WO2000052152A1 - Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2000052152A1
WO2000052152A1 PCT/EP2000/001652 EP0001652W WO0052152A1 WO 2000052152 A1 WO2000052152 A1 WO 2000052152A1 EP 0001652 W EP0001652 W EP 0001652W WO 0052152 A1 WO0052152 A1 WO 0052152A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ribosomal
seq
domains
peptide
dna sequence
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/001652
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mohamed A. Marahiel
Torsten Stachelhaus
Henning Mootz
Dirk Konz
Original Assignee
Marahiel Mohamed A
Torsten Stachelhaus
Henning Mootz
Dirk Konz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Marahiel Mohamed A, Torsten Stachelhaus, Henning Mootz, Dirk Konz filed Critical Marahiel Mohamed A
Priority to AU34257/00A priority Critical patent/AU3425700A/en
Priority to IL14500400A priority patent/IL145004A0/xx
Priority to CA002364569A priority patent/CA2364569A1/en
Priority to EP00912520A priority patent/EP1159416A1/de
Priority to JP2000602764A priority patent/JP2002537806A/ja
Publication of WO2000052152A1 publication Critical patent/WO2000052152A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing modified non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and the use of those for producing native or artificial peptides and proteinogens.
  • NRPS modified non-ribosomal peptide synthetases
  • Non-ribosomal peptide synthetases are modular enzymes with complex structures and important biological functions. Numerous peptides with pharmaceutical and biotechnological interest - in particular those such as biosurfactants, siderophores, antibiotics, cytostatics, immunosuppressants or antitumor agents - are produced by large enzyme complexes, the so-called NRPS (Marahiel et al. (1997), Chem. Rev. 97: p.2651- 2673) biosynthesized. These include well-known drugs such as cyclosporin A and vancomycin. The large variety of bioactive peptides produced in this way is a result of the large structural diversity of the NRPS.
  • NRPS Non-ribosomal peptide synthetases
  • NRPS In addition to the 20 proteinogenic amino acids, NRPS often build special residues, such as ⁇ -hydroxy amino acids or non-proteinogenic amino acids.
  • the individual residues are linked to one another via peptide bonds or the formation of esters and lactones.
  • the residues can also be further modified by N-methylation, heterocyclic ring formation or epimerization.
  • Many of the peptides synthesized by natural NRPS are also cyclized by ester or peptide bonds.
  • NRPS can play a key role in the synthesis of complex peptide bio-compounds.
  • the module is the catalytic unit that incorporates a specific amino acid into the product (peptide) (Marahiel et al. (1997), Chem. Rev. 97: S.2651-2673).
  • the individual modules are composed of so-called domains, each of which is responsible for a specific reaction.
  • the adenylation domain (A- Domain) determines the entry of the substrate into the peptide by the A domain selecting and adenylating the substrate, usually an amino acid.
  • the activated amino acid is then bound via a thioester bond to the cofactor 4'-phosphopantetin in a thiolation domain (T).
  • T thiolation domain
  • the aminoacyl or peptidyl residues are condensed to a neighboring module.
  • This reaction is catalyzed by the condensation domain (C domain).
  • C domain condensation domain
  • the last module of an NRPS usually contains a termination domain (Te domain) which is responsible for the release of the synthesis product.
  • Te domain termination domain
  • Modification domains are built into the corresponding module at locations where a modified amino acid is incorporated.
  • An adenylation (A) domain recognizes and activates its cognate substrate amino acid as an enzyme-associated amino acyl adenylate with simultaneous ATP hydrolysis. These relatively unstable intermediates are then stabilized by transfer to the thiol group of a 4'-phosphopantethein cofactor (4'-PAN) covalently linked to a thiolation (T) domain. With the participation of condensation (C) domains, a sequential chain growth up to the finished peptide product then takes place in an ordered sequence of transpeptidations of the amino acids activated in this way.
  • A adenylation domain
  • the structure of the products formed can also be changed by modifying the incorporated monomers (for example epimerization or N-methylation) or the main peptide chain (for example acylation or glycosylation).
  • Such functionalizations are catalyzed by special domains or polyketide synthase (PKS) modules within the NRPS matrix. It could be shown that A domains determine the primary structure (sequence) of the non-tribosomal peptide formed via their substrate specificity and relative sequence within a specific NRPS system.
  • NRPS-A domains identified highly conserved sequence areas, the so-called core motifs, which occur within the A domains with almost unchanged localization and amino acid sequence.
  • core motifs also have functions in binding the substrate amino acid.
  • the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxy group of the substrate amino acid L-phenylalanine in PheA are coordinated electrostatically by the residues Asp235 (Core A4) and Lys 517 (Core A10) [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673].
  • the actual substrate specificity-mediating region of PheA is located in an approximately 100 amino acid-long region which has a reduced conservation within the group of the A domains.
  • This region forms the binding pocket for the side chain of the phenylalanine substrate (FIG. 1B), which is built up on one side by the residues Ala236, Ile330 and Cys331, and on the other side by the residues Ala322, Ala301, He 299 and Thr278 .
  • Both sides of the bag are separated by the indole ring of the Trp239, which is located on the bottom of the bag.
  • the object underlying the present invention was a method for modifying A domains for the purpose of providing and producing appropriately modified non-ribosomal peptide synthetics for the production of new peptides.
  • the invention allows the targeted production of a desired non-ribosomal peptide.
  • consensus sequences could be derived from the phylogenetic studies, which are to be understood as the non-tribosomal code of the NRPS (Table 1). Similar to the ribosomal code, this code is degenerate (redundant), and so far, for example, four different codes for Leu-activating domains, three codes for Val and two for Cys-activating domains have been identified. It can be assumed that there are also several substrate detection strategies for other substrates which can be determined with the aid of the inventive method.
  • the invention also relates to the non-ribosomal code, represented in Table 1, coding for a non-ribosomal peptide.
  • substrate binding pockets can be predicted on the basis of the “codons” determined by sequence comparisons.
  • the putative binding pockets for the substrate amino acids Asp, Orn and Val are shown as examples in FIG. 3. While Asp235 and Lys517 are keys in all A domains - To mediate interactions with the amino and carboxy groups of the substrate and are therefore highly conserved, it is assumed that the remaining residues are largely responsible for determining the specificity for a certain amino acid side chain: the corresponding residues (items 236 to 331) in the three given Examples support this theory and perfectly reflect the needs regarding the polarity and size of the activated substrates.
  • Asp activation (codon 'Asp'): The basic residue His322 (possibly also Lys278) establishes a polar interaction with the acidic side chain, whereas the rest Leu236 closes the binding pocket for the acceptance of longer-chain substrates (e.g. Glu).
  • positions 278, 299 and 331 are those wobble-like residues that have increased flexibility within certain codons.
  • binding pockets which recognize smaller amino acids have a higher flexibility at positions near the bottom of the pocket, whereas with large substrates a greater variability is observed in the upper region (see Table 1).
  • Asp235 is only absent in A domains that activate substrates without an ⁇ -amino group. Examples include the ⁇ -aminoadipate-activating domains of the AcvA synthetases or the carboxyacid-activating domains of the Enterobactin (Escherichia coli) and Yersiniabactin systems (Yersinia pestis). Lys517, on the other hand, is absolutely invariant and binds both the ⁇ -carboxy group of the cognate amino acid and the 04 'and 05' of the ATP / AMP-Ribose unit, which presumably brings both substrates into a position of optimal interaction. Both residues convey important Interaction with the (largely) unchangeable ⁇ -amino and ⁇ -carboxy groups of the substrate, which explains their own invariance.
  • the modified DNA is implanted chromosomally or extrachromosomally in the host organism according to methods known per se to the person skilled in the art (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the benzyl ring of the side group of D-Phe is rotated about 30 ° relative to the L-Phe ring, resulting in a slight shift in the relative position of the ⁇ -C- but not the ⁇ -C -Atoms results.
  • AspA H322E
  • a complete change in substrate specificity can be achieved by introducing a single point mutation.
  • the mutant AspA (H322E) also showed an approximately 5-fold increase in the activation efficiency for similarly large, aliphatic Asn analogues, such as, for example, Ile, Leu and Val.
  • the changed substrate specificity of an A domain can also be used for the in vivo synthesis of a peptide with a modified primary structure.
  • the gene fragment of the Asn-specific double mutant AspA (1330V / H322E) was transferred into the chromosome of the surfactin producer B. subtilis ATCC 21332 by means of homologous recombination. This integration was carried out using a two-stage recombination method [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet.
  • the biosurfactant surfactin is a lipoheptapeptide with a variable ß-hydroxy fatty acid content (6-9 methylene groups), which is produced at the transition to the stationary growth phase and is secreted into the culture medium.
  • the B. subtilis strains ATCC 21332 and Asn-5 were fermented to detect the modified lipoheptapeptide, and wild-type and [Asn-5] surfactin were prepared from their culture supernatants.
  • the subsequent HPLC-MS analysis showed that the [Asn-5] surfactin was produced in the same quantity compared to the wild type (1), (2) had a longer retention time, and (3) in the ESIMS analysis a mass difference of 1 Da showed.
  • the mutated A domains are first overexpressed in E. coli, purified and examined for their substrate specificity. If this enables the expected change in specificity to be confirmed, the mutated A-domain DNA is exchanged for the native A-domain DNA in the chromosome of the producer organism via homologous recombination. The producer strain with a mutated A domain thus generated can now be used to produce the modified non-tribosomal peptide.
  • the method according to the invention can also be used to influence the specificity and / or activity of known biologically active peptides.
  • certain A domains are changed on the basis of the code found so that the peptides synthesized with the aid of the modified NRPS have the desired properties.
  • An example of this is the improvement in solubility which can be achieved by replacing hydrophobic with hydrophilic amino acids and vice versa.
  • the results according to the invention also allow a targeted prediction of substrate specificities of already sequenced NRPS genes, the function of which has not yet been determined. This is becoming increasingly important in the context of the steadily increasing sequence quantities due to various genome sequencing projects. So it is with the method described here e.g. possible to predict the putative structure of the product peptide formed from the DNA sequence of an NRPS cluster. Subsequent structural-functional analysis of such genes is thus made much easier.
  • the PCR amplificates were purified using the 'QIAquick-spin PCR purification' system (Qiagen; Hilden, Germany, catalog number: 28104), their cohesive ends were smoothed and then ligated intramolecularly.
  • pPheA (A236L) (by using the oligonucleotides Seq ID-NO: 1 and Seq ID-NO: 2), pPheA (W239G) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 4), pPheA (W239L) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 5), pPheA (T278M) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 7), pPheA (T278Q) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID -NO: 8), pPheA (l299T) (Seq
  • the DNA fragment coding for the aspartate-activating A domain from SrfA-B was amplified by means of PCR from the chromosomal DNA from Bacillus subtilis JH642 with the following oligonucleotides: (Seq ID-NO: 25) ⁇ '-AspA: 5'- AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3 'and (Seq ID-NO: 26) 3'-AspA: 5'-AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3'.
  • the resulting PCR amplificate was purified (see above), digested with the restriction enzymes Ncol and BamHI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1160Z and E1010Y) and digested in the similarly prepared 'is-tag' vector pQE60 (Qiagen; Hilden, Germany, order no .: 33603).
  • the resulting plasmid pAspA (H322E) subsequently served as a template for the generation of pAspA (H322E / l330V) by means of inverse PCR with the following primers (Seq ID-NO: 29) 5'-AspA (l330V): 5'-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3 'and (Seq ID-NO: 30) 3'-AspA (I330V): 5'-CTG TGG GCC CGT ACT CAT TAA TAA ATT CGG-3'. The identity of all constructs was again checked and confirmed by DNA sequencing.
  • the DNA fragment coding for the glutamate-activating A domain from SrfA-A was amplified by PCR from the chromosomal DNA of Bacillus subtilis JH642 with the following oligonucleotides: (Seq ID-NO: 31) 5'-GluA: 5'-TAT GGA TCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3 'and (Seq ID- NO: 32) 3'-GluA: 5'-TAT GGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT -3 '.
  • the resulting PCR amplificate was purified (see above), digested with the restriction enzyme BamHI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1010Y) and with Bglll (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no. No .: E1021Y) cloned his-tag vector pQE60 (Qiagen; Hilden, Germany, order no .: 33603).
  • BamHI Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1010Y
  • Bglll Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany
  • pQE60 Qiagen; Hilden, Germany, order no .: 33603
  • Fractions containing the respective recombinant protein were pooled and dialyzed against assay buffer (50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 2 mM dithioerythritol (DTE) and 1 mM EDTA). After adding 10% glycerol (v / v), the proteins could be stored at - 80 ° C without any noticeable loss of their catalytic activity.
  • assay buffer 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 2 mM dithioerythritol (DTE) and 1 mM EDTA.
  • the protein concentration of the different solutions was determined using the calculated extinction coefficients at 280 nm (A280nm): 64060 M-1 cm-1 for PheA and all PheA mutants except PheA (W239Xaa), 58370 M-1 cm-1 for PheA (W239Xaa), and 39780 M-1 cm-1 for AspA and AspA (H322E) and 35490 M-1 cm-1 for GluA and GluA (K239Q).
  • the ATP-pyrophosphate exchange reaction was carried out to determine both the catalytic activity and the specificity of the purified, recombinant A domains [Mootz & Marahiel, 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. The specificity was checked with all 20 proteinogenic amino acids, as well as L-ornithine and D-phenylalanine.
  • the reaction mixtures contained (final volume: 100 ⁇ L): 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 2 mM DTE, 1 mM EDTA, 0 to 2 mM amino acid, and 250 nM enzyme.
  • the various reactions were initiated by adding 2 mM ATP, 0.2 mM sodium pyrophosphate and 0.15 ⁇ Ci (16.06 Ci / mmol) sodium [32P] pyrophosphate (NEN / DuPont; Germany; order no .: NEX019) and for 10 min Incubated at 37 ° C.
  • the exchange reactions could then be stopped by adding 0.5 mL stop solution: 1.2% (w / v) activated carbon, 0.1 M sodium pyrophosphate and 0.35 M perchloric acid.
  • the activated carbon was separated by centrifugation, washed once with 1 ml of double-distilled water and resuspended in 0.5 ml of water.
  • Protein sequences from 160 A domains were obtained from publicly accessible databases (eg http // www.ncbi. Nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide. Html) and on the approximately 100 amino acid region between the core motifs A4 and A5 reduced [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. These sequences were subsequently aligned, using the MegAlign subroutine from the DNAStar program package, with respect to sequence homologies, the method 'clustal' was used in its basic setting. The sole purpose of this first alignment was to facilitate the subsequent assignment of the putative substrate binding pocket constituents.
  • the coding gene fragment of the AspA double mutant (Asp (H322E / l331V) was inserted into the srfA biosynthesis operon from B. subtilis [Cosmina, P. et al., 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831].
  • the corresponding srfA-B gene fragment coding for the Asp-activating module (base pair 14195-18200; [Cosmina , P. et al. 1993, Mol. Microbiol.
  • the resulting amplificate was purified with the restriction enzymes Clal and Spei (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E11034Y and E1086Z) digested and cloned into the equally prepared vector pBluescript SK (-) (Stratagene, Heidelberg, Germany, order no .: 212206).
  • This cloning provided the plasmid pSK-homoAsp, from which subsequently an approximately 1.3 kb aspA fragment (base pair 15212.) with the restriction endonucleases EcoRI and Pstl (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1040Y and E1073Y) -16559; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) was cut out and replaced with the complementary, double mutated fragment from pAspA (H322E / 1333V). The identity of the resulting integration plasmid pSK-homoAsp (H322E / 1330V) could be confirmed by DNA sequencing.
  • subtilis AS20 was made competent for DNA uptake and co-transformed with the integration vector pSK-homoAsp (H322E / l330V) and the helper plasmid pNEXT33A [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318].
  • the latter helper plasmid initially mediated a positive selection via its neomycin resistance gene, and the clones obtained could then be examined for the loss of their chloramphenicol cassette and thus the integration of the aspA (H322E / l330V) 'gene fragment.
  • the identity of the constructed clone B. subtilis Asn-5 could be verified by PCR amplification of this area from the chromosome of the selected clones and subsequent DNA sequencing.
  • the methanolic solution obtained was analyzed using a ⁇ P1100 Series
  • Figure 1 Structural basis for the detection and activation of phenylalanine (from Conti et al. [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183]).
  • A The band diagram shows that PheA consists of two folding domains, a large N-terminal (below) and a smaller C-terminal (above).
  • AMP and the substrate amino acid phenylalanine are shown in black.
  • B The binding pocket for phenylalanine is formed from ten amino acids. Asp235 and Lys517 mediate electrostatic interactions (dashed lines) with the ⁇ -amino and ⁇ -carboxyl group of the substrate.
  • the actual binding pocket which enables the specific recognition of the phenylalanine side group, is formed by Ala236, Ile330 and Cys331 on the one hand, and Ala322, Ala301, 1299 and Thr278 on the other. Both sides are kept separate at the lower end by the indole ring of the Trp239.
  • This architecture allows the PheA binding pocket to accept both stereoisomers, L-Phe (light gray) and D-Phe (dark gray) without noticeable change in conformation.
  • Figure 2 Phylogenetic tree constructed with the ten specificity-mediating amino acids of the A domains.
  • the phylogenetic examination reveals a grouping of the codons determined, according to the specificity of their domains of origin (light gray boxes). This confirms the correctness of the concept of structural homology between A domains and shows that the ten amino acids determined in each case really form the codon for the recognition of the cognate substrate amino acid. Examples are given which show that the specificity of newly discovered domains can be predicted using this technique and that the grouping is guided by the experimentally observed specificity (dark gray background). This also applies to the constructed mutants PheA (T278M / A301G) and AspA (H322E), which show a Leu or Asn specificity (medium gray background) in the ATP-pyrophosphate exchange reaction.
  • Figure 3 Schematic representation of the postulated binding pockets of three adenylation domains.
  • the codons determined from three different substrates ('Asp', Orn (2) 'and Nal (3)'; see Table 1) were projected into the representation of the binding pocket of PheA shown in FIG. 1B.
  • Aliphatic (light gray), polar (striped), acidic (white) and basic (dark gray) side groups are shown schematically.
  • Asp235 and Lys517 mediate interactions with the ⁇ -amino and ⁇ -carboxyl group of the respective substrate, while all other residues (Xaa236 to Xaa331) mediate the actual recognition of the side chain of the substrate.
  • a perfect correlation between the polarity of the binding pocket and the substrate can be observed for all the examples shown.
  • Figure 4 observed variability of the constituents of different substrate binding pockets.
  • the constituent amino acids of the various positions in 160 postulated substrate binding pockets were examined for their variability.
  • the proportional distribution of the nature of the substrates in the examined A domain is shown in the middle gray box.
  • the ten constituent amino acids can be classified into three subgroups: (1) Positions 235 (Asp: acid, white) and 517 (Lys: basic, dark gray) are 'invariant'. (2) Items 236, 301 and 330 are only 'conditionally variant'.
  • FIG. 5 Targeted change in the substrate specificity of PheA and AspA.
  • the substrate specificity of wild type (white) and mutants (different shades of gray) were examined with the help of ATP-pyrophophate exchange reactions.
  • the substrates used are shown on the abscissa and the maximum observed activity for each protein was set at 100%.
  • the corresponding double mutant (PheA (T278M / A301G); dark gray) preferentially activates Leu with a catalytic activity that is in no way inferior to the efficiency of the wild-type enzyme PheA for Phe.
  • PheA T278M / A301G
  • dark gray preferentially activates Leu with a catalytic activity that is in no way inferior to the efficiency of the wild-type enzyme PheA for Phe.
  • a H322E point mutation in AspA was sufficient to completely shift the substrate specificity of the mutant from Asp to Asn.
  • the observed activation patterns of the mutants correspond to the position of their codons in the phylogenetic tree shown in FIG. 2 (medium gray background).
  • Figures 6-9 stand for Tables 1-4.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung modifizierter nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS) und die Verwendung derer zur Herstellung nativer oder künstlicher Peptide und Proteinogene. Insbesondere ist anhand eines neuen nicht-ribosomalen Codes ein gewünschtes Peptid erhältlich.

Description

Beschreibung
NICHT-RIBOSOMALE PEPTIDSYNTHETIKA, VERFAHREN ZU DEREN HERSTELLUNG UND DEREN VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung modifizierter nicht- ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS) und die Verwendung derer zur Herstellung nativer oder künstlicher Peptide und Proteinogene.
Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS oder Peptidsynthetasen) sind modular aufgebaute Enzyme mit komplexen Strukturen und wichtigen biologischen Funktionen. Zahlreiche Peptide mit pharmazeutischem und biotechnologischem Interesse - insbesondere solche wie Biotenside, Siderophore, Antibiotika, Cytostatika, Immunsuppressiva oder Antitumorwirkstoffe - werden von großen Enzymkomplexen, den sogenannten NRPS (Marahiel et al. (1997), Chem. Rev. 97: S.2651-2673) biosynthetisiert. Dazu gehören ebenfalls bekannte Arzneimittel wie Cyclosporin A und Vancomycin. Die große Vielfalt derart hergestellter bioaktiver Peptide sind ein Ergebnis der großen strukturellen Vielfalt der NRPS. NRPS bauen - neben den 20 proteinogenen Aminosäuren - oft besondere Reste, wie z.B. α-hydroxi Aminosäuren oder nicht-proteinogene Aminosäuren, ein. Untereinander sind die einzelnen Reste über Peptidbindungen oder die Bildung von Estern und Lactonen verknüpft. Die Reste können ferner durch N-Methylierung, heterozyklische Ringbildung oder Epimerisierung weiter modifiziert werden. Viele der durch natürliche NRPS synthetisierten Peptide sind durch Ester- oder Peptidbindungen zudem zyklisiert. Generell kann man sagen, daß NRPS eine Schlüsselrolle bei der Synthese von komplexen peptidischen Bioverbindungen spielen.
Es wurde gefunden, daß die multifunktionellen Proteintemplates einen im wesentlichen modularen Aufbau besitzen. Man bezeichnet als Modul die kataiytische Einheit, die eine spezifische Aminosäure in das Produkt (Peptid) einbaut (Marahiel et al. (1997), Chem. Rev. 97: S.2651-2673).
Die einzelnen Module setzen sich aus sogenannten Domänen zusammen, die jeweils für eine bestimmte Reaktion zuständig sind. Die Adenylierungsdomäne (A- Domäne) bestimmt den Eintritt des Substrates in das Peptid, indem die A-Domäne das Substrat, gewöhnlich eine Aminosäure, selektiert und adenyliert. Die aktivierte Aminosäure wird anschließend über eine Thioesterbindung an den Kofaktor 4'- Phosphopantethein einer Thiolierungsdomäne (T) gebunden. Von dort werden die Aminoacyl- oder Peptidylreste an ein Nachbarmodul kondensiert. Diese Reaktion wird durch die Kondensationsdomäne (C-Domäne) katalysiert. Diese drei, die C-, die A- und die T-Domäne bilden die Grundeinheit der multimodularen NRPS. Das letzte Modul einer NRPS enthält in der Regel eine Terminationsdomäne (Te-Domäne) die für die Freisetzung des Syntheseproduktes verantwortlich ist. Die Reihenfolge der Module innerhalb des NRPS bestimmt die Struktur des Peptids.
An Stellen, an denen eine modifizierte Aminosäure eingebaut wird, sind Modifikationsdomänen in das entsprechende Modul eingebaut.
In EP 0789078 A2 wurde der Austausch von Domänen zur Variation von bekannten Verbindungen lediglich vorgeschlagen, es findet sich dort nur eine technische Lehre bzgl. der prinzipiellen Steuerung der Peptid kettenabbruchsreaktion.
Im Einzelnen: Eine Adenylierungs-(A)-Domäne z.B. erkennt und aktiviert ihre kognate Substrat-Aminosäure als Enzym-assoziiertes Aminoacyladenylat unter gleichzeitiger ATP-Hydrolyse. Diese relativ instabilen Intermediate werden anschließend durch die Übertragung auf die Thiolgruppe eines kovalent mit einer Thiolierungs-(T)-Domäne verknüpften 4'-Phosphopantethein-Kofaktors (4'-PAN) stabilisiert. Unter Beteiligung von Kondensations-(C)-Domänen findet dann, in einer geordneten Folge von Transpeptidierungen der so aktivierten Aminosäuren, ein sukzessives Kettenwachstum bis hin zum fertigen Peptidprodukt statt. Durch eine Modifikation der eingebauten Monomere (z.B. Epimerisierung oder N-Methylierung) bzw. der Peptidhauptkette (z.B. Acylierung oder Glycosylierung) kann die Struktur der gebildeten Produkte zusätzlich verändert werden. Derartige Funktionalisierungen werden durch spezielle Domänen oder Polyketidsynthase-(PKS)-Module innerhalb der NRPS-Matrize katalysiert. Es konnte gezeigt werden, daß A-Domänen über ihre Substratspezifität und relative Abfolge innerhalb eines spezifischen NRPS-Systems die Primärstruktur (Sequenz) des gebildeten nichtribosomalen Peptides bestimmen. Durch die Auflösung der Kristallstruktur von zwei Mitgliedern der Superfamilie der Adenylat-bildenden Enzyme, hierbei handelte es sich um die Luciferase aus Photinus pyralis [Conti et al., 1996, Structure 4: 287-298] und die A-Domäne der Gramicidin S-Synthetase 1 (nachfolgend mit PheA bezeichnet) aus Bacillus brevis [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183], konnte gezeigt werden, daß, obwohl beide Enzyme nur 16% Identität bezüglich ihrer Primärstruktur besitzen, sie eine ausgesprochen homologe Faltungstopologie aufweisen. Die Struktur von PheA (Figur 1A), die in Gegenwart ihrer Substrate ATP und Phenylalanin determiniert wurde, gestattete erste Einblicke in die molekularen Mechanismen der Substraterkennung und -aktivierung.
Durch Sequenzvergleiche von NRPS-A-Domänen wurden hochkonservierte Sequenzbereiche, die sogenannten Core-Motive identifiziert, die innerhalb der A- Domänen mit nahezu unveränderter Lokalisation und Aminosäure-Abfolge auftreten. Durch frühere Mutationsanalysen und nun auch durch die Kristallstruktur von PheA konnte gezeigt werden, daß die überwiegende Mehrheit dieser Core-Sequenzen essentiell an der ATP-Bindung und -Hydrolyse beteiligt sind. Darüber hinaus üben einige Core-Motive aber auch Funktionen bei der Bindung der Substrat-Aminosäure aus. So werden z.B. die α-Aminogruppe und α-Carboxygruppe der Substrat- Aminosäure L-Phenylalanin in PheA durch die Reste Asp235 (Core A4) bzw. Lys 517 (Core A10) elektrostatisch koordiniert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Die eigentliche Substratspezifität-vermittelnde Region von PheA befindet sich dagegen in einem ca. 100 Aminosäure-langen Bereich, der innerhalb der Gruppe der A-Domänen eine reduzierte Konservierung aufweist. Diese Region bildet die Bindungstasche für die Seitenkette des Phenylalanin-Substrates aus (Figur 1B), die auf der einen Seite durch die Reste Ala236, Ile330 und Cys331 , sowie auf der anderen Seite durch die Reste Ala322, Ala301 , He 299 und Thr278 aufgebaut wird. Beide Seiten der Tasche sind durch den Indolring des Trp239, der sich am Boden der Tasche befindet, getrennt. Aus früheren in silico (Computersimulationen) Studien an NRPS-A-Domänen konnte geschlossen werden, daß der Substratspezifität-determinierende Bereich von A- Domänen vermutlich zwischen den Core-Motiven A3 und A6 lokalsiert ist. Diese Region weist eine vergleichsweise reduzierte Konservierung auf, wohingegen jedoch für Domänen gleicher Substratspezifität eine erhöhte Homologiebeziehung postuliert wurde. Dementsprechend sollten Domänen die gleiche Substrate aktivieren in phylogenetischen Bäumen gruppiert auftreten. In detaillierten Analysen ließen sich derartige Korrelationen jedoch nicht verifizieren. Vielmehr zeigte sich, daß der evolutionäre Ursprung (Wirtsorganismus) der A-Domänen einen größeren Einfluß auf deren Bündelung ausübte als ihre Substratspezifität.
Zur Ableitung der Konsensus-Sequenzen ermittelten wir über Sequenzvergleiche mit PheA und Luciferase die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstaschen von 160 in öffentlichen Sequenz-Datenbanken zugänglichen A- Domänen. Nachfolgend wurden für jede A-Domäne nur diese zehn Reste als eigenständige Aminosäure-Sequenz verwendet, um Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit dem Programm MegAlign von Lasergene (erhältlich zB. GATC, GmbH. Fritz-Arnold Str. 23, D-78467 Konstanz) durchzuführen. Mittels dieser Untersuchungen wurde ein phylogenetischer Stammbaum erhalten (Figur 2), in dem sich eine Gruppierung der 10 Aminosäuregroßen Sequenzen, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen offenbart. Dieses Ergebnis gibt einen eindeutigen Hinweis darauf, daß die ausgewählten Reste tatsächlich in die Substraterkennung involviert sind. Basierend auf diesen Untersuchungen können Diskrepanzen zwischen postulierten und beobachteten Substratspezifitäten von A-Domänen erklärt und die Spezifitäten von NRPS- Systemen vorhergesagt werden.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand in einem Verfahren zur Modifikation von A-Domänen zwecks Bereitstellung und Herstellung entsprechend modifizierter nicht-ribosomaler Peptidsynthetika zur Herstellung von neuen Peptiden. Die Erfindung erlaubt die gezielte Herstellung eines gewünschten nicht-ribosomalen Peptids. Überraschenderweise konnte anhand den phylogenetischen Studien Konsensus- Sequenzen abgeleitet werden, die als der nichtribosomale Kode der NRPS zu verstehen sind (Tabelle 1 ). Ähnlich wie der ribosomale Kode ist dieser Kode degeneriert (redundant), und es konnten bisher z.B. vier verschiedene Kodone für Leu-aktivierende Domänen, drei Kodone für Val- und zwei für Cys-aktivierende Domänen identifiziert werden. Es kann davon ausgegangen werden, daß auch für andere Substrate mehrere Strategien zur Substraterkennung existieren, die mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens bestimmt werden können.
Daher ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung der nicht-ribosomale Code, repräsentiert in Tabelle 1 , kodierend für ein nicht-ribosomales Peptid.
Anhand der durch Sequenzvergleiche ermittelten „Kodone" kann die generelle Gestalt von Substrat-Bindungstaschen vorhergesagt werden. Als Beispiele sind in Figur 3 die putativen Bindungstaschen für die Substrat-Aminosäuren Asp, Orn und Val dargestellt. Während Asp235 und Lys517 in allen A-Domänen Schlüssel- Wechselwirkungen mit der Amino- und Carboxygruppe des Substrates vermitteln und daher hochkonserviert sind, wird von den übrigen Resten angenommen, daß sie maßgeblich die Spezifität für eine bestimmte Aminosäure-Seitenkette determinieren. Die entsprechenden Reste (Pos. 236 bis 331 ) in den drei gegebenen Beispielen untermauern diese Theorie und spiegeln perfekt die Bedürfnisse bezüglich der Polarität und Größe der aktivierten Substrate wider.
(1 ) Asp-Aktivierung (Kodon 'Asp'): Der basische Rest His322 (eventuell auch Lys278) etabliert eine polare Wechselwirkung mit der aciden Seitenkette, wohingegen der Rest Leu236 die Bindungstasche für die Aufnahme von längerkettigen Substraten (z.B. Glu) verschließt.
(2) Orn-Aktivierung (Kodon Orn(2)'): Die aciden Reste Glu278 und Asp331 scheinen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung der großen basischen Seitenkette zu spielen. (3) Val-Aktivierung (Kodon Nal(3)'): Die gesamte Bindungstasche wird durch hydrophobe Reste aufgebaut. Dem durch die Verzweigung der ß-Position entstehenden relativ großen Raumbedarf wird (1 ) durch die Verwendung kleinerer Seitengruppen im oberen Bereich, sowie (2) räumlich anspruchsvoller Reste im unteren Bereich, die die Bindungstasche ausweiten, Rechnung getragen.
Neben der Degenerierung besteht eine weitere Homologie zum ribosomalen Kode im Auftreten von flexiblen (Wobble-ähnlichen) Positionen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind die Positionen 278, 299 und 331 solche Wobble-ähnlichen Reste, die innerhalb bestimmter Kodone eine erhöhte Flexibilität aufweisen. Allgemein wird beobachtet, daß Bindungstaschen die kleinere Aminosäuren erkennen eine höhere Flexibilität bei Positionen nahe des Bodens der Tasche aufweisen, wohingegen bei großen Substraten eine größere Variabilität im oberen Bereich beobachtet wird (siehe Tabelle 1 ).
Die Ergebnisse der in silico Studien, die in Figur 3 und Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß die einzelnen Konstituenten einer Bindungstasche unterschiedliche Signifikanz für die Ausbildung einer bestimmten Substratspezifität besitzen. Um diese Beobachtung zu bestätigen wurden die Reste von 160 Bindungstaschen genauer untersucht. Die in Figur 4 und Tabelle 2 dargestellten Resultate zeigen, daß sich die zehn Konstituenten einer Bindungstasche in drei Gruppen einteilen lassen. Ihre ungleichmässige Variablität spiegelt wahrscheinlich ihre unterschiedliche Bedeutung bei der Vermittlung der Substratspezifität wider:
(1 ) 'Invariante' Positionen (Pos. 235 und 517): Asp235 ist lediglich in A- Domänen, die Substrate ohne α-Aminogruppe aktivieren, abwesend. Beispiele hierfür sind z.B. die α-Aminoadipat aktivierenden Domänen der AcvA-Synthetasen oder die Carboxysäure-aktivierenden Domänen der Enterobactin- (Escherichia coli) und Yersiniabactin-Systeme (Yersinia pestis). Lys517 ist dagegen absolut invariant und bindet sowohl die α-Carboxygruppe der kognaten Aminosäure, als auch das 04' und 05' der ATP/AMP-Ribose-Einheit, wodurch vermutlich beide Substrate in eine Position optimaler Interaktion gebracht werden. Beide Reste vermitteln also wichtige Wechselwirkung mit den (weitgehend) unveränderlichen α-Amino- und α- Carboxygruppen des Substrates, wodurch ihre eigene Invarianz erklärt werden kann.
(2) 'Bedingt Variante' Positionen (Pos. 236, 301 und 330): Diese Reste zeigen innerhalb aller untersuchten Domänen eine nur geringe Variabilität und in 93% aller Fälle werden hydrophobe Aminosäuren an diesen Positionen realisiert. Unter Berücksichtigung der geringen Flexibilität dieser Positionen und des unverhältnismäßig geringen Auftretens von geladenen oder polaren Seitenketten kann eine essentielle Bedeutung bei der Vermittlung der Substratspezifität ausgeschlossen werden.
(3) 'Höchst Variante' Positionen (Pos. 239, 278, 299, 322 und 331 ): Diese Positionen weisen die höchste Flexibilität in Bezug auf die verwendeten Aminosäuren auf. Abgesehen von Pos. 299 und 331 , die generell sehr adaptiv und Wobble-ähnlich zu sein scheinen (vgl. Tabelle 1 ), sind alle Positionen für die Etablierung der Substratspezifität prädestiniert. Unter Berücksichtigung ihrer relativen Lokalisation innerhalb der Bindungstasche und der in Tabelle 1+2 sowie Figur 3 gezeigten Daten, kann angenommen werden, daß die Position 322 einen größeren Einfluß auf kleinere Substrat-Reste ausübt, wohingegen die Positionen 239 und 278 eher größere Reste beeinflussen. Diese Hypothese wird z.B. durch die Kodone der Asp- (His322), Glu- (Lys239) und Orn- (Glu278) aktivierenden A- Domänen untermauert (Tabelle 1 +2). In allen genannten Beispielen sind die Polarität des erkannten Substrates und 'höchst varianter' Positionen der Bindungstasche perfekt gekoppelt (vgl. Tabelle 2; dunkelgraue Unterlegung).
Die veränderte DNA wird nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren im Wirtsorganismus chromosomal oder extrachromosomal implantiert (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in den Patentansprüchen angeführten Ausführungsformen. Zur experimentellen Bestätigung mutierten wir mehrere der Spezifität-vermittelnden Aminosäure-Konstituenten der Bindungstasche von PheA und untersuchten die Mutanten auf resultierende Veränderung in (1 ) der Rate des ATP-Pyrophosphat- Austauschs (Enzymaktivität) und (2) der Aktivierung von mis-kognaten Aminosäuren (Enzymspezifität). Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt sollte nicht unerwähnt bleiben, daß das Wildtyp-Protein von vornherein eine signifikante Aktivierung der mis-kognaten Substrate Trp (18%) und Leu (7%) zeigte. Die Ergebnisse unserer PheA-Mutagenese-Experimente sind in Tabelle 3 zusammengefaßt und können wie folgt generalisiert werden:
(1 ) Die Substitution gegen etwas größere Aminosäuren ging zwangsläufig auf Kosten des zur Verfügung stehenden Raumes in der Bindungstasche. Als Folge hiervon sank die ATP-Pyrophosphat-Austauschrate dieser Mutanten, während ihre Spezifität für das kognate Substrat Phenylalanin anstieg (z.B. T278M, T278Q, A301V, A322S und C331 L). In allen Fällen konnte die Seitenspezifität für die mis- kognaten Substrate Trp und Leu um einen Faktor 20 reduziert werden.
(2) Das genaue Gegenteil wurde für Austausche gegen etwas kleinere Gruppen beobachtet, die die Bindungstasche geringfügig erweiterten. In diesen Mutanten konnte die kataiytische Aktivität des Wildtyp-Proteins herübergerettet werden, während die Fähigkeit, mis-kognaten Substrate zu diskrimieren, um bis das 5-fache herabgesetzt wurde (z.B. A301G, A322G und I330V).
(3) Die Mutation der 'höchst Varianten' Seitenketten (Pos. 239, 278, 322 und 331 ) verursachten einen bis zu 5-fachen Verlust an Enzymaktivität (z.B. W239L, T278M und C331L). Die Einführung polarer oder geladener Seitengruppen veränderten die Gesamtpolarität der Bindungstasche, wodurch das entsprechende Enzym quasi vollständig inaktiviert wurde (z.B. A322D, A322K und A322N).
(4) Die beobachtete Zunahme der Aktivierung eines bestimmten mis-kognaten Substrates war aufgrund des Spezifität-Kodes (Tabelle 1 ) vorhersagbar. Beispielsweise blieb die Aktivität und Spezifität für Phe in der Mutante PheA(l330V) unbeeinflusst, doch offenbarte dieses Konstrukt eine signifikante Erhöhung der Aktivierung der mis-kognaten Substrate Trp und Tyr. Interessanterweise besitzen alle Trp- und Tyr-aktivierenden Domänen ein Valin an Position 330. Ein ähnlicher Zusammenhang konnte auch, wie nachfolgend gezeigt, für Mutationen in Richtung des 'Leu(4)'-Kodons (Tabelle 1 ) beobachtet werden.
'Phe'- und 'Leu(4)'-Kodon (Tabelle 1 ) besitzen eine etwa 60%-ige Homologie und Hauptunterschiede betreffen die Positionen 278, 301 und 322 (bemerke: zwei-von- drei Positionen sind 'höchst Variante' Gruppen). Dementsprechend wurde vermutet und anschließend auch experimentell bestätigt, daß Punktmutationen in Richtung des 'Leu(4)'-Kodons (→ T278M and A301 G) eine erhöhte Aktivierung von Leucin zeigen (Tabelle 3). Interessanterweise, ist für die Mutante PheA(T278M) die kataiytische Effizienz für die unspezifische Aktivierung von L-Leu quasi unbeeinflußt (gleiches Vmax), während gleichzeitig die Aktivität für die kognaten Substrate (D- und L-Phe) eine etwa 3-fache Erniedrigung erfuhr. Das genaue Gegenteil wurde für die Mutante PheA(A301G) beobachtet. Hier blieb das Vmax für die Aktivierung von Phenylalanin unbeinflußt, während gleichzeitig die kataiytische Aktivierung von L- Leu quasi um das zweifache anstieg. All diese Änderungen der Substratspezifität und -aktivität waren signifikant, reproduzierbar und deutlich oberhalb der Standardabweichung. Wie nur drei Unterschiede im Kodon eine Unterscheidung zwischen Phenylalanin und Leucin ermöglichen ist derzeit noch unklar, doch zumindest für die Pos. 301 kann vermutet werden, daß hier aufgrund von Unterschieden in der räumlichen Ausdehnung einer CH- (Phe) versus CH3-Gruppe (Leu) in der δ-Position der entsprechenden Aminosäure diskrimiert wird. Alle Domänen, die Substrate mit sterisch anspruchsvollen γ- or δ-Positionen aktivieren, besitzen die kleinstmögliche Seitengruppe (Gly) in Position 301 (Tabelle 2 und 3).
Um die Substratspezifität von PheA vollständig zu Leucin zu verändern, konstruierten wir die Doppelmutante PheA(T278M/A301G). Das Kodon dieser Mutante zeigt eine Ähnlichkeit von ca. 80% zum 'Leu(4)'-Kodon (vgl. Tabelle 1) und ist im phylogenetische Baum in unmittelbarer Nähe zu Leu-aktivierenden Domänen zu finden (Figur 2; mittelgraue Unterlegung). Wie in Figur 5A gezeigt, aktiviert dieses Konstrukt tatsächlich bevorzugt Leu, und zwar mit einer katalytischen Effizienz, die dem Wildtyp-Enzym in nichts nachsteht bzw. dessen Aktivität sogar übertrifft (Aktivität der Mutante für L-Leu: kcat/Km = 86 mM-1 min-1 , Wildtyp-Aktivität für L- Phe: 69 mM-1 min-1 ; Tabelle 4). Es konnte ein mindestens 30-facher Zuwachs der L-Leu-spezifischen Aktivierungseffizienz festgestellt werden. Erstaunlicherweise war die Doppelmutante nur geringfügig in der Aktivierung von D-Phe beeinträchtigt, wohingegen die kataiytische Effizienz für die Aktivierung des anderen Stereoisomers, L-Phe, eine signifikante, ca. 7-fache Verringerung erfuhr (Figur 5A und Tabelle 4). Für das Wildtyp-Protein PheA konnte im Gegensatz dazu gezeigt werden, daß die Wechselwirkungen des Proteins mit beiden Liganden, L- und D- Phe, fast identisch sind. Wie in Figur 1 B gezeigt, ist der Benzyl-Ring der Seitengruppe von D-Phe um etwa 30° relativ zum L-Phe-Ring gedreht, woraus eine geringfügige Verlagerung der relativen Position des ß-C-, aber nicht des α-C-Atoms resultiert.
Wir veränderten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Spezifität einer A- Domäne, deren Kristallstruktur noch nicht aufgeklärt ist. Als Ausgangspunkt dieses Experiments diente die Feststellung, daß die ermittelten Kodons von Asp- und Asn- aktivierenden Domänen sehr ähnlich sind (ca. 80 %; vgl. Tabelle 1 ), und die Hauptunterschiede die Positionen 322 (His vs. Glu; eine 'höchst Variante' Gruppe) und 330 (Val vs. Ile; eine 'bedingt Variante' Gruppe) betreffen. Demzufolge wählten wir die Asp-aktivierende A-Domäne des umfassend charakterisierten Surfactin- Biosynthesekomplexes [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8:821-831] und unternahmen den Versuch, ihre Spezifität in Richtung Asparagin zu verändern. Für das Wildtyp-Protein AspA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Asp, aber nicht L-Asn, mit einer moderaten Aktivität (Wildtyp-Aktivität für L-Asp: kcat/Km = 10 mM-1 min-1 ; vgl. Figur 5B und Tabelle 4) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante AspA(H322E) eine hohe Selektivität für L-Asn (Figur 5B), wenngleich diese Spezifitätsänderung mit ihrer Abnahme der katalytischen Aktivität (Faktor 10) verbunden war (Aktivität der Mutante für L-Asn: kcat/Km = 1 mM-1 min-1 ; Tabelle 4). Somit konnte also mit dem Konstrukt AspA(H322E) gezeigt werden, daß eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden kann. Die Mutante AspA(H322E) zeigte übrigens darüber hinaus auch eine etwa 5-fache Erhöhung der Aktivierungseffizienz für ähnlich-große, aliphatische Asn-Analoga, wie z.B. Ile, Leu und Val.
Die etwa 70-fache Zunahme der Effizienz der L-Asn-spezifischen Aktivierung konnte durch die Einführung einer He330Val-Punktmutation weiter gesteigert werden. Hierdurch wurde zugleich eine kataiytische Aktivität der nunmehr Asn aktivierenden Domäne erreicht, die im selben Größenordnungsbereich der ursprünglichen AspA- Domäne lag.
Bei der Analyse der Kodone von Glu- und Gln-aktivierenden Domänen zeigte sich, daß auch diese Domänen sehr ähnliche Kodone realisieren (Tabelle 1). Der Hauptunterschied betrifft die Position 239 (Lys vs. Gin; eine 'höchst Variante' Gruppe). Wir wählten daher die Glu-aktivierende Domäne des Surfactin- Biosynthesekompleses (SrfA-A1 ) und unternahmen den Versuch die Spezifität in Richtung Glutamin zu verändern. Für das Wildtyp-Protein GluA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Glu, aber nicht L-Gln, mit einer moderaten Aktivität (kcat/Km = 25 mM-1 min-1 ) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante GluA(K239Q) eine hohe Selektivität für L-Gln, bei einer gleichzeitig nur geringfügig herabgesetzten, katalytischen Aktivität (kcat/Km = 20 mM-1 min-1 ). Dieses Ergebnis durfte aufgrund der Kodone der Mutante und Gin-Domänen erwartet werden und zeigt, daß auch mit dem Konstrukt GluA(K239Q) eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden konnte.
Nachfolgend wird gezeigt, daß die veränderte Substratspezifität einer A-Domäne auch zur in vivo Synthese eines Peptides mit veränderter Primärstruktur ausgenutzt werden kann. Exemplarisch wurde hierzu das Genfragment der Asn-spezifischen Doppelmutante AspA(l330V/H322E) mittels homologer Rekombination ins Chromosom des Surfactin-Produzenten B. subtilis ATCC 21332 transferiert. Diese Integration erfolgte mit Hilfe einer Zweistufen-Rekombinationsmethode [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257:308-318] und führte zur Substitution von aspA' gegen aspA(H322A/l330V)' im srfA-B-Gen des Surfactin-Biosynthese-Operons. Die Identität dieses Klones, B. subtilis Asn-5, wurde durch PCR-Amplifikation des mutierten asp(H322E/l330V)'-Genfragments aus dessen Chromosom und anschließende DNA-Sequenzanalyse des Amplifikates verifiziert.
Das Biosurfactant Surfactin ist ein Lipoheptapeptid mit variablem ß- Hydroxyfettsäure-Anteil (6-9 Methylengruppen), das am Übergang zur stationären Wachstumsphase produziert und ins Kulturmedium sekretiert wird. Entsprechend wurden zum Nachweis des modifizierten Lipoheptapeptide die B. subtilis-Stämme ATCC 21332 und Asn-5 fermentiert, und Wildtyp- und [Asn-5]Surfactin aus ihren Kulturüberständen präpariert. Die nachfolgende HPLC-MS-Analyse zeigte, daß das [Asn-5]Surfactin im Vergleich zum Wildtyp (1 ) in gleicher Quantität produziert wurde, (2) eine längere Retentionszeit besaß, und (3) in der ESIMS-Analyse einen Massenunterschied von 1 Da aufwies. Diese Massendifferenz war signifikant, und im negativen lonenmodus konnten lonenserien in einer 14er-Abstufung (variabler Fettsäure-Anteil) für den Wildtyp bei m/z 992 bis 1.034, sowie für die Mutante bei m/z 991 bis 1.033 determiniert werden. Dieser Befund ist, gemeinsam mit der reduzierten hämolytischen Aktivität des [Asn-5]Surfactins, als eindeutiger Hinweis auf die Substitution einer Carboxy- (Asp-5; Wildtyp) gegen eine Carbamid-Gruppe (Asn-5; Mutante) im Surfactin anzusehen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß durch die gezielte Veränderung der Substratspezifität einer A- Domäne innerhalb einer katalytischen NRPS-Matrize auch das korrespondierende Peptidprodukt in vivo verändert werden konnte.
Grundsätzlich sieht das erfinderische Verfahren zur gezielten Synthese von Peptiden so aus:
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich ausgehend von einem natürlich auftretenden, funktionell aktiven NRPS-System durch gerichtete Punktmutationen innerhalb der A-Domänen jede Aminosäureposition des gebildeten nichtribosomal Produktpeptides gezielt zu verändern. Hierzu wird zunächst die DNA der zu verändernden A-Domäne aus dem Chromosom des Produzentenorganismus amplifiziert und in einen E. coli His-tag-Expressionsvektor kloniert. Mit Hilfe dieses Konstruktes ist es nun möglich ausreichende Mengen an funktioneil aktivem A- Domänenprotein zu produzieren, aufzureinigen sowie in vitro auf seine Substratspezifität zu untersuchen. Im folgenden können nun in die rekombinante A- Domänen-DNA gerichtet Punktmutationen eingeführt werden, die gemäß Tabellel) zu einer Veränderung der Substratspezifität führen. Zur Verifizierung dieser Änderung werden die mutierten A-Domänen zunächst in E. coli überexprimiert, aufgereinigt und in Bezug auf ihre Substratspezifität untersucht. Kann hierdurch die zu erwartende Spezifitätsänderung bestätigt werden, wird die mutierte A-Domänen DNA über homologe Rekombination gegen die native A-Domänen-DNA im Chromosom des Produzentenorganismus ausgetauscht. Der so erzeugte Produzentenstamm mit mutierter A-Domäne kann nun zur Produktion des veränderten nichtribosomalen Peptides eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, um die Spezifität und/oder Aktivität bekannter biologisch aktiver Peptide zu beeinflussen. Hierzu werden aufgrund des aufgefundenen Codes, bestimmte A-Domänen so verändert, daß die mit Hilfe der veränderten NRPS synthetisierten Peptide die gewünschten Eigenschaften besitzen. Beispielhaft sei hier die Vebesserung der Löslichkeit erwähnt, die durch den Austausch von hydrophoben gegen hydrophile Aminosäuren und umgekehrt erfolgen kann.
Die erfindungsgemäßen Ergebnisse erlauben auch eine gezielte Vorhersage von Substratspezifitäten bereits sequenzierter NRPS-Gene, deren Funktion aber noch nicht bestimmt wurde. Dies gewinnt im Rahmen der durch diverse Genom- Sequenzierungsprojekte stetig zunehmenden Sequenzmengen immer mehr an Bedeutung. So ist es mit dem hier beschriebenen Verfahren z.B. möglich aus der DNA-Sequenz eines NRPS-Clusters die putative Struktur des gebildeten Produktpeptides vorherzusagen. Somit ist eine anschließende Struktur-Funktionsanalyse derartiger Gene sehr erleichtert.
Zur Ableitung der Substratspezifität einer NRPS-A-Domäne mit bekannter DNA- Sequenz wird zunächst ein Sequenzvergleich mit der DNA-Sequenz von PheA durchgeführt. Hierdurch können die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstasche der zu untersuchenden A-Domäne identifiziert werden. Diese zehn Reste werden nun nachfolgend als eigenständige Aminosäuresequenz in Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit den zehn Resten der Bindungstasche sämtlicher anderen, bekannten A-Domänen eingesetzt. Hierbei ergibt sich eine strikte Gliederung der Sequenzen bezüglich der Substratspezifität der zugehörigen A-Domänen. Somit kann über das Gruppierungsverhalten die Substratspezifität der zu untersuchenden A-Domäne bestimmt werden kann.
Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Erkenntnisse wird es auch möglich aus den bekannten DNA-Sequenzen für bestimmte A-, C- und T-Domänen, sowie ggfls. anderen Domänen - wie in Mahariel et al.(supra) beschrieben - NRPS zu synthetisieren, die nicht von natürlichen Synthetasen abgeleitet sind.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne sie auf diese einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
PCR Amplifikation und Klonierung der PheA- und AspA-Mutanten. Alle PheA-Mutanten wurden mittels inverser PCR durch gerichtete Mutagenese im Plasmid pPheA erzeugt. Die PCR-Amplifikation des gesamten Plasmides erfolgte mit dem Εxpand Long-Range PCR' System (Boehringer Mannheim; Mannheim, Deutschland, Katalognr.: 1681842) unter Einhaltung des Hersteller-Protokolls. Die folgenden, 5'-phosphorylierten Oligonukleotide (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurden verwendet (die jeweils mutierten Kodone sind unterstrichen): (Seq ID-NO: 1 ) 3'-A236: 5'-ATC AAA AGA GAT GCT GGC A-3'; (Seq ID-NO: 2) 5'- A236L: 5'-TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3'; (Seq ID-NO: 3) 3'-W239: 5'- TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3"; (Seq ID-NO: 4) 5'-W239G: 5'-GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3'; (Seq ID-NO: 5) 5'-W239L: 5'-TTA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA-3'; (Seq ID-NO: 6) 3'-T278: 5'-AAT AAC AGT GAT TTC CTT TTG G-3'; (Seq ID-NO: 7) 5'-T278M: 5'-ATG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID-NO: 8) 5'-T278Q: 5'- CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID- NO: 9) 3'-l299: 5'-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3'; (Seq ID-NO: 10) 5'- I299T: 5'-ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3'; (Seq ID-NO: 11 ) 3'-A301G: 5'-TCC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID-NO: 12) 3'-A301V: 5'-AAC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID-NO: 13) 5'-A301 : 5'-GGC TCA GCT ACC TCG CCT-3'; (Seq ID-NO: 14) 3'-A322: 5'-AAT GTA AGT TAC TTT CTC CTT C-3'; (Seq ID-NO: 15) 5'-A322D: 5'-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 16) 5'-A322E: 5'-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 17) 5'- A322G: 5'-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 18) 5'-A322l: 5'-AAT ATT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 19) 5'-A322K: 5'-AAT AAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 20) 5'-A322N: 5'-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 21 ) 5'-A322Q: 5'-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 22) 5'-A322S: 5'-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 23) 3'-l330: 5'-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3'; und (Seq ID-NO: 24) 5'-l330V: 5'-GTT TGT GCG ACT ACA TGG G-3'.
Die PCR-Amplifikate wurden mit dem 'QIAquick-spin PCR purification'-System (Qiagen; Hilden, Deutschland, Katalognr.: 28104) aufgereinigt, ihre kohäsiven Enden geglättet und nachfolgend intramolekular ligiert. Die Zugabe der Restriktionsendonuklease Dpnl (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E0302Z), die eine methylierte Erkennungssequenz benötigt, gestattete einen gezielten Abbau der PCR-Matrize (pPheA; aufgereinigt aus einem dam+- Escherichia coli-Stamm) und damit die Vermeidung von falsch-positiven Klonen. Für alle DNA-Manipulationen sowie die Präparation der rekombinaten Plasmide aus E. coli XL-1-blue (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 200268) kamen Standardmethoden zum Einsatz [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. Durch die Klonierung der PCR-Amplifikate konnten die folgenden Plasmide erhalten werden: pPheA(A236L) (durch Verwendung der Oligonukleotiden Seq ID-NO: 1 und Seq ID-NO: 2), pPheA(W239G) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 4), pPheA(W239L) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 5), pPheA(T278M) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 7), pPheA(T278Q) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 8), pPheA(l299T) (Seq ID-NO: 9 plus Seq ID-NO: 10), pPheA(A301 G) (Seq ID-NO: 11 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A301V) (Seq ID-NO: 12 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A322D) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 15), pPheA(A322E) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 16), pPheA(A322G) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 17), pPheA(A322l) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 18), pPheA(A322K) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 19), pPheA(A322N) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 20), pPheA(A322Q) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 21 ), pPheA(A322S) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 22) und pPheA(l330V) (Seq ID-NO: 23 plus Seq ID-NO: 24). Die Identität aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierungen an einem 'ABI prism 310 Genetic Analyzer' (ABI; Weiterstadt, Deutschland, Best.-Nr.: 310-A) überprüft und bestätigt.
Das für die Aspartat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-B kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO:25) δ'-AspA: 5'-AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3' und (Seq ID-NO:26) 3'-AspA: 5'-AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s.o.), mit den Restriktionsenzymen Ncol und BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1160Z u. E1010Y) verdaut und in den gleichermaßen präparierten Ηis-tag'-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pAspA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s.o.): (Seq ID-NO:27) 5'-AspA(H322E): 5'-TAA TGA GTA CGG CCC GAC AGA AGC-3' (Seq ID-NO:28) und 3'-AspA(H322E): 5'-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3'. Das resultierende Plasmid pAspA(H322E) diente nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E/l330V) mittels inverser PCR mit den folgenden Primern (Seq ID-NO:29) 5'-AspA(l330V): 5'- TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3' und (Seq ID-NO:30) 3'-AspA (I330V): 5'-CTG TGG GCC CGT ACT CAT TAA TAA ATT CGG-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA-Sequenzierungen überprüft und bestätigt. Das für die Glutamat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-A kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO:31 ) 5'-GluA: 5'-TAT GGA TCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3' und (Seq ID-NO:32) 3'-GluA: 5'-TAT GGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT -3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s.o.), mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1010Y) verdaut und in den mit Bglll (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1021Y) geschnittenen 'His-tag'-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pGluA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pGluA(K239Q) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s.o.): (Seq ID- NO:33) 5'-GluA(K239Q): 5'- GTG CAG CAA ATC TTC GCG TCG CTT C-3' und (Seq ID-NO:34) 3'-GluA(K239Q): 5'-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA-Sequenzierungen überprüft und bestätigt.
Beispiel 2
Expression und Aufreinigung von Adenylierungsdomänen (Wildtyp und Mutanten). Die Expression der (mutierten) Genfragmente sowie die Aufreingung der resultierenden His6-Fusionsproteine wurde, wie an anderer Stelle beschrieben [Mootz et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850], durchgeführt. Die Ligation in die BamHI-Schnittstelle von pQE60 führte jeweils zur Fusion der Aminosäure-Sequenz "GSRSHHHHHH" an den Carboxy-Terminus des jeweilgen rekombinanten Proteins. Mittels SDS-PAGE konnte gezeigt werden, daß die meisten Proteine annäherend homogen mittels Ni2+-Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden konnten; zwei Konstrukte jedoch waren unlöslich (vgl. Tabelle 3). Fraktionen, die das jeweilige rekombinante Protein enthielten, wurden vereinigt und gegen Assay-Puffer dialysiert (50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Dithioerythritol (DTE) und 1 mM EDTA). Nach Zugabe von 10% Glycerin (v/v) konnten die Proteine, ohne erkennbaren Verlust ihrer katalytischen Aktivität, bei - 80°C gelagert werden. Die Protein-Konzentration der verschiedenen Lösungen wurde mit Hilfe der berechneten Extinktionskoeffizienten bei 280 nm (A280nm) ermittelt: 64060 M-1 cm-1 für PheA und alle PheA-Mutanten außer PheA(W239Xaa), 58370 M-1 cm-1 für PheA(W239Xaa), sowie 39780 M-1 cm-1 für AspA und AspA(H322E) und 35490 M-1 cm-1 für GluA und GluA(K239Q).
Beispiel 3
ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion.
Die ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion wurde durchgeführt, um sowohl die kataiytische Aktivität als auch die Spezifität der aufgereinigten, rekombinanten A- Domänen zu [Mootz & Marahiel, 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. Hierbei wurde die Spezifität jeweils mit allen 20 proteinogenen Aminosäuren, sowie zusätzlich L- Ornithin und D-Phenylalanin, überprüft. Die Reaktionsmischungen enthielten (Endvolumen: 100 μL): 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM DTE, 1 mM EDTA, 0 bis 2 mM Aminosäure, sowie 250 nM Enzym. Die verschiedenen Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 mM ATP, 0.2 mM Natriumpyrophosphat und 0.15 μCi (16.06 Ci/mmol) Natrium-[32P]pyrophosphat (NEN/DuPont; Deutschland; Best.-Nr.: NEX019) initiiert und für 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend konnten die Austauschreaktionen durch Zugabe von 0.5 mL Stopp-Lösung abgestoppt werden: 1.2% (w/v) Aktiv-Kohle, 0.1 M Natriumpyrophosphat und 0.35 M Perchlorsäure. Die Aktiv-Kohle wurde durch Zentrifugation abgetrennt, einmal mit 1 mL bidestilliertem Wasser gewaschen und in 0.5 mL Wasser resuspendiert. Nach Zugabe von 3.5 mL Szintillationsflüssigkeit (Rotiscint Eco Plus; Roth; Art.-Nr.:0016.2) konnte die Kohle-gebundene Radioaktivität an einem Szintallationsmeßgerät (1900CA Tri-Carb 'liquid scintillation analyzer'; Packard) bestimmt werden.
Beispiel 4
Computeranalyse zur Ermittlung der putativen Substrat-Bindungstaschen. Protein-Sequenzen von 160 A-Domänen wurden von öffentlich-zugänglichen Datenbanken (z.B. http//www.ncbi. nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide. html) bezogen und auf den ca. 100 Aminosäuren großen Bereich zwischen den Core-Motiven A4 und A5 reduziert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Diese Sequenzen wurden nachfolgend, mittels des Unterprogramms MegAlign aus dem DNAStar- Programmpaket, im Bezug auf Sequenzhomologien ausgerichtet, wobei die Methode 'clustal' in ihrer Grundeinstellung zum Einsatz kam. Der einzige Zweck dieser ersten Ausrichtung war es, die anschließende Zuordnung der Konstituenten der putativen Substrat-Bindungstaschen zu erleichtern. Diese Zuordnung konnte letztendlich durch die Berücksichtigung ihrer Lage, relativ zu hoch-konservierten Sequenzmotiven (Core-Motive A4 und A5, sowie die Motive TPS' und 'GE'; strukturelle 'Anker') getroffen werden. Alle Sequenzen wurden nachfolgend auf die ermittelten Konstituenten der Bindungstaschen zurecht gestutzt, und neue Ausrichtungen und phylogenetische Untersuchungen wurden mit diesen lediglich zehn Aminosäuregroßen Bereichen durchgeführt. Eine Gruppierung der kodierenden Sequenzen gemäß der Substratspezifität ihrer Herkunftsdomänen konnte mit jeder Methode und jedem Parameter-Satz erzielt werden. Der in Figur 2 gezeigte phylogenetische Baum wurde mit der Methode von Jotun Hein, unter Anwendung der folgenden Parameter, ermittelt: gap penalty 12, gap length penalty 6, und Ktuple 2.
Beispiel 5
Integration des AspA(H322E/l330V)-kodierenden Genfragments ins Chromosom von B. subtilis AS20.
Um das Potential unserer Methode zur in vivo Synthese von gerichtet-modifizierten Peptidantibiotika unter Beweis zu stellen, wurde das kodierende Genfragment der AspA-Doppelmutante (Asp(H322E/l331V) in das srfA-Biosynthese-Operon von B. subtilis [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8:821-831] eingebracht. Für die Konstruktion des hierzu benötigten Integrationsplasmids mußte zunächst das entsprechende srfA-B-Genfragment, das für das Asp-aktivierende Modul kodiert (Basenpaar 14195-18200; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8:821-831]), mittels PCR aus dem Chromosom von B. subtilis ATCC 21332 amplifiziert werden (unterstrichen: Restriktionsendonuklease-Schnittstellen): (Seq ID-NO:35) 5'-homo Asp(Clal): 5'-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG -3'; und (Seq ID-NO: 36) 3'- homo Asp (Spei): 5'-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGC CCA GT -3'. Das resultierende Amplifikat wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen Clal und Spei (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E11034Y u. E1086Z) verdaut und in den gleichermaßen präparierten Vektor pBluescript SK(-) kloniert (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 212206) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pSK-homoAsp, aus dem nachfolgend mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Pstl (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1040Y u. E1073Y) ein ca. 1.3 kb-großes aspA'-Fragment (Basenpaar 15212-16559; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8:821-831]) herausgeschnitten und gegen das komplementäre, zweifach mutierte Fragment aus pAspA(H322E/l33V) ersetzt wurde. Die Identität des resultierenden Integrationsplasmids pSK-homoAsp(H322E/l330V) konnte durch DNA- Sequenzierung bestätigt werden.
Zur Integration des mutierten aspA'-Fragmentes in das Surfactin-Biosynthese- Operon wurde auf eine bewährte Ko-Transformationstechnik ('congression') zurückgegriffen [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257:308-318]. Als Wirt diente der B. subtilis Stamm AS20 [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257:308-318], in dem das aspA'-Fragment (Basenpaar: 15245-17177; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8:821-831]) deletiert und gegen das Chloramphenicoltransferase-Gen substituiert wurde. B. subtilis AS20 wurde für eine DNA-Aufnahme kompetent gemacht und mit dem Intergrationsvektor pSK- homoAsp(H322E/l330V) sowie dem Helferplasmid pNEXT33A ko-transformiert [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257:308-318]. Das letztgenannte Helferplasmid vermittelte hierbei über sein Neomycin-Resistenzgen zunächst eine positive Selektion, und die erhaltenen Klone konnten anschliessend auf den Verlust ihrer Chloramphenicol-Kassette und damit die Integration des aspA(H322E/l330V)'- Genfragments untersucht werden. Über eine PCR-Amplifikation dieses Bereiches aus dem Chromosom der selektionierten Klone, sowie eine anschließende DNA- Sequenzierung, konnte die Identität des konstruierten Klons B. subtilis Asn-5 verifiziert werden.
Beispiel 6
Surfactin-Präparation und -Analyse.
Die Präparation des Surfactin-Derivats aus B. subtilis Asn-5 erfolgte nach einem
Standardverfahren [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257:308-318]. Zur
Analyse wurde die erhaltene methanolische Lösung mittels eines ΗP1100 Series
LC/MSD' HPLC-System unter Verwendung einer PepRPC HR 5/5-Säule Säule (Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Best.-Nr.: 18-0383-01 ) aufgetrennt. Die Separation der einzelnen Komponenten wurde bei einer Flußrate von 0.7 mL min-1 durch Anlegen eines linearen Gradienten von 35% bis 70% Acetonitril (v/v) in 0.1% Trifluoressigsäure (v/v) erzielt. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 214 nm und durch eine massenspektrometrische Online-Analyse der eluierten Substanzen. Als Kontrolle wurde eine Präparation aus dem Wildtyp-Surfactin- Produzenten B. subtilis ATCC 21332 analog aufgearbeitet und analysiert.
Beschreibung der Figuren:
Figur 1 : Strukturelle Basis für die Erkennung und Aktivierung von Phenylalanin (aus Conti et al. [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183]). (A) Das Bänder-Diagramm zeigt, daß PheA aus zwei Faltungsdomänen, einer großen N-terminalen (unten) und einer kleineren C-terminalen (oben), besteht. AMP und die Substrat-Aminosäure Phenylalanin sind schwarz gezeigt. (B) Die Bindungstasche für Phenylalanin wird von zehn Aminosäuren gebildet. Asp235 und Lys517 vermitteln elektrostatische Wechselwirkungen (gestrichelte Linien) mit der α-Amino- und α-Carboxylgruppe des Substrates. Die eigentliche Bindungstasche, die die spezifische Erkennung der Phenylalanin-Seitengruppe ermöglicht, wird durch Ala236, Ile330 und Cys331 auf der einen, sowie Ala322, Ala301 , 1299 und Thr278 auf der anderen Seite gebildet. Beide Seiten werden am unteren Ende durch den Indol-Ring des Trp239 voneinander getrennt gehalten. Diese Architektur gestattet es der Bindungstasche von PheA beide Stereoisomere, L-Phe (hellgrau) und D-Phe (dunkelgrau) ohne erkennbare Änderung der Konformation aufzunehmen.
Figur 2: Phylogenetischer Baum, konstruiert mit den zehn Spezifität-vermittelnden Aminosäuren der A-Domänen. Die phylogenetische Untersuchung offenbart eine Gruppierung der ermittelten Kodone, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen (hellgraue Kästen). Dies bestätigt die Richtigkeit des Konzepts der strukturelle Homologie zwischen A-Domänen und zeigt, daß die jeweils ermittelten zehn Aminosäuren wirklich das Kodon für die Erkennung der kognaten Substrat- Aminosäure bilden. Es werden Beispiele gebracht die zeigen, daß die Spezifität von neu-entdeckten Domänen mittels dieser Technik vorhersagbar ist und das die Gruppierung von der experimentell beobachteten Spezifität geleitet wird (dunkelgraue Unterlegung). Dies gilt auch für die konstruierten Mutanten PheA(T278M/A301G) und AspA(H322E), die in der ATP-Pyrophosphat- Austauschreaktion eine Leu bzw. Asn-Spezifität (mittelgraue Unterlegung) zeigen.
Figur 3: Schematische Darstellung der postulierten Bindungstaschen von drei Adenylierungsdomnänen. Die ermittelten Kodone von drei verschiedenen Substraten ('Asp', Orn(2)' und Nal(3)'; vgl. Tabelle 1 ) wurden in die in Figur 1 B gezeigte Darstellung der Bindungstasche von PheA projeziert. Aliphatische (hellgrau), polare (gestreift), acide (weiß) und basische (dunkelgrau) Seitengruppen sind schematisch gezeigt. In allen drei Fällen vermitteln Asp235 und Lys517 Wechselwirkungen mit der α-Amino und α-Carboxylgruppe des jeweiligen Substrats, während alle anderen Reste (Xaa236 bis Xaa331 ) die eigentliche Erkennung der Seitenkette des Substrates vermitteln. Es kann eine perfekte Korrelation zwischen der Polarität der Bindungstasche und des Substrates für alle gezeigten Beispiele beobachtet werden.
Figur 4: Beobachtete Variabilität der Konstituenten von verschiedenen Substrat- Bindungstaschen. Die konstituierenden Aminosäuren der verschiedenen Positionen in 160 postulierten Substrat-Bindungstaschen wurden auf ihre Variabilität hin untersucht. Die proportionale Verteilung der Natur der Substrate in den untersuchten A-Domäne ist im mittelgrauen Kasten dargestellt. Die hellgrauen Kästen, die mit jeder Position der Bindungstasche verbunden sind, geben die Anzahl der beobachteten, verschiedenen Reste (Häufigkeit: =1%), sowie das proportionale Auftreten von hydrophoben, polaren, aciden und basischen Seitengruppen an diesen Stellen wieder. Aufgrund der gezeigten Ergebnisse können die zehn konstituierenden Aminosäuren in drei Untergruppen klassifiziert werden: (1 ) Die Positionen 235 (Asp: acid, weiß) und 517 (Lys: basisch, dunkelgrau) sind 'invariant'. (2) Die Positionen 236, 301 und 330 sind lediglich 'bedingt variant'. Sie offenbaren ein unterdurchschnittliches Auftreten von geladen und polaren Seitengruppen und die überwiegende Mehrzahl (93%) der untersuchten A-Domänen verwendet aliphatische Reste (grau) an diesen Positionen. Als 'höchst variant' können die Positionen 239, 278, 299, 322 und 331 angesehen werden, die eine hochgradige Variabilität im Bezug auf die Verwendung unterschiedlicher Aminosäuren zeigen.
Figur 5: Gezielte Veränderung der Substratspezifität von PheA und AspA. Die Substratspezifität von Wildtyp (weiß) und Mutanten (verschiedene Grau-Töne) wurden mit Hilfe von ATP-Pyrophophat-Austauschreaktionen untersucht. Die verwendeten Substrate sind auf der Abzisse dargestellt, und der beobachtete Maximalwert für die Aktivität eines jedes Protein wurde als 100% festgesetzt. (A) Punktmutationen in PheA in Richtung des 'Leu(4)'-Kodons (T278M and A301 G) erhöhen geringfügig die Seitenspezifität für Leu, während das bevorzugte Substrat immernoch Phe ist. Die entsprechende Doppelmutante (PheA(T278M/A301G); dunkelgrau) aktiviert dagegen bevorzugt Leu mit einer katalytischen Aktivität, die der Effizienz des Wildtyp-Enzyms PheA für Phe in nichts nachsteht. (B) Eine H322E- Punktmutation in AspA reichte aus, um die Substratspezifität der Mutante vollständig von Asp nach Asn zu verschieben. Die beobachteten Aktivierungsmuster der Mutanten stimmen mit der Lage ihrer Kodons im in Figur 2 gezeigten phylogenetische Baum überein (mittelgraue Unterlegung).
Die Figuren 6-9 stehen für die Tabellen 1-4.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer gewünschten Struktur, wobei in einer gegebenen DNA Sequenz, kodierend für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase, einer oder mehrere A-Domänen kodierende Abschnitte gemäß des in Tabelle 1 ) vorgelegten nicht-ribosomalen Codes so verändert werden, daß das Expressionsprodukt der veränderten DNA Sequenz das Peptid der gewünschten Struktur exprimiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in mindestens einer zu verändernden A- Domäne höchstens 10, vorzugsweise höchstens 6, besonders bevorzugt höchstens 3, ganz besonders bevorzugt eine Aminosäure ausgetauscht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei gezielt bei der gegebenen DNA Sequenz A- Domänen kodierende Abschnitte hinzugefügt oder entfernt werden, zwecks Herstellung längerer oder kürzerer Peptide.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die synthetisierten Peptide antibiotische, immunsuppressive, cytostatische, antiviral, antihelmitisch, fungizide oder oberflächenaktive Wirkung haben.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens eine veränderte nicht-ribosomale Peptidsynthetase in einen Wirtsorganismus enthalten ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe: Bakterien, Pilze, Hefen, besonders bevorzugt sind Bacilli , Actinomyceten, Myxobakterien, Pseudomonaden und Escherichia Coli, ganz besonders bevorzugt ist Bacillus subtilis.
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus eine Pflanze ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus ein Säugetier ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Wirtsorganismus ein Mensch ist.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die veränderte eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase in isolierter Form (in vitro) eingesetzt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die veränderte nicht-ribosomale Peptidsynthetase immobilisiert ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11 , wobei die veränderte nicht-ribosomale Peptidsynthetase an einen Träger gebunden ist.
13. DNA Sequenz, die für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase kodiert, worin eine oder mehrere A-Domänen anhand des nicht-ribosomalen Codes in Tabelle 1 derart verändert wurde, daß das Expressionsprodukt der veränderten DNA Sequenz das Peptid einer vorherbestimmten Struktur, die bevorzugterweise nicht einem natürlichen Peptid entspricht, exprimiert.
14. DNA Sequenz nach Anspruch 13, worin in mindestens einer zu verändernden A-Domäne höchstens 10, vorzugsweise höchstens 6, besonders bevorzugt höchstens 3, ganz besonders bevorzugt eine Aminosäure ausgetauscht wird.
15. Verwendung der DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 13 oder 14 zur Synthese von Peptiden in einem der Verfahren nach Anspruch 1 bis 11.
16. Peptid erhältlich anhand des nicht-ribosomalen Codes gemäß Tabelle 1 , wobei Tabelle 1 Teil des Anspruches ist.
PCT/EP2000/001652 1999-03-03 2000-02-28 Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung WO2000052152A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU34257/00A AU3425700A (en) 1999-03-03 2000-02-28 Non-ribosomal peptide synthetases, method for producing same and the use thereof
IL14500400A IL145004A0 (en) 1999-03-03 2000-02-28 Non-ribosomal peptide synthetases, method for the production thereof and use thereof
CA002364569A CA2364569A1 (en) 1999-03-03 2000-02-28 Non-ribosomal peptide synthetases, method for producing same and the use thereof
EP00912520A EP1159416A1 (de) 1999-03-03 2000-02-28 Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
JP2000602764A JP2002537806A (ja) 1999-03-03 2000-02-28 非リボソームペプチドシンテターゼ、その製造のための方法およびその使用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19909146.3 1999-03-03
DE19909146A DE19909146A1 (de) 1999-03-03 1999-03-03 Verfahren zur gezielten biologischen Synthese von Peptiden

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000052152A1 true WO2000052152A1 (de) 2000-09-08

Family

ID=7899460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/001652 WO2000052152A1 (de) 1999-03-03 2000-02-28 Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1159416A1 (de)
JP (1) JP2002537806A (de)
CN (1) CN1342201A (de)
AU (1) AU3425700A (de)
CA (1) CA2364569A1 (de)
DE (1) DE19909146A1 (de)
IL (1) IL145004A0 (de)
WO (1) WO2000052152A1 (de)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063361A2 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Kosan Biosciences, Inc. A multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
WO2001030985A1 (de) * 1999-10-22 2001-05-03 Marahiel Mohamed A Massgeschneiderte peptidsynthetasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US6399789B1 (en) 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US7498404B2 (en) 2004-01-30 2009-03-03 The Texas A&M University System Compositions, methods and uses for a novel family of peptides
EA016155B1 (ru) * 2006-10-05 2012-02-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. ПОЛУЧЕНИЕ β-ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ
CN104583385A (zh) * 2012-08-06 2015-04-29 丹尼斯科美国公司 产生减小量哌珀霉素的真菌细胞
WO2017020983A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Merck Patent Gmbh Artificial non-ribosomal peptide synthetases
WO2017137443A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Artificial non-ribosomal peptide synthases and their use
WO2019138117A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main System for the assembly and modification of non-ribosomal peptide synthases
WO2024038117A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt Method and means for engineering non-ribosomal peptides

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10340068A1 (de) * 2003-08-28 2005-03-24 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Substrate für die Inhibierung der Adenylierungsdomänen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen
US8945898B2 (en) * 2010-07-01 2015-02-03 Dsm Ip Assets B.V. Recombinant host cell with deficiency in non-ribosomal peptide synthase production
EP3648109A4 (de) * 2017-06-30 2020-06-24 Nec Corporation Prognosevorrichtung, prognoseverfahren, speichermedium mit gespeichertem prognoseprogramm und genetische inferenzvorrichtung
CN111575251B (zh) * 2020-05-29 2022-03-11 上海交通大学 一种用于达托霉素生物合成的dptC1突变体的构建
CN113278601B (zh) * 2021-05-17 2022-07-08 浙江工业大学 一种腺苷酰化蛋白a6突变体及其编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0637630A2 (de) * 1993-07-13 1995-02-08 ENIRICERCHE S.p.A. Verfahren zur biologischen Herstellung von Peptiden
EP0789078A2 (de) * 1995-08-09 1997-08-13 ENIRICERCHE S.p.A. Modifizierte Peptidsynthetasen, und deren Verwendung in die nicht-ribosomaler Herstellung von Peptiden

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0637630A2 (de) * 1993-07-13 1995-02-08 ENIRICERCHE S.p.A. Verfahren zur biologischen Herstellung von Peptiden
EP0789078A2 (de) * 1995-08-09 1997-08-13 ENIRICERCHE S.p.A. Modifizierte Peptidsynthetasen, und deren Verwendung in die nicht-ribosomaler Herstellung von Peptiden

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COSMINA P ET AL: "SEQUENCE AND ANALYSIS OF THE GENETIC LOCUS RESPONSIBLE FOR SURFACTIN SYNTHESIS IN BACILLUS SUBTILIS", MOLECULAR MICROBIOLOGY,GB,BLACKWELL SCIENTIFIC, OXFORD, vol. 8, no. 5, 1 May 1993 (1993-05-01), pages 821 - 831, XP002037894, ISSN: 0950-382X *
E. CONTI ET AL.: "Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidine S", EMBO J., vol. 16, no. 14, 16 July 1997 (1997-07-16), OXFORD UNIVERSITY PRESS,GB;, pages 4174 - 4183, XP002141777 *
MARAHIEL M A ET AL: "Modular ppetide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis", CHEMICAL REVIEWS,US,AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, vol. 97, no. 7, November 1997 (1997-11-01), pages 2651 - 2673-2673, XP002133489, ISSN: 0009-2665 *
SCHNEIDER A ET AL: "Targeted alteration of the substrate specificity of peptide synthetases by rational module swapping.", MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 257, no. 3, February 1998 (1998-02-01), pages 308 - 318, XP002141778, ISSN: 0026-8925 *
STACHELHAUS T ET AL: "Peptide bond formation in nonribosomal peptide biosynthesis. Catalytic role of the condensation domain", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,US,AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, vol. 273, no. 35, 28 August 1998 (1998-08-28), pages 22773 - 22781-22781, XP002133488, ISSN: 0021-9258 *
STACHELHAUS T ET AL: "THE SPECIFICITY-CONFERRING CODE AS ADENYLATION DOMAINS IN NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTHETASES", CHEMISTRY AND BIOLOGY,GB,CURRENT BIOLOGY, LONDON, vol. 6, 29 June 1999 (1999-06-29), pages 493 - 505-505, XP000892837, ISSN: 1074-5521 *
VOLLENBROICH D ET AL: "ANALYSIS OF A MUTANT AMINO ACID-ACTIVATING DOMAIN OF SURFACTIN SYNTHETASE BEARING A SERINE-TO-ALANINE SUBSTITUTION AT THE SITE OF CARBOXYLTHIOESTER FORMATION", FEBS LETTERS,NL,ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, vol. 325, no. 3, 5 July 1993 (1993-07-05), pages 220 - 224, XP002037890, ISSN: 0014-5793 *
ZUBER P: "NON-RIBOSOMAL PEPTIDE SYNTHESIS", CURRENT OPINION IN CELL BIOLOGY,GB,CURRENT SCIENCE, LONDON, vol. 3, 1 January 1991 (1991-01-01), pages 1046 - 1050, XP002037891, ISSN: 0955-0674 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399789B1 (en) 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US7049100B2 (en) 1996-12-18 2006-05-23 Kosan Biosciences Incorporated Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
WO2000063361A2 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Kosan Biosciences, Inc. A multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
WO2000063361A3 (en) * 1999-04-16 2001-07-12 Kosan Biosciences Inc A multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
WO2001030985A1 (de) * 1999-10-22 2001-05-03 Marahiel Mohamed A Massgeschneiderte peptidsynthetasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US7498404B2 (en) 2004-01-30 2009-03-03 The Texas A&M University System Compositions, methods and uses for a novel family of peptides
EA016155B1 (ru) * 2006-10-05 2012-02-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. ПОЛУЧЕНИЕ β-ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ
CN104583385A (zh) * 2012-08-06 2015-04-29 丹尼斯科美国公司 产生减小量哌珀霉素的真菌细胞
WO2017020983A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Merck Patent Gmbh Artificial non-ribosomal peptide synthetases
WO2017137443A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Artificial non-ribosomal peptide synthases and their use
US11643643B2 (en) 2016-02-08 2023-05-09 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Artificial non-ribosomal peptide synthases and their use
WO2019138117A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main System for the assembly and modification of non-ribosomal peptide synthases
WO2024038117A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt Method and means for engineering non-ribosomal peptides

Also Published As

Publication number Publication date
CN1342201A (zh) 2002-03-27
EP1159416A1 (de) 2001-12-05
CA2364569A1 (en) 2000-09-08
AU3425700A (en) 2000-09-21
JP2002537806A (ja) 2002-11-12
IL145004A0 (en) 2002-06-30
DE19909146A1 (de) 2000-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1159416A1 (de) Nicht-ribosomale peptidsynthetika, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
DE69033616T3 (de) Riboflavin überproduzierende Bakterienstämme
DE102004031177A1 (de) Neue Geruchsstoffe bildende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
FI120543B (fi) DNA-yhdisteitä, jotka sisältävät mannuronaani-C-5-epimeraasia koodaavia sekvenssejä
Yamane et al. Efficient in vitro translocation into Escherichia coli membrane vesicles of a protein carrying an uncleavable signal peptide. Characterization of the translocation process.
DE102004058306A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden
DE69834452T2 (de) Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Verbindungen
DE69333954T2 (de) An der streptogramin biosynthese beteiligte polypeptide, ihre kodierenden nukleotidsequenzen und ihre verwendung
DE69728377T2 (de) Verbesserte mutanten von (2,5 dkg) reduktase a
CA2125376A1 (en) Lipopeptides from actinoplanes sp. with pharmacological action, process for their production and the use thereof
DE10241152A1 (de) Tubulysin-Biosynthese-Gene
DE19622783A1 (de) Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung
DE102012007491A1 (de) Neue Enzyme
EP0724629A1 (de) Verfahren zur gezielten veränderung von enzymen, veränderte enzyme und deren verwendung
DE19951196A1 (de) Massgeschneiderte Peptidsynthetasen und ihre Verwendung
DE60123334T2 (de) Methode für die Produktion von Nukleotiden durch Fermentierung
Stettler et al. An essential and specific subunit of RNA polymerase III (C) is encoded by gene RPC34 in Saccharomyces cerevisiae.
DE60109952T2 (de) Ramoplaninbiosynthesegenkluster
DE112019000467T5 (de) Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10
EP1504110A1 (de) Verfahren zur biotechnologischen herstellung von xylit
EP1725582A1 (de) Der faktor reca aus bacillus licheniformis und reca-inaktivierte sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion
DE102004030938A1 (de) Neue, Polyaminosäuren bildende oder abbauende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
EP0733704B1 (de) Steuerbares Expressionssystem
WO2005017166A1 (de) Verfahren zur herstellung eines lysates zur zellfreien proteinbiosynthese
EP0569806B1 (de) DNA-Verbindungen und rekombinante, die Ribloflavinsynthetaseaktivität von S. cerevisiae codierende DNA-Expressionsvektoren

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 00804496.1

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA CN CZ HU IL IN JP KR NO NZ PL TR US ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000912520

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 145004

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2364569

Country of ref document: CA

Ref document number: 2364569

Country of ref document: CA

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2000 602764

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09914477

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000912520

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000912520

Country of ref document: EP