WO2000012697A1

WO2000012697A1 - KLONIERUNG UND EXPRESSION VON RINDER ESTROGENREZEPTOR-$g(b)

Info

Publication number: WO2000012697A1
Application number: PCT/EP1999/006244
Authority: WO
Inventors: Norbert Walther
Original assignee: Ihf Institut Für Hormon- Und Fortpflanzungsforschung Gmbh
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2000-03-09
Also published as: DE19839115A1

Abstract

Die Erfindung betrifft isolierten Rinder Estrogenrezeptor-β, Isoformen davon sowie Polypeptide, welche die Ligandenbindungsdomäne von Rinder ERβ enthalten. Weiterhin werden für diese Polypeptide kodierende Nukleinsäuren sowie diese Nukleinsäuren enthaltende rekombinante Vektoren und Zellen offenbart. Die Polypeptide, Nulkeinsäuren, Vektoren und Zellen können zur Identifizierung von Liganden für Erβ, insbesondere zur Identifizierung von neuen Arzneimitteln, eingesetzt werden.

Description

Klonierung und Expression von Rinder Estrogenrezeptor-ß

Beschreibung

Die Erfindung betrifft isolierten Rinder Estrogenrezeptor-ß, Isoformen davon sowie Polypeptide, welche die Ligandenbindungsdomäne von Rinder ERß enthalten. Weiterhin werden für diese Polypeptide kodierende Nukleinsäuren sowie diese Nukleinsäuren enthaltende rekombinante Vektoren und Zellen offenbart. Die Polypeptide, Nukleinsäuren, Vektoren und Zellen können zur Identifizierung von Liganden für ERß, insbesondere zur Identifizierung von neuen Arzneimitteln eingesetzt werden.

Das Geschlechtshormon Estradiol übt seine Funktion bei der Genregulation durch Bindung an einen spezifischen intrazelllären Rezeptor aus (Jensen, Ann. NY Acad. Sei. 784 (1996), 1 -17). Dieser Estrogenrezeptor gehört zur Superfamilie der nuklearen Rezeptoren (Tsai und O'Malley, Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 451 -486), von denen viele durch Bindung kleiner lipophiler Liganden aktivierbar sind. Obwohl eine Anzahl von Hormonliganden spezifisch an verschiedene Rezeptorsubtypen bindet, war man viele Jahre lang der Meinung, daß jedes Steroid nur einen einzigen Rezeptorsubtyp besitzt. Vor kurzem wurde jedoch in der Rattenprostata ein zweiter Estrogenrezeptor (ERß) entdeckt (Kuiper et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (1996), 5925-5930). Homologe ERß-Polypeptide wurden aus dem Menschen (Mosselman et al. FEBS Lett. 392 (1996), 49-53) und der Maus (Tremblay et al., Mol. Endocrinol. 1 1 (1997), 353-365) kloniert. Beide Formen des Estrogenrezeptors sind für sich alleine wirksam, sie können jedoch auch Heterodimere miteinander bilden, die an Estrogen-Response- Elemente binden (Pace et al. J. Biol. Chem. 272 (1997), 25832-25838 und Petterson et al., Mol. Endocrinol. 1 1 (1997), 1486-1496). Die Expressions- muster von ERß und ERσ sind unterschiedlich. Darüber hinaus ist die Expression von mehreren Isoformen des ERσ und ERß-Gens bekannt, was zur Komplexität der Expressionskontrolle von Estrogen-regulierten Genen beiträgt. Die Expression von ERσ-lsoformen ist seit langem bekannt (Wang und Miksicek, Mol. Endocrinol. 5 (1991 ), 1707-1715; Murphy et al. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 62 (1997), 363-372). Darüber hinaus wurden vor kurzem auch ERß-lsoformen beschrieben (Chu und Füller, Mol. Cell. Endocrinol. 132 (1997), 195-199; Maruyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (1998), 142-147, Petersen et al., Endocrinology 139 (1998), 1082-1092, und Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 247 (1998), 75-78) . Angesichts der Komplexität bisheriger Resultate zur Expression von ERß-Genen und der Wirkung der ERß-Proteine auf die Genregulation besteht ein großes Bedürfnis, weitere Estrogenrezeptor ß Polypeptide bereitzustellen.

Überraschenderweise konnten aus Rindergranulosazellen mehrere cDNA- Klone erhalten werden, die für verschiedene Rinder ERß Isoformen kodieren und im Reproduktionssystem ein unterschiedliches Expressionsmuster aufweisen. Weiterhin konnte die Transaktivierung heterologer Genexpression durch vollständigen Rinder ERß gezeigt werden, dessen Nukleinsäure und korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 1 und 2 des beiliegenden Sequenzprotokolls gezeigt sind.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft daher einen isolierten Rinderestrogen-Rezeptor ß (ERß) umfassend die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, welches eine Isoform eines Rinder ERß, vorzugsweise eine natürlich vorkommende Isoform ist. Erfindungsgemäße Isoformen zeichnen sich beispielsweise dadurch aus, daß eine oder mehrere funktionale Domänen von Rinder ERß teilweise oder vollständig deletiert sind, beispielsweise die N-terminale Domäne, die DNA-bindende Domäne oder/und die Liganden-bindende Domäne. Spezifische Beispiele sind die in Fig. 2 dargestellten Isoformen ΔLBD, Δ1 1 , Δ21 und Δ31. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid umfassend die Ligandenbindungsdomäne eines Rinderestrogenrezeptor ß entsprechend Position 247 Position 445 in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminoäuresequenz oder eine dazu mindestens 93 %, vorzugsweise mindestens 95 % und besonders bevorzugt mindestens 98 % identische Aminosäuresequenz. Die prozentuale Identität auf Nukleotid- bzw. Aminosäureebene wird dabei wie folgt ermittelt:

n

100

wobei I die Identität, L die Länge der Basissequenz und n die Anzahl an Unterschieden (Substitutionen, Deletionen, Insertionen) zwischen der Basissequenz und der zu untersuchenden Sequenz bedeutet.

Weiterhin umfaßt das erfindungsgemäße Polypeptid eine DNA-Bindungsdomäne, beispielweise eine DNA-Bindungsdomäne, die aus einem nuklearen Rezeptor wie etwa einem ERß oder aber aus einem heterologen nuklearen Rezeptor wie etwa ERσ stammt. Alternativ kann die DNA-Bindungsdomäne auch von anderen Polypeptiden stammen, z.B. Helix-Turn-Helix-Motive, Zinkfinger, basische Leucinzipper (Struhl, TIBS 14 (1989), 137-140).

Ein Beispiel für ein derartiges Polypeptid ist eine Variante des Rinder-ERß, die sich von der in SEQ ID NO.1 und 2 gezeigten Sequenz nur um einen Aminosäureaustausch (Position 7 Asp→Asn) unterscheidet. Die für diese Variante kodierende cDNA weist an 3 Positionen Unterschiede auf (Position 171 G→A, Position 209 T→C und Position 354 C→T). Die entsprechende Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 3 und 4 des beiliegenden Sequenzprotokolls dargestellt.

Die Erfindung betrifft auch eine isolierte Nukleinsäure, die für eines der vorgenannten Polypeptide kodiert. Die Nukleinsäure ist vorzugsweise eine rekombinante Nukleinsäure, z.B. eine rekombinante DNA oder RNA. Besonders bevorzugt ist die Nukleinsäure eine cDNA oder eine genomische DNA.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält, wobei die Nukleinsäure vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz ist. Bei dem Vektor kann es sich um einen prokaryontischen oder eukaryontischen Vektor handeln, der entweder extrachromosomal sein kann oder in das Chromosom einer Wirtszelle integrierbar ist. Vorzugsweise ist der Vektor ein Plasmidvektor. Beispiele für geeignete Vektoren sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, beispielsweise in den Kapiteln 1 bis 4 und 16 bis 17. Dort finden sich auch Hinweise auf geeignete prokaryontische und eukaryontische Expressionskontrollsequenzen, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in entsprechenden Wirtszellen ermöglichen.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert ist. "Transfektion" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß die Zelle die Nukleinsäure oder den Vektor in beliebiger heterologer Form, beispielsweise extrachromosomal auf einem Plasmid oder chromosomal unter Kontrolle einer heterologen Expressionskontrollsequenz enthält. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle sein, z.B. eine gram-negative Bakterienzelle, wie etwa E.coli, sie kann jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, z.B. eine Hefezelle oder eine höhere eukaryontische Zelle, z.B. eine Säugerzelle. Besonders bevorzugt ist die Zelle eine Säugerzelle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Zelle weiterhin eine Reportergen unter Kontrolle einer durch Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids regulierbaren Expressionskontrollsequenz. Das Reportergen kann beispielsweise ein für ein durch visuelle Mittel nachweisbares Protein wie Luciferase, ß-Galactosidase oder Green- Fluorescence-Protein kodierendes Gen sein. Die Expressionskontrollsequenz des Reportergens enthält vorzugsweise ein Element, an das die DNA- Bindungsdomäne eines nuklearen Rezeptors binden kann, beispielsweise ein Estrogen-Response-Element. Durch Cotransfektion einer Zelle mit einem Vektor, der für ein erfindungsgemäßes Rinder ERß Polypeptid kodiert, und einem weiteren Vektor, der für ein durch Expression des Rinder ERß regulierbares Reportergen enthält, können Bindungsuntersuchungen durchgeführt werden. Dabei bringt man die erfindungsgemäße Zelle mit einem potentiellen Liganden für den ERß in Kontakt und bestimmt - indirekt - über die Expression des Reportergens die Bindefähigkeit des Liganden an den Rinder ERß.

Wenn die Expression des Reportergens nach Zugabe des Liganden induziert wird, kann der Ligand als Rezeptoragonist wirken. Wenn die Expression des Reportergens jedoch verringert wird, kann es sich bei dem Liganden um einen Rezeptorantagonisten handeln. Entsprechende Tests mit anderen Steroidrezeptoren sind beispielsweise in WO-A-88 031 68 oder von Tsai et al. (Cell 57 (1989), 443) oder Meyer et al. (Cell 57 (1989), 433) beschrieben.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Polypeptiden, Nukleinsäuren, Vektoren und Zellen wie zuvor beschrieben zur Identifizierung von Liganden für einen ERß und insbesondere zur Identifizierung von ERß-spezifischen Liganden, d.h. von Liganden, die eine differenzielle Bindung an ERß und ERσ zeigen. Somit wird durch die vorliegende Erfindung ein wesentlicher Beitrag zur Identifizierung und Bereitstellung von potentiellen neuen Arzneimitteln insbesondere auf dem Gebiet von mit der Ex- pression von ERß assoziierten Krankheiten, z.B. Prostata- oder Eierstockkrebs, Osteoporose etc. geleistet. Selbstverständlich umfaßt die Erfindung auch die durch Verwendung der beanspruchten Polypeptide erhaltenen neuen Wirkstoffe als unmittelbare Endprodukte des Identifzierungsver- fahrens.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Sequenzprotokolle, Figuren und Beispiele verdeutlicht werden.

Es zeigen:

SEQ ID NO. 1 /2: die Nukleotidsequenz von Rinder ERß cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz,

SEQ ID NO. 3/4: die Nukleotidsequenz einer Variante von Rinder ERß cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz,

SEQ ID NO. 5-25: die Nukleotidsequenzen von Primern,

SEQ ID NO. 26: eine genomische Teilsequenz aus dem 5'-Bereich des

Rinder ERß-Gens.

Fig. 1 die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von vollständigem Rinder ERß. Die Nukleotidsequenz des am häufigsten vorkommenden vollständigen Rinder ERß Transkripts ist zusammen mit der korrespondierenden Aminosäuresequenz des Rinder ERß Proteins gezeigt. Start- und Stopkodon des offenen Leserahmens unterstrichen. Die in Kleinbuchstaben angegebenen Aminosäuren können gegebenenfalls den Leserahmen 5'-seitig des ATG-Kodons verlängern. Die Grenzen der funktionalen Domänen des

ERß Proteins (A bis F definiert durch Homologie mit anderen nuklearen Rezeptoren) sind durch vertikale Striche angezeigt. E bezeichnetdie Ligandenbindungsdomäne und reicht von Nukleotidpo- sition 891 bis 1485. Der Pfeil zeigt das 3'-Ende der Homologie zwischen dem vollständigen Transkript und dem unvollständigen Transkript ΔLBD.

Fig. 2 die Struktur von Rinder ERß-lsoformen. Die Strukturen der klonierten und sequenzierten Rinder ERß-lsoformen sind schematisch gezeigt, wobei sich die Numerierung auf die Nukleotidpositionen des vollständigen Transkripts (siehe Fig. 1 ) bezieht. Die Startpositionen der funktionalen Proteindomänen und die Position des Stopkodons sind in Bezug auf das vollständige Transkript angegeben. Die kursive Zahl bei dem Transkript ΔLBD zeigt das Ende der Homologie mit dem vollständigen Transkript, während die kursiven Zahlen bei den Transkripten Δ1 1 , Δ21 und Δ31 den Beginn und das Ende der jeweiligen Deletion zeigen. Die unterstrichenen Zahlen zeigen die

Positionen der eingeführen Stopkodons, wobei der Stern angibt, daß das entsprechende Stopkodon aus Intronsequenzen stammt. Der schraffierte Bereich zeigt, daß diese Region des Transkripts aufgrund der durch die 5'-Deletion in diesem Klon eingeführten Leserahmenver- Schiebung nicht in ERß-Proteinsequenzen translatiert werden kann.

Fig.3 das Expressionsmuster von zwei Rinder ERß-lsoformen (vollständiges Transkript und ΔLBD) . Die Expression wurde durch RT-PCR in Proben aus Gesamt RNA von Rindergewebe nachgewiesen. Die PCR- Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch Hybridisierung an eine Oligonukleotidsonde identifiziert. Als Kontrolle wurde das Transkript des konstitutiv exprimierten Gens Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase nachgewiesen. GC: Granulosazellen; TC: Thecazellen; CL: Corpus luteum. Fig. 4 die Transkriptionsaktivität von Rinder ERß in einem transienten Transfektionstest. HEK 293 Zellen wurden mit einem Reporterkon- strukt zum Nachweis der Expression von Luciferase transfiziert. Expressionsvektoren für vollständigen Rinder ERß (Δ) die ERß Isoform ΔLBD (V) oder humanem ERσ (o) wurden cotransfiziert. Estradiol wurde den transfizierten Zellen in den angegebenen Endkonzentrationen zugesetzt.

Beispiele

1 .Material und Methoden

1 .1 RNA-Präparation und Primerdesign

Rindergewebe wurden aus einem Schlachthof bezogen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Primäre Rindergranulosa- zellen wurden unter Zusatz von 100 ng/ml Insulin wie von Lioutas et al. (Endocrinology 1 38 (1 997), 5059-5062) beschrieben kultiviert. Gesamt- RNA wurde aus den Geweben und Zellkulturen unter Verwendung des RNA- Clean-System (AGF, Heidelberg, Deutschland) präpariert.

Sequenzen zur Verwendung als Oligonukleotidprimer für eine RT-PCR wurden aus bekannten ERß-Sequenzen ausgewählt und die Primer nach bekannten Methoden synthetisiert. Es wurden die in den Sequenzprotokollen SEQ ID No. 3 bis 21 gezeigten Primer Nr. 1 bis Nr. 19 verwendet.

1.2 Amplifikation und Klonierung von Rinder ERß cDNA-Sequenzen

Die RT-PCR wurde wie von Walther et al., (Exp. Cell. Res. 225 ( 1 996), 41 1 - 421 ) beschrieben durchgeführt. Die optimalen Annealingtemperaturen für die verwendeten Primer mußten - um spezifische Produkte zu erhalten - empirisch ermittelt werden. Zur Klonierung des 5'-Endes der cDNA durch inverse PCR (Zeiner und Gering, BioTechniques 17 (1994), 1051 -1053) und des 3'-Endes durch RACE (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8998-9002) wurde eine Extensionsdauer von 2 min bei 72°C gewählt. Zur Klonierung der ersten partiellen DNA-Sequenz wurden 2 Primerpaare aus der Ratten ERß-Sequenz (Nr. 1 /Nr.2 und Nr. 3/Nr. 4) sequenziell in einer "Nested" RT- PCR eingesetzt. Zur Klonierung von LBD-Sequenzen wurde Primer Nr. 5 von 5'-Rindersequenzen und Primer Nr. 6 aus einer zwischen humanem ERσ und ERß konservierten LBD-Region verwendet. Für das 5'-inverse PCR-Protokoll wurde Primer Nr. 7 für die Reverse Transkripion eingesetzt. Doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert und zirkularisiert und Rinder ERß Sequenzen durch inverse PCR unter Verwendung des Primerpaares Nr. 8/Nr. 9 amplifiziert. Im 3'-RACE Protokoll wurde Primer Nr. 10 für die Reverse Transkription verwendet, gefolgt von einer PCR-Amplifikation von Rinder ERß Sequenzen unter Verwendung des 3'-RACE Primers Nr. 1 1 und 2 Sätzen von 5'-Primem (Nr. 12/Nr. 9 und Nr. 13/Nr. 14) für das Transkript ΔLBD bzw. das vollständige ERß Transkript. Zur Klonierung der vollständigen cDNAs wurde ein gemeinsamer 5'-Primer (Nr. 15) sowie die jeweils transkriptspezifischen 3'-Primer (Nr. 16/Nr. 17) verwendet.

Die RT-PCR-Produkte wurden in den Plasmidvektor pGEM T-Easy (Promega, Mannheim, Deutschland) kloniert. Für transiente Transfektionsexperimente wurden die vollständigen cDNAs in den eukaryontischen Expressionsvektor pRc/CMV (Invitrogen, Leek, Niederlande) subkloniert.

Alle partiellen RT-PCR-Klone sowie die unabhängig erhaltenen vollständigen cDNAs wurden durch die Dideoxysequenzierung analysiert. Für Expressionsuntersuchungen wurden 4μg Gesamt RNA aus verschiedenen Rindergeweben revers transkribiert und Aliquots der Reaktion wurden wie bei Walther et al. ( 1996), supra, beschrieben, unter Verwendung der Primerpaare Nr. 5/Nr. 18 für das vollständige Transkript und Nr. 5/Nr. 19 für das Transkript ΔLBD amplifiziert. PCR-Reaktionen zum Nachweis des konstitutiv exprimier- ten Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gens wurden wie von Bathgate et al., (Biol. Reprod. 55 ( 1 996), 1452-1457) beschrieben, durchgeführt.

1 .3 Transiente Transfektionsuntersuchungen

HEK 293 Zellen wurden von der European Collection of Cell Cultures (Nr. 85 1 20 602) bezogen. Für transiente Transfektionsexperimente wurden die Zellen in 1 2-Lochplatten (Costar, Bodenheim, Deutschland) in einer Dichte von 75.000 Zellen/Loch ausgesät. Üblicherweise wurde ein Steroid-Mangel Kulturmedium verwendet (DMEM ohne Phenolrot unter Zusatz von 10 % Kohle-behandeltem Serum; Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) . Da die Zellen in diesem Medium sehr schlecht wuchsen, wurden die Transfek- tionen unter Verwendung von normalen Kulturmedium unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) wiederholt.

Die Zellen wurden durch Calciumphosphat-Copräzipitation unter Verwendung des Profection Mammalian Transfection System (Promega, Mannheim, Deutschland) transfiziert. Ein Estrogen-Response-Element (ERE)-enthaltendes Luciferase-Reporterplasmid wurde durch partielles Ersetzen von Rinderoxy- tocin Promotorsequenzen (Walther et al., J. Neuroendocrinol. 3 (1 991 ), 539-549) durch homologe Rattensequenzen mit einem bekannten ERE (Burbach et al., J. Neuroendocrinol. 2 ( 1 990), 633-639; Mosselman et al., FEBS, Lett. 392 (1 996), 49-53) und Einfügen dieser 1 80 bp langen Promotorsequenzen in das pGL2 Luciferasekonstrukt (Promega, Mannheim, Deutschland) hergestellt. 1 ,6 μg dieses Reporterkonstrukts wurden zusammen mit 1 ,6 μg der zuvor beschriebenen Expressionskonstrukte oder eines inaktiven Kontrollplasmids sowie 0,8 μg eines ß-Galactosidase- Kontrollvektors in jeweils drei Ansätzen in die Zellen kotransfiziert. 24 bis 28 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Luciferase- und ß- Galactosidaseaktivität nach der Methode von Rust et al. (J. Mol. Endocrinol. 21 ( 1 998), 1 89-1 99) bestimmt. 1.4 Klonierung einer genomischen Rinder ERß DNA

Eine inverse PCR an genomischer Rinder DNA wurde unter Verwendung eines 5'-Primers GCTAGTCATGCTTACTGGTC und eines 3'-Primers GTAGGATGGATTGACCGCAG durchgeführt (SEQ ID NO. 24 und 25). Die genomische Sequenz wurde durch eine unabhängige genomische PCR mit einem 5'-Primer aus dem neu klonierten genomischen Bereich bestätigt.

2. Ergebnisse

2.1 Klonierung von Rinder ERß Isoformen aus Granulosazellen

Mehrere cDNA Klone mit Transkripten des Rinder ERß Gens wurden durch eine Kombination unterschiedlicher RT-PCR-Strategien aus in Gegenwart von Insulin kultivierten Granulosazellen kloniert.

Zuerst wurden Primer aus der Ratten ERß cDNA Sequenz verwendet, um eine partielle Rinder cDNA mit der DNA-Bindungsdomäne (DBD) durch Nested RT-PCR zu amplifizieren. Aus der Sequenz dieses partiellen Rinderklons wurden Primer zur Klonierung der 5'- und 3'-Enden durch inverse PCR und RACE-Protokolle gewonnen. Dabei wurde gefunden, daß der durch inverse PCR identifzierte Klon sich weiter 5'-seitig erstreckt als die kodierende Region, die ursprünglich für die ERß Gene aus Ratte, Mensch und Maus beschrieben worden war. Allen durch eine direkte 3'-RACE Methode erhaltenen Klone fehlten die 3'-ERß Sequenzen.

Die ein Stopkodon in den Leserahmen einführende Sequenz ist homolog zu Teilsequenzen aus dem Intron H-L1 (Enmark et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 82 (1997), 4258-4265). Um das 3'-Ende des vollständigen Transkripts zu klonieren, mußte daher ein 3'-Primer verwendet werden, der aus einer zwischen ERσ und ERß konservierten Region der Ligandenbindedo- mäne (LBD) stammt, um eine partielle cDNA mit LBD-Sequenzen zu amplifizieren. Aus diesen Sequenzen wurden 5'-Primer zur Verwendung im 3'-RACE Protokoll erhalten.

Es wurden zwei Arten von Klonen erhalten, die identische Sequenzen innerhalb der für ERß 3'-kodierenden Region enthielten, sich aber in der 3'- nichtkodierenden Region unterschieden. Die komplette Sequenz des vollständigen Transkripts ist in Fig. 1 gezeigt. Das vollständige Transkript umfaßt einen offenen Leserahmen von 1422 Nukleotiden, wobei das erste Methionin an Position 153 dem durch Homologie zu Sequenzen aus der Ratte, dem Menschen und der Maus vermuteten Startkodon entspricht. Der Translationsstart kann jedoch weiter stromaufwärts liegen, da die 5'-seitig des ersten Methioninrests gelegene Sequenz homolog mit zusätzlichen 5'- Sequenzen ist, die kürzlich für das humane Gen beschrieben wurden (Ogawa et al., Biochem. Biophys. Rev. Commun. 243 (1998), 122-126).

Die Aminosäuresequenz von Rinder ERß hat eine relativ hohe Homologie zu den bekannten Sequenzen aus der Ratte und dem Menschen. In der N- terminalen Domäne (Nukleotidposition 153-428) ist der Homologiegrad 85%, in der DNA-Bindedomäne (429-626) 100 % in der Hinge-Region (627- 890) 94 %, in der Liganden-bindenden Domäne (LBD) und der C-terminalen Domäne (891 -1574) 93 %, wobei die Berechnung der Homologie auf Aminosäureebene und gegen die Konsensus-Sequenz von Mensch- und Ratten-ERß erfolgt. Ein die LBD nicht enthaltendes Transkript (ΔLBD) zeigte eine perfekte Homologie mit dem vollständigen Transkript bis zum Exon- Intron-Übergang an Position 936. Durch die Intronsequenzen wird jedoch ein Stopkodon 12 Nukleotide 3'-seitig des Übergangs eingeführt.

Die Amplifikation von partiellen ERß cDNA-Sequenzen aus verschiedenen Rindergeweben zeigte das Vorhandensein zusätzlicher Isoformen. Klonierung und Sequenzierung dieser cDNAs ergab, daß diese Isoformen große Deletionen enthielten. Klon Δ1 1 enthielt eine Deletion der Nukleotide 637 bis 936, so daß dem Protein ein großer Teil der Hinge-Region und der N-terminale Abschnitt der LBD fehlt. Klon Δ21 zeigt dieselbe Deletion wie Δ1 1 , aber zusätzlich eine Deletion der Nukleotide 347 bis 519. Die resultierende Leserahmenverschiebung führt einen Stopkodon in den Leserahmen an Position 524 der vollständigen cDNA ein, so daß ein kurzes Protein entsteht, welches nur aus Sequenzen der N-terminalen Domäne besteht. Klon Δ31 enthält eine große Deletion (Nukleotide 388 bis 924), wobei ein Protein entsteht, dem die DBD und die Hinge-Region vollständig fehlen. Die Gesamtstruktur der vollständigen ERß-Transkripte ist in Fig. 2 gezeigt. Mit Ausnahme der Deletion in Klon Δ31 können alle Deletionen durch alternatives Splicing entstehen. Die Mengen der einzelnen Transkripte variieren über einen weiten Bereich. Während das Transkript ΔLBD in relativ hohen Mengen vergleichbar mit dem vollständigen Transkript exprimiert wird wird, können andere deletierten Transkripte durch RT-PCR nur als schwache Banden nachgewiesen werden.

2.2 Gewebespezifische Expression von Rinder ERß Isoformen in Reproduktionsgeweben

RNA-Proben aus verschiedenen Geweben des Rinderfortpflanzungssystems und verschiedenen Kontrollgeweben sowie aus in vitro kultivierten Rindergranulosa- und Thecazellen wurden auf Expression des vollständigen ERß-Transkripts und der Isoform ΔLBD durch RT-PCR analysiert. Expression des vollständigen ERß Transkripts kann in allen untersuchten Reproduktions- und Kontrollgeweben mit Ausnahme des Seminalvesikels nachgewiesen werden. Im Corpus luteum, insbesondere während der Schwangerschaft, findet man eine signifikante Verringerung der Expression. Ein vollständiges Abschalten der Expression sowohl des vollständigen Transkripts als auch des Transkripts ΔLBD erfolgt im Endometrium während der lutealen Phase. 2.3 Transkriptionelle Transaktivierung durch Rinder ERß

Zur Untersuchung der Transaktivierungsaktivität der klonierten Rinder ERß Isoformen wurden transiente Transfektionsuntersuchungen durchgeführt (Fig. 4). Diese Experimente zeigen, daß vollständiger Rinder ERß die Estrogen-abhängige Transkription eines ERE Reporterkonstrukts aktivieren kann. Geringe Konzentrationen von Estradiol, die mit denen zur Aktivierung von ERσ vergleichbar sind, führen zu einer maximalen Transaktivierungsaktivität von Rinder ERß (drei- bis vierfache Erhöhung gegenüber der basalen Transkriptionsstärke) . Ein direkter Vergleich von Aktivierungskurven zeigte, daß in diesem Experiment die maximale Höhe der ERß-vermittelten transkriptioneilen Aktivierung signifikant geringer als diejenige von humanem ERσist. Die ERß Isoform ΔLBD zeigt keinerlei Transaktivierung in diesem Test.

2.4 Identifizierung einer Rinder ERß-Variante

Bei Klonierung der Rinder ERß cDNA durch RT-PCR wurde neben der in SEQ ID NO. 1 /2 dargestellten Sequenz auch eine Variante davon erhalten, deren Nukleotid- und Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellt ist. Die Unterschiede beider Varianten bestehen in drei Basenaustauschen, von denen zwei stumme Mutationen sind, während eine zu einem Aminosäureaustausch führt.

Die in SEQ ID NO. 26 gezeigte genomische Sequenz enthält eine 5'- Extension des in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 3 dargestellten offenen Leserahmens. Durch diese δ'-Extension des Leserasters ergeben sich zwei ATG-Kodons und ein TAG-Stopkodon, so daß das zweite ATG das mutmaßliche Startkodon darstellt. Bei in vitro Translation im Kaninchen- Reticulozytensystem des 5'-verlängerten ERß Klons wurde jedenfalls ein Protein mit entsprechender Größe erhalten. 2.5 Genomische Rinder ERß-DNA

Die durch genomische PCR identifizierte Sequenz ist in SEQ ID NO. 26 dargestellt. Das 3'-Ende dieser Sequenz entspricht Nukleotid 43 in SEQ ID NO. 1 . Abschnitte dieser genomischen Sequenz können für die Regulation der Expression von Rinder ERß verantwortlich sein und sind daher ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ebenso wie Varianten dieser Sequenz, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press ( 1 989), 1 .101 -1 .104 definiert und bedeuten, daß ein positives Hybridi- sierungssignal nach Waschen für 1 h mit 1 x SSC Puffer und 0, 1 % SDS bei 55 °C, vorzugsweise bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68 °C und insbesondere für 1 h in 0,2 x SSC Puffer und 0, 1 % SDS bei 55 °C, vorzugweise bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C gefunden wird.

Claims

Patentansprüche

1 . Isolierter Rinder Estrogenrezeptor ß umfassend die in SEQ ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz.

2. Isoliertes Polypeptid, welches eine Isoform eines Rinder Estrogenrezeptor ß nach Anspruch 1 ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 2 ausgewählt aus der Gruppe der in Fig. dargestellten Isoformen ΔLBD, Δ1 1 , Δ21 und Δ31 .

4. Isoliertes Polypeptid umfassend die Ligandenbindungsdomäne eines Rinder Estrogenrezeptor ß entsprechend Position 247 bis 445 der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder eine dazu mindestens 93 % identische Aminosäuresequenz.

5. Polypeptid nach Anspruch 4 weiterhin umfassend eine DNA-Bindungsdomäne.

Polypeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Bindungsdomäne aus einem nuklearen Rezeptor stammt.

Isolierte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, die eine cDNA oder eine genomische DNA ist.

9. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 enthält.

10. Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz ist.

1 1 . Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder einem Vektor nach Anspruch 9 oder 10 transfiziert ist.

12. Zelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein Reportergen unter Kontrolle einer durch Expression des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 regulierbaren Expressionskontrollsequenz enthält.

13. Zelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen ein für Luciferase, ß-Galactosidase oder Green Fluorescence Protein kodierendes Gen ist.

14. Zelle nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz des Reportergens ein Element enthält, an das die DNA-Bindungsdomäne eines nuklearen Rezeptors binden kann. 1 o

15. Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz des Reportergens ein Estrogen- Response-Element enthält.

16. Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 7 bis 8, Vektoren nach einem der Ansprüche 9 bis 10 und Zellen nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14 zur Identifizierung von Liganden für ERß

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Identifizierung und Bereitstellung von ERß-spezifischen Liganden.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17 zur Identifizierung und Bereitstellung von neuen Arzneimitteln.

19. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO. 26 gezeigten Sequenz oder eine damit unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz.