FR2995613A1 - Promoteurs de genes de cafeier et leurs applications - Google Patents

Abstract

L'invention vise une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2, respectivement dénommées pW1a et pW1b, et dérivés de celle-ci tels que pW1a (-1026).

Description

PROMOTEURS DE GÈNES DE CAFÉIER ET LEURS APPLICATIONS La présente invention se rapporte à des promoteurs de gènes de caféier (Coffea arabica) pour induire la transcription de gènes d'intérêt dans des plantes dicotylédones, en particulier en réponse à des agents pathogènes, des traitements hormonaux et des agressions. Les réponses de défense des végétaux aux stress biotiques et abiotiques impliquent de nombreuses modifications cellulaires et moléculaires. En particulier, une importante reprogrammation du transcriptome se produit pour déclencher un ensemble de réponses définies. Les facteurs de transcription WRKY constituent l'une des plus grandes familles de régulateurs transcriptionnels chez les végétaux. Ils peuvent jouer le rôle d'activateurs transcriptionnels ainsi que de répresseurs dans un certain nombre de processus physiologiques et développementaux chez les végétaux. En particulier, ils jouent un rôle prépondérant dans la régulation des réponses des végétaux aux agents pathogènes et sont des régulateurs clés de l'immunité des végétaux, soit pour l'immunité déclenchée par les mécanismes moléculaires associés aux agents pathogènes (PathogenAssociated Molecular Pattern-Triggered Immunity, PTI), soit pour l'immunité déclenchée par les effecteurs (Effector- Triggered Immunity, ETI). Les séquences des protéines WRKY contiennent un ou deux domaines de liaison à l'ADN, appelés domaines WRKY, ce domaine étant constitué de 60 acides aminés et comprenant la séquence WRKYGQK conservée ainsi qu'un motif en doigt à zinc.

La quasi-totalité des facteurs de transcription WRKY se lie à la même séquence nucléique coeur, TTGACC/T, appelée boîte W (Eulgem et al., 2000 ; Ciolkowski et al., 2008). Bien que la boîte W soit toujours nécessaire, les séquences adjacentes déterminent également, en partie, les sites de liaison préférentiels de certains facteurs de transcription WRKY spécifiques. Des études bio-informatiques des séquences promotrices d'Arabidopsis thaliana ont mis en évidence une surreprésentation des boîtes W dans les promoteurs inductibles par le stress ainsi que dans les promoteurs des gènes WRKY. Les gènes WRKY sont statistiquement enrichis en boîtes W dans leurs promoteurs, ce qui indique que l'autorégulation et l'interrégulation sont des caractéristiques courantes de l'action WRKY. Par exemple, AtWRKY6 inhibe son propre promoteur ainsi que le promoteur de son homologue le plus proche, AtWRKY42. À l'inverse, AtWRKY53 inhibe son propre promoteur tout en jouant un rôle d'activateur sur d'autres promoteurs tels que celui du gène AtWRKY62. Les maladies fongiques font partie des principaux facteurs limitants pour la production de café, y compris la rouille du café (ou rouille brune) provoquée par H. vastatrix. Ce champignon biotrophe strict se développe dans le monde entier, dans les régions caféicoles, et peut être responsable d'importantes pertes de production en l'absence de lutte chimique. La résistance à la rouille des variétés de C. arabica est conditionnée par des interactions gène pour gène et se traduit par une réaction hypersensible, c'est-à-dire par la mort rapide des cellules végétales au niveau des foyers d'infection.

La construction de banques d'ADNc par hybridation soustractive suppressive a permis d'isoler des gènes spécifiquement induits dans les feuilles de caféier après l'inoculation d'H. vastatrix (Fernandez et al., 2004 ; Ganesh et al., 2006).

Parmi ceux-ci, le gène du caféier CaWRKY1 a été identifié et présente la plus grande homologie avec le gène AtWRKY6 d'A. thaliana. C. arabica est une variété allotétraploïde et deux copies homologues du gène CaWRKY1, dénommées CaWRKY1a et CaWRKY1b, ont été caractérisées (Petitot et al., 2008).

Une analyse de l'expression génique, dosée au moyen d'expériences de PCR quantitative en temps réel, a démontré que ces deux gènes étaient exprimés de façon concomitante et présentaient le même profil d'expression altéré dans les feuilles et dans les racines lors de traitements biotiques et abiotiques. En particulier, les gènes CaWRKY1 ont été activés par des traitements exogènes à l'acide salicylique (SA) et au méthyljasmonate (MeJA) et par des blessures. Les séquences promotrices de ces deux gènes ont été 10 isolées par les inventeurs et caractérisées. La présence d'éléments de régulation agissant en cis liés aux réponses de défense a été recherchée et comparée dans les deux séquences promotrices. L'activité des promoteurs a été comparée par dosage lors 15 de transformations transitoires menées par agroinfiltration dans des feuilles de tabac (Nicotiana benthamiana). Ce système d'expression transitoire a tout d'abord été choisi pour éviter les longs protocoles de régénération inhérents à la transformation stable des plants de caféier. 20 La transformation génétique via Agrobacterium de C. arabica a été réussie il y a environ 10 ans (Leroy et al., 2000) et son efficacité a récemment été largement améliorée grâce à l'utilisation de cultures continues de cal embryogéniques (Ribas et al., 2011). 25 Ce dernier protocole a été utilisé pour obtenir des plants de caféier transformés avec le promoteur du gène CaWRKY1a, fusionné avec le gène rapporteur GUS. Comme l'ont démontré les inventeurs, ces plants ont présenté une forte activité GUS dans leurs feuilles et en réponse à des « blessures » 30 mécaniques. Les promoteurs du gène CaWRKY1 semblent ainsi être de nouveaux outils particulièrement utiles pour les techniques de biotechnologie sur les plants de caféier.

Une analyse in silico a révélé qu'ils contenaient d'importants éléments de régulation liés à la défense, dont des boîtes W et des éléments as-1. Fusionnés avec le gène rapporteur de la P-glucuronidase 5 (GUS), ces deux promoteurs ont conféré l'expression d'une activité GUS dans des feuilles de tabac, lors de dosages transitoires menés par agroinfiltration. Des traitements exogènes à l'acide salicylique (SA) ont renforcé l'activité des promoteurs, ce qui peut être associé à 10 la présence des éléments de régulation as-1. Des dosages de transactivation ont démontré que l'expression de CaWRKY1 réduisait l'activité des promoteurs pWla et pW1b, ce qui indique que le facteur de transcription CaWRKY1 régule négativement ses propres promoteurs. Ce 15 résultat peut expliquer le rapide retour au niveau d'expression de base du gène CaWRKY1 après le pic d'induction observé dans les feuilles de caféier inoculées avec H. vastatrix. Des lignées transgéniques stables de C. arabica exprimant 20 une construction pWla::GUS ont été obtenues par transformation via Agrobacterium. Les plantules de caféier transgéniques ont présenté une activité GUS dans leurs feuilles. Une forte activité GUS a par ailleurs été détectée autour des tissus foliaires endommagés, après blessure mécanique. 25 La capacité de pWla à commander l'expression stable de transgènes chez le caféier et son expression accrue en réponse à des stress permettent d'utiliser ce promoteur en tant que nouvel outil pour les techniques de biotechnologie sur les plants de caféier. 30 La présente invention se rapporte à une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2, respectivement dénommées pWla et pW1b, et à des dérivés de celle-ci tels que pW/a(-1026).

Elle se rapporte tout particulièrement à un promoteur des copies homologues du gène CaWRKY1, à savoir CaWRKYla et CaWRKY1b, ayant les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2, respectivement dénommées pWla et pW1b, et à des dérivés de celui-ci tels que pW/a(-1026). L'utilisation d'un promoteur tel que défini ci-dessus pour commander l'expression de gènes rapporteurs dans des plants de caféier ou de tabac et en réponse à des stress biotiques ou abiotiques fait également partie de l'invention, en particulier l'utilisation du promoteur pWla pour piloter l'expression de transgènes en réponse à des stress dans des plants de caféier. La présente invention se rapporte à un système d'expression d'un gène d'intérêt dans des végétaux, comprenant 15 au moins la séquence dudit gène commandée par une séquence d'acide nucléique ou un promoteur tel que défini ci-dessus. Elle se rapporte également à un vecteur d'expression d'un gène, comprenant au moins la séquence dudit gène commandée par une séquence d'acide nucléique ou un promoteur tel que défini 20 ci-dessus. Une cellule de végétal transfectée par un système ou un vecteur tel que défini ci-dessus est également couverte par la présente invention. Ce végétal est, en particulier, une dicotylédone. 25 De manière avantageuse, ce végétal est un plant de caféier ou de tabac. Une plante transgénique transfectée par un système ou un vecteur tel que défini ci-dessus fait également partie de l'invention. Cette plante transgénique est, en particulier, 30 une dicotylédone telle qu'un plant de caféier ou de tabac. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention sont décrits dans les exemples suivants, en référence aux figures 1 à 8 qui représentent respectivement : Figure 1 Comparaison des séquences des promoteurs pWla et pW1b. A) Alignement des séquences des promoteurs pWla et pW1b. Les mutations ponctuelles sont représentées par des rectangles gris. Les éléments de régulation putatifs sont représentés par des rectangles noirs. Les boîtes CAAT, les boîtes TATA et les sites d'initiation de la transcription (TSS) potentiels sont soulignés. Les distances indiquées dans les paires de bases sont exprimées par rapport au site d'initiation de la traduction. B) Représentation schématique des promoteurs pWla et pW1b. Une sélection d'éléments potentiels agissant en cis, identifiés dans la base de données PLACE, est indiquée (triangle blanc : boîte W, triangle noir : élément as-1, ovale blanc : boîte PAL A, ovale noir : boîte PAL L, carré noir : boîte TATA). Les flèches indiquent la position des amorces utilisées pour les constructions promoteur::GUS. Les distances sont exprimées en paires de bases par rapport au site d'initiation de la traduction (+1). - Figure 2 Expression transitoire des promoteurs pWla et pWlb dans des feuilles de tabac soumises à une agroinfiltration. L'activité GUS est déterminée 48 h après l'infiltration, dans des feuilles de N. benthamiana, d'agrobactéries contenant des constructions promoteur::GUS, vecteur pC1305.1 (35S::GUS) ou vecteur PCN3 (vecteur négatif). Les données illustrent la moyenne et l'écart-type de quatre expériences indépendantes. - Figure 3 Analyse de l'insertion d'un transgène dans l'ADN génomique d'un plant de caféier. A) L'ADN génomique de six lignées transgéniques (A à F) est amplifié par PCR avec des amorces spécifiques d'une construction pWla::GUS. Le produit amplifié a une taille théorique de 500 pb. L : échelle d'ADN (SmartLadder SF, Eurogentec) ; + : amplification du plasmide utilisé pour la transformation du plant de caféier (témoin positif) ; - : ADN génomique d'un plant de caféier non transformé (témoin négatif). B) Nombre relatif de copies du transgène pWla::GUS dans les plantules A, B et C, mesuré par PCR quantitative. Le gène CaUbiquitin a été choisi en tant que normalisateur. La quantification relative concerne le signal de PCR du transgène dans la plantule B ou C, par rapport à la plantule A. Figure 4 Expression du promoteur pWla dans des feuilles de caféier transformées de manière stable. A) L'activité GUS est mesurée dans des feuilles jeunes et adultes de plantules de C. arabica transformées avec une construction pWla::GUS. B) Localisation histochimique de l'activité GUS dans des feuilles de caféier transformées, soumises à une agression mécanique (pince à gauche et ciseaux à droite). Figure 5 Niveau d'expression relatif des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b, mesuré par RT-PCR quantitative, dans des feuilles de C. arabica inoculées avec H. vastatrix race VI (réaction incompatible). Les feuilles sont prélevées 18, 21 et 24 heures après l'inoculation. Différentes quantités d'ADNc sont étalonnées en utilisant le gène CaUbiquitin en tant que référence. L'expression génique dans les plants traités est exprimée par rapport à celle des plants témoins. Figure 6 Effet de l'acide salicylique (SA) sur l'expression transitoire des promoteurs pWla et pWlb dans des feuilles de tabac soumises à une agroinfiltration. Deux jours après l'infiltration d'agrobactéries contenant des constructions promoteur::GUS, vecteur pC1305.1 (35S::GUS) ou vecteur PCN3 (vecteur négatif), les feuilles de tabac sont pulvérisées de SA (5 mM) ou d'eau. L'activité GUS est déterminée après 6 h de traitement au SA ou à l'eau. Les données illustrent la moyenne et l'écart-type de quatre expériences indépendantes. - Figure 7 Dosages de transactivation des promoteurs pWla et pWlb par le facteur de transcription CaWRKY1 dans des feuilles de tabac soumises à une agroinfiltration. L'activité GUS est déterminée dans des feuilles de N. benthamiana 48 h après la co-infiltration d'agrobactéries contenant une construction promoteur::gus (pWla ou pW1b) et d'agrobactéries contenant une construction (35S::CaWRKY1) ou un vecteur vide (PCN3). Deux rapports de co-inoculum effecteur/promoteur sont testés (rapport 1/1 = quantités égales d'agrobactéries ; rapport 5/1 = inoculum contenant 5 fois plus d'agrobactéries contenant une construction effecteur ou témoin que d'agrobactéries contenant une construction promoteur). Les données illustrent la moyenne et l'écart- type de quatre expériences indépendantes. - Figure 8 Effet de délétions sur l'expression transitoire du promoteur pWla. L'activité GUS est déterminée 48 h après l'infiltration, dans des feuilles de N. benthamiana, d'agrobactéries contenant des constructions promoteur::gus ou un vecteur PCN3 (vecteur témoin). Matériel et méthodes Plants de caféier et expérience d'inoculation de rouille On cultive des plants de caféier (C. arabica var. Caturra) 25 dans une serre de type S2 (24 °C le jour, 22 °C la nuit, 65 % d'HR). On réalise l'expérience d'inoculation de rouille sur des plants âgés de 4 mois, tel que décrit dans Ramiro et al. (2010). On inocule, sur les feuilles de caféier, des urédospores d'H. vastatrix (isolat 71, race VI), induisant une 30 interaction incompatible. On effectue trois dosages biologiques en utilisant 5 plants (2 feuilles par plant) à chaque instant. On utilise des plants simplement pulvérisés d'eau en tant que témoins. On congèle immédiatement les échantillons de feuille prélevés à chaque instant en les plongeant dans de l'azote liquide et on les conserve à -80 °C avant d'en extraire l'ARN. Analyse quantitative de l'expression génique On extrait l'ARN à l'aide de la minitrousse RNEasy Plant Mini Kit (Qiagen, France), avec traitement à la DNase I. On réalise des réactions de RT-PCR quantitative en temps réel tel que décrit dans Ganesh et al. (2006). Les amorces spécifiques utilisées pour différencier les transcrits CaWRKY1a et CaWRKY1b sont décrites dans Petitot et al. (2008). On choisit le gène CaUbiquitin en tant que témoin d'expression constitutive interne. La quantification relative concerne le signal de PCR du transcrit cible dans l'échantillon inoculé par rapport à celui de l'échantillon témoin, à chaque instant.

Isolement des promoteurs pWla et pWlb : arpentage génique par PCR On adapte le protocole de Siebert et al. (1995) et de Devic et al. (1997). On digère de l'ADN génomique (3 pg) pendant une nuit à 37 °C avec 80 U d'enzyme de restriction dans un volume de réaction final de 100 pL. On utilise séparément les enzymes DraI, EcoRV, PvuII et ScaI. On purifie les mélanges réactionnels avec du phénol/chloroforme, on les précipite avec de l'éthanol et du glycogène et on les remet en suspension dans 20 pL d'eau stérile.

Les séquences des amorces sont données dans le Tableau 1 ci-dessous. Numéro de Nom de l'amorce Séquences SEQ ID N°3 ADA1 SEQ ID N°4 ADA2 SEQ ID N°5 AP1 SEQ ID N°6 AP2 SEQ ID N°7 GSP1a SEQ ID N°8 GSP2a SEQ ID N°9 GSP lb SEQ ID N°10 GSP2b SEQ ID N°11 pW1BamHI SEQ ID N°12 pW2BamHI SEQ ID N°13 pW3NcoI SEQ ID N°14 pW4BamHI SEQ ID N°15 pW5BamHI SEQ ID N°16 pW6BamHI SEQ ID N°17 pW7BamHI SEQ ID N°18 pW 1XhoI SEQ ID N°19 pW2XhoI SEQ ID N°20 WRKY lbBg/II SEQ ID N°21 WRKY lbBstEII SEQ ID N°22 GUS-P3 SEQ ID N°23 pWla-GUS-F SEQ ID N°24 pWla-GUS-R Séquence de l'amorce (5'-3') CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCGGCCCGGGCAGGT PO4-ACCTGCCC-NH2 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCAGCAGCAGCGTGCGAGTCTTCCCGGCGG GGCCGGAAACATACTCAGACTACCCTTG ACCCTTGCTAGGATTCAACCTAGGACTC TATCTACGGTTACGCCCCATCCTTTGTC TCGGATCCTTAGGCTGTGTTTGGATTGC TCGGATCCGCAACCAGTTTACTAGTAGG TACCATGGTTACGCCCCATCCTTTGTCCAT TCGGATCCAACCCATTAAAATTGCACGC TCGGATCCGGTTGACTTTCTCCTCTTAC TCGGATCCCACAGACGAAACCTTCCCT TCGGATCCAACCTTGAAATCAAGACACC ATCTCGAGTTAGGCTGTGTTTGGATTGC ATCTCGAGGCAACCAGTTTACTAGTAGG TCAGATCTTATGGACAAAGGATGGGGC CTGGTCACCAATTCACACGTGATGGTGATGGTGATGATTCCCAGGAAAATTGGC GTCGAAGACGCCACGGGTCTCG AAAGGATGGGGCGTAACC GACACACGAAATAAAGTAATCAG Tableau 1 : liste des amorces (les sites de restriction sont soulignés) On mélange les adaptateurs ADA1 et ADA2 (tableau 1) à une concentration finale de 25 pM et on les hybride en les portant à ébullition pendant 1 min, puis en les refroidissant progressivement jusqu'à la température ambiante. On ligature les adaptateurs (concentration finale de 5 pM) dans 15 pL d'ADN digéré pendant une nuit à 16 °C, avec 10 U d'ADN-ligase de T4 (Promega, France). On dilue cet ADN mère à 1:10 dans de l'eau stérile. On utilise l'amorce AP1 (tableau 1) correspondant aux adaptateurs, avec les amorces spécifiques de gènes GSPla et GSPlb (tableau 1), pour des réactions de PCR primaires. On conduit ces réactions dans 25 pL, en utilisant 0,4 pL d'ADN mère dilué, 0,2 pM de chaque amorce et 0,5 pL de mélange Advantage® 2 Polymerase (Clontech, États-Unis), dans les conditions suivantes : 30 cycles - 94 °C pendant 30 s, 64 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 3 min. On dilue les produits des PCR primaires à 1:50 avant de réaliser la PCR interne avec 1 pL de la dilution, 0,2 pM d'amorce AP2 combinée à l'amorce GSP2a ou GSP2b, dans un volume final de 50 pL et dans les mêmes conditions de cyclage. Après séparation électrophorétique sur gel d'agarose à 1,2 %, on découpe les bandes d'intérêt dans le gel, on les clone dans le vecteur pGEM®-T Easy (Promega, France) et on les séquence (Genome Express, France). Les séquences renfermant les promoteurs pWla et pWlb portent respectivement les numéros d'enregistrement 10 DQ335613 et DQ335612 dans la base Genbank. Analyses bio-informatiques des séquences promotrices On recherche des homologies avec les séquences présentes dans des bases de données internationales (collection de 15 nucléotides Genbank nr et est), au moyen d'outils de recherche d'alignements locaux de base (BLASTN et BLASTX) (Altschul et al., 1990). On aligne les séquences à l'aide du programme ClustalW. On prédit l'emplacement des sites d'initiation de transcription (TSS), des boîtes TATA et des boîtes CAAT en 20 utilisant la matrice de fréquences de la base de données PlantProm (Shahmuradov et al., 2003). On recherche les éléments de régulation à action cis putatifs à l'aide de la base de données PLACE (Higo et al., 1999). 25 Plasmides artificiels On conçoit des amorces introduisant des sites de restriction BamHI et NcoI afin de cloner les promoteurs dans le vecteur binaire pC1305.1 (CAMBIA, Australie). On utilise la paire d'amorces pW1BamHI/pW3NcoI (-1353/+23) pour amplifier le 30 promoteur pWla et la paire d'amorces pW2BamHI/pW3NcoI (-1139/+23) pour amplifier le promoteur pWlb (tableau 1). On digère les produits de PCR avec les enzymes de restriction BamHI et NcoI et on les clone dans le vecteur pC1305.1 en remplaçant le promoteur CaMV35S (préalablement supprimé par digestion par les enzymes de restriction BamHI/NcoI) afin de créer des constructions promoteur::GUS. On crée un vecteur témoin négatif, dénommé PCN3, en supprimant le promoteur CaMV35S du vecteur pC1305.1 par digestion par les enzymes de restriction XhoI/NcoI. Pour le promoteur pWla, on obtient une série de séquences délétées (-1026, -593, -404 et -216 pb par rapport au site d'initiation de la traduction, voir figure 1B) en utilisant les amorces pW4-, pW5-, pW6- ou pW7-BamHI combinées à l'amorce pW3NcoI (tableau 1). On digère les produits de PCR amplifiés à partir de la séquence pWla avec les enzymes de restriction BamHI et NcoI et on les clone dans le vecteur binaire pC1305.1 en remplaçant le promoteur CaMV35S. Pour les dosages de transactivation et l'étude des réponses aux stress, on supprime du vecteur pC1305.1 un promoteur 35S proche qui commande la résistance à l'hygromycine, afin d'éliminer son influence sur les promoteurs analysés. On excise par digestion un fragment XhoI/NcoI du plasmide, puis on fusionne les promoteurs pWla et pWlb avec le gène GUS en utilisant respectivement les paires d'amorces pW1XhoI/pW3NcoI et pW2XhoI/pW3NcoI (tableau 1). Pour les expériences de transactivation, étant donné que les séquences des protéines CaWRKY-la et -lb présentent 98 % d'homologie, on choisit arbitrairement CaWRKYlb en tant qu'effecteur. On amplifie le gène CaWRKY1b (n° d'enregistrement DQ335598) avec les amorces WRKY1bBg1II et WRKY1bBstEII (tableau 1) en introduisant des sites BglII et BstEII et on le fusionne avec le promoteur CaMV35S afin de remplacer le gène GUS dans le vecteur pC1305.1. Pour des raisons pratiques, on dénomme cette construction « plasmide effecteur » et les constructions promoteur::GUS « plasmides rapporteurs ».

On transfère tous ces constructions dans la souche d'Agrobacterium tumefasciens GV3101 par électroporation (Main et al., 1995).

Dosages de l'expression transitoire via Agrobacterium On réalise des dosages d'agroinfiltration conformément au protocole décrit par Yang et al. (2000). On laisse la souche d'Agrobacterium tumefasciens GV3101, contenant les différentes constructions, se développer dans un milieu LB additionné de rifampicine (50 pg/mL) et de kanamycine (50 pg/mL) à 28 °C pendant une nuit. On recueille les cellules d'Agrobacterium par centrifugation pendant 15 min à 3 000 x g, on les remet en suspension dans un milieu d'infiltration (MgSO4 10 mM, acétosyringone 200 pM, MES 20 mM, pH 5,6), ajusté à une DO600 de 0,5 et laissé à température ambiante pendant 3 h avant infiltration dans des feuilles de tabac. On cultive des plants de tabac (N. benthamiana) dans une chambre de culture (22 °C, 16 h de lumière, 50 % d'HR) et on les utilise pour l'agroinfiltration à l'âge de 6 semaines. On infiltre les suspensions bactériennes dans le dos des feuilles complètement étalées, à l'aide d'une seringue de 1 mL sans aiguille. On prélève des disques de feuille 48 h après l'infiltration. Pour les expériences de transactivation, on réalise des dosages de co-infiltration en utilisant soit un mélange égal de plasmides effecteur et rapporteur, soit un rapport 5/1 de plasmides effecteur et rapporteur. En tant que témoin, on coinocule le vecteur PCN3 avec les plasmides rapporteurs. Pour les stress abiotiques, on pulvérise les feuilles de tabac, 48 h après l'agroinfiltration, avec de l'acide salicylique 5 mM ou avec de l'eau en tant que témoin, puis on prélève les échantillons au bout de 6 h. Pour les blessures mécaniques, on coupe les disques de feuille 2 fois avec des ciseaux, 48 h après l'infiltration, et on prélève les échantillons après 1 h ou 6 h.

Transformation stable de plants de caféier par A. tumefaciens On effectue une transformation génétique stable de C. arabica conformément au protocole de Ribas et al. (2011). 5 On utilise la construction pWla::GUS cloné dans le vecteur binaire pC1305.1 pour réaliser la transformation. Pour résumer, on utilise des cultures de cal embryogéniques de 7 mois. On co-cultive du cal de caféier et des agrobactéries à 20 °C pendant 5 jours, à l'abri de la lumière. On sélectionne 10 le cal transformé sur un milieu contenant 50 mg/L d'hygromycine en 3 subcultures de 1 mois. On régénère plusieurs plantules à partir de chaque cal résistant et on les cultive dans des pots de nourriture pour bébé en conditions stériles. On vérifie l'insertion du transgène en réalisant une 15 PCR sur l'ADN génomique extrait de feuilles des plantules de caféier transformées. On utilise l'amorce pW7BamHI spécifique de pWla, combinée à l'amorce spécifique du gène GUS, GUS-P3 (tableau 1), pour l'amplification d'un fragment de 500 pb. On évalue le nombre relatif de transgènes en réalisant une PCR 20 quantitative sur l'ADN génomique avec les amorces pWla-GUS-F et pWla-GUS-R (tableau 1). On choisit le gène CaUbiquitin en tant que normalisateur. La quantification relative concerne le signal de PCR du transgène dans le plant B ou C, par rapport au plant A. 25 On effectue des tests d'agression sur des feuilles de plantules de caféier contenant 6 à 8 paires de feuilles. On coupe les feuilles 3 ou 4 fois avec des ciseaux ou on les comprime avec une pince et on prélève les échantillons au bout de 6 h pour une coloration histochimique ou des dosages 30 fluorimétriques. Détection de l'activité GUS On évalue l'activité 13-glucuronidase par coloration histochimique, conformément au protocole de Jefferson et al. (1987). On infiltre sous vide, dans les tissus foliaires, une solution de coloration constituée de 1 mg/mL de X-Gluc, de NaH2PO4 20 mM, de Na2HPO4 30 mM, de K3FeCN6 0,25 mM, de K4FeCN6 0,25 mM, de 0,5 % de Triton X-100 et de 10 % de DMSO, pH 7, et on incube le tout pendant 16 heures à 37 °C. On fixe ensuite les tissus pendant 2 heures dans une solution contenant 10 % de formaldéhyde, 5 % d'acide acétique et 50 % d'éthanol, et on élimine la chlorophylle avec de l'éthanol à 95 % pendant 24 heures.

Quantification de l'activité GUS On quantifie l'activité 13-glucuronidase au moyen de dosages fluorimétriques de la protéine GUS. On homogénéise des disques de feuille dans 1 mL de tampon d'extraction (NaH2PO4 50 mM, pH 7, EDTA 10 mM, 0,1 % de Triton X-100, 0,1 % de laurylsarcosine sodique, 13-mercaptoéthanol 10 mM). On centrifuge l'homogénat pendant 15 min à 12 000 tr/min et à 4 °C et on recueille le surnageant. On détermine la teneur en protéines conformément au protocole de Bradford (1976), en utilisant de la sérumalbumine bovine (BSA) en tant que témoin. On mesure l'activité GUS tel que décrit par Jefferson et al. (1987) et on l'exprime en picomoles de 4-méthylumbelliférone (4-MU) produites par minute et par milligramme de protéines.

RÉSULTATS Clonage des promoteurs pWla et pWlb et analyse des séquences Pour cloner les régions de régulation des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b, on conçoit des paires d'amorces à partir des séquences d'ADNc correspondantes. Au moyen d'un arpentage 30 génique par PCR sur de l'ADN génomique de C. arabica, on obtient 2 séquences promotrices que l'on nomme pWla et pW1b. La séquence pWla contient 1380 pb en amont du site d'initiation de la traduction et présente une teneur en AT de 61 %. La séquence pWlb contient 1187 pb et présente une teneur en AT de 60 %. Les deux séquences présentent 76 % d'identité nucléotidique et diffèrent par de nombreuses insertions/délétions et mutations ponctuelles (figure LA). Des recherches d'homologie réalisées à l'aide de programmes Blast ne révèlent aucune similitude avec des gènes ou des promoteurs connus, présents dans la base de données Genbank nr. On localise la boîte TATA, la boîte CAAT et le site d'initiation de la transcription (TSS) dans les deux séquences. Les distances qui séparent le TSS de la boîte TATA (-47 pb) et de la boîte CAAT (-105 pb) concordent avec celles généralement décrites pour d'autres promoteurs de végétaux. Le TSS prédit, déterminé à partir de la séquence consensus de plantes dicotylédones (wHTCAwHw, où w = A ou T, H = A ou C ou T) correspond à l'extrémité 5' des deux séquences d'ADNc 15 correspondantes obtenues par 5YRACE (Petitot et al., 2008). On recherche les éléments de régulation à action cis putatifs dans les séquences pWla et pW1b. Les inventeurs se sont concentrés sur les éléments à action cis habituellement associés aux réactions de défense et ont découvert plusieurs 20 boîtes W (TTGACC/T) caractéristiques des facteurs de transcription WRKY ainsi que des éléments as-1 (TGACG) caractéristiques des facteurs de transcription TGA (figure 1). Quatre boîtes W et trois éléments as-1 sont organisés de manière similaire dans les séquences pWla et pW1b. Une seule 25 boîte W supplémentaire est présente dans la séquence pWlb (position -73). Cette boîte W (TTGACC) a également été décrite en tant qu'élément de réponse à des éliciteurs (Elicitor Responsive Element, E1RE), identifié dans le promoteur du gène PR1 du persil. À l'inverse, deux boîtes PAL A (CCGTCC) ne se 30 retrouvent que dans la séquence du promoteur pWla. La boîte PAL a tout d'abord été identifiée dans le promoteur du gène de la phénylalanine-ammoniac-lyase (PAL) du persil et est impliquée dans la sensibilité à la lumière UV ou la réactivité aux éliciteurs (Logemann et al., 1995). Nous avons également découvert, dans les deux promoteurs du caféier, deux boîtes PAL L (ACCWWCC, où W = A ou T) qui sont des éléments à action cis importants des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes (Logemann et al., 1995 ; Maeda et al., 2005). Détermination de l'activité des promoteurs pWla et pWlb Expression transitoire dans les feuilles de tabac Pour déterminer si les régions isolées en 5' des gènes CaWRKY1 présentent une activité promotrice, on introduit des constructions pWla::GUS et pW1b::GUS dans des feuilles de tabac par infiltration via Agrobacterium. Les séquences pWla et pWlb induisent de hauts niveaux d'expression de GUS, s'élevant respectivement à 74 % et 56 % de l'expression du gène GUS commandé par le promoteur CaMV35S présent dans le vecteur pC1305.1 (figure 2). L'infection agrobactérienne en elle-même ainsi que l'agression provoquée par le protocole d'infiltration contribuent probablement à l'activation des promoteurs. Des expériences préliminaires ont permis d'observer que le gène CaWRKY1 natif est induit dans les feuilles de caféier soumises à l'infiltration de souches d'A. tumefaciens. Ces résultats démontrent que les séquences d'ADN pWla et pWlb isolées en amont du gène CaWRKY1 sont des séquences promotrices fonctionnelles dans les feuilles de tabac. Activité du promoteur pWla dans les feuilles de caféier transformées Pour vérifier la fonctionnalité des promoteurs chez le 30 caféier, on procède à une transformation génétique de C. arabica avec la construction pWla::GUS. On cultive 6 lignées embryogéniques continues indépendantes ayant une activité GUS. À partir de ces lignées embryogéniques, on régénère, par embryogenèse somatique, des plantules putativement transformées pour lesquelles on confirme l'insertion du transgène par PCR (figure 3A). Pour 3 plantules issues d'épisodes de transformation indépendants, on teste l'activité GUS des feuilles à deux stades de croissance différents (figure 4A). Globalement, le niveau d'activité GUS est beaucoup plus élevé chez le caféier que dans les feuilles de tabac transformées avec les constructions pWla::GUS (figure 2). Cela peut s'expliquer par le fait que toutes les cellules 10 de caféier testées ont été transformées. En outre, plusieurs copies du transgène peuvent avoir été transférées dans les clones de végétaux testés (Ribas et al., 2011). Les plantules B et C présentent un niveau d'activité GUS 15 deux ou trois fois plus élevé que le plant A. Étant donné que ces variations peuvent s'expliquer par des différences au niveau du nombre de copies du transgène, on réalise une PCR quantitative sur l'ADN génomique de chaque lignée afin d'évaluer le nombre de copies du transgène 20 qu'elles contiennent (figure 3C). On conçoit des amorces spécifiques pour la quantification en temps réel de la séquence pWla-GUS. Globalement, les 3 lignées testées présentent le même nombre relatif de copies du transgène. La variation du niveau d'activité GUS peut probablement être 25 associée à la position d'insertion du transgène dans le génome du caféier. Enfin, pour chaque lignée testée, on observe des valeurs plus élevées dans les jeunes feuilles que dans les feuilles adultes, ce qui indique une régulation directe du promoteur pWla par les conditions de développement. 30 On teste l'effet d'agressions mécaniques sur l'activité du promoteur pWla. Les dosages histochimiques révèlent une coloration bleu foncé des tissus entourant les zones lésées, traduisant la présence d'une induction locale de l'activité du promoteur pWla (figure 4B). Toutefois, les dosages fluorimétriques ne permettent de quantifier aucune différence significative d'activité GUS lorsque les tissus lésés sont comparés à des tissus témoins.

Régulation de l'activité des promoteurs pWla et pWlb Profil d'expression de CaWRKY1a et CaWRKY1b après l'inoculation d'H. vastatrix ou après des stress abiotiques Pour caractériser le niveau d'expression des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b lors de réponses de résistance à une infection fongique, on inocule H. vastatrix dans des feuilles de caféier, induisant une interaction incompatible. On prélève des feuilles 18, 21 et 24 heures après l'inoculation (Hour Post-Inoculation, hpi) et on mesure l'accumulation des transcrits des deux gènes au moyen de RT-PCR quantitatives (figure 5). Les deux gènes sont induits de manière transitoire par l'infection fongique, avec un pic d'accumulation de transcrits vers 21 hpi qui confirme les résultats précédemment obtenus (Petitot et al., 2008). L'instant d'apparition de ce pic varie légèrement en fonction de l'expérience biologique considérée, mais on observe toujours une accumulation transitoire des deux gènes. Vers 24 hpi, l'expression des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b revient au niveau de base observé sur les feuilles témoins.

Activité des promoteurs pWla et pWlb en réponse au SA et à une agression On teste l'impact d'un traitement au SA et d'une agression mécanique sur l'activité des promoteurs au moyen d'un dosage transitoire sur feuilles de tabac. Le promoteur 35S proche qui commande le gène de résistance à l'hygromycine, même en orientation inverse, peut influencer les promoteurs proches faisant l'objet de l'analyse, c'est la raison pour laquelle on l'élimine du vecteur pC1305.1 et on teste de nouvelles constructions. les feuilles augmentation l'application ayant subi une de l'activité exogène de SA 20 agroinfiltration provoque GUS (figure 6). L'effet est similaire pour les Cette fois-ci, le traitement au SA appliqué sur une de deux promoteurs, avec une activation de l'ordre de 2,4 pour pWla et de l'ordre de 2,3 pour pW1b. On réalise des expériences d'agression sur des feuilles ayant subi une agroinfiltration et on prélève des échantillons après différents laps de temps. On s'attend, d'après les analyses d'expression génique (Petitot et al., 2008), à observer une augmentation significative de l'activité GUS. Comme pour les plants de caféier transformés, une coloration histochimique permet de détecter une forte activité dans les feuilles de tabac lésées, traduisant l'activation des promoteurs pWla et pW1b. Toutefois, le dosage enzymatique ne permet de détecter aucune variation quantitative de l'activité GUS après l'agression. Régulation de l'activité des promoteurs par la protéine CaWRKY1 On observe souvent une autorégulation et une interrégulation des gènes WRKY. Les séquences des promoteurs pWla et pWlb contiennent plusieurs boîtes W putatives. De plus, les résultats d'activation transitoire du gène CaWRKY1, observés après l'inoculation de la rouille, suggèrent que la protéine CaWRKY1 peut exercer une action directe sur l'expression de ses propres transcrits. Pour confirmer cette hypothèse, on réalise des expériences de transactivation avec la protéine CaWRKY1b. On co-infiltre des agrobactéries contenant la construction génique effecteur (gène CaWRKY1b commandé par le promoteur CaMV35S) ou contenant les constructions géniques rapporteurs (gène GUS commandé par le promoteur pWla ou pW1b) dans des feuilles de tabac, dans deux rapports différents (1/1 ou 5/1).

En tant que témoin, on co-inocule des agrobactéries contenant le vecteur vide PCN3 et des bactéries contenant les constructions géniques rapporteurs. Comme le montre la figure 7, au rapport 1/1, l'expression de CaWRKY1 provoque une diminution de l'activité GUS pilotée par les deux promoteurs (respectivement 62 % pour pWla et 52 % pour pW1b). Lorsque le rapport effecteur/rapporteur passe à 5/1, l'effet de l'expression de CaWRKY provoque une réduction plus importante de l'activité GUS : 44 % pour pWla et 30 % pour pW1b. Ensemble, ces données révèlent que CaWRKY1 inhibe ses propres promoteurs. Analyse des délétions du promoteur pWla Pour détecter les régions de régulation agissant en cis 15 dans le promoteur du gène CaWRKY1, on procède à une série de délétions sur le promoteur pWla. La conception des constructions repose sur les éléments de régulation putatifs (boîtes W et éléments as-1) identifiés dans la séquence. On obtient quatre constructions délétées 20 mesurant -1026 pb à -216 pb de long (voir positions sur la figure 1B) et on les fusionne avec le gène rapporteur GUS. On analyse leur activité par agroinfiltration dans des feuilles de tabac et on la compare à l'activité du promoteur pWla (figure 8). 25 La première délétion (-1026 pb) provoque une augmentation de l'activité GUS, révélant la présence d'éléments de régulation négative entre les positions -1353 et -1026. Les délétions à -593 et -404 pb ne modifient pas significativement l'activité promotrice constitutive. 30 Toutefois, la construction de -216 pb provoque une diminution de 50 % de l'activité GUS par rapport à l'activité du promoteur pWla entier, ce qui démontre que des éléments de régulation positive sont présents dans cette région promotrice.

On réalise des expériences de traitement au SA, d'agression et de transactivation sur la série de délétions de pWla. On n'observe aucune différence significative au niveau de l'activité des promoteurs. Cela est probablement dû à l'influence du promoteur CaMV35S proche qui commande la résistance à l'hygromycine. Commentaires sur les résultats ci-dessus Identification des promoteurs du gène CaWRKY1 Comme décrit ci-dessus, les inventeurs ont isolé des séquences promotrices fonctionnelles (respectivement pWla et pW1b) des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b. Les gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b sont deux copies homéologues du gène CaWRKY1 du génome tétraploïde de C. arabica (Petitot et al., 2008). Les séquences pWla de 1380 pb et pWlb de 1187 pb présentent une identité nucléotidique de seulement 76 %. Ces données contrastent avec celles des séquences codantes des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b, qui partagent 97,5 % d'identité (Petitot et al., 2008). La forte divergence des séquences non codantes se traduit par de nombreuses insertions/délétions et mutations ponctuelles. En outre, pWla et pWlb sont légèrement différents quant à leur teneur en éléments de régulation à action cis. Toutefois, la composition globale et l'organisation de ces éléments sont conservées, révélant des caractères de régulation similaires pour les deux promoteurs. Ces données concordent avec les données d'expression qui démontrent que les gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b présentent un profil d'expression similaire en conditions de stress biotiques et abiotiques (Petitot et al., 2008). Les inventeurs ont également démontré que les deux promoteurs ont le même comportement d'expression génique lorsqu'ils sont soumis à un dosage lors de transformation transitoire de feuilles de tabac. En outre, ils sont inhibés de manière similaire par la protéine CaWRKY1 lorsqu'ils sont exprimés de manière transitoire dans des feuilles de tabac. Les séquences promotrices des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b divergent davantage que les séquences codantes, bien qu'elles semblent conserver des régions de régulation. Plusieurs éléments de régulation à action cis putatifs associés aux réactions de défense des végétaux tels que des boîtes W et des éléments as-1 ont été identifiés dans les séquences pW1a et pW1b.

Les séquences pW1a et pW1b contiennent respectivement 4 et 5 boîtes W et 3 éléments as-1 chacune. Ces valeurs sont supérieures ou égales aux valeurs obtenues lors de l'étude des promoteurs des 20 gènes de l'opéron PR1 d'Arabidopsis thaliana (moyenne de 2,6 boîtes W et de 0,9 élément as-1 dans 1,1 kb de promoteurs) ou des promoteurs des 49 gènes WRKY régulés lors des réponses de défense des végétaux (moyenne de 2,9 boîtes W et de 1,46 élément as-1 dans 1,5 kb de promoteurs). L'enrichissement des promoteurs des gènes CaWRKY1 en éléments de régulation des réponses de défense indique que les gènes CaWRKY1 peuvent être des acteurs moléculaires de la machinerie de défense des végétaux. Régulation par l'acide salicylique Lors des dosages de transformation transitoire menés dans le cadre de cette étude, il a été démontré qu'un traitement exogène au SA permettait d'induire l'activité des promoteurs pWla et pWlb dans les feuilles de tabac. Ce résultat concorde avec l'induction des gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b dans les feuilles de caféier quelques heures après l'application exogène de SA (Petitot et al., 2008). L'activation des promoteurs pWla et pWlb par le SA dépend probablement de membres de la famille des facteurs de transcription TGA. Les facteurs TGA appartiennent à la catégorie des facteurs de transcription comprenant des "glissières à leucines" et ils ont initialement été décrits chez le tabac pour leur capacité à se lier sélectivement à l'élément as-1 du promoteur CaMV35S. En présence de SA, certains facteurs TGA interagissent avec la protéine de régulation NPR1. Ces interactions stimulent à leur tour la liaison des facteurs TGA aux éléments TGACG des promoteurs des gènes sensibles au SA. L'expression de neuf gènes WRKY d'Arabidopsis dépend de NPR1, ce qui indique qu'ils peuvent être commandés par les facteurs TGA. Le promoteur d'un autre gène WRKY, AtWRKY51, est ciblé par TGA2 de manière dépendante au SA. De même, les gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b peuvent être régulés par les facteurs TGA en réponse à un traitement au SA.

Régulation de l'activité des promoteurs par la protéine CaWRKY1 La réalisation de dosages de transactivation de protéines/promoteurs par agroinfiltration dans des feuilles de tabac constitue un système pratique qui a été utilisé avec succès pour démontrer la transactivation du promoteur de GAL4 chez la levure par l'activateur GAL4/VP16 (Yang et al., 2000). Des dosages de transactivation réalisés selon l'invention ont révélé que la protéine CaWRKY1 inhibe ses propres promoteurs, pWla et pWlb. Il semble que l'inhibition des gènes WRKY corresponde à la répression induite par une boucle de rétro-inhibition afin d'éviter l'accumulation prolongée de ces facteurs de transcription dans la cellule. CaWRKY1 peut inhiber ses propres promoteurs de la même manière. Ces résultats concordent avec les données d'accumulation de transcrits obtenues par PCR quantitative, qui démontrent que les gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b sont induits de manière transitoire par le champignon de la rouille H. vastatrix (figure 5). La diminution des quantités de transcrits de CaWRKY-la et -lb peut alors correspondre à une autorégulation de CaWRKY-la et -lb. On ne peut cependant pas exclure une inhibition exercée par d'autres facteurs de transcription WRKY ou par d'autres régulateurs. Les éléments de régulation à action cis nécessaires à cette inhibition peuvent se trouver entre les régions de -1353 et -1026 pb de la séquence du promoteur pWla, comme l'indiquent les analyses de délétions (figure 8). Outre les aspects fonctionnels de cette étude, pWla et pWlb constituent de nouveaux outils importants pour les techniques de biotechnologie sur le caféier. La transformation génétique de C. arabica a été réussie il y a 10 ans (Leroy et al., 2000), mais jusqu'à présent, seul le promoteur CaMV35S a été étudié dans des plants transformés de manière stable (Albuquerque et al., 2009 ; Ribas et al., 2011).

Il existe un besoin évident pour des promoteurs pilotant l'expression de transgènes de manière histospécifique ou régulée. Chez Coffea sp., les promoteurs clonés jusqu'à présent étaient essentiellement liés au développement des grains ou à la biosynthèse de la caféine. Le promoteur cspl commande un gène codant une protéine de stockage des grains 11S de C. arabica. Le promoteur du gène de la déhydrine de CcDH2 de C. canephora a été isolé et sa séquence a révélé des éléments de régulation putatifs associés au développement des grains.

Le promoteur NMT du gène de la N-méthyltransférase exprimé chez C. canephora entre en jeu dans la biosynthèse de la caféine. Des promoteurs de gènes liés à la photosynthèse ont été isolés : le promoteur rbcsl du gène codant la petite sous-unité de la Rubisco de C. arabica et le promoteur NCED3 du gène de la 9-cis-époxycaroténoïde dioxygénase de C. canephora. Un seul promoteur lié au stress a été étudié jusqu'à présent : le promoteur du gène CaIRL codant une isoflavoneréductase de C. arabica commande une forte expression d'un gène rapporteur après agression mécanique de feuilles de tabac transformées. Les analyses de ces promoteurs de caféier ont été essentiellement menées sur des feuilles de tabac, système végétal hétérologue. Toutefois, Kumar et al. (2007) ont transformé des tissus de C. canephora par électroporation et ont démontré la capacité de la globuline 11S et des promoteurs NMT à commander l'expression de transgènes dans les tissus de l'endosperme de C. canephora et, pour le promoteur NMT, à piloter l'expression dans des embryons secondaires transgéniques.

Selon l'invention, la capacité du promoteur pWla à commander l'expression de gènes rapporteurs dans des feuilles de caféier transformées de manière stable a été vérifiée et la capacité à répondre aux stress a été visualisée. En conséquence, le promoteur pWla est un nouveau candidat efficace pour commander l'expression de transgènes en réponse à des stress chez le caféier. Malgré leurs différences de séquence, les deux promoteurs de caféier isolés à partir des deux gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b homologues contiennent des éléments de régulation similaires et présentent les mêmes réponses au champignon de la rouille, au SA et aux agressions lors de nos expériences. Il semble que les gènes CaWRKY1a et CaWRKY1b soient régulés de manière similaire et qu'aucune divergence fonctionnelle n'apparaisse pendant l'évolution de ces gènes homologues. Tout comme AtWRKY6, homologue d'Arabidopsis le plus proche, une autorégulation négative commande l'expression des 2 gènes, ce qui indique que ce mécanisme de régulation est conservé entre les espèces de végétaux. En outre, ces promoteurs présentent une forte activité constitutive qui peut permettre l'expression ectopique d'un certain nombre de protéines chez le caféier. Ils constituent de nouveaux outils pour les besoins des biotechnologies sur le caféier, telle l'amélioration de la résistance aux maladies ou de la qualité de la tasse de café.

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Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2, respectivement dénommées pWla et pW1b, et dérivés de celle-ci tels que pW/a(-1026).
2. 2. Promoteur des copies homologues du gène CaWRKY1, à savoir CaWRKYla et CaWRKY1b, ayant les séquences SEQ ID N° 1 10 et SEQ ID N° 2, respectivement dénommées pWla et pW1b, et dérivés de celui-ci tels que pW/a(-1026).
3. 3. Utilisation d'un promoteur selon la revendication 2 pour commander l'expression de gènes rapporteurs dans des 15 plants de caféier ou de tabac et pour répondre à des stress biotiques ou abiotiques.
4. 4. Utilisation du promoteur pWla pour commander l'expression de transgènes en réponse à des stress chez le 20 caféier.
5. 5. Système d'expression d'un gène d'intérêt dans des végétaux, comprenant au moins la séquence dudit gène commandé par une séquence ou un promoteur selon la revendication 1 ou 25 2.
6. 6. Vecteur d'expression d'un gène, comprenant au moins la séquence dudit gène commandé par une séquence ou un promoteur selon la revendication 1 ou 2. 30
7. 7. Cellule végétale transfectée par un système ou un vecteur selon la revendication 5 ou 6.
8. 8. Cellule végétale selon la revendication 7, dans laquelle le végétal est un plant de caféier ou de tabac.
9. 9. Plante transgénique transfectée par un système ou un 5 vecteur selon la revendication 5 ou 6.
10. 10. Plante transgénique selon la revendication 9, dans laquelle la plante est un plant de caféier ou de tabac. 10