteur. Les deux ADN plasmidiques ont été utilisés dans le bombardement de tissus de feuilles de palmier à huile et de coupes de mésocarpe comme témoin. Les résultats obtenus dans l'essai GUS et la détection de PFV ont confirmé que le promoteur LSO1 était capable de commander l'expression des gènes rapporteurs uniquement dans le tissu foliaire. Dans le travail Arabidopsis, la plante modèle a été transformée par Agrobacterium en portant un vecteur binaire hébergeant le promoteur spécifique aux feuilles qui contrôle un gène rapporteur (GUS). Une plante transgénique portant le promoteur spécifique aux feuilles a été plantée jusqu'à la troisième génération de manière à obtenir une intégration stable des transgènes dans le génome d'Arabidopsis. Les résultats de la coloration GUS du plant Arabidopsis ont confirmé, en outre, la spécificité aux feuilles du promoteur LSO1.
Résumé de l'invention En conséquence, l'objet principal de la présente invention est de fournir une séquence promoteur de gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle isolée du palmier à huile, dans lequel la séquence promoteur présente une spécificité aux feuilles.
Un autre objet de la présente invention est de fournir une séquence promoteur pour contrôler l'expression spécifique aux feuilles de gènes étrangers codant pour la protéine.
Un autre objet de la présente invention est d'utiliser la séquence partielle ou complète d'ADNc de LSO1 ou un promoteur pour isoler une séquence promoteur ou de régulation.
Un autre objet de la présente invention est de fournir une construction d'ADN recombinant contenant le promoteur LSO1 pour transformer des cellules végétales, des tissus végétaux ou des parties de plantes.
Un autre objet de la présente invention est de fournir des plantes transgéniques résultant de constructions d'ADN recombinant contenant, pour produire des produits à haute valeur ajoutée, des anticorps monoclonaux, des vaccins et d'autres produits pharmaceutiques ou industriels utiles.
Dans un premier aspect, il est donc fourni un acide nucléique isolé comprenant une séquence d'acides nucléiques de régulation qui est au moins identique à 50 % à la séquence exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complément de celle-ci après alignement optimal.
Un acide nucléique isolé est, en outre, fourni, comprenant un acide nucléique de régulation qui s'hybride dans des conditions de stringence faible à la séquence d'acides nucléiques, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complément de celle-ci.
Un acide nucléique isolé est également fourni, comprenant un acide nucléique de régulation, dans lequel une partie de l'acide nucléique, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1, ou un complément de celle-ci, est efficace pour réguler l'expression d'un gène lié de façon opérationnelle.
L'invention fournit, en outre, un acide nucléique isolé comprenant une séquence d'acides nucléiques de régulation, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complément de celle-ci.
En général, il est préféré que l'acide nucléique isolé comprenne une séquence d'acides nucléiques de régulation qui est au moins identique à 50 % à la séquence exposée dans la SEQ ID NO: 1, telle que mentionnée précédemment. Il est cependant également préféré que, si référence est faite à une séquence polynucléotidique, telle que la SEQ ID NO: 1, l'invention s'étend également à la séquence complémentaire de celle-ci, ou à des séquences ayant un degré particulier d'homologie de séquence à ladite séquence complémentaire. La séquence complémentaire peut être déterminée après alignement optimal. La séquence d'acides nucléiques s'hybride, de préférence, dans des conditions de stringence faible, à la séquence d'acides nucléiques, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complément de celle-ci. Il est également préféré que l'acide nucléique isolé comprend un acide nucléique de régulation, dans lequel une partie de l'acide nucléique, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1, ou un complément de celle-ci, est efficace pour réguler l'expression d'un gène lié de façon opérationnelle. Ce qui précède peut être appliqué à tous les aspects de la présente invention.
Lorsqu'il est fixé à un gène rapporteur et introduit dans des tissus photosynthétiques, l'acide nucléique stimule, de préférence, de manière sélective, l'expression du gène rapporteur dans les tissus photosynthétiques. Il est également préféré que lorsqu'il est fixé à un gène rapporteur et introduit dans des tissus foliaires, il stimule de manière sélective l'expression du gène rapporteur dans les tissus foliaires.
Un acide nucléique isolé est également fourni, qui code pour une séquence d'acides aminés exposée dans la SEQ ID NO: 2 ou pour une séquence d'acides aminés qui a plus de 70 % de similarité à la SEQ ID NO: 2 après alignement optimal.
L'acide nucléique code, de préférence, pour une séquence d'acides aminés exposée dans la SEQ ID NO: 2. Il est également préféré que l'acide nucléique a plus de 70 % d'identité à la SEQ ID NO: 3 après alignement optimal ou est capable de s'hybrider à la SEQ ID NO: 3 ou à sa forme complémentaire, dans des conditions de stringence faible.
Les acides nucléiques de la présente invention peuvent être liés de façon opérationnelle à un acide nucléique recombiné.
L'invention fournit également une construction d'acide nucléique, comprenant un acide nucléique suivant la présente invention, dans lequel l'acide nucléique est lié de façon opérationnelle à un acide nucléique recombiné, un vecteur comprenant la construction d'acide nucléique, une cellule comprenant la construction d'acide nucléique, et une plante transgénique comprenant ou transformée par ladite construction d'acide nucléique. La plante est, de préférence, une plante à huile de palme.
L'(acide nucléique) recombiné code, de préférence, pour une protéine qui assure une résistance aux insectes, une production de bioplastique, une production de produits nutraceutiques, une production de macromolécules pharmaceutiques incluant une protéine thérapeutique et diagnostique, des anticorps et des vaccins ou qui a pour résultat une augmentation de l'intensité de la photosynthèse d'une plante, ou qui a pour résultat des changements de teinte de la plante.
La cellule peut comprendre une cellule bactérienne ou une cellule végétale.
Il est préféré que l'expression de l'acide nucléique recombiné dans la plante transgénique entraîne la résistance aux insectes, la production de produits à haute valeur ajoutée, la production de produits nutraceutiques, la production de macromolécules pharmaceutiques incluant une protéine thérapeutique et diagnostique, des anticorps et des vaccins, ou qui a pour résultat une augmentation de l'intensité de la photosynthèse d'une plante, ou qui a pour résultat des changements de teinte de la plante.
La plante est, de préférence, sélectionnée dans le groupe comprenant: Elaeis guineensis Jacq., Elaeis oleifera, des hybrides d'Elaeis guineensis Jacq. et d'Elaeis olifera, du maïs, du riz, du tabac, du coton, de la luzerne, du blé, du soja, du colza, du tournesol, arabidopsis, de la noix de coco, de la pomme de terre, du raisin, Bactris gasipaes et d'autres palmiers.
Il est également préféré que les produits desdites plantes soient destinés à une application industrielle, nutraceutique ou pharmaceutique, ou à améliorer des propriétés agronomiques.
Les polynucléotides ont, de préférence, une homologie de séquence d'au moins 60 % à la SEQ ID NO: 1, plus de préférence, d'au moins 70 %, plus de préférence, d'au moins 80 %, plus de préférence, d'au moins 90 %, plus de préférence, d'au moins 95 %, plus de préférence, d'au moins 99 %, plus de préférence, d'au moins 99,5 %, et le plus de préférence, une homologie de séquence d'au moins 99,9 % à la SEQ ID NO: 1.
Les polypeptides ont, de préférence, une homologie de séquence d'au moins 80 % à la SEQ ID NO: 2, plus de préférence, d'au moins 90 %, plus de préférence, d'au moins 95 %, plus de préférence, d'au moins 99 %, plus de préférence, d'au moins 99,5 %, et le plus de préférence, une homologie de séquence d'au moins 99,9 % à la SEQ ID NO: 2.
Les procédés d'évaluation de l'homologie de séquence sont bien connus dans l'art, mais peuvent inclure l'utilisation du programme BLAST (en utilisant, par exemple, le programme d'analyse de séquence GCG en utilisant des paramètres par défaut standards), par exemple. Des substitutions conservatives utilisant, par exemple, les règles de Dayhof, sont envisagées, telles que sont les délétions et insertions, pour autant, bien entendu, que l'activité fonctionnelle soit sensiblement conservée ou qu'elle code pour un produit d'expression équivalent sur le plan fonctionnel.
Des séquences polynucléotidiques complémentaires peuvent se fixer, dans des conditions de stringence faible ou modérée, bien qu'il soit particulièrement préféré que les conditions soient de stringence élevée, telles qu'exposées ci-dessous.
Les conditions de variation de niveaux de stringence sont bien connues de l'homme du métier et impliquent une combinaison de concentration de sel et de température. Des conditions de stringence élevée peuvent inclure, par exemple, une hybridation à un ADN lié à un filtre dans 0,5 M de NaHPO4, 7 % de laurylsulfate de sodium (SDS), 1 mM d'EDTA à 65 degrés C, et un lavage dans 0,1 x SSC/0,1 % de SDS à 68 degrés C. (Ausubel F.M. et coll., éds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Protocoles actuels en Biologie Moléculaire), Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., et John Wiley & Sons, Inc., NY, à p. 2.10.3).
Des conditions de stringence modérée peuvent inclure, par exemple, un lavage dans 0,2 x SSC/0,1 % de SDS à 42 degrés C (Ausubel et coll., 1989, supra) ou dans 6xSSC et 40 % de formamide à 42 C. Des conditions de stringence faible peuvent inclure 2 x SSC à 65 degrés C ou 6xSSC et 50 % de formamide à 42 C, le processus de lavage étant réalisé dans 6xSSC et 40 % de formamide à 25 C, par exemple.
Des équivalents fonctionnels de la protéine incluent des mutants, qu'ils soient naturellement présents ou élaborés (par mutagenèse dirigée, réarrangement génétique, évolution dirigée, tels que décrits, par exemple, dans les Brevets américains Nos. 5.837.458 et 5.723). L'invention inclut également des variants d'acides nucléiques dégénérés des séquences polynucléotidiques décrites.
Brève description des figures
La figure 1.0 représente les produits de RT-PCR utilisant les amorces CAB(F) et CAB(R). La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1 et 2 sont les produits à 500 pb amplifiés à partir du groupe de gènes exprimés dans des feuilles de palmier à huile.
La figure 2.0 fournit les séquences nucléotidiques et d'acides aminées déduites de pRTLS01.
Les acides aminés sont représentés en codes à lettre unique. La séquence fait partie de la région codante du gène Lhcb.
La figure 3.0 représente les résultats de phagémides digérés sur un gel d'agarose à 1,0 %. Les phagémides ont été obtenus à partir d'une excision in vivo de clones généralement reconnus à partir d'une recherche secondaire dans une bibliothèque. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1, 3, 5 et 7 sont les phagémides non digérés. Les bandes 2, 4, 6 et 8 sont les phagémides digérés par EcoR I et Xho 1.
La figure 4.0 fournit les séquences nucléotidiques et d'acides aminés déduites de pLS01 qui ont été obtenues à partir de la recherche dans la bibliothèque d'ADNc de feuilles de palmier à huile. Les acides aminés dérivés sont représentés en codes à lettre unique. Les séquences consensus pour le signal 2889540 Il de polyadénylation sont soulignées. Le codon d'arrêt (TGA) est désigné par un astérisque (*).
La figure 5.0 représente l'alignement entre des séquences d'acides aminés déduites de pRTLS01 et de pLSOL. Les acides aminés identiques dans les deux séquences sont représentés par un astérisque (*). Une homologie totale de 96 % a été observée.
La figure 6.0 représente les produits de SMART RACE qui ont été amplifiés à partir de l'ADNc de 5'- RACE-Ready en utilisant une amorce spécifique au gène, LS 10. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1, 2 et 3 sont les produits de 1,0 kb de SMART RACE.
La figure 7.0 fournit les séquences nucléotidiques et d'acides aminés déduites de la séquence d'ADNc complète LSO1. Les acides aminés dérivés sont représentés en codes à lettre unique. Le site de début de transcription généralement reconnu est en gras et en italique. Le site de début de traduction est indiqué en caractères gras. Le peptide de transit est souligné. La position marquée par des crochets désigne le premier acide aminé prévu de la protéine mature. Les séquences consensus pour les signaux de polyadénylation sont soulignées et en italique. Le codon d'arrêt (TGA) est désigné par un astérisque (*).
La figure 8.0 fournit la comparaison de la séquence d'acides aminés déduite de LSO1 avec l'acide aminé Lhcb I d'autres plantes. Le premier acide aminé prévu conservé de la protéine mature a été souligné.
Des points ont été introduits pour optimiser l'alignement. L'astérisque (*) représente des acides aminés identiques. Le numéro d'ordre GenBank des séquences se présente comme suit: lentille d'eau (L. gibba AAA33396), coton (G. hirsutum AAA18529), pomme de terre (S. tuberosum AAA80589), tabac (N. sylvestris BAA25388), tomate (L. esculentum AAA34137), soja (G.
max AAA50172), blé (T. aestivum PO4784), riz (O. sativa P 1233) et maïs (Z. mays P06671).
La figure 9.0 fournit les résultats de l'analyse par Northern blot utilisant deux sondes produites par PCR différentes, LS1 et LS2 contenant, respectivement, la séquence complète de LSO1 (9a) et la 3'-UTR de LSO1 (9b). L'ARN total (5 pg/bande) a été fractionné en taille sur du gel d'agarose à 1,2 % et transféré sur une membrane en nylon avant hybridation avec des sondes LS1 et LS2 marquées au 32P. M, S, Y, F et GS représentent l'ARN total isolé de feuilles matures, de feuilles lancéolées, de jeunes feuilles, de la fleur et de semences germées. La lettre de l'alphabet 'w' représente le nombre de semaines après l'anthèse. Un gel coloré au bromure d'éthidium (9c) a été inclus pour présenter la charge égale d'ARN total à partir de différents tissus du palmier à huile.
La figure 10 donne les résultats de l'analyse de Southern pour déterminer le nombre de copies de gène LSO1 dans le génome du palmier à huile. Un total de 10 pg d'ADN génomique provenant de feuilles du palmier à huile a été digéré par Hind III (Bande H) et Xba I (Bande X) avant fractionnement en taille sur du gel d'agarose à 1,0 % (10a). L'ADN digéré a été transféré sur une membrane en nylon et hybridé avec des sondes marquées au 32P préparées en utilisant la séquence complète de LSO1 (10b) et la 3'- UTR de LSO1 (10c).
La figure lia représente les produits de PCR amplifiés obtenus à partir d'une PCR primaire de banques GenomeWalker en utilisant les amorces LS14 et API. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1, 2, et 3 sont les produits amplifiés à partir, respectivement, de banques GenomeWaiker Dra I, EcoR V, et Pvu II.
La figure llb représente les produits de PCR amplifiés obtenus à partir d'une PCR secondaire de banque GenomeWaiker Dra I en utilisant les amorces LS12 et AP2. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 sont les produits amplifiés à partir de la banque GenomeWaiker Dra I. La figure 12 fournit la séquence nucléotidique du promoteur LSO1 du palmier à huile, pGWLS01. Le site de début de transcription généralement reconnu est représenté en italique. L'astérisque (*) représente les séquences chevauchantes avec 5'-UTR du gène LS01.
Plusieurs éléments généralement reconnus agissant en cis ont été identifiés et soulignés. Ils comprennent un élément initiateur (Inr), la boîte I, la boîte GATA, la boîte CCAAT, la boîte G, un élément sensible aux blessures (WUN), un élément sensible à l'acide abscisique (ABA) et un élément sensible au choc thermique (HSE).
La figure 13a représente les produits PCR primaire amplifiés à partir, respectivement, de banques GenomeWalker Dra 1, EcoR V, Pvu 11 et Stu I, en utilisant les amorces LS17 et API. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1, 2, 3 et 4 sont les produits amplifiés à partir, respectivement, de banques GenomeWalker Dra 1, EcoR V, Pvu 11 et Stu I. La figure 13b représente les produits PCR secondaire amplifiés à partir de la banque GenomeWalker Pvu 11, en utilisant les amorces LS 18 et AP2. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1 et 2 sont les produits amplifiés à partir de la banque GenomeWalker Pvu 11.
La figure 14 fournit le résultat d'alignement du clone génomique, pGWLS1718 et du clone d'ADNc, LSO1. L'astérisque (*) représente les nucléotides conservés dans les deux séquences. Le site de début de traduction (ATG) est en gras et en italique. Le site de début de transcription est en gras et souligné.
La figure 15 représente les résultats de l'analyse des enzymes de restriction des plasmides pLS01GUS et pLS01GPF, en utilisant Sma I et Hind 111. La bande M est le Marqueur de Mélange en Echelle d'ADN. Les bandes 1 et 3 sont le plasmide non digéré, respectivement, de pLS01GUS et pLS01GFP. Les bandes 2 et 4 sont le plasmide digéré, respectivement, de pLS01GUS et pLS01GFP.
La figure 16 représente la localisation histochimique d'expression de GUS dans les feuilles du palmier à huile bombardées avec le plasmide pLS01GUS (16a et 16b) et sans plasmide (16c). La présence de taches bleues a été observée dans les feuilles bombardées avec pLS01GUS (16a et 16b), mais pas dans le témoin négatif (16c).
La figure 17 fournit l'expression de PFV transitoire dans des tissus foliaires et de mésocarpe bombardés avec des constructions de gènes promoteur- rapporteur différentes. Des disques de feuilles et des coupes de mésocarpe ont été bombardés avec trois plasmides différents: pEGFP sans promoteur (témoin négatif), pEGFP conduit par le promoteur LSO1 (désigné par pLS01GFP) et pEGFP conduit par le promoteur de virus mosaïque du chou-fleur 35S constitutif (p35SGFP). L'expression de GFP a été observée dans les tissus foliaires bombardés avec pLS01GFP et p35SGFP. L'expression de GFP n'a cependant pas été détectée dans les coupes de mésocarpe bombardées avec pLS01GFP.
La figure 18 représente l'analyse de l'enzyme de restriction du plasmide pB1I01LS01 en utilisant Sma I et Hind 111. Les bandes MI et M2 sont, respectivement, un mélange en échelle d'ADN et un marqueur k Hind III.
Les bandes I et 3 sont le plasmide pBI101LS01 non digéré. Les bandes 2 et 4 sont le plasmide pBI101LS01 digéré avec Sma I et Hind 111.
La figure 19 fournit une analyse PCR du plasmide pBI101LS01 qui a été isolé d'Agrobacterium tumefaciens C58 en utilisant des amorces spécifiques au promoteur LSO1, LS221c et LS221d. La bande M est le marqueur de mélange en échelle d'ADN. La bande I est le plasmide pBI101LS01 non digéré qui a été isolé d'Agrobacterium sélectionné sur une plaque d'agar LB contenant 50 pg/ml de kanamycine et de rifampicine. Les bandes 2, 3 et 4 sont les produits PCR amplifiés à partir du plasmide dans la bande 1. La bande 5 est le plasmide pBI101LS01 non digéré qui a été isolé d'Agrobacterium sélectionné sur une plaque d'agar LB contenant 50 pg/ml de kanamycine. Les bandes 6, 7 et 8 sont les produits PCR amplifiés à partir du plasmide dans la bande 5. La bande 9 est le témoin négatif eau.
La figure 20 représente une analyse PCR du plasmide pBI101LS01 qui a été isolé d'Agrobacterium tumefaciens C58 en utilisant une amorce spécifique au promoteur, LS221c et l'amorce spécifique au gène GUS, GUS-inférieur. La bande M est le marqueur de mélange en échelle d'ADN. La bande 1 est le produit PCR amplifié pour le plasmide pBI101LS01 qui a été obtenu à partir d'Agrobacterium sélectionné sur une plaque d'agar LB contenant 50 pg/ml de kanamycine et de rifampicine. La bande 2 est le témoin négatif eau.
La figure 21 représente la germination de graines sur un milieu de sélection de kanamycine pour identifier la descendance d'Arabidopsis thaliana transformé avec succès. Le transformant est résistant à la kanamycine et se développera en plants verts et sains (21a). Le non transformant restera cependant comme des plants à deux feuilles jaunâtres, même s'il était maintenu sur le milieu de sélection pendant I mois (21b).
La figure 22 représente l'amplification PCR du gène GUS partiel pour confirmer la présence de la construction pBI101LS01 dans le transformant Arabidopsis thaliana généralement reconnu. De l'ADN génomique extrait des feuilles de transformant a été amplifié avec des amorces spécifiques pour le gène GUS (GUS direct, GUS3FOR et GUS inverse, GUS2REV). La bande M est le marqueur de mélange en échelle d'ADN. Un fragment de 348 pb a été amplifié avec succès dans la Bande 1 et a confirmé indirectement la présence d'un promoteur spécifique aux feuilles dans le transformant.
Le gène GUS n'a pas été détecté dans l'ADN génomique de type sauvage (Bande 2) et la Bande 3 est le témoin négatif eau.
La figure 23 fournit la coloration GUS histochimique de plants d'Arabidopsis de 22 jours provenant de plantes transformées avec une construction de gène contenant un promoteur spécifique aux feuilles de palmier à huile et un promoteur constitutif CaMV 35S. Une plante de type sauvage a été utilisée comme témoin négatif. Dans les plants transformés avec un promoteur spécifique aux feuilles, une coloration bleue a été observée uniquement dans la feuille (23a). Une coloration bleue a été détectée dans tous les tissus (feuille, tige et racine) pour la plante transformée avec un promoteur constitutif (23b). Une coloration bleue n'a pas été détectée dans la plante de type sauvage (23c).
Le Tableau 1.0 récapitule la valeur numérique et le pourcentage d'identité obtenus dans l'analyse BLASTX de la séquence LSO1 en utilisant la base de données GenBank.
Une brève description des Séquences est fournie à la fin de la description.
Description détaillée de l'invention
Une amorce dégénérée sens, CAB(F) et une amorce dégénérée anti-sens, CAB(R) qui ont été dérivées de la région conservée du gène (Lhcb) de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle à récolte légère en provenance de trois plantes monocotylédones différentes, comprenant du maïs, du riz et du grain, ont été utilisées pour amplifier le gène associé en provenance du groupe d'ADNc du palmier à huile. L'incorporation de ces amorces dans la réaction PCR s'est traduite par l'isolation du gène Lhcb à 500 pb en provenance du groupe d'ADNc de feuilles monocaténaire dérivé de la transcription inverse d'ARNm de feuilles (Figure 1.0).
La séquence nucléotidique et d'acides aminés déduite de ce clone a été désignée par pRTLS01 (Figure 2.0). L'analyse BLASTX utilisant la base de données non redondante GenBank a montré que pRTLSOI a une homologie à 85 % et 84 % avec des séquences d'acides aminés déduites, respectivement, du maïs et du riz. Ces homologies ont été considérées telles que les amorcesdégénérées ont été désignées sur la base des séquences de maïs et de riz. Il a été constaté que la séquence de pRTLS01 codait pour un cadre de lecture ouvert (CLO) du gène Lhcb.
Une recherche primaire dans la banque d'ADNe de feuilles utilisant une pRTLS01 radiomarquée a eu pour résultat la détection de 61 clones Lhcb de palmier à huile généralement reconnus. Après une recherche secondaire, le nombre de clones généralement reconnus a été réduit à 30. Une excision in vivo et une analyse de l'enzyme de restriction des phagémides recombinants isolés avant séquençage, ont confirmé que tous les clones ont la même taille d'insert de 350 pb (figure 3.0). Sur la base des séquences nucléotidique et d'acides aminés déduites, ce clone désigné par pLS01 comprend un CLO de 224 pb, une région non traduite 3' de 89 pb (3'- UTR) et une séquence poly(A)+ (figure 4.0). Un codon d'arrêt (TGA) a été observé à la position 225 pb. Deux signaux consensus imparfaits pour la polyadénylation, AATAAA et TGTGTTTT, ont, en outre, été trouvés, respectivement, à 14 pb et 48 pb, en aval du codon d'arrêt TGA. Deux motifs de séquences imparfaites ont également été observés dans la 3'-UTR d'ADNc Lhcb de pin de Scots (Jansson & Gustafsson 1990). Le CLO de pLS01 a également montré une homologie très élevée, 96 % avec une partie du CLO de pRTLS01 (figure 5.0).
L'approche 5'-RACE a été réalisée pour obtenir la séquence d'ADNc complète et pour déterminer le site de début de transcription du gène Lhcb du palmier à huile. Sur la base des informations de séquences de pLS01, une amorce spécifique au gène anti-sens, LS10 située avant la séquence poly(A)+ de ce clone a été désignée. La présence de l'amorce LS10 et d'une amorce adapteur provenant du kit dans la réaction PCR d'ADNc de 5'-RACE-Ready, avait eu pour résultat l'amplification d'une bande distincte de 1,0 kb (figure 6.0). Les séquences nucléotidique et d'acides aminés déduites de ce clone ont été désignées par pLS01 (figure 7.0). Une analyse sur les deux séquences a révélé que LSO1 représente le clone complet du gène Lhcb dans le palmier à huile. Il est prévu que l'adénine à l'extrémité 5' de la séquence LS01 soit le site de début de transcription de ce gène. Ce clone contient une région non traduite 5' de 78 pb, un CLO de 795 pb et une région non traduite 3' de 89 pb. Il a été constaté que le CLO de ce clone codait pour une protéine de 265 acides aminés. Un total de 33 acides aminés constitue le peptide de transit et un autre de 232 constitue la protéine mature. Comme le gène Lhcb est un gène codé nucléaire, le peptide de transit est nécessaire pour le transport de ce gène dans le chloroplaste (Mullet 1993). Il a également été constaté que le peptide de transit se trouvait dans le gène Lhcb isolé d'autres espèces de plantes, telles que maïs, tabac, riz et tomate (Demmin et coll., 1989).
Le tableau 1.0 présente les résultats obtenus lors de la recherche d'identité BLASTX pour le clone LSO1 en utilisant la base de données GenBank. Ce clone présentait une homologie de 86 % et plus avec la séquence d'acides aminés déduite du photosystème 11 isolé de 9 plantes monocotylédones et dicotylédones différentes. L'alignement de la séquence d'acides aminés déduite LSO1 avec les séquences d'autres espèces de plantes sur la figure 8.0 montrait que la région codant pour une protéine mature était bien conservée comparée à la région du peptide de transit. Un motif d'acides aminés conservés pour le début de la protéine mature, MRK, a, de plus, été également observé dans toutes les plantes.
Dans la famille multigènes Lhcb du photosystème II, des types différents de Lhcb (Lhcbl, Lhcb2 et Lhcb3) peuvent être identifiés sur la base de la caractéristique des acides aminés de peptide de transit et de protéine mature de clone d'ADNc ou de la présence d'intron dans le clone génomique (Demmin et coll., 1989; Chinn et coll., 1995). Le LS01 complet du palmier à huile a la structure et le nombre d'acides aminés comparables tels qu'observés dans le Lhcbl de Glycine max (Stockinger & Walling, 1994), Gossypium hirsutum (Anderson et coll., 1993) et Solanum tuberosum (Fernandez et coll., 1995). Suivant Buetow et coll. (1988), LhcblCLO comprend normalement de 31 à 37 acides aminés pour le peptide de transit et 231 à 235 acides aminés pour la protéine mature. Sur la base des résultats de la recherche d'identité BLASTX et de la caractéristique de l'acide aminé, il est confirmé que le LSO1 du palmier à huile appartient à la famille du gène Lhcbl.
Une analyse par Northern blot a été réalisée pour déterminer les profils d'expression du gène Lhcb du palmier à huile dans plusieurs tissus du palmier à huile. Deux sondes produites par PCR LSI et LS2 contenant, respectivement, une séquence complète de LS01 et 3'-UTR de LSO1, ont été hybridées avec les transferts de Northern. Il a été observé que les deux sondes hybridées à un transcrit unique d'approximativement 1,0 kb (figure 9.Oa et 9.0b). L'expression du gène LSO1 a, de plus, été très forte, spécifique et régulée sur le plan du développement dans les tissus foliaires. Une forte expression de LSO1 a été détectée dans les feuilles vertes jeunes et matures. Quant aux feuilles lancéolées jaunâtres, un niveau inférieur d'expression a été observé.
L'expression de LSO1 n'a pas été détectée dans les tissus non photosynthétiques, tels que noyau, mésocarpe, semences germées et fleur.
L'intensité du signal observé dans la membrane en nylon hybridée avec la sonde LS1 est supérieure à celle observée avec la sonde LS2. Les différences indiquaient que la séquence complète de LSO1 s'hybridait avec le transcrit d'ARNm complet qui contenait la région codante conservée du gène Lhcb. Alors que la sonde 3'-UTR permet l'analyse spécifique du gène individuel puisque seul le transcrit LSO1 a été hybridé. Ces résultats ont révélé qu'en dehors de LSO1, d'autres membres du gène Lhcb pouvaient être présents dans les feuilles du palmier à huile.
L'analyse génomique par Southern a été réalisée pour déterminer le nombre de copies du gène du palmier à huile LS01. Les mêmes sondes produites par PCR pour l'analyse de Northern ont été utilisées pour s'hybrider aux transferts de Southern contenant un ADN génomique digéré par Hind III (Bande H) et Xba I (Bande X). Il a été observé sur la figure l0a que la séquence complète de LSO1 s'hybridait à 4 fragments différents dans les deux bandes. Dans la membrane hybridée avec la sonde 3'-UTR, un seul fragment a, cependant, été détecté dans chaque bande (figure 10b). Il a été constaté que ces bandes, 10 kb dans la Bande H et 2,2 kb dans la Bande X, ont migré de la même distance qu'un des fragments dans la membrane hybridée avec la séquence complète de LSO1. Ces résultats ont confirmé la présence d'une seule copie du gène LSO1 dans le génome du palmier à huile.
De manière à obtenir la séquence de régulation amont 5' de LSO1, l'approche de la marche sur le génome a été réalisée en utilisant un kit GenomeWalker et un kit PCR Advantage Genomic de CLONTECH. Dans la PCR primaire de banques GenomeWalker utilisant une amorce spécifique au gène dans le 29 mère, LS14 et une amorce adapteur, API, des fragments génomiques de tailles différentes ont été amplifiés à partir de banques digérées Dra I, EcoR V et Pvu II (figure 11 a). Le fragment le plus grand de 1,2 kb a été amplifié à partir de la banque digérée Dra I. Alors que des produits PCR d'approximativement 800 pb ont été amplifiés, à la fois, à partir de banques EcoR V et Pvu II. Puisque la banque digérée Dra I contenait le produit PCR le plus grand, elle a été sélectionnée comme matrice pour la PCR secondaire. La banque a été diluée 50x et 1 pl a été utilisé dans la réaction PCR avec une amorce spécifique au gène nichée dans le 30 mère, LS12 et une amorce adapteur nichée, AP2. La PCR secondaire utilisant la banque Dra I a eu pour résultat l'amplification de 1,0 kb de produit PCR (figure llb). Puisque l'amorce LS12 se situait à 228 pb en amont de l'amorce LS14, il était à prévoir une taille plus petite de fragment génomique amplifié autour de 1,0 kb.
Le fragment a ensuite été cloné dans un vecteur TOPO-pCR 1I et le clone recombinant désigné par pGWLS01 a été séquencé en utilisant une amorce directe et inverse M13.
Le résultat du séquençage de pGWLS01 a été représenté sur la figure 12. Un total de 932 (pb) nucléotides en amont du site de début de transcription généralement reconnu code pour la région promoteur. Comme pour les 58 (pb) nucléotides en aval du site de début de transcription généralement reconnu, cette région chevauche la 5'-UTR de LSO1. À la distance prévue de 32 7 pb en amont du site de début de transcription, aucune séquence consensus de boîte TATA n'a été identifiée (Joshi 1987). À une position comprise entre -1 à -7 en amont du site de début de transcription, un élément initiateur (Inr) qui est riche en pyrimidine, PyTCANTPyPy a, cependant, été observé (Nakamura et coll., 2002). Cette découverte a révélé que le promoteur LS01 du palmier à huile est un promoteur sans TATA et que l'initiation de la transcription de base pouvait être conduite par le motif Inr. L'absence de boîtes TATA dans la majorité de gènes de photosynthèse codés nucléaires a été signalée précédemment par Nakamura et coll. (2002). Leurs études sur 232 séquences promoteur laissent sérieusement supposer que des mécanismes de transcription indépendants de TATA jouent un rôle important dans l'expression régulée de gènes nucléaires de photosynthèse.
De plus, à la région distale du promoteur, quelques éléments intéressants agissant en cis ont été identifiés. Des éléments sensibles à la lumière, tels que GATA, CCAAT, boîte G et I, ont été couramment trouvés dans le promoteur sensible à la lumière (Arguello-Astorga & Herrera-Estrella, 1998). Deux régions séparées qui contiennent des motifs GATA et CCAAT aux positions -88 et -65 par rapport au site de début de transcription, ont été admises comme étant phytochromo-sensibles. Ces motifs ont également été identifiés dans le promoteur Lhcb de Lemna gibba et d'autres plantes (Kehoe et coll., 1994). Dans la région amont du promoteur, un élément sensible aux blessures généralement reconnu (WUN) CAAATTCCAAA pratiquement identique à l'élément WUN du gène propre à la pathogénie, AAATTTCCT dans la pomme de terre, a été identifié à la position -464 (Matton et coll., 1993). Alors qu'aux positions -699 et -878, un élément sensible à l'acide abscisique (Knight et coll., 1992) et un élément sensible au choc thermique (Pastuglia et coll., 1997) ont, respectivement, été identifiés. La présence de ces éléments indiquait que l'expression du gène LSO1 pouvait être régulée par des repères d'ambiance, tels que lumière, blessures mécaniques, acide abscisique et chaleur.
Le kit GenomeWalker a également été utilisé pour déterminer la présence d'intron dans le gène LSO1. Dans la PCR primaire avec l'amorce LS17, un fragment génomique intense a été amplifié à partir de banques GenomeWalker EcoR V et Pvu II. Aucune bande n'a été observée dans la banque Dra I et un seul petit fragment d'environ 0,3 kb a été amplifié à partir de la banque Stu I (figure 13a). Puisque le fragment de la banque Pvu II est légèrement plus grand qu'EcoR V, il a été sélectionné pour la PCR secondaire. Une autre amplification de cette matrice avec une amorce spécifique au gène nichée, LS18 a eu pour résultat l'isolation d'un clone génomique de 0,9 kb (figure 13b). L'alignement entre cette séquence, désignée par pGWLS1718, avec la séquence d'ADNc LSO1 complète, a été présenté sur la figure 14. Il a été constaté que des nucléotides en amont du site de début de transcription étaient similaires à la région proximale du promoteur LSO1. Alors qu'un total de 508 (pb) nucléotides en aval du site de début de transcription étaient identiques à la région codante du gène LSO1. Aucune séquence d'introns n'était présente dans ce clone. Un tel critère n'est observé que dans le gène Lhcbl qui manque généralement d'introns (Arguello-Astorga & Herrera- Estrella, 1998). Ce résultat confirme, en outre, que LSO1 du palmier à huile appartient à la famille de gènes Lhcbl.
Un essai d'expression transitoire a été réalisé pour analyser la force et la spécificité du promoteur spécifique aux feuilles du palmier à huile. Un promoteur de 900 pb qui a été amplifié à partir de pGWLS01 en utilisant l'amorce LS221c et LS221d, a été lié avec succès dans le vecteur pB1221 et pEGFP sans promoteur portant, respectivement, GUS et PVF, comme gène rapporteur. Une analyse de restriction des plasmides recombinants désignés par pLS01GUS et pLS01GFP, en utilisant Sma I et Hind III, a été présentée sur la figure 15. Un pLS01GUS digéré a montré la présence du vecteur pB1221 de 5,7 kb et d'un promoteur de 900 pb. Comme pour pLS01GFP, des fragments de vecteur et de promoteur ont également été observés.
La taille du vecteur pEGFP était de 4,2 kb. Une analyse des résultats de séquençage a confirmé que le promoteur LSO1 était lié dans l'orientation correcte dans les deux plasmides recombinants.
Dans la localisation histochimique de l'expression GUS, l'enzyme GUS (EC 3.2.1.31) qui a été codée par le locus uidA catalysera le clivage du substrat 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-glucuronide (XGluc). La précipitation de colorant bleu au site d'activité enzymatique a été obtenue par dimérisation oxydante du dérivé indoxyle. Il a été constaté que la présence de catalyseur oxydant, tel que ferricyanure et mélange de ferrocyanure pouvait activer ce processus de dimérisation (Jefferson et coll., 1987). Dans les études, 2 jours d'incubation dans une solution de coloration GUS a eu pour résultat la détection de 60 taches bleues dans les tissus foliaires bombardés avec pLS01GUS à une pression d'hélium de 1350 psi et à une distance de 9 cm entre le macro-porteur et les tissus cibles. Il a, de plus, été observé, sur la figure 16, que certaines taches bleues pouvaient être attribuées à une cellule bleue unique (16a), mais, dans la plupart des cas, plusieurs cellules adjacentes ont été également colorées (16b). Ce type de localisation enzymatique a également été détecté dans le travail réalisé par Chowdhury et coll. (1977). Comme pour le témoin négatif sur la figure 16c, la présence de taches bleues n'a pas été observée.
La spécificité du promoteur LS01 a, en outre, été prouvée par le résultat obtenu à partir de la détection de PFV. Le bombardement de disques de feuilles et de coupes de mésocarpe témoin avec pLS01GFP a montré un résultat très prometteur. En utilisant cette construction, l'expression de PFV a été détectée uniquement dans la feuille, mais pas dans les coupes de mésocarpe (figure 17). Comme pour la construction conduite par un promoteur 35S constitutif, des taches de fluorescence verte ont été détectées dans les deux tissus. Aucune expression de PFV n'a été détectée dans les tissus bombardés avec pEGFP sans promoteur.
Pour une intégration stable du promoteur LSO1 dans le génome d'Arabidopsis, la première étape a mis en jeu la construction d'un vecteur binaire recombinant approprié et le clonage dans E. coll. La transformation du produit lié contenant le promoteur spécifique aux feuilles du palmier à huile (LSO1) et le vecteur binaire pBI101 dans la souche DH5a d'E. co1i, a eu pour résultat l'isolation de deux colonies de bactéries uniques. Les plasmides recombinants désignés par pBI101LS01 ont ensuite été extraits de ces colonies. Tel que représenté sur la figure 18, deux tailles différentes de bandes qui étaient le vecteur de 12,5 kb et le fragment LS01 de 0,9 kb ont été observées après que le plasmide pBI101LS01 a été digéré par Sma I et Hind III. Cette analyse a confirmé que LS01 a été cloné avec succès dans pBI101. Alors qu'une analyse des résultats de séquençage a montré que LSO1 était lié dans pBI101 dans l'orientation correcte.
De manière à permettre le transfert de la construction d'intérêt dans Arabidopsis, le plasmide pBI101LS01 a été transformé dans la souche C58 d'Agrobacterium tumefaciens qui a souvent été appelée "ingénieur génétique de la nature" en utilisant le procédé d'électroporation. Après 3 jours d'incubation à 28 C, des colonies d'Agrobacterium ont été observées dans la plaque d'agar contenant de la kanamycine. Il a été constaté que la tension actuelle de 2,21 kV et une constante de temps de 5,2 ms produisaient des colonies de taille plus grande. Un total de 8 transformants s'est ensuite développé dans un bouillon de Luria contenant de la kanamycine et des plasmides ont été préparés en utilisant un kit spin miniprep QlAprep (Q1Agen). Par ailleurs, des solutions mères de glycérol des mêmes plasmides ont également été réensemencées en stries sur une plaque de Luria contenant de la rifampicine et de la kanamycine. Des plasmides ont également été préparés à partir de ces transformants. Tel que représenté sur la figure 19, des transformants obtenus à partir de deux plaques de sélection d'antibiotiques différentes ont montré la présence d'un fragment promoteur LSO1 de 0,9 kb. Ce résultat a laissé penser que la kanamycine seule était capable de sélectionner un Agrobacterium recombinant. De manière à vérifier avec précision la présence de plasmide ADN-T dans les transformants, une analyse PCR a été répétée en utilisant un promoteur de feuilles et des amorces spécifiques à GUS. Il a été observé sur la figure 20 l'amplification d'un produit PCR de 2,7 kb. La taille prévue comprenait un gène GUS de 1,8 kb (Mayer et coll., 2001) et un fragment promoteur LSO1 de 0,9 kb. Sur la base de ces résultats, l'Agrobacterium transformé peut être utilisé pour transformer Arabidopsis thaliana.
La transformation in planta d'Arabidopsis a été réalisée par un procédé par immersion florale. Suivant Weigel et Glazebrook (2002), ce procédé a été capable de donner une fréquence de transformants de 0,1 à 1 %. Dans le travail réalisé par Clough et Bent (1998), ces derniers ont conclu que l'étape de développement de l'inflorescence et le milieu d'inoculation étaient les facteurs les plus importants qui déterminent l'efficacité d'une transformation par immersion florale. Les plantes avec le nombre maximum de bourgeons floraux non ouverts étaient l'étape la plus prédisposée à la transformation. Alors qu'avec la présence de saccharose à 5 % dans l'inoculum, un total de 1,62 % d'Arabidopsis transformé a été obtenu. Comme pour l'agent tensio-actif Silwet L-77, ce composant améliore considérablement l'introduction de bactéries dans des tissus végétaux relativement inaccessibles. Dans cette étude, des plantes avec beaucoup de bourgeons floraux immatures et peu de fleurs ouvertes ont été choisies pour être immergées dans le milieu d'inoculation contenant un bouillon de Luria, 5 % de saccharose et 0,05 % de Siwet L-77. Après 8 semaines sur le sol, des graines ont été récoltées sur la plante T1.
La sélection de transformant généralement reconnu à partir de graines T1 a été réalisée sur le milieu de sélection de kanamycine. Après 14 jours, un transformant a été observé dans une des plaques. Le transformant était un plant résistant à la kanamycine qui produisait des feuilles vertes et capable de se développer en une plante Arabidopsis mature (figure 21a). Comme pour un non transformant, le plant n'aura que deux feuilles jaunâtres et la croissance a été retardée (figure 21b). La troisième semaine, le nombre de feuilles adultes de l'Arabidopsis transformé a augmenté de 3 à 5 feuilles. À ce stade, le plan a été transplanté dans le sol. Des graines récoltées sur cette plante ont été désignées par T2.
La sélection de 16 plantes de génération T2 a eu pour résultat l'isolation d'une lignée homozygote (désignée par T1P1/T2P4) qui présentait un taux de survie de 100 % sur le milieu de sélection de kanamycine. L'analyse PCR avait amplifié avec succès un gène GUS partiel de 348 pb à partir de l'ADN génomique de feuilles de cette plante homozygote (figure 22). Cela a, en outre, confirmé la présence d'une construction pBI101LS01 dans la plante transformée. L'essai GUS de plants de 22 jours a également montré, de plus, l'expression spécifique dans le tissu foliaire. La coloration GUS n'a été observée que dans le tissu foliaire, mais pas dans la tige et la racine (23a). Cependant, pour la plante transformée avec la construction génétique contenant un promoteur constitutif 35S, tous les tissus indiqués précédemment ont été colorés en bleu (23b). Comme pour une plante de type sauvage, aucune coloration bleue n'a été obtenue (23c).
Sur la base des résultats de l'essai d'expression transitoire et de transformation stable dans l'Arabidopsis, il peut être conclu que le promoteur LSO1 était capable de conduire l'expression de transgènes spécifiques au tissu foliaire. La transformation réussie de ce promoteur dans l'Arabidopsis a, de plus, également montré qu'il peut être utilisé dans le système de plante hétéro loque.
L'invention va maintenant être décrite dans les exemples non limitatifs suivants.
Exemples
Exemple 1. Amplification de gène Lhcb par l'approche de transcription inverse et d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) L'ADNc premier brin a été synthétisé à partir de l'ARNm des feuilles dans 25 pl de réaction contenant 5 pg d'ARNm de feuilles, 4 p1 de tampon 5x de premier brin, 2 pl de 0,1 M de DTT, 5 pl de 2 mM de dNTP et 1 p1 de transcriptase inverse SuperScript II (200 U/pl) (Société Gibco BRL Life Technology, New York, E-U) à 42 C pendant 1 heure. La solution a été extraite dans du phénol-chloroforme, précipité à l'éthanol et le dépôt a été dissous dans 25 pl d'eau stérile. L'ADNc a été soumis à une hydrolyse d'ARN en utilisant 12,5 pl de 0,15 N de NaOH et 1 pl de 0,5 M d'EDTA à 68 C pendant min. Cette opération a été suivie d'une neutralisation de la réaction par addition de 12,5 pl de Tris-HCl, de pH 8,0; 12,5 pl de I N de HC1 et 17,3 p1 de 7,5 M d'acétate d'ammonium avant précipitation à l'éthanol. Le dépôt d'ADNc a été dissous dans 25 pl d'eau stérile et la concentration d'ADNc a été déterminée en utilisant une plaque de bromure d'éthidium.
Une PCR a été réalisée en présence d'amorces dégénérées [CAB(R)5'NGGRTCNGCDATRTGRT3' et CAB(F)- 5'GCNGAYCCNGARACNTTY3'] qui ont été désignées sur la base de la région conservée du vecteur pCF II d'a/c de chlorophylle connu du Kit de Clonage TOPO-TA (Invitrogen) avant d'être soumises à l'appareil Elmer. Le mélange PCR de 50 pl contenait 1 pl d'ADNc (50 ng), 5 pl de tampon 10x, 1 pl de 10 mM de dATP, 1 pl de 10 mM de dCTP, 1 pl de 10 mM de dGTP, 1 pl de 10 mM de dTTP, 2 pl de 15 pM de CAB(R), 2 pl de 15 pM de CAB(F), 5 pL de 25 pM de MgC12, 30,5 pl d'eau stérile et 0,5 pl d'ADN-polymérase AmpliTaq (5 U/pl). La réaction PCR a été placée dans le thermocycleur Perkin Elmer 9700 avec les conditions suivantes: 94 C, 5 min pendant 1 cycle; puis 94 C, 1 min; 43 C, 1 min et 72 C, 1 min 30 s pendant 40 cycles, et, enfin, 72 C, 10 min pendant 1 cycle. Le fragment prévu a été purifié en utilisant un Kit d'Extraction sur Gel QlAquick (QIlAgen), cloné dans un vecteur TOPO-pCR II du Kit de Clonage TOPO-TA (Invitrogen) avant d'être soumis à un séquençage automatique avec ABI 377 PRISM. Une analyse des séquences nucléotidiques a été réalisée en utilisant DNAsis Max version 1.0 avant la recherche d'homologie dans la base de données.
Exemple 2. Recherche dans la banque d'ADNe de feuilles avec sonde d'ADNc générée à partir de RT-PCR Un total de 200 000 plaques en provenance de la banque d'ADNc de feuilles construite dans le vecteur Uni-ZAP XR (Stratagene) a été ensemencé selon Sambrook et coll. (1989) et le transfert des plaques a été réalisé tel que décrit par Siti Nor Akmar et coll. (1995). Les membranes transférées des plaques ont d'abord été traitées avec un tampon de dénaturation (0,5 N de NaOH, 1,0 M de NaCl) pendant 10 min, puis avec un tampon de neutralisation (0,5 M de Tris-HC1, de pH 8,0; 1,5 M de NaCl) pendant 5 min et 2x SSC pendant 5 min avant réticulation optimale à la lumière UV.
La préhybridation des membranes a été réalisée à 65 C dans 5x de solution de Denhardt (lx de solution de Denhardt est 0,02 % de chaque de Ficoll 400, d'albumine de sérum bovin et de polyvinylpyrrolidone), 5x de SSPE (lx de SSPE est 0,18 M de NaCl, 10 mM de NaH2PO4, de pH 7,5, 1 mM d'EDTA), 0,5 % de SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé. L'hybridation des membranes a été réalisée en utilisant le même tampon d'hybridation en présence de pRTLS01 marqué au 32P à 65 C. La sonde a été marquée au 32P-dCTP en utilisant un Kit de Marquage d'ADN Megaprime de la société Amersham Pharmacia Biotech. Après hybridation pendant la nuit, les membranes ont été lavées à 65 C avec 4x de SSPE, 0,1 % de SDS; puis avec 2x de SSPE, 0,1 % de SDS et 0,5x de SSPE, 0,1 % de SDS. Ces membranes ont ensuite été exposées à un film pour rayons X pendant 24 heures à - 80 C.
Selon le signal détecté sur le film pour rayons X, des plaques généralement reconnues ont été évidées et placées dans un tampon SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4.7H2O, 0,05 M de Tris-HC1 et 0,01 % de gélatine) contenant 0,3 % de chloroforme. Le lysat phagique a été soumis à une analyse PCR en présence de l'amorce T7 et d'amorces spécifiques au gène. Les conditions PCR étaient telles qu'indiquées ci-dessous: 95 C, 5 min et C, 45 min pendant 1 cycle; puis 95 C, 1 min; 60 C, 1 min et 72 C, 1 min 30 s pendant 30 cycles et 1 cycle d'extension finale à 72 C pendant 10 min. Les produits amplifiés ont été visualisés sur du gel d'agarose à 1,2 %.
Un phage recombinant a été excisé in vivo suivant les instructions du fabricant (Stratagene). Le phagémide pBluescript purifié a été digéré par EcoR I et Xho I pour confirmer la longueur de l'insert d'ADNc.
Exemple 3. Amplification rapide d'extrémités 5'-ADNc (5'-RACE) Une séquence complète de gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle a été isolée par 5'-RACE en utilisant un Kit d'amplification d'ADNc SMART RACE et un Kit PCR Advantage 2 de la société CLONTECH, Laboratories, E.-U. La réaction pour le premier brin d'ADNc a été initiée par incubation de 1 pg d'ARN total de feuille avec I pl d'amorce 5'-CDS, I p1 d'oligo SMART II A et 2 pl d'eau stérile à 70 C pendant 2 min. La réaction a été immédiatement refroidie sur de la glace avant addition de 2 pl de tampon 5x de premier brin, 1 pl de 20 mM de DTT, 1 p1 de 10 mM de mélange dNTP et 1 pl de PowerScript de transcription inverse. Cela a été suivi d'une incubation à 42 C pendant 1,5 heure. La réaction a été arrêtée par addition de 200 pl de tampon Tricine-EDTA et incubation à 72 C pendant 7 min. Un total de 2,5 pl d'ADNc 5'-RACE Ready monocaténaire a été ajouté au mélange PCR contenant 34,5 pl d'eau de qualité PCR, 5 p1 de 50x de tampon polymérase Advantage 2, 5 pl de 10x d'amorce UPM et 1 p1 de 10 pM d'amorce spécifique au gène, du LSIO (5'TAATGCACACCACGCCAACAATTTCAATTC3') qui a été désigné sur la base de la séquence de pRTLS01. La réaction PCR a été réalisée en utilisant un thermocycleur Perkin Elmer 9700 avec les conditions suivantes: 94 C, 5 s; 68 C, 10 s et 72 C, 3 min pendant 25 cycles. Le fragment prévu a été purifié, cloné dans le vecteur TOPOpCR II du Kit de Clonage TOPO-TA (Invitrogen) avant d'être soumis à un séquençage automatique avec ABI 377 PRISM. Une analyse des séquencesnucléotidiques a été réalisée en utilisant DNAsis Max version 1.0.
Exemple 4. Analyse par Northern blot L'ARN total a été extrait de différents tissus du palmier à huile suivant le procédé de Rochester et coll. (1986).
Deux fragments différents contenant une séquence nucléotidique complète et une région non traduite 3' (3'-UTR) de gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle ont été utilisés comme sondes dans l'analyse par Northern et Southern blot. La séquence nucléotidique complète de LSO1 a été générée par amplification du plasmide LS10.3 avec l'amorce LSIO (5'TAATGCACACCACGCCAACAATTTCAATTC3') et l'amorce LS15 (5' GCACCTACCCAACAGCATTTCCATTGG3'). Alors que la région 3'-UTR a été amplifiée en utilisant une paire d'amorces LSIO et LS11 (5'GCCTGGCAACCTTAATTAATTTGGTGCTTAG3'). Les fragments prévus ont été purifiés en utilisant un Kit d'Extraction sur Gel QlAquick (QlAgen) et marqués au 32P-dCTP en utilisant un Kit de Marquage d'ADN Megaprime de la société Amersham Pharmacia Biotech.
Une analyse par Northern blot a été réalisée suivant le procédé de McMaster & Carmichael (1977) et Kroczek & Siebert (1990). Dans cette étude, 5 pg d'ARN total ont été dénaturés par la chaleur à 55 C pendant 15 min dans 18 pl de mélange de PFV contenant 78 % (p/p) de formamide désionisé, 16 % de glyoxal désionisé et 10 mM de tampon phosphate de sodium. Après dénaturation par la chaleur, l'ARN a été refroidi immédiatement sur de la glace avant électrophorèse sur du gel d'agarose à 1,2 % avec 40 lx TAE, de pH 7,2, comme tampon d'électrophorèse. L'ARN a été transféré sur une membrane Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech) par un système de transfert sous vide (60 psi, 6 heures) en présence de 20x de SSC comme tampon de transfert.
La préhybridation de la membrane a été réalisée à 65 C pendant 4 heures dans 5x de SSC (lx de SSC est 0,15 M de NaCl, 15 mM de citrate trisodique) , 5x de solution de Denhardt (lx de solution de Denhardt est 0,02 % de chaque de Ficoll 400, d'albumine de sérum bovin et de polyvinylpyrrolidone), 0,5 % de SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé. Cette opération a été suivie d'une hybridation pendant la nuit de la membrane avec une sonde marquée au 32P à 65 C. Le lavage de la membrane a été réalisé avec 4x de SSC/0,1 % de SDS à 65 C pendant 15 min, puis avec 2x de SSC/0,1 % de SDS à 65 C pendant 15 min. L'exposition à un film pour rayons X a été réalisée à - 80 C pendant 48 heures.
Exemple 5. Analyse par Southern blot De l'ADN génomique a été extrait de feuilles lancéolées de palmier à huile suivant le procédé de Doyle & Doyle (1990).
Un total de 20 pg d'ADN génomique a été digéré par Hind III et Xba I. Les produits digérés ont été fractionnés en taille sur du gel d'agarose à 1,0 % à 100 V pendant 5 heures dans lx de TAE, de pH 7,9. Cette opération a été suivie d'une immobilisation de l'ADN sur une membrane en nylon par buvardage sous vide du gel à 60 psi pendant 1 heure, en présence de 0,4 N de NaOH comme tampon de transfert. À la fin du processus, la membrane a été rincée avec 2x de SSC avant réticulation UV. L'hybridation et le lavage du buvardage ont été réalisés tel qu'indiqué précédemment pour l'analyse par buvardage de Northern.
Exemple 6. Isolation du promoteur Le promoteur spécifique aux feuilles a été isolé après le protocole standard indiqué dans le manuel du Kit GenomeWalker Universel et du Kit PCR génomique Advantage de la société CLONTECH, Laboratories. Deux amorces spécifiques au gène anti-sens, désignées par LS14 (5'GTGTCCCACCCATAGTCACCGGGGAATTC3') et LS12 (5' GATGATGCCTTGGAGATGGGAGCGGTGATC3') ont été désignées sur la base de l'extrémité terminale 5' de la région codante, respectivement, de LSO1 et à l'intérieur de 5'-UTR. Un total de quatre banques GenomeWalker a été obtenu par digestion de 2,5 pg d'ADN génomique de feuille par Dra 1, EcoR V, Pvu 11 et Stu I, avant liaison avec l'adapteur GenomeWalker. Une partie aliquote de 12 pl de ces banques a été utilisée dans l'amorce adapteur, AP2, fournie dans le kit. Les conditions PCR correspondaient à celles d'une réaction PCR primaire en présence de l'amorce spécifique au gène anti-sens, LS12, et de l'amorce adapteur, API, fournie avec le kit. Cela a été suivi d'une PCR secondaire de 50x de banque primaire diluée avec une amorce spécifique au gène nichée anti-sens, LS14, et 2889540 38 recommandée dans le manuel du Kit GenomeWalker en utilisant le thermocycleur Perkin Elmer 9700. La bande prévue a été purifiée à partir de gel d'agarose en utilisant du Gel QlAquick.
Le Kit d'Extraction (QIAgen) a été cloné dans le vecteur TOPO-pCR II du Kit de Clonage TOPO-TA (Invitrogen) avant séquençage en utilisant des amorces directes et inverses M13.
L'approche de la marche sur le génome a également été utilisée pour étudier la structure du gène LSO1. Une PCR primaire des banques GenomeWalker a été réalisée en présence de l'amorce spécifique au gène anti-sens, LS17 (5'CGAAGTTGGTGGCGTAGGCCCAAGCATTG3'), de l'extrémité terminale 3' de la région codante de pLS01 et de l'amorce AP 1. Elle a été suivie d'une PCR secondaire avec amorce spécifique au gène nichée anti-sens, LS18 (5' CTCTGAGCATGGATCAAGCTCGGGTTGCC3'), de l'extrémité terminale 5' de la région codante de pLS01 et de l'amorce AP2. La bande prévue a été purifiée, clonée et séquencée comme ci-dessus.
Exemple 7. Clonage du promoteur spécifique aux feuilles dans les vecteurs pBI221 et pEGFP Le promoteur spécifique aux feuilles (922 pb) a été amplifié à partir du plasmide pGWLS01 en utilisant une amorce sens et anti-sens. L'amorce sens, LS221c (5'OOCAAGCTTCCATATCTGGCTCG3') a été introduite avec le site Hind III à l'extrémité 5'. Comme pour l'amorce anti-sens, LS221d (5'TOOCCCGGGCAATGGAAATGCTGY), l'extrémité 5' a été introduite avec le site Sma I. Ces amorces, 2 pl de 15 pM de solution mère ont été utilisés pour amplifier le promoteur dans 50 pl de réaction PCR, contenaient 4 pl de dNTP (10 mM chacune), 250 ng de plasmide pGWLS01, 5 pl de 10x de tampon, 5 pl de 25 MM de MgC12 et 2,5 U d'ADN-polymérase AmpliTaq de la société Perkin Elmer. Les conditions PCR étaient les suivantes: 95 C, 5 min pendant 1 cycle; puis 95 C, 1 min; 56 C, 1 min et 72 C, 1 min 30 s pendant 30 cycles et 1 cycle d'extension finale à 72 C pendant 10 min. Le produit PCR a été purifié à partir d'amorces, de nucléotides, de polymérases et de sels en utilisant la colonne de Purification PCR QIAquick de la société QIAgen. Le plasmide pB31221 portant GUS comme gène rapporteur et le plasmide sans promoteur, pEGFP, portant une PFV comme gène rapporteur, ont été préparés en utilisant un kit Miniprep QIAprep de la société QIAgen. Le fragment du promoteur LSO1, le plasmide pB1221 et le plasmide pEGFP, ont été digérés d'abord par Sma I (Fermentes) à 30 C pendant 6 heures. Une digestion par une seconde enzyme de restriction, Sind III (Fermentes), a été réalisée à 37 C pendant 16 heures. Les produits digérés ont été analysés sur du gel d'agarose à 1,0 % et des fragments prévus ont été purifiés à partir du gel d'agarose en utilisant le Kit d'Extraction sur Gel QIAquick de la société QIAgen.
Le promoteur LSO1 digéré et le pB1221 sans promoteur à un rapport molaire de 4:1 ont été incubés à 50 C pendant 5 min. Après refroidissement immédiat, le vecteur et le mélange d'insert ont été ajoutés dans un mélange de liaison contenant 1,5 pl de 10x de tampon ligase et 1,5 pl d'ADN-ligase T4 (1 U/pl) avant incubation pendant la nuit à 16 C. Dix microlitres du mélange de liaison ont été utilisés pour transformation avec une cellule compétente d'E. coli DH5a, tel que décrit par Siti Nor Akmar Abdullah (1999). Une sélection bleue/blanche de clones recombinants a été réalisée sur une plaque LB contenant 40 pl de 20 mg/ml de 5-bromo-4chloro-3-indoyl-0 D-galactopyranoside (X-gal) et 40 pl de 20 mg/ml d'isopropyl 13 D- thiogalactopyranoside (IPTG). Le plasmide du clone recombinant, désigné par pLS01GUS, a été préparé en utilisant un Kit Spin Miniprep QIAprep (QlAgen) et une digestion par des enzymes de restriction Sma I et Hind III a été réalisée pour confirmer la taille de l'insert. Le plasmide a, enfin, été séquencé en utilisant des amorces M13F et M13R. Le clonage du promoteur LSO1 digéré dans pEGFP sans promoteur a également été réalisé comme ci-dessus et le clone recombinant, pLS01GFP, a été séquencé en utilisant l'amorce EGFPN.
Exemple 8. Analyse du promoteur par essai GUS histochimique et détection de la PFV Préparation de coupes des tissus Des feuilles vertes de palmier à huile ont été récoltées sur un plan de palmier dans une pépinière MPOB. Les tissus ont été immergés dans du RBS pendant 15 min avant d'être soumis à une stérilisation de surface en utilisant 20 % de Clorox pendant 15 min dans l'écoulement laminaire. Les feuilles ont été rincées deux fois avec de l'eau stérile, coupées en segments de 1,0 cm2 et ont été aplaties sur un milieu Murashige et Skoog (Duchefa, Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture (Biochimie, Culture de Tissus et de Cellules Végétales), Haarlem, Pays-Bas), épiderme inférieur orienté vers le haut. Des disques de feuilles ont été conservés à 28 C pendant 24 heures et ont été éclairés avant et après bombardement par une construction de gène chimère.
Préparation d'or pour le bombardement particulaire Un total de 1 ml d'éthanol absolu a été ajouté à 0,06 g de particules d'or de 1,0 micron. Le mélange a été mélangé par agitation à vortex à vitesse élevée. Après centrifugation à 10.000 g pendant 1 min, le surnageant a été enlevé du dépôt d'or. Ces étapes de stérilisation ont été répétées 3 fois. Lors de la stérilisation finale, 1 ml d'eau stérile a été ajouté au dépôt d'or. La sonication du dépôt d'or a été répétée 3 fois avant de remettre l'or en suspension dans 1 ml d'eau stérile. L'or peut être stocké à 20 C pendant une durée allant jusqu'à 6 mois.
Préparation d'ADN sur des microprojectiles d'or pg de plasmide pLS01GUS approximativement ont été ajoutés à 2 pg de particules en or dans un microtube à centrifuger. Pendant l'agitation à vortex, 100 pl de 2,5 M de chlorure de calcium et 40 pl de 0,1 M de spermidine ont été ajoutés. Le mélange a été agité à vortex pendant 3 min avant centrifugation à 10 000 g pendant 1 min. Le surnageant a été enlevé et le microporteur a été remis en suspension dans 65 pl d'éthanol absolu. Le microporteur enrobé d'ADN peut être conservé à 20 C jusqu'à utilisation.
Bombardement par microprojectiles Des disques de feuilles ont été bombardés par une construction génétique en utilisant un Système de Distribution de Particules commandé à l'Hélium/PDS-1000 de BioRad (Hercules, Californie, E.-U.). Avant le bombardement, la chambre de la machine, le disque de rupture, l'écran d'arrêt, le macroporteur, le support de macroporteur et les bouchons à oreilles rouges ont été stérilisés avec de l'éthanol absolu. Une partie aliquote de 8 pl de microporteur enrobé d'ADN a été chargée au centre du microporteur et séchée à l'air pendant 10 minutes. Les disques de feuilles ont été bombardés en utilisant les conditions suivantes. pression d'hélium de 1350 psi avec une distance de 9 cm entre le macroporteur et les tissus cibles. Comme pour les coupes de mésocarpe, le bombardement a été réalisé à 1550 psi avec une distance de 9 cm entre le macroporteur et les tissus cibles. Les disques de feuilles bombardés sans ADN plasmidique ont été utilisés comme témoin négatif dans l'essai GUS. Alors que dans la PFV, les disques de feuilles et les coupes de mésocarpe bombardés par pEGFP sans promoteur ont été utilisés comme témoin négatif. Après bombardement, les tissus foliaires ont été incubés pendant 24 heures à 28 C dans la lumière avant essai GUS et détection de PFV.
Essai GUS histochimique L'activité GUS a été mesurée de manière histochimique en suivant le procédé décrit par Jefferson et coll. (1987). Les tissus foliaires ont été incubés dans un tampon de coloration GUS stérilisé par filtration (0,1 M de tampon phosphate de sodium, de pH 7,0; 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5 mM de ferricyanure de potassium, 1 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-glucuronide/X-Gluc, 0,2 % de Triton X100 et 10 mM d'EDTA) pendant une durée allant jusqu'à 2 jours à 37 C dans l'obscurité. Après coloration, les tissus ont été fixés dans un mélange fixateur (10 % de formaldéhyde, 50 % d'éthanol et 5 % d'acide acétique glacial) et la chlorophylle des feuilles a été enlevée en utilisant 80 % d'éthanol. La présence de taches bleues a été observée en utilisant un Système Leica QF550W.
Détection de la protéine fluorescente verte (GFP) La détection microscopique de PFV a été réalisée en utilisant un microscope 12,5 Leica MZ avec éclairage bleu. L'image de la PFV a été capturée en utilisant un logiciel informatique Image Manager 50.
Exemple 9. Analyse de promoteur en utilisant Arabidopsis thaliana (Système de plante modèle) Préparation de la construction pB1101LS01 Le fragment du promoteur spécifique aux feuilles du plasmide pGWLS01 et du vecteur binaire sans promoteur pBI101 (à un rapport molaire de 13:1) qui ont été digérés par Sma I et Hind III ont été traités à la chaleur à 55 C pendant 5 min. Cela a été suivi d'un refroidissement immédiat et de l'addition d'un mélange de liaison contenant 1,5 pl de 10x de tampon ligase et 1,5 p1 d'ADN-ligase T4 (I U/pl) avant incubation pendant la nuit à 16 C. Cinquante microlitres du mélange de liaison ont été ensuite utilisés pour transformer une cellule compétente d'E. coli DH5a et la sélection de clones recombinants a été réalisée sur une plaque LB (Luria- Bertini) contenant 50 pl/ml de kanamycine. Le plasmide du clone recombinant, désigné par pBI101LS01 a été préparé en utilisant un kit spin miniprep QlAprep (QIAgen) et une digestion par des enzymes de restriction Sma I et Hind III a été réalisée pour confirmer la taille de l'insert. Le plasmide a, enfin, été séquencé en utilisant des amorces M13F et M13R.
Electroporation Un total de 100 ng de plasmide binaire pBI101LS01 a été mélangé sur de la glace avec 100 pl de cellule compétente de souche C58 d'Agrobacterium tumefaciens dans une Cuvette Gene Pulser prérefroidie (écartement des électrodes 0,2 cm). Le mélange a été soumis à électroporation en utilisant un Electroporator Gene Pulser II (Bio-Rad) avec les conditions suivantes. capacité : 1,0 pF, tension: 2,2 kV et constante de temps: 5 à 10 ms. Immédiatement après électroporation, 1 ml de bouillon LB a été ajouté à la cuvette avant incubation à 28 C pendant 4 heures. La culture a été incubée sans agitation pendant les 2 premières heures et poursuivie en agitant légèrement à 150 tr/min pendant les 2 heures suivantes. Après incubation, les cellules ont été récoltées par centrifugation brièvement à 4000 tr/min pendant 1 min. Le dépôt a été remis en suspension dans 40 p1 de bouillon LB et les cellules ont été ensemencées sur une plaque LB contenant 50 pg/ml de kanamycine. La plaque a été incubée pendant 3 jours à 28 C et une PCR a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques pour un promoteur de feuilles et un gène GUS (GUS-inférieur, 5' CATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTT3') pour vérifier la présence du vecteur binaire recombinant, pBI101S01 dans 1'Agrobacterium.
Croissance de la plante Arabidopsis On a fait germer et croître des graines d'un écotype Arabidopsis thaliana Columbia à l'étape de floraison dans des pots de fleurs remplis d'un mélange de sol de deux tiers de mélange de mise en pot Steven Dutch et d'un tiers de vermiculite dans une chambre de croissance. Les conditions de croissance étaient de 16 heures de lumière (80 à 100 pmol/m2) à 22 C/8 h d'obscurité à 20 C, avec une humidité relative de 75 %. De manière à obtenir plus de bourgeons floraux par plante pour l'immersion, des inflorescences primaires ont été coupées pour encourager l'émergence de pousses secondaires.
Transformation In Planta par immersion florale On a fait croître une colonie unique de souche C58 d'Agrobacterium tumefaciens hébergeant le plasmide binaire pBI101LS01, pendant la nuit à 28 C avec agitation (220 tr/min) dans un bouillon LB contenant 50 pg/ml de kanamycine. Les cultures pendant la nuit ont été diluées à 1:10 en utilisant un bouillon LB et se sont développées pendant approximativement 8 heures pour obtenir une DO600 de 0,6 à 0,8. Des cellules ont été récoltées par centrifugation à 5000 tr/min pendant 15 min. Le dépôt qui était de couleur rose a ensuite été remis en suspension dans 5 % (p/v) de saccharose. La culture a été transférée dans un récipient carré et du Silwet L-77 a été ajouté à 0,05 % (v/v). Les plantes ont été inversées dans cette suspension et immergées pendant 10 secondes. Les plantes ont ensuite été retirées et les pots de fleurs ont été enveloppés avec des sacs en plastique. Le dessus des sacs en plastique a été fermé par un trombone pendant 2 jours pour maintenir une humidité élevée. Après 48 heures, le trombone a été retiré et les plantes se sont développées dans des conditions de croissance normales.
La plante qui a été désignée par T1 a été développée jusqu'à maturité et récoltée lorsque les siliques étaient marron et sèches.
Identification et sélection de transformant qénéralement reconnu Récolte de graines transgéniques Sept semaines après l'immersion florale, des graines transgéniques généralement reconnues ont été récoltées en tirant légèrement les siliques secs entre les doigts sur un morceau de papier propre. Les graines ont été tamisées pour retirer les matières de la cosse. Les graines propres ont été stockées dans le tube Eppendorf et conservées à 22 C dans le dessicateur.
Stérilisation de graines transgéniques Les graines ont été mises en suspension dans de l'eau stérile contenant 1 % de Tween 20 (v/v) dans un tube Eppendorf. Les graines ont été agitées à vortex, centrifugées et rincées avec de l'eau stérile 3 fois avant trempage dans 25 % de Clorox pendant 20 minutes. Le Clorox a ensuite été retiré en lavant les graines avec de l'eau stérile 3 fois. Les graines ont enfin été soumises à une stérilisation de surface avec 70 % d'éthanol pendant 1 minute. Les graines ont été rincées de nouveau avec de l'eau stérile avant d'être utilisées pour sélection.
Sélection de lignée homozygote portant un promoteur spécifique aux feuilles Des graines stérilisées ont été ensemencées sur un milieu Murashige et Skoog complété de 50 pg/ml de kanamycine. Les plaques de sélection ont été traitées au froid à 4 C dans l'obscurité pendant deux jours pour favoriser la germination uniforme de graines. Les plaques ont ensuite été transférées à 22 C sous un éclairage de lumière fluorescente continu. Après environ 3 semaines, 16 plants résistant à la kanamycine ont été transplantés dans le sol. Ces plantes de génération T2 se sont développées jusqu'à maturité et ont été récoltées séparément. La stérilisation et la sélection des graines ont été répétées pour ces 16 plantes. Seuls les plants de génération T3 qui ont montré un taux de survie de 95 % et plus sur la plaque de sélection de kanamycine ont été considérés comme lignée homozygote. Ces plantes ont ensuite été transplantées dans le sol pour recueillir les graines.
Analyse PCR de transformant De l'ADN génomique a été extrait de feuilles d'Arabidopsis portant un promoteur spécifique aux feuilles suivant le procédé décrit par Doyle et Doyle (1990). Une amplification PCR a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques pour le gène GUS qui sont GUS3FOR (5'TGACGCATGTCGCGCAAGAC3') et GUS2REV (5'ATCCTTTCGCACGTAAGTCC3'). Dans cette étude, l'ADN génomique en provenance d'Arabidopsis de type sauvage a été considéré comme témoin négatif.
Essai GUS histochimique de transformant L'activité GUS a été mesurée de manière histochimique en suivant le procédé décrit par Jefferson et coll. (1987). L'ensemble de la plante de plant d'Arabidopsis (22 jours) portant un promoteur spécifique aux feuilles a été incubé dans un tampon de coloration GUS stérilisé par filtration (0,1 M de tampon phosphate de sodium, de pH 7,0; 1 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-glucuronide/XGluc et 0,2 % de Triton X-100) pendant la nuit à 37 C dans l'obscurité.
Après coloration, la chlorophylle a été enlevée de la plante en utilisant 70 % d'éthanol. La présence de précipité bleu a été observée en utilisant un Stéréomicroscope SMZ800 Nikon. Des dépôts bleus, dus à l'activité GUS dans le transformant, ont été comparés à l'Arabidopsis portant un promoteur constitutif 35S, ainsi qu'à une plante de type sauvage.
Bien que des modes de réalisation particuliers de l'objet de l'invention aient été décrits, il sera évident à l'homme du métier que différents changements et modifications de l'objet de l'invention peuvent être apportés sans sortir de l'esprit et du cadre de l'invention. Ils sont destinés à couvrir, dans les revendications jointes, toutes les modifications qui se trouvent dans le cadre de la présente invention.
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Description des séquences
SEQ ID NO: 1 - Séquence promoteur de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle de palmier à huile SEQ ID NO: 2 - Séquence d'acides aminés de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle de palmier à huile SEQ ID NO: 3 - Séquence CLO complète de gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle de palmier à huile.
Identificateur de séquence:
Sequence Identité Description du clone
ID NO: du clone 1 pGWLS01 Séquence promoteur de protéine (LSO1) se fixant aux a/c de chlorophylle 2 LSO1 Séquence d'acides aminés de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle 3 LSO1 Séquence CLO complète de gène de protéine se fixant aux a/c de chlorophylle 4 pRTLS01 LS01 partiel isolé par RT-PCR pLS01 LS01 partiel isolé d'une banque d'ADNc (séquence d'acide nucléique) 6 pLS01 LS01 partiel isolé d'une banque d'ADNc (séquence d'acide aminé) 7 PGWLS1718 Séquence génomique obtenue par PCR en utilisant les amorces LS17 et LS18 8 CAB(F) Amorce dégénérée directe pour amplification de LSO1 partiel en utilisant RT-PCR 9 CAB(R) Amorce dégénérée inverse pour amplification de LSO1 partiel en utilisant RT-PCR LS1 Séquence complète du fragment d'ADNc LSO1 amplifié pour analyse par Northern blot 11 LS2 3'-UTR du fragment d'ADNc LSO1 amplifié pour analyse par Northern blot 12 LS10 Amorce anti-sens pour amplification de LS1 et LS2 13 LS11 Amorce sens pour amplification de LS2 14 LS12 Amorce nichée (nested) gène spécifique pour amplification de pGWLS01 LS14 Amorcespécifique au gène pour amplification de pGWLS01 16 LS15 Amorce sens pour amplification de LS1 17 LS17 Amorce spécifique au gène pour amplification de pGWLS1718 18 LS18 Amorce nichée (nested) gène spécifique pour amplification de pGWLS1718 19 API Amorce spécifique à l'adapteur pour amplification de pGWLS01 et pGWLS1718 AP2 Amorce spécifique à l'adapteur nichée pour amplification de pGWLS01 et pGWLS1718 21 LS221c Amorce sens pour amplification de fragment de promoteur spécifique aux feuilles à partir du plasmide pGWLS01 22 LS221d Amorce anti-sens pour amplification de fragment de promoteur spécifique aux feuilles à partir du plasmide pGWLS01 23 EGFPN Amorce pour séquençage de plasmide pLS01GFP 24 M13F Amorce directe pour séquençage de plasmide pLS01GUS M13R Amorce inverse pour séquençage de plasmide pLS01GUS 26 GUS- Amorce pour détection du gène gus inférieur dans la construction ADN pBI101LS01 27 GUSFOR Amorce directe pour détection du gène gus dans l'ADN génomique de la plante transgénique 28 GUSREV Amorce inverse pour détection du gène gus dans l'ADN génomique de la plante transgénique Information de Séquences 1. pGWLS01 (Voir figure 12) NO. ID SEQ: 1
AAAT AAAAAGATCG GATTCAAATT
CAAAATTTTT TTATTCGATC CATATCTGGC TCGATCTATT TATATCCGAT TCAATCCGAT
TATCATCCCT AAAAAAAATC ATCATGCGTG CGGCCATTAT ATCATTAAAA TTGGTCATCT
TTATCCGGTG CTGCGCAAAT GGGTACATGT GGAGTGCCAT TGAATTGCTC CCGTGCAAGC
GTGGCATGTC AACGTTCGAA TTAAGGGTAT GAGGAGCGTA TGGAATAGAT GGGGCGGGAG
CCTAACAGGC TTATGTTGGC CTTGCTGGCT TGCTCGTGTT TGAACACGTT GGTGACCAAT
GAGCCATGGT TTGGTCATTT TTGGTCTAAG ATAATAAGTA TTTTTTTTTC TTTTTTCTCT
TTTTGCTTTG ATAAATTAGA TTTATTAAAT CAATCTACAG TAAATGTATC CGTGAGCATC
ACCGAAAATC CTCCTCTTAA AGAGGTCCGA CTAGACTGGG TTACATGCTA AGCAACTCAA
AACTCAAATT CCAAATCAAG TCACTCATGC ACCGGCTCAA CTTGGTTTAG GGTAGACGAC
TGCCACTAGA ACGGTACATC TAGAACCTTC CGACCAGCTG TTTGATAAAA GTCAGGAGAT
GTTTACATCA AAAATAAAGA TAAAAAATCG GGGATACGTG TAACTCCAAT TTACGCGTGG
ATCCCAAGTC GTGGAGGGGC GACCACCGGG GAAGAAAATC TAGGAGGCCC AATCACAACT
CAAGAACGAG ATTCCTAGCA GAAACCAATG CCCAAAGTAT CTGAAGCGCA GCTTGCCAGG
TGTTCGACCA TTAGCCTTAA CCTCAAAGCC CATGAAGCAG CCAATTAAAT GAAAGAATTA
GATTTCCTGG GATAAGGACT GCACCCGCCC CTCGTCTTTT AAGTCCCCTT AGACCCAACC
CTTCACTCAG AGCACCTACC CAACAGCATT TCCATTGGGA TCACCGCTCC CATCTCCAAG
GCATCATC
2. LSO1 (Voir figure 7) Séquence d'acides aminés NO. ID SEQ: 2
MAATMALSSPSLAGKAVKLA PSASPILGNGRVTMRKTSTK RVPSGSPWYGPDRVKYLGPL SGEPPSYLTGEFPGDYGWDT AGLSADPETFAKNRELEVIH CRWAMLGALGCVFPELLARN GVKFGEAVWFKAGAQIFSEG GLDYLGNPSLIHAQSILAIW ACQVILMGAVEGYRVAGGPL GEVTDPLYPGGSFDPLGLAD
DPEAFAELKVKEIKNGRLAM FSMFGFFVQAIVTGKGPLEN LADHLADPVNNNAWAYATNF VPGK* 3. LS01 (Voir figure 7) Séquence d'acides aminés NO. ID SEQ: 3
AGAGCACCTACCCAACAG CATTTCCATTGGGATCACCGCTCCCATCTCCAAGGCATCATCTCTATCTAGTCCTTCTCA
ATGGCTGCCACCATGGCCCTCTCCTCCCCTTCCCTCGCCGGAAAAGCGGTGAAGCTCGCT CCCTCGGCCTCTCCCATCCTCGGGAATGGCAGGGTCACCATGCGGAAGACCTCGACCAAG CGCGTCCCCTCCGGCAGCCCATGGTACGGGCCAGACCGTGTCAAGTACCTCGGCCCCTTG TCTGGGGAGCCCCCGTCCTACCTGACCGGTGAATTCCCCGGTGACTATGGGTGGGACACT GCTGGTCTCTCGGCCGACCCTGAGACCTTCGCCAAGAACCGGGAGCTCGAGGTCATCCAC
TGCAGGTGGGCCATGCTGGGTGCCCTCGGCTGCGTCTTTCCGGAGTTGCTTGCCCGCAAT GGCGTCAAGTTCGGCGAGGCCGTCTGGTTCAAAGCGGGAGCTCAGATCTTCAGCGAGGGC GGTCTGGACTACCTGGGCAACCCGAGCTTGATCCATGCTCAGAGCATTCTGGCCATCTGG
GCTTGCCAAGTTATACTGATGGGTGCCGTCGAAGGGTACCGCGTCGCCGGCGGTCCCCTG GGTGAGGTCACCGACCCTCTGTACCCTGGGGGGAGCTTCGATCCCTTGGGCCTTGCCGAT GACCCGGAGGCGTTCGCAGAGCTTAAAGTGAAAGAGATCAAGAACGGCAGGCTAGCCATG TTCTCCATGTTCGGTTTCTTTGTTCAGGCTATCGTGACCGGGAAGGGCCCGTTGGAGAAC
CTGGCCGACCACCTTGCGGATCCTGTTAACAACAATGCTTGGGCCTACGCCACCAACTTC GTGCCCGGAAAGTGAGCCTGGCAACCTTAATTAATTTGGTGCTTAGAAATTCTTCATCTG TTGTGGTTTTTGTTTGAATTGAAATTGTTGGCGTGGTGTGCATT AAAAA
4. pRTLSO1 (Voir figure 5)
ADPETFAKNRELEVIHCRWAMLGALGCVFPELLARNGVKFGEAVWFKAGAQIFSEGGLDY LGNPSLIHAQSILAIWACQVVLMGAVEGYRVAGGPLGEVTDPLYPGGSFDPLGLADDPEA
FAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLENLADHIADP
5. pLSO1 (Voir figure 4) * Séquence d'acides aminés
GC
ACGAGGTTCGATCCCTTGGGCCTTGCCGATGACCCGGAGGCGTTCGCAGAGCTTAAAGTG AAAGAGATCAAGAACGGCAGGCTAGCCATGTTCTCCATGTTCGGTTTCTTTGTTCAGGCT
ATTGTGACCGGGAAGGGCCCGTTGGAGAACCTGGCCGACCACCTTGCGGATCCTGTTAAC AACAATGCTTGGGCCTACGCCACCAACTTCGTGCCCGGAAAGTGAGCCTGGCAACCTTAA TTAATTTGGTGCTTAGAAATTCTTCATCTGTTGTGGTTTTTGTTTGAATTGAAATTGTTG GCGTGGTGTGCATTAAAAAA
* Séquence d'acides aminés
T R F D P L G L A D D P E A F A E L K V K E I K N G R L A M F S M F G F F V Q A
I V T G K G P L E N L A D H L A D P V N N N A W A Y A T N F V P G K * 6. pGWLS1718 (Voir figure 14) 40
CTGTTTGATAAAAGTCAGGAGATGTTTACATCAAAAATAAAGATAAAAAATCGGGGATAC GTGTAACTCCAATTTACGCGTGGATCCCAAGTCGTGGAGGGGCGACCACCGGGGAAGAAA ATCTAGGAGGCCCAATCACAACTCAAGAACGAGATTCCTAGCAGAAACCAATGCCCAAAG
TATCTGAAGCGCAGCTTGCCAGGTGTTCGACCATTAGCCTTAACCTCAAAGCCCATGAAG CAGCCAATCAAATGAAAGAATTAGATTTCCTGGGATAAGGACTGCACCCGCCCCTCGTCT TTTAAGTCCCCTTAGACCCAACCCTTCACTCA_GAGCACCTACCCAACAGCATTTCCATTG GGATCACCGCTCCCATCTCCAAGGCATCATCTCTATCTAGTCCTTCTCAATGGCTGCCAC CATGGCCCTCTCCTCCCCTTCCCTCGCCGGAAAAGCGGTGAAGCTCGCTCCCTCGGCCTC
TCCCATCCTCGGGAATGGCAGGGTCACCATGCGGAAGACCTCGACCAAGCGCGTCCCCTC CGGCAGCCCATGGTACGGGCCAGACCGTGTCAAGTACCTCGGCCCCTTGTCTGGGGAGCC CCCGTCCTACCTGACCGGTGAATTCCCCGGTGACTATGGGTGGGACACTGCTGGTCTCTC GGCCGACCCTGAGACCTTCGCCAAGAACCGGGAGCTCGAGGTCATCCACTGCAGGTGGGC CATGCTGGGTGCCCTCGGCTGCGTCTTTCCGGAGTTGCTTGCCCGCAATGGCGTCAAGTT
CGGCGAGGCCGTCTGGTTCAAAGCGGGAGCTCAGATCTTCAGCGAGGGCGGTCTGGACTA CCTGGGCAACCCGAGCTTGATCCATGCTCAGAG
7. pLSO1GUS (Voir figures 15 et 16) Il s'agit d'une construction d'ADN. Le promoteur CaMV 35S dans le vecteur squelette de pBI221 (CLONTECH) a été retiré et remplacé par le promoteur spécifique aux feuilles du palmier à huile (pGWLS01). La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible.
8. pLSO1GFP (Voir figures 15 et 17) Il s'agit d'une construction d'ADN. Le promoteur spécifique aux feuilles du palmier à huile (pGWLS01) a été cloné dans les nombreux sites de clonage du vecteur squelette pEGFP-1. La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible.
9. p35SGFP (Voir figure 17) Il s'agit d'une construction d'ADN. Le promoteur CaMV 35S a été cloné dans les nombreux sites de clonage du vecteur squelette pEGFP-1. La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible.
10. pBI1O1LSO1 (Voir figures 18, 19, 20, 22 et 23) Il s'agit d'une construction d'ADN. Le promoteur spécifique aux feuilles du palmier à huile (pGWLS01) a été cloné dans le vecteur binaire pB1101. La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible.
11. CAB(F) (Voir figure 1) Séquence amorce 5' GCNGAYCCNGARACNTTY3' 12. CAB(R) (Voir figure 1) Séquence amorce 5' CNGGRTCNGCDATRTGRT3' 13. LS1 (Voir figures 9 et 10) -la séquence complétée de LSO1
GCACCTACCCAACAG
CATTTCCATTGGGATCACCGCTCCCATCTCCAAGGCATCATCTCTATCTAGTCCTTCTCA ATGGCTGCCACCATGGCCCTCTCCTCCCCTTCCCTCGCCGGAAAAGCGGTGAAGCTCGCT CCCTCGGCCTCTCCCATCCTCGGGAATGGCAGGGTCACCATGCGGAAGACCTCGACCAAG CGCGTCCCCTCCGGCAGCCCATGGTACGGGCCAGACCGTGTCAAGTACCTCGGCCCCTTG TCTGGGGAGCCCCCGTCCTACCTGACCGGTGAATTCCCCGGTGACTATGGGTGGGACACT
GCTGGTCTCTCGGCCGACCCTGAGACCTTCGCCAAGAACCGGGAGCTCGAGGTCATCCAC TGCAGGTGGGCCATGCTGGGTGCCCTCGGCTGCGTCTTTCCGGAGTTGCTTGCCCGCAAT GGCGTCAAGTTCGGCGAGGCCGTCTGGTTCAAAGCGGGAGCTCAGATCTTCAGCGAGGGC GGTCTGGACTACCTGGGCAACCCGAGCTTGATCCATGCTCAGAGCATTCTGGCCATCTGG GCTTGCCAAGTTATACTGATGGGTGCCGTCGAAGGGTACCGCGTCGCCGGCGGTCCCCTG
GGTGAGGTCACCGACCCTCTGTACCCTGGGGGGAGCTTCGATCCCTTGGGCCTTGCCGAT GACCCGGAGGCGTTCGCAGAGCTTAAAGTGAAAGAGATCAAGAACGGCAGGCTAGCCATG TTCTCCATGTTCGGTTTCTTTGTTCAGGCTATCGTGACCGGGAAGGGCCCGTTGGAGAAC
CTGGCCGACCACCTTGCGGATCCTGTTAACAACAATGCTTGGGCCTACGCCACCAACTTC GTGCCCGGAAAGTGAGCCTGGCAACCTTAATTAATTTGGTGCTTAGAAATTCTTCATCTG
T TGTGGTTTTTGTTTGAATTGAAATTGTTGGCGTGGTGTGCATTAA
14. LS2 (Voir figures 9 et 10)
GCCTGGCAACCTTAATTAATTTGGTGCTTAGAAATTCTTCATCTGTTGTGGTTTTTGTTTG
AATTGAAATTGTTGGCGTGGTGTGCATTAA
15. LS1O (Voir figures 9 et 10) Séquence amorce 5' TAATGCACACCACGCCAACAATTTCAATTC3' 16. LS11 (Voir figures 9 et 10) Séquence amorce 5' GCCTGGCAACCTTAATTAATTTGGTGCTTAG3' 17. LS12 (Voir figure llb) Séquence amorce 5' GATGATGCCTTGGAGATGGGAGCGGTGATC3' 18. LS14 (Voir figure lla) Séquence amorce 5' GTGTCCCACCCATAGTCACCGGGGAATTC3' 19. LS15 (Voir figures 9 et 10) Séquence amorce 5' GCACCTACCCAACAGCATTTCCATTGG3 20. LS17 (Voir figure 13a) Séquence amorce 5' CGAAGTTGGTGGCGTAGGCCCAAGCATTG3' 21. LS18 (Voir figure 13b) Séquence amorce 5' CTCTGAGCATGGATCAAGCTCGGGTTGCC3' 22. APi (Voir figures 11 et 13) Séquence adapteur 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC3' 23. AP2 (Voir figures 11 et 13) Séquence adapteur 5'ACTATAGGGCACGCGTGGT3' 24. LS221c (Apparentée aux figures 15, 19 et 20) Séquence amorce 5' CCCAAGCTTCCATATCTGGCTCG3' 25. LS221d (Apparentée aux figures 15 et 19) Séquence amorce 5' TCCCCCGGGCAATGGAAATGCTG3' 26. pBI221 (Apparentée aux figures 15 et 16) Il s'agit d'un vecteur squelette pour pLS01GUS. La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible 27. pEGFP-1 (Apparentée à la figure 17) Il s'agit d'un vecteur squelette pour pLS01GFP. La séquence d'acides nucléiques n'est pas disponible.
28. EGFPN 17) (Apparentée aux figures 15 et Amorce de séquençage 5'CGTCGCCGTCCAGCTCGACCA G3' 29. M13F (Apparentée à la figure 18) Amorce de séquençage 5'GTAAAACGACGGCCAG3' 30. M13R (Apparentée à la figure 18) Amorce de séquençage 5' CAGGAAACAGCTATGAC3' 31. GUS-inférieur (Voir figure 20) Séquence amorce 5' CATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTT3' 32. GUSFOR (Voir figure 22) Séquence amorce 5' TGACGCATGTCGCGCAAGAC3' 33. GUSREV (Voir figure 22) Séquence amorce 5' ATCCTTTCGCACGTAAGTCC3'

Claims (25)

REVENDICATIONS
1. Un acide nucléique isolé comprenant une séquence d'acides nucléiques de régulation qui est au moins identique à 50 % à la séquence exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complémentaire de celle-ci après alignement optimal.
2. Un acide nucléique isolé comprenant un acide nucléique de régulation qui s'hybride dans des conditions de stringence faible à la séquence d'acides nucléiques, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complémentaire de celle-ci.
3. Un acide nucléique isolé comprenant un acide nucléique de régulation, dans lequel une partie de l'acide nucléique, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1, ou un complémentaire de celle-ci, est efficace pour réguler l'expression d'un gène qui y est lié de façon opérationnelle.
4. Un acide nucléique isolé comprenant une séquence d'acide nucléique de régulation, telle qu'exposée dans la SEQ ID NO: 1 ou un complément de celle-ci.
5. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'acide nucléique, lorsqu'il est fixé à un gène rapporteur et introduit dans des tissus photosynthétiques, stimule, de manière sélective, l'expression du gène rapporteur dans les tissus photosynthétiques.
6. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'acide nucléique, lorsqu'il est fixé à un gène rapporteur et introduit dans des tissus foliaires, stimule de manière sélective l'expression du gène rapporteur dans les tissus foliaires.
7. L'acide nucléique isolé codant pour une séquence d'acides aminés exposée dans la SEQ ID NO: 2 ou pour une séquence d'acides aminés qui a plus de 70 % de similarité avec SEQ ID NO: 2 après alignement optimal.
8. L'acide nucléique isolé selon la revendication 7, dans lequel l'acide nucléique code pour une séquence d'acides aminés exposée dans la SEQ ID NO: 2.
9. L'acide nucléique isolé selon la revendication 8, dans lequel l'acide nucléique a plus de 70 % d'identité à la SEQ ID NO: 3 après alignement optimal ou est capable de s'hybrider à la SEQ ID NO: 3 ou à son complémentaire, dans des conditions de stringence faible.
10. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant une homologie de séquence d'au moins 60 % avec SEQ ID NO: 1.
11. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant une homologie de séquence d'au moins 80 % avec SEQ ID NO: 1.
12. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant une homologie de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO: 1.
13. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant une homologie de séquence d'au moins 95 % avec SEQ ID NO: 1.
14. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant une homologie de séquence d'au moins 99 % avec SEQ ID NO: 1.
15. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, codant pour un polypeptide ayant une homologie de séquence d'au moins 90 % avec SEQ ID NO: 2.
16. L'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, codant pour un polypeptide ayant une homologie de séquence d'au moins 99 % avec SEQ ID NO: 2.
17. Une construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique, selon l'une quelconque des revendications précédentes, lié de façon opérationnelle à un acide nucléique recombiné.
18. La construction d'acide nucléique selon la revendication 17, dans laquelle l'acide nucléique recombiné code pour une protéine qui assure une résistance aux insectes, une production de bioplastique, une production de produits nutraceutiques, une production de macromolécules pharmaceutiques incluant une protéine thérapeutique et diagnostique, des anticorps et des vaccins, ou qui a pour résultat une augmentation de l'intensité de la photosynthèse d'une plante, ou qui a pour résultat des changements de teinte de la plante.
19. Un vecteur comprenant la construction d'acide nucléique selon la revendication 17 ou 18.
20. Une cellule comprenant la construction d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendication 17 à 18.
21. La cellule selon la revendication 20, dans laquelle la cellule comprend une cellule bactérienne et une cellule végétale.
22. Une plante transgénique comprenant la construction d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 17 à 19.
23. La plante transgénique selon la revendication 22, dans laquelle l'expression de l'acide nucléique recombiné entraîne la résistance aux insectes, la production de produits à haute valeur ajoutée, la production de produits nutraceutiques, la production de macromolécules pharmaceutiques incluant une protéine thérapeutique et diagnostique, des anticorps et des vaccins, ou qui a pour résultat une augmentation de l'intensité de la photosynthèse d'une plante, ou qui a pour résultat des changements de teinte de la plante.
24. La plante transgénique selon la revendication 22, dans laquelle la plante est sélectionnée dans le groupe comprenant: Elaeis guineensis Jacq. , Elaeis oleifera, des hybrides d'Elaeis guineensis Jacq. et d'Elaeis olifera, du maïs, du riz, du tabac, du coton, de la luzerne, du blé, du soja, du colza, du tournesol, arabidopsis, de la noix de coco, de la pomme de terre, du raisin, Bactris gasipaes et d'autres palmiers.
25. Plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, dans laquelle les produits desdites plantes sont destinés à une application industrielle, nutraceutique ou pharmaceutique, ou à améliorer des propriétés agronomiques.
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