WO2000049046A1 - Nouvelle proteine de recepteur couplee a la proteine g et adn - Google Patents

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WO2000049046A1
WO2000049046A1 PCT/JP2000/000927 JP0000927W WO0049046A1 WO 2000049046 A1 WO2000049046 A1 WO 2000049046A1 JP 0000927 W JP0000927 W JP 0000927W WO 0049046 A1 WO0049046 A1 WO 0049046A1
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present
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salt
compound
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PCT/JP2000/000927
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Takuya Watanabe
Yasuko Terao
Yasushi Shintani
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein derived from human (human hippocampus) or a salt thereof, a DNA encoding the same, and the like.
  • G protein conjugated guanine nucleic acid-binding protein
  • 7TMR 7-transmembrane receptor protein
  • G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs, and is a target for molecules that regulate the function of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and biologically active substances. Plays a physiologically important role.
  • the receptor transmits a signal into the cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances. Have been.
  • physiologically active substances are present at various sites in the body, and regulate their physiological functions through the corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body There are many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body, and the structure of their receptor proteins has not yet been reported. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
  • the G protein-coupled receptor is useful for searching for a new physiologically active substance (that is, a ligand), and for searching for an agonist or an agonist for the receptor, using its signal transduction as an index. On the other hand, even if a ligand is not found, analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor to produce an agonist or an antagonist of the receptor. Is also possible.
  • These ligands, agonists, antagonists and the like for the receptor can be expected to be used as preventive / therapeutic agents and diagnostic agents for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptors.
  • a decrease or enhancement of the function of the receptor in a living body based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease.
  • not only administration of an antagonist or agonist to the receptor, but also introduction of the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor gene Can also be applied to gene therapy.
  • the nucleotide sequence of the receptor is essential information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the receptor gene is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor. / Can also be applied to therapeutic and diagnostic agents.
  • the present invention provides a novel useful G protein-coupled receptor protein as described above.
  • Method for determining ligand for receptor, method for screening compound (antagonist, agonist) that changes the binding property between ligand and said G protein-coupled receptor protein, or salt thereof, kit for screening, screening And a G protein-coupled receptor obtained using the method or screening kit Compounds (antagonists, agonists) that change the binding to white matter, or salts thereof, and compounds (antagonists, agonists) that change the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein or It is intended to provide a drug or the like containing a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies and, as a result, have isolated cDNA encoding a novel protein derived from human (human hippocampus) based on EST information generated by the degenerated PCR method, and sequenced the entire nucleotide sequence thereof. Successfully analyzed. Then, when this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobic plot, and the protein encoded by these cDNAs was found to be a seven-transmembrane G protein. It was confirmed to be a protein-coupled receptor protein. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention. That is, the present invention
  • a protein or a salt thereof which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a partial peptide of the protein according to (1) or a salt thereof,
  • a ligand for the protein of (1) or a salt thereof which can be obtained by using the protein of (1) or the partial peptide of (2) or a salt thereof;
  • the protein according to (1) or the partial peptide or (2) according to (2) is a kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand characterized by containing the salt and the protein or the salt thereof according to the above (1);
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (3) and a part thereof,
  • (21) a method for quantifying the mRNA of the protein according to (1), which comprises using the polynucleotide or a part thereof according to (3);
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the amount of a protein according to (1) above in a cell membrane which comprises using the quantification method according to (22);
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by using the screening method according to (24) above, which alters the expression level of the protein according to (1),
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 9); , More preferably several (1 to 5) amino acid sequences in which amino acid has been deleted, (2) 1 or 2 or more (preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 Degree, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids, 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ( Preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids.
  • the ligand may be, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxotocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin.
  • Somatos quintin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP Vasoactive Intestinal polypeptide
  • the compound that activates the protein according to the above (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxocytosine, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal polypeptide), somatosin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin , CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, and ⁇ -chemokine (eg, IL_8, GROa, GRO) 3, GR0a NAP-2, ENA-78, PF
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by the screening method according to (31) to (38) above, which alters the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1) above,
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by using the screening kit according to any one of (41) to (43), which changes the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1).
  • (45) Contains a compound or a salt thereof, which can be obtained by using the screening kit according to any one of (41) to (43), which alters the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1).
  • a medicament characterized by:
  • the antibody of (9) is competitively reacted with the test wave and the labeled protein of (1) or the partial peptide of (2) or a salt thereof, and The bound and labeled protein of (1) or
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel G protein-coupled receptor evening protein hSLT derived from the human hippocampus of the present invention obtained in Example 1, and the amino acid sequence deduced therefrom (continued from FIG. 2). .
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of a DNA encoding the novel G protein-coupled receptor evening protein hSLT derived from the human hippocampus of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. 1). Continued) .
  • FIG. 3 shows a hydrophobicity plot of hSLT, a novel G protein-coupled receptor protein from human hippocampus of the present invention, which was created based on the amino acid sequences shown in FIGS. 1 and 2.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (see FIGS. 1 and 2).
  • the receptor protein of the present invention can be used, for example, in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glia) of human mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, egret, bush, sheep, horse, monkey, etc.).
  • human mammals eg, guinea pig, rat, mouse, egret, bush, sheep, horse, monkey, etc.
  • the brain various parts of the brain (e.g., olfactory bulb, nucleus planis, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence has about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • Substantially the same activity includes, for example, a ligand binding activity and a signal information transmitting action. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and signal transduction can be performed according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to a ligand determination method and a screening method described later.
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) a protein represented by SEQ ID NO: 1; One or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5 )), An amino acid sequence to which amino acids are added, 3 SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence represented by 1, More preferably, a protein containing an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • the receptor protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (caprolactyl terminus) at the right end.
  • the receptor protein of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually has a C-terminus at the terminal hydroxyl group (-COOH) or carboxylate (-COO). —), but the C-terminal may be an amide (—CONH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, cyclo pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , alpha-C 6 2 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, phenylene Lou C E alkyl or alpha-naphthylmethyl etc.
  • alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, cyclo pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , alpha-C 6 2 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, phenylene Lou C E alkyl or alpha-naphthylmethyl etc.
  • alpha-naphthyl such as phenethyl - C 7 _ 1 4, such as C i-2 alkyl group
  • a Viva yloxymethyl group widely used as an oral ester is used.
  • the receptor protein of the present invention has a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the receptor protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the receptions evening one protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - such as 6 Arukanoiru group (: City 6 N-terminally cleaved in vivo, and the resulting darminyl group is pyroglutamine-oxidized; substituents on the side chains of amino acids in the molecule (for example, _ OH, — protection such as 6 C i _ 6 Ashiru groups such as Al force Noiru group) - SH, amino group, i imidazole group, indole group, etc. Guanijino group) appropriate protecting groups (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • N-terminal e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - such as 6 Arukanoiru group (: City
  • receptor protein of the present invention for example, a receptor protein of human origin (more preferably from the human hippocampus) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the like are used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be any peptide as long as it is a partial peptide of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein proteins of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an extracellular region (hydrophilic region) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. This is the peptide containing the part that was analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention. Is preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence is defined as about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more, of these amino acid sequences. 1 shows an amino acid sequence having homology of at least%.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence may be substituted with another amino acid.
  • partial peptide C-terminal of the present invention is usually a carboxyl group (one COOH) or carboxylate (one COO-), as the protein of the present invention described above, C-terminal amide (one CONH 2) or ester (One COOR).
  • R of the ester those similar to the above can be used.
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected with a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • a protecting group for protecting the amino group of the methionine residue
  • the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group
  • those in which a sugar chain is bonded such as a so-called sugar peptide.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one COO—) at the C-terminus, but has an amide (one CONHJ or ester (- COOR) You can use it.
  • the R of the ester those similar to the above can be used.
  • salts of the receptor protein of the present invention or its partial peptide include physiologically acceptable salts with acids or bases, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cell or tissue by a known method for purifying the receptor protein, or the receptor protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant transformed with a DNA encoding one protein. In addition, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reversed phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) — Fmoc aminoethyl) Phenoxy resin.
  • the amino group and the side chain functional group is condensed on a resin according to the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or its amide.
  • Activation by these involves adding the protected amino acid directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or pre-protecting the amino acid as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. Can be added to the resin after activation.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • pre-protecting the amino acid as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulphoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 t: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, Yuichi Sharipentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, and adamantyl.
  • Oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, an alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, evening butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, benzene benzene ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxy It can be protected by carbonyl hydrazide, short-lived butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, etc.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, evening butyl, cyclopentyl, cyclohex
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarponyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydroxyvinyl group, and a tributyl group.
  • a protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bzl, Cl 2 -Bz K 2 -nitrobenzyl, Br-Z, Yuichi Sharpyl and the like are used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, and Boc. , Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (for example, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4 Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOBt).
  • active esters for example, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4 Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOBt.
  • an activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride or methyl sulfone.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 to 4 Ot:
  • anisol, phenol, thioanisole, methcresol, paracresol It is effective to add a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol, etc.
  • it is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • amides of proteins include, for example, After amidation and protection of the ⁇ -functional lipoxyl group of the terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired length on the amino group side, and then a protecting group for the N-terminal a-amino group of the peptide chain is protected. A protein from which only the C-terminal carboxyl group is removed and a protein from which only the C-terminal protecting group is removed are produced, and both proteins are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • an ester of a protein for example, after condensing a single carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of a protein be able to.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. be able to.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. There may be.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention for example, by the method described in the known experimental medicine special edition "New PCR and its applications” 15 (7), 1997, or a method analogous thereto
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention can be quantified.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any one of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells and tissues described above, cDNA library derived from the cells and tissues described above, and synthetic DNA. May be.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, and phagemid.
  • totalR Using the prepared NA or mRNA fraction, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method).
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a high stringency.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having about 95% or more homology is used.
  • Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). And so on. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a condition in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Show. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used as the DNA encoding the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of DNA encoding the receptor protein of the present invention or a part of a nucleotide sequence complementary to the DNA is a polynucleotide encoding the following partial peptide of the present invention.
  • the term is used to mean not only DNA but also RNA.
  • a G protein-coupled receptor protein in which an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene has been cloned or determined can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding
  • a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene and inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the synthesis or function of the G protein-coupled receptor protein. It can regulate and control the expression of G protein-coupled receptor protein protein through its interaction with protein-related RNA.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the G protein-coupled receptor protein-associated RNA include: It is useful for regulating and controlling the expression of the G protein-coupled receptor protein gene in vivo and in vitro, and is also useful for treating or diagnosing disease.
  • the term “corresponding” means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide a base sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of a peptide (protein) specified by a sequence derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. I have.
  • G protein-coupled receptor 5'-end hairpin loop, 5'-end 6-base spare repeat, 5'-end untranslated region, 5'-end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein code region, ORF translation start Codons, 3 'untranslated regions, 3' end parindromic regions, and 3 'end hairpin loops may be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled receptor protein gene may be selected. You can choose.
  • the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be that the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides are 2-deoxy D-ribose-containing polydeoxynucleotides, D-repoise-containing polydeoxynucleotides, N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • polynucleotides or other polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special linkages eg, Polymers contain base pairs that are found in DNA or RNA, and contain nucleotides with a configuration that allows the attachment of bases). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • Nucleotides as well as those with known modifications, such as labeled, capped, methylated, and one or more natural nucleotides as analogs known in the art.
  • Substituted, modified with an intramolecular nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (for example, those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases, inhibitors, toxins)
  • Those with side groups such as antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc., sugars (eg, monosaccharides), those with inter-current compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), Those containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other complex rings. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups are replaced with a halogen, an aliphatic group, etc., or a functional group, such as ether, amine, etc. May be converted to
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell-permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, are provided in special forms such as ribosomes and microspheres, are applied by gene therapy, or are added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and cell membranes
  • Crude aqueous substances such as lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.) that enhance the interaction and increase the uptake of nucleic acids.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Examples of such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid is examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein. be able to.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA from cells and tissues described above, cDNA library from cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Or (2) an activity substantially identical to that of the receptor protein peptide of the present invention (eg, ligand binding activity) And a DNA having a partial nucleotide sequence of DNA encoding a receptor protein having a signal signal transduction action.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having about 95% or more homology is used.
  • the partial base of the receptor protein of the present invention may be used.
  • Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Conversion of the DNA base sequence can be performed using a known kit, for example, Mutan TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), or the like, using the Gupped duplex method or Kunke method.
  • the method can be carried out according to the method described above or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned receptor protein can be used as is or digested with restriction enzymes or added with a linker if desired. can do.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the receptor protein of the present invention may be prepared, for example, by (i) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the receptor protein of the present invention, and (mouth) expressing the DNA fragment appropriately. It can be produced by ligating downstream of a promoter in a vector.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmid e.g, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • the CMV promoter, SR promoter and the like are preferably used.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, 1 ac promoter one, re cA promoter, AP L promoter, l pp promoter is, when the host is Bacillus, SPO l promoter, SP 02 promoter If the host is yeast, such as Yuichi, pen P promoter, etc., PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter Motors and the like are preferred.
  • a polyhedrin promoter a promoter or a P10 promoter—is preferred.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used.
  • selectable markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp "), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) etc.
  • dh fr gene is used as a selection marker using CHO (dh fr ") cells
  • Genes can also be selected on thymidine-free media.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. If the host is a genus Escherichia, the PhoA 'signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin' signal sequence, etc., and the host is yeast If the host is an animal cell, the insulin signal sequence, the ⁇ -interferon signal sequence, the antibody molecule, the signal sequence, etc. Are available respectively.
  • a transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention thus constructed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12 ⁇ DH1 . Nail. Acad. Sci. U SA), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1 981)], JA 221 [Journal of Ob'Molecular ' Biology (Journal of Molecular Biology)], 120, 5 17 (1 978)], ⁇ 101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C 600 [The Enetics] (Genetics), Vol. 39, 440 (1954)] and the like, include, for example, Bacillus subtilis MI 114 (Gene, Vol. 24, 255 (1 983)), 207- 2 1 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD—5D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris, etc. are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG 1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from egg of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ cell), dh fr gene-deficient chinini—zhamster cell CHO (hereinafter CHO (dhfr -) Abbreviated as cell), mouse L cell, mouse At T_20, mouse myeloma cell, rat GH3, human FL cell, etc. are used.
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitably used as a culture medium, and contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for the growth of the transformant.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato
  • the inorganic or organic substance such as the extract and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a culture medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of the “Ob” Journal of Molecular Genetics (Journal of Experiments). in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972). If necessary, an agent such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the medium used is Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used. Preferably, ⁇ of the medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)), RPM I 1640 medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the isolation and purification of the receptor protein of the present invention from the above culture can be performed, for example, by the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasonication, lysozyme and ethanol.
  • a method of destroying cells or cells by freeze-thawing or the like, and then obtaining a crude extract of Receptu Yuichi protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • Proteins such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer Modifier or may contain a surfactant such as Triton X- 1 0 0 TM.
  • Purification of the receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method that mainly uses differences in molecular weight a method that uses differences in charge such as ion exchange chromatography, a method that uses specific novelty such as affinity mouth chromatography, a reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc.
  • a method utilizing the difference in the hydrophobicity of the polymer a method utilizing the difference in the isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the receptor protein thus obtained When the receptor protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • Receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • protein-modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, and protein kinase.
  • Glycosidase is used.
  • the activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt can be obtained by using the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt. Any polyclonal or monoclonal antibody may be used as long as it can be recognized.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a known antibody or a known antibody using the receptor protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to the method for producing antiserum.
  • the receptor protein of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration to itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, Vol. 256, p. 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration and incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes.
  • the hybridoma culture supernatant is applied to a solid phase (eg, a microplate) to which the antigen of the receptor protein of the present invention is adsorbed directly or together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (if the cells used for cell fusion are mice, use an anti-mouse immunoglobulin antibody) or protein A, and bind to the solid phase.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme if the cells used for cell fusion are mice, use an anti-mouse immunoglobulin antibody
  • protein A protein A
  • a monoclonal antibody was detected by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A had been adsorbed, and a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme was added to the solid phase.
  • Examples include a method for detecting a monoclonal antibody.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or no hybridoma culture medium Serum medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • Culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • C The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Immunoglobulin separation and purification methods e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, Adsorption and desorption using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase, or an active adsorbent such as protein A or protein G collects only the antibody and dissociates the antibody by binding. Specific Purification Method Obtained].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen of a receptor protein) and a carrier-protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the fact that the antibody is efficiently used for the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, ⁇ serum albumin, ⁇ thyroglobulin, keyhole 'limpet' hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten A method of bubbling at a rate of 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • condensation product is administered to a warm-blooded animal at the site where antibody production is possible, or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein of the present invention or its salt, its partial peptide or its salt, and the DNA encoding the receptor protein or its partial peptide are: (1) a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention ( (2) a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, (3) a gene diagnostic agent, (4) a genetic diagnostic agent, A method for screening a compound that changes the expression level of a receptor protein or a partial peptide thereof, (5) prevention and / or prevention of various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention. Or therapeutic agent,
  • a method for screening a compound (eg, agonist, antagonist, etc.) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor of the present invention and a ligand (8) a G protein-coupled receptor of the present invention; A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, angonist) that changes the binding property between a protein and a ligand, (9) the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • (10) a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane; (11) a method for screening the receptor protein or its partial peptide of the present invention in the cell membrane.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the amount (12) neutralization of the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof with an antibody, (13) the G of the present invention. It can be used for producing non-human animals having a DNA encoding the protein-coupled receptor protein.
  • binding of a ligand to a G protein-coupled receptor specific to humans and mammals can be achieved.
  • Compounds that alter the sex eg, agonist, angyo gonist, etc.
  • the agonist or angyo gonist can be used as a preventive or therapeutic agent for various diseases.
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention
  • the DNA encoding the receptor protein or its partial peptide of the present invention hereinafter, the use of the DNA of the present invention may be abbreviated
  • the use of the antibody against the receptor protein of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide or a salt thereof of the present invention is a reagent for searching for and / or determining a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin).
  • Adrenomedullin Adrenomedullin, Somatos, Chitin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP Soactive Intestinal and Restricted Polypeptide), Somatos, Chitin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP Ningene relayed peptide), leukotriene, pancreatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and 3-chemokine (eg IL-8 GRO ⁇ , GROi3, GROT, NAP—2, ENA—78, PF4, IP10, GC P—2, MCP—1, HC14, MCP—3, I-309, MIP—1 , MIP-Li3, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, Hismin, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptides or galanin), as well as, for example, humans or mammals ( For example,
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and By using the receptor-based Atsushi system, the cell stimulating activity by binding to the receptor protein of the present invention (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular AMP production) , Intracellular c GMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • the receptor protein of the present invention eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular AMP production
  • Intracellular c GMP production Intracellular c GMP production
  • Inositol phosphate production Cell membrane potential fluctuation
  • Intracellular protein phosphorylation c-fos activation, pH
  • a compound having an inhibitory activity eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.
  • a salt thereof e.
  • the present invention provides
  • the labeled test compound When a labeled test compound is brought into contact with a receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the receptor protein of the present invention, the labeled test compound has the receptor protein.
  • a method for determining a ligand for a receptor protein of the present invention which comprises measuring the amount of binding to a salt thereof,
  • a test compound When a test compound is brought into contact with a cell containing the receptor protein of the present invention, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus
  • a method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention which comprises measuring an activity of promoting or suppressing oxidation, activation of c-fos, reduction of pH, and the like.
  • ⁇ Receptor protein-mediated cell stimulation when the test compound is brought into contact with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • Activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-1 and a method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention, which comprises measuring the activity of promoting or suppressing the activation of fos, the decrease of pH, and the like.
  • the receptor protein used in the ligand determination method may be any receptor protein containing the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Receptor Yuichi protein expressed in large amounts is suitable.
  • the above-mentioned expression method is used, but it is preferable to express the DNA encoding the receptor protein in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is usually used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment is a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using an insect as a host.
  • NPV Nuclear polyhedrosis virus
  • S40-derived promoter retrovirus promoter
  • retrovirus promoter It is preferable to incorporate the gene into the downstream of a motor, a meta mouth thionine promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SR promoter and the like.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, according to the method described in the literature [: Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry, 267, 19555-19559, 1992]. It can be carried out.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a receptor protein or a partial peptide thereof or a purified peptide thereof according to a method known per se. It may be a salt, or a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell expressing the receptor protein of the present invention. Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells. Are used.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-E lvehj em-type homogenizer, crushing with a Warlinda Blender 100 Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or using a French press. Disruption by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure can be cited.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (150 rpm to 300 rpm). (0.0000 rpm) at 30 minutes to 2 hours
  • the precipitate obtained is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptor protein in the cells containing the receptor protein or in the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • the equivalent activity, equivalent ligand binding activity, as the labeled test compound indicating, for example, signal transduction activity, [3 H], [125 I], [14 C], etc.
  • the membrane fraction of a cell or a cell containing the receptor protein of the present invention is suitable for the determination method.
  • the buffer 1 may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a tris-monohydrochloride buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, dexcholate, and various proteins such as serum albumin and gelatin may be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepsin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and ligand by the protease.
  • 0.0 lm 1 to 10 ml of the receptor solution was labeled with a fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of [ 3 H], [ 125 I], [ 1 C], [ 35 s] or the like.
  • the test compound is allowed to coexist.
  • the reaction is carried out at about 0 ° C to 50 ° C, preferably about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an r-counter.
  • a test compound having a count (B-NSB) of less than 0 cpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or a salt thereof.
  • B-NSB a count of the non-specific binding amount obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B)
  • NBS non-specific binding amount
  • the above-described method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention or a salt thereof is described above.
  • the cell stimulating activity mediated by the receptions evening over proteins e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. It can be measured using a kit. Specifically, first, cells containing the receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like.
  • the assay Prior to ligand determination, replace cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant Then, the generated product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in the cells, the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • the kit for determining a ligand that binds to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes the receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, and a cell containing the receptor protein of the present invention. Or a membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 m filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 2 days at 37 ° (5% C 2 , 95% air).
  • Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethylformamide, DMS ⁇ , methanol, etc.
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • the ligand capable of binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, engulf, and the like. Specifically, angiotensin, Bombesin, canapinoid, colecist Kinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioids, purines, vasopressin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP ( Vasoactive Intestinal and Restricted Polypeptide), Somatos Retin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene Relayed Peptide), Leukotriene, Pancreastatin, Prostaglandin, Thromboxan, Adenosine, Adrenaline, ⁇ and
  • the receptor protein of the present invention if the ligand for the receptor protein of the present invention is revealed, then depending on the action of the ligand, (1) the receptor protein of the present invention or (2) encoding the receptor protein
  • the DNA can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the physiological activity of ligand cannot be expected because the receptor protein of the present invention is reduced in a living body (the receptor protein deficiency).
  • the cells are By transplanting into a patient or the like, the amount of receptor protein in the patient's body can be increased, and the effect of the ligand can be fully exerted. That is, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention has an amino acid sequence level of SLC-11 receptor or somatosustin receptor type 3 or type 5 (SS5R or SS3R), which is a G protein-coupled receptor protein. Approximately 60% homology is observed.
  • the receptor protein of the present invention and the DNA encoding the receptor protein of the present invention may be used for central diseases (eg, Alzheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia), epilepsy, etc.), hormonal diseases (eg, , Weak labor, laxative bleeding, before and after placenta delivery, reconstructive failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc., liver / bile / knee / endocrine disorders (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory It is useful for the prevention and treatment of diseases (eg, allergy, asthma, rheumatism, etc.) and cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.).
  • central diseases eg, Alzheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia), epilepsy, etc.
  • hormonal diseases eg, , Weak labor, laxative bleeding, before and after placenta delivery, reconstructive failure, cesarean section, abortion
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention when used as the above preventive or therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or in a retrovirus vector. After being inserted into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, it can be administered according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting ingestion, using a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, It can be used orally as microcapsules or the like, or parenterally in the form of injections such as sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids or suspensions.
  • the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein together with known carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., which are physiologically recognized. It can be manufactured by admixing it in the unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and a suitable solubilizing agent.
  • alcohols e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene Dali call, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate - DOO 8 0 TM, HCO- 5 0
  • solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agent is, for example, a buffer (eg, a phosphate buffer, vinegar).
  • a buffer eg, a phosphate buffer, vinegar
  • Sodium acid buffer eg, a phosphate buffer, vinegar
  • soothing agent eg, benzalkonidum chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in anorexic patients (as 60 kg)
  • one dose is required.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • injection usually, for example, anorexic patients (6 O kg )
  • a dose converted per 6 O kg can be administered.
  • the dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. Is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day is administered by intravenous injection. It is convenient to give. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a human or mammal (eg, a rat, a rabbit, a sheep, a pig, a pig, a cat, a dog, a monkey, etc.). Since abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding DNA can be detected, for example, damages, mutations or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA can be detected. It is useful as a gene diagnostic agent.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989) ) Etc.
  • the DNA of the present invention when used as a probe, can be used for screening for a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the present invention relates to, for example, U) blood of a non-human mammal, 2 a specific organ, 3 a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a receptor of the present invention contained in a transformant or the like.
  • the measurement of the mRNA amount of the receptor protein or its partial peptide of the present invention is specifically performed as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, egrets, sheep, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteries, etc.
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the mRNA of the receptor protein or its partial peptide of the present invention contained in the obtained cells is quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a conventional method and using a technique such as TaqManPCR, for example. It can also be analyzed by performing Northern plots by a method known per se.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide is prepared according to the above-described method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant is similarly determined. Quantification and analysis.
  • Screening for a compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention comprises:
  • a given time before drug or physical stress is given to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the stress, and after a lapse of a certain time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) Later), it can be carried out by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cells,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) This can be performed by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, cell Activities to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • the G protein-coupled receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, cell Activities to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention (for example, a central disease (for example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorder). Anorexia) 'epilepsy etc.), hormonal diseases (eg, weak labor, laxative bleeding, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, etc.), liver / bile / knee / endocrine Diseases (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, high blood pressure) It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for illness / cardiac hypertrophy (angina pectoris / arteriosclerosis).
  • a central disease for example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorder.
  • Anorexia 'epilepsy etc.
  • hormonal diseases eg, weak labor, laxative bleeding
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-described drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be administered, for example, to human mammals (for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). can do.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in anorexia nervous patients (as 60 kg)
  • one dose is required. It is about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. ) of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention
  • the receptor protein of the present invention can be used in vivo, for example, for central functions. It is thought to play an important role. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof may be a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention (eg, a central disease (eg, Alzheimer's disease 'dementia').
  • a central disease eg, Alzheimer's disease 'dementia'.
  • Eating disorders ⁇ epilepsy, etc., hormonal diseases (eg, weak labor, lax bleeding, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, etc.), liver / bile / Win / Prevention of endocrine diseases (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.) And Z or can be used as a therapeutic agent.
  • hormonal diseases eg, weak labor, lax bleeding, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, etc.
  • Prevention of endocrine diseases eg diabetes, eating disorders, etc.
  • inflammatory diseases egy, asthma, rheumatism, etc.
  • cardiovascular diseases eg, hypertension, cardiac hypertrophy,
  • the compound when used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by doing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the material of the pump may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and a suitable solubilizing agent.
  • alcohols e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene Dali call, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate - DOO 8 0 TM, HCO - 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in anorexic patients (as 60 kg) About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, and the like. 0 kg ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. For other animals, the equivalent dose per 60 kg can be administered.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the specimen can be measured by bringing the specimen into contact with the receptor protein of the present invention. Specifically, for example,
  • the method can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • Such compounds include (ii) cell stimulatory activity via G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production
  • G protein-coupled receptors eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is contacted with a ligand; and (ii) the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its partial peptide.
  • a compound which changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, which is compared with a case where the salt is brought into contact with the ligand and the test compound; or A method for screening the salt is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the labeled ligand and the test compound are combined with the DNA of the present invention.
  • the method comprises measuring and comparing the amount of a labeled ligand bound to the receptor protein in the case of contacting the receptor protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the protein.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding between the ligand to be used and the receptor protein of the present invention
  • a compound of the present invention that activates the receptor protein of the present invention eg, a ligand for the receptor protein of the present invention
  • a cell containing the receptor protein of the present invention A cell stimulating activity via receptor receptor (eg, arachidonic acid release, acetyl choline release) when a protein activating compound and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor protein of the present invention.
  • receptor receptor eg, arachidonic acid release, acetyl choline release
  • Intracellular Ca2 + release Intracellular cAMP generation
  • Intracellular cGMP generation Intracellular cGMP generation
  • Inositol phosphate production Cell membrane potential fluctuation
  • Intracellular protein phosphorylation Activation of c-fos, Decrease in pH Or a salt thereof, which changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention, which are characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing the activity of the present invention.
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention eg, the receptor of the present invention—a ligand for the protein
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • the compound of the present invention expressed on the cell membrane by contacting the receptor protein of the present invention with the receptor protein of the present invention and by culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound activating the receptor protein of the present invention and a test compound.
  • the present invention relates to a ligand characterized in that the activity of the present invention is measured or compared with the activity of the present invention, for example, the activity of promoting or suppressing cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, and reduction of pH. And a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property of the compound to a receptor protein.
  • a cell, tissue or cell membrane fraction thereof containing a G protein-coupled receptor protein such as a rat
  • a test to confirm whether the candidate compound actually inhibits the binding of a human G protein-coupled receptor protein to a ligand was needed. If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, so it has been difficult to actually screen the agonist or gonist for the target receptor protein.
  • the use of the human receptor protein of the present invention eliminates the need for primary screening, and improves the efficiency of compounds that inhibit the binding of ligand to G protein-coupled receptor protein. Can screen well. Further, it is possible to easily evaluate whether the compound screened is an agonist or an engonist.
  • the receptor protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any one as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention.
  • Cell membrane fractions of mammalian organs containing one protein are preferred.
  • human-derived organs are particularly difficult to obtain, it is suitable to use, for example, rat receptor protein expressed in large amounts using recombinants, etc., for screening. .
  • the above-mentioned method is used. It is preferable to carry out the method by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited thereto.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce the DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into host animal cells and to express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus (nuc) belonging to a baculovirus using an insect as a host.
  • nuc nuclear polyhedrosis virus
  • polyhedrin promoter of ear po lyhedros is virus (NPV), promoter derived from SV40, retroviral promoter, meta-oral thionine promoter, human heat shock promoter overnight, cytomegalovirus promoter, SR It is preferably incorporated downstream such as a promoter.
  • NMV virus
  • the quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method is carried out according to the method described in the literature [Namb i, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
  • the receptor protein of the present invention may be a receptor protein purified according to a method known per se, or may be a receptor protein of the present invention. May be used, or the membrane fraction of cells containing the receptor protein may be used.
  • the cell when a cell containing the receptor protein of the present invention is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor protein, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, or the like. .
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cell disruption methods include Potter— Method of crushing cells with an Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Perling Blender 10 Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, crushing by ejecting cells from a narrow nozzle while applying pressure by a French press, etc. Can be exacerbated.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes. Centrifuge for ⁇ 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptor protein in cells or membrane fractions containing the receptor protein is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. .
  • the receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is preferable.
  • the equivalent activity indicates equivalent ligand binding activity, signal transduction action and the like.
  • labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • the receptor protein of the present invention is contained.
  • Prepare the receptor protein sample by suspending the cells or membrane fraction of the cells to be used in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of Tris-HCl, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein.
  • Surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can also be added to the buffer to reduce non-specific binding.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide suptin can be added to suppress the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • the solution is filtered through a glass fiber filter paper, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured using a liquid scintillation counter or an iron counter.
  • the non-specific binding amount (NSB) minus the non-specific binding amount (NSB) is 100%
  • the specific binding amount (B-NSB) force 50% or less of the test compound can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • a cell stimulating activity through the receptor protein for example, Arachidonic acid release, Acetylcholine release, Intracellular Ca release, Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of C-fOS ,
  • the activity of promoting or suppressing the decrease of pH, etc. can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
  • cells containing the receptor protein of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant.
  • the products produced are quantified according to the respective method.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • a cell line having a natural type receptor protein of the present invention a cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein and the like are desirable.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention includes the receptor protein of the present invention, a cell containing the receptor protein of the present invention, or the present invention. And those containing the membrane fraction of cells containing the protein of Recept.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent 1Measurement buffer and washing buffer
  • CH ⁇ cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 510 5 holes, and cultured for 2 days in 37T: 5% CO 2 , 95% air.
  • the ligand is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) so as to become ImM, and stored at 20 ° C.
  • test compound 1G M solution 5 ⁇ 1 was added, the labeled ligand 5 1 was added to react at room temperature for one hour.
  • a supplementary 5 a 1 to 10 one 3 Micromax ligands in place of the test of compounds in order to know the amount of non-specific binding.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • B) Cell stimulating activity via G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the agonist against the receptor protein of the present invention has the same action as the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the ligand activity. is there. Since the antagonist of the present invention for the receptor protein of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity. is there.
  • a compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention (for example, a central drug).
  • Diseases eg, Alzheimer's disease • Dementia's eating disorders (anorexia) ⁇ epilepsy etc.
  • hormonal diseases eg, weak labor, flaccid bleeding, before and after placenta delivery, uterine renal failure, cesarean section, abortion, milk Stasis, etc., liver / bile / win / endocrine disorders (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory disorders (allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension 'cardiac hypertrophy' angina pectoris' It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for arteriosclerosis).
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be used in a conventional manner.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-described medicine containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. Parenteral administration In such cases, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, and more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, angonist) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein and the ligand of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo, such as central function. Therefore, the compounds of the present invention that alter the binding property between the receptor protein and the ligand (agonist, antagonist) can be used to prevent and / or treat diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. It can be used as an agent.
  • the compound may be used in combination with diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention (eg, central illness (eg, Alzheimer's disease, dementia, anorexia), epilepsy, etc.), hormonal diseases (eg, weak labor , Diastolic hemorrhage, placental delivery, before and after delivery of the placenta, uterine remodeling failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc.
  • diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention eg, central illness (eg, Alzheimer's disease, dementia, anorexia), epilepsy, etc.), hormonal diseases (eg, weak labor , Diastolic hemorrhage, placental delivery, before and after delivery of the placenta, uterine remodeling failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc.
  • diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention eg, central illness (eg, Alzheimer's disease, dementia, anorexia), epilepsy, etc.)
  • hormonal diseases eg
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound may be a known physiologically recognized carrier. It can be manufactured by mixing with body, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in the unit dosage form generally required for the practice of the formulation. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and a suitable solubilizing agent.
  • alcohols e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene Dali call, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant e.g., polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, puppies, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in anorexia nervous patients (as 60 kg)
  • one dose is required.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. (kg)), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.:! to about 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. It is.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention, it can be used for quantification of the receptor protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay. it can. That is, the present invention provides, for example, (i) competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled receptor protein, and determining the ratio of the labeled receptor protein bound to the antibody.
  • a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution which comprises measuring
  • the present invention provides a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor protein of the present invention
  • the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against the receptor protein of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody-antigen corresponding to the amount of antigen in the test solution (for example, the amount of receptor protein).
  • any measurement method may be used as long as the amount of the complex is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • a nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used.
  • a method using a chemical bond used for insolubilizing or immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, simultaneously, or at an interval.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the receptor protein. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • a competition method an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to react competitively with an antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation The amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • BZF separation was performed using soluble A liquid phase method using tylene glycol, a second antibody to the above antibody, or an immobilized antibody as the first antibody, or using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody
  • the immobilization method used is used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody. Then, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the measurement system for the receptor protein of the present invention or a salt thereof may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • the measurement system for the receptor protein of the present invention or a salt thereof may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • it is possible to refer to reviews and compendiums [for example, Hiroshi Irie “Radio Immunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “ (Radio Munozetsu)] (Kodansha, published in 1979), edited by Eiji Ishikawa et al.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
  • various diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention for example, Central diseases (eg Alzheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia) 'epilepsy etc.), hormonal diseases (eg weak labor, flaccid bleeding, before and after placental delivery, incomplete uterine reconstruction, cesarean section, artificial abortion, Milk stasis, etc.), liver / bile / zen / endocrine diseases (eg, diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension 'cardiac hypertrophy' angina pectoris ⁇ Diagnosis of arteriosclerosis etc.).
  • Central diseases eg Alzheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia) 'epilepsy etc.
  • hormonal diseases eg weak labor, flaccid bleeding, before and after placental delivery, incomplete uterine reconstruction, cesarean section, artificial abortion, Milk stasis, etc.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt, it changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. It can be used for screening compounds.
  • non-human mammal blood specific organs, tissues isolated from organs After disrupting cells or the like, the cell membrane fraction is isolated, and the receptor protein of the present invention or the receptor protein of the present invention in the cell membrane is determined by quantifying the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction.
  • a method for screening a compound that changes the amount of the partial peptide
  • the cell membrane fraction is isolated, and the receptor protein of the present invention contained in the cell membrane fraction or a portion thereof A method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane by quantifying the peptide,
  • Sections of (1) blood, (2) specific organs, and (3) tissues or cells isolated from the organs of non-human mammals, and then using immunostaining to obtain the receptor at the cell surface Provided is a method for screening for a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the protein. I do.
  • Transfectants expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof are sectioned, and the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using an immunostaining method.
  • a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane is provided.
  • the quantitative determination of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, rabbits, sheep, higgies, bush, birds, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is suspended.
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.
  • a cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.), and further using a method such as centrifugation, filtration, or column fractionation.
  • a surfactant for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Methods for crushing cells include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Pelling Blender ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, and narrowing the cells while pressing with a French press. It can be broken by erupting from For cell membrane fractionation, centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes. Centrifuge for ⁇ 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
  • a given time before drug or physical stress is given to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered simultaneously with the stress, and after a lapse of a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cell membrane It can be carried out by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed with the medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) After a day), it can be carried out by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • the confirmation of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or a specific organ eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissue or cells isolated from the organ is obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained with the antibody of the present invention.
  • the degree of staining of the receptor protein on the cell surface By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, and confirming the protein on the cell membrane, quantitatively or qualitatively The amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the membrane can be confirmed.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane.
  • the cell stimulating activity via G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca
  • Mouth reducing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. More, a compound that decrease the cell stimulating activity.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention (for example, a central disease (for example, Alzheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia) Illness) 'epilepsy etc.), hormonal diseases (eg, weak labor, lax hemorrhage, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc.), liver / bile / knee / endocrine disease (For example, diabetes and eating disorders), inflammatory diseases (allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (for example, prevention and / or treatment of hypertension 'cardiac hypertrophy' angina, arteriosclerosis, etc.) Useful.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-described drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in anorexic patients (as 60 kg), the It is about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. ), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. is there.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane can be used to prevent and / or treat a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. It can be used as an agent.
  • the compound when used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method. .
  • the compound can be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by doing. The amount of the active ingredient in these preparations is adjusted so that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be administered, for example, to human mammals (for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). can do.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in anorexia nervous patients (as 60 kg)
  • one dose is required. It is about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. ), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is a neutralizing activity against the receptor protein or the like. It means an activity to inactivate a signaling function involving the interfering protein. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transmission involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, Activity to promote intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc. Activity, etc.) can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and Z or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, Activity to promote intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intra
  • a transgenic non-human animal expressing the receptor protein of the present invention can be prepared.
  • Non-human animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, oysters, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals). And egrets are preferred.
  • the DNA of the present invention When transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct in which the DNA of the present invention derived from an animal having a high homology with the DNA is linked to a downstream of various promoters capable of expressing the same in animal cells is used, for example, By microinjecting into a heron fertilized egg, a DNA transgenic animal that highly produces the receptor protein of the present invention can be produced.
  • the promoter examples include ubiquitous expression promoters such as virus-derived promoters and meta-mouth thionein, and preferably, NGF gene promoter and enolase gene promoter specifically expressed in the brain. Is used. Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal. The presence of the receptor protein of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. I do. The offspring of such animals that have inherited the gene will have the receptor protein of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by crossing, it can be reared and subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all offspring have the DNA. They can be bred to subculture.
  • the animal to which the DNA of the present invention has been transferred has high expression of the receptor protein of the present invention, and thus is useful as an animal for screening an agonist or an antagonist for the receptor protein of the present invention.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the receptor of the present invention is analyzed.
  • One protein can be analyzed.
  • Cells of a tissue having the receptor protein of the present invention can be cultured by standard tissue culture techniques, and these can be used to study the function of cells from generally difficult-to-culture tissues, such as those from brain or peripheral tissues. it can.
  • a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • TC thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
  • Trt Trityl
  • HONB trihydroxy-5-norporene-2,3-dicarboximide SEQ ID NOs in the Sequence Listing of this specification indicate the following sequences.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the human hippocampus-derived novel G protein-coupled receptor protein h SLT of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein hSLT derived from the human hippocampus of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • primer 1 shows the nucleotide sequence of primer 1 used for cloning cDNA encoding the novel human hippocampus-derived G protein-coupled receptor protein hSLT of the present invention.
  • [SEQ ID NO: 4] 1 shows the nucleotide sequence of Primer 2 used for cloning cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein hSLT derived from the human hippocampus of the present invention.
  • Escherichia coli DH5a / pCR3.l_hSLT obtained in Example 1 described below has been used since April 28, 1999, 1-1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Ministry of International Trade and Industry. Deposited with National Institute of Bioscience and Biotechnology (NI BH) No. FERM BP-6710 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Japan from April 20, 1999 (1999) It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IF ⁇ 16284.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • E. coli DH5a transformed with plasmid pCR3.1-hSLT into which a gene encoding the full-length amino acid sequence of human hippocampus-derived hSLT whose sequence was confirmed in Example 1 was cultured, and Plasmid Midi was cultured.
  • PCR Kit Qiagen
  • plasmid DNA for PCR3.
  • HSLT was prepared. This was transfected into CH0-K1 cells using CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol.
  • 10 mg of plasmid DNA was used as a suspension co-precipitated with calcium phosphate, and added 24 hours before to a 10 cm dish seeded with 5 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 6 CHO-K1 cells. After culturing in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum for 1 day, the cells were subcultured and cultured in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and lmg / ml G418 as selective media. Forty colonies of colonies of hSLT-expressing CH0 cells growing in the selection medium were selected.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention includes: (1) determination of ligand (agonist), (2) Acquisition of antibodies and antisera; (3) Construction of a recombinant receptor protein expression system; (4) Development of a receptor-binding assay system using the expression system and screening of drug candidate compounds; Perform drug design based on comparison, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ probe in genetic diagnosis ⁇ ⁇ Reagent for preparing PCR primers, ⁇ ⁇ prepare transgenic animals or 8can be used as pharmaceuticals such as gene preventive and therapeutic agents .

Description

明細書
新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質およびその D N A 技術分野
本発明は、 ヒト （ヒト海馬） 由来の新規蛋白質またはその塩およびそれをコ ードする D N Aなどに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特 異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ 夕一蛋白質のうち多くは共役している guanine nuc l eot ide- binding protein ( 以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝 達を行ない、 また 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることか ら、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質 ( 7 TM R) と総称される。
G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存 在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経伝達物 質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセ プ夕一は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグ ナルにより細胞の賦活ゃ抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセ プ夕ー蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにす ることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連し た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝 達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ れている。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対 応するレセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内に は未だ未知のホルモンゃ神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらの レセプター蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知のレセプ夕一蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかに ついても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質と の関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセプ夕一蛋白質に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストを効率よくスクリー二 ングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプ夕一蛋白質 の遺伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であ つた。
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D NAの配列 をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデ一夕ベース に登録され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難である。
従来、 G蛋白質共役型レセプターと生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結 合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグ ナル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプ夕一の特異的なアン夕ゴニストま たはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従 つて、 このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬 品開発の標的ともなりうる G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を新規に見出し、 その遺伝子 （例えば c D N A) をクロ一ニングすることは、 新規 G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出 す際に、 非常に重要な手段となる。 しかし、 G蛋白質共役型レセプターはその全てが見出されているわけではな く、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプ夕一、 また対応するリガン ドが同定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており、 新たな G蛋白質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
G蛋白質共役型レセプターは、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな 生理活性物質 （即ち、 リガンド） の探索、 また該レセプターに対するァゴニス トまたはアン夕ゴニスト） の探索に有用である。 一方、 リガンドが見出されな くても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ夕一の 生理作用を解析することにより、 該レセプターに対するァゴニストまたはアン 夕ゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプ夕一に対するリガン ド、 ァゴニストまたはアンタゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプターの機 能不全に関連する疾患の予防/治療薬や診断薬として活用することが期待でき る。
さらにまた、 G蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、 生体での該 レセプ夕一の機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合 も多い。 この場合には、 該レセプ夕一に対するアン夕ゴニストやァゴニストの 投与だけでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への 導入や、 該レセプ夕ー遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子 治療に応用することもできる。 この場合には該レセプタ一の塩基配列は遺伝子 上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプ夕ー の遺伝子は、 該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬 に応用することもできる。
本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を提供 するものである。 即ち、 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチド （D N A、 R N Aおよびそれらの誘導 体） を含有するポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） 、 該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 該組換えべクタ一を保持する 形質転換体、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩の製造法、 該 G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット 、 該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られるリガ ンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （ァ ン夕ゴ二スト、 ァゴニスト） またはその塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニ スト） もしくは該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合 物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。 発明の開示
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 degenerated PCR法によって作成した E S T情報に基づいて、 ヒト （ヒト海馬） 由来の新規な蛋白質をコードする c D NAを単離し、 その全塩基配列を解析することに成功した。 そして、 この塩 基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜第 7膜貫通領域が疎水性プロ ッ卜上で確認され、 これらの c D N Aにコードされる蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプター蛋白質であることを確認した。 本発明者らは、 これ らの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩、 (2) 上記 （1) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の蛋白質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチ ドを含有するポリヌクレオチド、
(4) DN Aである上記 （3) 記載のポリヌクレオチド、
(5) 配列番号： 2で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載のポリヌクレ ォチド、
(6) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(7) 上記 （6) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
(8) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の蛋白質を生成 せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩の製造法、
(9) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩に対する抗体、
(10) 上記 （1) 記載の蛋白質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体であ る上記 （9) 記載の抗体、
(1 1) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(12) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることにより得られうる上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩 に対するリガンド、
(13) 上記 （12) 記載のリガンドを含有してなる医薬、
(14) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩に対 するリガンドの決定方法、
(15) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(16) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質また はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、
(1 7) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(18) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医 薬、
(19) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下 でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(20) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、
(21) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特 徴とする上記 （1) 記載の蛋白質の mRNAの定量方法、
(22) 上記 （9) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋 白質の定量方法、
(23) 上記 （21) または上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載の蛋白質の機能が関連する疾患の診断方法、
(24) 上記 （21) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載の蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法
(25) 上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜にお ける上記 （1) 記載の蛋白質量を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、 (26) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩、
(27) 上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜 における上記 （1) 記載の蛋白質量を変化させる化合物またはその塩などに関 する。
さらには、
(28) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程 度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のァ ミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個 程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が付加したアミノ酸配 列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 また は④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記 載の蛋白質またはその塩、
(29) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分 ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする上記 (14) 記載のリガンドの決定方法、
(30) リガンドが例えばアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コ レシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y 、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレ チン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 G HRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ イン テスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 ァ ミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプチ ド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボ キサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) ( 例えば、 I L一 8、 GROひ、 GR〇/3、 GR〇ァ、 NAP— 2、 ENA- 7 8、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 I — 309、 MI P 1—ひ、 MI P— 1 ^3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン 、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレア ティックポリぺプ夕イドまたはガラニンである上記 （29) 記載のリガンドの 決定方法、
(31) ( i) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載 の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と、 （ii) 上 記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドも しくはその塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行 なうことを特徴とする上記 （15) 記載のスクリーニング方法、
(32) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩ま たは上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合と、 （ii ) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその 塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 (2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較する ことを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(33) ( Ϊ) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記 載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 細胞に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1 ) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
(34) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の 膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識 したリガンドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(35) ( i) 標識したリガンドを上記 （7) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と、 （ii ) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （7) 記載の形質転換体を培養す ることによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの該蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(36) ( i) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上 記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （ 1 ) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介した細胞 刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋 白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、
(37) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上記 （7 ) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した 蛋白質に接触させた場合と、 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化す る化合物および試験化合物を上記 （7) 記載の形質転換体を培養することによ つて該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合における、 蛋白 質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記
( 1 ) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、
(38) 上記 （1) 記載の蛋白質を活性化する化合物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メ ラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキ シトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメ ジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チ ン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニ ンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび β—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L_8、 GROa、 GRO)3、 GR 0ァ、 NAP- 2, ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—309、 M I P— 1ひ、 M I P— l 3、 RA NTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロ テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラニンである 上記 （36) または （37) 記載のスクリーニング方法、
(39) 上記 （31) 〜 （38) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩、
(40) 上記 （31) 〜 （38) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(41) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴とする 上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、
(42) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特 徵とする上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、
(43) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した蛋白質を含有することを特徴とする上記 （16) 記載のスク リ一ニング用キット、
(44) 上記 （41) 〜 （43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩、
(45) 上記 （41) 〜 （43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(46) 上記 （9) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2 ) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させることを特徴とする上記 （1 ) の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
(47) 上記 （9) 記載の抗体と、 被検波および標識化された上記 （1) 記載 の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記
( 2 ) 記載の部分べプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被 検液中の上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩の定量法、 および
(48) 被検液と担体上に不溶化した上記 （9) 記載の抗体および標識化され た上記 （9) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担 体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の 蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法などを提 供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質 h S L Tをコードする D N Aの塩基配列、 およびそれから推定され るアミノ酸配列を示す （図 2に続く） 。
図 2は実施例 1で得られた本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質 h S L Tをコ一ドする D NAの塩基配列、 およびそれから推定され るアミノ酸配列を示す （図 1の続き） 。
図 3は図 1〜図 2に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のヒト海 馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h S L Tの疎水性プロットを示す
発明を実施するための最良の形態
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 レセプ夕一蛋白質と略記 する場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 （図 1および図
2中のアミノ酸配列） と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する レセプ夕—蛋白質である。 本発明のレセプター蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細 胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 ]3細胞、 骨髄細胞、 メサン ギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細 胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球 ) 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン 細胞など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例 えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下 部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状 核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心 臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎 盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） に由来するタンパ ク質であってもよく、 また合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあ げられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝 達作用などがあげられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質で あることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用など の活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 よ り好ましくは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度 やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の 方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するリガンドの決定方法や スクリ一ニング方法に従つて測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個 ) ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを 組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書におけるレセプ夕一蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本発明のレセプ夕一蛋白質は、 C末端が通常力ルポキシル基 （一 C O OH) ま たはカルボキシレート（—C O O—) であるが、 C末端がアミド （― C O NH 2 ) またはエステル （一 C O O R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどの フエ二ルー Cェ アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル — C i— 2アルキル基などの C 7 _ 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして 汎用されるビバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキ シレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。 この場合のエステルと しては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 本発明のレセプ夕一蛋白質には、 上記した蛋白質において、 N末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アルカノィル基などの (：ト 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端 側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 _ OH、 — S H、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アル力ノィル基などの C i _ 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの 複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト海馬由来） のレ セプ夕一蛋白質などが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する 場合がある） としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドであれば何 れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプ夕一結合活性を有するものな どが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプター蛋 白質の部分べプチドとしては、 図 3で示される疎水性プロット解析において細 胞外領域 （親水性 （Hydroph i l i c) 部位） であると分析された部分を含むぺプチ ドである。 また、 疎水性 （Hydrophobi c) 部位を一部に含むペプチドも同様に用 いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数 のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のレセプター蛋白 質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 50%以上、 好 ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 9 0%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す 。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （ 好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のァミノ 酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 〜20個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜10個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1 〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) またはカルボキシレート （一 COO— ) であるが、 前記した本発明のタンパク質 のごとく、 C末端がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であ つてもよい。 エステルの Rとしては上記と同様のものなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のレセプター蛋白質と 同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) またはカルボキシレート（一 COO—) であるが、 前記した本発明のタンパク質 のごとく、 C末端がアミド （一 CONHJ またはエステル （― COOR) であ つてもよい。 エステルの Rとしては上記と同様のものなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または 塩基との生理学的に許容される塩があげられ、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸 、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用 いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞 または組織から自体公知のレセプ夕一蛋白質の精製方法によつて製造すること もできるし、 後述する本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aで形質転 換された形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ る。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル 樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4一 ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4一 （2' , 4' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹 脂、 4一 （2' , 4' -ジメトキシフエ二ル— Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂な どをあげることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基 を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知 の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク 質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジス ルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得 する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジイミド類としては、 DC Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル- N' -（3-ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらに よる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOBt, HOOBt)とともに保護アミ ノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HOB tエステルあるい は HOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂 に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 t：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニン ヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる 。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセ チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 夕一シャリーペンチル ォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2 _ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ ニルホスフィノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル 、 プロピル、 ブチル、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル 、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状 もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジ ルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエス テル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕ーシャリーブトキシカル ボニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができ る。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラ二ル基、 卜ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 Cl 2-Bz K 2—ニトロベンジル、 Br-Z、 夕一シャリ一プチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2， 3, 6-トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc 、 Tr t、 Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール 、 2， 4, 5-トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアル コール、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキ シフ夕ルイミド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の 活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d -黒あるいは P d -炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ 夕ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア 中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一 般に約— 2 0で〜 4 O t:の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル 、 ジメチルスルフイ ド、 1， 4-ブタンジチオール、 1， 2 -エタンジチオールなどの ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール 保護基として用いられる 2， 4-ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により 除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は 上記の 1， 2 -エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理に よる脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアル力 リ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ 末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側に ペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末 端の a—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基 の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記した ような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である 。 縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての 保護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質 は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望 のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸のひ 一カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得るこ とができる。
本発明の夕ンパク質の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断す ることによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のタンパ ク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製 造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 の①〜⑤に記載された方法があげられる。
① M. Bodanszky および M. A. Onde t t K ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , In tersc i ence Publ i shers, New York (1966年 j
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Pep t i de) , Academi c Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） ④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部 分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが 遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし 、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができ る。
本発明のレセプタ一蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述し た本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好 ましくは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポ リヌクレオチドとしては、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA、 m RNA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖 の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アンチ センス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチドを用いて、 例えば 、 公知の実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15(7)、 1997記載の方法またはそ れに準じた方法により、 本発明のレセプ夕一蛋白質の mRNAを定量すること ができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DN Aライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 •組織由来の cDNAライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラ リーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 フ ァージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より totalR N Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅 することもできる。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 例え ば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズす る塩基配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リ ガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプター蛋白質をコ ードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては 、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相 同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー 'クロ一ニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェン卜な条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4 0mM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは 約 60〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕 —蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を 有する DN Aなどが用いられる。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAの塩基配列の一部、 または該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記 の本発明の部分ペプチドをコードする D NAを包含するだけではなく、 R NA をも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の複製又は発現を 阻害することのできるアンチセンス 'ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン 化したあるいは決定された G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （ 核酸） は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の R N Aとハイブリダィズ することができ、 該 R N Aの合成又は機能を阻害することができるか、 あるい は G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aとの相互作用を介して G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレ ォチド、 及び G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aと特異的に八イブリ ダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病 気などの治療又は診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めた ヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補 的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白 質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列又はその相補体 から誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6— ベ一スペア · リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋 白質コ一ド領域、 O R F翻訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンド ローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうる が、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選 択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は 、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオ チドは、 2—デォキシー D—リボースを含有しているポリデォキシヌクレオチ ド、 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリン又はピリ ミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 ある いは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核 酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポ リマー （但し、 該ポリマ一は D N Aや R NA中に見出されるような塩基のペア リナグゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などがあ げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D N A： R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポ リヌクレオチド （又は非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付 加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いた もの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換し たもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 カルバメー トなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロ チォエート、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレ ァーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L —リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基 を有しているもの、 インタ一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレ ンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよ い。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核酸」 とは、 プリン及 びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基を もつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリン 及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるいはその他の複 素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレ ォチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水酸基がハロゲ ンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの 官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R N A、 D N A、 あ るいは修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例と しては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシド アミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものがあげられるが、 そ れに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で 好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定な ものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス 鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチ センス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており。 例えば J. Kawakaii e t al. , Pharm Tech Japan, Vo l. 8, pp. 247, 1992 ; Vo l. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに 開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものがあげられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） があげられる。 こうしたものは、 核酸 の 3' 端あるいは 5' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア ーゼ、 RNa s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものがあげ られる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラ エチレングリコ一ルなどのグリコ一ルをはじめとした当該分野で知られた水酸 基の保護基があげられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の生体内や生 体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法 で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコ一ドする DNAとしては、 前述した本発明の部分 ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞，組 織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファ ージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また 、 前記した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- PCR法と略称する ) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 (1) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有 する DNA、 または （2) 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリン ジエンドな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のレセプター 蛋白質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報 伝達作用など） を有するレセプター蛋白質をコードする DN Aの部分塩基配列 を有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては 、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相 同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプ ター蛋白質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクロ一ニング の手段としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて PCR法によって増幅するか、 または適当なベクターに 組み込んだ DN Aを本発明のレセプ夕一蛋白質の一部あるいは全領域をコード する DNA断片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼ ーションによって選別することができる。 ハイブリダィゼーションの方法は、 例えば、 モレキュラー 'クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 MutanTM- G (宝酒造 （株 ) ) 、 Mutan™-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 Gupped duplex法や Kunke 去 などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができ る。
クローン化されたレセプター蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適 当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプター蛋白質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のレセ プタ一蛋白質をコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り出し、 （口 ) 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結すること により製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 p XT1、 pRc/CMV, pRc/RSV, p c DNA I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモー夕一、 L TRプロモーター、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどがあげ られる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 S Rひプロモーターなどを用いるのが 好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモータ一、 r e cAプロモーター、 A PLプロモーター、 l ppプロモー ターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO lプロモーター、 SP 02プロモー夕一、 p e n Pプロモータ一など、 宿主が酵母である場合は、 P HO 5プロモーター、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロ モーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモ —夕一、 P 10プロモータ一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下 、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセー卜 （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp "·と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne o と略称する場合がある、 G418耐性） 等があ げられる。 特に、 CHO (dh f r") 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マー カーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選 択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプター蛋 白質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA 'シ グナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン 'シグナル配列などが、 宿主が 酵母である場合は、 MFひ ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿 主が動物細胞である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 α—インタ一フ ェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明のレセプター蛋白質をコードする DN Αを 含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞 、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア *コリ （Escherichia col i ) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー · ォブ.サイェンシィズ.ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Nail. Acad. Sci. U SA) ， 60巻， 160 (1 968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ ' リサーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1 98 1)〕 ， J A 22 1 〔ジャーナル'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー（Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 5 1 7 (1 978)〕 ， ΗΒ 101 〔ジャーナル ·ォブ .モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジ エネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1 954)〕 などが用いられる バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズブチルス （Bacillus subtilis ) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207 - 2 1 〔ジャー ナル 'ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R—， NA87 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ポンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1 9 1 3, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) な どが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) , S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L ら、 イン ·ヴイボ （In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 31 5巻， 592 (1 985)〕 。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハム ス夕一細胞 CHO (以下、 CH〇細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r-) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T_20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ *ォブ* ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 21 10 (1972)やジーン (Gene) , 17巻， 107 ( 1982)などに記載の方法に従って行なうことが できる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド •ジェネラル ·ジエネティックス (Molecular & General Genetics) ， 168 巻， 1 1 1 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ'イン'ェンザィモロジ一（Me t hod s in Enzymology) , 194巻， 182 - 187 (1991) 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ 一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978 ) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー （ Bio/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことがで きる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロ トコ一ル. 263— 267 (1995) (秀潤社発行）、 ヴィロロジー（Virology ) ， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。 このようにして、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DNAを含 有する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 3
養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一 、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機また は有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリ ゥム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促 進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) ， ジャーナル 'ォブ 'ェクスぺリメ ンッ ·イン ·モレキュラー ·ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ るために、 例えば、 3 /3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えること ができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホ一ルダ一 （Burkholder) 最小培地 CBostian, K. L. ら、 「プロシージングズ •ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ 一エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980) 〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシージ ングズ.'ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ · ザ.ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 (1 984) 〕 があげられる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培 養は通常約 20°C〜35 で約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気ゃ撹 拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C. ,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788(1962) ) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる 。 培地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻 ， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8巻， 3 96 (1959)) , RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカ ン ·メディカル ·ァソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199卷， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング' ォブ 'ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ'バイオロ カル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30で〜 40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のレセプ夕一蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下 記の方法により行なうことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては 、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁 し、 超音波、 リゾチームおよびノまたは凍結融解などによって菌体あるいは細 胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプ夕一蛋白質の粗抽出液を得る 方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質 変性剤や、 トリトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培 養液中にレセプター蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知 の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプタ一 蛋白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことが できる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解 度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリア クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィォ ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマト グラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点 の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるレセプタ一蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体ま たは他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプ夕一蛋白質を、 精製前または精製後に適当 な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ
、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のレセプタ一蛋白質またはその塩の活性は、 標識し たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィな どにより測定することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れで あってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明のレセプター蛋白質と略記する場合もある） に対する抗体は、 本発明の レセプ夕一蛋白質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に 従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナ一ル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗 体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジ ュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回 程度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ 、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギがあげられるが、 マウスおよび ラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物 、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後 に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞 と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製する ことができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプ夕一 蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーと ミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature) , 2 5 6巻、 4 9 5頁 （1 9 7 5年 ) 〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレ ングリコール （P E G) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2Z0などがあげ られるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PE G (好ましくは、 PEG 1000〜PEG6000) が 10〜80%程度の濃 度で添加され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間 ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質の抗原を直接あるいは担体 とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清 を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞 融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いら れる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出 する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイ プリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋 白質を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげら れる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育 種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20 %の牛胎児血清を 含む RPMI 1640培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光 純薬工業 （株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C 、 好ましくは約 37°Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1 週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハ イブリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にし て測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノク口一ナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と 同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点 沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精 製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に したがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （レセプター蛋白質の抗 原） とキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプ夕一蛋 白質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造 できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は 、 キャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば 、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ' リンペット 'へモシァニン等を 重量比でハプテン 1に対し、 約 0. 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカブ ルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル 、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことが できる。
ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など 、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一 ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこと ができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、 および該レセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aは、 （ 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト ) の決定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連 する疾患の予防および Zまたは治療剤、 （3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発明の レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスク リ一ニング方法、 （5 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、
( 6 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの定量法、
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法、 （ 8 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤、 （9 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチド 4
またはその塩の定量、 （1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質また はその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、 （1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物を含有する各種疾病の予防およびノまたは治療剤、 （1 2 ) 本発 明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体に よる中和、 （1 3 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを有する非ヒト動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現系を用いた レセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋白質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例 、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァ ゴニストまたはアン夕ゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用する ことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のレセプ夕一蛋白質と略記する場合がある） 、 本発明のレセプ夕一蛋白質ま たはその部分ペプチドをコードする D N A (以下、 本発明の D NAと略記する 場合がある） および本発明のレセプター蛋白質に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
( 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴニス ト） の決定
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもし くはその塩は、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァ ゴニスト） を探索し、. または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発 明の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴と する本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。 試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべ シン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニ ン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシ ン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリ ン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P ひ ソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド ) 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CG RP (カルシ卜ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パン クレアス夕チン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 ァドレ ナリン、 αおよび3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GRO α 、 GROi3、 GROT、 NAP— 2、 ENA— 7 8、 P F 4、 I P 1 0、 GC P— 2、 MCP— 1、 HC 1 4、 MC P— 3、 I 一 3 0 9、 M I P— 1 ひ、 M I P— l i3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス 夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまた はガラニンなど） の他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラ ット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用 いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本発明のレセプ夕ー蛋 白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一のリガ ンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もし くはその部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプ夕一 蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用い ることによって、 本発明のレセプター蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば 、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s活性化、 pHの低下などを促進する活性ま たは抑制する活性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド 性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である 本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプ夕ー蛋 白質または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性など を測定することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本 発明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試験 化合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩に対 する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 塩に対するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または 該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D N Aを含 有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白 質に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプター蛋白質また はその塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明のレセプ夕ー蛋 白質に対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合 における、 レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活 性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩 に対するリガンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAを含有する形 質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質に接触 させた場合における、 レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成 、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または 抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプタ一蛋白質ま たはその塩に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質 に結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプター蛋白質としては、 上記した本発 明のレセプター蛋白質または本発明の部分べプチドを含有するものであれば何 れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白 質が適している。
本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが 、 該レセプター蛋白質をコードする DN Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現す ることにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする DN A断片には、 通常、 相補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるも のではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明のレセ プ夕ー蛋白質をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率 よく発現させるためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルス に属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NPV) のポリ ヘドリンプロモータ一、 S V40由来のプロモ一夕一、 レトロウイルスのプロ モータ一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモータ一 、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R ひプロモーターなどの下流に組み 込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法 で行うことができる。 例えば、 文献 [： Namb i , P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ · バイオロジカル ·ケミストリー （J. Bi o l. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992 年〕 に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプター蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 それ自体 公知の方法に従って精製したレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩であってもよいし、 該レセプタ一蛋白質を含有する細胞またはその細 胞膜画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する 細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプ夕ー蛋 白質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵 母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t ter— E lvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ一ゃポ リトロン （Kinemat i ca社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあ げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清を さらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕ー蛋 白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量 は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子で あるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活 性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプタ一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の ①〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプ夕一蛋白質画分と、 標識した 試験化合物が必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す 標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 な どで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ二 ン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド 、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカ ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CR F、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリ ン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッド ペプチド） 、 ロイコ卜リエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 ト ロンボキサン、アデノシン、ァドレナリン、 ひおよび3—ケモカイン（chemokine ) (例えば、 I L_8、 GR〇o;、 GRO/3、 GROr、 NAP— 2、 ENA 一 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3 、 I一 309、 MI P— lひ、 M I P— 1 ]3、 RANTESなど） 、 エンドセ リン、 ェンテロガス卜リン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンク レアティックポリぺプタイドまたはガラニンなどが好適である。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決 定方法を行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または細 胞の膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプ夕一 標品を調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) の リン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタ一蛋白 質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的 結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n - 80™ (花王—アトラス 社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミン やゼラチンなどの各種蛋白質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プ 口テアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイ ぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ 阻害剤を添加することもできる。 0. 0 lm 1〜 10mlの該レセプ夕ー溶液に 、 一定量 （5000 c pm〜 500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔 1 C] 、 〔35s〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （ NSB) を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用 意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは約 4 °Cから 37 °Cで、 約 20分 から 24時間、 望ましくは約 30分から 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾 紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する 放射活性を液体シンチレ一シヨンカウン夕一あるいは r—カウンターで計測す る。 全結合量 （B) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B— N SB) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明のレセプター蛋白質またはその 塩に対するリガンド （ァゴ二スト） として選択することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の ④〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプ夕ー蛋白質を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞 内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進 する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを 用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含有す る細胞をマルチウエルプレ一ト等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたつ ては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交 換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出 あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する 。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細 胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤 を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性に ついては、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞 に対する産生抑制作用として検出することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは 、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもしくは その塩、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕 一蛋白質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1 . リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Sal t Solut i on (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 4 5 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 ② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37° (：、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養した もの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝 液にて 1 Mに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチル ホルムアミド、 DMS〇、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕一蛋白質発現 CH 〇細胞を、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液 を各穴に加える。
②標識試験化合物を 5 μ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドと しては、 例えば、 脳、 下垂体、 滕臓などに特異的に存在する物質などがあげら れ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシスト キニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオ イド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グ ルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティ ナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン 、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレー ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグラン ジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L一 8、 GROa、 GROiS、 GROァ、 NAP— 2、 ENA - 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 MI P— 1ひ、 M I P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TR H、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニンなどが用いられる。
(2) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の 予防および Zまたは治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドが 明らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプ夕ー蛋 白質または②該レセプタ一蛋白質をコードする DNAを、 本発明のレセプ夕一 蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤などの医薬とし て使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプ夕一蛋白質が減少しているためにリガ ンドの生理作用が期待できない （該レセプター蛋白質の欠乏症） 患者がいる場 合に、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質を該患者に投与し該レセプタ一蛋白質の量 を補充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAを該患 者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明 のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該 患者に移植することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕一蛋白質の量 を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 即ち、 本発明 のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aは、 安全で低毒性な本発明のレセプ夕 —蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として有用で ある。
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質である S L C 一 1受容体またはソマトス夕チン受容体タイプ 3またはタイプ 5 ( S S 5 Rま たは S S 3 R) にアミノ酸配列レベルで約 6 0 %の相同性が認められる。
本発明のレセプ夕一蛋白質および本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAは、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病'痴呆'摂食障害 （拒食症） ·てんか んなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子 宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /膝/内分泌 疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など）、 炎症性疾患（アレルギー ·喘息 · リュウマ チなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧症 ·心肥大 '狭心症 ·動脈硬化等）の予防およ びノまたは治療に有用である。
本発明のレセプター蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套 手段に従つて製剤化することができる。
一方、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N A (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） を上記予防，治療剤として使用する場合は、 本発明 の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに揷 入した後、 常套手段に従って投与することができる。 本発明の D N Aは、 その ままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲル カテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプター蛋白質をコード する D N Aは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学 的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口 的に使用できる。 例えば、 ①本発明のレセプター蛋白質または②該レセプ夕一 蛋白質をコードする D NAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形 剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよう にするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水 、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D— マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例 えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ —ト 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば 、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
本発明のレセプター蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （ 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ましく は約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましく は約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注 射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換 算した量を投与することができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （6 O kgと して） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによって も異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を 投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動 物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば 、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAま たは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。 本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーシヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 874〜 879頁 （ 1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜2770頁 （ 1989年） ） などにより実施することが できる。
(4) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物のスクリーニング方法
本発明の DN Aは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング に用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、 U) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器 、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含まれ る本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの mRNA量を測定する ことによる、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変 化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの mR N A量の測定は具 体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ ト、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （ 例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時 間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド の mR N Aは、 例えば、 通常の方法により細胞等から mR N Aを抽出し、 例え ば TaqManPCRなどの手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手 段によりノザンプロットを行うことにより解析することもできる。
(i i) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体を前述の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプター 蛋白質またはその部分ペプチドの mR N Aを同様にして定量、 解析することが できる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化 合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは 一定時間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より 好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレス と同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後 、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間 後） 、 細胞に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの m R NA量を定量、 解析することにより行なうことができ、
(i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より 好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ夕 一蛋白質またはその部分べプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行 なうことができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発 明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有 する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 部分ペプチドの発現量を増加させることにより、 G蛋白質共役型レセプ夕一を 介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 (口） 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ ることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし 、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬 （例えば、 中枢疾患 (例えばァルツハイ マ一病 ·痴呆 '摂食障害 （拒食症） 'てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば 、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠 中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /膝/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など） 、 炎症性疾患 (アレルギー ·喘息 ·リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧 症 ·心肥大 '狭心症 ·動脈硬化等）の予防および または治療剤） として有用であ る。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【0067】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとす ることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （60 kgと して） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。
(5) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発明のレセ プ夕ー蛋白質の機能不全に関連する疾患 （例えば、 中枢疾患 (例えばァルツハイ マー病 '痴呆'摂食障害 （拒食症） ·てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば 、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠 中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /勝/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など） 、 炎症性疾患（アレルギー ·喘息 ·リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧 症 ·心肥大'狭心症 ·動脈硬化等)等） の予防および Zまたは治療剤として用いる ことができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水 、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D— マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例 えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ —ト 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば 、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （6 0 k gと して） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。
(6) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプ夕一蛋白質は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いること ができる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプ夕一蛋白質と接触させることに よって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば
、 以下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用い ることができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(7) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法 本発明のレセプ夕一蛋白質を用いるか、 または組換え型レセプター蛋白質の 発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることに よって、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物 など） またはその塩を効率よくスクリ一二ングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 ; f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の レセプ夕一蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化 合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （ハ ) リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強する 化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質 との結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は 、 上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。 すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明のレセプ 夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化 合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明 のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i ) の場合における、 例えば、 該レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを 測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質に接触させた場合と、 標識 したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質に接触させた場合 における、 標識したリガンドの該レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明 のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に おける、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質に接触させた場合と、 標識した リガンドおよび試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養する ことによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質に接触させた場合 における、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明のレセプ夕一蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ夕 一蛋白質に対するリガンドなど） を本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞 に接触させた場合と、 本発明のレセプター蛋白質を活性化する化合物および試 験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合におけ る、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤本発明のレセプ夕一蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ夕 —蛋白質に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培 養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質に接触させ た場合と、 本発明のレセプター蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した本発明のレセプ夕一蛋白質に接触させた場合における、 レセプ夕一を介す る細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産 生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの 低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプ夕一蛋白質が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプターァ ゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリーエングする場合、 まずラットなどの G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用 いて候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際 にヒ卜の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否 かを確認する試験 （二次スクリーニング） が必要であった。 細胞、 組織または 細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的 とするレセプ夕一蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際にス クリーニングすることは困難であつた。
しかしな力 Sら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプ夕一蛋白質を用いることに よって、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすること ができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニス トかを簡便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプ夕一蛋白質とし ては、 上記した本発明のレセプタ一蛋白質を含有するものであれば何れのもの であってもよいが、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する哺乳動物の臓器の細 胞膜画分が好適である。 し力 し、 特にヒ卜由来の臓器は入手が極めて困難なこ とから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発 現させたラット由来のレセプ夕一蛋白質などが適している。
本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本 発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好まし レ 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片には相補 D N Aが用いられ るが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用いてもよい。 本発明のレセプタ一蛋白質をコードする D N A断片を宿 主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D N A断片を 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc l ear po lyhedros i s vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来の プロモーター、 レトロウイルスのプロモータ一、 メタ口チォネインプロモータ ―、 ヒトヒートショックプロモ一夕一、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R aプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプター の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Namb i ， P. ら、ザ ·ジャーナル'ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー（J. Bi o l. Chem. ) ， 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕ー蛋 白質を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプタ 一蛋白質であってもよいし、 該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞を用いてもよ く、 また該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化 してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 該レセプ夕ー蛋白質を 発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆 虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダ一ゃポ リトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあ げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕ー蛋 白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタ一蛋白質を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子である のが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （ 比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりで なく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物をスク リ一ニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプ夕一 蛋白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 こ こで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など を示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ 化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 な どで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁す ることによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜l 0 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファーな どのリガンドとレセプター蛋白質との結合を阻害しないバッファ一であればい ずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe en-80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界 面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレ セプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加するこ ともできる。 0. 0 lm 1〜 10m 1の該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10— 4M 〜10— 1GMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量（NSB) を知るため に大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°C から 50t：、 望ましくは約 4 から 37 で、 約 20分から 24時間、 望まし くは約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙で濾過し、 適量の同バ ッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一 ションカウンターまたはァ—カウン夕一で計測する。 拮抗する物質がない場合 のカウント（B。） から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B。一 NS B) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) 力 例えば、 50%以 下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ る。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物スクリ —ニングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一蛋 白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離 、 細胞内 C a遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C一 f O Sの活性化 、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法また は市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリ一ニングを行なうにあたっては前もって新鮮 な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物 などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を 回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の 指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解 酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセ ィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオル スコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制 作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプ夕ー蛋 白質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプター蛋白質を発現した細胞 としては、 天然型の本発明のレセプ夕一蛋白質を有する細胞株、 前述の組換え 型レセプ夕一蛋白質を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用 いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質、 本発明のレ セプ夕一蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する 細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものがあげられる。 1 . スクリーニング用試薬 ①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕ー標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CH〇細胞を、 12穴プレートに 5 105個ダ穴で継代し、 37T：、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養した もの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImM となるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CH 〇細胞を、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液 を各穴に加える。
② 10— 3〜10— 1GMの試験化合物溶液を 5 ^ 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 合物の代わりに 10一3 Μのリガンドを 5 a 1加えておく。
③反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0. 2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一夕一 A (和光純薬製） と混合する。 ④液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NSB) / (B。― NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B 0 ： 敢大 ?1；口も里
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質との結合性を 変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レ セプ夕一を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 : f o sの 活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化 合物 （いわゆる、 本発明のレセプター蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該 細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対す るアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋 白質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし 、 公知の化合物であってもよい。
本発明のレセプター蛋白質に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一蛋白 質に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガ ンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニストは、 本発明のレセプ夕一 蛋白質に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リ ガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する 化合物は、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが有する生理活性を増 強するための安全で低毒性な医薬 （例えば、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病 •痴呆'摂食障害 （拒食症） ·てんかんなど)、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱 陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /勝/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など）、 炎症 性疾患（アレルギー ·喘息 · リュウマチなど）、 循環器疾患（例えば高血圧症 '心 肥大 '狭心症 ·動脈硬化等）の予防および Zまたは治療剤） として有用である。 リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少させ る化合物は、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが有する生理活性を 減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従 つて使用することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプター蛋白質を含 有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセ ル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （6 O k gと して） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
( 8 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防およ び/または治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプター 蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニス ト） は、 本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および/ または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患 （例えば、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病 ·痴呆 ·摂食障害 （拒食症） 'てんかんなど） 、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古 不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /勝/内分泌疾患（ 例えば糖尿病'摂食障害など）、 炎症性疾患（アレルギー ·喘息， リュウマチなど )、 循環器疾患 (例えば高血圧症，心肥大 ·狭心症 ·動脈硬化等)等） の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することがで さる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水 、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D— マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例 えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ ート 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば 、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜ゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （60 kgと して） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(9) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定 量
本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質を特異的に認識することができる ので、 被検液中の本発明のレセプ夕一蛋白質の定量、 特にサンドイッチ免疫測 定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 ( i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプ夕一蛋白質とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化レセプ夕一蛋白質の割合を測定することを特 徵とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質の定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質の定量法を 提供する。 上記 （i i) においては、 一方の抗体が本発明のレセプター蛋白質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質の C端部に反応する 抗体であることが好ましい。
本発明のレセプター蛋白質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプタ一蛋白質の 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの 目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質に対 する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の 抗原量 （例えば、 レセプター蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一 抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原 を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれ の測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリツ ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述 するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては 、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上 記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラク トシダ一ゼ、 ]3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダ ーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フ ルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光 物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシ ゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオ チン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セル口 —スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の 合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検液中の本発明のレセプ夕一蛋白質量を定量することができる。 1次反応 と 2次反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をず らして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じる ことができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識 用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上 させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一蛋白質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプ夕一蛋白質 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レセプ 夕一蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましく は C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば 、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることがで きる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応 させたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分 離し （B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を 定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエ チレングリコール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを 用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量 の沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタ一蛋白質 またはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細に ついては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラ ジオイムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィ ムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法 」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版 ) (医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版 ) (医学書院、 昭和 62年発行） 、 「メソッズ'イン'ェンジモノジ一 （Methods in ENZYMOLOGY) J Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol, 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E :Monoclonal Ant i bodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr i doma Technology and Monoc lonal Ant ibodi es) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプ夕ー蛋 白質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一蛋白質また はその塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関 連する各種疾患 （例えば、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病'痴呆'摂食障害 （ 拒食症） 'てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /膳/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など）、 炎症性疾患（アレルギー •喘息 · リユウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧症 '心肥大 '狭心症 ·動脈 硬化等)等） の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセ プ夕ー蛋白質を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明 のレセプ夕一蛋白質を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各 分画中の本発明のレセプ夕一蛋白質の検出、 被検細胞内における本発明のレセ プ夕ー蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセ プ夕ー蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリ一ニン グに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明 のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜に おける本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化 合物のスクリーニング方法、
( i i) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレ セプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜におけ る本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物 のスクリーニング方法、
(i i i) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 受容体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ンパ ク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
( iv) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容 体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タンパク質 を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 定量は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ 卜、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （ 例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時 間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織ま たは細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩 衝液、 へぺス緩衝液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界 面活性剤 （例えば、 トリトン X100TM、 ツイ一ン 20TMなど） などを用い、 さらに遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。 細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポ リトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などがあ げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋 白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドは 、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンブロッ ト解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ 、 ウェスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
(ii) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体を前述の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋 白質またはその部分べプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変 化させる化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは 一定時間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より 好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレス と同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後 、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間 後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量 を定量することにより行なうことができ、
( Π) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より 好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質 またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 確認は具体的には以下のようにして行なう。
( i i i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ 卜、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （ 例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時 間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織ま たは細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行 う。 細胞表層での該受容体タンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞 膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を確認する ことができる。
(iv) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞 膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレ セプタ一蛋白質またはその部分べプチドの量を増加させることにより、 G蛋白 質共役型レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセ チルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分べプチドの量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる 化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし 、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬 （例えば、 中枢疾患 (例えばァルツハイ マー病 '痴呆'摂食障害 （拒食症） 'てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば 、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠 中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /膝/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など） 、 炎症性疾患 (アレルギー ·喘息 · リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧 症'心肥大'狭心症 ·動脈硬化等）の予防および/または治療剤） として有用であ る。 該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとす ることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （60 kgと して） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。
(1 1) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 細胞膜における本発 明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、 本 発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療 剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。.
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水 、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D— マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例 えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ —ト 80TM、 HCO-50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば 、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 拒食症患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 拒食症患者 （60 kgと して） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
(12) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体による中和
本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体が、 それらレセプター蛋白質などに対する中和活性とは、 即ち、 該レセプ ター蛋白質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従つ て、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕ー蛋白質の関与するシグナ ル伝達、 例えば、 該レセプタ一蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を不活性化することができる。 従って、 該レセプ夕ー蛋白質 の過剰発現などに起因する疾患の予防および Zまたは治療に用いることができ る。
(13) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DNAを有す る非ヒト動物の作製
本発明の DNAを用いて、 本発明のレセプ夕一蛋白質を発現するトランスジ エニック非ヒト動物を作製することができる。 非ヒト動物としては、 哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル など） など （以下、 動物と略記する） があげられるが、 特に、 マウス、 ゥサギ などが好適である。
本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 DN Aを動物細胞 で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用 いるのが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の DN Aを転移させ る場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の DNAを動物細胞で発現させ うる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥ サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプター 蛋白質を高産生する DN A転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては 、 例えば、 ウィルス由来プロモー夕一、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発 現プロモー夕一も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する NGF遺伝 子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモータ一などが用いられる。 受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽 細胞において本発明のレセプ夕一蛋白質が存在することは、 作出動物の子孫が 全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質を有すること を意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体 細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質を有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認 して、 該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる 。 さらに、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝 子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を 交配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代すること ができる。
本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質が高発現さ せられているので、 本発明のレセプター蛋白質に対するァゴニストまたはアン タゴニス卜のスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することも できる。 例えば、 本発明の D N A転移マウスの組織中の D N Aもしくは R N A を直接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプ夕一蛋白 質が存在する組織を分析することにより、 本発明のレセプ夕一蛋白質について 分析することができる。 本発明のレセプター蛋白質を有する組織の細胞を標準 組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来の ような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また 、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬 の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセ プター蛋白質を単離精製することも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
d GTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP '三リン酸
EDTA ミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ダリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 ン
Le u
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ： グルタミン酸
As ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ： ヒスチジン
Ph e ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリプ卜ファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グル夕ミン
pG 1 u ： ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
P h ： フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記 目己する。
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
Cl2Bzl ： 2, 6—ジクロロべンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル Z ：ベンジルォキシカルポニル
C 1—Z ： 2 _クロ口べンジルォキシカルポニル
B r— Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
Bo c ： t—ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエノール
T r t ： トリチル
Bum ： t—ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t ： 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3—べンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン -2, 3-ジカルボキシイミド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h SLTのアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h S LTをコ一ドする c DNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 3〕
本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 h SLTをコー ドする c D N Aをクローニングするために使用したプライマー 1の塩基配列を 示す。
〔配列番号： 4〕 本発明のヒト海馬由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h S LTをコード する c DN Aをクローニングするために使用したプライマー 2の塩基配列を示 す。
後述の実施例 1で得られた Escherichia coli DH5 a/pCR3. l _hS LTは、 平成 1 1年 （1999年） 4月 28日から日本国茨城県つくば市東 1 - 1 -3, 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託 番号 FERM BP- 6710として、 平成 1 1年 （1999年） 4月 20日 から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17-85, 財団法人 ·発酵研究 所 （ I F O) に寄託番号 I F〇 16284として寄託されている。 実施例
以下に参考例および実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操 作法は、 モレキュラー ·クローニング （Molecular cloning) に記載されている 方法に従った。 実施例 1 ヒト海馬の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコ一ドする c DN A のクローニングと塩基配列の決定
ヒト海馬 cDNA (CLONTECH社） を銬型とし、 2個のプライマー、 プライマー 1 (配列番号： 3) およびプライマ一 2 (配列番号： 4) を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DN Aの 10分の 1量を铸型として使用し、 Adv an t a g e 2 Po l yme r a s e M i x (CLONTECH社） 1 Z 50量、 プライマ一 1 (配列番号： 3 ) お よびプライマー 2 (配列番号： 4) を 各 0. 2 M、 dNTP s 200 、 および酵素に添付のバッファーを加え、 25 1の液量とした。 PCR反応 は、 ① 94 · 1分の後、 ② 94°C · 20秒、 72°C · 2分のサイクルを 3 回、 ③ 94°C · 20秒、 65 · 20秒、 68 · 2分のサイクルを 3回、 ④ 94 20秒、 58 : · 20秒、 68 °C · 2分のサイクルを 36回繰り返し 、 ③最後に 68°C · 7分の伸長反応を行った。 該 PC R反応後の反応産物を T Aクローニングキット（ I n V i t r o g e n社）の処方に従いプラスミドべク 夕一 pCR3. 1 ( I n V i t r o g e n社）へサブクロ一ニングした。 これを 大腸菌 DH5 αに導入し、 c DN Αをもつクローンをアンピシリンを含む LB 寒天培地中で選択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白 質共役型レセプタ一蛋白質をコードする cDN A配列 （配列番号： 2) を得た 。 この cDNAより導き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 1を含有する新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を h SLTと命名し、 この形質転換体を大腸 菌 （Escherichia coli) DH5 α/ρ CR 3. 1 _h S LTと命名した。 実施例 2 hSLT発現 CHO細胞の作製
実施例 1で配列が確認されたヒト海馬由来 hSLTの全長アミノ酸配列をコード した遺伝子を導入したプラスミド pCR3.1-hSLTを用いて形質転換をした E. coli DH5a (トーョーボー） を培養し、 Plasmid Midi Kit (キアゲン社） を用いて PCR3.卜 hSLTのプラスミド DNAを調製した。 これを CellPhect Transfection Kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社） を用い添付のプロトコ一ルに従って CH0-K1細胞に導入した。 10 mgのプラスミド DNAをリン酸カルシウムとの共沈懸 濁液とし、 24時間前に 5 X 105または 1 X 106個の CHO- K1細胞を播種した 10 cmシ ャ一レに添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地で 1日間培養した後、 継代 し、 選択培地である 10%ゥシ胎児血清及び lmg/ml G418を含む DMEM培地で培養し た。選択培地中で増殖してくる hSLT発現 CH0細胞のコロニ一 40クローンを選択 した。 さらに、 選択した hSLT発現 CH0細胞から常法に従い全 RNAを抽出した後、 TaqMan法により hSLTの mRNA量を測定 ·コピー数を算出した。 その結果、 発現量 の高い株とし、 3クローン （# 5、 # 7および #28) を選択した。 産業上の利用可能性
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれら の塩、 およびそれらをコードするポリヌクレオチド （例えば、 D NA、 R N A およびそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 ②抗体および 抗血清の入手、 ③組み替え型レセプター蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を 用いたレセプター結合アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング 、 ⑤構造的に類似したリガンド · レセプターとの比較にもとづいたドラッグデ ザインの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプロ一ブゃ P C Rプライマーの作成のた めの試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の 医薬等として用いることができる。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩。
2 . 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3 . 請求項 1記載の蛋白質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを 含有するポリヌクレオチド。
4 . D NAである請求項 3記載のポリヌクレオチド。
5 . 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 3記載のポリヌクレオチ ド。
6 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
7 . 請求項 6記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
8 . 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質を生成せしめ ることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩の製造法。
9 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩 に対する抗体。
1 0 . 請求項 1記載の蛋白質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請 求項 9記載の抗体。
1 1 . 請求項 9記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 2 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を用いることにより得られうる請求項 1記載の蛋白質またはその塩に対する リガンド。
1 3 . 請求項 1 2記載のリガンドを含有してなる医薬。
1 4 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその 塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩に対するリガ ンドの決定方法。
1 5 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 6 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 7 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 8 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
1 9 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハ ィブリダイズするポリヌクレオチド。
2 0 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一部を 含有してなるポリヌクレオチド。
2 1 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴と する請求項 1記載の蛋白質の mR N Aの定量方法。
2 2 . 請求項 9記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質の 定量方法。
2 3 . 請求項 2 1または請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする 請求項 1記載の蛋白質の機能が関連する疾患の診断方法。
2 4 . 請求項 2 1記載の定量方法を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の 蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2 5 . 請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜における 請求項 1記載の蛋白質量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法。
2 6 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 請求項 1記 載の蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩。
2 7 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜にお ける請求項 1記載の蛋白質量を変化させる化合物またはその塩。
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