WO2005116214A2 - Promoteurs inductibles par des insectes ravageurs, et leurs utilisations - Google Patents

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WO2005116214A2
WO2005116214A2 PCT/FR2005/001204 FR2005001204W WO2005116214A2 WO 2005116214 A2 WO2005116214 A2 WO 2005116214A2 FR 2005001204 W FR2005001204 W FR 2005001204W WO 2005116214 A2 WO2005116214 A2 WO 2005116214A2
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plant
gene
plants
expression
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PCT/FR2005/001204
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WO2005116214A3 (fr
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Fanchon Divol
Sylvie Dinant
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Genoplante-Valor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible

Definitions

  • the present invention relates to promoters inducible by insect pests, in particular biting-sucking insects such as aphids, and allowing the expression of a gene of interest in phloem tissue.
  • insect pests in particular biting-sucking insects such as aphids
  • biting-sucking insects such as aphids
  • a gene of interest in phloem tissue.
  • biting-sucking insects such as aphids
  • phloem tissue One of the major causes of loss in global agriculture is the phytophagous insect pests. They meet in different families, in particular among Coleoptera, Lepidoptera and Homoptera. The damage they cause in plants is very varied: they can attack the foliage, young shoots, flowers, fruits, roots, etc; among the most devastating pests are biting-sucking insects, which feed on the elaborate sap carried by the phloem.
  • the biting-sucking insects belong almost entirely to the super-order of Hemipteroids (or Hemiptera); some of them belong to the order of Heteroptera (bedbugs), but most are Homoptera, such as whiteflies, leafhoppers, mealybugs, and Aphids, commonly known as "aphids".
  • Homoptera such as whiteflies, leafhoppers, mealybugs, and Aphids, commonly known as "aphids”.
  • the stinging and sucking insects can cause significant deformations of the plant organs, which can go as far as destroying them.
  • they are one of the main vectors of viral diseases, which they can inject into plants during their bites.
  • transgenic plants In general, in the context of the production of transgenic plants, it is in many cases desirable that the transgene of interest be expressed specifically or preferentially, in certain tissues or organs, and / or under certain environmental conditions and / or at certain stages of development. Thus, for transgenic plants produced for the purpose of combating insect pests, it is desirable that the expression of the transgene is induced by the attacks of the insects concerned, and that this expression occurs preferentially in the target tissues or organs by these attacks. This requires the availability of appropriate expression regulation sequences, and in particular promoters.
  • a promoter or promoter sequence is a nucleotide sequence having the function of controlling the conditions and the intensity of the transcription of the gene with which it is associated.
  • a promoter therefore makes it possible to modulate the quantity of mRNA transcribed from the DNA sequence located downstream of this promoter.
  • Certain promoters are said to be constitutive, that is to say that they allow the expression of the genes placed under their control at an equivalent level, whatever the conditions.
  • Others are said to be inducible, that is to say that the level of expression that they control is significantly increased in response to a stimulus whose causes can be very varied (for example, environmental conditions, stage of development, etc.).
  • the promoters can be ubiquitous or tissue-specific: promoters which provide a similar level of expression in all cell types and tissues of an organism are termed ubiquitous promoters; promoters which provide preferential or exclusive expression in a given tissue are called tissue-specific promoters.
  • the level of expression, as well as the inducibility and specificity properties of tissue expression of a particular promoter are determined by certain specific "promoter elements”.
  • the promoter sequences to which transcription factors specifically bind transcription factors are called “promoter elements” or “cis control elements”.
  • the eukaryotic promoters recognized by RNA polymerase II conventionally include several categories of promoter elements. The first category consists of sequences which interact with the basic transcriptional complex.
  • the basic transcription complex contains RNA polymerase as well as other transcription factors called “general transcription factors” (mainly the “TATA-binding protein” (TBP), as well as the factors TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF and TFIIH), and is necessary for the initiation of transcription as well as the elongation of the transcript.
  • the promoter elements recognized by the basic transcriptional complex are located in the immediate vicinity of the transcription initiation site; they usually include a TATA box generally located approximately 20 to 40 bp upstream of the transcription initiation site, or in some cases, an INR element (INitiatoR) located at the transcription initiation site.
  • upstream promoter elements upstream promoter elements
  • UPEs upstream promoter elements
  • upstream elements varies according to the genes concerned; the most frequently encountered are the CCAAT boxes, capable of interacting with various transcription factors, and sequences rich in GC, capable of binding the transcription factor SP1.
  • the specificity of tissue expression and the inducibility are governed by other sequences of the promoter, called “regulatory elements”. There are a wide variety of regulatory elements and control factors in trans capable of recognizing them.
  • trans control factors can be transcription activators, synthesized or active only in certain tissues, and / or in response to a particular stimulus, or transcription repressors, synthesized or active throughout an organism to except for one or more particular cell types, and / or in the absence of a particular stimulus.
  • tissue specificity and the inducibility of a promoter thus depend on the presence of particular regulatory elements, or, more frequently, on the presence of a particular combination of regulatory elements. Most of the upstream promoter and regulatory elements of a gene are generally located in a region of a few hundred base pairs upstream of the site for initiating transcription of said gene.
  • promoters there are other regions which can intervene in the regulation of the transcription of eukaryotic genes; these regions, called “enhancers” generally contain a combination of elements controlling the level, inducibility, or specificity of transcription.
  • Amplifiers have the particularity of being active even at a great distance from the promoter, upstream or downstream of it, and in any orientation. Amplifiers cannot, in themselves, induce the transcription of a gene, but can be used, in association with a promoter, to modify its activity, and in particular to increase the level thereof.
  • a number of specific promoters of different organs or tissues are known at the present time, which can be used to express a transgene in a plant tissue targeted by specific insect pests.
  • a specific promoter of the phloem will be used, such as the promoter derived from WDV (Wheat D arf Virus) described in PCT Application WO 03/060135. It is more problematic to find a promoter whose expression is both induced by the attacks of the insects concerned, and specific to the target plant tissues of these insects.
  • the induction remains localized at the site of application of the stimulus, or at best, zones neighboring, but is not exerted in a systemic way, that is to say in the regions of the plant located at a distance from the site of induction.
  • This can present a major drawback when, for example, the gene whose expression is to be induced is a gene intended to prevent attack by insect pests.
  • the present invention provides for the first time promoters inducible by insect pests, in particular biting-sucking insects, and also allowing targeted expression in all of the phloem vessels.
  • the inventors identified from the celery phloem (Api um graveolens), TSEs corresponding to genes induced after infestation by the aphid Myzus persicae. Part of these ESTs corresponded to genes coding for proteins involved in the biosynthesis and / or modification of cell walls, including several xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolases (XTH). The inventors have found that the expression of one of them, which will be referred to hereinafter as AgXTH1, was strongly induced in the phloem, but not in the other tissues tested, by infestation with aphids, and that furthermore, it was not caused by injury to the plant.
  • AgXTH1 xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolases
  • the sequence of the EST corresponding to AgXTH1 is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1, and the polypeptide sequence partial of AgXTHl deduced from this EST is represented under the number SEQ ID NO: 2.
  • An ortholog of AgXTHl has been identified in Arabidopsis thaliana sequence databases. It is the xyloglucan endotransglycosylase / hydrolase called AtXTH33 (accession number At: Atlgl0550).
  • the sequence coding for AtXTH33 is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 3, and the corresponding polypeptide sequence is represented under the number SEQ ID NO:
  • XTHs are involved in the construction of cell walls in plants, by catalyzing the endohydrolysis and endotransglycosylation of xyloglucans. These proteins belong to a multigene family, which in Arabidopsis thaliana, has 33 members. The XTHs were distributed, on the basis of their sequence homologies, into 4 phylogenetic groups: 3 in the dicotyledons, and a fourth in the monocotyledons (CAMPBELL and BRAAM, Plant J. 18 (4): 371-
  • AtXTH33 is classified among the XTHs of group 3.
  • a phylogenetic tree was constructed using the CLUSTAL W program from the alignment of the sequences of the 33 XTHs identified in Arabidopsis thaliana (numbered from 1 to 33); an XTH identified in Da ucus carota (De-); of 2 XTH identified in Hordeum vulgaris
  • FIG. 1 represents the alignment of the sequences of the 150 N-terminal amino acids, carried out with the PileUp program of GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) of 3 XTH of Arabidopsis thaliana representative respectively of group 1 (AtXTHl), group 2 (AtXTH17) and group 3 (AtXTH33), with the partial sequence of AgXTHl (BIP0760).
  • the identical sequences between AtXTH33 and AgXTHl are underlined.
  • the location of the ⁇ -glucanase motif characteristic of XTHs is indicated by the gray box.
  • DIMMER et al. Plant Biotechnol. J.
  • Bv-XTHl and Bv-XTH2 report the isolation of two XTHs genes, called Bv-XTHl and Bv-XTH2, from a cDNA library of beet roots [ Beta vulgaris) infected with the parasitic fungus Polymyxa betae, and obtaining promoters of these genes.
  • the GUS reporter gene placed under the control of one or other of these two promoters is expressed, in the absence of induction, preferentially in the vascular tissues (phloem and xylem); its expression is also induced by wounds (cut, or insect bite), and in this case remains localized at the level of the wound.
  • AtXTH33 For this purpose, they first studied the effect of the Myzus persicae infestation on the level and localization of the transcription of AtXTH33 in healthy Arabidopsis thaliana plants, and observed, following the infestation with Myzus persicae, overexpression of the transcripts of AtXTH33. Similar to that observed with AgXTH1 in celery, this overexpression appears systemic, that is to say even occurring at a distance from the infested leaves. The inventors then undertook the study of the promoter of AtXTH33. For this purpose, they isolated a polynucleotide approximately 1.3 kb in length located upstream of the sequence coding for AtXTH33, and studied the promoter properties of this polynucleotide.
  • the present invention relates to a polynucleotide.
  • said polynucleotide consists of the promoter isolated from a gene coding for a xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolase, said xyloglucan endotransglycosylase / hydrolase containing a peptide sequence having at least 50%, preferably at least 55%, most preferably at least 60%, and in ascending order of preference, at least 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, or 95% identity, with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • said polynucleotide consists of a sequence of 0.5 to 2 kb, preferably from 1 to 1.5 kb, upstream from the transcription initiation site of said gene.
  • said xyloglucan endotransglycosylase / hydrolase comprises at least one of the following peptide sequences: SGVVVAFYLSN (SEQ ID NO: 6); LDKSSG (SEQ ID NO: 7).
  • said promoter is chosen from: the promoter of a gene coding for a xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolase AtXTH33 from Arabidopsis thaliana defined by the sequence SEQ ID NO: 4; the promoter of a gene coding for an xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolase AgXTHl of celery comprising the sequence SEQ ID NO: 2.
  • Promoters in accordance with the invention can be easily obtained by a person skilled in the art, by the conventional techniques of molecular biology, for example as follows: the cDNA coding for a xyloglucan endo-transglycosylase / hydrolase having the percentage of identity defined above with the sequence SEQ ID NO: 2 can be isolated, in a conventional manner, from of a cDNA library of the chosen plant, by screening said library under conditions of low stringency, using for example as probe one of the sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a portion of this, for example nucleotides 100-344 or 73-322 of the sequence SEQ ID NO: 3, or else using Degenerate oligonucleotides derived from the regions conserved between the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • the cDNA library used for screening is obtained from mRNAs overexpressed in said plant in response to an infestation by a biting-sucking insect.
  • the cDNA thus isolated can then be used to recover, from the corresponding genomic DNA, the upstream fragment which contains the promoter, for example by screening of genomic libraries, or by PCR on the genomic DNA after digestion with a restriction enzyme having a cleavage site every 2-6 kb and ligation of adapters of known sequence at the end of the restriction fragments, using as primers on the one hand an oligonucleotide specific for cDNA, and on the other hand, an oligonucleotide specific for the adapter used.
  • a promoter in accordance with the invention, it consists of the polynucleotide SEQ ID NO: 5, or of a fragment thereof comprising at least the functional domains responsible for induction in the phloem during an aphid attack.
  • Those skilled in the art can, from the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 5, locate its functional domains, by techniques known in themselves of dissection of the promoters, for example by determining the level and the specificity of the activity.
  • DNA motifs, and in particular the regulatory elements present in these fields can be identified by bioinformatic analysis, for example by research on databases such as the PLACE database (HIGO et al., Nucleic Acids Res.
  • the present invention also relates to the use of a promoter in accordance with the invention, as defined above, for inducing preferential expression in the phloem of a plant of a gene of interest placed under control transcriptional of said promoter, during an attack by a pest insect, in particular a biting-sucking insect.
  • said insect pest is a stinging-sucking insect such as a hemipteroid, in particular a Homoptera, advantageously an Aphidian.
  • a stinging-sucking insect such as a hemipteroid, in particular a Homoptera, advantageously an Aphidian.
  • a promoter in accordance with the invention is its ability to induce systemic expression, throughout the phloem, of the gene of interest placed downstream.
  • the gene of interest will not be expressed only in the phloem vessels at the point of attack, but in those of all of the plant organs.
  • Said gene of interest may in particular be a DNA sequence making it possible to directly fight against infestation by pests, in particular aphids, or against viral transmission or infection with viruses.
  • aphids and other sucking biting insects are vectors of viruses which they transmit from plants to plants.
  • the DNA sequence of interest can in particular correspond to a sequence coding for an aphicidal or virucidal protein.
  • genes coding for aphicidal proteins there may be mentioned: the Mi gene for resistance to nematodes and / or aphids described in Application WO 98/06750, or else genes coding for proteins such as lectins (HILDE et al., Transgenic Res.
  • Said gene of interest can also be a gene coding for a protein involved in the stress response pathways and making it possible to improve the resistance of plants to infections by triggering a hypersensitive response. It may also be any gene coding for a protein of interest which it is desired to see expressed specifically in the phloem and whose expression it would be advantageous to trigger.
  • the phloem is one of the plant tissues favored for carrying out the photoassimilate from the source organs to the well organs; the phloem also allows long distance signaling and homeostasis (VILAINE et al., Plant J. 36: 67-81, 2003; HAYASHI et al., Australian J. Plant Physiol. 27: 489-496, 2000; RUIZ- MEDRANO et al, Curr. Opin. Plant Biol. 4: 202-209, 2001; SJ ⁇ LUND, Plant Cell 9: 1137-1146, 1997; OPARKA and CRUZ, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
  • the gene of interest in the phloem makes it possible to diffuse in all the organs of the plant (leaves, roots, flowers, stems, etc.) the protein encoded by the gene of interest.
  • the gene of interest can also be a sequence transcribed into antisense RNA or into interfering RNA, usable in particular for combating infection by viruses.
  • the present invention also relates to any recombinant polynucleotide containing a promoter in accordance with the invention.
  • recombinant expression cassettes comprising, in addition to a promoter according to the invention, a heterologous gene of interest placed under transcriptional control of said promoter, or a site allowing the insertion of said gene of interest; recombinant vectors, resulting from the insertion of a promoter or of an expression cassette in accordance with the invention in a host vector.
  • the expression cassettes and recombinant vectors in accordance with the invention can, of course, also comprise other sequences, usually used in this type of construction. The choice of these other sequences will be carried out, in a conventional manner, by a person skilled in the art as a function in particular of criteria such as the chosen host cells, the transformation protocols envisaged, etc.
  • transcription terminators include transcription terminators, leader sequences (leader sequences - enhancer sequences favorable to the initiation of translation) and polyadenylation sites.
  • leader sequences Leader sequences - enhancer sequences favorable to the initiation of translation
  • polyadenylation sites can be those which are naturally associated with the gene of interest, or may be heterologous sequences. These sequences do not intervene on the specific properties of the promoter, but can improve overall qualitatively or quantitatively, transcription, and if necessary, translation.
  • sequences of this type frequently used in plants mention will be made of the most widespread, the terminator of CaMV 35S RNA, the terminator of the nopaline synthase gene, etc.
  • sequences allowing the monitoring of the transformation, and the identification and / or selection of the transformed cells or organisms are in particular reporter genes, conferring on these cells or organisms an easily recognizable phenotype, or else selection marker genes: only the cells or organisms expressing a determined selection marker gene are viable under given conditions (selective conditions ).
  • reporter genes are, for example, that of beta-glucuronidase (GUS), that of luciferase, or that of "green fluorescent protein” (GFP).
  • Selection marker genes are generally genes for resistance to an antibiotic, or also, in the case of plants or plant cells, to a herbicide.
  • the present invention also encompasses host cells transformed by a polynucleotide, in particular an expression cassette or a recombinant vector in accordance with the invention.
  • host cells transformed by a polynucleotide in particular an expression cassette or a recombinant vector in accordance with the invention.
  • cell or organism transformed by a polynucleotide is meant any cell or organism whose genetic content has been modified by transfer of said polynucleotide into said cell or said organism, whatever the transfer method that was used, and whether the genetic information provided by said polynucleotide is integrated into chromosomal DNA or remains extra-chromosomal .
  • Host cells can be prokaryotic, or eukaryotic cells.
  • prokaryotic cells it may especially be Agrobacteria such as Agroba c ter i um tumefaciens or Agroba cteri um rhizobium.
  • eukaryotic cells they may in particular be plant cells, derived from dicotyledonous or monocotyledonous plants.
  • the present invention also relates to plants transformed with at least one expression cassette or a recombinant vector in accordance with the invention, and in particular transgenic plants comprising in their genome at least one copy of a transgene containing a promoter in accordance with the invention.
  • a transgenic plant is defined as a transformed plant in which the exogenous genetic information provided by a transforming polynucleotide is stably integrated into the chromosomal DNA, in the form of a transgene, and can thus be transmitted to the descendants of said plant.
  • This definition therefore also includes the descendants of plants resulting from the initial transgenesis, since they contain in their genome a copy of the transgene.
  • the transgenic plants according to the invention have the property, following an infestation by a pest insect, and in particular a biting-sucking insect, to express preferentially in their phloem, the gene of interest inserted in said expression cassette.
  • the plant material (protoplasts, calluses, cuttings, seeds, etc.) obtained from transformed cells or transgenic plants conforming to the invention also forms part of the object of the present invention.
  • the invention also encompasses the products obtained from plants according to the invention, in particular fodder, wood, leaves, stems, roots, flowers and fruits.
  • the present invention applies to all plants, and in particular to plants sensitive to attack by biting-sucking insects. In particular, without limitation, it can be used in vegetable plants, ornamental plants, fruit trees, field crops such as wheat, corn or rice, or industrial crops such as cotton, rapeseed or sunflower.
  • the plants concerned can be dicots, such as for example in particular cucurbits, solanaceae, crucifers, compounds, umbelliferae, purplish, malvaceae, rosaceae, etc., or monocots, such as cereals or lily.
  • dicots such as for example in particular cucurbits, solanaceae, crucifers, compounds, umbelliferae, purplish, malvaceae, rosaceae, etc.
  • monocots such as cereals or lily.
  • Different methods of obtaining transgenic plants are well known in themselves to those skilled in the art. Generally, these methods involve the transformation of plant cells, the regeneration of plants from transformed cells, and the selection of plants that have integrated the transgene. Very numerous techniques for transforming germinal or somatic plant cells (isolated, in the form of tissue or organ cultures, or on the whole plant), and of regenerating plants are available. The choice of the most appropriate method generally depends on the plant concerned.
  • RNA 10 ⁇ g of total RNA are subjected to electrophoresis on 1% agarose gel containing 15% formaldehyde. The RNA is then transferred to the membrane of nylon (Genescreen, Perkin Elmer Life Science), by overnight incubation in 10X SSC buffer (1.5M NaCl, 0.15M Na Citrate). After washing the membrane in 2X SSC buffer, the RNA is fixed by exposure to UV (UV Stratalinker 2400 apparatus Stratagene).
  • 10X SSC buffer 1.5M NaCl, 0.15M Na Citrate
  • Detection is carried out using the following probes, labeled with a 32P dCTP (Prime-a-gene Labeling kit Promega): - EST BIP0760 of sequence SEQ ID NO: 1, for AgXTHl - EST BIP1217 of sequence SEQ ID NO: 8, for AgMT5 Prehybridization was carried out for 4 hours at 50 ° C, and followed by hybridization overnight at 65 ° C, in the buffer described by CHURCH and GILBERT (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984) without formamide.
  • FIG. 1 illustrates the transcription of AgXTHl and AgMT5 in phloem 3 days or 7 days after infestation (dpi) in plants infested with aphids (+), and in non-infested control plants (-).
  • FIG. 3 illustrates the transcription of AgXTHl and AgMT5 in the phloem (Ph) of uninfested plants (-) and in the xylem (Xyl) and the reserve parenchyma (Par) 3 days or 7 days after the infestation (dpi) in plants infested with aphids (+), and in non-infested control plants (-).
  • Ph phloem
  • Xyl xylem
  • Para reserve parenchyma
  • the specificity of tissue expression of AgXTH1 was studied by hybridization in si tu on petioles of celery leaves infested or not. 9 ⁇ m thick sections were obtained from the petioles previously fixed with formaldehyde and included in the paraffin.
  • oligonucleotide probe labeled with digoxigenin and corresponding to the following sequence: 5'-GCACTGAAAAATCCGTAATAGTA-3 '(SEQ ID NO: 9) is synthesized from the sequence coding for AgXTH1, using the kit “DIG oligonucleotide Tailing Kit”, according to the manufacturer's instructions (Roche Diagnostics, Indianapolis). Hybridization in si tu with this probe is carried out in accordance with the manufacturer's instructions, and at a temperature of 60 ° C.
  • the immunodetection of the probe is carried out using anti-DIG Fab fragments conjugated to alkaline phosphatase and visualization is carried out using as substrates the tetrazolium nitroblue (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP).
  • AgXTH1 transcripts were detected only in the petioles of plants infested with M. persicae.
  • the labeling reflecting hybridization with the AgXTH1 probe is observed only in the area of the conductive phloem.
  • FIG. 4 illustrates the transcription of AgXTHl and AgMT5 in the phloem, 3 days after the infestation (dpi) in plants infested with aphids (+) and in uninfested control plants (-), as well as 3 days or 7 days after treatment by injury (by application of laboratory forceps on mature leaves) (+), and in untreated control plants (-)
  • dpi the infestation of AgXTH1
  • AgMT5 an equivalent increase in transcription is observed after induction by injury or by aphid infestation.
  • AgXTHl on the other hand, while transcription is strongly induced by aphids, it remains at basal level after treatment by injury.
  • EXAMPLE 2 ISOLATION OF THE pAtXTH33 PROMOTER
  • GATEWAY TM technology Invitrogen
  • the donor vector used, pDONR TM 207 contains the ccdB negative selection gene (lethal for E. coli), and a chloramphenicol resistance gene (Cm R ), flanked on the one hand by an attP1 and d site.
  • AttP2 site This vector is multiplied in E bacteria. coli DB3.1 TM (Invitrogen) which are resistant to ccdB.
  • the AtXTH33 promoter is amplified by PCR from genomic DNA of Arabidopsi s thaliana, using the primer promXET33 + (SEQ ID NO: 10) containing the recombination site ⁇ attBl (5'- AAAAAAGCAGGCTTAAAATCAAGAATAAAACAG-3 ' ) and the primer promXET33 " (SEQ ID NO 11) containing the recombination site attB2 (5'- AAGAAAGCTGGGTCGTTGTGTTTTATACTTCT-3 ').
  • the sequences which correspond to the recombination sites provided by the primers are underlined, the rest of the sequence is specific for the AtXTH33 promoter
  • the attB-promXET33 amplifier (1251 bp) obtained is inserted into the donor vector pDONR TM 207 by attB x attP (BP) construct.
  • the construct is used to transform competent E. coli cells. DH10B (sensitive to ccdB); only cells comprising the recombinant plasmid in which the cc B + Cm R fragment is replaced by the amplified fragment produce colonies.
  • the input vector obtained contains the promoter of AtXTH33, flanked by attL1 and attL2 recombination sites.
  • EXAMPLE 3 OBTAINING THE pAtXTH 33 + GUS AND pAtXTff 33 + GFP CONSTRUCTIONS
  • the cloning of the pAtXHT33 promoter in front of the GUS gene coding for ⁇ -glucuronidase or the erGFP5 gene coding for a green fluorescent protein is also carried out using the GATEWAY TM recombination system (Invitrogen).
  • Destination vectors are constructed from the binary vectors pBHOl-GUS (JEFFERSON et al., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987) and pBHOl-GFP (HASELOFF et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • R1-R2 recombination cassette (Invitrogen) containing the ccdB negative selection gene, and a chloramphenicol resistance gene, flanked on the one hand by an attR1 site and on the other hand by an attR2 site is inserted into both of these vectors at Hindi I I sites -Xba I, in phase with the coding sequence of GUS, or that of erGFPS.
  • the destination vectors obtained respectively designated PBI101-R1R2-GUS and pBI101-RlR2-GFP, which contain the ccdB gene are multiplied in E. coli DB3.1 TM.
  • the pAtXHT33 promoter contained in the input vector described in Example 2 above is introduced by LR recombination (attLxattR) into these destination vectors.
  • the recombinants obtained are selected on E. coli DH10B, as described in Example 2 above.
  • the expression vectors obtained are respectively designated pBI101-RlR2-GUS and pBI101-RlR2-GFP. The maps of these vectors are shown in Figure 5.
  • Each of these vectors is introduced into Agrobacteri um tumefaciens C58 by electroporation.
  • the transformed Agrobacterium strains are used to transform plants.
  • EXAMPLE 4 EXPRESSION OF GUS OR GFP AFTER INDUCTION BY THE BITTING OF Aphids AND HISTOCHEMICAL LOCATION OF EXPRESSION
  • the expression of GUS or GFP in transformed plants is analyzed on the one hand in non-infested plants, and on the other hand in plants infested with M. persicae, 48h, 72h and 7 days after the infestation. Histochemical analyzes of the expression of ⁇ -glucuronidase are carried out according to the protocol described by JEFFERSON et al. (1987, supra).
  • the tissue samples are fixed in ice-cold 80% acetone for 20 minutes, then washed three times with water and infiltrated under vacuum to facilitate penetration of the reagent into the tissues.
  • the samples are then incubated at 37 ° C overnight in the reaction buffer (1 mg / ml 5-bromo 4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc), 100 mM potassium phosphate pH 7, 0.1% (vol / vol) Triton X 100) in the presence of 1 mM potassium ferrocyanide).
  • the samples are observed after discoloration with 70% ethanol. In the case of non-infested plants, a very weak expression is observed in the vascular tissues of the rosette leaves.

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Abstract

La présente invention est relative au promoteur d'une xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase (XTH), et son utilisation pour induire l'expression d'un gène d'intérêt dans le phloème d'une plante lors d'une attaque par un insecte ravageur. L'invention concerne également les cellules-hôte et les plantes transgéniques comprenant ledit promoteur.

Description

PROMOTEURS INDUCTIBLES PAR DES INSECTES RAVAGEURS, ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention concerne des promoteurs inductibles par des insectes ravageurs, notamment des insectes piqueurs-suceurs tels que les pucerons, et permettant l'expression d'un gène d'intérêt dans les tissus du phloème. Les insectes phytophages ravageurs constituent l'une des causes majeures de pertes dans l'agriculture mondiale. Ils se rencontrent dans différentes familles, en particulier parmi les Coléoptères, les Lépidoptères et les Homoptères. Les dégâts qu'ils occasionnent chez les plantes sont très variés : ils peuvent s'attaquer au feuillage, aux jeunes pousses, aux fleurs, aux fruits, aux racines, etc ; parmi les ravageurs les plus dévastateurs figurent les insectes piqueurs-suceurs, qui se nourrissent de la sève élaborée transportée par le phloème. Les insectes piqueurs-suceurs appartiennent en quasi-totalité au super-ordre des Hémiptéroïdes (ou Hémiptères) ; certains d'entre eux appartiennent à l'ordre des Hétéroptères (punaises), mais la plupart sont des Homoptères, tels que les aleurodes, les cicadelles, les cochenilles, et les Aphidiens, communément dénommés « pucerons ». Outre l'affaiblissement de la plante résultant du prélèvement continuel de la sève élaborée, les insectes piqueurs-suceurs peuvent provoquer des déformations importantes des organes végétaux, pouvant aller jusqu'à la destruction de ceux-ci. En outre, ils font partie des principaux vecteurs des maladies virales, qu'ils peuvent inoculer aux plantes lors de leurs piqûres. Parmi les principales méthodes de lutte contre les insectes ravageurs actuellement connues, on citera, de manière non-exhaustive : l'utilisation d'insecticides, qui s'avère de moins en moins efficace, du fait de l'apparition de résistances chez de nombreux insectes- cible ; la lutte biologique, qui fait appel à l'utilisation d'organismes prédateurs ou pathogènes de l'insecte-cible ; la production de plantes transgéniques (pour revue, GROOT et DICKE, Plant J. 31(4) : 387-406, 2002) exprimant par exemple, des gènes dont les produits sont toxiques ou répulsifs pour les ravageurs, ou diminuent la susceptibilité des plantes à leurs attaques. De manière générale, dans le cadre de la production de plantes transgéniques, il est dans de nombreux cas, souhaitable que le transgène d'intérêt soit exprimé spécifiquement ou préférentiellement , dans certains tissus ou organes, et/ou dans certaines conditions environnementales et/ou à certains stades du développement. Ainsi, pour les plantes transgéniques produites à des fins de lutte contre des insectes ravageurs, il est souhaitable que l'expression du transgène soit induite par les attaques des insectes concernés, et que cette expression intervienne préférentiellement dans les tissus- ou organes-cible visés par ces attaques. Ceci nécessite que l'on dispose de séquences appropriées de régulation de l'expression, et notamment de promoteurs . Une séquence promotrice ou promoteur est une séquence nucléotidique ayant pour fonction de contrôler les conditions et l'intensité de la transcription du gène auquel il est associé. Un promoteur permet donc de moduler la quantité d'ARNm transcrit à partir de la séquence d'ADN située en aval de ce promoteur. Certains promoteurs sont dits constitutifs, c'est-à-dire qu'ils permettent l'expression des gènes placés sous leur contrôle à un niveau équivalent, quelles que soient les conditions. D'autres sont dits inductibles, c'est-à-dire que le niveau d'expression qu'ils contrôlent est significativement augmenté en réponse à un stimulus dont les causes peuvent être très variées (par exemple, conditions environnementales, stade de développement, etc.). Outre leur caractère constitutif ou inductible, les promoteurs peuvent être ubiquitaires ou tissu- spécifiques : des promoteurs qui assurent un niveau d'expression similaire dans tous les types cellulaires et tissus d'un organisme sont qualifiés de promoteurs ubiquitaires ; des promoteurs qui assurent une expression préférentielle ou exclusive dans un tissu déterminé sont qualifiés de promoteurs tissu-spécifiques. Le niveau d'expression, ainsi que les propriétés d' inductibilité et de spécificité d'expression tissulaire d'un promoteur particulier sont déterminés par certains « éléments de promoteur » spécifiques. On dénomme « éléments de promoteur » ou « éléments de contrôle en cis », les séquences du promoteur auxquelles se lient spécifiquement des facteurs de transcription (dénommés facteurs de contrôle en trans) . Les promoteurs eucaryotes reconnus par l'ARN polymérase II comprennent classiquement plusieurs catégories d'éléments de promoteur. La première catégorie est constituée par les séquences qui interagissent avec le complexe transcriptionnel de base. Le complexe transcriptionnel de base contient l'ARN polymérase ainsi que d'autres facteurs de transcription dénommés « facteurs de transcription généraux » (principalement la « TATA-binding protein » (TBP) , ainsi que les facteurs TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF et TFIIH) , et est nécessaire à l'initiation de la transcription ainsi qu'à l'élongation du transcrit. Les éléments de promoteur reconnus par le complexe transcriptionnel de base sont situés à proximité immédiate du site d' initiation de la transcription ; ils comprennent usuellement une boite TATA située en général à environ 20 à 40pb en amont du site d'initiation de la transcription, ou dans certains cas, un élément INR (INitiatoR) localisé au niveau du site d'initiation de la transcription. Ces éléments définissent un « promoteur minimal » qui, lorsqu'il est incubé in vi tro avec le complexe transcriptionnel de base, permet une transcription à un niveau basai, qui ne varie que très peu, quel que soit le gène d'où proviennent les éléments du promoteur minimal. In vivo, dans la plupart des cas, le niveau de transcription assuré par le promoteur minimal isolé est inférieur au niveau basai observé in vitro, et se situe même fréquemment en dessous du seuil de détection (l'ADN intracellulaire, empaqueté dans les nucléosomes, est moins accessible au complexe transcriptionnel de base que l'ADN nu utilisé dans les expérimentations in vi tro) . L'obtention d'une transcription efficace in vivo nécessite l'intervention d'autres catégories d'éléments de promoteur, et des facteurs de contrôle en trans correspondants . L' augmentation du niveau de transcription, indépendamment du tissu concerné et de l'application d'un stimulus, implique des éléments de promoteur dénommés « éléments amont de promoteur » (upstream promoter éléments ou UPEs), qui sont reconnus par des facteurs de transcription synthétisés et activés de manière constitutive et ubiquitaire, et permettent donc une transcription uniforme dans tous les types cellulaires, et quels que soient les stimuli présents. La nature de ces éléments amont varie selon les gènes concernés ; les plus fréquemment rencontrés sont les boîtes CCAAT, capables d' interagir avec des facteurs de transcription variés, et des séquences riches en GC, capables de lier le facteur de transcription SP1. La spécificité d'expression tissulaire et l' inductibilité sont gouvernées par d'autres séquences du promoteur, dénommées « éléments régulateurs ». Il existe une grande variété d' éléments régulateurs et de facteurs de contrôle en trans capables de les reconnaître. Ces facteurs de contrôle en trans peuvent être des activateurs de transcription, synthétisés ou actifs uniquement dans certains tissus, et/ou en réponse à un stimulus particulier, ou des répresseurs de transcription, synthétisés ou actifs dans l'ensemble d'un organisme à l'exception d'un ou plusieurs types cellulaires particuliers, et/ou en l'absence d'un stimulus particulier . La spécificité tissulaire et l' inductibilité d' un promoteur dépendent ainsi de la présence d' éléments régulateurs particuliers, ou, plus fréquemment, de la présence d'une combinaison particulière d'éléments régulateurs . L' essentiel des éléments amont de promoteur et des éléments régulateurs d'un gène est généralement situé dans une région de quelques centaines de paires de bases en amont du site d' initiation de la transcription dudit gène . En dehors des promoteurs, il existe d'autres régions pouvant intervenir dans la régulation de la transcription des gènes eucaryotes ; ces régions, dénommées « amplificateurs » (enhancers) contiennent généralement une association d'éléments contrôlant le niveau, l' inductibilité, ou la spécificité de la transcription. Les amplificateurs ont la particularité d'être actifs même à grande distance du promoteur, en amont ou en aval de celui-ci, et dans n'importe quelle orientation. Les amplificateurs ne peuvent pas, en eux- mêmes, induire la transcription d'un gène, mais peuvent être utilisés, en association avec un promoteur, pour modifier son activité, et notamment pour augmenter le niveau de celle-ci. Dans le cas des plantes, on connaît à l'heure actuelle un certain nombre de promoteurs spécifiques de différents organes ou tissus, que l'on peut utiliser pour exprimer un transgène dans un tissu végétal cible d'insectes ravageurs déterminés. Par exemple, dans le cas d'insectes phloemophages, on utilisera un promoteur spécifique du phloème, tel que le promoteur issu du WDV (Wheat D arf Virus) décrit dans la Demande PCT WO 03/060135. Il est plus problématique de trouver un promoteur dont l'expression est à la fois induite par les attaques des insectes concernés, et spécifique des tissus végétaux cibles de ces insectes. D'autre part, dans le cas de la plupart des promoteurs inductibles par un stimulus appliqué localement, tel qu'une piqûre d'insecte, l'induction demeure localisée au niveau du site d' application du stimulus, ou au mieux, des zones voisines, mais ne s'exerce pas de manière systémique, c'est-à-dire dans les régions de la plante situées à distance du site d'induction. Ceci peut présenter un inconvénient majeur lorsque, par exemple, le gène dont on souhaite induire l'expression est un gène destiné à prévenir l'attaque d'insectes ravageurs. La présente invention propose pour la première fois des promoteurs inductibles par les insectes ravageurs, notamment les insectes piqueurs-suceurs, et permettant en outre une expression ciblée dans l'ensemble des vaisseaux du phloème. Les Inventeurs ont identifié à partir du phloème de céleri (Api um graveolens) , des EST correspondant à des gènes induits après infestation par le puceron Myzus persicae . Une partie de ces EST correspondaient à des gènes codant pour des protéines impliquées dans la biosynthèse et/ou la modification des parois cellulaires, parmi lesquelles plusieurs xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolases (XTH) . Les Inventeurs ont constaté que l'expression de l'une d'entre elles, qui sera dénommée ci-après AgXTHl, était fortement induite dans le phloème, mais pas dans les autres tissus testés, par 1' infestation par les pucerons, et qu'en outre, elle n'était pas induite par une blessure de la plante. La séquence de l'EST correspondant à AgXTHl est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et la séquence polypeptidique partielle de AgXTHl déduite de cette EST est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2. Un orthologue de AgXTHl a été identifié dans des banques de données de séquences d' Arabidopsis thaliana . Il s'agit de la xyloglucane endo- transglycosylase/hydrolase dénommée AtXTH33 (n° d'accession At : Atlgl0550). La séquence codant pour AtXTH33 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3, et la séquence polypeptidique correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO:
4. Les XTHs interviennent dans la construction des parois cellulaires chez les plantes, en catalysant l' endohydrolyse et l' endotransglycosylation des xyloglucanes . Ces protéines appartiennent à une famille multigénique, qui chez Arabidopsis thaliana , compte 33 membres. Les XTHs ont été réparties, sur la base de leurs homologies de séquences, en 4 groupes phylogénétiques : 3 chez les dicotylédones, et un quatrième chez les monocotylédones (CAMPBELL et BRAAM, Plant J. 18(4) : 371-
382, 1999 ; YOKOYAMA et NISHITANI, Plant Cell Physiol.
42 : 1025-1033, 2001 ; ROSE et al., Plant Cell Physiol.
43 : 1421-1435, 2002) . AtXTH33 est classée parmi les XTHs du groupe 3. Un arbre phylogénétique a été construit à l'aide du programme CLUSTAL W à partir de l'alignement des séquences des 33 XTH identifiées chez Arabidopsis thaliana (numérotées de 1 à 33) ; d'une XTH identifiée chez Da ucus carota (De-) ; de 2 XTH identifiées chez Hordeum vulgaris
(PM-), et de la séquence partielle de AgXTHl (BIP0760) identifiée par les Inventeurs. Cette analyse phylogénétique permet de classer AgXTHl, comme AtXTH33, parmi les XTHs du groupe 3 (seuil de bootstrap 75%). La figure 1 représente l'alignement des séquences des 150 acides aminés N-terminaux, effectué avec le programme PileUp de GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) de 3 XTH d' Arabidopsis thaliana représentatives respectivement du groupe 1 (AtXTHl), du groupe 2 (AtXTH17) et du groupe 3 (AtXTH33), avec la séquence partielle de AgXTHl (BIP0760). Les séquences identiques entre AtXTH33 et AgXTHl sont soulignées. L'emplacement du motif β-glucanase caractéristique des XTHs est indiqué par la boîte grisée. La comparaison des séquences entre AtXTH33 et AgXTHl, effectuée sur une fenêtre de comparaison constituée par les 136 acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 1, en utilisant le logiciel BlastX (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402, 1997), avec les paramètres par défaut (matrice BLOSUM 62, pénalité pour existence de discontinuités : 11, pénalité pour extension de discontinuités : 1, taille des mots : 3 ), et sans filtrage des séquences de faible complexité de composition, fait apparaître un pourcentage d'identité de séquence de 55% entre ces deux XTHs. Dans une publication récente, DIMMER et a l . (Plant Biotechnol. J. 2(2) : 127-139, 2004) rapportent l'isolement de deux gènes de XTHs, dénommés Bv-XTHl et Bv- XTH2, à partir d'une banque d'ADNc de racines de betterave [ Beta vulgaris) infectées par le champignon parasite Polymyxa betae , et l'obtention des promoteurs de ces gènes. Chez Arabidopsis thaliana , le gène rapporteur GUS placé sous contrôle de l'un ou l'autre de ces deux promoteurs est exprimé, en l'absence d'induction, préférentiellement dans les tissus vasculaires (phloème et xylème) ; son expression est également induite par des blessures (coupure, ou piqûre d'insecte), et demeure dans ce cas localisée au niveau de la blessure. Des analyses des profils d'expression des 33 XTHs d' Arabidopsis thaliana ont été effectuées par YOKOYAMA et NISHITANI, (Plant Cell Physiol. 42 : 1025- 1033, 2001). En ce qui concerne AtXTH33, ces auteurs rapportent un niveau d'expression faible, localisé essentiellement au niveau des siliques vertes. Cette expression n' est pas inductible par les hormones végétales testées (acide indole acétique ; acide gibérellique, brassinolide, acide abscissique) . Au vu de l'homologie existant entre AtXTH33 et AgXTHl , les Inventeurs ont recherché si les modalités d'expression de ces gènes étaient également semblables. Dans ce but, ils ont dans un premier temps étudié l'effet de l' infestation par Myzus persicae, sur le niveau et la localisation de la transcription de AtXTH33 dans des plants d' Arabidopsis thaliana sains, et ont observé, suite à l' infestation par Myzus persicae, une surexpression des transcrits de AtXTH33. De manière similaire à celle observée avec AgXTHl chez le céleri, cette surexpression apparaît systémique, c'est-à-dire intervenant même à distance des feuilles infestées. Les Inventeurs ont ensuite entrepris l'étude du promoteur d' AtXTH33. Dans ce but ils ont isolé un polynucléotide d'une longueur d'environ 1,3 kb situé en amont de la séquence codant pour AtXTH33, et ont étudié les propriétés promotrices de ce polynucléotide. Ils ont ainsi observé qu' il contenait tous les éléments nécessaires à l'induction de l'expression d'un gène dans le phloème en réponse à une attaque par le puceron Myzus persicae. La présente invention a pour objet un polynucléotide. isolé ayant une activité de promoteur inductible, dans le phloème d'une plante, par une attaque par un puceron, caractérisé en ce que ledit polynucléotide est constitué par le promoteur isolé d'un gène codant pour une xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase, ladite xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase contenant une séquence peptidique possédant au moins 50%, de préférence au moins 55%, de manière tout à fait préférée au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 2. Les pourcentages d' identité auxquels il est fait référence ici sont établis, comme indiqué ci-dessus, à l'aide du logiciel BlastX, en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison comprenant les 136 acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 1. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit polynucléotide est constitué par une séquence de 0,5 à 2 kb, de préférence de 1 à 1,5 kb, en amont du site d'initiation de la transcription dudit gène. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, ladite xyloglucane endo- transglycosylase/hydrolase comprend au moins une des séquences peptidiques suivantes : SGVVVAFYLSN (SEQ ID NO: 6) ; LDKSSG (SEQ ID NO: 7). Avantageusement, ledit promoteur est choisi parmi : le promoteur d'un gène codant pour une xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase AtXTH33 d' Arabidopsis thaliana définie par la séquence SEQ ID NO: 4 ; le promoteur d'un gène codant pour une xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase AgXTHl de céleri comprenant la séquence SEQ ID NO: 2. Des promoteurs conformes à l'invention peuvent être facilement obtenus par l'homme du métier, par les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple de la manière suivante : l'ADNc codant pour une xyloglucane endo-transglycosylase/hydrolase possédant le pourcentage d' identité défini ci-dessus avec la séquence SEQ ID NO: 2 peut être isolé, de manière classique, à partir d'une banque d'ADNc de la plante choisie, par criblage de ladite banque en conditions de faible stringence, en utilisant par exemple comme sonde l'une des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou une portion de celle-ci par exemple les nucléotides 100-344 ou 73-322 de la séquence SEQ ID NO: 3, ou bien en utilisant des oligonucléotides dégénérés dérivés des régions conservées entre les séquences SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 4. Avantageusement, la banque d'ADNc utilisée pour le criblage est obtenue à partir d'ARNms surexprimés chez ladite plante en réponse à une infestation par un insecte piqueur-suceur . L'ADNc ainsi isolé peut ensuite être utilisé pour récupérer, à partir de l'ADN génomique correspondant, le fragment en amont qui contient le promoteur, par exemple par criblage de banques genomiques, ou par PCR sur l'ADN génomique après digestion avec une enzyme de restriction possédant un site de coupure tous les 2-6 kb et ligation d'adaptateurs de séquence connue à l'extrémité des fragments de restriction, en utilisant comme amorces d'une part un oligonucléotide spécifique de l'ADNc, et d'autre part un oligonucléotide spécifique de l'adaptateur utilisé. Plusieurs enzymes de restriction peuvent être éventuellement testées pour l'obtention de fragments amplifiés contenant la région promotrice entière. Selon un mode de réalisation préféré d'un promoteur conforme à l'invention, il est constitué par le polynucléotide SEQ ID NO: 5, ou par un fragment de celui- ci comprenant au moins les domaines fonctionnels responsables de l'induction dans le phloème lors de l'attaque par un puceron. L'homme du métier peut, à partir du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 5, localiser ses domaines fonctionnels, par des techniques connues en elles-mêmes de dissection des promoteurs, par exemple en déterminant le niveau et la spécificité de l'activité promotrice de mutants de délétion de ce polynucléotide, et/ou par des techniques telles que celles des empreintes sur l'ADN (footprints) , par exemple en incubant le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 5 ou les portions de celui-ci dont on souhaite étudier la fonction, avec des extraits nucléaires de cellules du phloème d'une plante infestée par un puceron, et en parallèle, avec des extraits nucléaires de cellules du phloème de plantes témoin, et/ou avec des extraits nucléaires de tissus autres que le phloème. Les motifs d'ADN, et notamment les éléments régulateurs présents dans ces domaines peuvent être identifiés par analyse bioinformatique, par exemple par recherche sur des bases de données telles que la base PLACE (HIGO et al., Nucleic Acids Res. 27 : 297-300, 1999). On peut ainsi obtenir d'autres promoteurs possédant les propriétés d' inductibilité et de spécificité tissulaire d'un promoteur conforme à l'invention en associant les éléments régulateurs ou la combinaison d'éléments régulateurs de ce promoteur, aux éléments d'un promoteur minimal et le cas échéant à des éléments amont, issus d'autres promoteurs. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un promoteur conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus, pour induire l'expression préférentielle dans le phloème d' une plante d' un gène d' intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, lors d'une attaque par un insecte ravageur, en particulier un insecte piqueur-suceur . Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit insecte ravageur est un insecte piqueur-suceur tel qu'un Hémiptéroïde, en particulier un Homoptère, avantageusement un Aphidien. L'une des caractéristiques particulièrement avantageuses d'un promoteur conforme à l'invention est sa capacité à induire l'expression systémique, dans l'ensemble du phloème, du gène d'intérêt placé en aval. Ainsi, même si l'attaque du ravageur est limitée à une partie de la plante, le gène d'intérêt ne s'exprimera pas uniquement dans les vaisseaux du phloème au niveau du point d'attaque, mais dans ceux de l'ensemble des organes de la plante. Ledit gène d' intérêt peut être notamment une séquence d'ADN permettant de lutter directement contre 1' infestation par les ravageurs, notamment les pucerons, ou contre la transmission virale ou l'infection par des virus. En effet, les pucerons et autres insectes piqueurs suceurs sont vecteurs de virus qu' ils transmettent de plantes à plantes. La séquence d'ADN d'intérêt peut notamment correspondre à une séquence codant pour une protéine aphicide ou virucide. A titre d'exemples non-limitatifs de gènes codant pour des protéines aphicides, on peut citer : le gène Mi de résistance aux nématodes et/ou aphides décrit dans la Demande WO 98/06750, ou bien des gènes codant pour des protéines telles que des lectines (HILDE et al., Transgenic Res . 4 : 18-25, 1995 ; ZHOU et al., Chin. J. Biotechnol. 14 : 9-16, 1998 ; YAO et al., Transgenic Res. 12 : 715-722, 2003), des inhibiteurs de trypsine de type Bowman-Birk (RAHBE et al., Insect Biochem. Mol. Biol . 33(3) : 299-306, 2003), ou des inhibiteurs de protéase à cystéine, telle que l' oryzacystatine (RAHBE et al., Plant Sci. 164 : 441-450, 2003). Parmi les gènes provoquant une résistance à la transmission virale, on peut citer les gènes décrits par MILLER et al. (Plant Dis. 81 : 700-710, 1997), WILSON et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 : 3134-3141, 1993), DESMYTER et al. (Plant Mol. Biol. 51 : 567-576, 2004) . Ledit gène d' intérêt peut également être un gène codant pour une protéine impliquée dans les voies de réponse aux stress et permettant d'améliorer la résistance des plantes aux infections par déclenchement de réponse hypersensible . Il peut s'agir également de tout gène codant pour une protéine d'intérêt que l'on souhaite voir exprimer spécifiquement dans le phloème et dont il serait intéressant de déclencher l'expression. En effet, le phloème est l'un des tissus végétaux privilégiés pour réaliser le transport des photoassimilats des organes sources aux organes puits ; le phloème permet également la signalisation longue distance et l' homéostasie (VILAINE et al., Plant J. 36 : 67-81, 2003 ; HAYASHI et al., Australian J. Plant Physiol. 27 : 489-496, 2000 ; RUIZ- MEDRANO et al, Curr. Opin. Plant Biol. 4 : 202-209, 2001 ; SJÔLUND, Plant Cell 9 : 1137-1146, 1997 ; OPARKA and CRUZ, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51 : 323-347, 2000 ; OPARKA and TURGEON, Plant Cell 11 : 739-750, 1999) . Ainsi, l'expression du gène d'intérêt dans le phloème permet de diffuser dans tous les organes de la plante (feuilles, racines, fleurs, tiges, etc..) la protéine codée par le gène d'intérêt. Le gène d' intérêt peut également être une séquence transcrite en ARN antisens ou en ARN interfèrent, utilisables notamment pour lutter contre l'infection par les virus. La présente invention a également pour objet tout polynucléotide recombinant contenant un promoteur conforme à l'invention. Il s'agit notamment : des cassettes d'expression recombinantes, comprenant, outre un promoteur conforme à l'invention, un gène hétérologue d' intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site permettant l'insertion dudit gène d'intérêt ; des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conformes à l'invention dans un vecteur hôte. Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants conformes à l'invention peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc. On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription, les séquences de tête (leader séquences - séquences enhancer/favorables à l'initiation de la traduction) et les sites de polyadénylation . Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène d' intérêt, ou bien peuvent être des séquences hétérologues . Ces séquences n' interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. A titre d'exemples de séquences de ce type fréquemment utilisées chez les plantes, on citera parmi les plus répandues, le terminateur de l'ARN 35S du CaMV, le terminateur du gène de la nopaline synthase, etc. Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant à ces cellules ou organismes un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seuls les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives). Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la bêta-glucuronidase (GUS) , celui de la luciférase, ou celui de la "green fluorescent protein" (GFP) . Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés. La présente invention englobe également des cellules-hôtes transformées par un polynucléotide, notamment une cassette d' expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention. On entend par cellule ou organisme transformé par un polynucléotide, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique. Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes, ou eucaryotes. Dans le cas de cellules procaryotes, il peut notamment s'agir d' Agrobactéries telles qu' Agroba c ter i um tumefaciens ou Agroba cteri um rhizobium . Dans le cas de cellules eucaryotes, il peut s'agir notamment de cellules végétales, issues de plantes dicotylédones ou monocotylédones . La présente invention a également pour objet des plantes transformées par au moins une cassette d' expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention, et notamment des plantes transgéniques comprenant dans leur génome au moins une copie d' un transgène contenant un promoteur conforme à l'invention. On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu'ils contiennent dans leur génome une copie du transgène. Les plantes transgéniques conformes à l'invention ont la propriété, suite à une infestation par un insecte ravageur, et notamment un insecte piqueur- suceur, d'exprimer préférentiellement dans leur phloème, le gène d' intérêt inséré dans ladite cassette d' expression . Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc..) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques conformes à l'invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes conformes à l'invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits. La présente invention s'applique à toutes les plantes, et notamment aux plantes sensibles aux attaques des insectes piqueurs-suceurs. En particulier, de manière non limitative, elle peut être utilisée chez des plantes potagères, des plantes ornementales, les arbres fruitiers, les plantes de grandes cultures telles que le blé, le maïs ou le riz, ou les cultures industrielles comme le cotonnier, le colza ou le tournesol. Les plantes concernées peuvent être des dicotylédones, telles que par exemple notamment les cucurbitacées, les solanacées, les crucifères, les composées, les ombellifères, les violacées, les malvacées, les rosacées, etc., ou des monocotylédones, telles que les céréales ou les liliacées. Différentes méthodes d'obtention de plantes transgéniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Généralement, ces méthodes impliquent la transformation de cellules végétales, la régénération de plantes à partir des cellules transformées, et la sélection des plantes ayant intégré le transgène. Des techniques très nombreuses de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques, (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont disponibles. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante concernée . A titre d'exemples non limitatifs de méthodes utilisables dans le cas des plantes mentionnées ci-dessus, il est possible de citer les protocoles décrits par GUIS et al . (Scientia Horticulturae 84 : 91-99, 2000) pour le melon, par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot. 44 : 1837-1845, 1993) pour la tomate, par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Rep. 3 : 178-181, 1986), ou TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Rep. 6 : 231-234, 1987) pour le cotonnier, par VAN DER MARK et al. (J. Genêt Breeding 44 : 263-268, 1990) ou par MARCHANT et al. (Ann. Bot. 81 : 109-114, 1998) pour les rosiers. Dans le cas des plantes monocotylédones, on peut citer par exemple les protocoles décrits par HIEI et al. (Plant J. 6 : 271-282, 1994) ou ISHIDA et al. (Nature biotechnol. 14 : 745-750, 1996) pour le mais, ou par RASCO-GAUNT et al. (J. Exp. Bot. 52 : 865-874, 2001) pour le blé. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en évidence de l' inductibilité et de la spécificité tissulaire des promoteurs des gènes AgXTHl et AtXTH33 et l'isolement du promoteur du gène AtXTH33.
EXEMPLE 1 : CARACTERISATION FONCTIONNELLE DU PROMOTEUR DU GENE AgXTHl . Les résultats présentés ci-après illustrent
1' inductibilité et la spécificité tissulaire de la transcription du gène AgXTHl sous contrôle de son promoteur endogène. La transcription de AgXTHl dans des plants de céleri non-infestes, et dans des plants de céleri infestés par Myzus persiceae est illustrée par des résultats de transfert de Northern. A titre de comparaison, la transcription d'un autre gène (gène AgMT5 codant pour une métallothionéine) qui est également fortement induit dans le phloème du céleri après infestation par Myzus persi ceae est aussi illustrée. L'ARN total a été extrait à partir du xylème, du phloème, ou du parenchyme de réserve de pétioles de feuilles de céleri. 10 μg d'ARN total sont soumis à électrophorèse sur gel d'agarose 1% contenant 15% de formaldéhyde . L'ARN est ensuite transféré sur membrane de nylon (Genescreen, Perkin Elmer Life Science) , par incubation pendant une nuit en tampon 10X SSC (1,5M NaCl, 0,15M Citrate de Na) . Après lavage de la membrane en tampon 2X SSC, l'ARN est fixé par exposition aux UV (UV Stratalinker 2400 apparatus Stratagene) . La détection est effectuée en utilisant les sondes suivantes, marquées à l'a 32P dCTP (Prime-a-gene Labelling kit Promega) : - l'EST BIP0760 de séquence SEQ ID NO : 1, pour AgXTHl - l'EST BIP1217 de séquence SEQ ID NO : 8, pour AgMT5 La préhybridation a été effectuée pendant 4 heures à 50°C, et suivie d'une hybridation pendant une nuit à 65 °C, dans le tampon décrit par CHURCH et GILBERT (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1991-1995, 1984) sans formamide. Les membranes ont été ensuite soumises à deux lavages successifs en conditions de stringence modérée (2X SSC, 0,1% SDS à 37°C pendant 30 min et 0,2X SSC, 0,1% SDS à 55°C pendant 30 min), puis déposées sur des plaques d' autoradiographie . Induction de la transcription d' AgXTHl dans le phloème en réponse à l' infestation par les pucerons : La Figure 2 illustre la transcription d ' AgXTHl et d' AgMT5 dans le phloème 3 jours ou 7 jours après 1' infestation (d.p.i) chez les plantes infestées par les pucerons ( + ) , et chez les plantes témoin non-infestées (- ). Dans le cas d ' AgXTHl , la transcription apparaît très faible, à la limite de la détection, chez les plantes non- infestées ; en revanche, 3 jours et 7 jours après infestation, on observe une forte induction de la transcription. Dans le cas d' AgMT5, la transcription est clairement détectable chez les plantes non-infestées, et est augmentée chez les plantes infestées, 3 jours et 7 jours après infestation. En outre, les pétioles, à partir desquels ont été effectués les prélèvements de phloème ne comptant pas parmi les parties de la plantes qui sont directement attaquées par les pucerons, ces observations indiquent que la réponse d' AgXTHl à la piqûre des pucerons se produit à distance des sites de piqûre, et donc qu'elle est systémique . Spécificité d'expression tissulaire d'Ag-XTHl La Figure 3 illustre la transcription d ' AgXTHl et AgMT5 dans le phloème (Ph) des plantes non infestées (- ) et dans le xylème (Xyl) et le parenchyme de réserve (Par) 3 jours ou 7 jours après l' infestation (d.p.i) chez les plantes infestées par les pucerons ( + ), et chez les plantes témoin non-infestées (-) . Dans le cas d' AgMT5 on n'observe aucune transcription dans le xylème ni dans le parenchyme, que les plantes soient infestées ou non. Dans le cas d ' AgXTHl , on n'observe aucune transcription dans le xylème, que les plantes soient infestées ou non. La faible bande observée dans l'extrait de parenchyme des plantes, 7 jours après 1' infestation, reflète probablement une contamination lors de l'extraction des ARN ou de l'isolement du parenchyme de réserve de ces plantes. Dans une autre série d'expérimentations, la spécificité d'expression tissulaire d' AgXTHl a été étudiée par hybridation in si tu sur des pétioles de feuilles de céleri infestées ou non. Des coupes de 9 μm d'épaisseur ont été obtenues à partir des pétioles préalablement fixés au formaldéhyde et inclus dans la paraffine. Une sonde oligonucléotidique marquée à la digoxigénine et répondant à la séquence suivante : 5'-GCACTGAAAAATCCGTAATAGTA-3' (SEQ ID NO: 9) est synthétisée à partir de la séquence codant pour AgXTHl, en utilisant le kit « DIG oligonucléotide Tailing Kit », selon les instructions du fabricant (Roche Diagnostics, Indianapolis) . L'hybridation in si tu avec cette sonde est effectuée conformément aux instructions du fabricant, et à une température de 60°C. L' immunodetection de la sonde est effectuée à l'aide de fragments Fab anti-DIG conjugués à la phosphatase alcaline et la visualisation est effectuée en utilisant comme substrats le nitrobleu de tetrazolium (NBT) et le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) . Les transcrits AgXTHl ont été détectés uniquement dans les pétioles des plantes infestées par M. persicae . Le marquage reflétant l'hybridation avec la sonde AgXTHl est observé uniquement dans la zone du phloème conducteur. L'accumulation de transcrits AgXTHl n'est pas discernable dans les pétioles des plantes non infestées, ni dans le xylème ou le parenchyme des pétioles des plantes infestées. Spécificité de l'induction d' AgXTHl par les pucerons La Figure 4 illustre la transcription d ' AgXTHl et d' AgMT5 dans le phloème, 3 jours après l' infestation (d.p.i) chez les plantes infestées par les pucerons (+) et chez les plantes témoin non-infestées (-), ainsi que 3 jours ou 7 jours après un traitement par blessure (par application de forceps de laboratoire sur les feuilles matures) (+ ) , et chez les plantes témoin non-traitées (-) Dans le cas d' AgMT5 on observe une augmentation équivalente de la transcription après induction par blessure ou par infestation par les pucerons. Dans le cas d' AgXTHl , en revanche, alors que la transcription est fortement induite par les pucerons, elle demeure au niveau basai après le traitement par blessure.
EXEMPLE 2 : ISOLEMENT DU PROMOTEUR pAtXTH33 Le clonage du promoteur pAtXTH33 est réalisé par la technologie GATEWAY™ (Invitrogen) , basée sur le système de recombinaison site-spécifique du bactériophage λ, et qui est décrite notamment dans les Brevets US 5,888,732, 6,143,557, 6,171,861, 6,270,969, et 6,277,608. Le vecteur donneur utilisé, pDONR™207 (Invitrogen), contient le gène de sélection négative ccdB (léthal pour E . coli ) , et un gène de résistance au chloramphénicol (CmR) , flanqués d'une part par un site attPl et d'autre part par un site attP2. Ce vecteur est multiplié dans des bactéries E . coli DB3.1™ (Invitrogen) qui sont résistantes à ccdB . Le promoteur d' AtXTH33 est amplifié par PCR à partir d'ADN génomique d' Arabidopsi s thaliana , en utilisant l'amorce promXET33+ (SEQ ID NO : 10) contenant le site de recombinaison ^ attBl (5'- AAAAAAGCAGGCTTAAAATCAAGAATAAAACAG-3' ) et l'amorce promXET33" (SEQ ID NO 11) contenant le site de recombinaison attB2 (5'- AAGAAAGCTGGGTCGTTGTGTTTTATACTTCT-3' ) . Les séquences qui correspondent aux sites de recombinaison apportés par les amorces sont soulignées, le reste de la séquence est spécifique du promoteur d' AtXTH33. L'amplifiât attB-promXET33 (1251 pb) obtenu est inséré dans le vecteur donneur pDONR™207 par recombinaison attB x attP (BP) . Le produit de recombinaison est utilisé pour transformer des cellules compétentes E . coli DH10B (sensibles à ccdB) ; seules les cellules comprenant le plasmide recombiné dans lequel le fragment cc B+CmR est remplacé par le fragment amplifié, produisent des colonies. Le vecteur d'entrée obtenu contient le promoteur d' AtXTH33, flanqué de sites de recombinaison attLl et attL2. EXEMPLE 3 : OBTENTION DES CONSTRUCTIONS pAtXTH33+GUS ET pAtXTff33+GFP Le clonage du promoteur pAtXHT33 devant le gène GUS codant pour la β-glucuronidase ou le gène erGFP5 codant pour une protéine fluorescente verte est réalisé également grâce au système de recombinaison GATEWAY™ ( Invitrogen) . Des vecteurs de destination sont construits à partir des vecteurs binaires pBHOl-GUS (JEFFERSON et al., EMBO J. 6 : 3901-3907, 1987) et pBHOl-GFP (HASELOFF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 2122-2127, 1997). Une cassette de recombinaison R1-R2 (Invitrogen) contenant le gène de sélection négative ccdB, et un gène de résistance au chloramphénicol, flanqués d'une part par un site attRl et d'autre part par un site attR2 est insérée dans l'un et l'autre de ces vecteurs aux sites Hindi I I-Xba I , en phase avec la séquence codante de GUS, ou celle de erGFPS . Les vecteurs de destination obtenus, respectivement dénommés PBI101-R1R2-GUS et pBI101-RlR2-GFP, qui contiennent le gène ccdB sont multipliés chez E. coli DB3.1™. Le promoteur pAtXHT33 contenu dans le vecteur d'entrée décrit à l'exemple 2 ci-dessus est introduit par recombinaison LR (attLxattR) dans ces vecteurs de destination. Les recombinants obtenus sont sélectionnés sur E. coli DH10B, comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les vecteurs d'expression obtenus sont respectivement dénommés pBI101-RlR2-GUS et pBI101-RlR2- GFP. Les cartes de ces vecteurs sont représentées sur la Figure 5. Chacun de ces vecteurs est introduit dans Agrobacteri um tumefaciens C58 par électroporation . Les souches d' Agrobacterium transformées sont utilisées pour transformer les plantes.
EXEMPLE 3 : TRANSFORMATION D' ARAB IDOPSIS THALIANA AVEC LES CONSTRUCTIONS pAtXTH33 + GUS OU pAtXTH33 + GFP Les souches C58 d' agrobactéries transformées comprenant soit le vecteur pBI101-RlR2-GUS soit le vecteur pBI101-RlR2-GFP sont utilisées pour transformer Arabidopsis thaliana . La transformation des plants d ' Arabidopsis thaliana est effectuée par trempage des bourgeons floraux dans la solution d ' Agrobacteri um tumefa ciens , comme décrit par BECHTOLD et al. (C. R. Acad. Sci. Paris. Sciences de la Vie 316 : 1194-1199, 1993). Les transformants primaires sont sélectionnés sur milieu « Arabidopsis » (ESTELLE et SOMMERVILLE, Mol.
Gen. Genêt. 206 : 200-206, 1987) contenant 50 mg/L de kanamycine, et auto-pollinisés afin d'obtenir des individus homozygotes pour l'insertion. Les graines issues des autopollinisations sont récoltées après complet séchage des tiges. Seules les lignées ségréguant 3:1 pour la résistance à la kanamycine et possédant une seule insertion homozygote sont conservées pour l'analyse de l'expression du gène hétérologue par détection de son activité .
EXEMPLE 4 : EXPRESSION DE GUS OU DE LA GFP APRES INDUCTION PAR LA PIQURE DE PUCERONS ET LOCALISATION HISTOCHIMIQUE DE L'EXPRESSION L'expression de GUS ou de la GFP dans les plantes transformées est analysée d'une part chez des plantes non-infestées, et d'autre part chez des plantes infestées par M. persicae, 48h, 72h et 7 jours après 1' infestation . Les analyses histochimiques de l'expression de la β-glucuronidase sont réalisées en suivant le protocole décrit par JEFFERSON et al. (1987, précité). Les échantillons tissulaires sont fixés dans de l'acétone 80% glacé pendant 20 minutes, puis lavés trois fois à l'eau et infiltrés sous vide pour faciliter la pénétration du réactif dans les tissus. Les échantillons sont ensuite incubés à 37 °C pendant une nuit dans le tampon de réaction (1 mg/ml 5-bromo 4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc) , 100 mM de phosphate de potassium pH 7, 0.1% (vol/vol) Triton X 100) en présence de 1 mM de ferrocyanure de potassium) . Les échantillons sont observés après décoloration à l'éthanol 70%. Dans le cas des plantes non-infestées, on observe une expression très faible au niveau des tissus vasculaires des feuilles de la rosette. Chez les plantes matures on observe également un très faible signal au niveau des étamines des fleurs ; aucun marquage n'est observé au niveau du pistil, des sacs polliniques, et des jeunes siliques. Aucun marquage n'est observé au niveau des racines, des tiges, et des feuilles de la tige. Dans le cas des plantes infestées on observe une nette augmentation de l'activité GUS au niveau des tissus vasculaires des feuilles de la rosette 72 h après l' infestation. Chez les plantes transformées par le vecteur pBI101-RlR2-GFP, les observations réalisées à la loupe binoculaire en présence d' UV et avec un filtre pour l'observation de la fluorescence de la GFP (GFP3 BP) montrent clairement une expression de la GFP au niveau des nervures des feuilles de rosette d' Arabidopsis thaliana et ce, 24h et 48h heures après infestation par Myzus persiceae .

Claims

REVENDICATIONS 1) Polynucléotide isolé ayant une activité de promoteur inductible, dans le phloème d'une plante, par une attaque par un puceron, caractérisé en ce que ledit polynucléotide est constitué par le promoteur isolé d'un gène codant pour une xyloglucane endo- transglycosylase/hydrolase (XTH) , ladite XTH contenant une séquence peptidique possédant au moins 50% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2. 2) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' il est constitué par le promoteur isolé d'un gène codant pour une XTH d' Arabidopsis thaliana dénommée AtXTH33, ladite XTH étant définie par la séquence SEQ ID NO: 4. 3) Polynucléotide selon la revendication 2, défini par la séquence SEQ ID NO: 5. 4) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par le promoteur isolé d' un gène codant pour une XTH de céleri dénommée AgXTHl, ladite XTH comprenant la séquence SEQ ID NO: 2. 5) Utilisation d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 4, pour induire l'expression d'un gène d'intérêt dans le phloème d'une plante, lors d'une attaque par un insecte ravageur. 6) Cassette d'expression recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 4, et un gène d' intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. 7) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 6. 8) Cellule hôte transformée par une cassette d'expression selon la revendication 6. 9) Cellule-hôte selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale. 10) Plante transgénique, comprenant au moins un transgène contenant une cassette d' expression selon la revendication 6. 11) Plante transgénique selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cucurbitacée, d'une solanacee, d'une crucifère ou d'une composée.
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