WO2000050618A1

WO2000050618A1 - Vecteur viral

Info

Publication number: WO2000050618A1
Application number: PCT/JP2000/001069
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Hamada
Original assignee: Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2000-08-31
Also published as: AU2691400A; JP2000279178A; CA2365026A1; EP1156118A1; EP1156118A4

Description

明細書

ウィルスベクタ一

技術分野

本発明は、ウィルスを構成するタンパク質に、メラニン細胞刺激ホルモン（

MSH) 受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスベクターおよび、該ベクタ一を用いた腫瘍に対する^断薬および治療薬に関する。

背景技術

転移を伴う悪性黒色腫は、放射線療法や化学療法などの従来の治療法に抵抗性であり、予後はきわめて不良である。そのため、新しい有効な治療法の開発が強く望まれる。一方、ウィルスベクタ一などを介した遺伝子導入を用いた癌治療法（癌に対する遺伝子治療法）は、近年多くの臨床研究が開始され、期待を集めている。

しかしながら、現在、悪性黒色腫に対して十分に治療効果をあげるような効果的な遺伝子導入を行う方法は確立されていない。例えば、従来のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウィルス（AAV) などのウィルスべクタ一では悪性黒色腫細胞に対する遺伝子導入効率は十分でなレ ^。

本発明者らは現行のアデノウイルスベクタ一の悪性黒色腫細胞株に対する遺伝子導入効率について検討し、比較的高い MOI (mul t ipl i c i ty of infec t i on) のウィルスを用いても充分な遺伝子導入効率が得られないことを示している〔 Yosh i da e t al. , Hum Gene Ther. , 9 (17) 2503-2515, 1998、（以下、 Yosh ida et al. , 1998と略記する）〕。この論文に示された結果中、 MOI 100では、 A375 ヒト悪性黒色腫細胞で 50%、 RPMI 7951 悪性黒色腫細胞で 8Q %、 WM1 15 悪性黒色腫細胞で 50 %程度の遺伝子導入効率が得られるに過ぎず、 100 %に近い遺伝子導入を得るにはさらに大量のアデノウイルスの投与を必要とする。

現行のウィルスベクタ一は、単に遺伝子導入の効率が低いのみでなく、周辺の正常細胞にも非選択的に遺伝子が導入されるという欠点を持つ。すなわち、悪性黒色腫の治療を行うベクタ一としては、効率が低く、悪性黒色腫に対する選択性も乏しい。

アデノウイルスのファイバ一の C末端ないし HIループ部分に変異アミノ酸配列を入れて、宿主域を改変する試みは、米国 GenVec社の Wickhanu アラバマ大学の Curielらのグループによって報告されている〔Wickham et al. , J. Virol. Π, 8221 (1997)、 Wickham et al. , Gene Ther. 2, 750 (1995)、 Wickham et al. , Na t. Biotechnology, 14, 1570 (1996)、 Curiel et al. , Hum. Gene Ther. 3, 147

(1992)、 Dimitriev et al. , J. Virol. 72, 9706 (1998)、 W094/10323, W096/0 7734) 。

多くのヒト悪性黒色腫に、 MSH受容体が存在し MSHが結合することが報告されている CSiegrist et al. , Cancer Res. 49, 6352 (1989)〕。したがって、 MSH をウィルスの外皮タンパク質に融合させたウィルスベクタ一は、悪性黒色腫に効率的に遺伝子を導入できるベクターとなることが予想される。し力 ^し、 MSHリガンドを含むベクターの作成に成功したとの報告や、 MSH受容体を標的とした遺伝子治療の可能性を実証した報告は見当たらない。アデノウイルス以外のウイルスベクターとしては、レトロウイルスのエンベロープタンパク質に細胞の増殖因子（エリスロポエチン）〔Kasahara et al. , Science 266: 1373 (1994)〕、あるいは単鎖の抗体 [Jiang et al. J. Virol. 72(12)： 10148 (1998)) などを融合するように組み込んで標的化を目指しているもの、あるいは単純ヘルべスウィルスの C糖タンパク質にエリスロポエチンを融合させたもの〔Laquerre et al. , J. Virol. 72(12)： 9683 (1998)) などがある。 Jiangらの報告では、単鎖抗体の抗原として EGF (epidermal growth factor) 受容体ファミリ一に属する Her2neu、骨髄幹細胞に特異的といわれる CD34、トランスフェリン受容体が標的として検討されている。また、インデグリンと結合する RGDモチーフを人工的に組み込んだキメラウィルスタンパク質の報告は、アデノウイルスでは前述の Wickhamのグループ [Wickham et al. , J. Virol. 71: 8221 (1997)〕と Curiel のグループ [Dimitriev et al. , J. Virol. 72: 9706 (1998)) から、さらにァデノウィルス以外では、 B型肝炎ウィルスのコアタンパク質 [Chambers et al. , J. Virol. 70: 4805 (1996)； Sharma et al. , Virology 239: 150 (1997)〕、バクテリオファ―ジ Fdタンパク質〔Koivunen et a J. Biol. Chem. 268: 20205 (1993)； Koivunen et al. , J. Cell Biol. 124: 373 (1994)) などについてすでに報告されている。しかしながら、アデノウイルス以外でも MSHリガンドを含むウィルスベクタ一や、 MSH受容体を標的とした遺伝子治療の可能性を実証した報告は見当たらない。

発明の開示

悪性黒色腫の遺伝子治療を開発してゆくためには、現行のウィルスベクターでは遺伝子導入の効率および選択性が乏しい。従って、従来の治療に対して抵抗性で予後のきわめて悪い悪性黒色腫に対して、効率よく選択的に遺伝子導入が可能な手段が要望されている。

本発明の目的は、悪性黒色腫を含めた腫瘍の治療および診断に有用な、ウイルスを構成するタンパク質に MSH受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスベクターおよび当該ウィルスベクタ一の利用方法を提供することにある。

本発明者らは、従来のウィルスベクターによる遺伝子導入法では悪性黒色腫に対し効率が低く選択性に乏しいとの上記問題点が、ウィルスを構成するタンパク質に、 MSH受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスべクタ一を用いることにより解決できることを見出し、本発明を完成させた。また、このようなウィルスベクタ一は、作用機作上、アデノウイルスのファイバ一と同様に、ウィルスを構成するタンパク質に MSH受容体に特異的に結合するリガンドを融合させることができる他のウィルスを用いたベクター系にも適用できる。

このようなウィルスベクターを悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍に対して遺伝子導入用のベクタ一として用いれば、効率が高く選択性に優れた遺伝子導入が達成される。

従って、本発明によれば、悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍に対して高効率かつ高選択性のウイルスべクタ一、さらにはそれをもとにして作成される組換えウィルスベクターが提供される。このような組換えウィルスべク夕一は、含有させる遺伝子を選ぶことによって、悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍細胞を特異的に見分ける診断薬として、または当該腫瘍細胞を特異的に殺す癌治療薬として、あるいは当該腫瘍の持つ抗原性を特異的に高める癌の免疫治療剤として適用できる、診断用並びに治療用のベクタ一として有用である。

従来のアデノウイルスベクタ一は、ヒト 5ないし 2型アデノウイルスをべ一スとした組換え体が主体で、悪性黒色腫に対する遺伝子導入効率は、 50%導入を得られるウィルス量（ED₅。）が M0I 100前後である（Yoshida et al. , 1998) 。すなわち、悪性黒色腫に対しては余り高い導入効率が得られない。一方、正常細胞に対してもそれと同等ないしそれ以上の高い効率で遺伝子導入が得られるため、悪性黒色腫に特異的な高い遺伝子導入効率は望めない。本発明のウィルスベクタ一を用いることにより、 1) 悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍に対して従来法に比べ飛躍的に高い導入効率が得られ、 2) 周辺の正常細胞に対しては、従来のベクタ一と同等ないしそれ以下の導入効率であるため、結果として、悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍に対して特異性の高い遺伝子導入が可能である。そのため、 1) 高い発現量が必要な場合は、従来法と同じウィルス量を用いたとしても、標的となる腫瘍細胞に対し従来法よりも高い遺伝子発現が得られ、結果としてより高い効果が得られる。また、 2) 比較的低い発現量で充分な効果が得られるような遺伝子の場合には、本ベクターを用いればウィルスの投与量を減らすことが可能であり、結果としてウィルス投与に伴う望ましくない副作用（アレルギー反応や周辺正常細胞の傷害など）を軽減することが可能である。

また、 E1Aを持つアデノウイルスなどの増殖可能な組換えウィルスと一体型に組み合わせて用いれば、感染効率の増加と、感染したあとの腫瘍組織内でのゥィルスの増殖再感染とが相乗的に働き、非常に有効な治療法となる。

従って、本発明は、悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍の治療に対して高い有用性を有している。

フアイバータンパク質の C末端などに MSHとは別種のリガンドを入れた変異ァデノウィルスの作成はすでに報告がある。しかし、リガンドを入れたためにァデノウィルスができなくなってしまうものが多い。たとえウィルスができたとしても、得られたものが期待通りの受容体に対するァフィ二ティ一を有していないものである場合も多い [Wickham et al. , J. Virol. , U (11), 8221-8229 (1997)参照〕。従って、既に知られているリガンドから派生する融合タンパク質を用いて、すでに知られている受容体を標的としたベクターであっても、有用なウィルスベクターが得られるか否かは実際にそれらを作成して、作用させてみるまでは全く不明である。例えば、 Wickhamらは、 E-セレクチンと結合するモチーフ配列（TRSDITWDQLWWDLMKTS) やラミニンリセプタ一と結合するモチ一フ配列（TSAA(SIKVAV)₂) をアデノウイルスのファイバーの C末端に挿入したベクタ一を作製したが、組換えアデノウイルスはできなかった。また、同様に α インテグリンと結合する RGDモチーフを含む配列 TS (GRGDTF)₃SSやラミニンリセプ夕一と結合するモチーフ配列 TS(GYIGSR)₃SSを同様に挿入したベクターおよびその組換えアデノウイルスを作製したが、それぞれ予想されるリセプ夕一に対する特異的結合が見られなかったと報告している〔Wickhamet al. J., Virol. , 71 (11), 8221-8229 (1997)〕。

上記従来技術とは異なり、本発明のウィルスベクタ一では悪性黒色腫に対して通常期待される以上の格段に優れた結果が得られた。

本発明者は、 MSH受容体が多くの黒色腫細胞で発現している CSiegrist et al.， Cancer Res. , 49, 6352 (1989) ) ことと、リガンドである MSHが MSH受容体に高いァフィ二ティ一で特異的に結合することを利用して、悪性黒色腫細胞に効率よく感染し遺伝子導入できるベクタ一を完成させた。本発明のベクタ一は悪性黒色腫だけでなく、 MSH受容体を発現している他の腫瘍にも有効である。

本発明は、以下の（1)〜（26)に関する。

(1)ウィルスを構成するタンパク質に、 MSH受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスベクター。

(2)ウィルスを構成するタンパク質が、リンカ一を介して MSH受容体に特異的に結合するリガンドに融合している（1)記載のウィルスベクタ一。

(3)リンカーがオリゴペプチドである（2)記載のウィルスベクタ一。

(4)リンカ一が配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する（3)記載のウィルスベクタ一。

(5)ウィルスを構成するタンパク質が、ウィルスの外表面を構成するタンパク質である（1)〜（4)のいずれか 1つに記載のウィルスベクタ一。

(6)リガンドが、ひ- MSH、 β -MSH, r - MSHおよびこれらのいずれかの誘導体からなる群より選ばれるリガンドである（1)〜（5)のいずれか 1つに記載のウィルス

7々―

(7)ウィルスが、アデノウイルス科、レトロウイルス科、パルボウイルス科、へルぺスウィルス科、ボックスウィルス科、パボーバウィルス科、へパドナウイルス科、トガウィルス科、フラビウィルス科、コロナウィルス科、ラブドウィルス科、パラミクソウィルス科、オルソミクソウィルス科、バンャウィルス科、ァレナウィルス科およびレオウィルス科よりなる群のいずれかの科に属するゥィルスから選ばれる（1 )〜（6)のいずれか 1つに記載のウィルスベクター。

(8)ウィルスがヒトアデノウイルスである（1)〜（6)のいずれか 1つに記載のゥ

(9)ウィルスが外来の遺伝子を含むウィルスである（1)〜（8)のいずれか 1つに記載のウィルスベクター。

(10)遺伝子が、非毒性のプロドラッグを細胞毒性を有する薬剤に変換することができる酵素をコードする遺伝子である（9)記載のウィルスベクタ一。

(1 1)遺伝子が、単純へルぺスウィルス ·チミジンキナーゼ (HSV-tk) またはシトシン *デァミナ一ゼ（Cytos ine deaminase, CD) をコードする遺伝子である (10)記載のウィルスベクタ一。

(12)遺伝子が、直接または間接的に細胞毒性作用を有する分子をコードする遺伝子である（9)記載のウィルスベクタ一。

(13)遺伝子が、サイト力イン、細胞増殖因子または細胞増殖抑制因子をコードする遺伝子である（12)記載のウィルスベクター。

( )遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子または細胞死調節遺伝子である（12)記載のウィルスベクタ一。

(15)外来の遺伝子が、アデノウイルス E1Aないし E1B の野生型または変異型の遺伝子または該遺伝子の一部である（9)記載のウィルスベクタ一。

(16) (1)〜（15)のいずれか 1つに記載のウィルスベクタ一を含有してなる医薬。

(17) (1)〜（15)のいずれか 1つに記載のウィルスベクタ一を含有してなる抗腫瘍剤。

(18)腫瘍が悪性黒色腫である（17)記載の抗腫瘍剤。

(19) (1)〜（15)のいずれか 1つに記載に記載のウィルスベクターを含有してなる腫瘍の診断薬。

(20)腫瘍が悪性黒色腫である（19)記載の診断薬。

(21)配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を有するリン力一。

(22) (21)記載のリンカ一をコードする D N A。

(23)配列番号 2 4、 2 6、 2 8および 3 0のいずれか 1つに示される塩基配列からなる D N A。 (24)配列番号 32〜39のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。

(25) (24)記載のウィルスベクタ一をコードする DNA。

(26)配列番号 7、 13、 17、 18、 20、 21、 22および 23のいずれか 1つに示される塩基配列からなる D N A。

本発明のウィルスベクタ一としては、アデノウイルス科、レトロウイルス科、パルボウイルス科、ヘルぺスウィルス科、ボックスウィルス科、パポ一バウィルス科、へパドナウィルス科、トガウィルス科、フラビウィルス科、コロナゥィルス科、ラブドウィルス科、パラミクソウィルス科、オルソミクソウィルス科、バンャウィルス科、ァレナウィルス科およびレオウィルス科よりなる群のいずれかの科に属するウィルスおよびこれらのウィルスより由来するべクタ一、ァァノウイリレスドテ力へドロンべクタ一（Fender et al. , Nature Biotech. 15: 52-56 (1997)) 、ウィルスをリボゾームに組み合わせたベクター（例えば、センダイウィルスとリボゾームベクタ一等）等を用いることができ、ヒトアデノウィルスが好ましく用いられる。

本発明のウィルスベクタ一の作製は、ウィルスを構成するタンパク質をコ一ドする DNAに対し、一般的な組み換え DNA作成技術（Sambrook et al. 編、 Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989. などを参照）を用いて該タンパク質と MSH リガンドとの融合タンパク質をコードするように該当するウィルスタンパク質のコード領域を入れかえることによって行なえる。組換えウィルスの作成、あるいはリポゾームとの複合体などの作成については既存の方法に準じて行うことができる。既存の方法として、例えば、以下のような文献に記載の方法を挙げることができる。

Wolff ed. , Gene therapeutics: Methods and applications of direct gene transfer. Birkhaeuser, Boston, 1994; Kapl i tt and Loewy eds. , Viral v ectors： Gene therapy and neuroscience apl 1 icat ions. Academic Press, San Diego, 1995; Liu et al. eds. , DMA vaccines: A new era in vaccinology. Annals of the New York Academy of Sciences vol. 772. The New York Academy of Sciences, New York, 1995; Gluzman and Hughes eds. , Viral vectors： Current communications in molecular biology Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Roth ed. , Methods in cell biology: vol. 3. Protein expression in animal eel Is. Academic Press, San Diego 1994.

本発明に用いられるウィルスを構成するタンパク質として、例えば、ウィルスの外表面を構成するタンパク質を挙げることができる。外表面を構成する夕ンパク質としては、 VSV (vesicular stomatitis virus) の Gタンパク質、レトロウィルスのエンベロープタンパク質（env) 、アデノウイルスのキヤプシド夕ンパク質（へキソン、ペントンべ一ス、ファイバ一）、インフルエンザウィルスの Hemagglutinin, パラミクソウィルスの表面糖タンパク質などが挙げられるが、癌細胞などの宿主細胞の表面への吸着や特異的受容体との相互作用を担うようなウィルスタンパク質であれば、いずれも本発明に用いられる。

本発明に用いられる MSH受容体に特異的に結合するリガンドとしては、 a -MSH 、 β -MSH, ァ -MSH等が挙げられる。またこれらの変異体（誘導体やランダムべプチドからスクリーニングしたものなど）を作成して、天然の MSHよりも一層 MSH 受容体との結合力の強いものを人工的に作成することも可能である。本発明に用いられるリガンドは、これら全ての MSHないし MSH様のリガンドを包含する。以下の説明においては、 MSH受容体に特異的に結合するリガンドを MSHと略記するが、本発明においては、 MSH受容体と強い親和力を有する全てのリガンドも同様に用いることができる。

MSHとウィルスタンパク質とは、直接融合させることもできるが、リンカ一ぺプチドを介して融合させることもできる。リンカ一ペプチドついては、長さは 1 から 100残基程度までのオリゴぺプチドが用いられる。当該オリゴぺプチドの配列としては、文献上報告された特定のペプチド配列でも、未報告のペプチド配列でも、 MSH機能を保持しながらウィルスタンパク質と MSHとを結びつけるような役割を果たすペプチドであれば、 MSHの C末端、内部あるいは N末端のどちらについているか、長さ、配列などは問わず、いずれでも本発明に用いることができる。

MSHとウィルスを構成するタンパク質とを融合させる位置は、当該タンパク質の C末端、内部または N末端であっても、いずれの位置であってもよい。例えば、アデノウイルスのファイバ一タンパク質のようなウィルスを構成するタンパク質の C末端に配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれかに示されるァミノ酸配列を有するオリゴペプチドを介して MSHの N末端を結合させて融合させることができる。当該配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するリンカ一ペプチドおよび当該ペプチドをコードする DNAも本発明に包含される。

本発明のぺプチドリンカーを介して MSHを融合させたウィルスベクタ一を構成するタンパク質の具体例としては、配列番号 3 2〜3 9のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。当該タンパク質をコードする DNAも本発明に包含される。具体的には、配列番号 7、 1 3および 1 7〜2 3のいずれかに示される塩基配列からなる DNA等が挙げられる。

本発明のウィルスベクタ一に外来の遺伝子を組み込むことにより、当該遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。当該外来遺伝子を含むウィルスベクタ一も本発明に包含される。例えば、外来遺伝子として、直接的または間接的に標的細胞に対して細胞毒性作用を有するような分子をコードする遺伝子を組み込むことにより、癌細胞等の標的細胞を効率的かつ選択的に殺すことができる。このような遺伝子としては、例えば、サイト力イン、細胞増殖因子および細胞増殖抑制因子等をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、細胞死調節遺伝子等が挙げられる。また、外来遺伝子として、単純へルぺスウィルス ·チミジンキナーゼ (HSV-tk) 、シトシン ·デァミナ一ゼ（Cytos ine deaminase, CD)等の非毒性のプロドラッグを細胞毒性を有する薬剤に変換することができる酵素をコードする遺伝子を組み込むことにより、標的細胞を当該プロドラッグに対して感受性（sens i t ive) にすることができる。例えば、 HSV-tkをコ一ドする遺伝子を組み込んだ場合は、標的細胞をガンシク口ビルまたはァシク口ビルに対して感受性にすることができ、 CDをコードする遺伝子を組み込んだ場合は、標的細胞内で非毒性の 5 -フルォロシトシンを細胞毒性を有する薬剤である 5—フルォロウラシルに変換させることができる。

また、外来の遺伝子としては、例えば、アデノウイルス E1Aないし E1Bの野生型または変異型の遺伝子が挙げられるが、該遺伝子の一部を含んでいるものであってもよい。

本発明のウィルスベクターは、医薬、例えば、悪性黒色腫等の MSHを発現している腫瘍の治療薬、特に悪性黒色腫の治療薬として用いることができる。

本発明のウィルスベクタ一を含有する医薬は、治療薬として該ベクタ一単独で投与することも可能ではあるが、通常は該ベクターを薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化力リウム、クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。

投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は非経口経路、例えば皮下、筋肉内、静脈内、気道内等の投与経路が用いられる。本発明のベクタ一を含有する治療薬は、治療薬として該ベクター単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレンダリコール等のグリコール類、ごま油、オリ一ブ油、大豆油などの油類、 P —ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、スト口ベリ一フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシゥム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセル口一ス、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該ベクタ一そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該ベクターを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該ベクタ一および用いる担体の性質により、エア口ゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重、ウィルスベクタ一の種類等により異なるが、通常成人 1回当たりウィルスベクタ一として 10³〜10¹⁵個である。

本発明のウィルスベクターは、診断薬、例えば、悪性黒色腫等の MSHを発現している腫瘍の診断薬、特に悪性黒色腫の診断薬として用いることができる。例えば、本発明のウィルスベクタ一に標識となる遺伝子を組み込むことにより、悪性黒色腫等の MSHを発現している腫瘍を特異的に検出することができる。図面の簡単な説明

第 1図 293細胞に対し、野生型アデノウイルス Ad5dlX- F/wtおよび TVMSH変異型アデノウィルス Ad5-F/MSHを感染させ 4日間培養後の細胞形態を示す図である。 Aはコントロールの擬似感染 (mock)、 Bは野生型アデノウイルス Ad5dlX - F/wt、 Cは F/MSH変異型アデノウイルス Ad5- F/MSHを感染させたものをそれぞれ示す。

第 2図 A375細胞に対し、野生型アデノウイルス Ad5d lX- F/wtを感染させ 4日間培養後の細胞形態を示す図である。 Dはコントロールの擬似感染 (mock)、 E と Fは野生型アデノウイルス Ad5dlX-F/wtをそれぞれ M0110、 30で感染させたものをそれぞれ示す。

第 3図 A375細胞に対し、 F/MSH変異型アデノウイルス Ad5-F/MSHを感染させ 4 日間培養後の細胞形態を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、ウィルスベクターとしてヒト 5型のアデノウイルス（Ad5) を、 MSHと融合させるウィルスを構成するタンパク質として Ad5のファイバ一を用いて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。実施例 1 MSH融合ファイバ一変異型（F/MSH) の変異を持つヒト 5型アデノウィルス（以下、 Ad5-F/MSHと略記する）の作成

a) F/MSH変異をコードするプラスミドの作成：

野生型のファイバーをコードする遺伝子領域の 3'末端に 11アミノ酸よりなるリンカーと 13アミノ酸よりなるヒト -MSHをコードする塩基配列（配列番号 1 ) を、合成オリゴヌクレオチド No.924 (126mer、配列番号 2) をテンプレートとし、 No.933 (配列番号 3) と No.934 (配列番号 4) をプライマ一として、ポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction, PCR) によって合成した。この PCR産物を EcoRIで切って、 pBluescript SKI H (ストラタジーン社）の EcoRI サイトへクロ一ニングして pSKII+nbMSHを得た（Yoshida et al. , 1998) 。さらに、 pSKII+nbH (Yoshida et al. , 1998) の Hindlll I Xhol断片と pSKI I+nbMSH の Xhol / Muni断片を、 pSKIH[X_K] (Yoshida et al. , 1998) の Hindlll I Muni サイトへクロ一ニングしてプラスミド pSKII+[X- K]nbMSHを得た。さらに pSKII + [X-K]nbMSHの Nhel I Kpnl断片 (2.1 kbp)を pSKII +6.7Rnp (Yoshida et al. , 1998) の Nhel / 1サイトへサブクロ一ニングして、 pSKIH6.7R-MSHを得た。 pSKII+6.7R - MSHから EcoRI I Pacl断片を切り出して pTR (Yoshida et al. , 1998) の EcoRI I ^ lサイトへクローニングして pTR- MSHを得た。 F/MSH変異型のファィバ一の C末端の予想アミノ酸配列は以下のようになる。ただし、数字は 5型ァデノウィルス（Ad5) のファイバーの N末端を 1として数えたアミノ酸残基の位置を示す。

S₅₇₁SYTFSYIAQE₅₈₁PSASASASAPG₅₉₂SYSMEHFRWGKPV₆₀₅

581までが本来の Ad5ファイバ一のアミノ酸配列、 582から 592までの 11残基がリンカーのアミノ酸配列、 593から 605までの 13残基がヒト α - MSHのアミノ酸配列である。

pTR-MSHを含む大腸菌である Escher ichia coli DH5 α/pTR- MSHは、平成 11年 2 月 22日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番 3号（郵便番号 305-8566) に FERM BP- 6656として寄託されている。 b) F/MSH変異型組み換えアデノウイルスの作成

F/MSHを有する組み換えアデノウイルスは、公知の方法（Yoshidaet al.， 1998 ) に準じて作成した。すなわち、アデノウイルス Ad5dlX CMiyake et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1320-1324 (1996)〕からゲノム DNA-末端タンパク質複合体（以下、 DNA-TPCと略記する）を分離し、これを^ RIと^ Iで切断したものと、 pTR-MSHのプラスミド DNAを^ Iで切断したものとを、 293細胞へ共トランスフエクシヨンした。 Yoshida et al., 1998に F/K20変異体の作成法として記載した方法と本質的に同じ方法を用いた。ただし従来通りの方法〔M i yake e t al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1320-1324 (1996)) に従って共トランスフエクシヨンを行ったところ、繰り返して実験を行ったにもかかわらず、プラークは 1つも得られなかった（Yoshida et al. , 1998) 。本実施例では、得られた Adv-F/MSH変異体のウィルスタイ夕一がきわめて低いために、従来通りのウィルスプラーク作成法を用いてはウィルスの分離は困難と考えた。そこで本発明者は、 DNAをトランスフエクトされた 293細胞の 96ゥエルプレー卜へのまき込み数を従来法の 30%とし、培養液のゥシ胎児血清（Fetal bovine serum, FBS ) の濃度を従来の 10%からその半分の 5%へと低くし、培養液をトランスフエクシヨンから 4日目、 8日目、 15日目の 3回、それぞれ 1ゥエルに 50 lずつ適宜追加しながら 3週間にわたつて培養を続けたところ、ようやく全体で 2クローンのプラークを分離することができた。これらのウィルスを 293細胞ならびに A375ヒト悪性黒色腫細胞に感染させて増幅させてから生物活性の検討を行った。得られた Ad5-F/MSHのウィルス液の夕イタ一は通常の 293を用いたプラークアツセィ法では検出限界以下であった（10⁵pfu/ml以下）。

c) F/MSHファイバ一変異型アデノウイルスの 293細胞ならびに A375ヒト悪性黒色腫細胞に対する感染によって起こる細胞毒性の検討

293細胞または A375細胞を 6ゥエルプレ一卜にまき、翌日コントロールの擬似感染（mock infection) 、野生型（wt) アデノウイルス Ad5dlX-F/wtの感染、ならびに、 F/MSH変異型アデノウイルス（Ad5-F/MSH) の感染を行い、 96時間後の細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。第 1図の Aにコントロールの 293細胞、 B 、 Cにそれぞれ F/wtと F/MSHの Ad5d lXアデノウイルスに感染した 293細胞を示す。 4日間の培養で Bの F/wtの感染した 293細胞はほとんど 100%の細胞が死んで丸く浮き上がってくる。一方、 Cの F/MSHの感染した 293細胞では細胞のダメージはほとんど見られずコントロール（A) とほぼ同等の形態を示した。

第 2図の Dにコントロールの A375細胞、 E、 Fが野生型ファイバ一（F/wt) の Ad5dlXアデノウイルスをそれぞれ M0110、 30で感染させた A375の形態を示す。 4 日間の培養で、 293細胞の結果とは対照的に、 F/wtの感染した A375細胞では、十分な細胞毒性は得られていない（第 2図の E、 F) 。一方、第 3図の Gは F/MSH変異型ファイバーを有する Ad5dlXアデノウイルス（Ad5- F/MSH) を感染させた A375 細胞の形態を示す。 4日間の培養で非常に強い細胞毒性が得られることがわかる以上の結果から、 F/MSHファイバ一変異型アデノウイルスは、 293細胞に比し、 A375ヒト悪性黒色腫細胞に対して効率良く、しかも選択性も優れた遺伝子導入の可能なベクタ一として有用であることが示された。

実施例 2 MSH融合型の変異ファイバ一を持つヒト 5型アデノウイルスの改良型 (Ad5-F/asMSHa) の作成

実施例 1の方法では、 F/MSH変異型アデノウィルスの悪性黒色腫細胞に対する顕著な効果、すなわち、高効率の遺伝子導入と強い細胞毒性効果は示されたものの、得られたウィルス液のタイ夕一が低い（10¾fu/ml以下）のでこれを改善する必要がある。そこで、以下に述べるようなファイバ一変異型アデノウィルス作成方法を用いることによって、 10⁷から 10¾fu/ml以上の実用上充分に高い夕イタ一を有する MSH融合ファィバ一変異アデノウィルスを得ることができた。 a) F/asMSHaファイバ一変異をコ一ドする DNA断片の作成

a - MSHのコード領域とフアイバーのポリ Aシグナル領域は、新しく合成したォリゴヌクレオチドプライマ一の No. 1061 (配列番号 5 ) と No. 1092 (配列番号 6 ) を用いて、実施例 1の pSKI I+6. 7R-MSHをテンプレートとして PCR法によって合成した。

PCR産物を BamHI/EcoRIで切断して、 pNEB193 (NEB社）の BamHI/EcoRIサイ卜へクロ一ニングし、塩基配列を確認した。

b) コスミド pWE6. 7R-F/asMSHaの作成

コスミド PWE15 (GenBank access i on, M99569) は Cl ont ech社 (Pal o Al to, CA， USA) から購入した。 SKI I +6. 7R-K20 (Yosh i da et al.， Hum. Gene Ther. 9 : 2503-2515 (1998)の 2506ページに記載されている〕の^ I Iサイトを T4DNAポリメラーゼで平滑化して、ここに新たに合成したリン酸化リンカ一（ pdGCTTCGAAGC) を挿入した。これから Ad5アデノウイルスのゲノムを含む EcoRI/Bs tBI断片を切り出し、 pWE15の EcoRI/Cl alサイトにクロー二

PWE6. 7R- F/K20を得た。これから K20変異をコードする配列を含む BamHI /Kpn I断片を a) で述べた No. 106卜 No. 1092 PCR産物の BamHI/Kpnl断片に入れかえることによって PWE6. 7R- F/asMSHaを得た。このときファイバ一をコードする領域の塩基配列（Ad5- F/asMSHa. seq) およびコードするアミノ酸配列を配列番号 7に示した。

c) コスミド pWEAxKM-F/asMSHaの作成

フアルマシア社から購入したプラスミド PUC-4Kからカナマイシン耐性遺伝子を含む 5 }HI切断断片（1264bp) を切り出し、 T4DNAポリメラーゼで末端を平滑化して、 pAx - cw [Miyake et al. , Pro Nat l. Acad. Sc i. USA 93, 1320-1324 (1996) ] の ^I.サイトにクロ一ニングして pAxKMを得た。これの Ad5のゲノムを含む EcoRI断片 (約 25773bp) を、 b) で述べた pWE6. 7R-F/asMSHaの EcoRIサイトにクローニングして、 Ad5のゲノムが正しい方向につながっているものを選択することにより、全長約 40702bpのコスミド pWEAxKM-F/asMSHaを得た。

d) F/asMSHa変異型組み換えアデノウイルスの作成アデノウイルス Ad5d lXの DNA- TPCを EcoRIと Aselで切断したものと、 pWEAxKM - F/asMSHaを^ Iと^ Iで切断したものとを、 293細胞へ共トランスフエクシヨンした。実施例 1で述べたような細胞培養での工夫をする必要なく、従来通りの培養方法で、多数のプラークを分離することができ、ウィルスゲノムの解析結果からも、予想通りの F/asMSHa変異をもった Ad5d lXの変異株であることが確認された。実施例 1で述べたウィルスと区別するためこれを Ad5- F/asMSHaと名付けた。 Ad5- F/asMSHaウィルスのストック液のタイターは 1. 10 X pfu/mlと、実用上充分に高いタイ夕一が得られた。

実施例 3 レポ一夕一 l acZ遺伝子を発現する F/asMSHaファイバ一変異型組み換えアデノウィルス AxCAZ3- F/asMSHaの作成

E1A領域に各種外来性遺伝子の発現カセットを組み込んだ F/asMSHaファイバ一変異型アデノウイルス作成が可能なことを示すため、まずレポ一夕一として大腸菌 l acZ遺伝子を発現する組み換え体の作成を試みた。

Yoshi da e t al. , 1998に記載された pCAZ2から l acZを含む^ I断片（末端平滑化）約 4889bpを、プロメガ社（Mad i son, WI, USA) から購入した pCIプラスミドの 5£ΐ Ζ Ι (末端平滑化）サイトへクロ一ニングして PCAZ3を得た。これから Bgl l l/BamHI断片 (末端平滑化）約 5153bpを切り出し、コスミド pAx-cw (Miyake e t al. , 1996) の^^ Iサイトにクロ一ニングして pAxCAZ3を得た。このコスミド DNAと、 Ad5(HXの DM- TPCを用いて野生型ファイバ一（F/wt) の組み換えアデノウィルス AxCAZ3-F/wtを得た。これからさらに DNA-TPCを調製し、これを^ RIと ^Iで切断したものと、実施例 2で得られた WEAxKM- F/asMSHaコスミド DNAを ^1と^ Iで切断したものとを、 293細胞へ共トランスフエクシヨンした。従来通りの培養法で多数のプラークを分離することができ、ウィルスゲノムの解析結果からも、予想通りの F/asMSHa変異をもち、なおかつ、 E1A領域にレポーター l acZ発現カセットをもつ組換えアデノウイルスであることが確認された。この組換えウィルスを AxCAZ3-F/asMSHaと名付けた。実施例 4 MSH受容体（以下、 MSHRと略記する）を高発現する宿主細胞を用いた、 F/asMSHa変異型アデノウイルスの作成

a) MSHRを発現するレトロウイルスベクタ一の作成

ヒ卜のメラノーマ細胞 A375の粗 RNAから得た cDNAをテンプレートとし、 MSHRをコードする領域の N末側半分をプライマー No. 1037 (配列番号 8 ) と No. 1040 (配列番号 1 1 ) 、 C末側半分をプライマ一 No. 1038 (配列番号 9 ) と No. 1039 (配列番号 1 0 ) を用いて増幅（RT-PCR法）し、 MSHRの cDNA断片を得た。それぞれの DNA断片を EcoRI/Kpnlで切断して、 pBluescr ipt I ISK+の EcoRI/Kpnlサイ卜にクロ一二ングしたのち塩基配列を確認した。これから、 N末側を^ RI/ ^I、 C末側を^ 1/^1でそれぞれ切り出して、レトロウイルス作成用のプラスミドの pRx-bsr CSh inoura e t al. , Human Gene Ther. 9 : 1983-1993 (1998) 〕の ^RI/ Iサイ卜へ 3パート .ライゲーシヨンでクロ一ニングしてプラスミド pRxhMSHRを得た。このプラスミドを用いて文献（濱田洋文ら、レトロウイルスベクター日本遺伝子治療学会編集：遺伝子治療開発研究ハンドブック第 3 章導入技術、印刷中、ェヌ ·ティー ·エス、 1999) に記載の方法を用いて MSH 発現レトロウイルス産生細胞の CRIP/MSHRを樹立した。

b) MSHRを高発現する 293宿主細胞由来の細胞株の作成

CRIP/MSHRの培養上清中のレトロウイルスを 293細胞に感染させることにより MSHRを高発現する 293/MSHR細胞株を得た。

c) 293/MSHRを用いた F/asMSHa変異型アデノウィルスの増幅

通常のアデノウィルス作成の宿主として用いる 293細胞の代わりに、 293/MSHR 細胞を用いて F/asMSHa変異型アデノウイルスのタイ夕一をプラークアツセィ法で測定すると、同一の液をアツセィしているにもかかわらず、 293細胞で得られるタイ夕一値に比べて 3から 10倍高い見かけ上の夕イタ一値が得られた。これは、 293細胞を使った場合に比べて 293/MSHR細胞を使えば F/asMSHa変異型アデノウィルスの感染効率ならびにプラーク形成率が高まるためと考えられる。つまり、 293/MSHR細胞を宿主として用いれば、 293細胞を使う場合よりもさらに高いタイ夕一のウィルス液を調製できると考えられる。

実施例 5 3 -MSH融合ファイバ一変異型の組換えアデノウイルスの作成実施例 1から 4までは、ヒトひ- MSH融合ファイバー変異型アデノウイルスの作成例を示した。さらに、ひ- MSH以外のリガンドに関しても悪性黒色腫細胞の治療に有用なファイバ一変異型ウィルスを作成することが可能かどうかを、 iS

-MSHをリガンドの一例として用いて検討した。

a) i3 -MSH融合ファイバータンパク質をコードするプラスミド DNAの作成

/3 - MSHをコードする PCR用のプライマー No. 1075を新しく作成した（配列番号 1 2 ) No. 1075と No. 1092 (実施例 2に記載）をプライマーとして、 pSKI H6. 7Rnp をテンプレートとして PCRを行い、得られた PCR産物を^ HIと^ RIで切断して、 PNEB193の BamHI/EcoRIサイトにクローニングした後、塩基配列を確認した。 β -MSHをコードする DNA断片を^ ΗΙ/^Ιで切り出し、実施例 2で得られた PWE6. 7R- F/asMSHaの BamHI/Kpnlサイトにクローニングして pWE6. 7R- F/asMSHbを得た。さらにこの EcoRIサイ卜に、 pAxKMの^ RI断片（約 25kbp) を順方向にクローニングして、 pWEAxKM- F/asMSHbコスミド DNAを得た。

b) β -MSH融合ファィバー変異型アデノウィルスの作成

実施例 2と同様の方法で、 Ad5dlXの DNA- TPCと pWEAxKM-F/asMSHbの DNAを 293細胞に共トランスフエク卜することにより、 ]3 MSH融合ファイバ一変異型アデノウィルス Ad5-F/asMSHbを作成した。多くのプラークが得られ、ウィルスゲノムの解析からも、目的とした F/asMSHb変異ウィルスが得られたことが確認された。さらに実施例 3と同様の方法で、 AxCAZ3- F/wtの DNA- TPCと pWEAxKM- F/asMSHb の DNAを 293細胞に共トランスフエクトすることにより、大腸菌 l acZレポーター遺伝子発現カセットを持ち、なおかつ、 3 - MSH融合ファイバ一変異型の組換えアデノウイルス AxCAZ3-F/asMSHbを作成した。 F/asMSHb変異型のファイバーの DNA配列を配列番号 1 3に示した。実施例 6 GSリンカ一を持つ MSH融合ファイバ一変異型アデノウイルスの作成

実施例 1から 5までは、アデノウイルスのファイバータンパク質の C末端に AS リンカ一（PSASASASAPG配列番号 2 5 ) をはさんでひ- MSHないし ]3 - MSHのリガンドのアミノ酸配列が続く構造（]3 - MSHのリガンドの場合の ASリンカ一は、 C末端にさらにセリン残基が付加されている）をもつ変異型アデノウイルスの作成例を示した。さらに ASリンカ一以外のリンカ一に関しても、悪性黒色腫細胞の治療に有用なファイバ一変異型ウィルスを作成することが可能かどうかを、 GS リンカ一（GSGSGSGSGSG配列番号 2 7 ； 3 - MSHのリガンドの場合は、 C末端にさらにセリン残基が付加されている）を一つの例として用いて検討した。

a) GSリンカ一をコードするプラスミド DNAの作成

GSリンカ一をコードするプライマー No. 1060 (61mer 配列番号 1 4 ) を新たに合成した。さらに PCR反応を容易にするために、 No. 1060よりも短くコドンの使用も少し異なるプライマー No. 1098 (41mer 配列番号 1 5 ) を新たに合成した。 pSKI I+6. 7R- K20をテンプレートとしてさらに No. 931 (Yosh ida et al. , 1998に記載配列番号 1 6 ) と No. 1060で PCR反応を行い、その PCR産物をテンプレートとしてさらに No. 931と No. 1098で PCR反応を行った。

この PCR産物を d 111 /BamH Iで切断して pNEB 193にクローニングして、塩基配列を確認した。次に pWE6. 7R - F/asMSHaと pWE6. 7R - F/asMSHbの ASリンカーを含む XhoI/BamHIの DNA断片を、 GSリンカ一を含む^ I/^ il DNA断片にそれぞれ入れ替えることにより、 pWE6. 7R-F/gsMSHaと pWE6. 7R- F/gsMSHbを得た。それぞれのコスミド DNAの EcoRIサイトに pAxKMからの EcoRI断片 (約 25kbp) を順方向でクロ —ニングすることにより、それぞれ pWEAxKM-F/gsMSHaと pWEAxKM-F/gsMSHbを得た。

b) GSリンカ一を有する MSH融合ファイバー変異型アデノウイルスの作成 a)で作成したコスミドを、 Ad5dlXないし AxCAZ3- F/wt由来の DNA-TPCと共トランスフェクトすることにより、 GSリンカ一を有する MSH融合ファイバ一変異型ァデノウィルス 4種を樹立できた。すなわち、 Ad5-F/gsMSHa, Ad5-F/gsMSHb, AxCAZ3-F/gsMSHa，ならびに AxCAZ3-F/gsMSHbである。以上の 4種は、ウィルスゲノムの解析結果からも、目的とする変異型アデノウイルスであることが確認された。 F/gsMSHaと F/gsMSHbのファイバ一をコードする塩基配列およびそれがコ一ドするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 1 7、 1 8に示した。

実施例 7 K21リンカ一を持つ MSH融合ファイバ一変異型アデノウイルスの作成

実施例 1から 6までは、 ASリンカ一ないし GSリンカーのような 1 1〜12アミノ酸程度の比較的短いリンカ一配列を有する変異型アデノウイルスの作成例を示したが、さらに多数のアミノ酸配列を有するリンカ一に関しても悪性黒色腫細胞の治療に有用なファイバー変異型ウィルスを作成することが可能かどうかを、 ASリンカ一（1 1アミノ酸）または GSリンカ一（1 1アミノ酸）に 25残基のァミノ酸配列（計 37アミノ酸）を加えたリンカ一である asK21リンカ一（配列番号 2 9 ) と gsK21リンカ一（配列番号 3 1 ) を例として用いて検討した。

a) asK21リンカ一ならびに gsK21リンカーをコ一ドするプラスミド DNAの作成

K21リンカ一をコードするプライマ一 No. 1089 (128mer 配列番号 1 9 ) を新たに合成した。 No. 1089と No. 1092のプライマ一を用いて pSKI I+6. 7Rnpをテンプレートにして PCR反応を行い、 PCR産物を^ RIサイトにクローニングし、塩基配列を確認した。これの K21リンカ一をコードする領域である il !から^ !HIまでの DNA断片を pWE6. 7R-F/asMSHa, pWE6. 7R-F/gs SHa, pWE6. 7R - F/asMSHb, PWE6. 7R-F/gsMSHbの^ HIサイ卜へ挿入することによって、それぞれ pWE6. 7R- F/asK21MSHa, pWE6. 7R-F/gsK 1MSHa, pWE6. 7R-F/asK21MSHb, pWE6. 7R- F/gsMSHb のコスミド DNAを得た。これらの K21リンカ一を含むファイバ一をコードするコスミドの^ RIサイトに、 pAxKMの^ RI断片（約 25kbp) を順方向でクロ一ニングすることにより、それぞれ pWEAxKM-F/asK21MSHa, pWEAxKM-F/gsK21MSHa, pWEAxKM-F/asK21MSHb, pWEAxKM-F/gsK21MSHbのコスミド DNAを得た。

b) asK21リンカ一ならびに gsK21リンカ一を有する MSH融合ファイバ一変異型アデノウイルスの作成

a)で作成したコスミド DNAを、 Ad5dlXの DNA- TPCと共トランスフエクトすることにより、それぞれ Ad5- F/asK21MSHa， Ad5-F/gsK21MSHa, Ad5-F/asK21MSHb, Ad5-F/gsK21MSHbのアデノウィルスを樹立することができた。 Ad5 - F/asK21MSHa、 Ad5-F/gsK21MSHa、 Ad5- F/asK21MSHb、 Ad5-F/gsK21MSHbのファイバ一をコードする領域の DNA配列およびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 20、 21、 22 、 23に示した。また同様にして、 AxCAZ3- F/wtの DNA-TPCと共トランスフエクトすることにより、それぞれ、 AxCAZ3-F/asK21MSHa, AxCAZ3-F/gsK21MSHa, AxCAZ3-F/asK21MSHb, AxCAZ3-F/asK21MSHbのアデノウイルスを樹立することができた。以上の 8種は、ウィルスゲノムの解析結果からも、目的とするファイバ —変異型アデノウィルスであることが確認された。

産業上の利用可能性

本発明によれば、ゥィルスを構成しているタンパク質に MSH受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスベクタ一、および該ベクタ一を用レ ^た悪性黒色腫等の MSH受容体を発現している腫瘍に対する診断薬および治療薬を提供することができる。

配列表フリーテキスト

配列番号 1 ： 5型アデノウイルスのファイバ一の一部、 ASリンカ一ペプチドおよび a - MSHをコードする DNA

配列番号 2 ：配列番号 1の DNAを PCRで増幅させるためのテンプレートとして使用する合成 DNA No. 924

配列番号 3 ：配列番号 1の DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 933

配列番号 4 ：配列番号 1の DNAを PCRで増幅させるた ί 一として使用する合成 DNA No. 934

配列番号 5 ：ひ- MSHおよびアデノウイルスのファイバ一のポリ Aシグナルをコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 1061

配列番号 6 ： α -MSHおよびアデノウイルスのファイバーのポリ Aシグナルをコ —ドする DNAを PCRで増幅させるためのアンチセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 1092

配列番号 7 ： pWE6. 7R-F/asMSHaの変異型ファイバ一タンパク質をコードする DNA 配列番号 8 ：ヒト MSH受容体の卜 154残基をコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマ一として使用する合成 DNA No. 1037

配列番号 9 ：ヒト MSH受容体の 150-317残基をコードする DNAを PCRで増幅させるためのアンチセンスプライマ一として使用する合成 DNA No. 1038

配列番号 1 0 ：ヒト MSH受容体の 150-317残基をコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 1039

配列番号 1 1 ：ヒト MSH受容体の 1- 154残基をコードする DNAを PCRで増幅させるためのアンチセンスプライマ一として使用する合成 DNA No. 1040

配列番号 1 2 ： /3 -MSHおよびアデノウイルスのファイバーのポリ Aシグナルをコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成

DNA No. 1075

配列番号 1 3 ： pWE6. 7R-F/asMSHbの変異型ファイバ一タンパク質をコードする DNA

配列番号 1 4 ： 5型アデノウイルスのファイバ一の一部および GSリンカーぺプチドをコードする DNAを PCRで増幅させるためのアンチセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 1060

配列番号 1 5 ： 5型アデノウイルスのファイバ一の一部および GSリンカ一ぺプチドをコードする DNAを PCRで増幅させるためのアンチセンスプライマ一として使用する合成 DNA No. 1098

配列番号 1 6 ： 5型アデノウイルスのファイバ一の一部および GSリンカ一ぺプチドをコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成 DNA No. 931

配列番号 1 7 ： pWE6. 7R-F/gsMSHaの変異型ファイバータンパク質をコ一ドする DNA

配列番号 1 8 ： pWE6. 7R- F/gsMSHbの変異型ファイバータンパク質をコードする醒

配列番号 1 9 ： K21リンカ一をコードする DNAを PCRで増幅させるためのセンスプライマ一として使用する合成 DNA No. 1 089

配列番号 2 0 ： pWE6. 7R- F/asK21MSHaの変異型ファイバ一タンパク質をコードする DNA

配列番号 2 1 ： pWE6. 7R- F/gsK21MSHaの変異型ファイバ一タンパク質をコードする DNA

配列番号 2 2 ： pWE6. 7R- F/asK21MSHbの変異型' 質をコードする腿

配列番号 2 3 ： pWE6. 7R - F/gsK21MSHbの変異型' 質をコードする匪

配列番号 2 4 ： ASリンカ一をコードする DNA

配列番号 2 5 ： ASリンカーべプチド '

配列番号 2 6 ： GSリンカ一をコードする DNA

配列番号 2 7 ： GSリンカ一ぺプチド

配列番号 2 8 ： asK21リンカ一をコードする DNA

配列番号 2 9 ： asK21リンカ一ぺプチド

配列番号 3 0 ： gsK21リンカ一をコードする DNA

配列番号 3 1 ： gsK21リンカ一ペプチド配列番号 3 2 ： pWE6. 7R- F/asMSHaにコードされる変異型ファイバ一タンパク質配列番号 3 3 ： pWE6. 7R- F/asMSHbにコードされる変異型ファイバ一タンパク質配列番号 3 4 ： pWE6. 7R_F/gsMSHaにコードされる変異型ファイバ一タンパク質配列番号 3 5 ： pWE6. 7R-F/gsMSHbにコードされる変異型ファイバータンパク質配列番号 3 6 ： pWE6. 7R- F/asK21 MSHaにコードされる変異型ファイバ一タンパク質

配列番号 3 7 ： pWE6. 7R- F/gsK21MSHaにコードされる変異型ファイバ一タンパク質

配列番号 3 8 ： pWE6. 7R- F/asK21 MSHbにコードされる変異型ファイバ一タンパク質

配列番号 3 9 ： pWE6. 7R- F/gsK21 MSHbにコードされる変異型ファイバ一タンパク

Claims

m求の範囲

1. ウィルスを構成するタンパク質に、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH) 受容体に特異的に結合するリガンドを融合させてなるウィルスベクタ一。

2. ウィルスを構成するタンパク質が、リンカ一を介してメラニン細胞刺激ホルモン（MSH) 受容体に特異的に結合するリガンドに融合している請求項 1記

3. リンカーがオリゴペプチドである請求項 2記載のウィルスベクタ一。

4. リンカーが配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を有する請求項 3記載のウィルスベクタ一。

5. ウィルスを構成するタンパク質が、ウィルスの外表面を構成するタンパク質である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のウィルスベクタ一。

6. リガンドが、 a -MSH、 j3 _MSH、ァ -MSHおよびこれらのいずれか 1項の誘導体からなる群より選ばれるリガンドである請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のウィルスベクタ一。

7. ウィルスが、アデノウイルス科、レトロウイルス科、パルポウィルス科、ヘルぺスウィルス科、ボックスウィルス科、パポ一バウィルス科、へパドナウィルス科、トガウィルス科、フラビウィルス科、コロナウィルス科、ラブドウィルス科、パラミクソウィルス科、オルソミクソウィルス科、バンャウィルス科、ァレナウィルス科およびレオウィルス科よりなる群のいずれかの科に属するウィルスから選ばれる請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のウィルスべク夕一。

8. ウイルスがヒトアデノウィルスである請求項 1〜 6のいずれか 1項に記

9. ウィルスが外来の遺伝子を含むウィルスである請求項 1〜 8のいずれ力、 1項に記載のウィルスベクタ一。

10. 遺伝子が、非毒性のプロドラッグを細胞毒性を有する薬剤に変換することができる酵素をコードする遺伝子である請求項 9記載のウィルスベクタ一。

1 1. 遺伝子が、単純へルぺスウィルス ·チミジンキナーゼ（HSV- tk) またはシトシン ·デァミナ一ゼ（Cyt os ine deaminase, CD) をコードする遺伝子である請求項 1 0記載のウィルスベクター。

12. 遺伝子が、直接または間接的に細胞毒性作用を有する分子をコードする遺伝子である請求項 9記載のウィルスベクタ一。

13. 遺伝子が、サイト力イン、細胞増殖因子または細胞増殖抑制因子をコ —ドする遺伝子である請求項 1 2記載のウィルスベクタ一。

14. 遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子または細胞死調節遣伝子である請求項 1 2記載のウィルスベクタ一。

15. 外来の遺伝子が、アデノウイルス E1Aないし E1B の野生型または変異型の遺伝子または該遺伝子の一部である請求項 9記載のウィルスベクタ一。

16. 請求項 1〜 1 5のいずれか 1項に記載のウィルスベクターを含有してなる医薬。

17. 請求項 1〜 1 5のいずれか 1項に記載のウィルスベクターを含有してなる抗腫瘍剤。

18. 腫瘍が悪性黒色腫である請求項 1 7記載の抗腫瘍剤。

19. 請求項 1〜 1 5のいずれか 1項に記載のウィルスベクタ一を含有してなる腫瘍の診断薬。

20. 腫瘍が悪性黒色腫である請求項 1 9記載の診断薬。

21 . 配列番号 2 5、 2 7、 2 9および 3 1のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を有するリン力一。

22. 請求項 2 1記載のリンカ一をコードする D N A。

23. 配列番号 2 4、 2 6、 2 8および 3 0のいずれか 1つに示される塩基配列からなる D N A。

24. 配列番号 3 2〜3 9のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を有する

25. 請求項 24記載のタンパク質をコードする DNA。

26. 配列番号 7、 13、 17、 18、 20、 21、 22および 23のいずれか 1つに示される塩基配列からなる DNA。