WO2000050608A1 - Nouveau polypeptide - Google Patents

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WO2000050608A1
WO2000050608A1 PCT/JP2000/001070 JP0001070W WO0050608A1 WO 2000050608 A1 WO2000050608 A1 WO 2000050608A1 JP 0001070 W JP0001070 W JP 0001070W WO 0050608 A1 WO0050608 A1 WO 0050608A1
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polypeptide
dna
cells
sugar chain
gene
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PCT/JP2000/001070
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Hisashi Narimatsu
Soichiro Isshiki
Akira Togayachi
Katsutoshi Sasaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention relates to the synthesis of type 1 sugar chains such as sialyl Lewis a sugar chain in gastrointestinal cancer cells such as colon cancer cells and Teng carcinoma cells expressing sialyl Lewis a sugar chain.
  • Novel polypeptide having galactosyltransferase activity method for producing the polypeptide, DNA encoding the polypeptide, recombinant vector into which the DNA has been incorporated, trait carrying the recombinant vector A transformant, an antibody recognizing the polypeptide, a method for producing a type 1 sugar chain-containing sugar chain using the polypeptide, and a glycoconjugate containing the sugar chain, and a transformation having the recombinant vector.
  • the present invention relates to a method for producing a type 1 sugar chain-containing sugar chain and a complex carbohydrate containing the sugar chain using a body.
  • Glycans are involved in life phenomena such as development and differentiation and cell recognition, and are thought to be deeply involved in the development and progression of inflammation, cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, and many other diseases. [Kibata Yo, Hakomori Senichiro, Nagai Katsu ed., Glycobiology Series I-II, Kodansha, (1993), Glycobiology, 3, 97 (1993)].
  • Sugar chains are added to proteins and lipids to exist as glycoproteins, proteoglycans, or glycolipids, and also as oligosaccharides.
  • a sugar chain having a Gal3 ⁇ 3GlcNAc structure is called a type 1 sugar chain, and constitutes a skeletal sugar chain of a Lewis blood group antigen or a cancer-associated sugar chain antigen.
  • Lewis blood group antigens include Lewis a sugar chain (Gal? 1-3 (Fuca 4) GlcNAc) and Lewis b sugar chain [Fuc
  • GlcNAc sialyl Lewis c-glycans
  • NeAc a2-3Gal-l-3GlcNAc sialyl Lewis c-glycans
  • gastrointestinal cancers such as colorectal cancer and Tengler cancer.
  • adhesion molecule selectin E-, P-, and L-selectin
  • sugar chain ligands sialyl Lewis X sugar chain or its related sugar chain
  • Sialyl Lewis X sugar chain QieuAc 2-3-Gal 4 (Fuc 3) GlcNAc] is a structural isomer of Sialyl Lewis a sugar chain, which binds to selectin. Have been. In addition, there is a report that the expression level of sialyl Lewis a sugar chain in colorectal cancer and penile cancer is correlated with poor prognosis of the cancer.
  • the Gal / trit 3GlcNAc structure is synthesized by GlcNAc 51,3-galactosyltransferase. So far, three GlcNAc-l, 3-galactosyltransferase (? 3Gal-Tl,? 3Gal-T2, and? 3GalT3) genes have been cloned and their respective genes have been cloned. The acceptor substrate specificity of the enzyme has been analyzed [JP-A-6-181759, J. Biol. Chem., 273, 58-65 (1998), J. Biol. Chem., 273, 433-440 (1998), J. Biol. Chem., 273, 12770-12778 (1998)]. In addition, another /?
  • T 4 synthesizes gangliosides GA1, GM1, or GDlb, but does not synthesize the Gal3G3NAc structure.
  • GlcNAc 51,3-galactosyltransferase involved in the synthesis of cancer-related sugar chains, sialyl Louis a-glycan and sialyl Lewis c-glycan can be identified in gastrointestinal cancers such as colorectal cancer and Teng's carcinoma. It is presumed that a more accurate diagnosis of cancer can be made by examining the expression level of the enzyme or the enzyme gene. In addition, suppression of the enzyme activity or transcription and translation of the enzyme gene is expected to enable suppression of cancer metastasis. However, the enzyme or the enzyme gene has not been identified so far.
  • GlcNAc 51,3-galactosyltransferase from colon cancer cell line Colo205 Although the enzyme has been partially purified, isolation of the enzyme, determination of the amino acid sequence of the enzyme, and isolation of the enzyme gene have not been completed [J. Biol. Chem., 262, 15649-15658 ( 1987), Archi. Biochem. Biophys. 270, 630-646 (1989), Archi. Biochem. Biophys. 274, 14-25 (1989)].
  • a sugar chain having a strong binding ability to selectin is useful as a selectin antagonist in the treatment and prevention of inflammation and cancer metastasis. Therefore, it is involved in the synthesis of sialyl Lewis a sugar chains in gastrointestinal cancers such as colorectal cancer and renal carcinoma, etc.
  • 1,3—Galactose transferase is an efficient method for selectin antagonism. It is estimated that it can be used for synthesis.
  • the present invention utilizes a polypeptide having a novel /? 1,3-galactosyltransferase to improve pharmaceutical products such as anti-inflammatory, anti-infectious disease, or cancer metastasis, foods such as dairy products, and protein improvement. And a method for diagnosing diseases such as cancer.
  • the present invention relates to the following (1) to (47).
  • the polypeptides having novel /? 1,3-galactosyltransferase activity of the present invention include not only colon cancer cells expressing sialyl Lewis a sugar chains but also sialyl Lewis c sugar chains and Lewis a sugar chains. It is also present in gastrointestinal cancer cells such as colon cancer cells and renal cancer cells expressing type 1 sugar chains such as Lewis b sugar chains.
  • polypeptides having a 1,3-galactosyltransferase activity involved in the efficient synthesis of type 1 sugar chains present in these digestive cancer cells are also the polypeptides of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is a novel 31,3-galactosyltransferase which is different from the known / 3Gal-Tl, 53Gal-T2 and / 3Gal-T3.
  • Gal5tri3GlcNAc structure comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of the above (a) or (b), and having the polypeptide.
  • Possible /? Polypeptides having 1,3-galactosyltransferase activity are described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter referred to as Molecular 'Cloning No. 2). Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as' protocols in 'molecular' biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above.
  • the number is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and BLAST CJ. Ol. Biol., 215, 403 (1990)] and FAS TA CMethods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)], etc. The calculation method and method for defining% homology are described. It is preferred that the homology is at least 60% or more, usually 8 °% or more, particularly 95% or more.
  • the amino acid sequence of the above-mentioned polypeptide (a) or (b) has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and is capable of synthesizing a Gal ⁇ -3GlcNAc structure.
  • Polypeptides having galactosyltransferase activity are novel /? 1,3 different from known /? 3Ga1-T1, 53Ga1-T2 and /? 3Ga1-T3.
  • It is a galactose transferase.
  • the ⁇ 1, 3-galactosyltransferase activity is the activity of transferring galactose to the ⁇ -acetylglycosamine residue present at the non-reducing terminal of the sugar chain by a 1,3 bond.
  • the polypeptide according to (2) is the polypeptide according to (2).
  • the ⁇ 1,3-galactosyltransferase activity is due to the N-acetylglucosamine residue or N-acetyl present at the non-reducing end of GlcNAc? 3Gal? 4Glc.
  • the polypeptide according to the above (1) or (2) which has an activity of transferring galactose to glucosamine monosaccharide by 1,3 bonds.
  • DNA selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) and (d):
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to a DNA selected from the group consisting of the above DNAs (a), (b) and (c) as a probe, Seesion method, plaque 'DNA that can be obtained by using the hybridization method or the Southern plot hybridization method.Specifically, DNA derived from colonies or plaques is immobilized.
  • hybridizable DNA examples include those calculated using BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] and FASTA Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)]. (Calculation means and methods for defining% homology are described), at least 60% homology with the nucleotide sequence of DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA having homology, preferably DNA having homology of 80% or more, more preferably DNA having homology of 95% or more.
  • Polypeptides capable of synthesizing the Gal / triol 3GlcNAc structure encoded by the DNA and having a 1,3,3-galactosyltransferase activity are known /? 3Ga1-T1,? 3Ga1-T2 It is a novel /? 1,3-galactosyltransferase that is different from /? 3Ga1-T3.
  • transformant is a transformant selected from the group consisting of a microorganism, an animal cell, a plant cell, an insect cell, a non-human transgenic animal, and a transgenic plant. Convertible.
  • Animal cells are mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, CH0 cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, Namalwa cells, Namalwa KJM-1 cells, human embryos Kidney cells and human leukemia cells
  • insect cell is an insect cell selected from the group consisting of an ovary cell of Spodoptera f rugiperda, an ovary cell of Trichoplusiani, and an ovary cell of Ryco.
  • a transformant having a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding the polypeptide according to any one of the above (1) to (4) into a vector is cultured in a culture medium.
  • a method for producing the polypeptide comprising: producing and accumulating the polypeptide in the culture; and collecting the polypeptide from the culture.
  • an oligosaccharide having an N-acetylglucosamine residue at the non-reducing end ii) an acceptor substrate selected from a complex carbohydrate having an N-acetylglucosamine residue at the non-reducing end, and
  • an acceptor substrate selected from the group consisting of glycoconjugates having a glucose residue at the non-reducing end of the sugar chain, and
  • a transformant selected from the group consisting of the transformant derived from the microorganism, animal cell, plant cell and insect cell according to (9) above is cultured in a culture medium, and the galactose is added to the culture.
  • Tose produces / accumulates N-acetylglycosamine, N-acetylglycosamine residue, sugar chain having a structure added to glucose or glucose residue, or complex carbohydrate containing the sugar chain at 1,3 bonds
  • the non-human transgenic animal described in the above (9) is bred, wherein galactose is N-acetylglucosamine, N-acetylglucosamine residue, glucose or glucose having 51,3 bonds in the animal.
  • galactose is N-acetylglucosamine, N-acetylglucosamine residue, glucose or glucose having 51,3 bonds in the animal.
  • the complex carbohydrate is a complex carbohydrate selected from the group consisting of glycoproteins, glycolipids, proteoglycans, glycopeptides, lipopolysaccharides, peptidoglycans, and glycosides in which sugar chains are bonded to steroid compounds, etc.
  • a diagnostic agent for cancer or cancer metastasis comprising the antibody according to (32).
  • a method for screening a compound that alters the activity of the polypeptide which comprises contacting the polypeptide according to any one of the above (1) to (4) with a test sample. .
  • a cell expressing the polypeptide according to any one of (1) to (4) above is brought into contact with a test sample, and an anti-Sialyl Lewis a antibody, an anti-Lewis a antibody, an anti-Lewis b antibody or an anti-Sialyl Lewis using a c antibody to measure the content of a sialyl Lewis a sugar chain, a Lewis al chain, a Lewis b sugar chain or a sialyl Lewis c sugar chain, characterized in that the expression of a compound encoding the polypeptide is fluctuated. Screening method.
  • a cell expressing the polypeptide of any one of the above (1) to (4) is brought into contact with a test sample, and the polypeptide content is reduced using the antibody of the above (32).
  • Methods for preparing a cDNA library include Molecular Cloning 2nd Edition, Current 'Protocols'in' Molecular Biology Supplement 1-38, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), or other commercially available kits, such as Superscript 'plasmid' system for 'cDNA synthesis' and 'plasmid' Using the Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL)) ⁇ Zap-cDNA-Synthesis' kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, Straugene) And the like.
  • Any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as a closing vector for preparing a cDNA library as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, each other, 58 (1992)), pBluescript II SK (+) CNucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), ZAP II
  • E. coli LE392 is transformed to prepare a cDNA library.
  • pBluescript II SK (+), pBluescript SK (-) (all manufactured by Stratagene), pDIRECT (Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)), pCR-ScriptAmpSK (+) (Stratagene, Strategies , 5, 6264 (1992)], pT7Blue ( ⁇ & 611 companies Ltd.], (3 ⁇ 411 [Inbitorojen Inc., 8101 ⁇ 1,111,010, 9, 657 (1991)], pCR-TRAP [Genehunter Co., Ltd.], ⁇ ⁇ (5 , ⁇ 3, company).
  • Examples of the plasmid containing DNA of SEQ ID NO: 2 include pAMo-3GT5 and pBS-3GT5 (FERM BP-6645) described in Examples described later.
  • any vector can be used as long as it can incorporate the cDNA and can be expressed in animal cells, for example, pcDNAI / Amp, pcDNAI, pCD8 (all commercially available from Funakoshi), pAGE107 (Japanese Patent Publication No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pAMo, pAMoA (J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 (1993) s aka pAMoPRSA (Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963), pAS3-3 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075), and the like.
  • the obtained transformed cells are cultured by a conventional method.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • the target DNA is also prepared by chemically synthesizing DNA encoding the polypeptide. be able to. Chemical synthesis of DNA is performed using a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the thiophosphite method, a Perkin 'DNA synthesizer model 1392 manufactured by Elma Inc. using the phosphoramidite method, etc. be able to.
  • the above-mentioned oligonucleotides in which the melting temperature (Tm) and the number of bases of both do not extremely change are preferable.
  • Specific examples include oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 and the like.
  • oligonucleotide derivative examples include an oligonucleotide derivative in which a phosphate ester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide in which an N 3, -P 5 ′ phosphonate bond is an N 3, -P 5 ′ phosphor.
  • polypeptide of the present invention Production of novel /? 1,3-galactosyltransferase polypeptide (hereinafter also referred to as polypeptide of the present invention)
  • polypeptide of the present invention can be prepared by the methods described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols' in 'Molecular' Biology Supplement 1 to 38, etc. DNA can be expressed and produced in host cells.
  • DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared.
  • DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the polypeptide so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for expression in the host. The DNA is useful for improving the production rate of the polypeptide.
  • a recombinant DNA (recombinant vector) is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length DNA into the downstream of a promoter in an appropriate expression vector. By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • any prokaryotic cell, yeast, animal cell, insect cell, plant cell, or the like can be used as long as it can express the gene of interest.
  • an animal individual or a plant individual can be used.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the above host cells, or can be integrated into the chromosome, and contains a promoter at a position suitable for transcription of the novel /? 1,3-galactose transferase gene. Is used.
  • Expression base Kuta one, for example, (commercially available from both Beri down Gar Mannheim) P BTrp2, pBTacK pBTac2, pKK233- 2 ( Pharmacia Co.), pSE280 (In Bitorojen Co.), pGEMEX- 1 [Promega (Promega) Co. PQE-8 (QIAGEN), pKYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl CAgric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)), pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is the ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases) is used. Preferably, it is used.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia col i X-Blue Escherichia coli XL2- Blue, Escherichia coli DHU Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL DE3) pLysS,
  • Escherichia coli brain 74 (DE3), Escherichia coli HMS174 (DE3) pLysS, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens AT, bacterium ATCC, Brevibacterium ammonia bacterium ATCC bacterium ATCC ATCC14067, Corynebacterium glutamicum ATCC13869,
  • Any method for introducing the recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • electoporation method CNucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], calcium ion Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (63-248394), Gene 17, 17, 107 (1982), and Molecular & General Genetics, 168, 111. (1979).
  • host cells examples include yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schizinomyces, Pichia, and the like.Specifically, Saccharomyces cerevisiae,
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • electroporation Methods. EnzymoL, 194, 182 (1990)
  • USA 84, 1929 (1978)
  • the lithium acetate method J. Bacteriol., 153, 163 (1983)
  • any promoter that can be expressed in animal cells can be used.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include mouse myeloma cells, rat 'myeloma cells', mouse' hyperidoma cells, Chinese hamster cells CH0 cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, and human cells. Examples include Namalwa cells or Najnalwa KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is obtained.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • insect cells ovary cells of Spodoptera frugiperda, ovary cells of Trichoplusia, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.
  • Spodoptera frugiperda ovarian cells include Sf9 and Sf21 (Baculovirus 'Expression' Vector Vector 'Laboratory 1' manual), etc.
  • Ovarian cells of Trichoplusia ni include High 5, BTI-TN-5B1-4 (manufactured by Invitrogen), and Bombyx mori N4 and the like.
  • Methods for co-transferring the above-described recombinant gene into insect cells and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), and Lipofexion method. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 7413 (1987)].
  • DNA can be introduced into insect cells using the same method as that used to introduce DNA into animal cells.
  • the polysaccharide is prepared according to a known method [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)].
  • the expression vector include Ti plasmid and tobacco mosaic virus vector.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in a plant cell, and examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter.
  • the expression efficiency of the gene can also be increased by inserting the maize alcohol dehydrogenase gene intron 1 between the promoter and the gene to be expressed.
  • Examples of the host cell include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, carrot, wheat, barley, rye, Alfalpha, flax and the like.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • Agrobacterium Japanese Patent Application Laid-Open Nos. -78080, W094 / 00977
  • an electoral-portation method Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun Japanese Patent No. 2517813
  • Japanese Patent No. 2517813 Japanese Patent No. 2517813
  • the cells or organs of the plant into which the gene has been introduced can be cultured in large quantities using a jar fermenter.
  • culture medium use commonly used Murashige 'and' squeeg (MS) medium, white (White) medium, or medium supplemented with plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. be able to.
  • MS Murashige 'and' squeeg
  • White white
  • plant hormones such as auxin, cytokinin, etc.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a plant into which the gene has been introduced (transgenic plant) can also be created by redifferentiating the plant cell into which the gene has been introduced.
  • Animal polypeptides can also be used to produce the polypeptides of the present invention.
  • An animal into which a gene has been introduced according to a known method [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)].
  • the polypeptide of the invention can be produced therein.
  • promoter Any type of promoter can be used as long as it can be expressed in animals.
  • mammary gland cell-specific promoters such as Hicasein Promo — Yuichi, Casein Promo Yuichi,? Globulin promoter overnight, whey acidic protein promoter evening, etc. are preferably used.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which the DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method to produce the polypeptide.
  • the polypeptide can be produced by accumulating and collecting the polypeptide from the culture.
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the polypeptide, and the polypeptide is collected from the animal or plant individual.
  • Polypeptides can be produced.
  • a non-human transgenic animal carrying the DNA of the present invention is bred, and a polypeptide having a novel /? 1,3-galactose transferase activity encoded by the recombinant DNA is obtained. Is produced and accumulated in the animal, and the polypeptide is collected from the animal, whereby a polypeptide having a novel /? 1,3-galactose transferase activity can be produced. Examples of the production-accumulation site in the animal include milk, eggs, and the like of the animal.
  • a transgenic plant having the DNA of the present invention is cultivated, and a polypeptide having a novel /?
  • 1,3-galactose transferase activity encoded by the recombinant DNA is added to the plant.
  • a polypeptide having a novel /? 1,3-galactose transferase activity can be produced.
  • the transformant for producing a polypeptide of the present invention is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as a yeast
  • these transformants of the present invention are cultured in a medium, and the polypeptide of the present invention is contained in a culture.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by producing and accumulating the peptide and collecting it from the culture.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture C.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by each microorganism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic acids, ammonium salts of organic acids, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. , Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and digests thereof can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • Cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0. Adjustment of pH is performed using an inorganic or organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be used if necessary. It may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • isopropyl-15-D-thiogalactoviranoside or the like is used.
  • a medium for culturing the cell may be a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) ], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] or A medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums is used.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, and 5% C ⁇ 2 .
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • the medium for culturing the cell may be a commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900II SFM A culture medium (manufactured by Gibco BRL), ExCell 400, ExCell 405 (all manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) and the like can be used.
  • Gene expression methods include, besides expressing the full-length polypeptide,
  • Glycosyltransferases generally have a type 2 membrane protein topology, an N-terminal cytoplasmic region consisting of a few to several tens of amino acids, a membrane-binding region having a highly hydrophobic amino acid sequence, and a few to a few tens of amino acids. It consists of a stem region and most of the remaining C-terminal portion, including the catalytic region. Most of the remaining C-terminal portion, including the stem and catalytic regions, appears to be exposed in the Golgi lumen.
  • the boundary between the stem region and the catalytic region can be determined experimentally by preparing a polypeptide from which the N-terminus has been deleted and examining how far the deletion will result in loss of activity. On the other hand, by comparing the amino acid sequence with a similar glycosyltransferase that has knowledge of the stem region and the catalytic region, the stem region and the catalytic region can also be predicted.
  • the structure of the novel /? 1,3-galactosyltransferase of the present invention has the same structure as other glycosyltransferases.
  • the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, at least a cytoplasmic region consisting of 7 amino acids at the N-terminal, followed by a hydrophobic-rich membrane-binding region consisting of 19 amino acids, It consists of a stem region consisting of 4 amino acids, and most of the remaining C-terminal portion including the catalytic region.
  • a polypeptide comprising the 31st to 310th amino acid sequence is considered to contain a catalytic region.
  • the partial polypeptide containing the full-length polypeptide or a region having a 1,3-galactosyltransferase activity is described in Molecular Cloning Second Edition in addition to direct expression. It can also be expressed as a secreted protein or a fusion protein according to the method or the like.
  • the proteins to be fused include galactosidase, protein A, the IgG binding region of protein A, chloramphenicol acetyltransferase, poly (Arg), Poly (G lu), protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green ' Fluorescent protein and any antibody epitope [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)].
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide outside the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an ordinary enzyme isolation / purification method can be used. For example, when the polypeptide of the present invention accumulates in a dissolved state in the cells of the transformant for producing the polypeptide of the present invention, the cells in the culture are collected by centrifuging the culture. After washing the cells, the cells are crushed with an ultrasonic crusher, a French press, a Mantongaulin homogenizer, a Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • Galactose is a 1,3-linked N-acetylglucosamine, N-acetylglucosamine residue, a sugar chain having a structure added to glucose or a glucose residue, and a complex carbohydrate containing the sugar chain.
  • a structure in which galactose is added to the N-acetylglycosamine residue via /? 1,3 bonds As a sugar chain containing a structure, a sugar chain containing a sialyl Lewis a structure, a sugar chain containing a sialyl Lewis c structure, a sugar chain containing a Lewis a structure, a sugar chain containing a Lewis b structure, and Gal Gal 3Gal n -A sugar chain containing a 3GlcNAc structure, Gal 1-3 (Fuc 2) Gal? 1-3-A sugar chain containing a 3GlcNAc structure, GalNAc al-3 (Fuc al-2) Gal ⁇ l-3GlcNAc structure And the like.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium as needed.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene and octane decylamine (for example, Nimeen S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium, bromidealkyldimethyl, benzylammoniumchromate.
  • glycoconjugate having an N-acetylglycosamine residue at the non-reducing end of the sugar chain a glycoconjugate containing a sugar chain having any one of the structures of the oligosaccharide at the non-reducing end of the sugar chain And complex carbohydrates containing an asialo-galacto complex-type N-linked sugar chain.
  • Animals such as egrets, goats, rats, mice, and hamsters can be used for the administration.
  • Serum is obtained from a non-human mammal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and a polyclonal antibody can be separated and purified from the serum by the following method.
  • Rats whose sera showed a sufficient antibody titer against the partial polypeptide of the polypeptide of the present invention used for immunization are used as a source of antibody-producing cells.
  • the spleen is shredded in a MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as in the polyclonal method.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the antibody class refers to the antibody isotype, and in humans, includes IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE.
  • the subclass is an isotype within a class, and includes IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 in mice and IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 in humans.
  • the human chromosomal gene encoding the polypeptide of the present invention was identified by comparing the sequence of the human cDNA encoding the polypeptide of the present invention with the sequence of the human chromosomal gene registered on the database.
  • the structure of the gene can be clarified. If a chromosomal gene sequence that matches the sequence of the cDNA is registered, the sequence of the chromosome gene is compared with the sequence of the chromosome gene to obtain the promoter region of the chromosomal gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • the exon and intron structures can be determined.
  • diagnosis of disease and prediction of prognosis can be performed by examining the Fuc-TII I polymorphism.
  • the polymorphism analysis of the present gene can be performed using the gene sequence information of the present gene. Specifically, genetic polymorphisms can be analyzed using the Southern plot method, direct sequence method, PCR method, DNA chip method, etc. [Clinical test, 42, 1507-1517 (1998), clinical test, 42, 1565-1570 (1998)]. (6) Use of the polypeptide of the present invention
  • polypeptide of the present invention can be screened for a compound that enhances or inhibits the activity of the polypeptide by the method (a) of (8) below.
  • Examples of the immunological detection method of the polypeptide of the present invention include an ELISA method using a microplate, a fluorescent antibody method, a Westin blot method, and an immunohistological staining method.
  • the immunological assay Sanditsuchi ELISA method E Pi Bok one flop using two different monoclonal antibodies of the antibodies that react with polypeptides of the present invention in the liquid phase, radioactive isotopes, such as 126 1 And a radioimmunoassay method using the polypeptide of the present invention and an antibody recognizing the polypeptide of the present invention.
  • the above detection or quantification method can be used for diagnosis of colorectal cancer, Teng's cancer, and the like.
  • the antibody of the present invention can be used as a medicament, for example, as a therapeutic agent for diseases such as colorectal cancer and thyroid cancer.
  • the pharmaceutical containing the antibody of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers to give a pharmaceutical preparation. It is desirable to provide as a pharmaceutical preparation manufactured by any method well known in the technical field of the invention.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, sesame oil, olive oil, soybean oil, etc.
  • oils preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters, flavors such as strawberry flavor and ⁇ permint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, sugar, polyvinyl alcohol, It can be produced using a binder such as hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 // to 8111/1 ⁇ per adult per day.
  • the novel /? 1,3-galactosyltransferase polypeptide of the present invention can be used in gastrointestinal cancer cells such as colon cancer cells and kidney cancer cells to produce sialyl Lewis a sugar chains, sialyl Lewis c sugar chains, Lewis a sugar chains, Because it is involved in the synthesis of type 1 sugar chains such as Lewis b sugar chains, use a compound that enhances or inhibits the activity of the polypeptide to increase or decrease the amount of type 1 sugar chains synthesized in cells Is possible.
  • a compound that promotes or suppresses the transcription process of a gene encoding the polypeptide or the translation process from a transcript to protein controls the expression of the polypeptide, and suppresses the type 1 sugar in a cell. It is possible to control the amount of chain synthesis.
  • the above compounds can be obtained by the following methods (a) to (e).
  • Examples of the measurement method using the above antibody include a ELISA method using a microplate, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and a detection method using immunohistochemical staining.
  • the amount of the polypeptide in the cells is determined by the method of (4). Measurement is performed using the antibody of the present invention described above, and a compound having an activity of increasing or decreasing the amount of the polypeptide is selected and obtained.
  • a detection method using an ELISA method using a microplate for example, a detection method using an ELISA method using a microplate, a fluorescent antibody method, a Western plot method, immunohistological staining, or the like can be mentioned.
  • a plasmid in which a DNA obtained by linking the repo overnight gene was incorporated downstream of the promoted night obtained in (4) above was prepared by a known method, and the plasmid was added to the animal cell described in (2) above.
  • the repo genes include, for example, the chloramphenicil 'acetyltransferase gene, the? -Glucuronidase gene, the galactosidase gene, the lactate gene, the luciferase gene, the equorin gene or the green fluorescent protein. GFP) gene and the like.
  • the target gene on a chromosome in a non-human animal for example, an embryonic stem cell (embryonic stem cell) such as a sea lion, a sheep, a goat, a bush, a horse, a chicken, or a mouse.
  • embryonic stem cell embryonic stem cell
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention is inactivated or inactivated by a known homologous recombination technique (for example, Nature, 326, 6110, 295 (1987), Cell, 51, 3, 503 (1987), etc.). Mutant clones can be created that have been replaced with any sequence [eg, Nature, 350, 6315, 243 (1991)].
  • a chimera comprising an embryonic stem cell clone and normal cells by a technique such as an injection chimera method or a collective chimera method. Individuals can be created.
  • the polypeptide of the present invention on the chromosome is Mutations can be introduced at any position in the DNA to be loaded. For example, by introducing mutations such as base substitutions, deletions, and insertions into the translation region of the DNA encoding the polypeptide of the present invention on the chromosome, the activity of the product can be changed. Further, by introducing a similar mutation into the expression control region, it is possible to modify the degree, timing, tissue specificity, etc. of the expression. Furthermore, the expression timing, expression site, expression amount, and the like can be more positively controlled by combination with the Cre-- ⁇ system.
  • Examples of such cases include the use of promoters expressed in a specific region of the brain and deletion of the target gene only in that region [Cell, 87, 7, 1317 (1996)] and Cre. It has been known that an organ-specific deletion of a target gene at an intended time using an adenovirus that expresses [Science, 278, 5335, (1997)].
  • the expression of the DNA encoding the polypeptide of the present invention on the chromosome can be controlled at any time or in any tissue, or any insertion, deletion, or substitution can be performed in the translation region or expression control region. It is possible to produce a knockout non-human animal having the above.
  • Such a knockout non-human animal can induce symptoms of various diseases caused by the polypeptide of the present invention at any time, any degree, or any site.
  • the knockout non-human animal of the present invention becomes an extremely useful animal model in the treatment and prevention of various diseases caused by the polypeptide of the present invention.
  • it is very useful as a model for evaluation of therapeutic and prophylactic agents, functional foods, health foods, etc.
  • Fig. 1 A in Fig. 1 shows the results of measuring the expression levels of type 1 sugar chains (sialyl-sugar a-sugar, Lewis-a-sugar, and Lewis-b-sugar) in various human cancer cell lines. .
  • type 1 sugar chains sialyl-sugar a-sugar, Lewis-a-sugar, and Lewis-b-sugar
  • Analysis was performed using ACS.
  • the +10, +10, 10, Sat, and I are shown in order of strong reactivity with each antibody. One indicates that there was no reactivity with the antibody.
  • NT means not analyzed.
  • FIG. 1 shows the results of the quantitative PCR method using human 3Ga1-T1, human-3Ga1-T2, human-3Ga1-T2 in various human cancer cell lines.
  • FIG. 3 is a view showing the results of quantifying the amounts of transcripts of 3Ga1— ⁇ 3 and human 3Gal—T4. The amount of each transcript of 1,3-galactosyltransferase gene in various cell lines is considered to be expressed to the same extent in all cells. When the amount of transcript of? -Actin is 1000 It was displayed as a relative value of
  • FIG. 2 shows the construction process of Plasmid pBS-3GT5.
  • Fig. 3 A in Fig. 3 shows the appearance of Namalwa cells (Namalwa (mock)) transfected with control plasmid (pAMo) or human?
  • An indirect fluorescent antibody was obtained from Namalwa cells (Namalwa-3GT5) transfected with 3G a1-T5 expression plasmid (pAM0-3GT5) using anti-Sialyl Lewis c sugar chain antibody (DU-PAN-2).
  • FIG. 3 is a view showing the results of analysis using FACS after staining. The shaded histogram is the result when A-PBS was used instead of DU-PAN-2.
  • 4A shows the results of quantifying the amount of human 3 Ga1-T5 transcript in various human cancer cell lines using quantitative PCR.
  • the amount of human 33Gal-T5 transcripts in various cell lines is considered to be expressed to the same extent in all cells. It was displayed as a relative value when it was done.
  • FIG. 4B shows the results of examining the expression of CA19-9 antigen-containing protein in various human cancer cell lines by Western blotting analysis.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of quantifying the amount of human 3Ga1-T5 transcript in various human tissues using the quantitative PCR method. The amount of transcript of human ⁇ 3Ga1-T5 in each tissue is considered to be expressed to the same extent in all cells.-The amount of transcript of actin is expressed as a relative value when the amount of transcript is set to 1000. did.
  • FIG. 6A is a diagram showing the structure of the human 33 Ga 1-T5 chromosome gene.
  • the four exons are squares, and the introns are lines.
  • the coding area (open reading frame) is shaded.
  • the positions of the primers (si-1, si-2, si-3, si-4) used for the analysis of the isoform of 3G a1—T5c DNA are indicated by arrows.
  • FIG. 6B shows the structure of the isoform of human 3Gal-T5c DNA.
  • the abundance ratio indicates the expression amount of each isoform in Colo205 cells as a percentage.
  • FIG. 3 shows the results of examining the expression levels of human 3 Ga1-T5 cDNA isoforms in Colo205 cells using the ⁇ method.
  • isoforms were identified by digestion with the restriction enzymes (XbaI or Bsml) shown in FIG. none means that no restriction enzyme treatment is performed.
  • the left lane shows the molecular weight (100 bp ladder).
  • Example 1 Measurement of expression level of type 1 sugar chain and expression level of known /? 1,3-galactose transferase gene in various cell lines
  • type 1 sugar chains Sialyl Lewis a sugar chain, Lewis a sugar chain, Lewis b sugar chain
  • 1,3-galactosyltransferase gene By measuring the expression level of 1,3-galactosyltransferase gene, it is involved in the synthesis of type 1 sugar chains in colon cancer cell lines or rutile cancer cell lines /? 1,3-galactose transfer An attempt was made to identify the enzyme.
  • type 1 sugar chain Sialyl Lewis a sugar chain, Lewis a sugar chain, Lewis b sugar chain
  • anti-Sialyl Lewis a sugar chain antibody anti-Lewis a sugar chain antibody
  • anti-Lewis b sugar chain After staining with a fluorescent antibody using a chain antibody, analysis was performed using FACS (A in FIG. 1).
  • transcripts of the known /? 1,3-galactosyltransferase (? 3Gal-Tl, 53Gal-T2,? 3Gal- ⁇ 3, 53Gal-T4) genes in various human cell lines — PCR method [Pro Natl. Acad. Sci. USA., 87, 2725 (1990), J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994), JP-A 06-181759, J. Biol. Chem., 273 , 26729 (1998)].
  • the amount of each ⁇ 1,3-galactose transferase gene transcript in various cell lines is considered to be expressed to the same extent in all cells.
  • the relative value when the amount of --actin transcript is 1000 (B in Fig. 1).
  • Cell lines include colorectal cancer cell lines (Colo205, Colo201, SW1116, LS180, HT29, WiDr, HCT-15, SW480, SW620), ligament cancer cell lines (Capan-1, Capan-2), gastric cancer cell lines (KATOII I, MKN45, MKN74), lung cancer cell line (PC-1), neuroblastoma cell line (SK-N-MC, SK-N-SH), lymphoma cell line (Namalwa, Jurkat), prostate cancer cell The strain (PC-3) was used.
  • each cell After culturing the above cells in a medium suitable for each cell, each cell is cultured with an anti-Sialyl Lewis a glycan antibody (19-9), anti-Lewis a glycan antibody (7LE), or an anti-Lewis b glycan antibody (Neokokusai Was stained with a fluorescent antibody and analyzed using FACS. The specific method is shown below.
  • Each cell (about 1 ⁇ 10 6 ) was placed in a microtube (1.5 ml: manufactured by Eppendorf), and the cells were collected by centrifugation (550 ⁇ g, 7 minutes).
  • the cells were washed with 0.191111 of phosphate buffer PBS containing 0.1% sodium azide (A-PBS: 8 g / 1 NaCl, 0.2 g / 1 KC1, 1.15 g / 1 N a 2 HP0 4 (anhydrous), 0. 2 g / 1 KH 2 P_ ⁇ 4, washed with 0.1% sodium azide), said the washing cell A- approximately with PBS 10 ⁇ g / m 1
  • the anti-glycan antibody diluted above was added and suspended in 20 ⁇ 1, and reacted at 4 ° C for 1 hour.
  • the cells were washed once with 0.9 ml of A-PBS, and then an anti-mouse IgM / IgG antibody (manufactured by Bio-Rad) fluorescently labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) was added to the cells.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the cells were washed once with 0.9 ml of A—PBS, then suspended in 0.6 ml of A—PBS, and the cells were suspended in a fluorescent solution.
  • the analysis was performed using Elite's flow cytometer (EPICS Elite Flow Cytometer; manufactured by COULTER). As a control experiment, the same analysis was performed using A-PBS instead of the anti-glycan antibody.
  • RNA was extracted from the cell line described in the above (1) by the acid guanidium thiosinate phenol monoclonal form method [Anal. Biochem., 162, 156-159].
  • Deoxyribonuclease I (manufactured by Life Technologies) was added to 6 g of each total RNA at 5 units / ml and allowed to react at room temperature for 5 minutes. After the reaction, the enzyme was inactivated by heating at 65 for 15 minutes.
  • CDNA was synthesized using the SUPERSCRIPT TM Preamplification System for First Strand cDNA System (Life Technologies). The reaction was performed at 20 il, and the solution after the reaction was diluted 50-fold with water and stored at -80 ° C until use.
  • Standards used to create the calibration curve include the human 53Gal-Tl, human 53Gal- ⁇ 2, human-3Gal- ⁇ 3, and human-3Gal- ⁇ 4 cDNAs incorporated into pUC119 or pBluescript SK (-). Plasmid (pUC119-3GT1 ⁇ pBS-3GT2, pBS-3GT3, pBS-3GT4) was cleaved with an appropriate restriction enzyme to cut out each cDNA portion, and converted to linear DNA.
  • pUC119-3GTld was prepared by deleting 212 bp between BanII-Ec_2_RV in human-3Gal-Tl cDNA.
  • pBS-3GT3d was prepared by deleting 183 bp between StyI and StyI in human 53Gal-T3 cDNA.
  • Table 1 shows the nucleotide sequence of each gene-specific primer.
  • the base sequence of the 33Gal-T1 gene-specific primer is set to SEQ ID NOs: 4 and 5, and
  • the nucleotide sequence of the gene-specific primer is shown in SEQ ID Nos. 8 and 9, the nucleotide sequence of the 53Gal-T4 gene-specific primer is shown in SEQ ID Nos. 10 and 11, and the nucleotide sequence of the? -Actin specific primer is shown in SEQ ID No. 12. , 13 shown.
  • 1,3-galactosyltransferase which is involved in the synthesis of type 1 sugar chains in these cell lines, is a novel enzyme.
  • mRNA was obtained from human colon cancer cell line Colo205 using Oligotex TM -dT30 super>, an mRNA extraction kit manufactured by Roche. Specific reagents and methods followed the instructions attached to the kit.
  • RNA transfer RNA
  • tRNA transfer RNA
  • 10 mmol / l Tris-HC1 (pH 8.0) and 1 mm 01/1 EDTA Ethylenediamine tetrasodium acetate
  • TE buffer a buffer solution
  • E. coli LE392 strain [Molecular Cloning 2nd Edition] was transformed by the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], and about 1 million ampicillins were transformed. A transformant having resistance was obtained, and a cDNA library was constructed.
  • a plasmid containing cDNA was prepared using the cDNA library (Escherichia coli) and a plasmid preparation kit / plasmid / maxi kit (product number 41031) manufactured by Qiagen.
  • RPMI1640 medium containing 10% ⁇ shea fetal serum [7. 5% N a HC 0 3 1/40 volume, 200Mmo 1 / 1% L-glutamine solution (GIBC0) 3%, Penicillin streptova Suspended in 8 ml of RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 0.5% of isin solution (GIBCO, 5000 units / ml penicillin, 5000 ⁇ g / m1 streptomycin), and added: (: 0 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in the incubate.
  • the protein concentration of the cell lysate was measured using a micro BCA protein assay reagent kit (PIERCE), and 10 ⁇ g of the protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the protein on the gel was transferred to an I-bobi Ion PVDF membrane (Millipore) using a Transblot SD cell (Bio-Rad).
  • the membrane was treated with 10 g / ml anti-silyl Lewis a antibody (19-9) diluted with blocking solution at room temperature for 2 hours.
  • the transformed cells were suspended in a solution [2 Ommo 1/1 HEPES (pH 7.2) 2% TrironX-100], and then sonicated for a short time to prepare a cell lysate.
  • the protein concentration of the cell lysate was measured using a micro BCA protein assay reagent kit (PIERCE).
  • the activity was measured by using a 10 ⁇ 1 solution of Assay (14 mm 01/1 HE PES (H7.4), 75 zmo 1/1 UDP-Ga 1 (SIGMA), 11 Himo 1/1 MnCl 2,, 0. 01% TrironX- 100 , 25 zmo 1/1 pyridinium Jiruamino sugar chain substrate, 37 ° in the cell lysate] C, 2 hours after the reaction, the product by high performance liquid chromatography (HPLC) Was performed.
  • lactone-N-neotetraose (Lacto-N-neotetraose, Gal -4GlcNAc H-3Gal ⁇ 4Glc; hereinafter abbreviated as LNnT) fluorescently labeled with aminopyridine is treated with 5-galactosidase to give a terminal.
  • LNnT lactone-N-neotetraose
  • 5-galactosidase fluorescently labeled with aminopyridine
  • Agaract LN nT is prepared by adding 100 ml of /?-Galactosidase (manufactured by Seikagaku Corporation) to L NnT fluorescently labeled with about 60 nmo 1 of aminoviridine, and reacting at 37 for 16 hours. It was prepared by inactivating 5-galactosidase by heat treatment at 100 ° C for 5 minutes.
  • LN n T fluorescently labeled with aminopyridine or lacto-N-tetraose fluorescently labeled with aminoviridine (Lacto-N-tetraose, Gal- 3GlcNAc 3Gal 4Glc; hereinafter abbreviated as LNT).
  • LNT lacto-N-tetraose
  • LNT lacto-N-tetraose, Gal- 3GlcNAc 3Gal 4Glc; hereinafter abbreviated as LNT.
  • LNT lacto-N-tetraose, Gal- 3GlcNAc 3Gal 4Glc
  • the Assay solution was treated at 100 ° C. for 3 minutes, centrifuged at 10,000 ⁇ g for 5 minutes to obtain a supernatant, and a part thereof was subjected to HP LC.
  • HPLC was carried out using a TSK-ge 1 ⁇ DS-80Ts column (4.6 x 300 mm; manufactured by Tohso Corporation) and 0.02 mol / l ammonium acetate buffer ( ⁇ 4 ⁇ Using 0), elution was performed at 25 ° C and a flow rate of lml / min.
  • the product was detected using a fluorescence spectrum photometer FP-920 (manufactured by JASCO Corporation) (excitation wavelength: 320 nm, emission wavelength: 400 nm).
  • the product was identified using the standard sugar chain as the elution time as an index.
  • the quantification of the product was performed by comparing the fluorescence intensity using lactose that was aminobiliylated as a standard.
  • Table 3 shows the relative activity of each /? 1,3-galactose transferase when the activity of human? 3Ga1-T5 is defined as 100.
  • the GlcNAc 51,3-galactosyltransferase activity (LNT synthesis activity) of 3 Ga 1—T 5 is similar to that of other GlcNAc ⁇ , 3-galactosyltransferases (human 3Gal — Tl, human 3Gal). — ⁇ 2, human 53 G a1— ⁇ 3). It is known that human 53 Ga1- ⁇ 4 has no GkNAc 51,3-galactosyltransferase activity and has GalNAc 51,3-galactosyltransferase activity.
  • human 33 Ga1-T5 was proved to be a GlcNAc-1,3-galactosyltransferase. Also human? The activity of 3 G a1—T 5 is stronger than that of other GlcNAc ⁇ 1,3-galactosyltransferases (human 3 Ga 1- ⁇ 1, human 3Gal—T2, human 3Gal— ⁇ 3) This indicates that it is useful for the synthesis of type 1 sugar chains such as LNT.
  • HCT-15 cells HCT-3GT5L and HCT-L5
  • 3GT5H colon cancer cell lines
  • Colo205, SW1116, HCT-15 stomach cancer cell line
  • Capan-2 stomach cancer cell line
  • MKN45 gastric cancer cell line
  • PC-1 lung cancer cell line
  • the expression level of the /? 3 Ga 1 -T 5 transcript in each cell was determined using the method described in Example 1 or Example 2, (7).
  • GlcNAc-1,3-galactose transferase activity was measured according to the method described above.
  • the expression level of the 3 Ga 1-T 5 transcript was correlated with the activity of GlcNAc-1,3-galactose transferase (LNT synthesis activity).
  • LNT synthesis activity the activity of GlcNAc-1,3-galactose transferase.
  • the amount of 33Gal-T5 transcript in HCT-3GT5H was about three times that of HCT-3GT5L, but the GlcNAc —1,3-galactosyltransferase activity in HCT-3GT5H (LNT synthesis activity) ) was about three times that of HCT-3GT5L.
  • PC-1 expressed a large amount of /? 3Ga1-T1, but no GlcNAc-1,3-galactosyltransferase activity (LNT synthesis activity) was detected.
  • MKN45 expressed 3 Ga1-T3 in a large amount, but no GlcNAc-1,3-galactose transferase activity (LNT synthesis activity) was detected.
  • the 3 Ga1-T5 transcript was found to be significantly expressed in the stomach (body), stomach (sinus), jejunum, large intestine, and kidney. Some expression was also found in brain, esophagus, kidney and uterus. On the other hand, no expression was found in lung, liver, spleen, adrenal gland, or peripheral lymphocytes.
  • sequences of many human chromosome genes of unknown function are registered in the database. Therefore, by comparing the sequence of the human cDNA encoding the polypeptide of the present invention with the sequence of the human chromosomal gene registered in the database, the human chromosomal gene encoding the polypeptide of the present invention can be obtained. It may be possible to identify and clarify its structure. If a chromosomal gene sequence that matches the sequence of the cDNA is registered, the sequence of the cDNA and the sequence of the chromosomal gene are compared to obtain the promoter region of the chromosomal gene encoding the polypeptide of the present invention, exon, and The intron structure can be determined.
  • single-stranded cDNA was synthesized using mRNA (1 ig) derived from Colo205 cells as primers and two synthetic DNAs having the sequences shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 as primers.
  • an oligo dC was added to the 3 ′ end of the cDNA using a minaldexoxynucleotidyltransferase, and the synthetic DNA having dG till attached to the kit was subjected to fore-priming primers.
  • An array WO 00/50608 PCT / JPOO / 01070—PCR was performed using synthetic DNA having the sequence shown in No. 24 as a reverse primer.
  • the PCR was carried out under the conditions that after heating at 97 for 1 minute, 42 cycles of a reaction consisting of 94 at 1 minute, 55 at 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes as one cycle.
  • the amplified fragment was digested with HindIII and SpeI, and then subcloned between HindIII-SpeI of pBluescript SK (-).
  • the nucleotide sequences of the five plasmids thus obtained were determined.
  • the transcription start point of the /? 3Ga1-T5 chromosome gene in Colo205 cells was found to be at the 85153rd position on the above-mentioned accession number AF064860. It turned out to be a base.
  • the upstream region was a promoter region functioning at least in Colo205 cells.
  • the promoter region (including the transcription control region) of the? 3Gal-T5 chromosome gene is estimated to be 5 kb (1 to 5000 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3) upstream of the transcription start site.
  • TF SEARCH transcripiton factor searcn program (Akiyama, Y. , htt:.. // www .rwcp.or jp / 1 ab / pdap 1 / pap i html) 0 , which were analyzed using the
  • TATA box Although no TATA box was present upstream of the transcription start site, two CdxA sites, one AP-1 site, and one MZF-l (myeloid zinc finger 1) were found in the 150 bp upstream of the transcription start site. protein) site was presumed to be present.
  • Plasmids linked to a reporter gene downstream of this region were introduced into cells expressing? 3Gal-T5, and the promoter region was examined by examining whether or not the repo allele was expressed. Can also be specified.
  • the PCR method was used to isolate the / 53 Ga1-T5 cDNA isoform. We examined whether ohms existed.
  • the single-stranded cDNA derived from Colo205 cells prepared in Example 1 was subjected to PCR using type II, two synthetic DNAs having the sequences shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 25 as primers.
  • PCR 94 after heating for 1 minute at 97. (: 1 minute, 55 1 minute, 72 C for 2 minutes), and the cycle was repeated 42 times.
  • the amplified fragment was digested with HindIII and then subcloned into HindIII site of pBluescript SK (-).
  • the nucleotide sequence of the thus obtained plasmid was determined. As a result, it was found that at least five types of /? 3Gal-T5 cDNA isoforms were present in Colo205 cells (Fig. 6). ).
  • the ratio of the expression levels of each isoform was determined. 50% for isoform 1, 50% for isoform 2, and 50% for isoform. Forms 3, 4, and 5 each had less than 1%.
  • PCR amplified fragments corresponding to each isoform were identified by the size of the amplified fragments and restriction enzyme treatment (XbaI treatment or Bsml treatment).
  • SEQ ID NO: 3 shows the promoter region of the ⁇ 3Ga1_ 35 chromosome gene (including the transcription control region) and the sequence of the /? 3Gal- ⁇ 5 chromosome gene.
  • the sequence of the promoter overnight region (including the transcription control region) of the ⁇ 3 Ga 1- ⁇ 5 chromosome gene is l-5000 bp of SEQ ID NO: 3.
  • the sequence of the? 3Gal-T5 chromosome gene is from 5001 to 10562 bp of SEQ ID NO: 3.
  • Table 4 shows the positions of the exon and the inlet of the 33Gal-T5 chromosome gene using SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence shown in capital letters indicates the exon portion, and the base sequence shown in lower case letters indicates the intron portion.
  • ⁇ 3Ga1_T5 chromosome gene structure (location and sequence of exon and intron regions) and chromosomal location, and / or 3G al— ⁇ Promoter region of chromosome 5 gene The position and sequence of were first identifiable by the present study, which revealed the structure and function of 3G a1—T5 cDNA.
  • Table 4 Exon-Intron Binding Site of the ⁇ 3Gal-T5 Chromosome Gene Exon Subrysacceptor Splice Donor in SEQ ID NO: 3
  • a novel polypeptide which is involved in the synthesis of a type 1 sugar chain in digestive cancer cells such as colon cancer cells or knee cancer cells, and has a 1,3-galactosyltransferase activity.

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Description

明 細
新規ポリべプチド
技術分野
本発明は、 シァリルルイス a糖鎖を発現している大腸癌細胞、 滕臓癌細胞等 の消化器系癌細胞において、 シァリルルイス a糖鎖等のタイプ 1糖鎖の合成に 関与する ? 1， 3 —ガラクト一ス転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、 該 ポリペプチドの製造法、 該ポリペプチドをコードする D N A、 該 D N Aが組み 込まれた組換え体ベクター、 該組換え体べクタ一を保有する形質転換体、 該ポ リベプチドを認識する抗体、 該ポリべプチドを用いたタイプ 1糖鎖含有糖鎖お よび該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、 該組換え体ベクターを保有する形質 転換体を用いたタイプ 1糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造 法に関する。 景技術
糖鎖は、 発生 ·分化、 細胞認識といった生命現象に関与しているほか、 炎症、 癌、 感染症、 自己免疫疾患、 およびその他多くの病気の発生、 進行に深く関係 していると考えられている 〔木幡陽 ·箱守仙一郎 ·永井克孝編， グリコバイオ ロジ一シリーズ①〜⑥， 講談社， （1993年） 、 Glycobiology, 3, 97 ( 1993)〕 。
糖鎖は、 タンパク質や脂質に付加して、 糖タンパク質、 プロテオグリカン、 または糖脂質として存在するほか、 ォリゴ糖としても存在する。
Gal 3卜 3GlcNAc構造を有する糖鎖はタイプ 1糖鎖と呼ばれ、 ルイス式血液型 抗原や癌関連糖鎖抗原の骨格糖鎖を構成している。 ルイス式血液型抗原として は、 ルイス a糖鎖 （Gal ? 1- 3(Fuc a卜 4)GlcNAc) およびルイス b糖鎖 〔Fucひ
1- 2Gal β l-3(Fuc a l-4)GlcNAc] が存在する。 シァリルルイス a糖鎖 NeuAc a
2- 3Gal ? l-3(Fuc a l-4)GlcNAc) およびシァリルルイス c糖鎖 (NeuAc a2-3Gal ? l-3GlcNAc) は、 主に大腸癌や滕臓癌等の消化器系の癌において高頻度に検出 される癌関連糖鎖であり、 シァリルルイス a糖鎖およびシァリルルイス c糖鎖 に対する抗体は癌の血清診断に利用されている。
白血球の炎症部位への集積ゃリンパ球のリンパ節へのホーミングには、 接着 分子セレクチン （E -、 P -、 および L-セレクチン） とその糖鎖リガンド （シァリ ルルイス X糖鎖またはその関連糖鎖） の接着が関与していることが明らかとな つている。
シァリルルイス X糖鎖 QieuAcひ 2- 3Gal 卜 4(Fucひ卜 3)GlcNAc〕 の構造異性 体であるシァリルルイス a糖鎖はセレクチンと結合することから、 シァリルル イス a糖鎖は癌の転移に関与すると考えられている。 また、 大腸癌ゃ滕臓癌に おけるシァリルルイス a糖鎖の発現量が、 癌の予後の悪さと相関しているとい う報告もある。
Gal/?卜 3GlcNAc構造は、 GlcNAc 51， 3—ガラクトース転移酵素によって合成さ れる。 これまでに 3種類の GlcNAc ?l，3—ガラクト一ス転移酵素 （ ?3Ga l— T l、 ?3Ga l— T 2、 ?3Ga l-T 3) の遺伝子がクロ一ン化され、 そ れそれの酵素の受容基質特異性が解析されている 〔特開平 6- 181759、 J. Biol. Chem.， 273, 58-65 (1998)、 J. Biol. Chem.， 273, 433-440(1998)、 J. Biol. Chem.， 273, 12770-12778 (1998)〕 。 また、 基質特異性の異なる別の/? 1， 3—ガラク トース転移酵素（ 53 Ga 1— T4)の遺伝子がクローン化されている〔J. Biol. Chem. , 272, 24794-24799 (1997)、 J. Biol. Chem. , 273, 12770-12778 (1998)〕 。
3 Ga 1— T 4はガングリオシド GA1、 GM1または GDlbを合成するが、 Gal ? 卜 3GlcNAc構造は合成しない。
大腸癌や滕臓癌等の消化器系の癌において、 癌関連糖鎖であるシァリルルイ ス a糖鎖およびシァリルルイス c糖鎖の合成に関与する GlcNAc 51,3—ガラク トース転移酵素が同定できれば、 該酵素または該酵素遺伝子の発現量を調べる ことにより、 より正確な癌の診断が可能になると推定される。 また、 該酵素活 性、 または該酵素遺伝子の転写，翻訳を抑制することにより、 癌転移の抑制が 可能になると期待される。 しかし、 これまでに該酵素または該酵素遺伝子は同 定されていない。 大腸癌細胞株 Colo205から GlcNAc 51,3—ガラクトース転移酵 素が部分精製されているが、 該酵素の単離、 該酵素のアミノ酸配列の決定、 な らびに該酵素遺伝子の単離には至っていない 〔J. Biol . Chem. , 262, 15649- 15658 ( 1987), Archi . Biochem. Biophys. 270, 630- 646 ( 1989)、 Archi . Biochem. Biophys. 274, 14-25 ( 1989 )〕 。
セレクチンに強い結合能を有する糖鎖は、 セレクチンアン夕ゴニストとして、 炎症や癌転移の治療および予防に有用である。 従って、 大腸癌や臈臓癌等の消 化器系の癌においてシァリルルイス a糖鎖の合成に関与している/? 1 , 3 —ガ ラクト一ス転移酵素は、 セレクチンアン夕ゴニス卜の効率的合成にも利用可能 と推定される。
ヒトの乳中には、 様々なオリゴ糖が存在することが知られている (Acta Paediatrica, 82, 903 ( 1993 )〕 。 ラク トー N—テトラオース （Gal Π- 3GlcNAc ? l-3GlcNAc ? l-4Glc) は、 ヒト乳中に多く含まれ、 乳児がウィルスや微生物に 感染するのを防いでいると考えられている。 また、 ラクト一N—テトラオース には良性の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性もある。 一方、 ゥシ やマウス等の動物の乳中に存在するオリゴ糖の種類は少なく、 大部分がラクト ースであり 3糖以上のオリゴ糖はほとんど存在しない 〔Acta Paediatrica, 82, 903 ( 1993 )、 J. Biol . Chem. , 270, 29515 ( 1995 )〕 。
ラクト一 N—テトラオースを母核とする様々なオリゴ糖、 あるいはそれらが 含まれたミルクを効率よく生産することができれば、 産業上非常に有用と思わ れる。 したがって、 これまでにクローン化された GlcNAc /51，3—ガラクト一ス 転移酵素に比較して、 ラクト— N—テトラオースを合成する活性のより高い酵 素の開発は産業上重要な課題である。 発明の開示
本発明は、 新規な/? 1 , 3—ガラク ト一ス転移酵素を有するポリペプチドを 利用し、 抗炎症、 抗感染症、 または癌転移抑制等の医薬品、 乳製品等の食品、 タンパク質の改善法、 および癌等の疾患の診断法を提供することを目的とする。 本発明は、 以下の （ 1) 〜 （47) に関する。
( 1) シァリルルイス a糖鎖を発現している大腸癌細胞に存在する、 シァ リルルイス a糖鎖の合成に関与する/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素活性を有 するポリべプチド。
上記本発明の新規/? 1, 3—ガラクト一ス転移酵素活性を有するポリべプチ ドは、 シァリルルイス a糖鎖を発現している大腸癌細胞のみならずシァリルル イス c糖鎖、 ルイス a糖鎖、 ルイス b糖鎖等のタイプ 1糖鎖を発現している大腸 癌細胞、 臈臓癌細胞等の消化器系癌細胞にも存在する。 また、 これら消化器系 癌細胞に存在するタイプ 1糖鎖の効率的合成に関与する ? 1, 3—ガラクト一ス 転移酵素活性を有するポリぺプチドも、 本発明のポリベプチドである。 本発明 のポリぺプチドは、 公知の/? 3Ga l— T l、 53Ga l-T 2および/? 3 G a l— T 3とは異なる新規な 31， 3—ガラクト一ス転移酵素である。
(2) 以下の （a)、 （b) および （c) からなる群より選ばれるポリべ プチド ：
( a ) 配列番号 1記載のァミノ酸配列からなるポリべプチド、
(b) 配列番号 1記載のアミノ酸配列の 31〜310番目のアミノ酸配列を 含むポリペプチド、 および
(c) (a) または （b) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ Gal
3GlcNAc構造を合成可能な/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素活性を有するポ リぺプチド。
上記 （a) または （b) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以 上のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ該ポ リぺプチドの有する Gal 5卜 3GlcNAc構造を合成可能な/? 1 , 3—ガラクト一ス 転移酵素活性を有するポリペプチドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以 下、モレキュラー 'クロ一二ング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント 'プロトコールズ · イン 'モレキュラー 'バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13， 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 例えば配列番号 1で示 されるアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする DNAに部位特異的変 異を導入することにより、 取得することができる。
欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 上記の 部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、 置換もしくは付加できる程度の 数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1~20個、 より好ましくは 1〜 10 個、 さらに好ましくは 1~5個である。
また、 本発明のポリペプチドが Gal Π- 3GlcNAc構造を合成可能な/? 1, 3— ガラクトース転移酵素活性を有するためには、 配列番号 1記載のアミノ酸配列 と、 BLAST CJ. ol. Biol., 215, 403 (1990)〕 や FAS T A CMethods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)〕 等を用いて計算したときに （相同性の％を定 義するための計算手段 ·方法等を記載する） 、 少なくとも 60%以上、 通常は 8◦%以上、 特に 95%以上の相同性を有していることが好ましい。
上記の （a) または （b) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ Gal Π- 3GlcNAc構造を合成可能な/? 1， 3—ガラクトース転移酵素活性を有す るポリペプチドは、 公知の/? 3 Ga 1— T 1、 53 Ga 1— T 2および/? 3 G a 1—T 3とは異なる新規な/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素である。
(3) β 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素活性が、 糖鎖の非還元末端に存在 する Ν—ァセチルグルコサミン残基に/? 1 , 3結合でガラクトースを転移する 活性である上記 （ 1 ) または （2) 記載のポリペプチド。
(4) β 1 , 3—ガラク卜一ス転移酵素活性が、 GlcNAc ?卜 3Gal ?卜 4Glc の非還元末端に存在する N—ァセチルグルコサミン残基、 または N—ァセチル グルコサミン単糖に/? 1 , 3結合でガラク トースを転移する活性である、 上記 ( 1) または （2) 記載のポリペプチド。
(5) 以下の （a) 、 （b) 、 （c) および （d) からなる群より選ばれ る DNA：
(a) 上記 （ 1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコードす る DNA、
(b) 配列番号 2で表される塩基配列の 402- 1331番目の塩基配列を 有する DNA、
(c) 配列番号 2で表される塩基配列の 492〜1331番目の塩基配列を 有する DNA、 および
(d) (a) 〜 （c) いずれかに記載の DNAとストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズする D N Aであり、 かつ Gal ? 1 - 3G1 cNAc構造を合成可能な β 1， 3—ガラクトース転移酵素活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。 上記の 「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNA」 とは、 上 記 （a) 、 (b) および （c) の DNAからなる群より選ばれる DNAをプロ —ブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク 'ハイプリダイ ゼ一シヨン法あるいはサザンプロットハイプリダイゼ一シヨン法等を用いるこ とにより得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロニ一あるいはプラーク由 来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜： L . Omo l/1の N aC l存在下、 65 °Cでハイブリダィゼ一シヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃 度の S S C (saline-sodium citrate) 溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 15 Ommo 1/1 塩化ナトリウム、 15mmo l/l クェン酸ナトリウム よりなる） を用い、 65°C条件下でフィル夕一を洗浄することにより同定でき る DN Aをあげることができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント ' プロトコ一ルズ 'イン ·モレキュラー ·バイオロジー サプルメント 1〜38、 DNA Clonin 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことが できる。
ハイブリダィズ可能な DN Aとして具体的には、 BLAST 〔J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)〕 や FASTA Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)〕 等を用いて計算したときに （相同性の％を定義するための計算手段 ·方法等を 記載する） 、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ一 ドする DN Aの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、 好 ましくは 80%以上の相同性を有する DNA、 さらに好ましくは 95%以上の 相同性を有する DNAをあげることができる。 該 DNAのコードする Gal/?卜 3GlcNAc構造を合成可能な/? 1, 3_ガラクトース転移酵素活性を有するポリべ プチドは、 公知の/? 3 Ga 1— T 1、 ? 3 Ga 1— T 2および/? 3 Ga 1— T 3とは異なる新規な/? 1， 3—ガラクトース転移酵素である。
(6) 上記 （5) 記載の DN Aをベクターに組み込んで得られる組換え体 DNA。
(7) 組換え体 DNAが、 プラスミ ド pAMo— 3GT 5またはプラスミ ド pBS— 3GT 5 (FERM BP— 6645) である、 上記 （6) 記載の 組換え体 DNA。
(8) 上記 （5) に記載の DNA、 (6) 記載の組換え体 DNA、 または (7) 記載の組換え体 DN Aを保有する形質転換体。
(9) 形質転換体が、 微生物、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 非ヒ ト ト ランスジエニック動物およびトランスジェニック植物からなる群より選ばれる 形質転換体である、 上記 （8) 記載の形質転換体。
( 10) 微生物が、 Escherichia属に属する微生物である、 上記 （ 9 ) 記載 の形質転換体。
( 1 1) 動物細胞が、 マウス . ミエローマ細胞、 ラッ ト ' ミエローマ細胞、 マウス ·ハイプリ ド一マ細胞、 CH0細胞、 BHK細胞、 アフリカミ ドリザル腎臓細 胞、 Namalwa細胞、 Namalwa KJM- 1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細 胞から選ばれる動物細胞である、 上記 （9) 記載の形質転換体。
(12) 昆虫細胞が、 Spodoptera f rugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusiani の卵巣細胞および力ィコの卵巣細胞からなる群より選ばれる昆虫細胞である、 上記 （ 9 ) 記載の形質転換体。
(13) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコー ドする D N Aをベクターに組み込んで得られる組換え体 D N Aを保有する形質 転換体を培養液中で培養し、 該ポリべプチドを該培養物中に生成 ·蓄積させ、 該培養物中より該ポリぺプチドを採取することを特徴とする、 該ポリぺプチド の製造法。
(14) 上記 （ 1 ) 〜 （4)のいずれか 1つに記載のポリべプチドをコ一 ドする DNAをべクタ一に組み込んで得られる組換え体 D N Aを保有する非ヒ 卜トランスジエニック動物を飼育し、 該ポリべプチドを該動物中に生成 ·蓄積 させ、 該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、 該ポリぺプ チドの製造法。
(15) 生成 '蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、 上記 （1 4)記載の製造法。
(16) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコ一 ドする DNAをべク夕一に組み込んで得られる組換え体 D NAを保有するトラ ンスジエニック植物を栽培し、 該ポリべプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物中より該ポリべプチドを採取することを特徴とする、 該ポリべプチドの
(1 ) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコー ドする DN Aを用い、 vitroでの転写 ·翻訳系により該ポリべプチドを合成 することを特徴とする、 該ポリペプチドの製造法。
(18) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれか 1つに記載のポリベプチドを酵素 源として用い、
(a) 該酵素源、 (b) i)N—ァセチルグルコサミン （GlcNAc) 、
ii) N—ァセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ糖および iii) N—ァセチルグルコサミン残基を非還元末端に有する複合糖質から選ば れる受容基質、 および
(c) ゥリジン一 5， —二リン酸ガラク 卜ースを水性媒体中に存在せしめ、 該 水性媒体中に、 該受容基質の N—ァセチルダルコサミンまたは N—ァセチルグ ルコサミン残基に 51 , 3結合でガラクトースが付与された反応産物を生成 · 蓄積させ、 該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、 該反応 産物の製造法。
( 19) 上記 （ 1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドを酵素 源として用い、
(a) 該酵素源、
(b) i)グルコース、
ii)グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
iii)グルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質からなる群より選 ばれる受容基質、 および
(c) ゥリジン一 5， 一二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、 該 水性媒体中に、 該受容基質のグルコースまたはグルコース残基に/? 1 , 3結合 でガラクトースが付与された反応産物を生成 ·蓄積させ、 該水性媒体中より該 反応産物を採取することを特徴とする、 該反応産物の製造法。
(20) 上記 （9) 記載の微生物、 動物細胞、 植物細胞および昆虫細胞由 来の形質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、 該培 養物中に、 ガラク トースが/? 1， 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァ セチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を 有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該培養物中よ り該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合 糖質の製造法。 (21) 上記 （9) 記載の非ヒト トランスジエニック動物を飼育し、 該動 物中に、 ガラクトースが 51， 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセ チルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有 する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該動物中より該 糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合糖質 の製造法。
(22) 上記 （9) 記載のトランスジエニック植物を栽培し、 該植物中に、 ガラクト一スが ? 1， 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグル コサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖 または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該植物中より該糖鎖また は該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合糖質の製造法。
(23) 複合糖質が、 糖タンパク質、 糖脂質、 プロテオグリカン、 グリコ ペプチド、 リポ多糖、 ペプチドグリカン、 およびステロイ ド化合物等に糖鎖が 結合した配糖体からなる群より選ばれる複合糖質である、 上記 （ 18)〜（2 2) のいずれか 1つに記載の製造法。
(24) 生成 '蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、 上記 （2 1 ) 記載の製造法。
(25) 上記 （ 1) ~ (4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコー ドする DN Aを用い、 ハイブリダィゼ一シヨン法により、 該ポリペプチドをコ 一ドする遺伝子の発現量を定量する方法。
(26) 上記 （5) に記載の DNAまたは配列番号 2または 3で表される 塩基配列を有する DNAの有する塩基配列中の連続した 5~60塩基と同じ配 列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有す るオリゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチ ド誘導体から選ばれる DNA。
(27) オリゴヌクレオチド誘導体が、 ォリゴヌクレオチド中のリン酸ジ エステル結合がホスフォロチォェ一ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3， -P 5 ' ホスフ オアミデ一卜結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチ ド中のリボースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたォリ ゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロピニル ゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥ ラシルが C— 5チアゾ一ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C— 5プロピニルシ卜シンで置換されたォ リゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン 修飾シトシン （phenoxazine- modified cytosine)で置換されたォリゴヌクレオ チド誘導体、 DNA中のリボースが 2， —0—プロピルリボースで置換された オリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2' —メ トキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体からなる群よ り選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、 上記 （26) 記載のオリゴヌク レオチド。
(28) 配列番号 20または 21で表される塩基配列を有する DNA。
(29) 上記 （ 26 ) ~ ( 28 ) のいずれか 1つに記載のォリゴヌクレオ チドを用い、 ポリメラーゼ 'チェイン ' リアクション法により、 上記 （ 1 )〜
(4) のいずれかに記載のポリべプチドをコ一ドする遺伝子の発現量を定量す る方法。
(30) 上記 （25) または （29) 記載の方法を用いた癌または癌転移 の検出法。
(31) 上記 （5) 、 （26) 〜（28) 記載の DN Aおよび配列番号 2 または 3で表される塩基配列を有する DN Aから得らばれる DN Aを用い、 上 記 （ 1)〜（4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコードする DNAの 転写または mRN Aの翻訳を抑制する方法。
(32) 上記 （ 1)〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドを認識 する抗体。 (33) 上記 （32)記載の抗体を用いる、 上記 （1) 〜 （4) のいずれ かに記載のポリベプチドの免疫学的検出法。
(34) 上記 （32) 記載の抗体を用い、 上記 （1) 〜 （4) のいずれか に記載のポリぺプチドを検出することを特徴とする免疫組織染色法。
(35) 上記 （ 32 ) 記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
(36) 上記 （32) 記載の抗体を含有する、 癌または癌転移の診断薬。 (37) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれか 1つに記載のポリぺプチドと被験 試料とを接触させることを特徴とする、 該ポリべプチドの有する活性を変動さ せる化合物のスクリーニング法。
(38) 上記 （1) ~ (4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドを発現 する細胞と被験試料とを接触させ、 抗シァリルルイス a抗体、 抗ルイス a抗体、 抗ルイス b抗体または抗シァリルルイス c抗体を用い、 シァリルルイス a糖鎖、 ルイス al鎖、 ルイス b糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖含量を測定することを 特徴とする、 該ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現を変動させる化合物の スクリ一ニング法。
(39) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれか 1つに記載のポリぺプチドを発現 する細胞と被験試料とを接触させ、 上記 （32) 記載の抗体を用い、 該ポリべ プチド含量を測定することを特徴とする、 該ポリペプチドをコードする遺伝子 の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
(40) 上記 （1) ~ (4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコ一 ドする遺伝子の転写を司るプロモーター DNA。
(41) プロモ一夕一 DN Aが、 小腸細胞、 大腸細胞、 滕臓細胞、 胃細胞、 大腸癌細胞、 脬癌細胞および胃癌細胞からなる群より選ばれる細胞で機能して いるプロモー夕一である、 上記 （40) 記載のプロモー夕一 DNA。
(42) プロモー夕一 DNAが、 ヒトまたはマウス由来のプロモ一夕一 D NAである、 上記 （40) または （41) 記載のプロモーター DNA。
(43) プロモ一夕一 DNAが配列番号 3で表される塩基配列の 1〜50 00番目の塩基配列中の連続する 50~5000 bpの DN A配列を有する、 上記 （40) 〜 （42) のいずれか 1つに記載のプロモー夕一 DNA。
(44) 上記 （40) 〜 （43) のいずれか 1つに記載のプロモーター D N Aおよび該プロモーター D N Aの下流に連結させたレポ一夕一遺伝子を含有 するプラスミ ドを用いて動物細胞を形質転換し、 該形質転換体と被験試料とを 接触させ、 該レポ一夕一遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、 該プロモ一夕による転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
(45) レポ一夕一遺伝子が、 クロラムフエニコ一ル 'ァセチルトランス フェラーゼ遺伝子、 ?—グルクロニダ一ゼ遺伝子、 5—ガラクトシダーゼ遺伝 子、 ?-ラク夕マ一ゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 ェクオリン遺伝子および グリーン · フルォレツセント ·プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、 上記 （44) 記載のスクリーニング法。
(46) 上記 （ 1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のポリペプチドをコー ドする DNAを欠損または変異させたノックァゥト動物。
(47) ノックァゥト動物がマウスである、 上記 （46) 記載のノックァ ゥト動物。
以下、 本発明を詳細に説明する。
( 1) 本発明のシァリルルイス a糖鎖等のタイプ 1糖鎖を合成可能な/? 1 , 3 —ガラク卜ース転移酵素活性を有する新規ポリべプチドをコードする DN A
(以下、 新規/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素遺伝子と略すこともある） の取 得、 ならびに該 DN Aおよびオリゴヌクレオチドの製造
シァリルルイス a糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖を発現している、 大腸癌 細胞または脬臓癌細胞等の消化器系癌細胞より、 常法により cDNAライブラ リーを作製する。
cDNAライブラリ一作製法としては、 モレキュラー ·クローニング第 2版 やカレント 'プロ トコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー サプルメ ン卜 1〜38、 A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)、 DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、 あるいは市販のキッ ト、 例えばス一パースクリブ ト ' プラスミ ド ' システム · フォー ' c DNA ·シンセシス ' アンド ' プラス ミ ド · クロ一ニング Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning；ギブコ B R L (Gibco BRL) 社製〕 ゃザップ— c D N A -シ ンセシス 'キット 〔ZAP- cDNA Synthesis Kit, ストラ夕ジーン社製〕 を用いる 方法等があげられる。
シァリルルイス a糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖を発現している大腸癌細 胞または脬臓癌細胞等の消化器系癌細胞としては、 例えば、 シァリルルイス a 糖鎖を発現しているヒト大腸癌細胞株である Colo205、 Colo201、 SW1116等、 あ るいはシァリルルイス a糖鎖を発現しているヒト滕臓癌細胞株である Capan- 2 等を用いることができる。
cDNAライブラリーを作製するための、 クロ一ニングベクタ一としては、 大 腸菌 K 12株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクタ一、 プラスミ ドベクタ—等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン社製、 Strategies,互， 58 (1992)〕、 pBluescript II SK ( + ) CNucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕 、 え ZAP II
(ス トラ夕ジーン社製） 、 人 gtl 0 、 Agtl 1 CDNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕 、 ATriplEx (クロ一ンテック社製） 、 人 ExCell (フ アルマシア社製） 、 pT7T318U (フアルマシア社製） 、 pcD2〔Mol. Cell. Biol.， 3, 280 (1983)〕 、 pUC18 〔Gene， 33, 103 (1985)〕 、 pAMo〔J.Biol.Chem. , 268, 22782-22787 (1993)、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 05-336963) 〕 等をあげることが できる。
宿主微生物としては、 大腸菌 Escherichia coliに属する微生物であればいず れでも用いることができる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue ， 〔ス トラ夕ジーン社製、 Strategies,互， 81 ( 1992)〕、 Escherichia coli C6Q0CGenetics, 39, 440 (1954)〕 、 Escherichia coli Y1088 CScience, 222, 778 (1983)〕 、 Escherichia coli Y1Q9Q (Science, 222, 778 (1983)〕 、 Escherichia coli NM522 〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕 、 Escherichia coli K802 〔J. Mol. Biol., 16, 118 ( 1966 )〕、 Escherichia coli JM1Q5 〔Gene， 38, 275 ( 1985) ^Escherichia coli SOLR™ Strain〔ストラ夕ジーン社より市販〕 、 ^ coli LE392 (モレキュ ラ— ·クロ—ニング第 2版） 等を用いることができる。
cDNAライブラリ一として、 例えば、 以下のようにして作製した cDNA ラィブラリ一をあげることができる。
ヒト大腸癌細胞株 Colo205由来の mRNAより GIBCO BRL社製の cDNA合成 システム （cDNA Synthesis System) キヅトを用いて c D N Aを合成する。 該 DNAの両末端に S f i Iリンカ一を付与した後、 クローニングベクタ一 pAMoの Sf i I部位に挿入したプラスミ ドを作製する。
該プラスミ ドを用い、 . coli LE392を形質転換して cDNAライブラリーを 作製する。
作製した cDNAライブラリーより目的とする DNAを含むクローンを以下 の方法で選択する。
上記で作製した cDNAライブラリーから、 常法あるいはキイアジェン
(Qiagen) 社製のプラスミ ド調製キッ 卜である/ plasmid/maxi kit (商品番号 41031) 等のキッ 卜を用いてプラスミ ドを調製する。
既知の 4種の/? 1 , 3—ガラク卜一ス転移酵素のアミノ酸配列を比較するこ とにより、 4種の/? 1， 3—ガラクトース転移酵素でアミノ酸配列がよく保存 されている領域を 2ケ所以上見出す。
公知の方法 CCarl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, "PCR Primer: A Laboratry Manual", Cold Spring Harbor Lab. (1995)、 井上純一郎 ·仙波憲太 郎編， ザ 'プロ卜コールシリーズ 「cDNAクローニング」 ， 羊土社， （1996 年） 、 Science, 241, 42 (1988)〕 に従って各領域のアミノ酸配列に対応する D N A配列を有する degenerateプライマーを設計し、 上記で調製した c DNAラ ィブラリ一を錶型としてポリメラ一ゼ ·チェイン ' リアクション （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCRと略記する） 〔モレキュラー 'クローニング第 2版および P CRProtocols Academic Press (1990)〕 を行い、 増幅断片を適当 なプラスミ ドにサブクローニングする。
P CR増幅断片のサブクローニングは、 増幅 DNA断片をそのまま、 あるい は制限酵素や DNAポリメラ一ゼで処理後、 常法によりベクタ一に組み込むことに より行うことができる。
ベクターとしては、 pBluescript II SK( + )、 pBluescript SK (-) (いずれも Stratagene社製） 、 pDIRECT (Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)〕 、 pCR-ScriptAmpSK ( + )〔 Stratagene社製、 Strategies, 5, 6264 (1992)〕、 pT7Blue (^& 611社製〕、 (¾11〔ィンビトロジェン社製、8101^1111010 ， 9, 657 (1991)〕、 pCR-TRAP 〔Genehunter社製〕 、 ρΝοΤΑπ (5， →3， 社製） 等をあげることがで きる。
サブクローン化された P C R増幅断片の塩基配列を決定することにより、 既 知の/? 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素のアミノ酸配列とホモロジ一を有するが 完全には一致しないアミノ酸配列をコ一ドする DNA断片を選択する。 塩基配 列は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー（Sanger)らのジデォ キシ法 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 あるいは 373 A · DNAシークェンサ一 〔Perkin Elmer社製〕 等の塩基配列分析装置を用いて決 定することができる。
上記で作製した cDNAライブラリーに対して、 該 DNA断片をプローブと してコロニーハイブリダィゼーシヨンまたはプラークハイブリダイゼーシヨン
(モレキュラー 'クロ一ニング第 2版） を行うことにより、 既知の/? 1 , 3 - ガラクトース転移酵素とホモロジ一を有するポリぺプチドをコ一ドする cDN Aを取得することができる。 プローブとしては、 該 DNA断片をアイソトープ あるいはジゴキシゲニン （digoxigenin)標識したものを使用することができる。 上記の方法により取得された DNAの塩基配列は、 該 DNA断片をそのまま あるいは適当な制限酵素等で切断後、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版等に 記載の常法によりベクターに組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例 えばサンガー（Sanger)らのジデォキシ法 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは 373 A 'DNAシークェンサ一〔パーキン'エルマ一（Perkin Elmer) 社製〕 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定すること ができる。
該方法により取得される DN Aとして、 例えば、 配列番号 1で表されるポリ ペプチドをコードする DNA等をあげることができ、 具体的には、 配列番号 2 または 3で表される塩基配列を有する DN A等をあげることができる。
配列番号 2の D N Aを含むプラスミ ドとしては、 例えば、 後述の実施例に記 載した p AMo— 3 GT 5、 pBS-3GT 5 (FERM BP— 6645) をあげることができる。
上記のようにして取得した D N Aを発現べクタ一に組み込み、 発現プラスミ ドを構築する。 得られた発現プラスミ ドを適当な動物細胞に導入後、 抗シァリ ルルイス a糖鎖抗体または抗シァリルルイス c糖鎖抗体を用レ、たフルォレツセ ンス ·ァクティべ——テツド ·セノレ ·ソ——夕一 (Fluorescence Activated Cell Sorter；以下、 FACSと略記する） 解析により、 該 D N Aがシァリルルイス a糖 鎖またはシァリルルイス c糖鎖の合成に関与する/? 1, 3—ガラクトース転移 酵素をコ一ドするかどうかを調べることができる。
該発現ベクターとしては、 該 c D N Aを組み込んで動物細胞で発現できるベ クタ一であればいかなるものでも用いることができ、 例えば、 pcDNAI/Amp、 pcDNAI、 pCD 8 (いずれもフナコシ社より市販) 、 pAGE107〔特閧平 3-22979、 Cytotechnology, 3, 133 (1990))、 pREP4 (インビトロジェン社製) 、 pAGE103 〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕 、 pAMo、 pAMoA〔J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 ( 1993 )s 別名 p AMo PR S A (特開平 05- 336963)〕、 pAS3-3 (特 開平 2-227075) 等を用いることができる。
cDN Aを組み込んだ発現べクタ一を、 目的とする cDNAを選択可能な動 物細胞に導入し、 形質転換細胞を取得する。 該発現べク夕一の導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法
CCytotechnology, 3, 133 ( 1990)〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法〔proc. Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)〕、 Virology, 52, 456 ( 1973 )に記載の方法等の方法をあげることができる。
動物細胞としては、 ヒトの細胞である Najnalwa細胞、 Namalwa細胞のサブライ ンである Namalwa KJM- 1細胞、 サルの細胞である COS細胞、 チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開昭 63— 299) 、 大腸癌細胞株である HCT- 15等をあげることができ、 好ましくは、 Namalwa細胞、 Namalwa KJM-1細胞 または HCT- 15をあげることができる。
得られた形質転換細胞を常法により培養する。
具体的には、 以下の形質転換体の培養方法をあげることができる。
形質転換体が動物細胞である場合、 該細胞を培養する培地は、 一般に使用さ れている RPMI1640培地 The Journal of the American Medical Association, 199, 519 ( 1967)〕、 Eagleの MEM培地〔Science, 122, 501 ( 1952)〕、 DMEM培地〔Virology， 8, 396 ( 1959)〕 、 199培地 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 ( 1950)〕 またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等 が用いられる。
培養は、 通常 p H 6〜8、 2 5〜4 0 °C、 5 % C 02存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。
また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン、 ストレプトマイシン 等の抗生物質を培地に添加してもよい。
該培養により得られた細胞を、 抗シァリルルイス a糖鎖抗体または抗シァリ ルルイス c糖鎖抗体を用いて蛍光染色した後、 FACSを用いて解析することによ り、 該発現プラスミ ドを導入した細胞においてシァリルルイス a糖鎖またはシ ァリルルイス c糖鎖量が増加するかどうか検討する。 シァリルルイス a糖鎖ま たはシァリルルイス c糖鎖量が増加していれば、 該 D N Aはシァリルルイス a 糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖の合成に関与する新規/? 1 , 3—ガラクトー ス転移酵素をコードしていると考えることができる。
シァリルルイス a糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖と反応する抗体であれば いかなるものでも、 抗シァリルルイス a糖鎖抗体または抗シァリルルイス c糖 鎖抗体として用いることができ、 例えば、 抗シァリルルイス a糖鎖抗体である 19-9 (Fujirebio社製）や KM231 (Kyowa Medex社製） 、 あるいは抗シァリルルイ ス c糖鎖抗体である DU- PA -2 (Kyowa Medex社製） をあげることができる。
以上のようにして、 大腸癌細胞、 脬臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、 シァリルルイス a糖鎖等のタイプ 1糖鎖に属する癌関連糖鎖の合成に関与する、 β 1， 3—ガラク卜一ス転移酵素活性を有する新規ポリペプチドをコードする D Ν Αを取得することができる。
また、 上記方法で取得した DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする D N Aを選択することにより、 配列番号 1記載のァミノ酸配列と比較 して、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな るポリべプチドをコ一ドする目的の DNAを取得することができる。
即ち、 非ヒト動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥシ、 サル等由来の cDNA ライブラリ一に対してスクリーニングを行うことにより、 目的の DNAを取得 することができる。
決定された新規/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素ポリべプチドのアミノ酸配 列に基づいて、 該ポリべプチドをコ一ドする DNAを化学合成することによつ ても目的の DNAを調製することができる。 DNAの化学合成は、 チォホスフ アイ ト法を利用した島津製作所社製の DNA合成機、 フォスフォアミダイ ト法 を利用したパーキン 'エルマ一社製の DN A合成機 mo d e 1392等を用い て行うことができる。
また、 後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマ一およびアンチセンスプ ライマ一として用い、 これら DN Aに相補的な mRN Aを発現している細胞の mRNAから調製した cDNAを銪型として、 P C Rを行うことによつても、 目的とする D N Aを調製することができる。
上述の方法で取得した本発明の D N Aおよび D N A断片を用いて、 モレキュ ラー . クロ—ニング第 2版等に記載の常法、 あるいは D N A合成機により、 本 発明の D N Aの一部の配列を有するアンチセンス ·オリゴヌクレオチド、 セン ス ·オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。 該オリゴヌクレオチドとしては、 上記 D N Aの有する塩基配列中の連続した 5〜6 0塩基と同じ配列を有する D N Aまたは該 D N Aと相補的な配列を有す る D N Aをあげることができ、 具体的には、 配列番号 2または 3で表される塩 基配列中の連続した 5〜 6 0塩基と同じ配列を有する D N Aまたは該 D N Aと 相補的な配列を有する D N Aをあげることができる。 センスプライマーおよび アンチセンスプライマ一として用いる場合には、 両者の融解温度 （T m) およ び塩基数が極端に変わることのない上記記載のォリゴヌクレオチドが好ましい。 具体的には、 配列番号 2 0 , 2 1等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレ ォチドをあげることができる。
更に、 これらオリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 オリゴヌクレオチド誘導 体という） も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該ォリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジェ ステル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導 体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3， - P 5 ' ホスフォ アミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド 中のリボースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたォリゴ ヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C—5プロピニルゥ ラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラ シルが C一 5チアゾールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のシトシンが C— 5プロピニルシトシンで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシ卜シンがフエノキサジン修 飾シ卜シン （phenoxazine- modified cytosine)で置換されたォリゴヌクレオチ ド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースが 2， 一ひ—プロピルリボースで 置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 あるいはォリゴヌクレオチド中のリボ —スが 2' —メ トキシェトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導 体等をあげることができる 〔細胞工学， ， 1463 (1997)〕。
(2) 新規/? 1， 3—ガラクトース転移酵素ポリペプチド （以下、 本発明の ポリべプチドともいう） の製造
本発明のポリペプチドは、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレン卜 ' プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイオロジー サプルメント 1〜 38 等に記載された方法等を用い、 例えば以下の方法により、 本発明の DNAを宿 主細胞中で発現させ、 製造することができる。
本発明のポリべプチドをコードする全長 DNAを基にして、 必要に応じて、 該ポリべプチドをコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。 また、 該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、 宿主の発現に最適な コドンとなるように、 塩基を置換した DNAを調製する。 該 DNAは該ポリべ プチドの生産率を向上させるうえで有用である。
該 DNA断片、 または全長 DN Aを適当な発現べクタ一のプロモー夕一の下 流に挿入することにより、 組換え体 DNA (組換えベクター） を作製する。 該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することに より、 本発明のポリぺプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 原核細胞、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目 的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。 また、 動物個体や植物個体を用いることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製が可能、 または染色 体中への組込みが可能で、 新規/? 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素遺伝子の転写 に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、 新規/ 51 , 3—ガラクトー ス転移酵素遺伝子の発現ベクターは、 原核生物中で自立複製可能であると同時 に、 プロモータ一、 リボソーム結合配列、 新規 3 _ガラクトース転移酵 素遺伝子、 転写終結配列、 より構成されていることが好ましい。 プロモーター を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 PBTrp2、 pBTacK pBTac2 (いずれもベーリ ンガーマンハイム社より市販） 、 pKK233- 2 (フアルマシア社） 、 pSE280 (イン ビトロジェン社）、 pGEMEX- 1〔プロメガ ( Promega )社製〕、 pQE- 8 (キアゲン（ Q IAGEN ) 社製） 、 pKYPIO (特開昭 58- 110600) 、 pKYP200 〔Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕 、 pLSAl CAgric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕 、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕 、 pBluescript II SK+ (ストラ夕ジーン社 製） 、 Bluescript II SK (-) (ス 卜ラタジーン社製）、 pTrs30 (FERM BP-5407) 、 pTrs32(FERM BP- 5408)、 pGHA2(FERM BP- 400)、 pGKA2(FERM B- 6798)、 pTerm2
(特開平 3- 22979、 US4686191, US4939094, US5160735)、 pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕 、 pGEX (フアルマシア社製） 、 pETシステム （ノバジェン社 製） 、 pSupexヽ pUB110、 pTP5、 pC194、 pTrxFus ( Invitrogen社製） 、 pMAL-c2
(New England Biolabs社製) 、 pUC19 〔Gene， 33, 103 (1985)〕 、 pSTV28 (宝 酒造社製） 、 PUC118 (宝酒造社製） 、 pPAl (特開昭 63- 233798) 等を例示するこ とができる 。
プロモ—夕一としては、 大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればい かなるものでもよい。例えば、 trpプロモー夕一（P;^£)、 プロモー夕一（P lac) 、 PLプロモ一夕一、 PRプロモ一夕一、 PSEプロモ一夕一等の、 大腸菌ゃフ ァ一ジ等に由来するプロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモ一 夕一、 p e nPプロモ一夕一等をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列さ せたプロモー夕一 （Ptrp x 2) 、 tacプロモ一夕一、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いること ができる。
リボソーム結合配列であるシャイン—ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と開 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6~18塩基） に調節したプラスミ ドを 用いることが好ましい。
本発明の D N Aの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 構造遺 伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビパク テリゥム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シュ一ドモナス 属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia col i X - Blueヽ Escherichia coli XL2 - Blue、 Escherichia coli DHU Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli BL21(DE3 )、 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,
Escherichia coli腦 74(DE3)、 Escherichia coli HMS174(DE3 )pLysS, Serratia ficaria、 Serratia fonticola、 Serratia l iquefaciens、 Serratia marcescens、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Corynebacterium glutajnicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicuffl ATCC14067、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354s Pseudomonas sp. D- 0110等をあげることができる。
組換えベクタ一の導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 CNucleic Acids Res. , 16, 6127 ( 1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 69, 2110 ( 1972)〕、 プロトプラスト法（特閧昭 63- 248394)、 Gene, 17, 107 ( 1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 ( 1979)に記 載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 pHS19、 pHS15 等を例示することができる。 プロモータ一としては、 酵母菌株中で発現できるものであればいかなるもの でもよく、 例えば、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモ一夕一、 gal 1プロモ一夕一、 gal 10プロモーター、 ヒ一トショック タンパク質プロモー夕一、 Fひ 1プロモータ一、 CUP 1プロモ一夕一等をあげる ことができる。
宿主細胞としては、 サッカロマイセス属、 シゾサヅカロマイセス属、 クルイ ベロミセス属、 トリコスポロン属、 シヮニォミセス属、 ピチア属等に属する酵 母菌株をあげることができ、 具体的には、 Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans、 Schwann iomyces alluvius、 Pichia pastoris等をあげることができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 酵母に D N Aを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法 〔Methods. EnzymoL , 194, 182 ( 1990)〕 、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 84, 1929 ( 1978)〕 、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriol . , 153, 163( 1983)〕 、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 75, 1929 ( 1978)記載の方法等をあげることがで ぎる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pcDNAI/Amp、 pcDNAI、 pCDM8 (いずれもフナコシ社より市販） 、 pAGE107 〔特開 平 3- 22979、 Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)〕 、 pREP4 (インビトロジェン社製） 、 PAGE103 CJ . Biochem. , 101， 1307 ( 1987)〕 、 pAMo、 pAMoA〔J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 ( 1993 ), 別名 八1\1 0 1^八 (特開平 05-336963)〕、 pAS3- 3 (特 開平 2- 227075) 等を例示することができる。
プロモ一夕一としては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用い ることができ、例えば、サイ トメガロウィルス （ヒト C MV )の I E ( i腿 ediate early) 遺伝子のプロモーター、 S V 4 0の初期プロモ一夕一、 モロニ一 ' ミュ リン · ロイケミア ' ウィルス （Moloney Murine Leukemia Virus) のロング '夕 一ミナル · リピ一ト ·プロモーター （Long Terminal Repeat Promoter) 、 レト ロウィルスのプロモーター、 ヒートショックプロモー夕一、 S Rひプロモー夕 一、 あるいはメタ口チォネインのプロモーター等をあげることができる。 また、 ヒト C MVの I E遺伝子のェンハンサ一をプロモーターと共に用いてもよい。 宿主細胞としては、 マウス · ミエローマ細胞、 ラット ' ミエ口一マ細胞、 マ ウス 'ハイプリ ド一マ細胞、 チャイニーズ ·ハムスターの細胞である CH0細胞、 BHK細胞、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞、 ヒトの細胞である Namalwa細胞または Najnalwa KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、 ヒト白血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63 —299) 、 ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス ' ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NS0等、 ラッ 卜 ' ミエローマ細胞 としては YB2/0等、 ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC: CRL- 1573)等、 ヒト 白血病細胞としては BALL- 1等、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞としては C0S-1、 COS- 7、 ヒ卜大腸癌細胞株としては HCT-15等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法
CCytotechnology, 3, 133 ( 1990)〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)〕、 Virology, 52, 456 ( 1973)に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えば、 バキュロウィルス ，イクス プレッシヨン 'ベクターズ ァ ·ラボラトリ一 'マニュアル 〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork ( 1992)〕、モレキュラー'バイオロジー ァ 'ラボラ卜リ一'マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual ) 、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキ ユラ一 'バイオロジー サプルメント 1〜3 8 (Current Protocols in Molecular Biology) 、 Bio/Technology, 6, 47 ( 1988)等に記載された方法によって、 ポリ ぺプチドを発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導 入して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えゥィルス を昆虫細胞に感染させ、 ポリべプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacI I I (すべてインビ卜ロジェン社製） 等をあげることができ る。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るアウトグラファ ·カリフオル二力 .ヌクレア一 'ポリへドロシス ， ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用レヽることがで きる。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia の 卵巣細胞、 カイコ卵巣由来の培養細胞等を用レ、ることができる。
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては Sf9、 Sf21 (バキュロウィルス ' イクスプレツシヨン 'ベクタ一ズ ァ 'ラボラトリ一 'マニュアル） 等、
Trichoplusia niの卵巣細胞としては High 5、 BTI-TN-5B1-4 (インビトロジェン 社製） 等、 カイコ卵巣由来の培養細胞としては Bombyx mori N4等をあげること ができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク 夕一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, M, 7413 ( 1987)〕 等をあげることができる。
また、 動物細胞に D N Aを導入する方法と同様の方法を用いて、 昆虫細胞に D N Aを導入することもでき、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法
CCytotechnology, 3, 133 ( 1990)〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔ρΓ0 Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)〕 等をあ げることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、 公知の方法 〔組織培 養， 20 ( 1994)、 組織培養， 21 ( 1995 )、 Trends in Biotechnology, 15, 45 ( 1997)〕 に準じてポリぺプチドを生産することができる。 発現べクタ一として、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスべ クタ一等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるもので あればいずれも用いることができ、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) の 35Sプロモー夕一、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることがで きる。 また、 プロモ一夕一と発現させる遺伝子の間に、 トウモロコシのアルコ ール脱水素酵素遺伝子のィントロン 1等を挿入することにより、 遺伝子の発現 効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、 ポテト、 タバコ、 トウモロコシ、 イネ、 アブラナ、 大豆、 トマト、 ニンジン、 小麦、 大麦、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻等の植物細胞 等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) (特開昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977) 、 エレクト口ポレーシヨン 法 （特開昭 60-251887) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、 ジャーファーメンターを用いて大量 培養することができる。
培養する培地としては、 一般に使用されているムラシゲ 'アンド 'スク一グ (MS)培地、 ホワイ ト（White )培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイ ニン等、 植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 5〜9、 2 0〜4 0 °Cの条件下で 3〜6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
また、 遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入さ れた植物個体 （トランスジヱニック植物） を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリべプチドを生産することもできる。 例えば、 公知の方法 〔American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S ( 1996 )、 American Journal of Clinical Nutrition, 63， 627S ( 1996 )、 Bio/Technology, 9, 830 ( 1991 )〕 に準じて、 遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを 生産することができる。
プロモ一夕一としては、 動物で発現できるものであればいずれも用いること ができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモ一夕一であるひカゼインプロモ —夕一、 カゼインプロモー夕一、 ?ラクトグロブリンプロモ一夕一、 ホエー 酸性プロテインプロモー夕一等が好適に用レ、られる。
本発明のポリペプチドをコードする D N Aを組み込んだ組換え体べクタ一を 保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培 養方法に従って培養し、 該ポリペプチドを生成 ·蓄積させ、 該培養物より該ポ リベプチドを採取することにより、 該ポリべプチドを製造することができる。 形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育 または栽培し、 該ポリペプチドを生成 ·蓄積させ、 該動物個体または植物個体 より該ポリぺプチドを採取することにより、 該ポリぺプチドを製造することが できる。
即ち、 動物個体の場合、 例えば、 本発明の D N Aを保有する非ヒト トランス ジエニック動物を飼育し、 該組換え体 D N Aのコードする新規/? 1， 3—ガラ クトース転移酵素活性を有するポリべプチドを該動物中に生成 ·蓄積させ、 該 動物中より該ポリペプチドを採取することにより、 新規/? 1， 3—ガラクトー ス転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。 該動物中の生 成 -蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク、 卵等をあげることができる。 植物個体の場合、 例えば、 本発明の D N Aを保有する卜ランスジエニック植 物を栽培し、 該組換え体 D N Aのコードする新規/? 1 , 3—ガラクトース転移 酵素活性を有するポリべプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物中より該 ポリペプチドを採取することにより、 新規/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素活 性を有するポリべプチドを製造することができる。 本発明のポリべプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の 真核生物である場合、 これら本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 本発明のポリべプチドを生成 ·蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本発明のポリぺプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転 換体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類 等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、 グルコ ース、 フラクト一ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいは デンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノー ル、 プロパノ一ル等のアルコ一ル類を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、 その他含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ 一プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵 菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫 酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養または深部通気攪袢培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 5時間〜 7日間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの調整は、 無機あるいは有 機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。 また培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
プロモータ—として誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換 した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサ一を培地に添加し てもよい。 例えば、 プロモ一夕一を用いた発現ベクターで形質転換した微生 物を培養するときにはイソプロピル一 5— D—チォガラクトビラノシド等を、
^£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のポリぺプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、 該細胞を培 養する培地は、 一般に使用されている RPMI 1640培地 〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 〔Science， 122, 501 (1952)〕、 DMEM培地〔Virology， 8, 396 (1959))、 199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕 またはこれら 培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、 通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5 % C〇2存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。
また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン、 ス トレプトマイシン 等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリべプチド製造用形質転換体が昆虫細胞である場合、 該細胞を培 養する培地としては、 一般に使用されている TNM—FH培地 （ファーミンジ ェン社製） 、 Sf- 900 II SFM培地 （ギブコ B R L社製） 、 ExCe l l 400 、 ExCe l l 405 〔いずれも J R Hバイオサイエンシーズ社製〕 、 Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)〕 等を用いることができる。
培養は、 通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加して もよい。
遺伝子の発現方法としては、 ポリペプチド全長を発現させる以外に、
3—ガラクトース転移酵素活性を有する領域を含む部分ポリぺプチドとして発 現させることもできる。 糖転移酵素は、 一般にタイプ 2型の膜タンパク質のト ポロジーを有し、 N末端の数から数十アミノ酸からなる細胞質領域、 疎水性の 高いアミノ酸配列を有する膜結合領域、 数から数十アミノ酸からなる幹領域 (stem region) 、 および触媒領域を含む残りの大半の C末端部分からなってい る。 幹領域と触媒領域を含む残りの大半の C末端部分は、 ゴルジ体内腔に露出 していると考えられる。 幹領域と触媒領域の境界は、 N末端を欠失させたポリ ぺプチドを作製し、 どこまで欠失させると活性がなくなるかを検討することに より、 実験的に求めることができる。 一方、 幹領域と触媒領域に関する知見の ある類似の糖転移酵素とァミノ酸配列を比較することにより、 幹領域と触媒領 域を予想することもできる。
本発明の新規/? 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素の構造も、 他の糖転移酵素と 同様の構造を有している。
例えば、 配列番号 1で示されたァミノ酸配列を有する本発明のポリぺプチド の場合、 N末端の 7アミノ酸からなる細胞質領域、 それに続く 1 9アミノ酸か らなる疎水性に富む膜結合領域、 少なくとも 4アミノ酸からなる幹領域、 およ び触媒領域を含む残りの大半の C末端部分からなる。 他の 5 1， 3—ガラクト ース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、 ならびに他の/? 1 , 3—ガ ラクトース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見 〔特開平 6- 181759〕 を基 に、 幹領域は少なくとも 4アミノ酸からなると予想される。 従って、 3 1番目 から 3 1 0番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、 触媒領域を含むと考え られる。
上記のポリペプチド全長または/? 1， 3 _ガラクトース転移酵素活性を有す る領域 （触媒領域） を含む部分ポリペプチドは、 直接発現させる以外に、 モレ キュラー ·クロ一ニング第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌タンパ ク質または融合タンパク質として発現させることもできる。 融合させるタンパ ク質としては、 ガラクトシダ一ゼ、 プロテイン A、 プロテイン Aの I g G結 合領域、 クロラムフエニコ一ル ·ァセチルトランスフェラ一ゼ、 ポリ （A r g )、 ポリ （G l u ) 、 プロテイン G、 マルト一ス結合タンパク質、 グル夕チオン S - トランスフェラ一ゼ、 ポリヒスチジン鎖 （His- tag) 、 Sペプチド、 D N A結合 タンパク質ドメイン、 T a c抗原、 チォレドキシン、 グリーン ' フルォレヅセ ント ·プロティン、 および任意の抗体のェピトープ等があげられる 〔山川彰夫， 実験医学， 13, 469-474 ( 1995 )〕 。
本発明のポリべプチドの生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があ り、 使用する宿主細胞や、 生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場 合、 ポールソンらの方法 〔J. Biol . Chem. , 264, 17619 ( 1989)〕 、 ロウらの 方法 Proc. Natl . Acad. Sci . , USA, 86, 8227 ( 1989 )、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 、 または特開平 05- 336963、 W094/23021等に記載の方法を準用するこ とにより、 該ポリぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明のポリペプチドの活性部位 を含むポリべプチドの手前にシグナルべプチドを付加した形で発現させること により、 本発明のポリべプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができ る。
具体的には、 触媒部位を含むと考えられる 3 1番目から 3 1 0番目までのァ ミノ酸配列を有するポリぺプチドの手前に、 シグナルべプチドを付加して発現 させることにより、 本発明のポリべプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させる ことができると考えられる。 さらに、 シグナルペプチドと触媒領域を含むポリ ペプチドの間、 または触媒領域を含むポリペプチドの C末端に、 精製 ·検出用 のタグを付加することもできる。 精製 ·検出用のタグとしては、 ガラクトシ ダ一ゼ、 プロテイン A、 プロテイン Aの I g G結合領域、 クロラムフエニコー ル ·ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G 1 u ) 、 プロテ イン G、 マルトース結合タンパク質、 グル夕チオン S -トランスフェラーゼ、 ポ リヒスチジン鎖 （His-tag) 、 Sペプチド、 D N A結合タンパク質ドメイン、 T a c抗原、 チォレドキシン、 グリーン · フルォレツセント 'プロテイン、 およ び任意の抗体のェピト一プ等があげられる 〔山川彰夫， 実験医学， 469-474 ( 1995 )〕 。
また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 本発明ポリぺプチド製造用形質転換体の培養物から、 本発明のポリぺプチド を単離 ·精製するには、 通常の酵素の単離 ·精製法を用いることができる。 例えば、 本発明のポリぺプチドが本発明のポリぺプチド製造用形質転換体の 細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、 培養物を遠心分離することにより、 培 養物中の細胞を集め、 該細胞を洗浄した後に、 超音波破碎機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞 抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（D E A E ) ーセファロース、 DIAION HPA- 75 (三菱化成社製） 等レジンを用いた 陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製） 等 のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ一法、 プチルセファロース、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、 分子 篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォ —カシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、 精製標品を得 ることができる。
また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に 細胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常 の方法により該ポリべプチドを回収後、 該ポリべプチドの不溶体をポリべプチ ド変性剤で可溶化する。 該可溶化液を、 ポリペプチド変性剤を含まないあるい はポリべプチド変性剤の濃度がポリべプチドが変性しない程度に希薄な溶液に 希釈、 あるいは透析し、 該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、 上 記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ポリべプチドが分泌される場合には、 該培養物を遠心分離等の手 法により処理し、 可溶性画分を取得する。 該可溶性画分から、 上記無細胞抽出 液上清からの単離精製法と同様の手法により、 該ポリべプチドの精製標品を得 ることができる。
また、 通常の糖転移酵素の精製方法 CMethods in Enzymology, 83, 458〕 に 準じて精製できる。
また、 本発明のポリべプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生 産し、 融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマ 卜グラフィーを利用して精製することもできる 〔山川彰夫， 実験医学， ， 469-474 (1995)〕。
例えば、 ロウらの方法 〔Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)〕 、 特開平 05-336963、 W094/23021に記載の方法に 準じて、 本発明のポリべプチドをプロティン Aとの融合タンパク質として生産 し、 ィムノグロブリン Gを用いるァフィ二ティークロマトグラフィ一により精 製することができる。
また、 本発明のポリべプチドを FLAGぺプチドとの融合タンパク質として 生産し、 抗 FLAG抗体を用いるァフィ二ティークロマトグラフィーにより精 製することができる 〔Pro Natl. Acad. Sci.， USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)〕。
更に、 該ポリべプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティ一クロマトグ ラフィ一で精製することもできる。
本発明のポリペプチドは、 公知の方法 〔J. Biomolecular NMR, 6, 129-134、 Science, 242, 1162-1164、 J.Biochem., 110, 166- 168 ( 1991 )〕に準じて、 in vitro 転写 ·翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、 Fmo c法 （フルォ レニルメチルォキシカルボニル法） 、 t B 0 c法 （ t 一ブチルォキシカルボ二 ル法） 等の化学合成法によっても本発明のポリぺプチドを製造することができ る。 また、 ァドバンスト ·ケムテック （Advanced ChemTech ) 社、 パーキン · エルマ一社、 フアルマシアバイオテク社、 プロテイン 'テクノロジー 'インス 卜ウノレメン 卜 (Protein Technology Instrument) 社、 シンセセ レ -ベガ (Synthecel l -Vega) 社、 パーセプティブ (PerSeptive) 社、 島津製作所等の ぺプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリべプチドの構造解析は、 タンパク質化学で通常用いら れる方法、 例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析 （平野久著、 東京化学同人発行、 1 9 9 3年） に記載の方法により実施可能である。
本発明のポリぺプチドの ? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素活性は、 公知の測 定法〔J. Biol . Chem. , 258, 9893- 9898 ( 1983)、 J. Biol . Chem. , 262, 15649-15658 ( 1987)、 Archi . Biochem. Biophys. , 270, 630-646 ( 1989)、 Archi . Biochem. Biophys. , 274, 14-25 ( 1989)、 特開平 06- 181759、 J. Biol . Chem. , 273, 58- 65 ( 1998)、 J. Biol . Chem. , 273, 433-440( 1998)、 J. Biol . Chem. , 273, 12770-12778 ( 1998)〕 に準じて測定することができる。
( 3 ) ガラクトースが ? 1 , 3結合で、 N—ァセチルグルコサミン、 N—ァ セチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を 有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造
上記 （2 ) で取得した微生物、 動物細胞、 植物細胞および昆虫細胞由来の形 質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、 該培養物中 に、 ガラクト一スが/? 1， 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチル グルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する 糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該培養物中より該糖 鎖または該複合糖質を採取することにより、 該糖鎖または該複合糖質を製造す ることができる。
ガラクト一スが/? 1 , 3結合で N—ァセチルグルコサミン残基に付加した構 造を含有する糖鎖として、 シァリルルイス a構造を含有する糖鎖、 シァリルル イス c構造を含有する糖鎖、 ルイス a構造を含有する糖鎖、 ルイス b構造を含 有する糖鎖、 Galひ卜 3Gal n- 3GlcNAc構造を含有する糖鎖、 Galひ 1- 3(Fucひ卜 2 )Gal ? 1 - 3GlcNAc構造を含有する糖鎖、 GalNAc a l-3(Fuc a l-2 )Gal β l-3GlcNAc 構造を含有する糖鎖等をあげることができる。
培養は上記 （2 ) に準じて行うことができる。
上記形質転換体において、 本発明のポリべプチドと任意の組換え糖タンパク 質 （例えば医薬用組換え糖タンパク質） を、 糖鎖合成可能な形質転換体中で同 時に生産させることにより、 該組換え糖タンパク質に、 ガラクトースが ? 1 , 3結合で、 N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グル コースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を付加することがで きる。
また、 上記 （2 ) で取得した動物個体または植物個体を用い、 上記 （2 ) の 方法に準じて、 ガラクトースが ? 1 , 3結合で、 N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した 構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。 即ち、 動物個体の場合、 例えば、 本発明の D NAを保有する非ヒト トランス ジエニック動物を飼育し、 該動物中に、 ガラクト一スが ? 1， 3結合で N—ァ セチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグル コース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生 成 '蓄積させ、 該動物中より該生成物を採取することにより、 ガラクトースが β 1 , 3結合で Ν—ァセチルグルコサミン、 Ν—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の 付加した複合糖質を製造することができる。
該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク、 卵等をあげ ることができる。
植物個体の場合、 例えば、 本発明の D N Aを保有するトランスジエニック植 物を栽培し、 該植物中に、 ガラクトースが 3結合で N—ァセチルグルコ サミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に 付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該植物中より該生産物を採取することにより、 ガラクトースが/? 1， 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまた はグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖 質を製造することができる。
上記 （2 ) 記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用 い、 水性媒体中で、 糖鎖の非還元末端に存在する N—ァセチルグルコサミン残 基または N—ァセチルグルコサミン単糖に/? 1 , 3結合でガラクトースが付与 された反応産物を、 以下の方法で製造することができる。
即ち、 N—ァセチルグルコサミン単糖、 N—ァセチルグルコサミン残基を非 還元末端に有するオリゴ糖、 または N—ァセチルダルコサミン残基を糖鎖の非 還元末端に有する複合糖質を受容基質として、 上記 （2 ) 記載の方法で取得さ れる本発明のポリペプチドを酵素源として用い、 該受容基質、 該酵素源および ゥリジン一 5， 一二リン酸ガラク卜一ス （U D P— G a l ) を水性媒体中に存 在せしめ、 該水性媒体中に、 該受容基質の N—ァセチルグルコサミンまたは N —ァセチルグルコサミン残基に 5 1， 3結合でガラクト一スが付与された反応 産物を生成 ·蓄積させ、 該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、 該反応産物を製造することができる。
上記 （2 ) 記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用 い、 水性媒体中で、 糖鎖の非還元末端に存在するグルコース残基またはグルコ ース単糖に 5 1 , 3結合でガラクトースが付与された反応産物を、 以下の方法 で製造することができる。
即ち、 グルコース単糖、 グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖、 ま たはグルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質を受容基質として、 上記 （2 ) 記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、 該受容基質、 該酵素源および U D P— G a 1を水性媒体中に存在せしめ、 該水 性媒体中に、 該受容基質のグルコースまたはグルコース残基に/? 1 , 3結合で ガラクトースが付与された反応産物を生成 ·蓄積させ、 該水性媒体中より該反 応産物を採取することにより、 該反応産物を製造することができる。
酵素源は、 ァガラクトラクト— N—ネオテトラオース （agalact lacto-N- neotetraose, GlcNAc ? l-3Gal ? l-4Glc) を基質として、 3 7 °Cで 1分間に 1 モルのラクトー N—テトラオース（lacto- N-tetraose， Gal ? l-3GlcNAc ? l-3Gal 51-4Glc) を生成することのできる活性を 1単位 （U ) として、 0.1mU/ l〜 10, 000U/ 1であり、 好ましくは lmU/ 1〜1，000U/ 1の濃度で用いる。 水性媒体としては、 水、 りん酸塩、 炭酸塩、 酢酸塩、 ほう酸塩、 クェン酸塩、 トリス等の緩衝液、 メタノール、 エタノール等のアルコール類、 酢酸ェチル等 のエステル類、 アセトン等のケトン類、 ァセトアミ ド等のアミ ド類等をあげる ことができる。 また、 酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用 いることができる。 更に、 上記 （2 ) 記載の培養により得られた形質転換体の 培養液、 上記 （2 ) 記載の非ヒトトランスジヱニック動物より得られたミルク を水性媒体として用いることもできる。
水性媒体に、 必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。 界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン，ォク夕デシルァミン （例えばナ イミーン S-215、 日本油脂社製） 等の非イオン界面活性剤、 セチルトリメチルァ ンモニゥム ·ブロマイ ドゃアルキルジメチル ·ベンジルアンモニゥムクロライ ド （例えばカチオン F2-40E、 日本油脂社製） 等のカチオン系界面活性剤、 ラウ ロイル 'ザルコシネート等のァニオン系界面活性剤、 アルキルジメチルァミン (例えば三級アミン FB、 日本油脂社製） 等の三級アミン類等、 G a l含有糖質 の生成を促進するものであればいずれでもよく、 1種または数種を混合して使 用することもできる。
界面活性剤は、 通常 0 . 1〜5 0 g/ 1の濃度で用いられる。
有機溶剤としては、 キシレン、 トルエン、 脂肪族アルコール、 アセトン、 酢 酸ェチル等が挙げられ、 通常 0. 1〜50ml/ 1の濃度で用いられる。
UD P— G a 1としては、 市販品の他、 微生物等の活性を利用して生成した 反応液あるレ、は該反応液から精製したものを用いることができる。 該 U D P— Ga lは 0. l〜500mmo 1 / 1の濃度で用いることができる。
上記において、 N—ァセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ 糖としては、 GlcNAc ?l-3Gal ?l-4Glc, GlcNAc Π- 3Gal H-4GlcNAc、 GlcNAc 5 l-3(GlcNAc ?l-6)Gal ?l-4Glc, GlcNAc ? l-3( GlcNAc ? 1-6 )Gal β l-4GlcNAcs GlcNAcn- 3GalNAc、 GlcNAc ?l- 6 GalNAc, またはこれらオリゴ糖の構造のいず れか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖等をあげることができる。
N—ァセチルグルコサミン残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質として は、 上記ォリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖 鎖を含有する複合糖質、 あるいはァシァロアガラクト複合型 N結合型糖鎖を含 有する複合糖質等をあげることができる。
受容基質は 0. 01〜50 Ommo 1ノ 1の濃度で用いることができる。 該生成反応において、 必要に応じて MnC 12等の無機塩、 メルカプトェ 夕ノール、 ポリエチレングリコ一ル等を添加することができる。
生成反応は水性媒体中、 pH5〜10、 好ましくは pH6〜8、 20〜50°C の条件で 1〜96時間行う。
上記方法により生産される糖鎖または複合糖質より、 公知の酵素的手法また は化学的手法により糖鎖の一部を切り出すことができる 〔日本生化学会編， 続 生化学実験講座， 第 4卷，複合糖質研究法 I， I I，東京化学同人， （1986年） 、 谷口直之 '鈴木明身 '古川清 ·菅原和幸 監修， グリコバイオロジー実験プロト コール， 秀潤社， （1996年） 〕 。
(4) 本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製
(i) ポリクローナル抗体の作製
上述 （2) の方法により取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標 品、 あるいは本発明のポリべプチドの一部のアミノ酸配列を有するぺプチドを 抗原として用い、 動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製するこ とができる。
投与する動物として、 ゥサギ、 ャギ、 ラット、 マウス、 ハムスター等を用い ることができる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 5 0〜 1 0 が好ましい。
ペプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァニン （keyhole limpet haemocyanin) ゃ牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させた ものを抗原とするのが望ましい。 抗原とするペプチドは、 ペプチド合成機で合 成することができる。
該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜 1 0回行う。 各投 与後、 3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応 することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（E L I S A法） ：医学書院刊 1 9 7 6年、 Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory ( 1988)〕 等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、 その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物 より血清を取得し、 該血清より、 下記方法によりポリクローナル抗体を分離、 精製することができる。
抗体を分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 4 0〜5 0 %飽和硫酸アン モニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿 C Antibodies, A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1988)〕 、 または D E A E—セファロ一スカラム、 陰イオン交換カラム、 プロティン Aまたは G—カラムあるいはゲル濾過カラム 等を用いるクロマトグラフィー等を、 単独または組み合わせて処理する方法が あげられる。
( i i ) モノクロ一ナル抗体の作製
(a)抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリべプチドの部分断片ポリべプチドに対し、 その血 清が十分な抗体価を示したラッ 卜を抗体産生細胞の供給源として供する。 該抗体価を示したラッ卜に抗原物質を最終投与した後 3~7日目に、 脾臓を 摘出する。 該脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセットでほ ぐし、 1 , 200 r pmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス—塩化アンモニゥム緩衝液 （pH7. 6 5) で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、 得ら れた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
(b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスまたはラッ卜から取得した株化細胞を使用する。 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- U1 (以下、 P 3— U 1と略す） 〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、 Europ. J. Immunol., 6， 511 (1976)〕、 SP2/0-Agl4(SP-2) (Nature, 276, 269 (1978)〕 、 P3-X63-Ag8653(653) 〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)] 、 P3-X63-Ag8(X63) Nature, 256, 495 (1975)〕 等を用いることができる。 これ らの細胞株は、 8—ァザグァニン培地 〔RPMI- 1640培地にグルタミン （ 1. 5m mo 1/1) 、 2—メルカプトエタノール （5 x 10_5mo 1/1) 、 ジェン夕 マイシン （ 10 /g/ml)および牛胎児血清（FCS) (CSL社製、 10%) を加えた培地 （以下、 正常培地という） に、 さらに 8—ァザグァニン （ 15〃 g/ml) を加えた培地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜4日前に正常培地で 培養し、 融合には該細胞を 2 107個以上用いる。
(c)ハイプリ ドーマの作製
( a )で取得した抗体産生細胞と（ b )で取得した骨髄腫細胞を M E M培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1. 83 g、 リン酸一カリウム 0. 21 g、 食 塩 7. 65 g、 蒸留水 1リッ トル、 pH 7. 2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞：骨髄腫細胞 = 5〜10 ： 1になるよう混合し、 1 , 200 rp mで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に、攪拌しながら、 37°C で、 108抗体産生細胞あたり、 ポリエチレングライコ一ル— 1000 (PEG — 1000) 2 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド （DM SO) 0. 7 mlを混合した溶液を 0. 2〜 lml添加し、 更に 1〜 2分間毎に ME M培地 1〜 2 m 1を数回添加する。
添加後、 MEM培地を加えて全量が 50mlになるように調製する。 該調製 液を 900 r pmで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メスピペットによる吸 込み、 吹出しでゆるやかに HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン （ 10— 4mo 1/1) 、 チミジン （ 1. 5 x l (r5mo l/l) およびアミノプテリン （4 x 10"7mo 1/1) を加えた培地〕 100ml中に懸濁する。
該懸濁液を 96穴培養用プレートに 100〃 1/穴ずつ分注し、 5% C〇2 インキュべ一夕一中、 37°Cで 7〜 14日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をとりアンチボディズ CAntibodies, A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕 等に述べられ ている 酵素免疫測定法により、 本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチド に特異的に反応するハイプリ ドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、 以下の方法をあげることができる。
免疫の際、 抗原に用いた本発明のポリべプチドの部分断片ポリべプチドを適 当なプレートにコートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしくは後述の（d)で得られ る精製抗体を第一抗体として反応させる。 さらに第二抗体としてピオチン、 酵 素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウス ィムノグロプリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行なう。 本発 明のポリぺプチドに特異的に反応するものを本発明のモノクロ一ナル抗体を生 産するハイプリ ドーマとして選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、 限界希釈法によりクロ一ニングを 2回繰り返し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からアミノプテリンを除いた培地） 、 2回 目は、 正常培地を使用する〕 、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明 のポリべプチドの抗ポリべプチド抗体産生ハイプリ ドーマ株として選択する。 (d)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理 〔2, 6, 10 , 14—テトラメチルペン夕デカン （P r i s t ane) 0. 5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜 10週令 のマウスまたはヌ一ドマウスに、 （c)で取得した本発明のポリべプチドモノクロ —ナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞 5〜 20 X 106細胞/匹を腹腔内に注射す る。 10〜21日間でハイプリ ドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3， 000 rpmで 5分間遠心分 離して固形分を除去する。
得られた上清より、 ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクロ一 ナル抗体を精製、 取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体タイピングキッ 卜ま たはラットモノクローナル抗体タイピングキヅトを用いて行う。 抗体のクラス とは抗体のアイソタイプのことで、 ヒトでは、 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgEがあげ られる。サブクラスとは、 クラス内のアイソタイプのことで、 マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 ヒ卜では、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4があげられる。
抗体のタンパク質量は、 ローリー法あるいは 280 nmでの吸光度より算出 する。
( 5 ) 本発明の D N Aまたはオリゴヌクレオチドを用いた疾患の治療や診断等 への利用
本発明の DNAは、 アンチセンス RNA/DNA技術 〔バイオサイエンスと インダストリ一， 50, 322 (1992)、 化学， 6, 681 (1991)、 Biotechnology, 9, 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992) 、 Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、 細胞工学， l^, 1463 (1997)〕 あるいはトリプル 'ヘリックス 技術 CTrends in Biotechnology, 10, 132 (1992)〕 を用いた癌転移抑制等の疾 病の治療、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または P CR法を用いたそれら 癌の診断に利用することが可能である。
例えば、 上記 （1) 記載の本発明の DNA、 オリゴヌクレオチドまたはその 誘導体を投与することにより、 本発明のポリぺプチドの生産を抑制することが できる。
即ち、 本発明の D N A、 オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、 本 発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aの転写の抑制、 本発明のポリべプチド をコードする mR N Aの翻訳の抑制を行うことが可能である。
また、 本発明の D N Aあるいは該 D N Aより調製した上記オリゴヌクレオチ ドを用い、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または P C R法により、 本発明 のポリべプチドをコ一ドする D N Aの発現量を定量することができる。
更に、 本発明の D N Aをプローブとして、 公知の方法 〔東京大学医科学研究 所 制癌研究部編、 新細胞工学実験プロトコール、 秀潤社 （ 1 9 9 3年） 〕 を 用いて、 該遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。
現在、 多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録され ている。 したがって、 本発明のポリペプチドをコードするヒト cD N Aの配列と、 デ—夕ベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、 本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、 該遺伝子の構 造を明らかにできる可能性がある。 c D N Aの配列と一致する染色体遺伝子配列 が登録されていれば、 c D N Aの配列と染色体遺伝子の配列を比較することに より、 本発明のポリべプチドをコ一ドする染色体遺伝子のプロモーター領域、 ェクソンおよびィントロン構造を決定することができる。
プロモーター領域としては、 哺乳動物細胞において本発明のポリべプチドを コードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。 例えば、 ヒト大腸癌細胞あるいはヒト滕臓癌細胞で、 本発明のポリペプチドを コードする遺伝子の転写に関与するプロモータ領域をあげることができる。 具 体的には、 例えば、 配列番号 3で表される塩基配列の 1〜5 0 0 0番目の塩基 配列中の連続する 5 0〜5 0 0 0 b pの配列を有するプロモ一夕一 D N Aをあ げることができる。 該プロモータ一は後述のスクリ一ニング法に利用すること ができる。 糖転移酵素遺伝子には多型や変異が存在することが知られている。 例えば、
ABO式血液型の決定に関与する糖転移酵素に関しては、 遺伝子多型に基づく アミノ酸配列の違いにより以下の 3種の酵素が生成される。
A型抗原の合成に関与するひ 1，3-N—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 B 型抗原の合成に関与するひ 1，3-ガラクトース転移酵素、 および 0 (H) 型糖鎖 の生成に関与する活性を持たない酵素 〔Nature, 345, 229-233 (1990)〕。
またルイス式血液型の決定に関与する a 1 , 3 -フコース転移酵素 （ F u c— T i l l) の場合も、 遺伝子多型に基づくアミノ酸配列の違いにより、 活性が 低下または消失した酵素が生成することが知られている 〔J. Biol. Chem. , 269, 29271-29278 (1994)、 Blood, 82， 2915-2919 (1993)、 J. Biol. Chem. , 269, 20987-20994 (1994)、 J. Biol. Chem. , 272, 21994 - 21998 (1997)〕。
Fu c-T I I I遺伝子の多型は、 大腸癌における癌関連糖鎖抗原であるシ ァリルルイス a糖鎖の発現と密接な関係があることが知られている 〔Cancer Res., 56, 330-338 (1996)、 Cancer Res., 58, 512-518 (1998)〕。
従って、 Fu c— T I I Iの多型を調べることにより、 病気の診断や予後の 予測を行うことができると考えられる。
本発明の新規/? 1， 3-ガラクト一ス転移酵素は、 大腸癌ゃ脬臓癌においてシ ァリルルイス a糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖の合成に関与することから、 本遺伝子の多型を調べることにより、 大腸癌ゃ脬臓癌の診断や予後の予測に利 用できる。
また、 本遺伝子の多型と、 本遺伝子が発現している臓器 （胃、 空腸、 大腸、 脬臓など） における疾患との関連を調べることにより、 他の疾患の診断にも利 用できる。
本遺伝子の多型解析は、 本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができ る。 具体的には、 サザンプロット法、 ダイレクトシークェンス法、 PCR法、 D N Aチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる〔臨床検査， 42, 1507-1517 (1998)、 臨床検査， 42, 1565-1570 (1998)〕。 ( 6 ) 本発明のポリぺプチドの利用
(a) 本発明の抗体作製への利用
本発明のポリペプチドを用い、 上記 （4) の方法により本発明の抗体を作製 することができる。
(b) 本発明のポリペプチドを用いる糖鎖、 複合糖質製造への利用 本発明のポリペプチドを用い、 ガラクトースが/? 1， 3結合で N—ァセチル グルコサミン、 N—ァセチルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース 残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造する ことができる。
(c) 本発明のポリべプチドの活性に関与する物質のスクリーニングへの利 用
本発明のポリペプチドは、 下記 （8) の （a) の方法により、 該ポリべプチ ドの活性を増強または阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
(7) 本発明の抗体の利用
(a) 本発明の抗体を用いる本発明のポリべプチドの免疫学的検出および定 里
本発明のポリべプチドの免疫学的検出法としては、 マイクロ夕イタ一プレー トを用いる EL I SA法、 蛍光抗体法、 ウェス夕ンブロット法、 免疫組織染色 法等をあげることができる。
免疫学的定量法としては、 液相中で本発明のポリぺプチドと反応する抗体の うちェピ卜一プが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドィツチ E L I S A法、 1261等の放射性同位体で標識した本発明のポリべプチドと本発明の ポリぺプチドを認識する抗体とを用いるラジオィムノアッセィ法等をあげるこ とができる。
上記検出あるいは定量法は、 大腸癌、 滕臓癌等の診断に利用することができ る。
(b) 本発明の抗体を含有する医薬 本発明の抗体は、 医薬、 例えば大腸癌、 滕臓癌等の疾患の治療薬として用い ることができる。
本発明の抗体を含有する医薬は、 治療薬として該化合物単独で投与すること も可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体 と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製 造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口 投与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口 投与をあげることができる。 投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散 剤、 顆粒剤等があげられる。 例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物 は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プ ロビレングリコ一ル等のグリコ一ル類、 ごま油、 オリ一ブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ぺ パーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 夕 ルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼ ラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等 を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 例えば、 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担 体等を用いて調製する。 座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担 体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該化合物そのもの、 ないしは受容者の 口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸 収を容易にさせる担体等を用いて調製する。 担体として具体的には乳糖、 グリ セリン等が例示される。 該化合物および用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経 口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10 / / 〜8111 /1^ で ある。
(8) スクリーニング法への応用
本発明の新規/? 1, 3—ガラクトース転移酵素ポリペプチドは、 大腸癌細胞 ゃ脬臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、 シァリルルイス a糖鎖、 シァリル ルイス c糖鎖、 ルイス a糖鎖、 ルイス b糖鎖等のタイプ 1糖鎖の合成に関与す ることから、 該ポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物を用いて、 細 胞におけるタイプ 1糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。 また、 該ポリペプチドをコ一ドする遺伝子の転写過程、 あるいは転写産物か ら夕ンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、 該ポリぺプチドの 発現を制御し、 細胞におけるタイプ 1糖鎖の合成量を制御することが可能であ る。
タイプ 1糖鎖の合成量を抑制する化合物は、 癌転移抑制に有用と考えられる。 一方、 タイプ 1糖鎖の合成量を増加させる化合物は、 タイプ 1糖鎖の合成に有 用と考えられる。
上記の化合物は、 以下 （a) 〜 （e) に示す方法により取得可能である。 (a) 上記 （2) で記載した方法を用いて調製した本発明の新規/? 1， 3- ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチド （精製物あるいは該ポリぺプ チドを発現する形質転換体の細胞抽出液または培養上清） を酵素として用い、 被験試料の存在下、 公知の方法 〔J. Biol. Chem. , 258, 9893-9898 (1983)、 J. Biol. Chem. , 262, 15649- 15658 (1987)、 Archi. Biochem. Biophys., 270, 630-646 (1989)、 Archi. Biochem. Biophys., 274, 14-25 (1989)、 特開平 06- 181759、 J, Biol. Chem. , 273, 58-65 (1998)、 J. Biol. Chem. , 273, 433-440(1998)、 J. Biol. Chem. , 273, 12770-12778 (1998)〕 を用いて/? 1, 3-ガラクト一ス 転移酵素活性を測定し、 3—ガラク トース転移酵素活性を増加または低 下させる活性を有する化合物を選択 ·取得する。
(b) 本発明のポリペプチドを発現する細胞または上記 （2) で記載した形 質転換体を、 被験試料の存在下、 上記 （2) の培養法で 2時間から 1週間培養 後、 細胞表面のシァリルルイス a糖鎖、 シァリルルイス c糖鎖、 ルイス a糖鎖、 ルイス b糖鎖等のタイプ 1糖鎖の量を、 それぞれの糖鎖に対する抗体を用いて 測定し、 該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択 ·取得す る。
上記抗体を用いた測定法としては、 例えば、 マイクロ夕イタ一プレートを用 いる EL I SA法、 蛍光抗体法、 ウエスタンプロット法、 免疫組織染色等を用 いた検出法をあげることができる。
(c) 本発明のポリペプチドを発現する細胞を、 被験試料の存在下、 上記 （2) の培養法で 2時間から 1週間培養後、 細胞中の該ポリペプチド量を、 上記 （4) で記載した本発明の抗体を用いて測定し、 該ポリべプチド量を増加または低下 させる活性を有する化合物を選択 ·取得する。
本発明の抗体を用いた測定法としては、 例えば、 マイクロ夕イタ一プレート を用いる EL I SA法、 蛍光抗体法、 ウエスタンプロット法、 免疫組織染色等 を用いた検出法をあげることができる。
(d) 本発明のポリペプチドを発現する細胞を、 被験試料の存在下、 上記 （2) で記載の培養法で 2時間から 1週間培養後、 細胞中の該ポリペプチドをコード する遺伝子転写産物の量を、 上記 （5) で記載したノーザンハイブリダィゼ一 シヨン法または PCR法等の方法を用いて測定し、 該転写産物量を増加または 低下させる活性を有する化合物を選択 ·取得する。
(e) 上記 （4) で取得したプロモー夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結 した DNAを組み込んだプラスミ ドを公知の方法により作製し、 上記 （2) 記 載の動物細胞に、 上記 （2) 記載の方法に準じて導入し、 形質転換体を取得す る。 該形質転換体を、 被験試料の存在下、 上記 （2) 記載の培養法で 2時間か ら 1週間培養後、 細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、 公知の方法 〔東京大 学医科学研究所 制癌研究部編， 新細胞工学実験プロ トコール， 秀潤社
(1993),Biotechniques, 20, 914 (1996)、 J. Antibiotics, 49, 453 (1996)、 Trends in Biochemical Sciences, 20, 448 (1995)、 細胞工学， 16, 581 (1997)〕 を用いて測定し、 該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選 択 ·取得する。
レポ一夕—遺伝子としては、 例えば、 クロラムフエニコ一ル 'ァセチルトラ ンスフェラーゼ遺伝子、 ?—グルクロニダーゼ遺伝子、 ガラクトシダーゼ 遺伝子、 ラク夕マ一ゼ遺伝子、 ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ェクオリン遺伝子ま たはグリーン · フルォレヅセント .プロティン （GFP) 遺伝子等をあげるこ とができる。
(9) ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明の DNAを含むベクターを用い、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥマ、 ニヮトリ、 マウス等の胚性幹細胞（embryonic stem cell)において染色体上の本発明のポリべプチドをコ一ドする DN Aを公知の 相同組換えの手法 〔例えば、 Nature, 326, 6110, 295 (1987)、 Cell, 51, 3， 503 (1987)等〕 により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成する ことができる 〔例えば、 Nature, 350, 6315, 243 (1991)〕。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンと、 非ヒト動物の受精卵の胚盤 胞 (blastcyst)を用い、 注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹 細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。
該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全身の細胞の染色体上の本発 明のポリべプチドをコ一ドする DNAに任意の変異を有する個体を得ることが でき、 さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、 ホモ個体 （ノックアウト非ヒト動物） を得ることができる。
このようにして動物個体において、 染色体上の本発明のポリべプチドをコ一 ドする D N Aの任意の位置へ変異の導入が可能である。 例えば染色体上の本発 明のポリペプチドをコードする D N Aの翻訳領域中への塩基置換、 欠失、 挿入 等の変異を導入することにより、 その産物の活性を変化させることができる。 またその発現制御領域への同様な変異の導入により、 発現の程度、 時期、 組 織特異性等を改変させることも可能である。 さらに Cre- ΙοχΡ系との組合せによ り、 より積極的に発現時期、 発現部位、 発現量等を制御することも可能である。 このような例として、 脳のある特定の領域で発現されるプロモ一夕を利用し て、 その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例 〔Cell， 87, 7, 1317 ( 1996)〕 や Creを発現するアデノウイルスを用いて、 目的の時期に、 臓器特異的に目的遺 伝子を欠失させた例 〔Science， 278, 5335, ( 1997)〕 が知られている。
従って染色体上の本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aについてもこの ように任意の時期や組織で発現を制御できる、 または任意の挿入、 欠失、 置換 をその翻訳領域や、 発現制御領域に有するノックァゥト非ヒト動物を作製する ことが可能である。
このようなノックアウト非ヒト動物は任意の時期、 任意の程度または任意の 部位で、 本発明のポリべプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することが できる。
従って、 本発明のノックアウト非ヒト動物は、 本発明のポリペプチドに起因 する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。 特にそ の治療薬、 予防薬、 また機能性食品、 健康食品等の評価用モデルとして非常に 有用である。 図面の簡単な説明
第 1図 第 1図の Aは、 各種ヒト癌細胞株におけるタイプ 1糖鎖 （シァリルルイ ス a糖鎖、 ルイス a糖鎖、 ルイス b糖鎖） の発現量を測定した結果を示した図 である。 各細胞を抗シァリルルイス a糖鎖抗体 （19-9) 、 抗ルイス a糖鎖抗体 (7LE)、 または抗ルイス b糖鎖抗体 （Neokokusai) で蛍光抗体染色した後、 F ACSを用いて解析した。 各抗体との反応性が強い順に + +十、 +十、 十、 土、 一で示した。 一は抗体との反応性がなかったことを示している。 NTは解析し ていないことを意味している。
第 1図の Bは、 定量的 PCR法を用いて、 各種ヒ卜癌細胞株におけるヒト 3 Ga 1 -T 1, ヒト ?3Ga l— T 2、 ヒト ？ 3 G a 1— Τ 3およびヒト ? 3 Ga l—T 4の転写産物の量を定量した結果を示した図である。 各種細胞株 における各 ? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素遺伝子転写産物の量は、 いずれの 細胞においても同程度発現していると考えられる/?-ァクチンの転写産物の量 を 1000とした時の相対値として表示した。
第 2図 第 2図は、 プラスミ ド pB S— 3 GT 5の造成 程を示した図である。 第 3図 第 3図の Aは、 コント口一ルプラスミ ド （p AMo)を導入した Namalwa 細胞 [Namalwa(mock)]、 あるいはヒト ？ 3 G a 1— T 5発現プラスミ ド （pAM 0- 3 GT 5) を導入した Namalwa細胞 （Namalwa-3GT5) について、 抗シァリル ルイス c糖鎖抗体 (DU-PAN-2) を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、 FA CSを用いて解析した結果を示した図である。 影をつけたヒストグラムは、 DU-PAN- 2の代わりに A— PB Sを用いた時の結果である。
第 3図の Bは、 コントロールプラスミ ド （pAMo) を導入した HCT- 15細胞 [HCT15(mock)]、 あるいはヒト ？ 3 G a 1— T 5発現プラスミ ド （pAMo— 3 GT 5) を導入した HCT- 15細胞 （HCT- 3GT5H) について、 抗シァリルルイス a糖 鎖抗体 (19-9) 、 抗シァリルルイス c糖鎖抗体 (DU-PAN-2) 、 抗ルイス a糖鎖 抗体 （7LE) または抗ルイス b糖鎖抗体 (Neokokusai) を用いて間接蛍光抗体染 色を行なった後、 F AC Sを用いて解析した結果を示した図である。 影をつけ たヒストグラムは、 DU- PAN- 2の代わりに A— PB Sを用いた時の結果である。 第 4図 第 4図の Aは、 定量的 PCR法を用いて、 各種ヒト癌細胞株におけるヒ ト ? 3 Ga 1— T 5の転写産物の量を定量した結果を示したずである。 各種細 胞株におけるヒト ? 3 Ga l— T 5の転写産物の量は、 いずれの細胞において も同程度発現していると考えられる ?-ァクチンの転写産物の量を 1000と した時の相対値として表示した。
第 4図の Bは、 ウエスタン ·ブロッテイング解析により、 各種ヒ卜癌細胞株 における CA19- 9抗原含有タンパク質の発現を調べた結果を示した図である。 第 5図 第 5図は、 定量的 PC R法を用いて、 各種ヒト組織におけるヒト ? 3 G a 1—T 5の転写産物の量を定量した結果を示した図である。 各組織における ヒト^ 3 Ga 1—T 5の転写産物の量は、 いずれの細胞においても同程度発現 していると考えられる ?-ァクチンの転写産物の量を 1000とした時の相対 値として表示した。
第 6図 第 6図の Aは、 ヒト 33 Ga 1—T 5染色体遺伝子の構造を示した図で ある。 4つのェクソンは四角で、 イントロンは線で示してある。 ェクソン 2中 には Xb a Iサイ 卜が、 ェクソン 3中には B smlサイ 卜が存在している。 コ —ディング領域 （open reading frame) は、 斜線で示してある。 ヒト ？ 3 G a 1—T 5 c DN Aのァイソフォームの解析に使用したプライマ一 （si- 1、 si- 2、 si- 3、 si- 4) の位置を矢印で示した。
第 6図の Bは、 ヒト ?3Ga l— T 5 c DNAのアイソフォームの構造を示 した図である。 存在比は、 Colo205細胞における各ァイソフォームの発現量をパ 一センティジで示したものである。
第 6図の Cは、 ！^丁ー？^^法を用ぃて、 Colo205細胞におけるヒ卜 ? 3 Ga 1一 T 5 c DNAの各アイソフォームの発現量を調べた結果を示した図である。 図 6 Aに示したプライマーの組み合わせで RT— P CRを行った後、 第 6図中 に示した制限酵素 (Xb a Iまたは B sml) で切断してァイソフォームの特 定を行った。 noneは制限酵素処理をしないことを意味している。 左のレーンは 分子量マ一力一 （ 100 bpラダー） である。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示す。 遺伝子操作的手法として、 断らない限りモレキュラー · クロ一ニング第 2版に記載された方法を用いた。 実施例 1 各種細胞株におけるタイプ 1糖鎖の発現量と既知/? 1 , 3—ガラ クトース転移酵素遺伝子の発現量の測定
各種ヒ卜癌細胞株におけるタイプ 1糖鎖 （シァリルルイス a糖鎖、 ルイス a 糖鎖、 ルイス b糖鎖） の発現量と既知のヒト ？ 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素 遺伝子の発現量を測定することにより、 大腸癌細胞株あるいは臈臓癌細胞株で タイプ 1糖鎖の合成に関与する/? 1， 3—ガラク卜ース転移酵素の同定を試み た。
各種細胞株におけるタイプ 1糖鎖 （シァリルルイス a糖鎖、 ルイス a糖鎖、 ルイス b糖鎖） の発現量の測定は、 抗シァリルルイス a糖鎖抗体、 抗ルイス a 糖鎖抗体、 または抗ルイス b糖鎖抗体を用いた蛍光抗体染色後、 FACSを用 いて解析することにより行った （第 1図の A) 。
各種ヒト細胞株における既知/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素 （ ?3Ga l — T l、 53Ga l— T 2、 ?3Ga l— Τ3、 53 Ga l-T4) 遺伝子の 転写物の定量は、 RT— P CR法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 87, 2725 (1990)、 J. Biol. Chem. , 269, 14730(1994)、 特開平 06- 181759、 J. Biol. Chem. , 273, 26729(1998)〕 を用いて行った。 各種細胞株における各 ? 1， 3—ガラクトース 転移酵素遺伝子転写産物の量は、 いずれの細胞においても同程度発現している と考えられる ?-ァクチンの転写産物の量を 1000とした時の相対値として 表示した （第 1図の B) 。
( 1) 各種細胞株におけるタイプ 1糖鎖 （シァリルルイス a糖鎖、 ルイス a 糖鎖、 ルイス b糖鎖） の発現量の測定
細胞株としては、 大腸癌細胞株 （Colo205、 Colo201、 SW1116, LS180、 HT29、 WiDr、 HCT-15、 SW480、 SW620) 、 滕臓癌細胞株 （Capan- 1、 Capan-2) 、 胃癌細 胞株 (KATOII I、 MKN45、 MKN74)、肺癌細胞株（PC- 1)、神経芽細胞腫細胞株（SK- N- MC、 SK-N-SH) 、 リンパ腫細胞株 (Namalwa, Jurkat) 、 前立腺癌細胞株 （PC- 3) を 用いた。
Colo205、 Colo201、 LS180、 HT29、 WiDrヽ HCT- 15、 SW480S SW620、 Capan - 1、 Capan- 2、 KATOIIIヽ MKN45、 KN74、 PC- 1、 SK-N-MC, SK- N - SHヽ Namalwa, PC- 3は アメリカン ·タイプ ·カルチヤ一 · コレクション （American Type Culture Collection； AT CC)より入手した。 また、 SW1116 ( A T C Cより入手可能） および Jurkat (理研ジーンバンク ； RIKEN GENE BANKより入手可能） は愛知県が んセン夕一の高橋博士より入手した。
上記の細胞をそれぞれの細胞に適した培地で培養後、 各細胞を抗シァリルル イス a糖鎖抗体 (19-9) 、 抗ルイス a糖鎖抗体 (7LE) 、 または抗ルイス b糖鎖 抗体 （Neokokusai社製） を用いて蛍光抗体染色し、 F A C Sを用いて解析した。 具体的方法を以下に示す。
各細胞 （約 1 X 106) をマイクロチューブ （ 1. 5ml ：エツペンドルフ社 製） にとり、 遠心分離 （ 550 xg、 7分間） により細胞を集めた。
該細胞を 0. 91111の0. 1 %のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液 PB S (A-PB S： 8 g/1 NaC l、 0. 2 g/1 KC 1、 1. 15 g/1 N a2HP04 (無水） 、 0. 2 g/1 KH2P〇4、 0. 1% アジ化ナトリウム） で洗浄した後、 該洗浄細胞に A— P B Sで約 10〃 g/m 1に希釈した上記抗 糖鎖抗体を 20〃1加えて懸濁し、 4°Cで 1時間反応させた。
反応後、 細胞を 0. 9mlの A— PB Sで 1回洗浄した後、 フルォレセイン ィソチオシァネート （F I T C) で蛍光標識した抗マウス I gM/I gG抗体 (Bio-Rad社製） を A— PB Sで 16倍希釈した溶液を 20〃 1加えて懸濁し、 4°Cで 30分間反応させた。
反応後、 細胞を 0. 9mlの A— PB Sで 1回洗浄した後、 0. 6 mlの A — PB Sに懸濁し、 フルォレツセンス ·ァクティべ一ティ ド ·セル ·ソ一夕一 〔エピックス'エリート 'フローサイ トメ一夕一（EPICS Elite Flow Cytometer)； コール夕一 （COULTER) 社製〕 を用いて解析を行なった。 また対照実験として、 抗糖鎖抗体の代わりに A— PBSを用いて同様の解析を行なつた。
結果を第 1図の Aに示す。 大腸癌細胞株である Colo205、 Colo201、 SW1116、 および臈臓癌細胞株である Capan- 2においてタイプ 1糖鎖が多く発現している こと確認した。
(2) 各種ヒト細胞株における既知/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素 （ ? 3 G a l— T l、 ?3 Ga l— T2、 ?3Ga l— T3、 53Ga l— T4) 遺伝 子の転写物の定量
(a) 各種細胞株由来一本鎖 cDN Aの調製
上記 （ 1) 記載の細胞株から酸グァニジゥム チオシァネート フエノール一 クロ口ホルム法 〔Anal. Biochem., 162, 156-159〕 により全 RNAを抽出した。 全 RNA各々 6 gに、 デォキシリボヌクレアーゼ I (Life Technologies社 製） を 5単位/ mlずつ添加し、 室温で 5分間反応させた。 反応後、 65 で 15分間加熱することにより、 酵素を失活させた。
得られた全 RNA各々について、 オリゴ （dT) プライマ一を用いて
SUPERSCRIPT™ Preajnplif ication System for First Strand cDNA System (Life Technologies社） により c D N Aを合成した。 反応は 20 i lで行い、 反応後 の溶液を水で 50倍希釈し、 使用するまで— 80°Cで保管した。
(b) スタンダードと内部コントロールの調製
検量線の作成に用いるスタンダードとしては、 ヒト 53Ga l— T l、 ヒト 53Ga l— Τ2、 ヒト ?3Ga l— Τ3、 ヒト ?3Ga l— Τ4の各 cDN Aを pUC119または pBluescript SK (-)に組み込んだプラスミ ド (pUC119 - 3GT1ヽ pBS- 3GT2、 pBS- 3GT3、 pBS-3GT4) を、 各 c D N A部分を切り出す適当な制限酵 素で切断し、 直鎖状 DNAに変換したものを用いた。
PUC119- 3GT1は、 特開平 6- 181759記載のプラスミ ド pUC119-WMl (FERM B P- 401 1 ) と同じものである。 ヒト 33Ga l— T 2、 ヒト 53Ga l— T3およびヒト ? 3Ga 1— T4の各 cDNAの取得は、 以下のように行った。 各 c DN Aの配列に特異的なプライマーを用いて P CRを行うことにより各 cDNAの断片を取得した。
取得された各 c DN A断片をプローブとして用いて、 コロニーハイブリダィ ゼ一シヨンまたはプラークハイブリダイゼ一シヨンを行うことにより、 それぞ れの cDNAを取得した。 ヒト ?3Ga l— T2、 ヒト /53Ga l— Τ3およ びヒト ？ 3 Ga 1 _T 4の塩基配列を、 L I _ C 0 R社の D Ν Αシークェンサ ― (dNA sequencer model 4000L) またはパーキンエルマ一社の D N Aシ一クェ ンサ一 377と、 各シークェンサ一用の反応キッ トを用いて決定し、 それぞれ ヒト ?3 Ga l— T 2、 ヒ卜 ? 3Ga l— Τ 3、 ならびにヒト ?3Ga l— Τ 4をコ一ドすることを確認した。 各 cDNAは公知の配列をもとにした P CR によっても得ることができる。
ァクチンの転写産物定量用のスタンダードとしては、 pUC 119 -A CTを c DNA部分を切り出す制限酵素 (H ind I I Iと As p 718) で 切断して直鎖状 DNAに変換したものを用いた 〔J. Biol. Chem. , 269, 14730(1994)、 特開平 06- 181759〕 。
内部コントロールとしては、 下記のようにして調製したプラスミ ド （pBS- 3GTld、 pBS- 3GT2dヽ pBS - 3GT3d、 pBS-3GT4d) を、 各 c D N Aを切り出す適当な 制限酵素で切断し、 直鎖状 DN Aに変換したものを用いた。
PUC119-3GT1において、 ヒト ?3Ga l— T l cDNA中の B an I I -E c _2_RV間 212 bpを欠失させることにより pUC119-3GTldを作製した。
PBS-3GT2において、 ヒト 53Ga l— T 2 c DNA中の Af 1 I I— B s t E I I間 258 bpを欠失させることにより pBS- 3GT2dを作製した。
pBS- GT3において、 ヒト 53Ga l— T 3 cDNA中の S t y I— S t y I間 183 bpを欠失させることにより pBS- 3GT3dを作製した。
pBS- 3GT4において、 ヒト 33Ga l— T4 cDNA中の Ac c I I I -St I間 253 bpを欠失させることにより pBS-3GT4dを作製した。
5 -ァクチンの転写産物定量用の内部コントロールとしては、 pUC 1 19— ACT dを c DNA部分を切り出す制限酵素 (H i nd I I Iと As p 718) で切断して直鎖状 DNAに変換したものを用いた 〔J. Biol. Chem. , 269, 14730 (1994)、 特開平 06- 181759〕 。
(c) RT— P CRによる転写量の定量 上記各組織由来の c DNA 10〃1および内部コントロール用プラスミ ド 10 1 ( 10 f g) を含む 50〃 1の反応溶液 〔10mmo l/l T r i s — HC1 ( H 8. 3) 、 5 Ommo 1/1 KC1、 1. 5mmo 1/1 M C 12, 0. 2mmo 1/1 dNTP、 0. 001 % (w/v)ゼラチン、 ◦ 2/zmo 1/1 遺伝子特異的プライマ一〕 で、 DNAポリメラ一ゼ AmpliTaq Gold™ (Parkin Elmer社製） を用いて PCRを行った。
各遺伝子特異的プライマ一の塩基配列を第 1表に示した。 また、 33Gal 一 T 1遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号 4、 5に、 ?3Gal—
T 2遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号 6、 7に、 ?3Gal— T
3遺伝子特異的プライマ一の塩基配列を配列番号 8、 9に、 53Gal— T4 遺伝子特異的プライマ一の塩基配列を配列番号 10、 11に、 ?ーァクチン特 異的プライマ一の塩基配列を配列番号 12、 13に示した。
第 1表 定量的 PC Rに使用した条件とプライマ— ターケッ卜 PCR 産物のサイズ （bp) ァニ一リング
*プライマーセッ卜
遺伝子 /mux.
ターゲット コンペティ夕一
F:5 " -TTCAGCCACCTAACAGTTGCCAG6- β3。αΙ-Τ1 495 283 60
Figure imgf000060_0001
60
F:5 ' -CCCAATGCCAAGTACGT3VATGAAG- β3ϋαΙ-Τ3 474 291
R : 5 ' -TGTGGTGTTCCTTAGCATGACCTG- 60
Fi5 ' -TTGATCCCCAACCAGGAAGCTTGC- β3ΰαΙ-Τ4 R:5 ' -TGAGGCCACTGCTCCTCTGATACG- 590 337 68
F:5 ' -ACCACCAGCAGTGCAGCGGAAAC - β3βαΙ-Τ5 554 410
:5 ' -GCCACGATCCTCCXGAAGAGGCA- 65
F!5 ' -GATATCGCCGCGCTCGTCGTCGAC - β-Actiti R:5 ' -CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC - 789 639 60
* ：フォヮ一ドプライマ- R ： リバースプライマ一 上記プライマーのセットにより、 各遺伝子転写産物および各スタンダードか らは、 第 1表の夕一ゲッ卜のところに示したサイズの DNA断片を増幅させる ことができる。 一方、 上記プライマ一のセットにより、 各内部コントロールか らは、 第 1表のコンペティターのところに示したサイズの DNA断片を増幅さ せることができる。 PCRは、 95°Cで 1 1分間の加熱後、 95°Cで 1分間、 各遺伝子に適した第 1表に記載のァニーリング温度で 1分間、 72 で 2分間からなる反応を 1サ ィクルとして、 ? 1， 3—ガラクトース転移酵素遺伝子群については 42サイ クル、 ァクチンについては 24サイクルの条件で行った。
P CR後の溶液のうち 10〃 1を 1 %のァガロースゲルで電気泳動し、 ェチ ジゥムプロマイ ドで染色し、 写真を撮影した。 写真を NIHイメージシステム によりスキャニングすることにより増幅した断片の染色の強さを測定し、 増幅 量とした。
細胞由来 cDN Aのかわりに上記で調製したスタンダ一ドプラスミ ドを 1. 25 f g、 2. 5 f g、 5 f g、 10 f g、 20 f g、 40 f g用いて、 PC Rを行い、 増幅断片の増幅量を測定し、 cDNAの量と断片の増幅量をプロッ トして検量線を作成した。
この検量線と各細胞由来 c D N Aでの断片の増幅量から、 各細胞での c D N Aの量を計算し、 これを各細胞での mRN A転写量すなわち遺伝子の発現量と した。 なお、 ァクチンは各細胞で普遍的に発現している遺伝子と考えられ るため、 どの細胞においてもその発現量は同程度と考えられる。 従って、 各細 胞における/?—ァクチン遺伝子の発現量の差は、 cDNA合成反応の効率の差 と考えられるため/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素遺伝子の発現量を比較する 際に/ 5—ァクチンの発現量も考慮した。
各種細胞株における各 ? 1， 3—ガラクトース転移酵素遺伝子転写産物の量 を、 ァクチンの転写産物の量を 1000とした時の相対値として表示した (第 1図の； B) 。
? 3 Ga 1 -T U ? 3 Ga 1—T 2および/? 3 Ga 1— T 3は Gal^卜 3GlcNAc構造を合成する活性を有しているが、 タイプ 1糖鎖を多く発現している 大腸癌細胞株 (Colo205、 Colo201、 SW1116) および脬臓癌細胞株 (Capan- 2) で はほとんど発現していなかった。 一方、 ?3Ga l— T4は大腸癌細胞株 (Colo205、 Colo201、 SW1116) および臈臓癌細胞株 (Capan-2) で発現がみられ たが、 この酵素は Gal 1 - 3G 1 cNAc構造を合成する活性を有していないことが明 らかになつている。
以上の結果から、 これらの細胞株においてタイプ 1糖鎖の合成に関与してい る ? 1， 3—ガラクトース転移酵素は、 新規の酵素であることが明らかになつ た。
実施例 2 大腸癌細胞または脬臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、 シァ リルルイス a糖鎖等のタイプ 1糖鎖の合成に関与する、 新規/? 1， 3—ガラク トース転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子 （cDNA) の クローン化
( 1) ヒト大腸癌細胞株 Colo205からの mRNAの取得
ヒト大腸癌細胞株 Colo205より、 ロッシュ （Roche) 社製の mRNA抽出キヅ トである Oligotex™- dT30く super>を用いて、 約 30〃gの mRNAを取得した。 具体的試薬および方法は、 キッ卜に添付されている説明書に従った。
(2) ヒト大腸癌細胞株 Colo205由来 cDNAのライブラリーの作製
上記 （ 1) で取得したヒト大腸癌細胞株 Colo205由来の mRNA 8〃g、 お よび GIBCO BRL社製のキット (SUPERSCRIPT Choice System for cDNA Synthesis) を用い、 オリゴ dTをプライマーとして 2本鎖 cDN Aを合成した。
これら二本鎖 cDN Aの両末端に以下の方法で S f i Iリンカーを付与した。 CS f i Iリンカーの付与〕
配列番号 14で示された一本鎖 DN Aおよび配列番号 15で示された一本鎖 DN Aをアプライ ド ·バイオシステムズ社 380 A · DN A合成機を用いて合 成した。
該合成一本鎖 DN Aをそれぞれ 50〃gずつ、 別々に 50mmo l/l トリ ス一 HC1 (pH 7. 5) 、 10mmo l/l MgCl2、 5mmo 1/1 ジ チオスレィ トール （以下、 DTTと略記する） 、 0. lmmo 1/1 EDTA および lmmo l/1 A T Pを含む緩衝液 （以下、 T 4キナーゼ緩衝液と略記 する） 50 1に溶解し、 T4ポリヌクレオチドキナ一ゼ （宝酒造社製） 30 単位を加えて、 37 °Cで 1 6時間リン酸化反応を行ない、 1 1塩基および 8塩 基のリンカ一を取得した。
1 1塩基のリンカ一 4 g、 8塩基のリンカ一 2. 9〃gおよび上記で合 成した 2本鎖 c D N Aを T 4リガーゼ緩衝液 45 1に溶解後、 T 4 D N Aリ ガーゼ 1 050単位を加え、 1 6°Cで 1 6時間反応させ、 該ニ本鎖 DN A各々 に S f i I リンカ一を付与した。
得られた反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 1. 5kb以上の DN A断片を回収した。
直接発現クロ一ニングベクター （Expression Cloning Vector) である p AM o CJ.Biol.Chem., 268, 22782(1993)、 別名 pAMo PRC 3 S c (特開平 05-336963) 〕 24〃gを、 10mmo l/l トリス— HC 1 ( H 7. 5) 、 6mmo 1/1 M g C 12、 50 mm o 1/1 NaC l、 6 mm o 1/1 2— メルカプトエタノールからなる緩衝液 （以下、 Y— 50緩衝液と略記する） 5 90〃 1に溶解後、 80単位の S f i I (宝酒造社製、 以下、 特に断らないか ぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた） を加え、 37°Cで 16時間消化反 応を行なった。
該反応液に 40単位の B amH Iを加え、 37 °Cで 2時間消化反応を行なつ た。 該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 8. 8 kbのDNA断片を 回収した。
上記で調製した S f i Iリンカ一を付与した DN A (mRNA 8〃g由来 分） を T 4リガーゼ緩衝液 250〃 1に溶解後、 それぞれの溶解液に、 該約 8. 8 kbのDNA断片2 /gぉょびT4DNAリガーゼ2000単位を加えて、 16°Cで 1 6時間結合反応を行なった。
反応後、 それぞれの反応液にトランスファー RN A ( t RNA) 5 /gを添 加し、 エタノール沈殿後、 10mmo l/l トリス一 HC 1 (pH 8. 0) お よび 1 mm 01/1 EDTA (エチレンジァミン 4酢酸ナトリウム） からなる 緩衝液 （以下、 TE緩衝液と略記する） 20〃 1に溶解した。 該反応液を用い、エレクトロポ一レーシヨン法〔Nucleic Acids Res.， 16, 6127 (1988)〕 により大腸菌 LE 392株 〔モレキュラー · クロ一ニング第 2版〕 を 形質転換し、 約 100万個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、 cDNAライブラリ一を構築した。
更に、 該 cDNAライブラリ一 （大腸菌） および、 キイアジェン （Qiagen) 社製のプラスミ ド調製キットである/ plasmid/maxi kit (商品番号 41031) を 用い、 cDNAを含有するプラスミ ドを調製した。
(3) degenerateプライマーを用いた新規/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素 cDNA断片の取得
既知の 4種の/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素 （ ?3Ga l— T l、 /33 G a l— T2、 ?3Ga l— Τ 3、 /53 Ga l-T4) のアミノ酸配列を比較す ることにより、 4種の^ 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素でアミノ酸配列がよく 保存されている領域を 3ケ所以上見出した。 該 3領域を N末端側から順にモチ —フ 1、 モチーフ 2、 モチーフ 3と呼ぶ。 上記 4種の/? 1， 3—ガラクト一ス 転移酵素における各モチーフのアミノ酸配列と各モチーフの最初のアミノ酸の
N末端からの番号を第 2表に示す。 第 2表 ?3Gal-Tファミリーにおいて保存されたアミノ酸配列モチーフ モチーフ 1 モチーフ 2 モチーフ 3 β3θ3ΐ-Τ1 A" IRETWG Y172VMKTDSD E264DVYVGLC 3Gal-T2 A169IRQTWG Y247VMKTDSD E340DVYVGIC β3ΰα1-Τ3 A96 IRVTWG Y175VMKTDTD E266DVYVGIC 3Gal-T4 A89 IRASWG Y170VLKTDDD E290DFYVGVS 公知の方法 Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, "PCR Primer: A Laboratry Manual", Cold Spring Harbor Lab. (1995)、 井上純一郎 ·仙波憲太 郎編， ザ 'プロ卜コールシリーズ 「cDNAクローニング」 , 羊土社， （1996 年） 、 Science, 241, 42 (1988)〕 に従って、 各モチーフのアミノ酸配列に対応 する塩基配列を有する degenerateプライマ一を設計した。 フォワードプライマ —としてモチーフ 1とモチーフ 2に対応する 2種の合成 DN A (それぞれの配 列を配列番号 16と配列番号 17に示す） を合成した。 また、 リバ一スプライ マ一として、 モチーフ 2とモチーフ 3に対応する 2種の合成 DN A (それぞれ の配列を配列番号 18と配列番号 19に示す） を合成した。
配列番号 16記載の DNAと配列番号 18記載の DNAをプライマ一、 上記 (2) で調製した cDNAライブラリー （プラスミ ド） を錄型として PCRを 行い、 増幅断片の末端を DNAポリメラーゼ クレノー断片を用いて平滑末端 に変換した後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） の E c oRVサイ トにサ ブクローニングした。 また、 配列番号 17記載の DN Aと配列番号 19記載の DNAをプライマ一、 上記 （2) で調製した cDNAライブラリー （プラスミ ド） を錶型として P CRを行い、 増幅断片の末端を DN Aポリメラーゼ クレ ノー断片を用いて平滑末端に変換した後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） の E c oRVサイ 卜にサブクローニングした。
上記 （2) で調製した cDN Aライブラリー （プラスミ ド 100 ng) を 含む 50〃 1の反応溶液 〔 1 Ommo 1/1 T r i s -HC 1 (pH 8. 3) 、 5 Ommo 1/1 KC 1、 1. 5 mm o 1/1 MgC l2、 0. 2mmo 1/ 1 dNTP、 0. 001% (w/v) ゼラチン、 0. 2〃mo 1/1 プライ マ一〕 に、 1 Uの DNAポリメラーゼ AmpliTaq Gold™ (Parkin Elmer社） を添 加し、 PCRを行った。
PCRは、 95°Cで 1 1分間の加熱後、 95 °Cで 30秒間、 35°。で 1分間、 72 °Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして、 45サイクルの条件で行つ た。
サブクロ一二ングした p C R増幅断片の塩基配列は、 EPICENTRE TECHNOLOGIES 社のキッ 卜 (SequiTherm EXCEL II Long-Read DNA Sequencing kit-ALF： Catalog No. SE8301A) と ALF DNAシ一クェンサ一 （アマ一シャム フアルマシア バイオテック社製） を用いて決定した。
その結果、 配列番号 16記載の DN Aと配列番号 18記載の DN Aをプライ マーとして用いた P CRにより、 既知の/? 1, 3—ガラクトース転移酵素のァ ミノ酸配列とホモロジ一を有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコード する DNA断片を 1種取得した。
該 D N A断片のプライマー部分を除く配列は、 配列番号 2記載の D N Aの 6 43番目から 851番目の塩基配列と一致していた。
また、 配列番号 17記載の DN Aと配列番号 19記載の DN Aをプライマー として用いた P により、 既知の/? 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素のァミノ 酸配列とホモロジ一を有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードする DNA断片を 1種取得した。
該 DNA断片のプライマー部分を除く配列は、 配列番号 2記載の D N Aの 8 76番目から 1 124番目の塩基配列と一致していた。
(4) 新規/? 1， 3—ガラクトース転移酵素 cDNAの取得
上記 （3) で取得した 2種の PC R増幅断片を混合後、 マルチプライム DN A標識システム （アマシャム社） を用いて32 Pで標識し、 プローブを作製した。 該プローブを用いて、 上記 （2) で作製した cDNAライブラリーの内の 5 X 105クローンについてコロニ一ハイブリダイゼ一ションを行った。
該ハイブリダィゼ一シヨンにおいて、 フィル夕一を、 2倍濃度の SSPE〔1 倍濃度の S SPEの組成は、 18 Ommo 1/1 塩化ナトリウム、 l Ommo 1/1 リン酸二水素ナトリウム、 lmmo l/1 エチレンジアミンテトラ酢 酸 （EDTA) よりなる （pH7. 4) 〕 、 0. 1 % S D Sよりなる緩衝液中 で 65°C、 10分間振とうする条件で 2回、 1倍濃度の S SPE、 0. 1%S DSからなる緩衝液中で 65 C、 15分間振とうする条件で 1回、 0. 2xS SPE, 0. 1%SDSからなる緩衝液中で 65°C、 10分間振とうする条件 で 2回洗浄した。 該コロニーハイブリダイゼ一ションの結果、 ハイブリダイズする 2個の独立 したプラスミ ドが得られた。
(5) プラスミ ド pAMo— 3GT 5中に挿入されている cDNAの塩基配列 の決定
上記 （4) で得られたプラスミ ドの 1つである pAMo— 3GT5が含む c DN Aの全塩基配列を、 以下の方法で決定した。
p AM oベクタ一中の配列に特異的なプライマ一を用いて、 該 cDNAの 5， 側および 3' 側の配列を決定した。
決定された配列に特異的な合成 DN Aを調製し、 それをプライマ一として用 い、 さらに先の塩基配列を決定した。
該操作を繰り返すことにより、 該 cDN Aの全塩基配列を決定した。
塩基配列の決定には、 L I— COR社の DNAシークェンサ一（dNAsequencer model 4000い と反応キット （Sequitherm EXCEL 11™ Long-Read™ DNA-sequencing kit- Lc:エア 'ブラウン） 、 またはパーキンエルマ一社の DNAシークェンサ一 377と反応キヅト （ABI Prism™ BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit:Applied Biosystems社) を使用した。
pAMo- 3 GT 5が含む c D N Aの全塩基配列 （ 2775 b p ) を配列番 号 2に示した。
該 cDNAは、 糖転移酵素に特徴的な構造を有する 310アミノ酸からなる ポリべプチドをコ一ドしていた。
該ポリべプチドはこれまでにクローン化された 4種のヒト ? 1 , 3—ガラク トース転移酵素 （ ?3Gal— T l、 ?3Gal— T2、 ?3Gal_T3、 ?3Gal-T4) とアミノ酸レベルで 28%〜37%の相同性を示したこと から、 新規な 51,3-ガラクトース転移酵素であると考えられた。 該アミノ酸 配列のホモロジ一解析は、 配列解析ソフト GENETYX- MAC 10.1 (ソフトウェア開 発株式会社） を用いて行った。 一致したアミノ酸残基数を/? 3Gal— T5の アミノ酸残基数で割ることにより、 ホモロジ一（％) を算出した。 該ポリぺプチドのァミノ酸配列を配列番号 1に示した。
該ポリペプチドは、 N末端の 7アミノ酸からなる細胞質領域、 それに続く 1 9アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、 少なくとも 4アミノ酸からなる 幹領域、 および触媒領域を含む残りの大半の C末端部分からなると考えられた。 他の/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、 な らびに他の/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見 〔特閧平 6- 181759〕 を基に、 幹領域は少なくとも 4アミノ酸からなると予想さ れた。 したがって、 3 1番目から 3 10番目のアミノ酸配列を含むポリべプチ ドは、 触媒領域を含むと考えられる。
以下、 該 cDNAをヒト 3 Ga 1—T 5 c D N A、 該 c D N Aがコードす るポリべプチドをヒト ? 3 Ga l— T 5と呼ぶ。
pAMo— 3GT 5を H i ndlllと No t Iで切断することによりヒト ？ 3 Ga l— T 5 cDNAを切り出し、 pBluescript II SK( + )の H i ndlllと N o t Iサイ ト間に組み込むことにより、 pBS— 3GT 5を造成した （第 2図） 。 pBS— 3GT 5を含む大腸菌であ ¾ Escherichia coli MM294/pBS- 3GT5は、 平成 11年 2月 10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番 3号 郵便番号 305— 8566) に FERM BP— 66 45として寄託されている。
(6) ヒト ?3Ga l— T 5発現プラスミ ドを導入したヒト培養細胞における タイプ 1糖鎖の合成
コントロ一ルプラスミ ド （pAMo) およびヒト 33Ga 1— T 5発現ブラ スミ ド （pAMo— 3GT 5) をそれぞれ、 1 1になるように TE緩 衝液に溶解した後、エレクトロポレーシヨン法〔Cytotechnology， 3, 133 (1990)〕 により Namalwa細胞に導入し、 形質転換細胞を得た。
1. 6 X 106細胞あたり 4〃gのプラスミ ドを導入した後、 10%のゥシ胎 児血清を含む RPMI1640培地 〔7. 5 % N a H C 03を 1 /40量、 200mmo 1/1 L—グルタミン溶液 （GIBC0社製）を 3%、 ペニシリン ·ス トレブ卜マ イシン溶液 （GIBCO社製、 5000units/ml ペニシリン、 5000〃g/m 1ス トレプトマイシン）を 0. 5%添加した RPMI1640培地 （日水製薬社製） 〕 8 mlに懸濁し、 （：02ィンキュベー夕一で 37°Cで 24時間培養した。
培養後、 G418(ギブコ社製） を 0. 8mg/mlになるように添加し、 更 に 14日間培養し安定形質転換株を取得した。 該形質転換株は、 0. 8mg/m 1の G418を含む RPMI1640で継代した。
該形質転換細胞について、 抗シァリルルイス c糖鎖抗体 (DU-PA -2： Kyowa Medex社製） を用いて間接蛍光抗体染色を行なった。
間接蛍光抗体染色は、 実施例 1の （ 1) に記載した方法に従って行った。 そ の結果、 pAMo— 3GT 5を導入した細胞においては、 p AM 0を導入した 細胞に比較して、 抗シァリルルイス c糖鎖抗体 （DU- PAN- 2) への反応性が大幅 に増加していた （第 3図の A) 。
また、 コントロールプラスミ ド （p AMo) およびヒト 53Ga l— T 5発 現プラスミ ド （pAMo— 3GT 5) を上記と同様の方法により、 タイプ 1糖 鎖を発現していない大腸癌細胞株である HCT- 15に導入し、 安定形質転換細胞を 得た。 次いで、 限界希釈法を用いて該形質転換細胞からシングルクローン (HCT-3GT5Lおよび HCT- 3GT5H) を取得した。 HCT-3GT5Lにおける^ 3 G a 1 -T 5転写物の量は、 HCT- 3GT5Hにおける/? 3 Ga 1— T 5転写物の量に比較して少 ない （実施例 4および第 3表参照） 。 該シングルクローンは、 0. 8mg/ml の G418を含む RPMI1640で継代した。
取得したシングルクローン （HCT- 3GT5H) について、 抗シァリルルイス a糖鎖 抗体 (19-9) 、 抗シァリルルイス c糖鎖抗体 （DU- PAN- 2： Kyowa Medex社製） 、 抗ルイス a糖鎖抗体 （7LE) 、 または抗ルイス b糖鎖抗体 （ネオ国際社製） を用 いて間接蛍光抗体染色を行なった。
間接蛍光抗体染色は、 実施例 1の （ 1) に記載した方法に従って行った。 そ の結果、 p AMo— 3 GT 5を導入した細胞においては、 p AMoを導入した 細胞に比較して、 4種の抗体全てへの反応性が大幅に増加していることが明ら かになつた （第 3図の B) 。
以上の結果から、 53Ga l— T 5は形質転換細胞中で、 タイプ 1糖鎖 （シ ァリルルイス a糖鎖、 シァリルルイス c糖鎖、 ルイス a糖鎖およびルイス b糖 鎖） を合成可能であることが示された。
またこの結果は、 ?3Ga 1— T 5を細胞で発現させることにより、 タイプ 1糖鎖 （シァリルルイス a糖鎖、 シァリルルイス c糖鎖、 ルイス a糖鎖および ルイス b糖鎖等） を含有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質を新たに合 成できることを意味している。
以上のことより、 ?3Ga l— T 5を発現させた細胞を宿主として、 有用な 糖タンパク質を分泌生産することにより、 分泌生産される糖タンパク質にタイ プ 1糖鎖 （シァリルルイス a糖鎖、 シァリルルイス c糖鎖、 ルイス a糖鎖およ びルイス b糖鎖等） を付与することが可能である。
(7) 各種ヒト細胞株におけるヒト ? 3 Ga 1—T 5遺伝子の転写物の定量 実施例 1の （ 2 ) の方法に従って、 ヒト 53Ga l— T 5遺伝子の転写物の 定量を行った。
錶型として用いる各種細胞株由来一本鎖 cDNAは、 実施例 1 ( 1) で調製 したものを使用した。
検量線の作成に用いるスタンダードとしては、 上記 （5) で造成したヒト 3 Ga 1— T 5 cDNAを pBluescript II SK( + )に組み込んだプラスミ ド (PBS-3GT5) を、 cDNA部分を切り出す適当な制限酵素で切断し、 直鎖状 D N Aに変換したものを用いた。
内部コントロールとしては、 下記のようにして調製したプラスミ ド （pBS - 3GT5d) を、 cDNAを切り出す適当な制限酵素で切断し、 直鎖状 DNAに変換 したものを用いた。
pBS- 3GT5において、 ヒト ?3Ga l— T 5 cDNA中の E c o 81 I -Xc I間 144 bpを欠失させることにより pBS-3GT5dを作成した。
RT— P CRによる転写量の定量は、 ? 3 Ga 1— T 5特異的プライマ一を 用いて、 実施例 1の （2) と同様にして行った。 ? 3 Ga 1— T 5特異的ブラ イマ一の塩基配列を第 1表ならびに配列番号 2 0、 2 1に示した。
33 Ga 1 -T 5特異的プライマ一により、 β 3 G a 1— Τ 5遺伝子転写産 物およびスタンダードからは、第 1表の夕一ゲヅ卜のところに示したサイズ（5 54 bp) の DNA断片を増幅させることができる。 一方、 上記プライマーに より、 内部コントロールからは、 第 1表のコンペティ夕一のところに示したサ ィズ （4 1 0 bp) の DNA断片を増幅させることができる。
P C Rは、 9 5 で 1 1分間の加熱後、 9 5 で 1分間、 6 5 °Cで 1分間、 72 °Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして、 42サイクル繰り返す条件 で行った。
各種細胞株における/? 3 Ga 1— T 5遺伝子転写産物の量を、 ?-ァクチンの 転写産物の量を 1 0 00とした時の相対値として表示した （第 4図の A) 。
? 3 Ga l -T 5転写産物は、 タイプ 1糖鎖を多く発現している大腸癌細胞 株 （Colo205、 Colo201、 SW1116) および脬臓癌細胞株 (Capan-2) で発現してい ることが判明した。 また、 ? 3 Ga l— T 5転写産物の発現は、 タイプ 1糖鎖 の発現 （第 1図参照） とよく相関していた。
以上の結果と上記 （5) および （6) の結果を総合すると、 ? 3 Ga 1— T 5は、 大腸癌細胞または滕臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、 シァリルル ィス a糖鎖ゃシァリルルイス c糖鎖等のタイプ 1糖鎖の合成に関与する、 新規 β 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素であると結論される。
( 8) 各種ヒト細胞株における CA19-9抗原含有タンパク質の発現
抗シァリルルイス a抗体 （19-9) を用いたウエスタン 'ブロヅティング解析 を行うことにより、 大腸癌細胞株 （Colo205、 Colo201、 SW1116、 LS180、 HT29、 WiDr、 HCT-15、 SW480, SW620) 、 膝臓癌細胞株 （Capan- 1、 Capan-2) 、 胃癌細 胞株 (KATOIIK MKN45, MKN74) におけるシァリルルイス a糖鎖含有タンパク質 の発現について検討した。
19-9は大腸癌ゃ滕臓癌における癌関連糖鎖の検出に利用されており、 19-9で 検出されるシァリルルイス a糖鎖抗原は、 CA19-9抗原と呼ばれている。
各細胞（ 1 X 1 07個）を、 溶液〔2 Ommo 1/1 HEPE S (pH 7. 2) , 2% T r i r o nX— 100〕 に懸濁後、 短時間超音波にかけて細胞溶解液を 調製した。
該細胞溶解液のタンパク質濃度を、 マイクロ BC Aタンパク質アツセィ試薬 キット （PIERCE社） により測定し、 10〃gのタンパク質を SD S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （SD S— PAGE) に供した。
電気泳動後、 Transblot SD cell (Bio- Rad社製） を用いて、 ゲル上のタンパ ク質を I扁 obi Ion PVDF膜 （Millipore社製） に移した。
該膜をブロッキング溶液 （5%のスキムミルクを含む PB S) で 4。Cで終夜 処理することによりブロッキングした。
プロッキング後、 該膜をプロヅキング溶液で希釈した 10 g/m 1の抗シ ァリルルイス a抗体 （19-9) を用いて、 室温で 2時間処理した。
処理後、 ECL Western blotting detection reagent (Amersham社製） を用い て該膜を処理することにより、 19-9が結合したタンパク質の検出を行った。 方 法はキッ卜の説明書に従った。
結果を第 4図の Bに示した。
CA19- 9含有糖タンパク質の発現は、 上記 （7) で測定した/? 3 Ga 1— T 5 転写産物の発現（図 4の A参照） とよく一致していた。一方、 他の GlcNAc ?1,3 —ガラクト一ス転移酵素 （ ?3 Ga l— Tl、 ? 3Ga l— T 2、 3 G a 1 - T 3 )の転写物の発現は、 CA19- 9含有糖タンパク質の発現と相関していなかった。 また、 他の GlcNAc ?1，3—ガラクト一ス転移酵素 3 Ga 1— Tl、 ? 3 G a 1— T 2、 ?3Ga l— T 3 )は、 CA19-9含有糖タンパク質を高発現している Colo205や Colo201で発現していなかった （第 1図参照） 。
以上の結果は、 ?3Ga l— T 5は大腸癌や脬臓癌等における癌関連抗原 CA19- 9の合成に関与する/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素であることを示して いる。 更に、 ? 3 Ga l— T 5が糖タンパク質も基質として使用できることを 示している。
実施例 3 ヒト 53Ga l— T 5の vitro活性
実施例 2で取得したヒト ? 3Ga l— T 5 cDNAがコ一ドするヒト ? 3 G a 1— T 5の vitr_2での活性を以下のようにして調べた。
他の既知の/? 1, 3—ガラクトース転移酵素と活性を比較するため、 ヒト ? 3Ga l— T l、 ヒ 卜/? 3Ga l— Τ 2、 ヒ ト 53Ga l— Τ3、 ヒ ト ？ 3 G a 1— Τ4の各 cDNAを pAMoに組み込んだ発現プラスミ ド （pAMo- 3GT1、 pAMo- 3GT2、 pAMo- 3GT3、 pAMo- 3GT4) を造成した。
pAMo- 3GT1は、 特開平 6- 181759記載のプラスミ ド pUC119-WMl (FERM BP - 01 1) を構築するために用いたプラスミ ド pAMoPRWMlと同じものである。 コントロールプラスミ ド （pAMo) または 5種の ? 1， 3—ガラクト一ス 転移酵素発現プラスミ ド （pAMo- 3GT1、 pAMo-3GT2, pAMo-3GT3, pAMo- 3GT4、 ま たは pAMo- 3GT5) を、 実施例 3に記載の方法と同様の方法により Namalwa細胞に 導入し、 各形質転換細胞を得た。
実施例 1の （2) と同様にして、 該形質転換細胞から全 RNAを抽出し、 定 量的 RT— P CRを用いて、 5種の 3—ガラクトース転移酵素遺伝子の 転写量を測定した。
結果を第 3表に示す。
第 3表 ァガラク卜 LNnTを基質とした時の^ 1 ， 3-ガラクト一ス転移酵素活性
と
各細胞における; 53Gal -T転写物の発現量 53Gal-T転写物の発現量
細胞 %活性
( ?3Gal-T/ ?-actin x103)
Figure imgf000074_0001
?3Gal- ?3Gal- ?3Gal-
T4
Namalwa-mock <1 く 0.01 <ヽη 01 ？ 1 ヽ 1.4
Namalwa-3GT1 <1 く 0.01 ヽ nリ m 1.4
Namalwa- 3GT2 <1 く 0.01 <0.01 38 く 0.01 1.4
Namalwa - 3GT3 <1 く 0.01 <0.01 2.1 42 1.4
Nama1wa-3GT4 <1 く 0.01 <0.01 2.1 く 0.01 43
Namalwa- 3GT5 100 35 <0.01 2.1 <0.01 1.4
HCT-3GT5L 18 5 <0.01 く 0.01 2.2 0.1
HCT-3GT5H 48 16 <0.01 く 0.01 2.2 0.1
Colo205 40 3.5 く 0.01 <0.01 0.05 4.6
S 1116 22 1.4 <0.01 0.3 0.6 3.2
HCT-15 <1 く 0.01 く 0.01 <0.01 2.2 0.1
Capan-2 23 1.2 く 0.01 く 0.01 1.9 2.3
MKN45 <1 <0.01 0.04 0.5 66 く 0.01
PC-1 <1 <0.01 27 0.3 く 0.01 0.2 発現プラスミ ドを導入した細胞では、 対応する ? 1， 3_ガラクトース転移 酵素遺伝子の転写量が、 ベクタ一のみを導入した細胞に比較して増加している ことが確認された。
一方、 該形質転換細胞を溶液 〔2 Ommo 1/1 HEPE S (pH7. 2) 2% TrironX-100] に懸濁後、 短時間超音波にかけて細胞溶解液を調製した。 該細胞溶解液のタンパク質濃度は、 マイクロ B C Aタンパク質アツセィ試薬 キット （PIERCE社） により測定した。
該細胞溶解液を用いて、 3—ガラクトース転移酵素活性を測定した。 ピリジルァミノ化した糖鎖基質の調製や活性測定は、 既知の方法 〔特開平 6 — 181759、 特開平 06— 82302 1、 J. Biol. Chem. , 269, 14730- 14737(1994)〕 に準
具体的には、 活性測定は、 10〃 1のアツセィ溶液 〔 14 mm 01 / 1 HE PES ( H 7. 4) 、 75 zmo 1/1 UDP-Ga 1 (SIGMA社） 、 11 Himo 1/1 MnCl2、 、 0. 01 % TrironX- 100、 25 zmo 1/1 ピリ ジルァミノ化糖鎖基質、 上記細胞溶解液〕 中で 37°C、 2時間反応後、 高速液 体クロマトグラフィー （HPLC) により生産物を同定することにより行った。 基質としては、 ァミノピリジンで蛍光標識したラクト一 N—ネオテトラオ一 ス (Lacto-N-neotetraose, Gal Π- 4GlcNAc H- 3Gal^卜 4Glc；以下、 LN nT と略記する） を 5-ガラクトシダーゼ処理して末端のガラクトース残基を除去し たもの （ァガラクト LNnT, GlcNAc ?l-3Gal ?l-4Glc) を使用した。
ァガラクト L N n Tは、 約 60 nm o 1のアミノビリジンで蛍光標識した L NnTに対し、 100ミリュニッ卜の/?-ガラクトシダ―ゼ （生化学工業社製） を加え、 37 で 16時間反応後、 100 °Cで 5分間の熱処理により 5—ガラ クトシダーゼを失活させることにより調製した。
スタンダ一ドとしては、 ァミノピリジンで蛍光標識した L N n Tまたはアミ ノビリジンで蛍光標識したラクト一N—テトラオース （Lacto- N-tetraose， Gal Π- 3GlcNAc?卜 3Gal ?卜 4Glc；以下、 L NTと略記する） を用いた。 LNnT および LNTはオックスフォ一ド ·グライコシステムズ社から購入した。 オリ ゴ糖の蛍光標識は、 常法 〔Agric. Biol. Chem. , 54, 2169 (1990)〕 に従って行 つた。
UDP-Ga 1 (糖供与体） を含むアツセィ溶液と含まないアツセィ溶液を 用いて反応を行った後、 HP LCで解析し、 UDP— Ga 1を含むアツセィ溶 液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアツセィ溶液は、 100°Cで 3分間処理後、 10， 000 X gで 5分間遠心して上清を取得し、 その一部を HP LCに供した。 HPLCは、 TSK-ge 1 〇DS— 80Tsカラム （4. 6 x 300 mm；東ソ一社製） を使用し、 溶出液として 0. 02mo l/l 酢酸アンモニゥム緩衝液 （ρΗ4· 0) を用い、 溶出温度 25°C、 流速 lml/分の条件で行った。
生成物の検出は、 蛍光スペク トルフォトメータ一 FP— 920 (日本分光社 製） を用いて行った （励起波長 320 nm、 放射波長 400 nm)。
生成物の同定は、 スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致することを指標とし た。
生成物の定量は、 アミノビリジル化したラクトースをスタンダ一ドとして用 い、 蛍光強度を比較することにより行った。
ヒト ? 3 Ga 1— T 5の活性を 100とした時の、 各/? 1， 3—ガラクト一 ス転移酵素の相対活性を第 3表に示す。
ヒト ? 3 Ga l— T 5を発現させた細胞では明らかな/? 1, 3—ガラクトー ス転移酵素活性 （LNT合成活性） が検出されたが、 他の/? 1, 3_ガラク 卜 —ス転移酵素を発現させた細胞では活性は検出されなかった。 なお、 コント口 ールプラスミ ド （pAMo) を導入じた細胞でも活性は検出されなかった。 各 ? 1， 3—ガラクトース転移酵素発現プラスミ ドを導入した細胞において、 各 3—ガラクトース転移酵素転写物は同程度発現していることから （第 3表）、 ヒト ？ 3 Ga 1— T 5の GlcNAc 51,3—ガラクト一ス転移酵素活性（L NT合成活性） は他の GlcNAc Π， 3—ガラクト一ス転移酵素 （ヒト 3 Ga l — T l、 ヒト ?3Ga l— Τ 2、 ヒト 53 G a 1— Τ 3 ) に比較して強いこと が判明した。 なお、 ヒト 53 Ga 1—Τ 4に関しては、 GkNAc 51，3—ガラク トース転移酵素活性はなく、 GalNAc 51，3_ガラクトース転移酵素活性を有す ることが知られている。
以上の結果、 ヒト 33 Ga 1— T 5は GlcNAc ?1， 3—ガラクト一ス転移酵素 であることが証明された。 また、 ヒト ？ 3 G a 1— T 5の活性は他の GlcNAc β 1，3—ガラクトース転移酵素 （ヒト 3 Ga 1—Τ 1、 ヒト ?3Ga l— T 2、 ヒト ? 3Ga l— Τ3) に比較して強いことから、 LNT等のタイプ 1糖鎖の 合成に有用であることが示された。
また、 3 Ga l—Τ 5転写産物の発現量と GlcNAc 51，3—ガラクト一ス転 移酵素活性 （LNT合成活性） が相関するかを検討するために、 実施例 2で取 得した 53 Ga 1— T 5発現プラスミ ドを導入した HCT-15細胞 （HCT- 3GT5Lおよ び HCT- 3GT5H) 、 ならびに実施例 1で使用した大腸癌細胞株 （Colo205、 SW1116、 HCT-15) 、 脬臓癌細胞株 (Capan-2) 、 胃癌細胞株 (MKN45) および肺癌細胞株 (PC- 1) について、 ? 3 Ga 1— T 5転写産物の発現量と GlcNAc ?1，3—ガラ ク卜一ス転移酵素活性 （LNT合成活性） を測定した。
各細胞における/? 3 Ga 1— T 5転写産物の発現量は、 実施例 1または実施 例 2の （7) で記載した方法を用いて行った。 GlcNAc ?1，3—ガラクト一ス転 移酵素活性 （LNT合成活性） の測定は、 上記の方法に従った。
結果を第 3表に示す。
その結果、 3 Ga 1— T 5転写産物の発現量と GlcNAc ?1,3—ガラクトー ス転移酵素活性 （LNT合成活性） が相関することが判明した。 例えば、 HCT - 3GT5Hにおける ? 3 Ga l— T 5転写物量は、 HCT-3GT5Lの約 3倍であつたが、 HCT-3GT5Hにおける GlcNAc ?1，3—ガラクト一ス転移酵素活性 （LNT合成活 性） も HCT- 3GT5Lの約 3倍であつた。
一方、 PC- 1では/? 3 Ga 1— T 1を多く発現していたが、 GlcNAc ?1，3—ガ ラクトース転移酵素活性 （LNT合成活性） は検出されなかった。 また、 MKN45 では 3 Ga 1— T 3を多く発現していたが、 GlcNAc ?1，3—ガラクト一ス転 移酵素活性 （LNT合成活性） は検出されなかった。
以上の結果は、 3 Ga 1— T 1および/? 3 Ga 1— T 3の GlcNAc /31,2>- ガラクト一ス転移酵素活性 （LNT合成活性） は、 53 Ga l— T 5に比較し て弱いことを示しており、 上記の Nama 1 wa細胞を用いた結果と一致した。 実施例 4 ? 3 Ga l -T 5遺伝子の各種臓器での発現
実施例 2の （7) と同様にして、 RT— P CRを用いてヒト各組織 （脳、 肺、 食道、 胃 （体） 、 胃 （洞） 、 空腸、 大腸、 肝臓、 脬臓、 脾臓、 腎臓、 副腎、 子 宮、 抹消リンパ球における/? 3 Ga l— T 5転写物の定量を行った。 各組織に おける/? 3 Ga 1— T 5遺伝子転写産物の量を、 ァクチンの転写産物の量を 1000とした時の相対値として表示した （第 5図） 。
3 Ga 1— T 5転写物は、 胃 （体）、 胃 （洞） 、 空腸、 大腸、 脬臓で有意 に発現していることが明らかになった。 また、 脳、 食道、 腎臓、 子宮でも少し 発現がみられた。 一方、 肺、 肝臓、 脾臓、 副腎、 抹消リンパ球では発現はみら れなかった。
実施例 5 53 Ga l-T 5染色体遺伝子の構造解析
現在、 多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録され ている。 したがって、 本発明のポリペプチドをコードするヒト cDNAの配列と、 デ—夕べ—スに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、 本発明のポリべプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、 その構造を明 らかにできる可能性がある。 c D N Aの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録 されていれば、 c D N Aの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、 本発明のポリべプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、 ェクソ ンおよびィントロン構造を決定することができる。
? 3 Ga l -T 5 c D N Aの塩基配列 （配列番号 2 ) と Genome Project Databaseに登録されている D N A配列を比較した結果、 登録番号 AF064860の配 列の一部に、 ? 3 Ga l— T 5の cDNAの配列が含まれていたことより、 β 3 Ga 1 -Τ 5染色体遺伝子はヒト染色体 21q22.3に位置することが分かった。 β 3 Ga 1—Τ 5染色体遺伝子のプロモーター領域を明らかにする目的で、 5， RACE法を用いて、 C o 10205細胞より/? 3 Ga 1— T 5 cDNA の 5， 末端領域の取得を行った。 5， RACE法はキット （GIBC0社製 5， RA CEシステム、 バ一ジョン 2.0) に従って行った。
Colo205細胞由来の mRNA ( 1 ig) を銪型、 配列番号 22および配列番号 23に示す配列を有する 2種の合成 DN Aをプライマーとして、 まず一本鎖 c DN Aを合成した。 合成後、 夕一ミナルデォキシヌクレオチジルトランスフエ ラーゼを用いて、 該 cDNAの 3' 末端にオリゴ d Cを付加した後、 キットに 添付されている dGティルを有する合成 DNAをフォヮ一ドプライマ一、 配列 WO 00/50608 PCT/JPOO/01070— 番号 24に示す配列を有する合成 DNAをリバ一スプライマーとして、 P CR を行った。
P C Rは、 97 で 1 1分間の加熱後、 94 で 1分間、 55 で 1分間、 72 °Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして、 42サイクル繰り返す条件 で行った。
増幅断片を H i nd I I Iと S p e Iで消化後、 pBluescript SK (-）の H i n d I I I - S p e I間にサブクローン化した。 このようにして得られた 5種の プラスミ ドについて塩基配列を決定した結果、 Colo205細胞における/? 3 Ga 1 一 T 5染色体遺伝子の転写開始点は上記の登録番号 AF064860の配列上 85153番 目の塩基であることが明らかになった。
したがって、 これより上流の領域は、 少なくとも Colo205細胞において機能し ているプロモーター領域であることが判明した。
?3Ga l-T 5染色体遺伝子のプロモーター領域 （転写制御領域を含む） は、 転写開始点の上流の 5 k b (配列番号 3で表される塩基配列の 1〜 500 0番） と推定される。
転写開始点の上流 1 k b (配列番号 3で表される塩基配列の 4001〜 50 00番） について、 転写因子の結合配列のコンセンサス配列の存在について、 TF SEARCH (transcripiton factor searcn プロクラム (Akiyama, Y.， htt ： //www .rwcp.or. jp/1 ab/pdap 1 /pap i . html) を用いて解析した 0
転写開始点の上流に T A T Aボックスは存在しなかったが、 転写開始点の上 流 150 bp中に、 2つの CdxAサイ ト、 1つの AP-1サイ ト、 1つの MZF- l(myeloid zinc finger 1 protein)サイ 卜が存在すると推定された。
該領域の下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミ ドを、 ?3Ga l— T 5を発現している細胞に導入し、 レポ一夕一遺伝子が発現するかどうかを検討 することにより、 プロモーター領域を実験的に特定することもできる。
?3Ga l-T 5染色体遺伝子のェクソン領域とィン卜ロン領域をさらに詳 しく解析するために、 P CR法を用いて /53 Ga 1— T 5 cDNAのアイソフ オームが存在するかどうかについて検討した。
実施例 1で調製した Colo205細胞由来の 1本鎖 cDNAを錶型、 配列番号 22 と配列番号 25に示す配列を有する 2種の合成 DN Aをプライマーとして、 P CRを行った。
P C Rは、 97 で 1 1分間の加熱後、 94。(：で 1分間、 55 で 1分間、 72 Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして、 42サイクル繰り返す条件 で行った。
増幅断片を H i nd I I Iで消化後、 pBluescript SK (-)の H i nd I I Iサ ィ 卜にサブクローン化した。 このようにして得られたプラスミ ドについて塩基 配列を決定した結果、 Colo205細胞において少なくとも 5種類の/? 3 G a 1— T 5 cDNAァイソフォームが存在することが明らかとなった （第 6図） 。
各アイソフォームに相当する P CR増幅断片の量を比較することにより、 各 ァイソフォームの発現量の比を求めたところ、 ァイソフォーム 1が 50%、 ァ イソフォーム 2が 50%、 ァイソフォーム 3、 4、 5はそれぞれ 1%以下であ つた。
各アイソフォームに相当する P CR増幅断片は、 増幅断片の大きさと制限酵素 処理 (Xb a I処理または B sml処理) により特定した。
以上の結果、 53 Ga 1— T 5染色体遺伝子は 4つのェクソンと 3つのィン トロンよりなることが明らかとなった。 β 3 Ga 1_Τ 5染色体遺伝子のプロ モー夕一領域 （転写制御領域を含む） と/? 3 Ga l— Τ 5染色体遺伝子の配列 を合わせて配列番号 3に示した。 β 3 Ga 1—Τ 5染色体遺伝子のプロモ一夕 一領域 （転写制御領域を含む） の配列は、 配列番号 3の l〜5000 bpであ る。 ?3Ga l— T 5染色体遺伝子の配列は、 配列番号 3の 5001〜 105 62 bpである。 ?3Ga l— T 5染色体遺伝子のェクソンとイン卜口ンの位 置を配列番号 3の番号を用いて第 4表に示した。 第 4表中において、 大文字で 示した塩基配列はェクソン部分、 小文字で示した塩基配列はィントロン部分を 示している。 β 3 G a 1 _ T 5染色体遺伝子の構造 （ェクソン領域とィン卜ロン領域の位 置と配列） と染色体上の位置、 ならびに/? 3 G a l— Τ 5染色体遺伝子のプロ モー夕一領域の位置と配列は、 本研究によって/? 3 G a 1— T 5 c D N Aの構 造と機能が明らかになることにより、 初めて特定できたものである。 第 4表 β 3Gal -T5染色体遺伝子のェクソン-イントロン結合部位 ェクソン 配列番号 3中の スブライスァクセプタ スプライスドナ一
長さ ( bp)
塩基配列番号 一サイ 卜の配列 サイ 卜の配列 cxon丄 5001-5273 273 CTGTCACGgtatttcc exonl' 5001-5140 140 CCAAGCAGgtttctgg exon 5459-5567 109 ctotctagAGAACCCT GTTTGGAGgtaggact exonj 7427-7586 160 tttcctagTGATTCCT AGCAAAAAgtgagtta exon4 8234-10562 2329 cctttcaqATGGCTTT 産業上の利用可能性
本発明により、 大腸癌細胞または膝臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、 タイプ 1糖鎖の合成に関与する/? 1， 3—ガラクト一ス転移酵素活性を有する 新規ポリペプチド、 該ポリペプチドの製造法、 該ポリペプチドをコードする D N A、 該 D N Aが組み込まれた組換え体ベクター、 該組換え体ベクターを保有 する形質転換体、 該ポリペプチドを認識する抗体、 該抗体を用いる本発明のポ リベプチドの定量法および免疫染色法、 該ポリべプチドを用いたタイプ 1糖鎖 含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、 該組換え体べクタ一を保 有する形質転換体を用いたタイプ 1糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合 糖質の製造法、 該ポリべプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質の スクリーニング法、 該ポリぺプチドの有する活性を変動させる物質のスクリ一 ニング法、 該 D N Aあるいは該抗体を用いた大腸癌、 滕臓癌、 胃癌等の疾患の 診断法、 該 D N A、 該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物 質あるいは該ポリべプチドの有する活性を変動させる物質を用いた大腸癌、 脬 臓癌、 胃癌等の疾患の治療法を提供することができる。 「配列表フリーテキスト」 配列番号 4一人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 5—人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 6—人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 Ί一人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 8—人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 9一人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 10—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 1一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 2—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 3—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 14一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 5—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 6—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 7—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 8—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 19一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 20一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 2 1一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 22一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 23一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 24一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 25一人工配列の説明 合成 DNA

Claims

請求の範囲
1. シァリルルイス a糖鎖を発現している大腸癌細胞に存在する、 シァリ ルルイス a糖鎖の合成に関与する/? 1, 3—ガラクトース転移酵素活性を有す るポリべプチド。
2. 以下の （a)、 (b) および （c) からなる群より選ばれるポリぺプ チド。
( a ) 配列番号 1記載のァミノ酸配列からなるポリべプチド
(b) 配列番号 1記載のアミノ酸配列の 31-310番目のアミノ酸配列を 含むポリべプチド
(c) (a) または （b) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1 以上のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ Gal Π- 3GlcNAc構造を合成可能な/? 1 , 3—ガラクトース転移酵素活性を有す るポリべプチド
3. 51 , 3—ガラクトース転移酵素活性が、 糖鎖の非還元末端に存在す る N—ァセチルグルコサミン残基に/? 1 , 3結合でガラクトースを転移する活 性である、 請求項 1または 2記載のポリぺプチド。
4. ? 1 , 3—ガラクト一ス転移酵素活性が、 GlcNAcn- 3Galn- 4Glcの 非還元末端に存在する N—ァセチルグルコサミン残基、 または N—ァセチルグ ルコサミン単糖に 3結合でガラクトースを転移する活性である、 請求項 1または 2記載のポリべプチド。
5. 以下の （a)、 （b) 、 （c) および （d) からなる群より選ばれる DNA。
(a) 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする DN
A
(b) 配列番号 2で表される塩基配列の 402〜1331番目の塩基配列を 有する DNA
(c) 配列番号 2で表される塩基配列の 492〜1331番目の塩基配列を 有する DNA
(d) (a) 〜 （c) いずれかに記載の DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする D N Aであり、 かつ Gal β卜 3GlcNAc構造を合成可能な β 1， 3—ガラクトース転移酵素活性を有するポリべプチドをコードする DNA
6. 請求項 5記載の D Ν Αをべク夕一に組み込んで得られる組換え体 D N
A。
7. 組換え体 DNAが、 プラスミ ド p AMo— 3 GT 5またはプラスミ ド pB S- 3 GT 5 (FERM BP— 6645) である、 請求項 6記載の組換 え体 DNA。
8. 請求項 5に記載の DNA、 請求項 6記載の組換え体 DNA、 または請 求項 7記載の組換え体 D N Aを保有する形質転換体。
9. 形質転換体が、 微生物、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 非ヒトトラ ンスジエニック動物およびトランスジェニック植物からなる群より選ばれる形 質転換体である、 請求項 8記載の形質転換体。
10. 微生物が、 Escherichia属に属する微生物である、 請求項 9記載の形 質転換体。
11. 動物細胞が、 マウス · ミエローマ細胞、 ラット ' ミエ口一マ細胞、 マウス 'ハイプリ ドーマ細胞、 CH0細胞、 BHK細胞、 アフリカミ ドリザル腎臓細 胞、 Namalwa細胞、 Namalwa KJM- 1細胞、 ヒ ト胎児腎臓細胞およびヒ ト白血病細 胞からなる群より選ばれる動物細胞である、 請求項 9記載の形質転換体。
12. 昆虫細胞が、 Spodopter frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia ni の卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群より選ばれる昆虫細胞である、 請求項 9記載の形質転換体。
13. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする D N Aをべク夕一に組み込んで得られる組換え体 D Aを保有する形質転換体を 培養液中で培養し、 該ポリペプチドを該培養物中に生成 ·蓄積させ、 該培養物 中より該ポリべプチドを採取することを特徴とする、 該ポリべプチドの製造法。
14. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする D N Aをベクターに組み込んで得られる組換え体 D N Aを保有する非ヒ卜 トラン スジエニック動物を飼育し、 該ポリペプチドを該動物中に生成 ·蓄積させ、 該 動物中より該ポリべプチドを採取することを特徴とする、 該ポリべプチドの製 造法。
15. 生成 ·蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、 請求項 1 4 記載の製造法。
16. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする D N Aをべクタ一に組み込んで得られる組換え体 D N Aを保有するトランスジェ ニック植物を栽培し、 該ポリペプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物中 より該ポリべプチドを採取することを特徴とする、 該ポリべプチドの製造法。
17. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする D N Aを用い、 2 vitroでの転写 ·翻訳系により該ポリべプチドを合成すること を特徴とする、 該ポリペプチドの製造法。
18. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドを酵素源として 用い、
( a ) 該酵素源、
( b ) i ) N—ァセチルグルコサミン （GlcNAc) 、
i i ) N—ァセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するォリゴ糖および iii ) N—ァセチルグルコサミン残基を非還元末端に有する複合糖質から選ば れる受容基質、 および
( c ) ゥリジン一 5， 一二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、 該 水性媒体中に、 該受容基質の N—ァセチルダルコサミンまたは N—ァセチルグ ルコサミン残基に/? 1 , 3結合でガラクト一スが付与された反応産物を生成 · 蓄積させ、 該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、 該反応 産物の製造法。
19. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリぺプチドを酵素源として 用い、
( a ) 該酵素源、
( b ) i )グルコース、
ii )グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
iii )グルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質からなる群より選 ばれる受容基質、 および
( c ) ゥリジン一 5， 一二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、 該 水性媒体中に、 該受容基質のグルコースまたはグルコース残基に/? 1 , 3結合 でガラクトースが付与された反応産物を生成 ·蓄積させ、 該水性媒体中より該 反応産物を採取することを特徴とする、 該反応産物の製造法。
20. 請求項 9記載の微生物、 動物細胞、 植物細胞および昆虫細胞由来の 形質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、 該培養物 中に、 ガラクト一スが/? 1 , 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチ ルグルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有す る糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該培養物中より該 糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合糖質 の製造法。
21. 請求項 9記載の非ヒ卜 トランスジエニック動物を飼育し、 該動物中 に、 ガラクトースが/? 1， 3結合で N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチル グルコサミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する 糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該動物中より該糖鎖 または該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合糖質の製 造法。
22. 請求項 9記載のトランスジ: ニック植物を栽培し、 該植物中に、 ガ ラクト一スが 3結合で N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコ サミン残基、 グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖ま たは該糖鎖を含有する複合糖質を生成 ·蓄積させ、 該植物中より該糖鎖または 該複合糖質を採取することを特徴とする、 該糖鎖または該複合糖質の製造法。
23. 複合糖質が、 糖タンパク質、 糖脂質、 プロテオグリカン、 グリコべ プチド、 リポ多糖、 ぺプチドグリカン、 およびステロイ ド化合物に糖鎖が結合 した配糖体からなる群より選ばれる複合糖質である、 請求項 1 8〜2 2のいず れかに記載の製造法。
24. 生成 ·蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、 請求項 2 1 記載の製造法。
25. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする D N Aまたは該 D N Aの断片を用い、 ハイブリダィゼーシヨン法により、 該ポリ ぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量を定量する方法。
26. 請求項 5に記載の D N Aまたは配列番号 2または 3で表される塩基 配列を有する D N Aの有する塩基配列中の連続した 5〜 6 0塩基と同じ配列を 有するオリゴヌクレオチド、 該ォリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するォ リゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴヌクレオチドのォリゴヌクレオチド誘 導体からなる群より選ばれる D N A。
27. オリゴヌクレオチド誘導体が、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジェ ステル結合がホスフォロチォェ一ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導 体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3 ' - P 5 ' ホスフォ ァミデート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド 中のリボースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたォリゴ ヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロビニルゥ ラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラ シルが C— 5チアゾ一ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピニルシトシンで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修 飾シ卜シン (phenoxazine - modified cytosine)で置換されたォ1リコヌクレオチ ド誘導体、 D N A中のリボースが 2 ' —0—プロピルリボースで置換された誘 導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2， 一メ ト キシェトキシリボースで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体からなる群より 選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、 請求項 2 6記載の D N A。
28. 配列番号 2 0または 2 1で表される塩基配列を有する D N A。
29. 請求項 2 6〜2 8のいずれか 1項に記載のオリゴヌクレオチドを用 い、 ポリメラーゼ ·チェイン · リアクション法により、 請求項 1〜4のいずれ かに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
30. 請求項 2 5または 2 9記載の方法を用いた癌または癌転移の検出法。
31. 請求項 5、 2 6〜2 8記載の D N Aおよび配列番号 2または 3で表 される塩基配列を有する D N Aから得らばれる D N Aを用い、 請求項 1〜4の いずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする D N Aの転写または mR N A の翻訳を抑制する方法。
32. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
33. 請求項 3 2記載の抗体を用いる、 請求項 1〜4のいずれかに記載の ポリべプチドの免疫学的検出法。
34. 請求項 3 2記載の抗体を用い、 請求項 1〜4のいずれかに記載のポ リペプチドを検出することを特徴とする免疫組織染色法。
35. 請求項 3 2記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
36. 請求項 3 2記載の抗体を含有する、 癌または癌転移の診断薬。
37. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリぺプチドと被験試料とを 接触させることを特徴とする、 該ポリべプチドの有する活性を変動させる化合 物のスクリ一ニング法。
38. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドを発現する細胞 と被験試料とを接触させ、 抗シァリルルイス a抗体、 抗ルイス a抗体、 抗ルイス b抗体または抗シァリルルイス c抗体を用い、 シァリルルイス a糖鎖、 ルイス a 糖鎖、 ルイス b糖鎖またはシァリルルイス c糖鎖含量を測定することを特徴と する、 該ポリべプチドをコ一ドする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリ —ニング法。
39. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドを発現する細胞 と被験試料とを接触させ、 請求項 3 2記載の抗体を用い、 該ポリペプチド含量 を測定することを特徴とする、 該ポリベプチドをコードする遺伝子の発現を変 動させる化合物のスクリーニング法。
40. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコ一ドする遺 伝子の転写を司るプロモーター D N A。
41. プロモー夕一 D N Aが、 小腸細胞、 大腸細胞、 脬臓細胞、 胃細胞、 大腸癌細胞、 滕癌細胞および胃癌細胞からなる群より選ばれる細胞で機能して いるプロモ一夕一である、 請求項 4 0記載のプロモ一夕一 D N A。
42. プロモーター D N Aが、 ヒトまたはマウス由来のプロモ一夕一 D N Aである、 請求項 4 0または 4 1記載のプロモー夕一 D N A。
43. プロモーター D N Aが、 配列番号 3で表される塩基配列の 1〜5 0 0 0番目の塩基配列中の連続する 5 0〜5 0 0 0 b pの D N A配列を有する、 請求項 4 0〜4 2のいずれか 1項に記載のプロモーター D N A。
44. 請求項 4 0〜4 3のいずれか 1項に記載のプロモーター D N Aおよ び該プロモーター D N Aの下流に連結させたレポ一夕一遺伝子を含有するブラ スミ ドを用いて動物細胞を形質転換し、 該形質転換体と被験試料とを接触させ、 該レポ一夕—遺伝子の翻訳産物の含量を測定することを特徴とする、 該プロモ
—夕による転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
45. レポ一夕一遺伝子が、 クロラムフエ二コール 'ァセチルトランスフ ェラーゼ遺伝子、 β -グルクロ二ダーゼ遺伝子、 一ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ? -ラク夕マ一ゼ遺伝子、 ルシフヱラ一ゼ遺伝子、 ェクオリン遺伝子およびグリ 一ン ' フルォレツセント ·プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、 請求 項 4 4記載のスクリーニング法。
46. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコードする D Ν Αを欠損または変異させたノックァゥト動物。
47. ノックアウト動物がマウスである、 請求項 4 6記載のノックアウト 動物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002079424A2 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Deltagen, Inc. TRANSGENIC MICE CONTAINING β3GALT2 GENE DISRUPTIONS
WO2009028417A1 (ja) 2007-08-24 2009-03-05 Tokyo Institute Of Technology 婦人科癌の検出方法
RU2623167C2 (ru) * 2003-01-22 2017-06-22 Гликарт Биотекнолоджи АГ КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE408006T1 (de) 1998-11-13 2008-09-15 Henrick Clausen Udp-galaktose: beta-i(n)-acetyl-glukosamin beta1, 3 galaktosyltransferasen, beta3gal-t5
JP2005065687A (ja) 2003-01-23 2005-03-17 National Institute Of Advanced Industrial & Technology β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法
CA3149497A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Nutcracker Therapeutics, Inc. Methods and apparatuses for manufacturing for removing material from a therapeutic composition

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06181759A (ja) * 1992-12-16 1994-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ
JPH1156373A (ja) * 1997-08-27 1999-03-02 Koichi Furukawa 糖転移酵素遺伝子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE408006T1 (de) * 1998-11-13 2008-09-15 Henrick Clausen Udp-galaktose: beta-i(n)-acetyl-glukosamin beta1, 3 galaktosyltransferasen, beta3gal-t5

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06181759A (ja) * 1992-12-16 1994-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ
JPH1156373A (ja) * 1997-08-27 1999-03-02 Koichi Furukawa 糖転移酵素遺伝子

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMADO. M. ET. AL: "A family of human beta 3-galactosyltranferases.", J. BIOL. CHEM., vol. 273, no. 21, 1998, pages 12770 - 12778, XP002928042 *
BARDONI, A. ET. AL: "Differential expression of beta1,3 galatosyltransferases in human colon cells derived from adenocarcinomas or normal mucosa.", FEBS LETTERS, vol. 451, no. 1, May 1999 (1999-05-01), pages 75 - 80, XP002928040 *
HENNET- T. ET. AL: "Genomic cloning and expression of three murine UDP-galactose : Beta-N-acetylglucosamine beta1,3-galatosyltransferase genes.", J. BIOL. CHEM, vol. 273, no. 1, 1998, pages 58 - 65, XP002928043 *
ISSHIKI, S. ET. AL.: "Cloning, expression, and characterization of a novel UDP-galactose: beta-N acetyglucosamine beta 1,3-glactosyltranferase ( beta3Gal.T5) responsible for synthesis of type 1 chain in colorectal and pancreatic epithelia and tumor cells derived therefrom.", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 18, April 1999 (1999-04-01), pages 12499 - 12507, XP002928039 *
See also references of EP1162269A4 *
ZHOU, D. ET. AL: "Molecular cloning of a human UDP-galactose: GlcNAc beta 1,3 galactosyltranferase gene encoding an O-linked core3-elongation enzyme.", EUR. J. BIOCHEM, vol. 263, no. 2, July 1999 (1999-07-01), pages 571 - 576, XP002928038 *
ZHOU. D. ET. AL: "A beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase with poly-N-acetyllactosamine synthase activity is structurally related to beta-1,3-galactosyltransferases.", PROC. NATL. ACID. SCI. USA, vol. 96, no. 2, January 1999 (1999-01-01), pages 406 - 411, XP002928041 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002079424A2 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Deltagen, Inc. TRANSGENIC MICE CONTAINING β3GALT2 GENE DISRUPTIONS
WO2002079424A3 (en) * 2001-03-29 2003-09-04 Deltagen Inc TRANSGENIC MICE CONTAINING β3GALT2 GENE DISRUPTIONS
RU2623167C2 (ru) * 2003-01-22 2017-06-22 Гликарт Биотекнолоджи АГ КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
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