Vorrichtung und Verfahren zum Bestimmen von Abständen und ein zugehöriges Nanodosiersyste
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Bestimmen von Abständen, wobei die Vorrichtung insbesondere als Näherungssensor verwendbar ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Nanodosiersystem, das eine Vorrichtung zum Bestimmen von Abständen im Nanometerbereich aufweist, bzw. ein entsprechendes Verfahren einsetzt. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Gebiet von Biosensoren mit optischen Transducern.
In dem Artikel Chemo- und Biosensoren mit optischen Transducern, Günter Gauglitz, TM, Technisches Messen, 62 (1995) Seiten 204 bis 212 werden optische Sensoren zur Untersuchung von chemischen oder biologischen Proben beschrieben. Es werden optische Meßprinzipien, wie Absorption, Fluoreszenz und Reflexion erläutert. Insbesondere werden optische Sensorprinzipien vorgestellt, die auf Evaneszent-Feldtechniken beruhen, wie Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (surface plasmon resonance, SPR) oder bei denen eine abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflectance, ATR) oder Interferenzkontrast auftrit . Weiterhin werden Reflexionsinterferenz -Verfahren vorgestellt. Zudem werden Beispiele optischer, chemischer und biochemischer Sensoren der jeweils verwendeten Methode und für entsprechende Anwendungen beschrieben.
Optische Biosensoren beruhen in der Regel darauf, daß an eine optische Meßoberfläche Partikel wie Moleküle, Bakterien, Viren und ähnliches gebunden werden. Die Bindung erfolgt in der Regel über eine Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung, wobei die optische Schichtdicke insbesondere der Brechungsindex eines dünnen Filmes auf der Meßoberfläche verändert wird. Diese Veränderung wird über ein optisches Verfahren nachgewiesen, wobei das optische Signal der Anzahl von an der Oberfläche gebundenen Analyt-Partikeln entspricht. Auf diese Weise ist es möglich, die Assoziationsgeschwindigkeit und die
Dissoziationsgeschwindigkeit, die Bindungsstärke und die Konzentration der bindenden Partner zu zeigen.
Es sind verschiedene Verfahren bekannt, eine Flüssigkeit in einem optischen Biosensor an der optischen Meßoberfläche anzukoppeln. Ein erstes Verfahren betrifft ein Küvettensystem, in dem eine Kammer oder ein Topf verwendet wird, bei dem eine Seitenwand oder der Boden die Sensoroberfläche bildet. Ein zweites Verfahren betrifft ein Flußsystem, bei dem über Flußkanäle die Flüssigkeit an der Meßoberfläche vorbeigepumpt wird. Dabei wird häufig ein flow injection-analysis-Verfahren verwendet, und die Flüssigkeit wird häufig in einer Flüssigkeitsschleife über die Meßoberfläche geführt.
Wie vorstehend beschrieben, wird eine Oberflächen-Bindungsreaktion als sensorische Reaktion verwendet. Dabei ist das Ausmaß der Bindung in der Nähe der Oberfläche abhängig von der Konzentration der bindenden Moleküle, die für eine Bindung innerhalb der Bindungsreichweite der funktioneilen Gruppen, die auf dem Sensorsystem immobilisiert sind, zur Verfügung stehen. Haben sich aufgrund vorangegangener Bindungsereignisse Moleküle oder größere Partikel aus der Flüssigkeit bereits an die Oberfläche gebunden, tritt lokal in unmittelbarer Nähe der Oberfläche (bis 1-10 μm) eine Verarmung (depletion) oder ein Konzentrationsgefälle auf, weiches die weitere Messung verfälscht . Insbesondere wenn kinetische Phänomene gemessen werden sollen, werden nicht die Reaktionsgeschwindigkeiten, sondern die Diffusion oder die Massentransport limitierte Bindungskinetik ("Massentransport limitierte Diffusion") gemessen. Folglich werden die vom Sensor gemessene kinetische Konstante und Affinität nicht die tatsächlichen Verhältnisse wiedergeben, bei denen die Bindung zwischen Molekülen, die in einer Flüssigkeit gut vermischt sind, stattfindet. Beim üblichen Mischen wie z.B. Rühren oder Mikrodurchflußsystem, liegt in der Nähe der Meßoberfläche in der Regel ein laminarer Flüssigkeitsstrom vor und aufgrund von Newton-Reibung findet keine ausreichende Durchmischung
statt, um eine Verarmung zu vermeiden. Die Messung ist auf Massentransportkinetik beschränkt .
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Abstände zwischen einem Objekt und der Meßoberfläche bestimmbar sind und ein Nanodosiersystemsystem bereitzustellen, bei dem die Bildung von Verarmungszonen vermieden wird.
Diese Aufgabe wird gelöst mit den Merkmalen der Patentansprüche .
Die Erfindung geht von dem Grundgedanken aus, mit einer Sensoreinheit bei oberflächengebundenen Analysesystemen im Bereich des testenden Feldes eine Meßgröße zu bestimmen, die dem mittleren Brechnungsindex entspricht. Dieser mittlere Brechungsindex ergibt sich zum einen durch den Brechungsindex des Mediums, das der Transduceroberflache benachbart ist und zum anderen durch ein in der Nähe der Transduceroberflache angeordnetes Objekt, das aus einem Material besteht, dessen Brechungsindex von dem Brechungsindex des Mediums verschieden ist. Mit einer Auswerteeinrichtung, die mit der Sensoreinheit verbunden ist, wird eine Änderung der dem mittleren Brechnungsindex entsprechenden Meßgröße detektiert, die durch Annähern des Objekts an die Transduceroberflache hervorgerufen wird.
Die Erfindung ist anwendbar für alle optischen Meßprinzipien, bei denen eine Brechungsindexänderung benachbart zu einer Transduceroberflache auftritt, wenn ein Objekt benachbart zur Transduceroberflache angeordnet wird. Dabei kann die gewonnene Meßgröße zur Ermittlung des numerischen Wertes des mittleren Brechungsindexes verwendet werden, beispielsweise durch Kalibration der Meßgröße.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zum einen eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von Abständen eines Objekts von einer Transduceroberflache im Nanobereich. Bei
optischen Meßsensoren, die sichtbares Licht verwenden, ist die Bestimmung von Abständen im Bereich von ca. 0 bis 500 nm möglich. Bei Verwendung von elektromagnetischer Strahlung größerer Wellenlängen ist dieser Abstand entsprechend größer. Vorzugsweise werden evaneszente optische Felder eingesetzt zur Messung von mittleren Berechnungsindices in dem Raum oberhalb einer Meßoberfläche, in dem das evaneszente Feld genügend empfindlich auf Änderungen des Brechungsindex reagiert. Bevorzugt werden Methoden wie Oberflä- chenplasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR) , das Meßprinzip der abgeschwächten Totalreflexion (attenuated total reflectance, ATR) und Interferenzkontrast.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Nutzung der Vorrichtung bzw. des Verfahrens zur Abstandsbestimmung beim Formen von sehr kleinen Volumina in Systemen, in denen evaneszente Felder oder auch andere Detektionsprinzi- pien, wie insbesondere Reflexionsinterferenz zur oberflächengebundenen Analyse von Proben verwendet werden. Dabei wird das Volumen durch Einsatz des erfindungsgemäßen Prinzips zur Abstandsmessung in einer Dimension senkrecht zur Sensoroberfläche kontrolliert und kann so eingestellt werden. Insbesondere können kleinste Abstände bzw. optimale Abstände im Nanobereich eingestellt werden. Mit der Erfindung sind Nanodosiersysteme realisierbar. Ein zentraler Vorteil des erfindungsgemäßen Nanodosiersystems ist, daß es aus beweglichen Teilen besteht, die insbesondere zum Zwecke der Reinigung ohne Probleme voneinander entfernt werden können, um dann anschließend wieder in die Sollposition bewegt zu werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Nano- dosiervolumen gebildet, in dem ein Objekt:, das vorzugsweise plattenförmig ist, oder ein Objekt mit einer Fläche, die der Sensoroberfläche zugewandt ist, und das im Hinblick auf einen optimalen Analyttransport zu der Sensoroberfläche oder zu dem Meßpunkt auf der Oberfläche des Sensors geformt wurde, um die Flußcharakteristika zu optimieren, in der Nähe der
Transduceroberflache derart angeordnet wird, daß ein Volumen entsteht, durch das die zu untersuchende Flüssigkeit geleitet wird. Mit dem erfindungsgemäßen Detektorsystem lassen sich kleinste Abstände und damit geringe Höhen des Volumens im Nanometerbereich einstellen. Vorzugsweise wird dieses Nanodosiervolumen von Seitenwänden begrenzt, so daß ein Einlaß und ein Auslaß für die zu untersuchende Flüssigkeit bereitgestellt wird.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird das Nanodosiersystem durch eine Dosiereinrichtung vorzugsweise in Form einer Pipettenspitze realisiert, wobei die Dosiereinrichtung nahe an der Transduceroberflache angeordnet werden kann. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Detektorsystems können kleine Abstände zwischen der Pipettenspitze und der Transduceroberfäche eingestellt werden. Mit diesem Nanodosiersystem ist es möglich, Probenmaterial direkt an die Transduceroberflache zu applizieren.
Die Antriebsvorrichtung für das Bewegen der Teile weist vorzugsweise Systeme auf, mit denen Bewegungen mit genügend hoher Auflösung möglich sind. Beispielsweise werden Schrittmotoren unter Verwendung von Microsteps und/oder Piezotransla- toren eingesetzt. Dabei kann beispielsweise eine Kombination aus einem Schrittmotor für einen Feinantrieb und einem Pie- zotranslator für einen Feinstantrieb verwendet werden.
Mit dem erfindungsgemäßen System wird die Bildung von Verarmungszonen vermieden bzw. erheblich vermindert. Bei den bekannten Verfahren entstehen Verarmungszonen dadurch, daß die zu analysierenden Moleküle aus der Probe an die Sensoroberfläche gebunden werden, damit also aus einer oberflächennahen Schicht der Probe entfernt werden und ein Transport von weiteren Molekülen aus weiter entfernten Bereichen der Probe durch Diffusion nicht so schnell erfolgt, wie die Bindug an die Oberfläche. Dieses Problem tritt bei "stationären" Probenzuführungssystemen wie Küvetten aber auch bei Mikrofluß- systemen auf, wenn die Dimension der Mikroflußkammer senk-
recht zur Oberfläche im Mikrometerbereich liegt und die Flüsse parallel zur Oberfläche ausgerichtet sind. Es läßt sich auch nicht dadurch überwinden, daß die Probe mit einem Geschwindigkeitsvektor senkrecht zur Oberfläche dosiert wird, wenn sich die Dosieröffnung im Mikrometerbereich oberhalb der Oberfläche befindet. Erst der Einsatz des erfindungsgemäßen Nanodosiervolumens bzw. die Dosierung aus einem Dosiersystem, dessen Dosieröffnung weniger als 1 μm von der Oberfläche befindet, überwindet das Verarmungs-Problem.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Bestimmen von Abständen und das zugehörige Verfahren ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung einsetzbar beim Mischen einer Flüssigkeit mit Hilfe von Mischkörpern. Diese Misch- körper können durch Anlegen eines äußeren Feldes, insbesondere eines Magnetfeldes oberhalb der Transduceroberflache bewegt werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Detektorsystems sind die Bewegungen der Mischkörper, insbesondere des Abstands der Mischkörper von der Transduceroberflache bestimmbar. Vorzugsweise werden als Mischkörper Mischkügelchen (beads) eingesetzt. Alternativ werden als Mischkörper ein Netz (oder eine Membran) eingesetzt. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, daß im Nanometerbereich oberhalb der Transduceroberflache die Flüssigkeit gemischt und die Bildung von Verarmungszonen vermieden werden kann.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels und der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Teils einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und
Fig. 3 eine schematische Ansicht eines Teils einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 1 zeigt den Prinzipaufbau eines Biosensors mit optischen Transducer, der bei dem vorliegenden Beispiel als Oberflächenplasmonenresonanzsensor ausgebildet ist . Im einzelnen weist die Meßanordnung einen optischen Transducer 10 auf, der in dem gezeigten Beispiel als Prisma mit einer Transduceroberflache 12 ausgebildet ist. Von einer Lichtquelle 14 wird Licht in das Prisma eingeleitet und im Bereich der Transduceroberflache eine Oberflächenplasmonenresonanz angeregt, wobei das reflektierte Licht von einer Detektoranordnung 16 empfangen wird. Das Ausgangssignal der Detektoreinrichtung wird an eine Auswerteeinrichtung 40 geleitet. Auf der Transduceroberflache ist eine Küvettenanord- nung 20 mit mindestens einer Küvette zur Aufnahme einer zu untersuchenden Flüssigkeit angeordnet. Dabei wird in dem gezeigten Beispiel der Boden 22 der Küvette von einem Teil der Transduceroberflache 12 gebildet. Fig. 1 zeigt ferner ein im Abstand von der Transducerober lache angeordnetes Objekt 32. Das Objekt 32 ist an einem Halter 34 angeordnet, der mit einer Antriebseinrichtung 36 verbunden ist. Mit Hilfe der Antriebseinrichtung ist das Objekt 32 höhenverstellbar und kann bis dicht an die Transduceroberflache mit hoher Präzision herangefahren werden. Mit Hilfe der Sensoreinheit, die aus der Lichtquelle 14, dem optischen Transducer 10 und der Detektoranordnung 16 gebildet wird, wird der Brechungsindex eines Mediums, das der Transduceroberflache benachbart ist, bestimmt. Innerhalb der Reichweite des evaneszenten Feldes, das ausgehend von der Transduceroberflache in den Raum innerhalb der Küvette hineinreicht, wird ein mittlerer Brechungsindex bestimmt. Ein Objekt, das an die Transducerober- fläche herangefahren wird, und in den Bereich des evaneszenten Feldes gelangt, führt zu einer Veränderung des mittleren Brechungsindexes. Diese Änderung des Brechungsindexes wird von der Detektoranordnung detektiert und von der Auswerteeinrichtung 40, die mit der Sensoreinheit verbunden ist, ausgewertet .
Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung ist als Näherungssensor verwendbar, wobei eine Annäherung eines Objekts an die
Transduceroberflache eine Signaländerung bewirkt, die von der Auswerteeinrichtung erfaßt wird. Durch Kalibrieren der Meßvorrichtung, d.h. entsprechendes Auswerten eines Meßsignals abhängig von der Position des Objekts in bezug auf die Transduceroberflache können mit der Vorrichtung Abstände bestimmt werden. Bei Verwendung einer präzisen hochauflösenden Antriebseinrichtung 36, beispielsweise ein Schrittmotor mit Microsteps kann der Halter 34 mit dem daran angeordneten Objekt 32 hochgenau gegenüber der Transduceroberflache 12 angeordnet werden.
Die erste bevorzugte Ausführungsform von Fig. 2 zeigt den schematischen Aufbau eines Nanodosiervolumens 50. Das Nanodosiervolumen 50 wird in dem Raum zwischen der Transduceroberflache 12 bzw. dem Küvettenboden 22 und dem Objekt 32 gebildet. In dem Beispiel ist ein plattenförmiges Objekt 32 gezeigt, dessen Unterseite im wesentlichen parallel zur Transduceroberflache 12 angeordnet ist. In einer alternativen Ausführungsform (nicht dargestellt) wird das plattenförmige Objekt mit Hilfe von drei Antrieben und drei Haltern, die die Platte an beabstandeten Stellen halten, selektiv in der Höhe verstellt. Außerdem werden an vorzugsweise drei Meßflecken die jeweiligen Abstände zwischen Referenzpunkten an der Unterseite des Objekts und der Transduceroberflache 12 bestimmt. Dies hat den Vorteil, daß die Plattenunterseite definiert z.B. parallel zur Transduceroberflache ausgerichtet werden kann. Das Nanodosiervolumen 50 hat einen Einlaß 52 und einen Auslaß 54. Das Nanodosiervolumen wird außerdem begrenzt von zwei Seitenwänden 56, wobei in Fig. 2 nur die rückwärtige Seitenwand 56 gezeigt ist. Durch ein entsprechendes Einstellen der Lage des Objekts 32 mit Hilfe der Antriebseinrichtung wird das Objekt in den Bereich zwischen die Seitenwände 56 hineingefahren. Nach dem erfindungsgemäßen Prinzip kann bei optischen Meßsensoren, die sichtbares Licht verwenden, das Nanodosiervolumen 50 mit einer Höhe im Bereich von 0 bis etwa 500 nm ausgebildet werden. Mittels einer Einrichtung zum Einleiten einer Flüssigkeit (nicht dargestellt)
zum Einlaß 52 bzw. zum Absaugen der Flüssigkeit am Auslaß 54 wird dieser über die Meßoberfläche geleitet.
Bei der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform der Erfindung ist das Objekt eine Pipettenspitze 62, die wie das Objekt 32 mit einer Antriebseinrichtung 36 höhenverstellbar ist. Zwischen dem Ende der Pipettenspitze und der Transduceroberflache wird ein Raum 60 gebildet, in dem über eine Dosiereinrichtung Flüssigkeit mit Probenmaterial eingeleitet werden kann, wobei mit Hilfe der Dosiereinrichtung Probenmaterial direkt an die Detektoroberfläche appliziert wird. Diese Anordnung bildet einen Spezialfall eines Nanodosiersystems .
Die vorstehende Beschreibung ist nur beispielhaft, wobei Modifikationen ohne weiteres möglich sind. Insbesondere kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Bestimmen von Abständen eine Bestimmung der Position von Mischkörpern in einer Küvette vorgenommen werden. Zum Mischen mit Mischkörpern, wie Mischkugeln oder Netzen werden diese in die Küvette eingebracht und deren Lage über die Bestimmung des mittleren Brechungsindexes detektiert .