JP4366496B2 - 病原体感染初期に誘導されるイネペルオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的な発現を促進する、植物のペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を含む核酸分子（本明細書中以降、ＰＯＸプロモーター）に関する。より詳細には、本発明は、このＰＯＸプロモーターを利用したトランスジェニック植物の作出方法、この方法の利用によって得られた植物細胞、組織、植物体および種子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ（ＥＣ．１．１１．１．７）（本明細書中で「ＰＯＸ」ともいう）は、一般に種々の基質の過酸化水素による酸化反応を触媒する酵素であって、微生物から動植物までに広く存在する。ペルオキシダーゼは、種々のアイソザイムおよびアイソフォームの形態からなるスーパーファミリーを構成し、現在では、その反応特異性および構造により、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩに分類されている（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、非特許文献１）。クラスＩは、原核生物ペルオキシダーゼとも呼ばれ、酵母ミトコンドリアシトクロームｃＰＯＸ、葉緑体アスコルビン酸ＰＯＸ、細胞質ゾルアスコルビン酸ＰＯＸおよび遺伝子二重細菌ＰＯＸなどが含まれる。クラスＩＩは、分泌型真菌ペルオキシダーゼとも呼ばれ、代表的にはＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍマンガン依存性ＰＯＸ（ＰＣＭ）、およびリグニナーゼなどが含まれる。クラスＩＩＩは、古典的分泌型植物ペルオキシダーゼとも呼ばれ、代表的には西洋ワサビＰＯＸなどが含まれる。クラスＩＩＩ植物ＰＯＸは、植物において普遍的に見い出されており、さらに複数のアイソフォームが同一植物から見い出されている（非特許文献１）。
【０００３】
クラスＩＩＩ植物ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、植物における種々の生理的過程（例えば、木化（Ｗｈｅｔｔｅｎら、（非特許文献２））、コルク化（Ｅｓｐｅｌｉｅら、（非特許文献３））、細胞壁タンパク質の架橋（Ｆｒｙら（非特許文献４））、オーキシン分解および植物ホルモンであるインドール酢酸（ＩＡＡ）の酸化（Ｈｉｎｍａｎら（非特許文献５））、病原体からの防御（Ｃｈｉｔｔｏｏｒら（非特許文献６））、塩耐性（Ａｍａｙａら（非特許文献７））、老化（Ａｂｅｌｅｓら（非特許文献８））、植物の発生、分化および生長（Ｈｏｒｔｏｎら（非特許文献９））など）に寄与することが示唆されており、植物の生長および病傷害ストレス応答などにおいて重要な役割を担っていると考えられている。ペルオキシダーゼが単一の植物中に複数存在すること、および基質特異性が広いことなどから、個々のペルオキシダーゼの特異的な生理的機能を特定することは未だ困難である。
【０００４】
植物のＰＯＸ遺伝子については、例えば、アルファルファ、トマトおよびコムギから、それぞれ７以上のＰＯＸ遺伝子が単離され、そして同定されている（Ｃｈｉｔｔｏｒら（１９９９）、非特許文献６）。Ｃｈｉｔｔｏｏｒらは、イネから相同性の高い３つのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡフラグメントを単離し、そしてこの３つのＰＯＸがイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）による感染の際に異なる誘導を受けることを示した（Ｃｈｉｔｏｏｒら（１９９７）、非特許文献１０）。Ｉｔｏらは、イネの地上部組織にタンパク質レベルで２５のＰＯＸが存在することを示し、そのうち４種を精製して、Ｎ末端アミノ酸配列とそれぞれに対する抗体の反応性とから、これらが２組のアイソフォームであることを推定した（Ｉｔｏら、非特許文献１１）。Ｉｔｏらは、２つの構造的に関連するＰＯＸをコードするｃＤＮＡ（ｐｒｘＲＰＡおよびｐｒｘＲＰＮ）を単離したが、この２つの遺伝子は、同一ではないが類似する発現パターンを示した。（Ｉｔｏら、非特許文献１２）。タバコにおいて、１２のＰＯＸアイソザイムが、等電点電気泳動後の活性染色によって検出され、そして、これらのアイソザイムが器官特異性および傷害またはＴＭＶ感染に対する応答性が異なることが示された。これらのタバコＰＯＸについての観察から、個々のＰＯＸ遺伝子の発現が異なって調節されることが示唆された（Ｌａｎｇｒｉｍｉｎｉら、非特許文献１３）。
【０００５】
このように、発現特異性について従来研究されたＰＯＸアイソザイムの数は限定されており、数十あると予測されるＰＯＸの発現動向について概括的な解析はなされておらず、また従来の知見からではそのような解析は困難であった。
【０００６】
ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、過酸化水素に代表される活性酸素種の除去において役割を有することが知られている。一般に、植物などの細胞中の活性酸素種（スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素など）の濃度が上昇した状態は、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）と呼ばれる。これは、過酸化状態、紫外線および放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペルオキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生物的作因、オゾンおよび二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす酸化状態と、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ＰＯＸ、ビタミンＥ、ＣおよびＡ等の作用による、細胞内の抗酸化剤防御機構とのバランスが崩れたときに起きる。
【０００７】
真核生物では、酸化ストレスに曝されるとＳＯＤなどの活性が高まることが以前から知られている。あらかじめＳＯＤなどを誘導しておくことにより、細胞が酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示す例も観察されている。
【０００８】
植物においても、酸化ストレスの発生について、次のことが知られている。（１）光合成を妨げる様々な条件（光照射下の低温、除草剤処理など）によって、光合成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生し得る。（２）暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等の活性酸素種の濃度が上昇し得る。（３）除草剤（パラコート（商品名）（１，１−ジメチル−４，４−ジピリジニウムジクロリド）等）および紫外線も、その作用機構に活性酸素種が関わっている。そして、（４）乾燥ストレスや重金属なども、酸化ストレスを引き起こすと考えられている。
【０００９】
近年、酸化ストレスを含む環境ストレスが植物を含む生物の生体に与える影響が注目されている。近代の工業化による地球環境の悪化が深刻な社会問題になっており、植物においても環境ストレス耐性を向上させるための研究が行われている。ＰＯＸのような抗酸化酵素は、種々の環境ストレスによって生体中に過多に発生する活性酸素を除去するのに有効な、環境ストレス耐性（生体防御）因子であると考えられている。しかし、ＰＯＸについては、アイソザイムの多様性および広範な基質特異性などの点から、環境ストレス耐性における役割は充分に解明されていない。従って、現段階では環境ストレス耐性植物を作製するための材料とすることは困難である。
【００１０】
クラスＩＩＩ ＰＯＸについては、病原菌の感染のような生物的刺激に対しての役割も示唆されている。大橋ら（非特許文献１４）においては、タバコＰＯＸについて、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）感染による局部病斑形成とＰＯＸとの関連が研究され、ＴＭＶによる壊死病斑形成の過程でＰＯＸがポリフェノールの酸化という形で機能していることが示唆された。従って、ＰＯＸは、病原体の感染に対して植物に防御機能を付与することにおいても重要な役割を果たし得ることが示唆される。
【００１１】
従って、ストレス耐性植物を含む有用植物の、遺伝子工学的手法による作出という観点から、ＰＯＸ遺伝子の発現特性についての詳細な知見の蓄積が所望されている。
【００１２】
最近、イネを含む多くの植物において、大規模な発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定プログラムが進行中である。イネ（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（非特許文献１５））およびシロイヌナズナ（Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄら（非特許文献１６））からも、それぞれ４２および４１の異なるＰＯＸ遺伝子の存在が確認された。しかし、これらのＥＳＴ配列は、遺伝子の部分配列情報を提供するのみである。これらの遺伝子の機能については簡単に分析したものが報告されているが、詳細に機能分析をした報告はまだない。
【００１３】
【特許文献１】
再公表ＷＯ０２／０４２７４５号
【非特許文献１】
Ｗｅｌｉｎｄｅｒ Ｋ．Ｇ．ら（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：３８８
【非特許文献２】
Ｗｈｅｔｔｅｎ Ｒ．ら（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，１００１−１０１３）
【非特許文献３】
Ｅｓｐｅｌｉｅ Ｋ．Ｅ．ら（１９８６）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１，４８７−４９２
【非特許文献４】
Ｆｒｙ Ｓ．Ｃ．（１９８６）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７、１６５−１８６）
【非特許文献５】
Ｈｉｎｍａｎ Ｒ．Ｌ．ら（１９６５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４、１４４−１５８
【非特許文献６】
Ｃｈｉｔｔｏｏｒ Ｊ．Ｍ．ら（１９９９）、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ （ＤａｔｔａおよびＭｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ編） １７１−１９３、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
【非特許文献７】
Ａｍａｙａ Ｉ．ら（１９９９）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７、８０−８４
【非特許文献８】
Ａｂｅｌｅｓ Ｆ．Ｂ．ら（１９８８）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７．６０９−６１５
【非特許文献９】
Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｆ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：６９０
【非特許文献１０】
Ｃｈｉｔｏｏｒ Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．７：８６１−８６７
【非特許文献１１】
Ｉｔｏ Ｈ．ら（１９９１）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：２４４５−２４５４
【非特許文献１２】
Ｉｔｏ Ｈ．ら（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：３６１−３６６
【非特許文献１３】
Ｌａｎｇｒｉｍｉｎｉ Ｌ．Ｍ．ら（１９８７）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：４３８−４４２
【非特許文献１４】
大橋（Ｏｏｈａｓｈｉ Ｙ．）（１９７５）、名古屋大学大学院農学研究科農芸化学専攻、博士論文
【非特許文献１５】
Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．ら（１９９７）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：１３５−１４４
【非特許文献１６】
Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｌ．ら（１９９８）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３３：９８−１０２
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発現特性が解明された、ペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子（本明細書において、便宜上ＰＯＸプロモーターともいう）を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の発現特異性を有するペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子に関する。発現特異性の例としては、部位特異性、ストレス誘導性などが挙げられる。本発明は、所望の性質を有するトランスジェニック植物、特に病原体抵抗性植物に改変するために有用である。
【００１６】
本発明は、５つのイネペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター核酸分子についての発現特性データの解析に基づく。本発明者らによって、個々のイネペルオキシダーゼ遺伝子が、種々のパラメータ（例えば、組織、ストレスなど）に対して独自の発現パターンを示すことが明らかになった。さらに、これらのプロモーター核酸分子は、傷害、病原体への感染などのストレス刺激初期に、発現が誘導されることが明らかになった。
【００１７】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１８】
（１） プロモーター活性を含む核酸分子であって、上記核酸分子は、
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９、において、１もしくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を含むヌクレオチド配列であって、プロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１３または１５に示す配列を少なくとも含む、ヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示すヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；ならびに
（ｅ）（ａ）に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であって、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
上記ヌクレオチド配列に作動可能に外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列が連結されると、上記外来遺伝子の特異的な発現を促進する活性を有する、
核酸分子。
【００１９】
（２） 上記特異的な発現は、根特異的発現およびストレス誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２０】
（３） 上記特異的な発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現、およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２１】
（４） 上記特異的な発現は、いもち病菌誘導性発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２２】
（５） 項目１に記載の核酸分子および作動可能に連結された、外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【００２３】
（６） 上記外来遺伝子は、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、レポーター遺伝子、病原抵抗性を付与する遺伝子および組織修復に関与する遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、項目５に記載の発現カセット。
【００２４】
（７） 調節エレメントをさらに含む、項目５に記載の発現カセット。
【００２５】
（８） 上記調節エレメントは、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子および、エンハンサーからなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、項目７に記載の発現カセット。
【００２６】
（９） 項目５に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
【００２７】
（１０） 項目１に記載の核酸分子および外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、植物細胞。
【００２８】
（１１） 項目１０に記載の細胞を含む、植物体。
【００２９】
（１２） 上記植物体は単子葉植物である、項目１１に記載の植物体。
【００３０】
（１３） 上記植物体はイネ科植物である、項目１１に記載の植物体。
【００３１】
（１４） 上記植物体はイネである、項目１３に記載の植物体。
【００３２】
（１５） 項目９に記載の発現ベクターを用いて形質転換された、植物細胞。
【００３３】
（１６） 項目１５に記載の細胞を含む、植物組織。
【００３４】
（１７） 項目１５に記載の植物細胞から得られた、トランスジェニック植物体。
【００３５】
（１８） 上記トランスジェニック植物体が単子葉植物である、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３６】
（１９） 上記トランスジェニック植物体がイネ科植物である、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３７】
（２０） 上記トランスジェニック植物体はイネである、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３８】
（２１） トランスジェニック植物の作出方法であって、上記方法は以下の工程：
（Ａ）項目１に記載のプロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を植物細胞に導入する工程；および
（Ｂ）得られた植物細胞を再分化して、トランスジェニック植物を作出する工程、
を包含する、方法。
【００３９】
（２２） 外来遺伝子の根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための、項目１に記載の核酸分子の使用。
【００４０】
（２３） 上記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現、およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目２２に記載の使用。
【００４１】
（２４） 項目１に記載されるプロモーター活性を有する核酸分子、および植物細胞において上記核酸分子に作動可能に連結されるべき外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための組成物。
【００４２】
（２５） 上記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目２４に記載の組成物。
【００４３】
（２６） 植物体のストレス刺激の有無を検査するための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）上記植物体から組織を得る工程；
（ｂ）上記組織からＲＮＡを抽出し、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列に特異的なプローブを用いて、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列が発現されているか否かを検出する工程、
を包含し、
ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列の特異的発現は、上記植物体が病原体に感染したことを示す、
方法。
【００４４】
（２７） １以上の容器に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に示されるヌクレオチド配列に特異的なプローブを含む、植物体における病原体感染を検出するためのキット。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みおよび理解することによって、当業者に明らかとなる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００４７】
（定義）
本明細書において使用される主要な用語の一部を以下に定義する。
【００４８】
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キュウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００４９】
本明細書において、「刺激（の）初期」とは、創傷、病原体感染、農薬散布などの刺激を植物に与えた場合に、この刺激を与えた直後から数時間、１２時間以内、２４時間以内、または４８時間以内をいう。
【００５０】
本明細書において、本発明に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原体」とは、植物に感染可能なあらゆる病原性生物、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
病原体としての真菌類としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
病原体としての病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
病原性ウイルスとしては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書において、ＤＮＡの「断片」とは、参照ＤＮＡの全長よりも短く、少なくともプローブまたはプライマーとしての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。あるＤＮＡの断片を、それが由来した元のＤＮＡに対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイブリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてあるＤＮＡが「特異的にハイブリダイズ」するとは、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）について使用される場合、少なくとも２２種の本発明のＰＯＸ ＤＮＡを互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得、５０を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物として入手され得る。１対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーをＰＣＲに使用する場合、選択的プライマーは、代表的には少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または５０ヌクレオチド長あるいはそれ以上であり得る。
【００５５】
本明細書において、各ＰＯＸについて断片が特異的であるためには、ＰＯＸ保存領域を除いた領域から選択される必要がある。本明細書において、「ＰＯＸ保存領域」とは、本発明におけるＰＯＸ間でＤＮＡ配列またはアミノ酸配列が保存されている領域をいい、「ＰＯＸ非保存領域」とは、それ以外の領域をいう。「保存されている」とは、ある核酸配列領域において、その配列がコードするポリペプチドの機能を保持するに必要とされる程度にその核酸配列が同一または類似であることをいう。ＰＯＸ保存領域は、代表的には、以下の化１に示す配列アラインメントにおいてボックスで示される部分である。これらの部分は、特に、２つの不変ヒスチジン（ｈで表される）残基および８つのシステイン残基（ｃ１〜ｃ８で表される）を含む領域として特徴付けられる。
【００５６】
【化１】
本明細書において、ＤＮＡの「ホモログ」とは、参照ＤＮＡのヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有するＤＮＡをいう。ホモログは、代表的には、参照ＤＮＡと、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）についていう場合、ＰＯＸ遺伝子の「ホモログ」とは、ＰＯＸ ＤＮＡ配列と相同性を有するＤＮＡ配列を有するＤＮＡであって、その発現特性（例えば、部位特異性、時期特異性、ストレス応答性など）が同一または類似するＤＮＡをいう。
【００５７】
本明細書において、あるＰＯＸ遺伝子のホモログは、一般的に、参照されるＰＯＸポリペプチドのＰＯＸ非保存領域において相同性を有するが、他のＰＯＸポリペプチドのＰＯＸ非保存領域とは相同性を有さない。遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００５８】
塩基配列の同一性の比較は、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ら（１９８８）、ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８）を用いてデフォルトパラメーターで算出し得る。
【００５９】
ＰＯＸ遺伝子について、発現特性が「同一または類似」であるとは、発現の部位特異性、時期特異性およびストレス応答性のうち少なくとも１つの特性、好ましくは任意の２つの特性の組合せ、より好ましくは全ての特性が同一または類似であることをいう。本明細書において部位特異性について言及する場合、ＰＯＸ遺伝子の根と地上部との発現量の比率を評価して、根部で優勢か、地上部で優勢か、または両部でほぼ均一かの３つに分類したとき、同じカテゴリーに属することを「同一または類似」であるという。時期特異性について言及する場合、ＰＯＸ遺伝子の５日目の芽生えと１６日目の芽生えとでの発現量の比率を評価して、５日目（幼若期）に優勢か、１６日目（成熟期）に優勢か、または両時期でほぼ均一の３つに分類したとき、同じカテゴリーに属することを、「同一または類似」であるという。ストレス応答性について言及する場合、植物が、化学物質（例えば、パラコート、エテフォン、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）など）および物理的刺激（例えば、紫外線（ＵＶ）、切断、摩擦など）のいずれかによるストレスを受けたときの、ＰＯＸ遺伝子の発現量の変化を評価して、特定のストレスへの応答を発現量の増大、発現量の減少、または発現量の無変化の３つに分類したとき、おなじカテゴリーに属することを、「同一または類似」であるという。上記の各発現特性に関して、ＰＯＸ遺伝子の発現量は、下記の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析によって確認され得る。
【００６０】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔm）より約５℃低く選択される。Ｔmは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００６１】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ+未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ+濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００６２】
用語「プロモーター」は、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。従って、「プロモーター活性を有する」核酸配列とは、上記のようなプロモーターとしての働きを有する核酸配列をいう。
【００６３】
本明細書において、植物におけるペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位（例えば、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるＰＯＸ遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じたＰＯＸ遺伝子の発現の特異性をいう。「ストレス応答性」とは、植物に与えられた少なくとも一種のストレスに対して、ＰＯＸ遺伝子の発現が変化することをいう。
【００６４】
ここで、「ストレス」または「刺激」とは、植物に対して、物理的、化学的、生物学的に加えられ得る、植物の正常な生長を妨げる因子のことをいい、本明細書において交換可能に使用されうる。ストレスには、例えば、物理的ストレス（光、熱、冷却、凍結、紫外線、Ｘ線、切断、摩擦など）、化学的ストレス（酸素ストレス、化学物質、生理活性物質など）、生物学的なストレス（ウイルス、病原体（例えば、イモチ病菌）感染など）などが挙げられる。本明細書において使用される場合、「環境ストレス」とは、地球環境の変化に起因する植物に対するストレスをいい、例えば、オゾン層破壊による紫外線量の増加、大気汚染による活性酸素種、化学物質などが、その主な原因として挙げられる。
【００６５】
「酸素ストレス」または「酸化ストレス」とは、酸素および酸素誘導体によってもたらされるストレスをいい、代表的には、活性酸素種（スーパーオキシド、過酸化水素、ハイドロキシルラジカル、一重項酸素など）、オゾン、ＳＯｘおよびＮＯｘなどの大気汚染物質などによって引き起こされる。酸化ストレスは、過酸化状態、紫外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペルオキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御機構（スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ビタミンＥ、ＣおよびＡ等）」とのバランスが崩れたときに起きる。
【００６６】
本明細書において、「根発現型」とは、ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現について、植物の根において優先的に発現される性質、および植物の根および地上部において同程度に発現される性質のいずれかをいう。特に言及する場合、植物の根および地上部において同程度の発現を示すことを、「根および地上部発現型」と称する。「地上部発現型」とは、植物体の地上部の少なくとも一部において根におけるよりも優先的に発現される性質をいう。これらの性質は、それぞれの部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することにより決定することができる。
【００６７】
本明細書において、ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現が「構成的」であるとは、植物の組織において、その植物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、５日目の芽生えおよび１６日目の芽生えの同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的ペルオキシダーゼは、通常の生育環境にある植物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが植物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、植物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することにより決定することができる。
【００６８】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された成分が、それらの有用な機能を奏するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、核酸配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にその配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、核酸配列の発現を方向付けるように機能する限り、その配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写されたが、未だ翻訳されていない配列の介入が、プロモーター配列と核酸配列との間に存在し得、そしてなおこの核酸配列およびプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結され」ていると考えられ得る。
【００６９】
（種々のイネペルオキシダーゼ）
本発明者らによって、多数のイネペルオキシダーゼ遺伝子がそれぞれ互いに異なる種々の発現特異性を有することが示された。本明細書において、イネペルオキシダーゼは、その発現特異性に応じて、代表的に、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２およびＣの少なくとも５クラスに分類され得る。ＡおよびＢの分類は、刺激に対する応答性（誘導性）に基づく。ストレスに対する誘導性を有さないＰＯＸをクラスＡに分類し、ストレスに対する誘導性を有するＰＯＸをクラスＢに分類する。クラスＣには、発現が検出限界以下のものを分類する。
【００７０】
Ａ１およびＢ１には、地中部分に優先的に発現されるか地中部分と地上部分とに同程度に発現される「根発現型」または「根および地上部発現型」のＰＯＸを分類し、他方で、Ａ２およびＢ２には、主に地上部分に発現されるものを分類する。（分類のまとめを表１に示す。）
本発明者らによる２２のＰＯＸ遺伝子の発現解析により、Ａ１およびＢ１に属する酵素が１７個、Ａ２およびＢ２に属するものが４個、Ｃに属するものが１個と分類された（以下の表１Ａ、表１Ｂおよび図１もまた参照のこと）。本発明のＰＯＸ遺伝子は、以下に詳細に説明するように、ストレスに対して種々の異なる独自の応答性を示すこと、および、地上部におけるよりもむしろ根において主に発現されることが明らかになった。
【００７１】
【表１Ａ】
【００７２】
【表１Ｂ】
グレー部分のＰＯＸ遺伝子は、本研究におけるイネイモチ病菌の感染に応答性である。
ａ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
ｂ Ｉｔｏら（１９９４）、ならびにＹａｍａｍｏｔｏおよびＳａｓａｋｉ（１９９４）により記載されたｃＤＮＡライブラリー
ｃ Ｒ１７４４（この実験にさらに使用した）を除く、種々の処置に対する２１のＰＯＸ遺伝子プロモーターの応答、１６日齢のイネをの葉身を使用した（Ｈｉｒａｇａら、２０００）。
略語は、以下のとおりである。ＥおよびＪ：それぞれ、エテフォンおよびジャスモン酸メチルでの処理。Ｎ：応答なし。Ｗ：創傷。
【００７３】
以下に、本発明の範囲内に属する、５つのイネＰＯＸ遺伝子、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４について解説する。
【００７４】
Ｓ１４４９３は、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、以前はＡ２に属すると考えられていたが、本出願によりＢ２に属することが明らかになった。この遺伝子は配列番号１で示される遺伝子配列を有する。Ｓ１４４９３は地上部で優先的に発現される。遺伝子産物が地上部で優先的に発現されることは、地上部の生長の促進または維持（例えば、茎の伸長など）に優先的に寄与する機能を示唆する。Ｓ１４４９３はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｓ１４４９３ＦＰ１（配列番号３２）が挙げられる。Ｓ１４４９３遺伝子に由来するプロモーターもＳ１４４９３の発現特異性を反映していると考えられる。Ｓ１４４９３遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７５】
Ｒ２５７６は、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２５７６は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２５７６は、酸素ストレス（例えば、ＵＶおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激、摩擦ストレス、および病原体接種によって誘導され得る。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２５７６はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンであるＩＡＡ量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号３で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｒ２５７６Ｆ１（配列番号２７）が挙げられる。Ｒ２５７６遺伝子に由来するプロモーターもＲ２５７６の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２５７６遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７６】
Ｒ２１８４もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２１８４は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２１８４は、酸素ストレス（例えば、ＵＶ）および傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激によって誘導され得る。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る。従って、このＰＯＸは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２１８４はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号７で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は、液胞局在性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｒ２１８４ＦＰ１（配列番号２５）が挙げられる。Ｒ２１８４遺伝子に由来するプロモーターもＲ２１８４の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２１８４遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７７】
Ｒ２６９３もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２６９３は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２６９３は、酸素ストレス（例えば、ＵＶ）および傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激によって誘導され得る。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る。従って、このＰＯＸは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２６９３はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号９で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。Ｒ２６９３遺伝子に由来するプロモーターもＲ２６９３の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２６９３遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７８】
Ｒ２３２９もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ２に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２３２９は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２３２９は、酸素ストレス（例えば、ＵＶおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激、摩擦ストレス、および切断ストレスによって誘導され得る。このＰＯＸは、広範なストレスに対して誘導性であることは、種々のストレスに対して初期防御の役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２３２９はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンであるＩＡＡ量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号５で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。Ｒ２３２９遺伝子に由来するプロモーターもＲ２３２９の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２３２９遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７９】
（各遺伝子およびそのホモログの取得方法ならびに発現特異性の確認方法）
本発明のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）遺伝子およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＰＯＸ遺伝子のホモログは、公知のＰＯＸ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の非保存領域に対応する縮重プライマー対を用いて、単離され得る。このプライマー対を用いて、任意の対象植物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ対象植物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、陽性クローンを選択し、配列決定を行い本発明のＰＯＸ遺伝子またはそのホモログの特徴付けを行い得る。
【００８０】
このようにして得られた本発明のＰＯＸ遺伝子またはそのホモログが所望の発現特異性を有することは、例えば、当該遺伝子またはその断片を選択的プローブとして用いて、元の植物における発現特性を分析することで確認し得る。本明細書に開示の方法に従って当該遺伝子を任意の植物に導入して形質転換植物を作出することで確認してもよい。所望の発現特性に基づいて適切な植物材料からＲＮＡサンプルを調製し、このＲＮＡサンプルを用いてノーザンブロット分析を行い、発現量を確認し、比較することができる。
【００８１】
（プロモーターの特定）
上記の各遺伝子のプロモーターは、周知のように、コード領域の上流配列から取得することができる。プロモーターは、代表的には、翻訳開始点の上流約２ｋｂの範囲に存在する配列として定義されるが、これに限定されない。
【００８２】
プロモーター領域の特定は、当該分野で周知の方法に基づいて実施され得る。簡単に述べると、プロモーター領域の候補配列およびレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）を作動可能に連結した発現カセットを構築する。構築した発現カセットを用いて適切な植物細胞を形質転換し、形質転換細胞を植物に再生する。形質転換植物におけるレポーター遺伝子の発現を、適切な検出系（例えば、色素染色）を利用して検出する。検出結果に基づいて、プロモーター領域およびその発現特性を確認し得る。
【００８３】
（発現特異的ＰＯＸ遺伝子を利用する植物の改変方法）
上記のように、本発明のＰＯＸ遺伝子（構造遺伝子）およびプロモーターは、それぞれ、植物の特性を所望の様式で改変するための材料として有用であり得る。改変すべき特性は、植物のストレスに対する抵抗性、および植物の生育または代謝に関連する特性（例えば、生育の速度または期間）を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
本発明のＰＯＸ遺伝子は、適切なプロモーターに作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。また、本発明のプロモーターは、当該分野において周知の方法を用いて、適切な異種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。本明細書において、「発現カセット」とは、本発明におけるＰＯＸ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子、これに作動可能に（すなわち、当該ＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された植物遺伝子プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、本発明のプロモーターと、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸配列をいう。天然のペルオキシダーゼ遺伝子の発現カセット自体を、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る発現カセットである。
【００８５】
本発明のプロモーターに連結され得る「外来遺伝子」とは、そのプロモーターが由来するＰＯＸ遺伝子以外の本発明のＰＯＸ遺伝子、もしくはＰＯＸ遺伝子以外の植物における内因性遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌および真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発現が発現カセットが導入される植物において所望される任意の遺伝子をいう。所望される外来遺伝子としては、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、レポーター遺伝子、病原抵抗性を付与する遺伝子および組織修復に関与する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。抗菌タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、ディフェンシンをコードする遺伝子、α−チオニンをコードする遺伝子、リゾチームをコードする遺伝子、センチニクバエ由来のザルコトキシン１Ａ、エンバク由来の葉特異的チオニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。病原抵抗性を付与する遺伝子としては、例えば、ファイトアレキシン合成系に関与する遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、グルカナーゼをコードする遺伝子、感染特異的タンパク質をコードする遺伝子、サリチル酸合成に関与する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明のＰＯＸ ｃＤＮＡに連結され得る「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味する。例えば、タバコＰＲ１ａプロモーターなどのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター（Ｐｎｏｓ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
上記の発現カセットは、好ましくは、植物発現ベクターの形態が利用される。「植物発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子および、エンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００８８】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００８９】
「薬剤耐性遺伝子」とは、その遺伝子産物が宿主において発現される場合に、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子をいう。薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましく、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得る。
【００９０】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは複数個用いられ得る。
【００９１】
植物発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターあるいはｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられ得る。ｐＢＩ系およびｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。ｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ得る。例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが挙げられる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域（Ｔ−領域）の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現されるＮＰＴ２遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）とを含む。ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。
【００９２】
植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌ ら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、ならびにパーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００９３】
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再生され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザン法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、このタンパク質に対する抗体を使用して、ウェスタンブロット法により確認し得る。また、本発明のＰＯＸプロモーターの発現の特性および強度を調べるために、ＰＯＸプロモーターに外来遺伝子としてレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子）を連結させて発現を検出する方法がある。β−グルクロニダーゼは、Ｄ−グルクロン酸のβ型配糖体に作用して、そのグルクロニド結合を加水分解する酵素であり、高等植物には存在しない場合が多い。イネおよびタバコにはＧＵＳは存在しないことが分かっているため、本明細書ではＧＵＳをレポーター遺伝子として使用し、ＧＵＳ活性を、１ｍｇのタンパク質あたり１分間に遊離した４−ＭＵ（４−メチル−ウンベリフェロン）の量として表す。本明細書において使用されるＧＵＳ活性の測定方法は、概して、次のとおりである。植物組織約１０ｍｇを、エッペンドルフチューブに入れ、約５ｍｇの炭化ケイ素および２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および０．１％ サルコシルを含有する）を添加して、−８０℃で急速に凍結する。３０℃の水浴中で急速に融解した後、必要に応じて溶解緩衝液（４℃）で希釈する。これを、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清５μｌを新しいチューブに移す。サンプルチューブに、酵素溶液（１〜１０μｌ）および溶解緩衝液（４℃）を入れて総量を１２０μｌとする。この混合物に、８０μｌの基質溶液（５ｍＭ ４−ＭＵＧ（溶解緩衝液中）：ＭｅＯＨ＝１：１）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする（コントロールを０分とする）。その後、１ｍｌの反応停止溶液（０．２ＭＮａ2ＣＯ3水溶液）を添加して、反応を停止させる。反応が停止した後、蛍光分光光度計（モデルＦＰ−７７７（ＪＡＳＣＯ）またはモデルＲＦ−５４０（島津製作所））を使用し、励起：３６５ｎｍ、発光：それぞれ、４４８ｎｍまたは４５０ｎｍにより蛍光を定量的に測定する。
【００９４】
本発明のＰＯＸ遺伝子およびプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物の改変にも利用し得る。これは、両植物間でゲノム構造が類似していることにより説明される（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）、Ｖｏｌ．５、７３７−７３９、および長村（Ｎａｇａｍｕｒａ）ら（１９９７）、農業生物資源研究所ニュースＮｏ．５７、１−２）。特に好ましい対象植物としては、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、カンキツ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。ＰＯＸ遺伝子を植物に導入できることは、シロイヌナズナ（吉田（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２１〜１２５）、ヤマナラシ（河岡（Ｋａｗａｏｋａ Ａ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２５〜１２７）、サツマイモ（郭（Ｋｗａｋ Ｓ−Ｓ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２７〜１３０）、およびイネ（平賀（Ｈｉｒａｇａ Ｓ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１３１〜１３６）などで実証されている。
【００９５】
再生した形質転換が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアッセイを行うことにより確認し得る。例えば、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再生した植物体にモデル菌、例えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。
【００９６】
植物発現ベクターが導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００９７】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、特定のイネ品種にその品種に親和性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００９８】
あるいは、形質転換植物のストレス抵抗性は、ＵＶ処理に対する抵抗性、スーパーオキシド発生型除草剤（例えば、パラコート）処理に対する抵抗性、および／または塩ストレスに対する抵抗性などとして評価され得る。
【００９９】
本発明に従って、植物細胞、植物組織、植物器官または植物体に導入されたＰＯＸプロモーターおよびこれに作動可能に連結された外来遺伝子は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したＰＯＸプロモーターおよび外来遺伝子が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明のＰＯＸプロモーターおよび外来遺伝子が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原体感染などのストレスに対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、遺伝形質が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【０１００】
（遺伝子発現アッセイ）
本発明はまた、本発明のペルオキシダーゼ遺伝子またはそのセット、あるいはプロモーター由来の配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、植物の特性を解析するための方法を提供する。このような方法としては、ノーザンブロット分析などが挙げられる。そのような方法の概説としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ 、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹなどが挙げられる。
【０１０１】
（ディファレンシャルディスプレイ技術）
本発明はまた、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いた遺伝子解析に用いられ得る。
【０１０２】
ディファレンシャルディスプレイ技術とは、発現変動する遺伝子を検出または同定するための方法である。この方法では、２つ以上のサンプルからｃＤＮＡをそれぞれ作製し、任意のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅し、その後、生成された複数のＰＣＲ産物をゲル電気泳動により分離し、パターン化した後、各バンドの相対的なシグナル強度変化をもとに、発現変動遺伝子がクローニングされる。
【０１０３】
以上、本発明のＰＯＸプロモーターおよびそれらの利用方法について、詳説してきた。以下に、本発明の例示である、実施例を記載する。
【０１０４】
【実施例】
以下に記載する実施例は、本発明の例示であり、いかなる様式においても本発明を限定するものではない。従って、当業者は、実施例に記載された事項に基づき、特許請求の範囲内において、本発明に任意の改変を施し得る。
【０１０５】
なお、以下の実施例において使用した試薬類は、特記した場合を除いて、和光純薬、寶酒造から入手した。
【０１０６】
（材料および方法）
（イネの生育）
実験系統として、イモチ病感受性のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（本実施例において以下、親和性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）または−Ｐｉ−ｉと称する）、イモチ病抵抗性のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（本実施例において、非親和性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）、ＩＬ−７または＋Ｐｉ−ｉと称する。（国立農業研究センター（Ｎａｔ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔ．ｏｆ Ｊａｐａｎ）より入手可能）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、必要に応じて、３および４葉期、５葉期、６葉期、８葉期、または９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。別段記載されない限り、イモチ病感受性のイネを使用した。
【０１０７】
（イモチ病菌胞子噴霧液の調製）
イモチ病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ レース００３）を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中に濃度３×１０5胞子／ｍｌに懸濁することにより、イモチ病菌胞子噴霧液（以下、便宜上「噴霧液」という）を調製し、以下の実験に使用した。
【０１０８】
（実施例１） ＰＯＸ遺伝子の分類
（イモチ病菌によるＰＯＸ遺伝子の誘導）
上記の表１Ｂに示される各々のＰＯＸ遺伝子を、まず、イモチ病菌感染に対する誘導性に従って分類した。続いて、次いで、プロベナゾール（ＰＢＺ；イモチ病予防農薬（明治製菓からオリゼメート粒剤として入手可能））、ジャスモン酸（ＪＡ）および創傷、の各処理後の誘導性により、分類した。簡潔には、以下のとおりである。
【０１０９】
親和性イネ（８葉期）に、上記の噴霧液を、２４個体あたり１００ｍｌ噴霧することによりイモチ病菌を接種した。親和性イネを、温室にて２５℃で６時間、１２時間および１日インキュベートした後に、それぞれ最上部の葉身を採取し、ＡＴＡ法（Ｎａｇｙら（１９８８）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｇｌｅｖｉｎら編）、Ｂ４：１−２９頁、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて単離した総ＲＮＡを用いて、ＲＮＡゲルブロット分析（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により行った。
【０１１０】
表１Ｂに示した２２のイネＰＯＸ遺伝子の３’非翻訳領域をカバーするｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ法により増幅し、この増幅フラグメントを各ＰＯＸ遺伝子に特異的なプローブとして、ＲＮＡゲルブロット分析に使用した。各クローンに特異的なプローブを作製する際に使用した主な配列（配列番号１９〜３５）を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
上記ＲＮＡを電気泳動後、転写したメンブレン（ＨｙＢｏｎｄ Ｎ、アマシャム）に、特異的プローブをハイブリダイズさせた後、０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣを用いて、５分間（１回）および１０分間（２回）、室温で洗浄し、その後、０．１％ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣを用いて、６５℃で１５分間で３回洗浄した。次いで、オートラジオグラフィー用フィルム（ＸＡ ＯＭＴ、コダック）を用いて、−８０℃でオートラジオグラフィーに一晩以上かけた。取り出したフィルムを、ＢＡＳ２０００ Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ分析機（富士写真フィルム）またはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ（モリキュラーダイナミクス）を、製造業者の指示に従って用いて分析した。ロードしたＲＮＡ量の確認は、メチレンブルー染色したリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のレベルをモニターすることによって行った。各ＰＯＸの発現量を、このｒＲＮＡのレベルを標準として用いて比較した。
【０１１２】
（ＰＢＺ、ＪＡおよび創傷によるＰＯＸ遺伝子の誘導）
上記でイモチ病菌感染により誘導されたＰＯＸ遺伝子を、ＰＢＺ、ＪＡ、および創傷での処理に対する誘導性に従って分類した。プロベナゾールを、１００ｍｇ／ｍｌに希釈し、接種液として使用した。８葉期のイネに、ＰＢＺ接種、ＪＡ接種、および直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、創傷を施したこと以外は、上記の方法と同様にＲＮＡゲルブロット分析を行った。
【０１１３】
イモチ病菌感染接種、ＰＢＺ接種、ＪＡ接種、および創傷処理に対する誘導性により、使用した２２のＰＯＸ遺伝子は、図１に示されるように分類されることが分かった。特に、Ｒ２５７６、Ｓ１４４９３は、いずれの処理によっても誘導され、Ｒ２６９３はＰＢＺおよびＪＡを接種することにより誘導されることが分かった。Ｒ２３２９は、創傷処理により誘導され、ＪＡ接種によりわずかに誘導されることが分かった。
【０１１４】
特に、上記の４つのＰＯＸ遺伝子（Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、およびＲ２６９３）は、過敏感反応および傷害に関与する重要なシグナル伝達物質であるジャスモン酸接種により誘導される（図８もまた参照のこと）ことから、植物組織に病変部が現れる前に、植物体が病原体に感染したか否かを検出するために特に有用であると考えられる。
【０１１５】
（実施例２） イモチ病菌に対する親和性イネのＰＯＸ遺伝子の発現パターンと非親和性イネのＰＯＸ遺伝子の発現パターンとの比較
実施例１に記載した条件を用いて、親和性イネおよび非親和性イネともに８葉期まで生育させて実験に使用した。これら８葉期のイネを用いて、病原体ストレスとしてのイモチ病菌接種に対するイネペルオキシダーゼの誘導性について分析した。イモチ病菌の接種を、実施例１に記載されるように行った。
【０１１６】
接種して２日後、３日後、４日後、５日後および８日後の葉身の病変部を図２Ａに示す。それぞれのイネの病変部の大きさの差異を、図２Ｂのグラフに示す。これらの結果から、親和性イネでは、感染３日目に小さな壊死病変の形成が確認され、４〜５日目以降は病変が急激に拡大し、イモチ病菌の胞子形成が確認される一方で、耐病性イネでは、親和性イネと同様に小さな壊死病斑の形成が確認されたが、感染２日目以降、その病変部の大きさにほぼ変化がないことが観察された。
【０１１７】
（実施例３） 親和性イネにおけるＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現
実施例１において分類した５つのＰＯＸ遺伝子の特徴をより明らかにするために、３葉期、５葉期、６葉期および９葉期の親和性イネを使用して、これらＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現を（それぞれの段階の根、子葉鞘、最上部の葉身、および円錐花序について）、ＲＮＡブロット分析により調べた。結果を図３に示す。この結果は、ＰＯＸ遺伝子の構成的な発現が、主に、根および子葉鞘において観察され、５葉期〜９葉期の葉身においては、ＰＯＸ遺伝子がほとんど発現していない一方で、３葉期の葉身においてはＲ２５７６、Ｒ２１８４およびＲ２６９３が非常に強く発現していることを示す。このことは、これらＰＯＸ遺伝子が、成体イネの葉身においては発現しないが、幼若期のイネで構成的に発現することを示している。
【０１１８】
（実施例４） イモチ病菌接種後の植物についてのＲＮＡ発現パターンの解析次に、ＰＯＸ遺伝子とイモチ病との関係について調べた。実施例１に記載した条件を用いて、親和性イネおよび非親和性イネともに８葉期まで生育させて実験に使用した。これら８葉期のイネを用いて、病原体ストレスとしてのイモチ病菌接種に対するイネペルオキシダーゼの発現パターンについて分析した。イモチ病菌の接種を、実施例１に記載されるように行った。偽接種（コントロール）として、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液を接種した。接種直後、６時間後、１２時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、および５日後に、イネの最上部の葉身を採取した。これら採取時間を、実施例１で親和性イネで病変が認められた３日目を境にして、接種後０〜２日目までの第１相と、３日目以降の第２相に分けた。実施例１と同様に、総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。イモチ病菌を接種した親和性イネと非親和性イネにおけるそれぞれのＰＯＸ遺伝子のゲルブロット分析における比較結果を図４に示す。半定量的発現パターンの比較結果もまた、図５に示す。Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４、Ｒ２６９３の４つのＰＯＸ遺伝子は、偽接種したイネにおいて、１日目および２日目に一過性に発現された（図４左パネル）。イモチ病菌を接種した親和性イネにおいては、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４およびＲ２６９３のいずれも５日目に強く発現された。Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６およびＲ２３２９は、接種後６時間で発現された。この時点で、偽接種したイネにおいては、これらのＰＯＸ遺伝子は、発現していなかった。Ｒ２１８４およびＳ２６９３については、接種１日後に発現された。イモチ病菌を接種した非親和性イネにおいては、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４およびＲ２６９３のいずれも接種後１日目までに発現され、特にＲ２５７６は、接種後３時間目という短時間で発現された（図６もまた参照のこと）。Ｒ２３２９は、親和性イネにおいては接種後６時間目から４日後までは低レベルで発現され、接種後５日目には高レベルで発現している。一方、非親和性イネにおいて、Ｒ２３２９は接種後６時間目に発現され、５日目まで高レベルでの発現が維持されていた。従って、親和性イネおよび非親和性イネいずれにおいても、これら５つのＰＯＸ遺伝子は、第１相において主に発現されることが分かった。
【０１１９】
（実施例５） プロベナゾール処理後の植物についてのＰＯＸ遺伝子の発現パターンの解析
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。１００ｍｇ／ｍｌのＰＢＺを噴霧した後の５つのＰＯＸ遺伝子の応答を、８葉期の日本晴の最上部の葉身において測定した。上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供して、本発明の５つのＰＯＸ遺伝子について調べた。結果を図７に示す。Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、Ｒ２６９３は、接種して６時間後に高レベル発現され、Ｒ２３２９は、６時間後に低レベルで発現され、接種して５日後においても低レベルのままであった。
【０１２０】
（実施例６） ＰＯＸ遺伝子の発現に対する防御シグナル化合物の効果
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。１ｍＭ ジャスモン酸、３ｍＭ サリチル酸、および１ｍＭ アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＣ）溶液を、それぞれ８葉期のイネの最上部の葉身に噴霧して０日後、６時間後、および１日後に、それぞれの最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。結果を、図８に示す。ゲルブロット分析において、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、およびＲ２６９３がジャスモン酸を噴霧して１日後に高レベルで発現された。ＡＣＣまたはサリチル酸を噴霧して１日後には、上記４つのＰＯＸ遺伝子が発現されたが、ジャスモン酸と比較すると、それらの発現はあまり高くなかった。
【０１２１】
（実施例７） 創傷に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。イネの最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、傷をつけた。示された時間の後に、最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供し、５つのＰＯＸ遺伝子の発現パターンを調べた。結果を図９に示す。ＲＮＡゲルブロット分析により、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、およびＲ２３２９は、創傷を与えてわずか６時間という短い期間で発現され、その発現は、６時間から４日間にわたって続いた。
【０１２２】
図７、８および９から理解されるように、上記５つのＰＯＸ遺伝子は、イモチ病菌による感染により誘導されたが、ＳＡおよびＡＣＣによっては誘導されず、ＪＡ誘導性ＰＯＸ遺伝子であるＲ２５７６およびＲ２１８４は、創傷によっても誘導された。しかし、ＪＡ誘導性ＰＯＸ遺伝子であるＲ２３２９は、ジャスモン酸処理には、ほとんど応答しなかった。このように、これらＰＯＸ遺伝子は、個々に、プロベナゾール（ＰＢＺ）、ジャスモン酸（ＪＡ）、アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＣ）、およびサリチル酸（ＳＡ）による誘導に対して、定性的にも定量的にも独自の発現パターンを示す。
【０１２３】
（実施例８） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを含むベクターの構築
植物形質転換用ベクターを作製するために、ｐＢＩ１０１を改変して、ｐＢＩ１２１Ｈｍを構築した。概略は以下のとおりである。ｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９９７）、ｐＧＩ２２１（３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳ；Ｏｈｔａら、１９９０）およびｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧを用いて、５つのＰＯＸプロモーターそれぞれについて、ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを含むバイナリベクターを構築した。
【０１２４】
具体的には、基本骨格をなすｐＢＩ１０１ベクターは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，６ ３９０１−３９０７に記載されるものであり、ＣＬＯＮＴＥＣＨから販売されるものを利用した。３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳを含むｐＩＧ２２１は、Ｏｈｔａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３１，８０５−８１３に記載されるものである。Ｈｙｇr（ハイグロマイシン耐性遺伝子）を含むｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧは、Ｄｒ．Ｋｏ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏから入手したが、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドであれば、どのようなものであっても利用することができ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されている。
【０１２５】
まず、ｐＢＩ１０１ベクターを、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとで消化した。ｐＩＧ２２１に含まれる３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳをＳｓｔ１とＰｓｔ１とで消化することによって切り出した。次にＨｙｇrは、ｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧをＢａｍＨ１とＳｓｔ１とで消化することによって切り出した。これらの消化は、制限酵素を入手した寶酒造が提供するＵｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ中のそれぞれの酵素の組み合わせで適切なものを利用することによって行った。
【０１２６】
このようにして得られたｐＩＧ１２１Ｈｍをバイナリーベクターの基本骨格として用い、３５Ｓプロモーターの代わりに本発明のプロモーター配列を用いることによって、そのプロモーター活性を測定した。プロモーター活性はＧＵＳによって観察することができる。各々のプラスミドの概略図を図１０ＢおよびＣに示し、以下にその作製法を概説する。
【０１２７】
上述のように作製したｐＩＧ１２１ＨｍをＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩと、ＸｂａＩまたはＢａｍＨ１との組み合わせを用いて消化して３５Ｓプロモーターを取り除き、これに各々のＰＯＸ由来プロモーター配列を挿入して図１０ＢおよびＣに示される構造を作製した。
【０１２８】
Ｒ２６９３由来プロモーターが入ったｐＩＧ２６９３ＧＵＳは、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとを用いた消化によって断片を調製し、この断片を消化されたｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１２９】
Ｒ２１８４由来プロモーターが入ったｐＩＧ２１８４ＧＵＳは、ＢａｍＨＩとＸｂａＩとを用いて消化断片を生成し、この断片を消化された上述のｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３０】
Ｒ２１８４の０．６ｋｂの断片が入ったｐＩＧ２１８４ＡＧＵＳは、Ｒ２１８４からＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとを用いて消化断片を生成し、この断片を上述の消化ｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３１】
Ｒ２３２９が入ったｐＲ２３２９ＧＵＳは、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩとを用いて消化して断片を生成し、この断片を上述の消化ｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３２】
これらのベクターを用いて各々のプロモーターの活性を測定し、特性を特徴付けた。
【０１３３】
（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２３２９プロモーターの最小単位の決定）ＰＯＸ遺伝子Ｒ２１８４の削りこみを行うために、制限酵素として、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用した。緩衝液としては、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（寶酒造）の中の適切なものを使用した。適切な緩衝液中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使用して消化し、Ｒ２１８４を消化し、１９９３ｂｐ（Ｒ１ａと称する）のプロモーターフラグメントを得た。また、これをさらにＨｉｎｄＩＩＩを使用して制限消化し、それぞれ、５４８ｂｐ（Ｒ１ｃと称する）および１７２ｂｐ（Ｒ１ｅと称する）のプロモーターフラグメントを得た。Ｒ１ａの挿入については、ｐＩＧ１２１Ｈｍを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで適切な緩衝液中で消化し、プラスミドを直鎖状にした。この直鎖状にしたプラスミドと得られたフラグメントＲ１ａを連結し、形質転換用ベクターｐＩＧＲ１ａを得た。同様に、Ｒ１ｃおよびＲ１ｅの挿入については、ｐＩＧ１２１Ｈｍを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限消化して直鎖状にし、これと得られたＲ１ｃまたはＲ１ｅを連結して、形質転換用プラスミドｐＩＧＲ１ｃおよびｐＩＧＲ１ｅを構築した。
【０１３４】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２３２９については、制限酵素として、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用した。これらの酵素を使用してＲ２３２９を消化し、制限消化した断片をゲル電気泳動に供すると、３つのバンド（１８０７ｂｐ、７４８ｂｐ、および１５６ｂｐ）が得られた。ゲルからそれぞれのバンドを切り出し、このバンドからＤＮＡを抽出して、プロモーターフラグメントを得た（それぞれ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｅ）。これら３つの得られたフラグメントを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに適切な緩衝液中で連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ３ａ、ｐＩＧＲ３ｃ、およびｐＩＧＲ３ｅを構築した。
【０１３５】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２５７６の削りこみを行うために、制限酵素としてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使用した。これらの酵素を使用して適切な緩衝液中でＲ２５７６を消化し、２１９２ｂｐのＲ２５７６プロモーターフラグメント（Ｒ５ａと称する）を得た。得られたフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを使用して制限消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ５を構築した。
【０１３６】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２６９３の削りこみを行うために、制限酵素としてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、１３１７ｂｐのＲ２６９３プロモーターフラグメント（Ｒ６と称する）を得た。得られたフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ６を得た。概略図を図１０および１１に示す。
【０１３７】
（実施例９）ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳバイナリベクターを用いたイネの形質転換
実施例８において生成した種々のＰＯＸプロモーターを含むベクターを用いて、親和性イネのカルスを形質転換し、再分化させて、トランスジェニックイネを生産した。
【０１３８】
その具体的な手順は以下のとおりである。
【０１３９】
１．前培養
親和性イネの種子を、適切な濃度のオーキシン（２，４−Ｄ）を含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、２．８ｇ／Ｌ プロリン、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ８．８）に播種し、２７〜３２℃にて５日間インキュベートした。この間に種子は発芽した。
【０１４０】
２．植物発現ベクター
アグロバクテリウムを形質転換するための植物発現用ベクターとして、図１０に示されるｐＩＧＲ１ａ、ｐＩＧＲ１ｃ、ｐＩＧＲ１ｅ、ｐＩＧＲ３ａ、ｐＩＧＲ３ｃ、ｐＩＧＲ３ｅ、ｐＩＧＲ５、ｐＩＧＲ６ならびに図１０ＢおよびＣに示されるｐＩＧ２３２９ＧＵＳ、ｐＩＧ２１８４ＧＵＳ、ｐＩＧ２１８４ＧＵＳ、ｐＩＧ２６９３ＧＵＳを使用した。これらベクターを使用して、Ｈｏｏｄらの方法（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１（１９８６））に従って、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１を形質転換した。ＥＨＡ１０１は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来の菌である。
【０１４１】
１．３ アグロバクテリウム感染
形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、１０ｇ／Ｌ グルコース、０．３／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．２を含有する）に移植した。遮光して３日間、２８℃にてインキュベートした。
【０１４２】
１．４ 除菌および選抜
インキュベートした後、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を使用して、種子からアグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を以下の条件下で行った。
【０１４３】
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に種子を置き、７日間、２７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４４】
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に種子を置き、さらに７日間、２７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４５】
１．５ 再分化
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
【０１４６】
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、３０ｇ／Ｌ ソルビトール、２ｇ／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ カイネチン、０．００２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８））上に選抜された種子を置き、２週間、７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４７】
第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４８】
１．６ 鉢上げ
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２４ｍｇ／Ｌ）を補充したホルモンフリーのＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。
【０１４９】
このようにして得た形質転換体は、このベクター中にコードされるハイグロマイシン遺伝子によりハイグロマイシンに対する抵抗性が付与されていた。
【０１５０】
（生育段階におけるＰＯＸ：：ＧＵＳ−Ｔ１植物のＧＵＳ活性の誘導）
上記のように得られた全長のＰＯＸプロモーターを含む成体段階の形質転換体Ｔ１（形質転換当代の８葉期の植物）の最上部の葉身を切り取り、５０μＭ ＭｅＪＡおよびコントロールとして水のいずれかに浸漬し、２３℃にて４８時間インキュベートした後、ＧＵＳ染色に供した。これらの形質転換体において誘導されたＧＵＳ活性を、図１２に示す。この図において、切り取って直後の葉身を０時間として示した。この図におけるデータ点は、６〜９個体の独立した植物のＧＵＳ活性を示す。平均を横棒として示した。Ｒ２１８４プロモーターは、切断およびＪＡの両方の処理によってＧＵＳ活性が誘導され、Ｒ２６９３プロモーターは、ＪＡの処理によってのみＧＵＳ活性が誘導された。これらの結果は、いずれもＲ２１８４ ＰＯＸ遺伝子およびＲ２６９３ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致する。Ｒ２３２９プロモーターについては、創傷処理によりＧＵＳ活性が誘導された。これは、Ｒ２３２９ ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致する。Ｓ１４４９３およびＲ２５７６についても同様であった。
【０１５１】
（形質転換体Ｔ１の各組織におけるＧＵＳ発現の測定）
同様に、全長のＰＯＸプロモーター（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２６９３プロモーター）の各々を含む形質転換体（３．５葉期および８葉期）を実験植物として使用し、その葉身、葉鞘および根におけるＧＵＳ発現を、常法に従って測定した。コントロールとして、３５Ｓ：：ＧＵＳを含む発現ベクターを用いて形質転換した植物を使用した。結果を図１３および１４に示す。これらの結果は、それぞれのＰＯＸプロモーターが、それぞれのＰＯＸ遺伝子の発現特異性を反映していることを意味する。
【０１５２】
（形質転換体Ｔ２の種々の処理によるＧＵＳ活性の誘導）
同様に、全長のＰＯＸプロモーター（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２６９３プロモーター）の各々を含む形質転換体２代目のイネ植物（以下Ｔ２と称する）を、８葉期まで生育させ、実験植物として供した。この形質転換体Ｔ２の最上部の葉身を、５０μＭ ＭｅＪＡ、１μＭ パラコート（除草剤（パラコート（商品名）（１，１−ジメチル−４，４−ジピリジニウムジクロリド）等））、もしくは１００μｇ／ｍｌ プロベナゾール（ＰＢＺ）の噴霧または炭化ケイ素粉末（キシダ化学製）を用いた摩擦によって処理し、２５℃にて４８時間インキュベーションした後、最上部の葉身を採取し、ＧＵＳ活性を測定した。摩擦処理およびパラコート処理のコントロールとして滅菌水処理（コントロール１）したＴ２植物、ＭｅＪＡ処理のコントロールとして０．２％エタノール処理（コントロール２）、およびプロベナゾール処理のコントロールとして、０．１％アセトン処理（コントロール３）したＴ２植物をそれぞれ使用し、同様に最上部の葉身を採取して、ＧＵＳ活性を測定した。結果を図１５に示す。独立した３系統におけるＧＵＳ活性のプロットを示す。平均を、それぞれ横棒として示す。
【０１５３】
（削り込みプロモーターを有する形質転換植物におけるＧＵＳ活性の誘導）
上記のように作製したＲ２１８４プロモーター：：ＧＵＳ（すなわち、Ｒ１ａ：：ＧＵＳ、Ｒ１ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ１ｅ：：ＧＵＳ）またはＲ２３２９（すなわち、Ｒ３ａ：：ＧＵＳ、Ｒ３ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ３ｅ：：ＧＵＳ）を有する形質転換体Ｔ１を、Ｒ２１８４については５０μＭ ＭｅＪＡにより処理し、Ｒ２３２９については炭化ケイ素による摩擦により処理した。各Ｔ１植物を２３℃にて４８時間インキュベートし、最上部の葉身を採取して、ＧＵＳ活性を測定した。さらに、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液を偽接種したＴ１植物、およびイモチ病菌レース００３を接種したＴ１植物についても、同様にＧＵＳ活性を測定した。結果を、図１６に示す。図におけるデータ点は、それぞれ６〜１０の独立したＴ１個体におけるＧＵＳ活性のプロットである。
【０１５４】
（考察）
これらの結果により、５つのＰＯＸプロモーターは、それぞれのＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致して、種々の誘導に応答してＧＵＳ活性を発現させることが分かった。Ｒ２１８４およびＲ２３２９については、プロモーターの削りこみを行ったが、Ｒ１ｃ：：ＧＵＳ、Ｒ１ｅ：：ＧＵＳ、Ｒ３ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ３ｅ：：ＧＵＳのいずれも、ＭｅＪＡ処理および摩擦処理により誘導されなかった。従って、Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２３２９プロモーターの最小単位は、Ｒ２１８４の上流の境界が、−１９９３ｂｐ〜−５４８ｂｐの間に、Ｒ２３２９プロモーターの上流の境界が、−１８０７ｂｐ〜−７４８ｂｐの間に存在するようである。
【０１５５】
（実施例１０） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳ形質転換体の組織化学的分析（Ｒ２１８４：：ＧＵＳ Ｔ１およびＲ２１８４：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析）
実施例９において作出した、Ｒ２１８４：：ＧＵＳを有する形質転換体Ｔ１またはＴ２を、成体段階および８葉期まで生育させて、実験植物として使用した。これらの植物にＭｅＪＡ処理を施し、ＧＵＳ反応を３７℃で、０．５時間後、８時間後、および２４時間後に葉鞘、葯、節部分および根を切片にし、ＧＵＳ染色を行った。結果を図１７に示す。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＭｅＪＡ処理して４８時間インキュベートした後の葉身を示す。（Ａ）および（Ｄ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ１植物（本明細書において、例えば、「Ｒ１ａ−５Ｔ１植物」のような表記は、Ｒ１ａ−Ｔ１植物の個体番号を入れた呼称である）であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、Ｒ１ａ−４Ｔ１植物である。（Ｅ）および（Ｆ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の葯を示す。（Ｇ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の節部分の横断切片である。（Ｈ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の根の横断切片である。（Ａ）〜（Ｈ）により示されるように、Ｒ２１８４ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致して、ＧＵＳは、葉身および葉鞘、維管束、および根において高レベルで発現していた。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５６】
（Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ２植物の組織化学分析）
成体段階のＲ２３２９（−１８０７ｂｐ）：：ＧＵＳ Ｔ１植物および８葉期のＲ２３２９（−１８０７ｂｐ）：：ＧＵＳを含むＴ２植物を用いてＧＵＳ染色を行った。結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。（Ａ）および（Ｂ）は、創傷後、３７℃で１６時間インキュベートした後の葉身の横断切片である。（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｒ３ａ−１０Ｔ１植物の節間部分の横断切片である。（Ｅ）および（Ｆ）は、Ｒ３ａ−４Ｔ１植物の稈の切片である。（Ｇ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ１植物の葯であり、（Ｈ）は、葯の切片である。（Ｉ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の節間部分の横断切片である。（Ｊ）および（Ｋ）は、Ｒ３ａ−３Ｔ２植物の葉鞘の横断切片である。（Ｌ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の成熟葉身の横断切片である。（Ｍ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の幼若葉身の横断切片である。（Ｎ）は、Ｒ３ａ−３Ｔ２植物の根の横断切片である。（Ａ）〜（Ｎ）により示されるように、Ｒ２３２９遺伝子の発現特異性と一致して、ＧＵＳは、葉身および葉鞘、維管束、および根において高レベルで発現していた。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５７】
（Ｒ２６９３：：ＧＵＳを含むＴ１植物の組織化学分析）
Ｒ２６９３：：ＧＵＳ Ｔ１植物を成体段階または８葉期まで成育させて、実験植物として使用した。結果を、図１９に示す。（Ａ）および（Ｂ）は、Ｒ２６９３：：ＧＵＳを含むＴ１植物の葉鞘の横断切片である。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５８】
従って、外来遺伝子が作動可能に連結されたＰＯＸプロモーターを含む形質転換植物体においても、ネイティブのイネ植物と同様な発現特異性が認められた。このことは、実際に、外来遺伝子として病原体抵抗性を付与する遺伝子、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、組織修復に関与する遺伝子をＰＯＸプロモーターに作動可能に連結させたベクターをイネ植物体に導入することにより、病原抵抗性が付与されたイネ植物体を作出できることを示している。
【０１５９】
（実施例１１） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを有するタバコ形質転換体の組織化学的分析
実験植物として、双子葉植物であるタバコを使用した。Ｒ２１８４プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ１ａ）、Ｒ２３２９プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ３ａ）、Ｒ２５７６プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ５）およびＲ２６９３プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ６）を、タバコを形質転換するために使用した。
【０１６０】
タバコ形質転換体を、実施例９と同様に作製した。隔離温室または陽光定温器内で９葉期まで育成した。この形質転換タバコの最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、ストレスを与えた。傷をつけて３日後、最上部の葉身を採取し、その切断面におけるＧＵＳの活性を観察した。結果を図２０に示す。また、矢印は、切断面を示す。Ｒ２１８４、Ｒ２５７６、およびＲ２６９３は、切断面で特異的に強く発現しているが、Ｒ２３２９は、傷口周辺において全体的に発現していることが観察された。このことは、イネ以外の形質転換植物においても、この植物体にストレスを与えた場合、本発明のＰＯＸプロモーターが誘導されることを示す。従って、実際に、外来遺伝子として病原体抵抗性を付与する遺伝子、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、組織修復に関与する遺伝子をＰＯＸプロモーターに作動可能に連結させたベクターを植物体に導入することにより、病原抵抗性が付与された任意の植物体を作出できることを示している。
【０１６１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０１６２】
【発明の効果】
本発明により、従来困難であった、種々のペルオキシダーゼの発現特異性を解明し、およびそれらの発現特異性を利用して植物に改変を施すための手段を提供することが可能になった。本発明はさらに、本発明のペルオキシダーゼ遺伝子の特異的発現を利用し、ＰＯＸプロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子を発現させることにより、病原体に対する抵抗性が植物体に付与される。また、本発明により、病原体感染の早期発見が可能になる。
【０１６３】
（配列表の説明）
配列番号１：クローン番号Ｓ１４４９３の核酸配列（イネ）。
配列番号２：配列番号１の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号３：クローン番号Ｒ２５７６の核酸配列（イネ）。
配列番号４：配列番号３の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号５：クローン番号Ｒ２３２９の核酸配列（イネ）。
配列番号６：配列番号５の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号７：クローン番号Ｒ２１８４の核酸配列（イネ）。
配列番号８：配列番号７の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号９：クローン番号Ｒ２６９３の核酸配列（イネ）。
配列番号１０：配列番号９の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号１１：プロモーターＲ１の核酸配列（イネ）。
配列番号１２：プロモーターＲ１ａの核酸配列（イネ）。
配列番号１３：プロモーターＲ１ｃの核酸配列（イネ）。
配列番号１４：プロモーターＲ１ｅの核酸配列（イネ）。
配列番号１５：プロモーターＲ３の核酸配列（イネ）。
配列番号１６：プロモーターＲ３ａの核酸配列（イネ）。
配列番号１７：プロモーターＲ３ｃの核酸配列（イネ）。
配列番号１８：プロモーターＲ３ｅの核酸配列（イネ）。
配列番号１９：プローブＣ５２９０３ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２０：プローブＣ６２８４７ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２１：プローブｐｒｘＲＰＡＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２２：プローブｐｒｘＲＰＡＲＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２３：プローブＲ０３１７Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２４：プローブＲ１４２０ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２５：プローブＲ２１８４ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２６：プローブＲ２３９１ＦＰ２の核酸配列（イネ）。
配列番号２７：プローブＲ２５７６Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２８：プローブＳ１０９２７ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２９：プローブＳ１１２２２ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３０：プローブＳ１３３１６ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３１：プローブＳ１４０８２ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３２：プローブＳ１４４９３ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３３：プローブＳ４３２５Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３４：プローブｐｒｘＲＰＮＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３５：プローブｐｒｘＲＰＮＲＰ１の核酸配列（イネ）。
【０１６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２２のイネペルオキシダーゼを、創傷、プロベナゾールおよびジャスモン酸の処理により誘導された発現特異性に基づく分類を示す。
【図２】図２は、親和性品種である日本晴（左パネル）と非親和性品種であるＩＬ−７（右パネル）に、それぞれ８葉期のときに、イモチ病菌レース００３の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液に懸濁した胞子（３×１０5胞子／ｍｌ、２４個体あたり１００ｍｌ）を噴霧した。噴霧の２日後、３日後、４日後、５日後、および８日後に、病変部を撮影し、病変部の大きさを測定した。病変部の写真を２Ａに、そして病変部の大きさを棒グラフにしたものを２Ｂに示す。
【図３】図３は、１０のＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現を示すゲル写真である。イモチ病菌感染に応答した１０のＰＯＸ遺伝子の特異的発現を、親和性イネである日本晴の種々の組織（根、葉鞘、最上部の葉身（それぞれ、３葉期および４葉期、５葉期、６葉期、および９葉期）、および健常な野生型日本晴の円錐花序）を用いて調査した。これらの組織から総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図４】Ｍ．ｇｒｉｓｅａ感染に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答を示すゲル写真である。親和性品種の日本晴（左パネル）と非親和性品種であるＩＬ−７（右パネル）に、それぞれ８葉期のときに、イモチ病菌レース００３の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液に懸濁した胞子を噴霧し、示された時間の後、ＰＯＸ遺伝子の発現を測定した。コントロールとして、８葉期の日本晴に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を同量接種したものを使用した。示された時間の後に最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、各遺伝子の３’ＵＴＲ特異的プローブを使用して、１レーンあたり２０μｇをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図５】図５は、図４の結果を半定量的に示したグラフである。横軸は、接種後日数を示し、縦軸は任意の単位である。発現パターンにより、ＰＯＸ遺伝子は、６つのタイプに分けられた。
【図６】図６は、イモチ病菌を接種した後のＲ２５７６転写物の蓄積を示したゲル写真である。８葉期の日本晴に３×１０5胞子／ｍｌのＭ．ｇｒｉｓｅａレース３を接種し、示された時間の後、最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。接種して１時間後で、既にＲ２５７６が発現していることが示される。
【図７】図７は、イネのプロベナゾール（ＰＢＺ）により誘導されたＰＯＸ遺伝子の発現を示すゲル写真である。１００ｍｇ／ｍｌのＰＢＺを噴霧した後の１０のＰＯＸ遺伝子の応答を、８葉期の日本晴の最上部の葉身において測定した。上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図８】図８は、ＰＯＸ遺伝子の発現に対する防御シグナル化合物の効果を示すゲル写真である。１ｍＭ ジャスモン酸、３ｍＭ サリチル酸、および１ｍＭ ＡＣＣ溶液を、それぞれ８葉期の日本晴の最上部の葉身に噴霧して０日後、１／４日後、および１日後に、それぞれの葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図９】図９は、創傷に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答を示すゲル写真である。８葉期の日本晴の最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、傷をつけた。示された時間の後に、総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、５つのＰＯＸ遺伝子（Ｒ２１８４、Ｒ２３２９、Ｒ２５７６、Ｒ２６９３およびＣ５２９０３）についての各ｒＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するバイナリベクターの構造を模式的に示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｐＩＧｎＧＵＳ、ｐＩＧ２６９３ＧＵＳおよびｐＩＧ２１８４ＧＵＳの構造を模式的に示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｐＩＧ２１８４ＡＧＵＳ、ｐＩＧ２３２９ＧＵＳおよびｐＩＧ１２１Ｈｍの構造の模式図を示す。
【図１１】図１１は、ＧＵＳ遺伝子とｒＰＯＸプロモーターとの融合物を示すＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、成体段階のｒＰＯＸ：：ＧＵＳ−Ｔ１植物におけるＧＵＳ活性（６〜９の独立したトランスジェニック植物のＧＵＳ活性）の誘導を示す。平均値を、バーで示す。
【図１３】図１３は、異なる発生段階でのＴ２トランスジェニックイネにおけるｒＰＯＸ：：ＧＵＳ遺伝子の器官特異的発現を示す。独立した９〜１５株のそれぞれのプロットとしてＧＵＳ活性を示した。３５Ｓ：：ＧＵＳ植物をポジティブコントロールとして用いた。平均をバーで示す。
【図１４】図１４は、異なる発生段階でのＴ２トランスジェニックイネにおけるｒＰＯＸ：：ＧＵＳ遺伝子の器官特異的発現を示す。独立した９〜１５株のそれぞれのプロットとしてＧＵＳ活性を示した。３５Ｓ：：ＧＵＳ植物をポジティブコントロールとして用いた。平均をバーで示す。
【図１５】図１５は、８葉期のｒＰＯＸ−Ｔ２植物における種々の処置によるＧＵＳ活性（独立した３株のプロット）の誘導を示す。平均値をバーで示す。
【図１６】図１６は、Ｒ２１４８：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するトランスジェニックイネとＲ２３２９：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するトランスジェニックイネのＧＵＳ活性を示すグラフである。平均値をバーとして示した。
【図１７】図１７は、Ｒ２１８４：：ＧＵＳ Ｔ１およびＲ２１８４：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉身、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１８Ａ】図１８Ａは、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｒｐ：根原基、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉鞘、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｒｐ：根原基、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉鞘、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１９】図１９は、Ｒ２６９３：：ＧＵＳを有するＴ１植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｘ：木部、ｐｈ：篩部。
【図２０】図２０は、Ｒ２１８４：：ＧＵＳ、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ、Ｒ２５７６：：ＧＵＳ、およびＲ２６９３：：ＧＵＳを有するタバコ形質転換体の葉身を切断処理して３日後に誘導されたＧＵＳ発現を示す写真である。矢印は切断面を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的な発現を促進する、植物のペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を含む核酸分子（本明細書中以降、ＰＯＸプロモーター）に関する。より詳細には、本発明は、このＰＯＸプロモーターを利用したトランスジェニック植物の作出方法、この方法の利用によって得られた植物細胞、組織、植物体および種子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ（ＥＣ．１．１１．１．７）（本明細書中で「ＰＯＸ」ともいう）は、一般に種々の基質の過酸化水素による酸化反応を触媒する酵素であって、微生物から動植物までに広く存在する。ペルオキシダーゼは、種々のアイソザイムおよびアイソフォームの形態からなるスーパーファミリーを構成し、現在では、その反応特異性および構造により、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩに分類されている（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、非特許文献１）。クラスＩは、原核生物ペルオキシダーゼとも呼ばれ、酵母ミトコンドリアシトクロームｃＰＯＸ、葉緑体アスコルビン酸ＰＯＸ、細胞質ゾルアスコルビン酸ＰＯＸおよび遺伝子二重細菌ＰＯＸなどが含まれる。クラスＩＩは、分泌型真菌ペルオキシダーゼとも呼ばれ、代表的にはＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍマンガン依存性ＰＯＸ（ＰＣＭ）、およびリグニナーゼなどが含まれる。クラスＩＩＩは、古典的分泌型植物ペルオキシダーゼとも呼ばれ、代表的には西洋ワサビＰＯＸなどが含まれる。クラスＩＩＩ植物ＰＯＸは、植物において普遍的に見い出されており、さらに複数のアイソフォームが同一植物から見い出されている（非特許文献１）。
【０００３】
クラスＩＩＩ植物ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、植物における種々の生理的過程（例えば、木化（Ｗｈｅｔｔｅｎら、（非特許文献２））、コルク化（Ｅｓｐｅｌｉｅら、（非特許文献３））、細胞壁タンパク質の架橋（Ｆｒｙら（非特許文献４））、オーキシン分解および植物ホルモンであるインドール酢酸（ＩＡＡ）の酸化（Ｈｉｎｍａｎら（非特許文献５））、病原体からの防御（Ｃｈｉｔｔｏｏｒら（非特許文献６））、塩耐性（Ａｍａｙａら（非特許文献７））、老化（Ａｂｅｌｅｓら（非特許文献８））、植物の発生、分化および生長（Ｈｏｒｔｏｎら（非特許文献９））など）に寄与することが示唆されており、植物の生長および病傷害ストレス応答などにおいて重要な役割を担っていると考えられている。ペルオキシダーゼが単一の植物中に複数存在すること、および基質特異性が広いことなどから、個々のペルオキシダーゼの特異的な生理的機能を特定することは未だ困難である。
【０００４】
植物のＰＯＸ遺伝子については、例えば、アルファルファ、トマトおよびコムギから、それぞれ７以上のＰＯＸ遺伝子が単離され、そして同定されている（Ｃｈｉｔｔｏｒら（１９９９）、非特許文献６）。Ｃｈｉｔｔｏｏｒらは、イネから相同性の高い３つのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡフラグメントを単離し、そしてこの３つのＰＯＸがイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）による感染の際に異なる誘導を受けることを示した（Ｃｈｉｔｏｏｒら（１９９７）、非特許文献１０）。Ｉｔｏらは、イネの地上部組織にタンパク質レベルで２５のＰＯＸが存在することを示し、そのうち４種を精製して、Ｎ末端アミノ酸配列とそれぞれに対する抗体の反応性とから、これらが２組のアイソフォームであることを推定した（Ｉｔｏら、非特許文献１１）。Ｉｔｏらは、２つの構造的に関連するＰＯＸをコードするｃＤＮＡ（ｐｒｘＲＰＡおよびｐｒｘＲＰＮ）を単離したが、この２つの遺伝子は、同一ではないが類似する発現パターンを示した。（Ｉｔｏら、非特許文献１２）。タバコにおいて、１２のＰＯＸアイソザイムが、等電点電気泳動後の活性染色によって検出され、そして、これらのアイソザイムが器官特異性および傷害またはＴＭＶ感染に対する応答性が異なることが示された。これらのタバコＰＯＸについての観察から、個々のＰＯＸ遺伝子の発現が異なって調節されることが示唆された（Ｌａｎｇｒｉｍｉｎｉら、非特許文献１３）。
【０００５】
このように、発現特異性について従来研究されたＰＯＸアイソザイムの数は限定されており、数十あると予測されるＰＯＸの発現動向について概括的な解析はなされておらず、また従来の知見からではそのような解析は困難であった。
【０００６】
ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、過酸化水素に代表される活性酸素種の除去において役割を有することが知られている。一般に、植物などの細胞中の活性酸素種（スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素など）の濃度が上昇した状態は、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）と呼ばれる。これは、過酸化状態、紫外線および放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペルオキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生物的作因、オゾンおよび二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす酸化状態と、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ＰＯＸ、ビタミンＥ、ＣおよびＡ等の作用による、細胞内の抗酸化剤防御機構とのバランスが崩れたときに起きる。
【０００７】
真核生物では、酸化ストレスに曝されるとＳＯＤなどの活性が高まることが以前から知られている。あらかじめＳＯＤなどを誘導しておくことにより、細胞が酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示す例も観察されている。
【０００８】
植物においても、酸化ストレスの発生について、次のことが知られている。（１）光合成を妨げる様々な条件（光照射下の低温、除草剤処理など）によって、光合成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生し得る。（２）暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等の活性酸素種の濃度が上昇し得る。（３）除草剤（パラコート（商品名）（１，１−ジメチル−４，４−ジピリジニウムジクロリド）等）および紫外線も、その作用機構に活性酸素種が関わっている。そして、（４）乾燥ストレスや重金属なども、酸化ストレスを引き起こすと考えられている。
【０００９】
近年、酸化ストレスを含む環境ストレスが植物を含む生物の生体に与える影響が注目されている。近代の工業化による地球環境の悪化が深刻な社会問題になっており、植物においても環境ストレス耐性を向上させるための研究が行われている。ＰＯＸのような抗酸化酵素は、種々の環境ストレスによって生体中に過多に発生する活性酸素を除去するのに有効な、環境ストレス耐性（生体防御）因子であると考えられている。しかし、ＰＯＸについては、アイソザイムの多様性および広範な基質特異性などの点から、環境ストレス耐性における役割は充分に解明されていない。従って、現段階では環境ストレス耐性植物を作製するための材料とすることは困難である。
【００１０】
クラスＩＩＩ ＰＯＸについては、病原菌の感染のような生物的刺激に対しての役割も示唆されている。大橋ら（非特許文献１４）においては、タバコＰＯＸについて、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）感染による局部病斑形成とＰＯＸとの関連が研究され、ＴＭＶによる壊死病斑形成の過程でＰＯＸがポリフェノールの酸化という形で機能していることが示唆された。従って、ＰＯＸは、病原体の感染に対して植物に防御機能を付与することにおいても重要な役割を果たし得ることが示唆される。
【００１１】
従って、ストレス耐性植物を含む有用植物の、遺伝子工学的手法による作出という観点から、ＰＯＸ遺伝子の発現特性についての詳細な知見の蓄積が所望されている。
【００１２】
最近、イネを含む多くの植物において、大規模な発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定プログラムが進行中である。イネ（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（非特許文献１５））およびシロイヌナズナ（Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄら（非特許文献１６））からも、それぞれ４２および４１の異なるＰＯＸ遺伝子の存在が確認された。しかし、これらのＥＳＴ配列は、遺伝子の部分配列情報を提供するのみである。これらの遺伝子の機能については簡単に分析したものが報告されているが、詳細に機能分析をした報告はまだない。
【００１３】
【特許文献１】
再公表ＷＯ０２／０４２７４５号
【非特許文献１】
Ｗｅｌｉｎｄｅｒ Ｋ．Ｇ．ら（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：３８８
【非特許文献２】
Ｗｈｅｔｔｅｎ Ｒ．ら（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，１００１−１０１３）
【非特許文献３】
Ｅｓｐｅｌｉｅ Ｋ．Ｅ．ら（１９８６）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１，４８７−４９２
【非特許文献４】
Ｆｒｙ Ｓ．Ｃ．（１９８６）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７、１６５−１８６）
【非特許文献５】
Ｈｉｎｍａｎ Ｒ．Ｌ．ら（１９６５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４、１４４−１５８
【非特許文献６】
Ｃｈｉｔｔｏｏｒ Ｊ．Ｍ．ら（１９９９）、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ （ＤａｔｔａおよびＭｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ編） １７１−１９３、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
【非特許文献７】
Ａｍａｙａ Ｉ．ら（１９９９）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７、８０−８４
【非特許文献８】
Ａｂｅｌｅｓ Ｆ．Ｂ．ら（１９８８）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７．６０９−６１５
【非特許文献９】
Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｆ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：６９０
【非特許文献１０】
Ｃｈｉｔｏｏｒ Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．７：８６１−８６７
【非特許文献１１】
Ｉｔｏ Ｈ．ら（１９９１）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：２４４５−２４５４
【非特許文献１２】
Ｉｔｏ Ｈ．ら（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：３６１−３６６
【非特許文献１３】
Ｌａｎｇｒｉｍｉｎｉ Ｌ．Ｍ．ら（１９８７）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：４３８−４４２
【非特許文献１４】
大橋（Ｏｏｈａｓｈｉ Ｙ．）（１９７５）、名古屋大学大学院農学研究科農芸化学専攻、博士論文
【非特許文献１５】
Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．ら（１９９７）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：１３５−１４４
【非特許文献１６】
Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｌ．ら（１９９８）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３３：９８−１０２
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発現特性が解明された、ペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子（本明細書において、便宜上ＰＯＸプロモーターともいう）を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の発現特異性を有するペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子に関する。発現特異性の例としては、部位特異性、ストレス誘導性などが挙げられる。本発明は、所望の性質を有するトランスジェニック植物、特に病原体抵抗性植物に改変するために有用である。
【００１６】
本発明は、５つのイネペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター核酸分子についての発現特性データの解析に基づく。本発明者らによって、個々のイネペルオキシダーゼ遺伝子が、種々のパラメータ（例えば、組織、ストレスなど）に対して独自の発現パターンを示すことが明らかになった。さらに、これらのプロモーター核酸分子は、傷害、病原体への感染などのストレス刺激初期に、発現が誘導されることが明らかになった。
【００１７】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１８】
（１） プロモーター活性を含む核酸分子であって、上記核酸分子は、
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９、において、１もしくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を含むヌクレオチド配列であって、プロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１３または１５に示す配列を少なくとも含む、ヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示すヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；ならびに
（ｅ）（ａ）に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であって、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
上記ヌクレオチド配列に作動可能に外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列が連結されると、上記外来遺伝子の特異的な発現を促進する活性を有する、
核酸分子。
【００１９】
（２） 上記特異的な発現は、根特異的発現およびストレス誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２０】
（３） 上記特異的な発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現、およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２１】
（４） 上記特異的な発現は、いもち病菌誘導性発現を含む、項目１に記載の核酸分子。
【００２２】
（５） 項目１に記載の核酸分子および作動可能に連結された、外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【００２３】
（６） 上記外来遺伝子は、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、レポーター遺伝子、病原抵抗性を付与する遺伝子および組織修復に関与する遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、項目５に記載の発現カセット。
【００２４】
（７） 調節エレメントをさらに含む、項目５に記載の発現カセット。
【００２５】
（８） 上記調節エレメントは、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子および、エンハンサーからなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、項目７に記載の発現カセット。
【００２６】
（９） 項目５に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
【００２７】
（１０） 項目１に記載の核酸分子および外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、植物細胞。
【００２８】
（１１） 項目１０に記載の細胞を含む、植物体。
【００２９】
（１２） 上記植物体は単子葉植物である、項目１１に記載の植物体。
【００３０】
（１３） 上記植物体はイネ科植物である、項目１１に記載の植物体。
【００３１】
（１４） 上記植物体はイネである、項目１３に記載の植物体。
【００３２】
（１５） 項目９に記載の発現ベクターを用いて形質転換された、植物細胞。
【００３３】
（１６） 項目１５に記載の細胞を含む、植物組織。
【００３４】
（１７） 項目１５に記載の植物細胞から得られた、トランスジェニック植物体。
【００３５】
（１８） 上記トランスジェニック植物体が単子葉植物である、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３６】
（１９） 上記トランスジェニック植物体がイネ科植物である、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３７】
（２０） 上記トランスジェニック植物体はイネである、項目１７に記載のトランスジェニック植物体。
【００３８】
（２１） トランスジェニック植物の作出方法であって、上記方法は以下の工程：
（Ａ）項目１に記載のプロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を植物細胞に導入する工程；および
（Ｂ）得られた植物細胞を再分化して、トランスジェニック植物を作出する工程、
を包含する、方法。
【００３９】
（２２） 外来遺伝子の根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための、項目１に記載の核酸分子の使用。
【００４０】
（２３） 上記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現、およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目２２に記載の使用。
【００４１】
（２４） 項目１に記載されるプロモーター活性を有する核酸分子、および植物細胞において上記核酸分子に作動可能に連結されるべき外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための組成物。
【００４２】
（２５） 上記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、項目２４に記載の組成物。
【００４３】
（２６） 植物体のストレス刺激の有無を検査するための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）上記植物体から組織を得る工程；
（ｂ）上記組織からＲＮＡを抽出し、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列に特異的なプローブを用いて、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列が発現されているか否かを検出する工程、
を包含し、
ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるヌクレオチド配列の特異的発現は、上記植物体が病原体に感染したことを示す、
方法。
【００４４】
（２７） １以上の容器に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、および配列番号９に示されるヌクレオチド配列に特異的なプローブを含む、植物体における病原体感染を検出するためのキット。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みおよび理解することによって、当業者に明らかとなる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００４７】
（定義）
本明細書において使用される主要な用語の一部を以下に定義する。
【００４８】
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キュウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００４９】
本明細書において、「刺激（の）初期」とは、創傷、病原体感染、農薬散布などの刺激を植物に与えた場合に、この刺激を与えた直後から数時間、１２時間以内、２４時間以内、または４８時間以内をいう。
【００５０】
本明細書において、本発明に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原体」とは、植物に感染可能なあらゆる病原性生物、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
病原体としての真菌類としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
病原体としての病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
病原性ウイルスとしては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書において、ＤＮＡの「断片」とは、参照ＤＮＡの全長よりも短く、少なくともプローブまたはプライマーとしての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。あるＤＮＡの断片を、それが由来した元のＤＮＡに対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイブリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてあるＤＮＡが「特異的にハイブリダイズ」するとは、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）について使用される場合、少なくとも２２種の本発明のＰＯＸ ＤＮＡを互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得、５０を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物として入手され得る。１対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーをＰＣＲに使用する場合、選択的プライマーは、代表的には少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または５０ヌクレオチド長あるいはそれ以上であり得る。
【００５５】
本明細書において、各ＰＯＸについて断片が特異的であるためには、ＰＯＸ保存領域を除いた領域から選択される必要がある。本明細書において、「ＰＯＸ保存領域」とは、本発明におけるＰＯＸ間でＤＮＡ配列またはアミノ酸配列が保存されている領域をいい、「ＰＯＸ非保存領域」とは、それ以外の領域をいう。「保存されている」とは、ある核酸配列領域において、その配列がコードするポリペプチドの機能を保持するに必要とされる程度にその核酸配列が同一または類似であることをいう。ＰＯＸ保存領域は、代表的には、以下の化１に示す配列アラインメントにおいてボックスで示される部分である。これらの部分は、特に、２つの不変ヒスチジン（ｈで表される）残基および８つのシステイン残基（ｃ１〜ｃ８で表される）を含む領域として特徴付けられる。
【００５６】
【化１】
【００５７】
本明細書において、あるＰＯＸ遺伝子のホモログは、一般的に、参照されるＰＯＸポリペプチドのＰＯＸ非保存領域において相同性を有するが、他のＰＯＸポリペプチドのＰＯＸ非保存領域とは相同性を有さない。遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００５８】
塩基配列の同一性の比較は、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ら（１９８８）、ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８）を用いてデフォルトパラメーターで算出し得る。
【００５９】
ＰＯＸ遺伝子について、発現特性が「同一または類似」であるとは、発現の部位特異性、時期特異性およびストレス応答性のうち少なくとも１つの特性、好ましくは任意の２つの特性の組合せ、より好ましくは全ての特性が同一または類似であることをいう。本明細書において部位特異性について言及する場合、ＰＯＸ遺伝子の根と地上部との発現量の比率を評価して、根部で優勢か、地上部で優勢か、または両部でほぼ均一かの３つに分類したとき、同じカテゴリーに属することを「同一または類似」であるという。時期特異性について言及する場合、ＰＯＸ遺伝子の５日目の芽生えと１６日目の芽生えとでの発現量の比率を評価して、５日目（幼若期）に優勢か、１６日目（成熟期）に優勢か、または両時期でほぼ均一の３つに分類したとき、同じカテゴリーに属することを、「同一または類似」であるという。ストレス応答性について言及する場合、植物が、化学物質（例えば、パラコート、エテフォン、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）など）および物理的刺激（例えば、紫外線（ＵＶ）、切断、摩擦など）のいずれかによるストレスを受けたときの、ＰＯＸ遺伝子の発現量の変化を評価して、特定のストレスへの応答を発現量の増大、発現量の減少、または発現量の無変化の３つに分類したとき、おなじカテゴリーに属することを、「同一または類似」であるという。上記の各発現特性に関して、ＰＯＸ遺伝子の発現量は、下記の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析によって確認され得る。
【００６０】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔm）より約５℃低く選択される。Ｔmは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００６１】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ+未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ+濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００６２】
用語「プロモーター」は、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。従って、「プロモーター活性を有する」核酸配列とは、上記のようなプロモーターとしての働きを有する核酸配列をいう。
【００６３】
本明細書において、植物におけるペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位（例えば、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるＰＯＸ遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じたＰＯＸ遺伝子の発現の特異性をいう。「ストレス応答性」とは、植物に与えられた少なくとも一種のストレスに対して、ＰＯＸ遺伝子の発現が変化することをいう。
【００６４】
ここで、「ストレス」または「刺激」とは、植物に対して、物理的、化学的、生物学的に加えられ得る、植物の正常な生長を妨げる因子のことをいい、本明細書において交換可能に使用されうる。ストレスには、例えば、物理的ストレス（光、熱、冷却、凍結、紫外線、Ｘ線、切断、摩擦など）、化学的ストレス（酸素ストレス、化学物質、生理活性物質など）、生物学的なストレス（ウイルス、病原体（例えば、イモチ病菌）感染など）などが挙げられる。本明細書において使用される場合、「環境ストレス」とは、地球環境の変化に起因する植物に対するストレスをいい、例えば、オゾン層破壊による紫外線量の増加、大気汚染による活性酸素種、化学物質などが、その主な原因として挙げられる。
【００６５】
「酸素ストレス」または「酸化ストレス」とは、酸素および酸素誘導体によってもたらされるストレスをいい、代表的には、活性酸素種（スーパーオキシド、過酸化水素、ハイドロキシルラジカル、一重項酸素など）、オゾン、ＳＯｘおよびＮＯｘなどの大気汚染物質などによって引き起こされる。酸化ストレスは、過酸化状態、紫外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペルオキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御機構（スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ビタミンＥ、ＣおよびＡ等）」とのバランスが崩れたときに起きる。
【００６６】
本明細書において、「根発現型」とは、ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現について、植物の根において優先的に発現される性質、および植物の根および地上部において同程度に発現される性質のいずれかをいう。特に言及する場合、植物の根および地上部において同程度の発現を示すことを、「根および地上部発現型」と称する。「地上部発現型」とは、植物体の地上部の少なくとも一部において根におけるよりも優先的に発現される性質をいう。これらの性質は、それぞれの部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することにより決定することができる。
【００６７】
本明細書において、ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現が「構成的」であるとは、植物の組織において、その植物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、５日目の芽生えおよび１６日目の芽生えの同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的ペルオキシダーゼは、通常の生育環境にある植物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。ＰＯＸ遺伝子またはそのプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが植物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、植物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することにより決定することができる。
【００６８】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された成分が、それらの有用な機能を奏するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、核酸配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にその配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、核酸配列の発現を方向付けるように機能する限り、その配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写されたが、未だ翻訳されていない配列の介入が、プロモーター配列と核酸配列との間に存在し得、そしてなおこの核酸配列およびプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結され」ていると考えられ得る。
【００６９】
（種々のイネペルオキシダーゼ）
本発明者らによって、多数のイネペルオキシダーゼ遺伝子がそれぞれ互いに異なる種々の発現特異性を有することが示された。本明細書において、イネペルオキシダーゼは、その発現特異性に応じて、代表的に、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２およびＣの少なくとも５クラスに分類され得る。ＡおよびＢの分類は、刺激に対する応答性（誘導性）に基づく。ストレスに対する誘導性を有さないＰＯＸをクラスＡに分類し、ストレスに対する誘導性を有するＰＯＸをクラスＢに分類する。クラスＣには、発現が検出限界以下のものを分類する。
【００７０】
Ａ１およびＢ１には、地中部分に優先的に発現されるか地中部分と地上部分とに同程度に発現される「根発現型」または「根および地上部発現型」のＰＯＸを分類し、他方で、Ａ２およびＢ２には、主に地上部分に発現されるものを分類する。（分類のまとめを表１に示す。）
本発明者らによる２２のＰＯＸ遺伝子の発現解析により、Ａ１およびＢ１に属する酵素が１７個、Ａ２およびＢ２に属するものが４個、Ｃに属するものが１個と分類された（以下の表１Ａ、表１Ｂおよび図１もまた参照のこと）。本発明のＰＯＸ遺伝子は、以下に詳細に説明するように、ストレスに対して種々の異なる独自の応答性を示すこと、および、地上部におけるよりもむしろ根において主に発現されることが明らかになった。
【００７１】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
ａ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
ｂ Ｉｔｏら（１９９４）、ならびにＹａｍａｍｏｔｏおよびＳａｓａｋｉ（１９９４）により記載されたｃＤＮＡライブラリー
ｃ Ｒ１７４４（この実験にさらに使用した）を除く、種々の処置に対する２１のＰＯＸ遺伝子プロモーターの応答、１６日齢のイネをの葉身を使用した（Ｈｉｒａｇａら、２０００）。
略語は、以下のとおりである。ＥおよびＪ：それぞれ、エテフォンおよびジャスモン酸メチルでの処理。Ｎ：応答なし。Ｗ：創傷。
【００７３】
以下に、本発明の範囲内に属する、５つのイネＰＯＸ遺伝子、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４について解説する。
【００７４】
Ｓ１４４９３は、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、以前はＡ２に属すると考えられていたが、本出願によりＢ２に属することが明らかになった。この遺伝子は配列番号１で示される遺伝子配列を有する。Ｓ１４４９３は地上部で優先的に発現される。遺伝子産物が地上部で優先的に発現されることは、地上部の生長の促進または維持（例えば、茎の伸長など）に優先的に寄与する機能を示唆する。Ｓ１４４９３はまた、幼若期と成熟期とで同程度に発現され得る。幼若期および成熟期の芽生えにおいて同程度に発現されることは、植物の生育、伸長、および代謝の全般に関与することを示唆する。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｓ１４４９３ＦＰ１（配列番号３２）が挙げられる。Ｓ１４４９３遺伝子に由来するプロモーターもＳ１４４９３の発現特異性を反映していると考えられる。Ｓ１４４９３遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７５】
Ｒ２５７６は、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２５７６は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２５７６は、酸素ストレス（例えば、ＵＶおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激、摩擦ストレス、および病原体接種によって誘導され得る。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２５７６はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンであるＩＡＡ量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号３で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｒ２５７６Ｆ１（配列番号２７）が挙げられる。Ｒ２５７６遺伝子に由来するプロモーターもＲ２５７６の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２５７６遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７６】
Ｒ２１８４もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２１８４は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２１８４は、酸素ストレス（例えば、ＵＶ）および傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激によって誘導され得る。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る。従って、このＰＯＸは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２１８４はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号７で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は、液胞局在性であることが示唆される。この遺伝子に特異的な配列を有するプライマーの例として、Ｒ２１８４ＦＰ１（配列番号２５）が挙げられる。Ｒ２１８４遺伝子に由来するプロモーターもＲ２１８４の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２１８４遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７７】
Ｒ２６９３もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ１に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２６９３は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２６９３は、酸素ストレス（例えば、ＵＶ）および傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激によって誘導され得る。また、砕片への切断によるストレスによって誘導され得る。従って、このＰＯＸは、特に植物に激しい傷害が起きた場合の防御に関与していると考えられる。これらのことは、この遺伝子は、病原体からの防御および活性酸素種の除去について役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２６９３はまた、幼若期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。幼若期において顕著に発現されることは、植物の生育および伸長に必要なこと、例えば、細胞壁の合成などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号９で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。Ｒ２６９３遺伝子に由来するプロモーターもＲ２６９３の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２６９３遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７８】
Ｒ２３２９もまた、ＥＳＴ配列に基づいてイネから得られた配列で、本明細書の分類に従えば、Ｂ２に属する。遺伝子産物が種々のストレスに対して誘導されることは、Ｒ２３２９は、ストレスに対する植物の防御機構に関与していることを示唆する。具体的には、Ｒ２３２９は、酸素ストレス（例えば、ＵＶおよびパラコート）、傷害情報伝達物質（例えば、ＭｅＪＡ）刺激、エチレン放出因子（例えば、エテフォン）刺激、摩擦ストレス、および切断ストレスによって誘導され得る。このＰＯＸは、広範なストレスに対して誘導性であることは、種々のストレスに対して初期防御の役割を果たしていることを示唆する。Ｒ２３２９はまた、成熟期の芽生えにおいて顕著に発現され得る。成熟期において顕著に発現されることは、植物の成熟期の代謝に必要なこと、例えば、植物ホルモンであるＩＡＡ量の調節などに関与することを示唆する。この遺伝子は配列番号５で示される遺伝子配列を有する。推定アミノ酸配列の分析から、このタンパク質産物は細胞外分泌性であることが示唆される。Ｒ２３２９遺伝子に由来するプロモーターもＲ２３２９の発現特異性を反映していると考えられる。Ｒ２３２９遺伝子およびそのホモログならびにそれらに由来するプロモーターを利用することは、植物の特性を改変するのに有用であり得る。
【００７９】
（各遺伝子およびそのホモログの取得方法ならびに発現特異性の確認方法）
本発明のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）遺伝子およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＰＯＸ遺伝子のホモログは、公知のＰＯＸ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の非保存領域に対応する縮重プライマー対を用いて、単離され得る。このプライマー対を用いて、任意の対象植物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ対象植物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、陽性クローンを選択し、配列決定を行い本発明のＰＯＸ遺伝子またはそのホモログの特徴付けを行い得る。
【００８０】
このようにして得られた本発明のＰＯＸ遺伝子またはそのホモログが所望の発現特異性を有することは、例えば、当該遺伝子またはその断片を選択的プローブとして用いて、元の植物における発現特性を分析することで確認し得る。本明細書に開示の方法に従って当該遺伝子を任意の植物に導入して形質転換植物を作出することで確認してもよい。所望の発現特性に基づいて適切な植物材料からＲＮＡサンプルを調製し、このＲＮＡサンプルを用いてノーザンブロット分析を行い、発現量を確認し、比較することができる。
【００８１】
（プロモーターの特定）
上記の各遺伝子のプロモーターは、周知のように、コード領域の上流配列から取得することができる。プロモーターは、代表的には、翻訳開始点の上流約２ｋｂの範囲に存在する配列として定義されるが、これに限定されない。
【００８２】
プロモーター領域の特定は、当該分野で周知の方法に基づいて実施され得る。簡単に述べると、プロモーター領域の候補配列およびレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）を作動可能に連結した発現カセットを構築する。構築した発現カセットを用いて適切な植物細胞を形質転換し、形質転換細胞を植物に再生する。形質転換植物におけるレポーター遺伝子の発現を、適切な検出系（例えば、色素染色）を利用して検出する。検出結果に基づいて、プロモーター領域およびその発現特性を確認し得る。
【００８３】
（発現特異的ＰＯＸ遺伝子を利用する植物の改変方法）
上記のように、本発明のＰＯＸ遺伝子（構造遺伝子）およびプロモーターは、それぞれ、植物の特性を所望の様式で改変するための材料として有用であり得る。改変すべき特性は、植物のストレスに対する抵抗性、および植物の生育または代謝に関連する特性（例えば、生育の速度または期間）を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
本発明のＰＯＸ遺伝子は、適切なプロモーターに作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。また、本発明のプロモーターは、当該分野において周知の方法を用いて、適切な異種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。本明細書において、「発現カセット」とは、本発明におけるＰＯＸ遺伝子のプロモーター活性を有する核酸分子、これに作動可能に（すなわち、当該ＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された植物遺伝子プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、本発明のプロモーターと、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸配列をいう。天然のペルオキシダーゼ遺伝子の発現カセット自体を、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る発現カセットである。
【００８５】
本発明のプロモーターに連結され得る「外来遺伝子」とは、そのプロモーターが由来するＰＯＸ遺伝子以外の本発明のＰＯＸ遺伝子、もしくはＰＯＸ遺伝子以外の植物における内因性遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌および真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発現が発現カセットが導入される植物において所望される任意の遺伝子をいう。所望される外来遺伝子としては、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、レポーター遺伝子、病原抵抗性を付与する遺伝子および組織修復に関与する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。抗菌タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、ディフェンシンをコードする遺伝子、α−チオニンをコードする遺伝子、リゾチームをコードする遺伝子、センチニクバエ由来のザルコトキシン１Ａ、エンバク由来の葉特異的チオニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。病原抵抗性を付与する遺伝子としては、例えば、ファイトアレキシン合成系に関与する遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、グルカナーゼをコードする遺伝子、感染特異的タンパク質をコードする遺伝子、サリチル酸合成に関与する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明のＰＯＸ ｃＤＮＡに連結され得る「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味する。例えば、タバコＰＲ１ａプロモーターなどのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター（Ｐｎｏｓ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
上記の発現カセットは、好ましくは、植物発現ベクターの形態が利用される。「植物発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子および、エンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００８８】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００８９】
「薬剤耐性遺伝子」とは、その遺伝子産物が宿主において発現される場合に、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子をいう。薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましく、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得る。
【００９０】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは複数個用いられ得る。
【００９１】
植物発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターあるいはｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられ得る。ｐＢＩ系およびｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。ｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ得る。例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが挙げられる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域（Ｔ−領域）の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現されるＮＰＴ２遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）とを含む。ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。
【００９２】
植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌ ら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、ならびにパーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００９３】
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再生され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザン法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、このタンパク質に対する抗体を使用して、ウェスタンブロット法により確認し得る。また、本発明のＰＯＸプロモーターの発現の特性および強度を調べるために、ＰＯＸプロモーターに外来遺伝子としてレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子）を連結させて発現を検出する方法がある。β−グルクロニダーゼは、Ｄ−グルクロン酸のβ型配糖体に作用して、そのグルクロニド結合を加水分解する酵素であり、高等植物には存在しない場合が多い。イネおよびタバコにはＧＵＳは存在しないことが分かっているため、本明細書ではＧＵＳをレポーター遺伝子として使用し、ＧＵＳ活性を、１ｍｇのタンパク質あたり１分間に遊離した４−ＭＵ（４−メチル−ウンベリフェロン）の量として表す。本明細書において使用されるＧＵＳ活性の測定方法は、概して、次のとおりである。植物組織約１０ｍｇを、エッペンドルフチューブに入れ、約５ｍｇの炭化ケイ素および２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および０．１％ サルコシルを含有する）を添加して、−８０℃で急速に凍結する。３０℃の水浴中で急速に融解した後、必要に応じて溶解緩衝液（４℃）で希釈する。これを、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清５μｌを新しいチューブに移す。サンプルチューブに、酵素溶液（１〜１０μｌ）および溶解緩衝液（４℃）を入れて総量を１２０μｌとする。この混合物に、８０μｌの基質溶液（５ｍＭ ４−ＭＵＧ（溶解緩衝液中）：ＭｅＯＨ＝１：１）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする（コントロールを０分とする）。その後、１ｍｌの反応停止溶液（０．２ＭＮａ2ＣＯ3水溶液）を添加して、反応を停止させる。反応が停止した後、蛍光分光光度計（モデルＦＰ−７７７（ＪＡＳＣＯ）またはモデルＲＦ−５４０（島津製作所））を使用し、励起：３６５ｎｍ、発光：それぞれ、４４８ｎｍまたは４５０ｎｍにより蛍光を定量的に測定する。
【００９４】
本発明のＰＯＸ遺伝子およびプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物の改変にも利用し得る。これは、両植物間でゲノム構造が類似していることにより説明される（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）、Ｖｏｌ．５、７３７−７３９、および長村（Ｎａｇａｍｕｒａ）ら（１９９７）、農業生物資源研究所ニュースＮｏ．５７、１−２）。特に好ましい対象植物としては、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、カンキツ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。ＰＯＸ遺伝子を植物に導入できることは、シロイヌナズナ（吉田（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２１〜１２５）、ヤマナラシ（河岡（Ｋａｗａｏｋａ Ａ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２５〜１２７）、サツマイモ（郭（Ｋｗａｋ Ｓ−Ｓ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１２７〜１３０）、およびイネ（平賀（Ｈｉｒａｇａ Ｓ．）ら（１９９８）、植物の化学調節、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．２、１３１〜１３６）などで実証されている。
【００９５】
再生した形質転換が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアッセイを行うことにより確認し得る。例えば、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再生した植物体にモデル菌、例えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。
【００９６】
植物発現ベクターが導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００９７】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、特定のイネ品種にその品種に親和性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００９８】
あるいは、形質転換植物のストレス抵抗性は、ＵＶ処理に対する抵抗性、スーパーオキシド発生型除草剤（例えば、パラコート）処理に対する抵抗性、および／または塩ストレスに対する抵抗性などとして評価され得る。
【００９９】
本発明に従って、植物細胞、植物組織、植物器官または植物体に導入されたＰＯＸプロモーターおよびこれに作動可能に連結された外来遺伝子は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したＰＯＸプロモーターおよび外来遺伝子が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明のＰＯＸプロモーターおよび外来遺伝子が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原体感染などのストレスに対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、遺伝形質が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【０１００】
（遺伝子発現アッセイ）
本発明はまた、本発明のペルオキシダーゼ遺伝子またはそのセット、あるいはプロモーター由来の配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、植物の特性を解析するための方法を提供する。このような方法としては、ノーザンブロット分析などが挙げられる。そのような方法の概説としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ 、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹなどが挙げられる。
【０１０１】
（ディファレンシャルディスプレイ技術）
本発明はまた、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いた遺伝子解析に用いられ得る。
【０１０２】
ディファレンシャルディスプレイ技術とは、発現変動する遺伝子を検出または同定するための方法である。この方法では、２つ以上のサンプルからｃＤＮＡをそれぞれ作製し、任意のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅し、その後、生成された複数のＰＣＲ産物をゲル電気泳動により分離し、パターン化した後、各バンドの相対的なシグナル強度変化をもとに、発現変動遺伝子がクローニングされる。
【０１０３】
以上、本発明のＰＯＸプロモーターおよびそれらの利用方法について、詳説してきた。以下に、本発明の例示である、実施例を記載する。
【０１０４】
【実施例】
以下に記載する実施例は、本発明の例示であり、いかなる様式においても本発明を限定するものではない。従って、当業者は、実施例に記載された事項に基づき、特許請求の範囲内において、本発明に任意の改変を施し得る。
【０１０５】
なお、以下の実施例において使用した試薬類は、特記した場合を除いて、和光純薬、寶酒造から入手した。
【０１０６】
（材料および方法）
（イネの生育）
実験系統として、イモチ病感受性のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（本実施例において以下、親和性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）または−Ｐｉ−ｉと称する）、イモチ病抵抗性のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）（本実施例において、非親和性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）、ＩＬ−７または＋Ｐｉ−ｉと称する。（国立農業研究センター（Ｎａｔ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔ．ｏｆ Ｊａｐａｎ）より入手可能）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、必要に応じて、３および４葉期、５葉期、６葉期、８葉期、または９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。別段記載されない限り、イモチ病感受性のイネを使用した。
【０１０７】
（イモチ病菌胞子噴霧液の調製）
イモチ病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ レース００３）を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中に濃度３×１０5胞子／ｍｌに懸濁することにより、イモチ病菌胞子噴霧液（以下、便宜上「噴霧液」という）を調製し、以下の実験に使用した。
【０１０８】
（実施例１） ＰＯＸ遺伝子の分類
（イモチ病菌によるＰＯＸ遺伝子の誘導）
上記の表１Ｂに示される各々のＰＯＸ遺伝子を、まず、イモチ病菌感染に対する誘導性に従って分類した。続いて、次いで、プロベナゾール（ＰＢＺ；イモチ病予防農薬（明治製菓からオリゼメート粒剤として入手可能））、ジャスモン酸（ＪＡ）および創傷、の各処理後の誘導性により、分類した。簡潔には、以下のとおりである。
【０１０９】
親和性イネ（８葉期）に、上記の噴霧液を、２４個体あたり１００ｍｌ噴霧することによりイモチ病菌を接種した。親和性イネを、温室にて２５℃で６時間、１２時間および１日インキュベートした後に、それぞれ最上部の葉身を採取し、ＡＴＡ法（Ｎａｇｙら（１９８８）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｇｌｅｖｉｎら編）、Ｂ４：１−２９頁、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて単離した総ＲＮＡを用いて、ＲＮＡゲルブロット分析（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により行った。
【０１１０】
表１Ｂに示した２２のイネＰＯＸ遺伝子の３’非翻訳領域をカバーするｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ法により増幅し、この増幅フラグメントを各ＰＯＸ遺伝子に特異的なプローブとして、ＲＮＡゲルブロット分析に使用した。各クローンに特異的なプローブを作製する際に使用した主な配列（配列番号１９〜３５）を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
【０１１２】
（ＰＢＺ、ＪＡおよび創傷によるＰＯＸ遺伝子の誘導）
上記でイモチ病菌感染により誘導されたＰＯＸ遺伝子を、ＰＢＺ、ＪＡ、および創傷での処理に対する誘導性に従って分類した。プロベナゾールを、１００ｍｇ／ｍｌに希釈し、接種液として使用した。８葉期のイネに、ＰＢＺ接種、ＪＡ接種、および直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、創傷を施したこと以外は、上記の方法と同様にＲＮＡゲルブロット分析を行った。
【０１１３】
イモチ病菌感染接種、ＰＢＺ接種、ＪＡ接種、および創傷処理に対する誘導性により、使用した２２のＰＯＸ遺伝子は、図１に示されるように分類されることが分かった。特に、Ｒ２５７６、Ｓ１４４９３は、いずれの処理によっても誘導され、Ｒ２６９３はＰＢＺおよびＪＡを接種することにより誘導されることが分かった。Ｒ２３２９は、創傷処理により誘導され、ＪＡ接種によりわずかに誘導されることが分かった。
【０１１４】
特に、上記の４つのＰＯＸ遺伝子（Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、およびＲ２６９３）は、過敏感反応および傷害に関与する重要なシグナル伝達物質であるジャスモン酸接種により誘導される（図８もまた参照のこと）ことから、植物組織に病変部が現れる前に、植物体が病原体に感染したか否かを検出するために特に有用であると考えられる。
【０１１５】
（実施例２） イモチ病菌に対する親和性イネのＰＯＸ遺伝子の発現パターンと非親和性イネのＰＯＸ遺伝子の発現パターンとの比較
実施例１に記載した条件を用いて、親和性イネおよび非親和性イネともに８葉期まで生育させて実験に使用した。これら８葉期のイネを用いて、病原体ストレスとしてのイモチ病菌接種に対するイネペルオキシダーゼの誘導性について分析した。イモチ病菌の接種を、実施例１に記載されるように行った。
【０１１６】
接種して２日後、３日後、４日後、５日後および８日後の葉身の病変部を図２Ａに示す。それぞれのイネの病変部の大きさの差異を、図２Ｂのグラフに示す。これらの結果から、親和性イネでは、感染３日目に小さな壊死病変の形成が確認され、４〜５日目以降は病変が急激に拡大し、イモチ病菌の胞子形成が確認される一方で、耐病性イネでは、親和性イネと同様に小さな壊死病斑の形成が確認されたが、感染２日目以降、その病変部の大きさにほぼ変化がないことが観察された。
【０１１７】
（実施例３） 親和性イネにおけるＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現
実施例１において分類した５つのＰＯＸ遺伝子の特徴をより明らかにするために、３葉期、５葉期、６葉期および９葉期の親和性イネを使用して、これらＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現を（それぞれの段階の根、子葉鞘、最上部の葉身、および円錐花序について）、ＲＮＡブロット分析により調べた。結果を図３に示す。この結果は、ＰＯＸ遺伝子の構成的な発現が、主に、根および子葉鞘において観察され、５葉期〜９葉期の葉身においては、ＰＯＸ遺伝子がほとんど発現していない一方で、３葉期の葉身においてはＲ２５７６、Ｒ２１８４およびＲ２６９３が非常に強く発現していることを示す。このことは、これらＰＯＸ遺伝子が、成体イネの葉身においては発現しないが、幼若期のイネで構成的に発現することを示している。
【０１１８】
（実施例４） イモチ病菌接種後の植物についてのＲＮＡ発現パターンの解析次に、ＰＯＸ遺伝子とイモチ病との関係について調べた。実施例１に記載した条件を用いて、親和性イネおよび非親和性イネともに８葉期まで生育させて実験に使用した。これら８葉期のイネを用いて、病原体ストレスとしてのイモチ病菌接種に対するイネペルオキシダーゼの発現パターンについて分析した。イモチ病菌の接種を、実施例１に記載されるように行った。偽接種（コントロール）として、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液を接種した。接種直後、６時間後、１２時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、および５日後に、イネの最上部の葉身を採取した。これら採取時間を、実施例１で親和性イネで病変が認められた３日目を境にして、接種後０〜２日目までの第１相と、３日目以降の第２相に分けた。実施例１と同様に、総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。イモチ病菌を接種した親和性イネと非親和性イネにおけるそれぞれのＰＯＸ遺伝子のゲルブロット分析における比較結果を図４に示す。半定量的発現パターンの比較結果もまた、図５に示す。Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４、Ｒ２６９３の４つのＰＯＸ遺伝子は、偽接種したイネにおいて、１日目および２日目に一過性に発現された（図４左パネル）。イモチ病菌を接種した親和性イネにおいては、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４およびＲ２６９３のいずれも５日目に強く発現された。Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６およびＲ２３２９は、接種後６時間で発現された。この時点で、偽接種したイネにおいては、これらのＰＯＸ遺伝子は、発現していなかった。Ｒ２１８４およびＳ２６９３については、接種１日後に発現された。イモチ病菌を接種した非親和性イネにおいては、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２３２９、Ｒ２１８４およびＲ２６９３のいずれも接種後１日目までに発現され、特にＲ２５７６は、接種後３時間目という短時間で発現された（図６もまた参照のこと）。Ｒ２３２９は、親和性イネにおいては接種後６時間目から４日後までは低レベルで発現され、接種後５日目には高レベルで発現している。一方、非親和性イネにおいて、Ｒ２３２９は接種後６時間目に発現され、５日目まで高レベルでの発現が維持されていた。従って、親和性イネおよび非親和性イネいずれにおいても、これら５つのＰＯＸ遺伝子は、第１相において主に発現されることが分かった。
【０１１９】
（実施例５） プロベナゾール処理後の植物についてのＰＯＸ遺伝子の発現パターンの解析
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。１００ｍｇ／ｍｌのＰＢＺを噴霧した後の５つのＰＯＸ遺伝子の応答を、８葉期の日本晴の最上部の葉身において測定した。上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供して、本発明の５つのＰＯＸ遺伝子について調べた。結果を図７に示す。Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、Ｒ２６９３は、接種して６時間後に高レベル発現され、Ｒ２３２９は、６時間後に低レベルで発現され、接種して５日後においても低レベルのままであった。
【０１２０】
（実施例６） ＰＯＸ遺伝子の発現に対する防御シグナル化合物の効果
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。１ｍＭ ジャスモン酸、３ｍＭ サリチル酸、および１ｍＭ アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＣ）溶液を、それぞれ８葉期のイネの最上部の葉身に噴霧して０日後、６時間後、および１日後に、それぞれの最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。結果を、図８に示す。ゲルブロット分析において、Ｒ２５７６、Ｒ２１８４、およびＲ２６９３がジャスモン酸を噴霧して１日後に高レベルで発現された。ＡＣＣまたはサリチル酸を噴霧して１日後には、上記４つのＰＯＸ遺伝子が発現されたが、ジャスモン酸と比較すると、それらの発現はあまり高くなかった。
【０１２１】
（実施例７） 創傷に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答
実験植物として、８葉期の親和性イネを使用した。イネの最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、傷をつけた。示された時間の後に、最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供し、５つのＰＯＸ遺伝子の発現パターンを調べた。結果を図９に示す。ＲＮＡゲルブロット分析により、Ｓ１４４９３、Ｒ２５７６、およびＲ２３２９は、創傷を与えてわずか６時間という短い期間で発現され、その発現は、６時間から４日間にわたって続いた。
【０１２２】
図７、８および９から理解されるように、上記５つのＰＯＸ遺伝子は、イモチ病菌による感染により誘導されたが、ＳＡおよびＡＣＣによっては誘導されず、ＪＡ誘導性ＰＯＸ遺伝子であるＲ２５７６およびＲ２１８４は、創傷によっても誘導された。しかし、ＪＡ誘導性ＰＯＸ遺伝子であるＲ２３２９は、ジャスモン酸処理には、ほとんど応答しなかった。このように、これらＰＯＸ遺伝子は、個々に、プロベナゾール（ＰＢＺ）、ジャスモン酸（ＪＡ）、アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＣ）、およびサリチル酸（ＳＡ）による誘導に対して、定性的にも定量的にも独自の発現パターンを示す。
【０１２３】
（実施例８） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを含むベクターの構築
植物形質転換用ベクターを作製するために、ｐＢＩ１０１を改変して、ｐＢＩ１２１Ｈｍを構築した。概略は以下のとおりである。ｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９９７）、ｐＧＩ２２１（３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳ；Ｏｈｔａら、１９９０）およびｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧを用いて、５つのＰＯＸプロモーターそれぞれについて、ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを含むバイナリベクターを構築した。
【０１２４】
具体的には、基本骨格をなすｐＢＩ１０１ベクターは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，６ ３９０１−３９０７に記載されるものであり、ＣＬＯＮＴＥＣＨから販売されるものを利用した。３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳを含むｐＩＧ２２１は、Ｏｈｔａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３１，８０５−８１３に記載されるものである。Ｈｙｇr（ハイグロマイシン耐性遺伝子）を含むｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧは、Ｄｒ．Ｋｏ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏから入手したが、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドであれば、どのようなものであっても利用することができ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されている。
【０１２５】
まず、ｐＢＩ１０１ベクターを、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとで消化した。ｐＩＧ２２１に含まれる３５Ｓ：イントロン−ＧＵＳをＳｓｔ１とＰｓｔ１とで消化することによって切り出した。次にＨｙｇrは、ｐＬＡＮ１０１ＭＨＹＧをＢａｍＨ１とＳｓｔ１とで消化することによって切り出した。これらの消化は、制限酵素を入手した寶酒造が提供するＵｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ中のそれぞれの酵素の組み合わせで適切なものを利用することによって行った。
【０１２６】
このようにして得られたｐＩＧ１２１Ｈｍをバイナリーベクターの基本骨格として用い、３５Ｓプロモーターの代わりに本発明のプロモーター配列を用いることによって、そのプロモーター活性を測定した。プロモーター活性はＧＵＳによって観察することができる。各々のプラスミドの概略図を図１０ＢおよびＣに示し、以下にその作製法を概説する。
【０１２７】
上述のように作製したｐＩＧ１２１ＨｍをＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩと、ＸｂａＩまたはＢａｍＨ１との組み合わせを用いて消化して３５Ｓプロモーターを取り除き、これに各々のＰＯＸ由来プロモーター配列を挿入して図１０ＢおよびＣに示される構造を作製した。
【０１２８】
Ｒ２６９３由来プロモーターが入ったｐＩＧ２６９３ＧＵＳは、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとを用いた消化によって断片を調製し、この断片を消化されたｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１２９】
Ｒ２１８４由来プロモーターが入ったｐＩＧ２１８４ＧＵＳは、ＢａｍＨＩとＸｂａＩとを用いて消化断片を生成し、この断片を消化された上述のｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３０】
Ｒ２１８４の０．６ｋｂの断片が入ったｐＩＧ２１８４ＡＧＵＳは、Ｒ２１８４からＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとを用いて消化断片を生成し、この断片を上述の消化ｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３１】
Ｒ２３２９が入ったｐＲ２３２９ＧＵＳは、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩとを用いて消化して断片を生成し、この断片を上述の消化ｐＩＧ１２１Ｈｍに標準的なライゲーションを行うことによって連結した。
【０１３２】
これらのベクターを用いて各々のプロモーターの活性を測定し、特性を特徴付けた。
【０１３３】
（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２３２９プロモーターの最小単位の決定）ＰＯＸ遺伝子Ｒ２１８４の削りこみを行うために、制限酵素として、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用した。緩衝液としては、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（寶酒造）の中の適切なものを使用した。適切な緩衝液中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使用して消化し、Ｒ２１８４を消化し、１９９３ｂｐ（Ｒ１ａと称する）のプロモーターフラグメントを得た。また、これをさらにＨｉｎｄＩＩＩを使用して制限消化し、それぞれ、５４８ｂｐ（Ｒ１ｃと称する）および１７２ｂｐ（Ｒ１ｅと称する）のプロモーターフラグメントを得た。Ｒ１ａの挿入については、ｐＩＧ１２１Ｈｍを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで適切な緩衝液中で消化し、プラスミドを直鎖状にした。この直鎖状にしたプラスミドと得られたフラグメントＲ１ａを連結し、形質転換用ベクターｐＩＧＲ１ａを得た。同様に、Ｒ１ｃおよびＲ１ｅの挿入については、ｐＩＧ１２１Ｈｍを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限消化して直鎖状にし、これと得られたＲ１ｃまたはＲ１ｅを連結して、形質転換用プラスミドｐＩＧＲ１ｃおよびｐＩＧＲ１ｅを構築した。
【０１３４】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２３２９については、制限酵素として、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用した。これらの酵素を使用してＲ２３２９を消化し、制限消化した断片をゲル電気泳動に供すると、３つのバンド（１８０７ｂｐ、７４８ｂｐ、および１５６ｂｐ）が得られた。ゲルからそれぞれのバンドを切り出し、このバンドからＤＮＡを抽出して、プロモーターフラグメントを得た（それぞれ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｅ）。これら３つの得られたフラグメントを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに適切な緩衝液中で連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ３ａ、ｐＩＧＲ３ｃ、およびｐＩＧＲ３ｅを構築した。
【０１３５】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２５７６の削りこみを行うために、制限酵素としてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使用した。これらの酵素を使用して適切な緩衝液中でＲ２５７６を消化し、２１９２ｂｐのＲ２５７６プロモーターフラグメント（Ｒ５ａと称する）を得た。得られたフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを使用して制限消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ５を構築した。
【０１３６】
ＰＯＸ遺伝子Ｒ２６９３の削りこみを行うために、制限酵素としてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、１３１７ｂｐのＲ２６９３プロモーターフラグメント（Ｒ６と称する）を得た。得られたフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＩＧ１２１Ｈｍに連結して、バイナリベクターｐＩＧＲ６を得た。概略図を図１０および１１に示す。
【０１３７】
（実施例９）ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳバイナリベクターを用いたイネの形質転換
実施例８において生成した種々のＰＯＸプロモーターを含むベクターを用いて、親和性イネのカルスを形質転換し、再分化させて、トランスジェニックイネを生産した。
【０１３８】
その具体的な手順は以下のとおりである。
【０１３９】
１．前培養
親和性イネの種子を、適切な濃度のオーキシン（２，４−Ｄ）を含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、２．８ｇ／Ｌ プロリン、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ８．８）に播種し、２７〜３２℃にて５日間インキュベートした。この間に種子は発芽した。
【０１４０】
２．植物発現ベクター
アグロバクテリウムを形質転換するための植物発現用ベクターとして、図１０に示されるｐＩＧＲ１ａ、ｐＩＧＲ１ｃ、ｐＩＧＲ１ｅ、ｐＩＧＲ３ａ、ｐＩＧＲ３ｃ、ｐＩＧＲ３ｅ、ｐＩＧＲ５、ｐＩＧＲ６ならびに図１０ＢおよびＣに示されるｐＩＧ２３２９ＧＵＳ、ｐＩＧ２１８４ＧＵＳ、ｐＩＧ２１８４ＧＵＳ、ｐＩＧ２６９３ＧＵＳを使用した。これらベクターを使用して、Ｈｏｏｄらの方法（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１（１９８６））に従って、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１を形質転換した。ＥＨＡ１０１は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来の菌である。
【０１４１】
１．３ アグロバクテリウム感染
形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、１０ｇ／Ｌ グルコース、０．３／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．２を含有する）に移植した。遮光して３日間、２８℃にてインキュベートした。
【０１４２】
１．４ 除菌および選抜
インキュベートした後、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を使用して、種子からアグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換された種子の選抜を以下の条件下で行った。
【０１４３】
第１回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に種子を置き、７日間、２７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４４】
第２回目の選抜：カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、２〜４ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に種子を置き、さらに７日間、２７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４５】
１．５ 再分化
選抜された形質転換種子を、以下の条件で再分化させた。
【０１４６】
第１回目の再分化：再分化培地（カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、３０ｇ／Ｌ ソルビトール、２ｇ／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ カイネチン、０．００２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８））上に選抜された種子を置き、２週間、７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４７】
第２回目の再分化：第１回目の再分化において使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、７〜３２℃でインキュベートした。
【０１４８】
１．６ 鉢上げ
再分化した形質転換体を、発根培地（ハイグロマイシン（２４ｍｇ／Ｌ）を補充したホルモンフリーのＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。
【０１４９】
このようにして得た形質転換体は、このベクター中にコードされるハイグロマイシン遺伝子によりハイグロマイシンに対する抵抗性が付与されていた。
【０１５０】
（生育段階におけるＰＯＸ：：ＧＵＳ−Ｔ１植物のＧＵＳ活性の誘導）
上記のように得られた全長のＰＯＸプロモーターを含む成体段階の形質転換体Ｔ１（形質転換当代の８葉期の植物）の最上部の葉身を切り取り、５０μＭ ＭｅＪＡおよびコントロールとして水のいずれかに浸漬し、２３℃にて４８時間インキュベートした後、ＧＵＳ染色に供した。これらの形質転換体において誘導されたＧＵＳ活性を、図１２に示す。この図において、切り取って直後の葉身を０時間として示した。この図におけるデータ点は、６〜９個体の独立した植物のＧＵＳ活性を示す。平均を横棒として示した。Ｒ２１８４プロモーターは、切断およびＪＡの両方の処理によってＧＵＳ活性が誘導され、Ｒ２６９３プロモーターは、ＪＡの処理によってのみＧＵＳ活性が誘導された。これらの結果は、いずれもＲ２１８４ ＰＯＸ遺伝子およびＲ２６９３ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致する。Ｒ２３２９プロモーターについては、創傷処理によりＧＵＳ活性が誘導された。これは、Ｒ２３２９ ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致する。Ｓ１４４９３およびＲ２５７６についても同様であった。
【０１５１】
（形質転換体Ｔ１の各組織におけるＧＵＳ発現の測定）
同様に、全長のＰＯＸプロモーター（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２６９３プロモーター）の各々を含む形質転換体（３．５葉期および８葉期）を実験植物として使用し、その葉身、葉鞘および根におけるＧＵＳ発現を、常法に従って測定した。コントロールとして、３５Ｓ：：ＧＵＳを含む発現ベクターを用いて形質転換した植物を使用した。結果を図１３および１４に示す。これらの結果は、それぞれのＰＯＸプロモーターが、それぞれのＰＯＸ遺伝子の発現特異性を反映していることを意味する。
【０１５２】
（形質転換体Ｔ２の種々の処理によるＧＵＳ活性の誘導）
同様に、全長のＰＯＸプロモーター（Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２６９３プロモーター）の各々を含む形質転換体２代目のイネ植物（以下Ｔ２と称する）を、８葉期まで生育させ、実験植物として供した。この形質転換体Ｔ２の最上部の葉身を、５０μＭ ＭｅＪＡ、１μＭ パラコート（除草剤（パラコート（商品名）（１，１−ジメチル−４，４−ジピリジニウムジクロリド）等））、もしくは１００μｇ／ｍｌ プロベナゾール（ＰＢＺ）の噴霧または炭化ケイ素粉末（キシダ化学製）を用いた摩擦によって処理し、２５℃にて４８時間インキュベーションした後、最上部の葉身を採取し、ＧＵＳ活性を測定した。摩擦処理およびパラコート処理のコントロールとして滅菌水処理（コントロール１）したＴ２植物、ＭｅＪＡ処理のコントロールとして０．２％エタノール処理（コントロール２）、およびプロベナゾール処理のコントロールとして、０．１％アセトン処理（コントロール３）したＴ２植物をそれぞれ使用し、同様に最上部の葉身を採取して、ＧＵＳ活性を測定した。結果を図１５に示す。独立した３系統におけるＧＵＳ活性のプロットを示す。平均を、それぞれ横棒として示す。
【０１５３】
（削り込みプロモーターを有する形質転換植物におけるＧＵＳ活性の誘導）
上記のように作製したＲ２１８４プロモーター：：ＧＵＳ（すなわち、Ｒ１ａ：：ＧＵＳ、Ｒ１ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ１ｅ：：ＧＵＳ）またはＲ２３２９（すなわち、Ｒ３ａ：：ＧＵＳ、Ｒ３ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ３ｅ：：ＧＵＳ）を有する形質転換体Ｔ１を、Ｒ２１８４については５０μＭ ＭｅＪＡにより処理し、Ｒ２３２９については炭化ケイ素による摩擦により処理した。各Ｔ１植物を２３℃にて４８時間インキュベートし、最上部の葉身を採取して、ＧＵＳ活性を測定した。さらに、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液を偽接種したＴ１植物、およびイモチ病菌レース００３を接種したＴ１植物についても、同様にＧＵＳ活性を測定した。結果を、図１６に示す。図におけるデータ点は、それぞれ６〜１０の独立したＴ１個体におけるＧＵＳ活性のプロットである。
【０１５４】
（考察）
これらの結果により、５つのＰＯＸプロモーターは、それぞれのＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致して、種々の誘導に応答してＧＵＳ活性を発現させることが分かった。Ｒ２１８４およびＲ２３２９については、プロモーターの削りこみを行ったが、Ｒ１ｃ：：ＧＵＳ、Ｒ１ｅ：：ＧＵＳ、Ｒ３ｃ：：ＧＵＳ、およびＲ３ｅ：：ＧＵＳのいずれも、ＭｅＪＡ処理および摩擦処理により誘導されなかった。従って、Ｒ２１８４プロモーターおよびＲ２３２９プロモーターの最小単位は、Ｒ２１８４の上流の境界が、−１９９３ｂｐ〜−５４８ｂｐの間に、Ｒ２３２９プロモーターの上流の境界が、−１８０７ｂｐ〜−７４８ｂｐの間に存在するようである。
【０１５５】
（実施例１０） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳ形質転換体の組織化学的分析（Ｒ２１８４：：ＧＵＳ Ｔ１およびＲ２１８４：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析）
実施例９において作出した、Ｒ２１８４：：ＧＵＳを有する形質転換体Ｔ１またはＴ２を、成体段階および８葉期まで生育させて、実験植物として使用した。これらの植物にＭｅＪＡ処理を施し、ＧＵＳ反応を３７℃で、０．５時間後、８時間後、および２４時間後に葉鞘、葯、節部分および根を切片にし、ＧＵＳ染色を行った。結果を図１７に示す。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＭｅＪＡ処理して４８時間インキュベートした後の葉身を示す。（Ａ）および（Ｄ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ１植物（本明細書において、例えば、「Ｒ１ａ−５Ｔ１植物」のような表記は、Ｒ１ａ−Ｔ１植物の個体番号を入れた呼称である）であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、Ｒ１ａ−４Ｔ１植物である。（Ｅ）および（Ｆ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の葯を示す。（Ｇ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の節部分の横断切片である。（Ｈ）は、Ｒ１ａ−５Ｔ２植物の根の横断切片である。（Ａ）〜（Ｈ）により示されるように、Ｒ２１８４ＰＯＸ遺伝子の発現特異性と一致して、ＧＵＳは、葉身および葉鞘、維管束、および根において高レベルで発現していた。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５６】
（Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ２植物の組織化学分析）
成体段階のＲ２３２９（−１８０７ｂｐ）：：ＧＵＳ Ｔ１植物および８葉期のＲ２３２９（−１８０７ｂｐ）：：ＧＵＳを含むＴ２植物を用いてＧＵＳ染色を行った。結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。（Ａ）および（Ｂ）は、創傷後、３７℃で１６時間インキュベートした後の葉身の横断切片である。（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｒ３ａ−１０Ｔ１植物の節間部分の横断切片である。（Ｅ）および（Ｆ）は、Ｒ３ａ−４Ｔ１植物の稈の切片である。（Ｇ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ１植物の葯であり、（Ｈ）は、葯の切片である。（Ｉ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の節間部分の横断切片である。（Ｊ）および（Ｋ）は、Ｒ３ａ−３Ｔ２植物の葉鞘の横断切片である。（Ｌ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の成熟葉身の横断切片である。（Ｍ）は、Ｒ３ａ−２Ｔ２植物の幼若葉身の横断切片である。（Ｎ）は、Ｒ３ａ−３Ｔ２植物の根の横断切片である。（Ａ）〜（Ｎ）により示されるように、Ｒ２３２９遺伝子の発現特異性と一致して、ＧＵＳは、葉身および葉鞘、維管束、および根において高レベルで発現していた。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５７】
（Ｒ２６９３：：ＧＵＳを含むＴ１植物の組織化学分析）
Ｒ２６９３：：ＧＵＳ Ｔ１植物を成体段階または８葉期まで成育させて、実験植物として使用した。結果を、図１９に示す。（Ａ）および（Ｂ）は、Ｒ２６９３：：ＧＵＳを含むＴ１植物の葉鞘の横断切片である。この結果は、ＲＮＡゲルブロット分析の結果とも一致する。
【０１５８】
従って、外来遺伝子が作動可能に連結されたＰＯＸプロモーターを含む形質転換植物体においても、ネイティブのイネ植物と同様な発現特異性が認められた。このことは、実際に、外来遺伝子として病原体抵抗性を付与する遺伝子、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、組織修復に関与する遺伝子をＰＯＸプロモーターに作動可能に連結させたベクターをイネ植物体に導入することにより、病原抵抗性が付与されたイネ植物体を作出できることを示している。
【０１５９】
（実施例１１） ＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳを有するタバコ形質転換体の組織化学的分析
実験植物として、双子葉植物であるタバコを使用した。Ｒ２１８４プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ１ａ）、Ｒ２３２９プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ３ａ）、Ｒ２５７６プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ５）およびＲ２６９３プロモーター：：ＧＵＳを有するベクター（ｐＩＧＲ６）を、タバコを形質転換するために使用した。
【０１６０】
タバコ形質転換体を、実施例９と同様に作製した。隔離温室または陽光定温器内で９葉期まで育成した。この形質転換タバコの最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、ストレスを与えた。傷をつけて３日後、最上部の葉身を採取し、その切断面におけるＧＵＳの活性を観察した。結果を図２０に示す。また、矢印は、切断面を示す。Ｒ２１８４、Ｒ２５７６、およびＲ２６９３は、切断面で特異的に強く発現しているが、Ｒ２３２９は、傷口周辺において全体的に発現していることが観察された。このことは、イネ以外の形質転換植物においても、この植物体にストレスを与えた場合、本発明のＰＯＸプロモーターが誘導されることを示す。従って、実際に、外来遺伝子として病原体抵抗性を付与する遺伝子、抗菌タンパク質をコードする遺伝子、組織修復に関与する遺伝子をＰＯＸプロモーターに作動可能に連結させたベクターを植物体に導入することにより、病原抵抗性が付与された任意の植物体を作出できることを示している。
【０１６１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０１６２】
【発明の効果】
本発明により、従来困難であった、種々のペルオキシダーゼの発現特異性を解明し、およびそれらの発現特異性を利用して植物に改変を施すための手段を提供することが可能になった。本発明はさらに、本発明のペルオキシダーゼ遺伝子の特異的発現を利用し、ＰＯＸプロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子を発現させることにより、病原体に対する抵抗性が植物体に付与される。また、本発明により、病原体感染の早期発見が可能になる。
【０１６３】
（配列表の説明）
配列番号１：クローン番号Ｓ１４４９３の核酸配列（イネ）。
配列番号２：配列番号１の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号３：クローン番号Ｒ２５７６の核酸配列（イネ）。
配列番号４：配列番号３の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号５：クローン番号Ｒ２３２９の核酸配列（イネ）。
配列番号６：配列番号５の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号７：クローン番号Ｒ２１８４の核酸配列（イネ）。
配列番号８：配列番号７の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号９：クローン番号Ｒ２６９３の核酸配列（イネ）。
配列番号１０：配列番号９の核酸にコードされるタンパク質配列（イネ）。
配列番号１１：プロモーターＲ１の核酸配列（イネ）。
配列番号１２：プロモーターＲ１ａの核酸配列（イネ）。
配列番号１３：プロモーターＲ１ｃの核酸配列（イネ）。
配列番号１４：プロモーターＲ１ｅの核酸配列（イネ）。
配列番号１５：プロモーターＲ３の核酸配列（イネ）。
配列番号１６：プロモーターＲ３ａの核酸配列（イネ）。
配列番号１７：プロモーターＲ３ｃの核酸配列（イネ）。
配列番号１８：プロモーターＲ３ｅの核酸配列（イネ）。
配列番号１９：プローブＣ５２９０３ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２０：プローブＣ６２８４７ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２１：プローブｐｒｘＲＰＡＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２２：プローブｐｒｘＲＰＡＲＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２３：プローブＲ０３１７Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２４：プローブＲ１４２０ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２５：プローブＲ２１８４ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２６：プローブＲ２３９１ＦＰ２の核酸配列（イネ）。
配列番号２７：プローブＲ２５７６Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２８：プローブＳ１０９２７ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号２９：プローブＳ１１２２２ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３０：プローブＳ１３３１６ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３１：プローブＳ１４０８２ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３２：プローブＳ１４４９３ＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３３：プローブＳ４３２５Ｆ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３４：プローブｐｒｘＲＰＮＦＰ１の核酸配列（イネ）。
配列番号３５：プローブｐｒｘＲＰＮＲＰ１の核酸配列（イネ）。
【０１６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２２のイネペルオキシダーゼを、創傷、プロベナゾールおよびジャスモン酸の処理により誘導された発現特異性に基づく分類を示す。
【図２】図２は、親和性品種である日本晴（左パネル）と非親和性品種であるＩＬ−７（右パネル）に、それぞれ８葉期のときに、イモチ病菌レース００３の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液に懸濁した胞子（３×１０5胞子／ｍｌ、２４個体あたり１００ｍｌ）を噴霧した。噴霧の２日後、３日後、４日後、５日後、および８日後に、病変部を撮影し、病変部の大きさを測定した。病変部の写真を２Ａに、そして病変部の大きさを棒グラフにしたものを２Ｂに示す。
【図３】図３は、１０のＰＯＸ遺伝子の器官特異的発現を示すゲル写真である。イモチ病菌感染に応答した１０のＰＯＸ遺伝子の特異的発現を、親和性イネである日本晴の種々の組織（根、葉鞘、最上部の葉身（それぞれ、３葉期および４葉期、５葉期、６葉期、および９葉期）、および健常な野生型日本晴の円錐花序）を用いて調査した。これらの組織から総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図４】Ｍ．ｇｒｉｓｅａ感染に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答を示すゲル写真である。親和性品種の日本晴（左パネル）と非親和性品種であるＩＬ−７（右パネル）に、それぞれ８葉期のときに、イモチ病菌レース００３の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液に懸濁した胞子を噴霧し、示された時間の後、ＰＯＸ遺伝子の発現を測定した。コントロールとして、８葉期の日本晴に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を同量接種したものを使用した。示された時間の後に最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、各遺伝子の３’ＵＴＲ特異的プローブを使用して、１レーンあたり２０μｇをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図５】図５は、図４の結果を半定量的に示したグラフである。横軸は、接種後日数を示し、縦軸は任意の単位である。発現パターンにより、ＰＯＸ遺伝子は、６つのタイプに分けられた。
【図６】図６は、イモチ病菌を接種した後のＲ２５７６転写物の蓄積を示したゲル写真である。８葉期の日本晴に３×１０5胞子／ｍｌのＭ．ｇｒｉｓｅａレース３を接種し、示された時間の後、最上部の葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。接種して１時間後で、既にＲ２５７６が発現していることが示される。
【図７】図７は、イネのプロベナゾール（ＰＢＺ）により誘導されたＰＯＸ遺伝子の発現を示すゲル写真である。１００ｍｇ／ｍｌのＰＢＺを噴霧した後の１０のＰＯＸ遺伝子の応答を、８葉期の日本晴の最上部の葉身において測定した。上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図８】図８は、ＰＯＸ遺伝子の発現に対する防御シグナル化合物の効果を示すゲル写真である。１ｍＭ ジャスモン酸、３ｍＭ サリチル酸、および１ｍＭ ＡＣＣ溶液を、それぞれ８葉期の日本晴の最上部の葉身に噴霧して０日後、１／４日後、および１日後に、それぞれの葉身から総ＲＮＡを抽出し、上記のように、総ＲＮＡをＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図９】図９は、創傷に対するイネＰＯＸ遺伝子の応答を示すゲル写真である。８葉期の日本晴の最上部の葉身に、直径０．５ｍｍの針で１ｃｍ2あたり９つの孔を開けることによって、傷をつけた。示された時間の後に、総ＲＮＡを抽出し、上記のように、ＲＮＡゲルブロット分析に供した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、５つのＰＯＸ遺伝子（Ｒ２１８４、Ｒ２３２９、Ｒ２５７６、Ｒ２６９３およびＣ５２９０３）についての各ｒＰＯＸプロモーター：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するバイナリベクターの構造を模式的に示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｐＩＧｎＧＵＳ、ｐＩＧ２６９３ＧＵＳおよびｐＩＧ２１８４ＧＵＳの構造を模式的に示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｐＩＧ２１８４ＡＧＵＳ、ｐＩＧ２３２９ＧＵＳおよびｐＩＧ１２１Ｈｍの構造の模式図を示す。
【図１１】図１１は、ＧＵＳ遺伝子とｒＰＯＸプロモーターとの融合物を示すＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、成体段階のｒＰＯＸ：：ＧＵＳ−Ｔ１植物におけるＧＵＳ活性（６〜９の独立したトランスジェニック植物のＧＵＳ活性）の誘導を示す。平均値を、バーで示す。
【図１３】図１３は、異なる発生段階でのＴ２トランスジェニックイネにおけるｒＰＯＸ：：ＧＵＳ遺伝子の器官特異的発現を示す。独立した９〜１５株のそれぞれのプロットとしてＧＵＳ活性を示した。３５Ｓ：：ＧＵＳ植物をポジティブコントロールとして用いた。平均をバーで示す。
【図１４】図１４は、異なる発生段階でのＴ２トランスジェニックイネにおけるｒＰＯＸ：：ＧＵＳ遺伝子の器官特異的発現を示す。独立した９〜１５株のそれぞれのプロットとしてＧＵＳ活性を示した。３５Ｓ：：ＧＵＳ植物をポジティブコントロールとして用いた。平均をバーで示す。
【図１５】図１５は、８葉期のｒＰＯＸ−Ｔ２植物における種々の処置によるＧＵＳ活性（独立した３株のプロット）の誘導を示す。平均値をバーで示す。
【図１６】図１６は、Ｒ２１４８：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するトランスジェニックイネとＲ２３２９：：ＧＵＳ融合遺伝子を有するトランスジェニックイネのＧＵＳ活性を示すグラフである。平均値をバーとして示した。
【図１７】図１７は、Ｒ２１８４：：ＧＵＳ Ｔ１およびＲ２１８４：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉身、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１８Ａ】図１８Ａは、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｒｐ：根原基、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉鞘、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ Ｔ１植物およびＲ２３２９：：ＧＵＳを有するＴ２植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｖｓ：維管束、ｒｐ：根原基、ｅｐ：表皮、ｌｓ：葉鞘、ｙｂ：幼若葉鞘、ｘ：木部、ｐｈ：篩部、ｍｘ：後生木部、ｅｄ：内皮、ｅｘ：下皮、ｆ：フィラメント、ｐ：花粉。
【図１９】図１９は、Ｒ２６９３：：ＧＵＳを有するＴ１植物の組織化学分析を示す。略語は、以下のとおりである。ｘ：木部、ｐｈ：篩部。
【図２０】図２０は、Ｒ２１８４：：ＧＵＳ、Ｒ２３２９：：ＧＵＳ、Ｒ２５７６：：ＧＵＳ、およびＲ２６９３：：ＧＵＳを有するタバコ形質転換体の葉身を切断処理して３日後に誘導されたＧＵＳ発現を示す写真である。矢印は切断面を示す。
Claims (5)
- トランスジェニック植物の作出方法であって、該方法は以下の工程：
（１）配列番号１６に記載のプロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を植物細胞に導入する工程；および
（２）得られた植物細胞を再分化して、トランスジェニック植物を作出する工程、
を包含する、方法。 - 配列番号１６に記載のプロモーターの、外来遺伝子の根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための使用。
- 前記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現、およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、請求項２に記載の使用。
- 配列番号１６に記載されるプロモーター、および植物細胞において該プロモーターに作動可能に連結されるべき外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、根特異的発現および／またはストレス誘導性発現のための組成物。
- 前記ストレス誘導性発現は、病原体誘導性発現、傷害誘導性発現およびプロベナゾール誘導性発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現を含む、請求項４に記載の組成物。
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