WO2000011190A2 - UDP-N-AZETYL GLUKOSAMINYL: β1,4 GALAKTOSID: β1,3N-AZETYL GLUKOSAMINYL TRANSFERASE (POLYLAKTOSAMINYL TYP) - Google Patents

UDP-N-AZETYL GLUKOSAMINYL: β1,4 GALAKTOSID: β1,3N-AZETYL GLUKOSAMINYL TRANSFERASE (POLYLAKTOSAMINYL TYP) Download PDF

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Eric G. Berger
Thierry Hennet
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Berger Eric G
Thierry Hennet
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • UDP-N-acetylglucosaminyl ßl, 4 galactoside: ßl 3N-A_zetylducosaminevitransferase (polylactosaminyl type)
  • the present invention relates to area C (chemistry, metallurgy).
  • the invention relates to the field of biotechnology and recombinant DNA technology.
  • the invention relates to the cloning of a nucleic acid which codes for a novel glycosyltransferase.
  • the glycosyltransferases belong to the class of enzymes which are involved in the glycosylation mechanisms. These are among the most important biosynthetic properties of the living cell and are primarily involved in post-translational changes in proteins.
  • the nucleic acids according to the invention also affect the synthesis of the glycosaminoglycans (or, synonymously, proteoglycans).
  • the invention relates to a family of similar DNA 'sequences (nucleic acids), one of which has the specificity which it together with a ⁇ 1, 4galactosyltransferase (Almeida, R et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 31979-91; Sato T., et al, Proc Natl Acad Sei USA 1998, 95, 472-7, Sato T. et al, Biochem. Biophys Res. Commun 1998, 244, 637-641) for the synthesis of polylactosaminoglycans or keratan capable.
  • the invention relates to the gene, the in vitro derived cDNA, DNA constructs with similar activity, recombinant plasmids containing this gene or cDNA, as well as production plasmids for the production of the recombinant enzyme with the aid of transfection and transformation, and all methods for Identification of pofymorphisms in humans and animals and the production of antisense polynucleotides and so-called targeting vectors for the production of genetically modified animals
  • DNA stands for Acid, deoxyribonucleic acid State of the art
  • Ghcosylation is one of the most important post-translational changes in the covalent protein structure. It begins after the actual ribosomal protein synthesis and the translocation of the newly formed protein into the endoplasmic reticulum by the transfer of a preferred oligosaccharide (Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 ) 2 to the protein.
  • glycosylation This mechanism, which has evolved from baker's yeast to is very similar to the human organism and is described in detail in the literature under the term / glycosylation (Glycoproteins, Montreuil J, Ventethart, JFG & Schachter, H, Hsg, Elsevier, Lausanne, 1995), forms the preliminary stage for the glycosylation process , which takes place in the Golgi apparatus, the so-called ⁇ -glycosylation also takes place in the Golgi apparatus.
  • the glycosylation processes in the Golgi apparatus lead to the formation of specific glycan structures, which are involved in numerous biochemical and physiological phenomena (Varki, A, Glycobiology 1993, 3, 97-130).
  • polylactosaminoglycans have also been found in pathological processes, such as in the viral transformation of cells (Kobata A in Glycoproteins and Disease, Montreuil J, Ventethart. JFG & Schachter, H, Hsg, Elsevier, Lausanne, 1996, pp. 21 1-227) and in carcinogenesis (Yamashita K. &. Kobata A, ibidem, S 1 7-210) malignant transformed cells acquire novel adhesion and recognition properties in combination with other cells (metastatic
  • Glc 3 Man, GlcNAc is called GhikosesMannose ⁇ ⁇ '-azet lglukosainin;
  • Glycan-selectin interactions play a crucial role in the development of inflammation. It has been described that leukocytes contain a glycoprotein (PSGL-1) 4 , which has a certain O-glycosidic structure and contains polylactosaminoglycans (Liu, W et al, J Biol Chem 1998, 273, 7078-7087) These are involved in the recognition of the P-selectin on the endothelial surface of the vessels that supply the inflamed area (McEver, R. and Cummings, RD, J Clin. Invest. 1997, 100, 485-492 ⁇ , which is why some pharmaceutical companies are focusing their efforts in the field of this interaction with the aim of developing specific inhibitors
  • PSGL-1 stands for P-Sclectin Gl> koprotc ⁇ n L ⁇ gand-1 Description of the invention
  • the present invention describes the isolation of human and murine DNA which codes for the UDP- ⁇ ' -acetylglucosaminyl: ⁇ 1.4 galactoside ⁇ 1.3 / V-acetylglucosaminyltransferase (polylactosaminyl type, hereinafter referred to as 3GnT) with the associated code cDNA and genomic DNA.
  • the specificity of the enzyme relates to the donor substrate (UDP-N-acetylglucosamine) and the acceptor substrate jV-acetyllactosamine and all glycoconjugates that expose this structure terminally.
  • the complete nukeotide sequence is shown in Fig. 1.
  • a first embodiment of the invention relates to the nucleotide sequence of the human variant nucleotide 1 to 990 (Seq ED No. la), which is referred to as conserved, and all functionally conserved sequence variants.
  • a second embodiment of the invention relates to the nucleotide sequence of the murine form of the enzyme (Seq ED No. lb) and all function-conserved sequence variants.
  • the invention also relates to isolated nucleic acids which can hybridize with sequences No. 1, including fragments or variants derived therefrom with a conserved sequence or function. Conditions that correspond to a medium stringency are also included under hybridization.
  • a third embodiment corresponds to the sequence of the human protein which is obtained by translation 5 of the nucleic acid sequence according to the invention in accordance with Seq ID No. la.
  • This amino acid sequence (Seq ID No. 2a) is defined by the open reading frame (ORF, open reading frame) starting with the Meti (amino acid 1) to Pro 329 , (amino acid 329).
  • the murine sequence corresponds to (Seq ID No. 2b) those of the amino acids beginning with Meti (amino acid 1) to Pro 32 5 (amino acid 325), which is defined by the open reading frame of the nucleic acid sequence according to the invention in accordance with Seq ED No. 1b.
  • the sequence begins at Arg 31 to amino acid Pr ⁇ 329 (Seq ID No. 3a).
  • the sequence begins at Arg : Amino acid Pro 3 25 (Seq ID No. 3b)
  • translation refers to a colinear translation of the nucleic acid sequence into an amino acid sequence in accordance with the universal genetic code
  • the invention describes DNA constructs that contain the 3GnT sequences, including but not limited to those that link the 3GnT sequence to a transcriptional regulatory sequence with or without a polyadenylation signal. Such DNA constructs are also called “vectors" designated. Cells which are transiently or stably transfected with these vectors are included in the description. Viruses and bacteriophages which contain the 3GnT sequences are also included in the description. The invention also includes the methods for the production of 3GnT polypeptides.
  • the invention also includes the production of a cell line which stably expresses the 3GnT, taking into account the necessary transfer of the cDNA corresponding to the sequences according to Seq ID No. la or lb, or a fragment of these cDNAs which are suitable for a protein corresponding to sequence 2a , or 2b coded or a fragment that is enzymatically active or is suitable for crystallization.
  • the conditions for the selection and growth of the host cells expressing the 3GnT and for their identification are included. These cells can be used for the production of the recombinant enzyme which can be used as a catalyst for the production of glycans.
  • This cDNA can also be used to stably transfect cell lines or cells obtained ex vivo and thus to change their adhesion and recognition properties. Such stably transfected cells can also be used for the expression of glycoproteins which are substituted by the expression of the 3GnT with polylactosaminoglycans. All applications for the production of keratan and its derivatives are also included.
  • a further aspect of the invention relates to the isolation of 3GnT polypeptides which contain the sequences Nos.
  • Another aspect of the invention relates to the methods which are used to discover mutations in the coding region of the gene by analyzing genomic DNA from patients, for example from blood cells.
  • the method comprises the
  • nucleic acids or “polynucleotides” refer to polymers of purine and pyrimidine bases of any length, either as polyribonucleotides, polydesoxyribonucleotides or mixtures of both. These include single and double strands, for example DNA-DNA, DNA-RNA and RNA- RNA hybrids. Likewise, atypical bases are also mentioned 2 "cDNA" (copy DNA or complementary DNA) in this document denotes a DNA molecule, a DNA or a clone derived therefrom, which have been enzymatically synthesized from a messenger RNA (mRNA) as a template.
  • mRNA messenger RNA
  • a "DNA construct” is a DNA molecule or a clone of such a molecule, either double or single-stranded, which contains segments that do not occur in nature in this way.
  • a non-limiting example is a cDNA or a DNA that contains no introns and is directly linked to an exogenous DNA sequence
  • a "plasmid” or generally a “vector” is a DNA construct which contains genetic information which is required for replication in a host cell. Such plasmids or vectors generally contain the gene sequence intended for expression and additional sequences which require expression , including promoters and transcription initiation sites. The plasmid can be arranged linearly or circularly.
  • vectors are also included as DNA constructs, which are referred to as "targeting vectors". These are used for targeted gene inactivation or for overexpression of a gene in ivo uses 4 nucleic acids are "hybridizable" with each other if at least one strand forms a double strand with another under certain conditions of stringency.
  • the stringency is determined by a) the temperature during the hybridization experiment with or without washing step, b) the ionic strength and polar ity (eg formamide) of the hybridization and washing solutions.
  • the hybridization takes place only if the bases are complemented significantly. Depending on the stringency, however, deviations from the complementarity can be tolerated.
  • a matrix is an RNA or DNA sequence that is used for synthetic reactions to manufacture DNA copies are
  • the English Ausdnick is "template" pischerv.e ⁇ se
  • two strands are hybridized at high stringency (e.g. in aqueous solution with 0.1 x SSC at 65 ° C) only if there is high complementarity over the entire length
  • Medium stringency e.g. in aqueous solution with 0. 5 x SSC at 50 C
  • low stringency e.g. in aqueous solution with 1 x SSC at 40 C accordingly requires a lower degree of complementarity between the hybridizing strands (1 x SSC corresponds to a solution of 0 15 M NaCl, 0.015 M Na Citrate)
  • an "isolated" nucleic acid or an “isolated” polypeptide denotes a substance of the corresponding substance class which has been removed from its original environment, for example its natural environment, provided that this substance occurs in nature.
  • the isolation denotes one Process in which at least 50% of the other components have been removed from the original mixture, but preferably over 90%
  • probe is a nucleic acid that hybridizes with a specific sequence section of the gene to be examined.
  • derived nucleic acid denotes a nucleic acid sequence that corresponds to a specific section of a sequence. These are sequences which are referred to as homologous, similar, complementary (ie "antisense") or sequence-conserved or function-conserved. Sequence-conserved variants are those in which one or more changes in nucleotides of a certain codon do not result in changes in the amino acid sequence at this point.
  • Function-conserved variants in 3GnT are those in which mutations of individual amino acids undermine the conformation and the enzyme activity Inclusion of the substrate specificity is not affected, these mutations concern, among other things, exchanges of amino acids with similar physico-chemical properties, such as the acidic, basic or hydrophobic or other S
  • a "donor substrate” is a molecule which is recognized by the transferase and which contributes a TV-acetylglucosamine residue for enzyme catalysis.
  • the donor substrate is UDP-GlcNAc 7.
  • An "acceptor substrate” is a molecule to which the GlcNAc residue is transferred by the 3GnT.
  • This galactose residue is, for example, part of an N- or O-linked glycan, without excluding other possibilities
  • UDP-GlcNAc stands for uridine diphospho-V-aze glucosamine 9
  • GK coconjugates are biomolecules which contain complex linked glycans. These substances include glycoproteins, glycolipids and proteoglycans (or glycosaminoglycans).
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule including genomic DNA and the cDNA, which for a UDP-N-acetylglucosaminyl ß 1, 4 Galactoside ß 1, 3N-acetylglucosamine transferase (polylactosaminyl type) coded
  • the cDNA of the 3GnT was cloned in this way.
  • sequence similarities of a family of ⁇ 1, 3Galactosyltransferases have been used as a basis for the identification of functionally undefined EST 8 sequences.
  • a human gene bank developed in our laboratory was tested for the presence of similar sequences.
  • a sequence which had an open reading frame was expressed in an expression vector together with a specific binding sequence of 6 histidines 9 in insect cells.
  • the expressed product, which contained the His-tag was tested for its function in an enzyme mixture which contained both UDP-galactose and UDP-GlcNAc together with the acceptor substrate LAcNAc 10 as donor substrates. It was surprisingly found that the activity measured was exclusive was due to the addition of the UDP-GlcNAc.
  • the invention encompasses all nucleic acid sequences corresponding to the sequences according to the invention represented as Seq ID No. la or lb and fragments derived therefrom.
  • the fragments are at least S nucleotides long, but are preferred are at least 12 nucleotides and even more preferably 15 to 20 nucleotides further all nucleic acid derivatives
  • EST means "Evpressed sequence tag” and refers to undefined DNA sequences which result from the systematic recording Transcription have been derived. These EST sequences are available in a publicly accessible database
  • LacNAc stands for corresponding to the sequences according to the invention which hybridize under the stringency conditions of 1 x SSC, 40 ° C. with the Seq ID No. la or lb, hybridization conditions of 0.5 x SSC, 50 ° C. and even more preferably those of 0 are preferred , 1 x SSC at 65 ° C.
  • the nucleic acids can be isolated directly from cells.
  • the PCR method can also be used to obtain the nucleic acids according to the invention, either by using isolated RT after reverse transcription or genomic DNA as a template for the Primers necessary for PCR can be produced on the basis of the sequences according to the invention and supplemented by introducing sequences for restriction sites.
  • the sequences according to the invention can have natural or heterologous flanking sequences at the 5 'or 3' end with or without expression-regulating sections such as promoters, enhancers, Binding sites, polyadenylation sequences, introns, 3'- or 5 'nic Containing ht-coding sequences and the like.
  • the nucleic acids can also be modified according to the general level of knowledge, such as by methylation, "capping", introduction of nucleic acid analogs, changes in the phosphodiester bridges by introducing uncharged methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates and so on Bridges (such as phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.)
  • the nucleic acids can have one or more covalent substituents, such as. B.
  • nucleic acids and their derivatives can be further modified as methyl or ethyl phosphotriester or as alkyl phosphoramidates. They can also be provided with a marker such as radioactive isotopes, fluorescent substances, biotin, etc.
  • Usable probes which are developed on the basis of the nucleic acids according to the invention thus contain at least 8 nucleotides which occur in the Seq ID la or lb or sequence or function-conserved analog sequences or complementary sequence and which are provided with a marker mentioned above
  • the invention also relates to nucleic acid vectors which contain the sequences or derivatives and fragments thereof according to the invention.
  • vectors including plasmids and viruses, have been described for replication and / or expression in different host cells, these can be used both for gene therapy and be used for cloning and for protein expression
  • Recombinant cloning factors often contain one or more replication systems for cloning or expression, one or more selection markers in the host cell, such as for antibiotic resistance, and one or more expression cassettes.
  • the inserted sequences can be synthesized according to standard methods, isolated from natural sources or as hybrids.
  • Suitable host cells can be transfected using any suitable method, such as e.g. by electroporation, CaC ⁇ -mediated DNA uptake, liposome-packed DNA, infection with fungi, microinjection, viral infection etc.
  • Suitable host cells include bacteria, archaebacteria, fungi, especially yeasts, plants and animal cells. Of particular interest are Saccharomyces cerevtsiae, Saccharomyces poniche, Pichia pastoris, insect cells, Neurospora, CHO cells, COS cells, HeLa cells and immortalized myeloid and lymphoids Cell lines Preferred replication systems include M13, SV40, baculovirus, lambda, retro and adenovirus. A large number of transcription initiation and termination sequence sections are known and also proven to be effective for the expression of heterologous proteins. Examples of such sections, their isolation and mutagenization are known in the art. Under suitable conditions, host cells can express recombinant 3GnT and derivatives thereof and therefore as a source for the production of this enzyme can be used
  • DNA constructs to which a transcription-regulating element is added to the 3GnT coding sequence are used.
  • This promoter can contain operator sections and / or ribosomal binding sites.
  • Bacterial promoters which are compatible with E. coli such as ⁇ -lactamase (penicillinase) promoter, lactose promoter, tryptophan promoter, arabinose BAD operon promoter, lambda-derived are not exhaustively listed P, promoter and N gene ribosome binding site; also the hybrid tac promoter from the sequences of the tryptophan and lac UV5 promoters.
  • yeast promoters such as those for 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, galactokinase (GAL1), galactose epimerase, acid phosphatase (PH05) and alcohol dehydrogenase (ADH).
  • yeast promoters such as those for 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, galactokinase (GAL1), galactose epimerase, acid phosphatase (PH05) and alcohol dehydrogenase (ADH).
  • SV40 Simian Virus 40
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • ADV Adenovirus
  • BVPV Bovine Papilloma Virus
  • CMV Cytomegalovirus
  • the invention also relates to nucleic acids which code for the wild-type form or a derived form of 3GnT and which are transfected into the cells and recombine homologously or non-homologously with the endogenous DNA of the cell
  • the invention also relates to nucleic acids, which are used as probes for the discovery of 3GnT in species other than the mucous and human forms mentioned here and specified by Seq ID No. la or lb.
  • the invention relates to isolated peptides and polypeptides for which the nucleic acid sequences according to the invention code.
  • Preferred are peptides with at least five amino acids.
  • Nucleic acids which code for proteins can be used for the expression of recombinant polypeptides in intact cells or in vitro translation systems. The ones used for expression In addition to the conventional molecular biological methods, nucleic acids can also be synthesized chemically.
  • 2a or 2b can be obtained from natural organisms or cells, or from organisms or cells which heterologously express the recombinant 3GnT
  • the organisms are, for example, transgenic mice, which overexpnm the 3GnT gene or farm animals, which expand the 3GnT transgene in the mammary gland.
  • the cells are, for example, bacteria, fungi, insects, plants and animal Cells
  • the heterologously expressed polypeptides can also be expressed as fusion proteins.
  • the methods for isolating polypeptides are generally known.
  • the enzyme can be coupled to a binding site, such as a polyhistidine sequence of 4-8 histidine residues (so-called "His tag", the preferred variant containing 6 His residues), or epitopes for the binding of monoclonal antibodies such as the FLAG epitope or Myc epitope and others.
  • a binding site such as a polyhistidine sequence of 4-8 histidine residues (so-called "His tag", the preferred variant containing 6 His residues), or epitopes for the binding of monoclonal antibodies such as the FLAG epitope or Myc epitope and others.
  • Immunoaffinity chromatography with antibodies against the recombinant enzyme itself is preferred
  • the enzyme can be expressed as a hybrid enzyme, it being coupled directly to another enzyme to facilitate catalysis.
  • Preferred variants are 3GnT coupled with a ⁇ 1 4 galactos> l transferase for the production of the eratan and polylactosamine glycine. cangerustes this can be expressed either as fusion proteins or as separate proteins with or without "internal ribosomal entry sites" separate bicistronic vectors.
  • Preferred bicistronic vectors are those in which the sequence of expression leads to an adaptation of the catalytic activity of the expressed products.
  • Such hybrid enzymes can also be used in multicistronic It also contains vectors which code for other proteins such as resistance markers and / or other glycosyltransferases.
  • polypeptides according to the invention can be modified in the sense of post-translational modifications, such as by phosphorylation, sulfation, acylation and glycosylation. Artificial changes such as the incorporation of radioactive isotopes, for example by metabolic labeling or coupling with fluorescent dyes are included. Fusion proteins with fluorescent proteins such as the "green fluorescent protein" are also included antibodies that recognize immunogenic components of 3GnT. These antibodies can be used to specifically bind the enzyme with or without neutralizing its activity.
  • the antibodies against the polypeptides according to the invention include both mono- and polyclonal antibodies.
  • Such antibodies are obtained by in vivo immunization of animals such as mice, rats, rabbits, goats, donkeys and others or by in vitro immunization of immunocompetent cells.
  • the antigens used for this purpose as parts of the 3GnT are either obtained from natural or heterologous sources.
  • the antibodies themselves can also be produced recombinantly or formed biochemically from heavy and light chains.
  • the antibodies relate to hybrid antibodies, in which the chains with two different specificities against the 3GnT univalent antibodies and FAß as well as (FAB) 2 fragments
  • the different antibody forms are described in the literature. They are preferably purified using affinity chromatography, the methods mentioned for polypeptide purification are also used for the purification of specific antibodies.
  • the antibodies can be used to quantify the polyl peptides according to the invention
  • the methods used for this are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) or radioimmunoassays (RIA) which are carried out with different enzymes / substrates or isotopes. These methods are described in L iterature described
  • the expression of the GnT in the organism was carried out with the help of Northern blot analysis using commercially available analysis filters (English "blot") on which the electrophoretically separated mRNAs of different organs are immobilized (CLONTECH). To avoid DNA probes with increased GC content, 3 'fragments of the murine and human 3GnT were prepared.
  • a Sac -Pstl 668 bp fragment of the murine ⁇ 3GnT cDNA and a 367 bp fragment of the region of the human ⁇ 3GnT cDNA between nucleotides 616 and 977 were phosphorylated with [ ⁇ - 3 P] -CTP (Hartmann Analytics, Braunschweig, Germany) with "random priming" (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning A laboratory Manual, 2 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) and hybridized with the Poly (A) ' RNA Filters (blots) The filters (blots) were in 0, 1 x SSC, 0 1% SDS washed up to 55 ° C and exposed for four days in amplifier cassettes at -70 ° C
  • Fig. 1 Expression of the 3GnT according to the invention in various mouse and human tissues (Northern blot analysis)
  • Fig. 1 shows the result. Each lane shows approx. 2 ⁇ g poly (A) ⁇ RNA
  • the RNA large markers are given in kb.
  • Three transcripts (1.6, 2.4, and 3.3 kb as the strongest signal) were found in all examined human organs.
  • a 2.2 kb transcript was found in most tissues, as well as a weakly expressed form 3.7 kb in the lungs and kidneys. Weak signals were found in the liver and skeletal muscle.
  • the insect cells were infected with an MOI 13 out of 10 and grown at 27 ° C until measurement of 3GnT activity.
  • Sf9 stands for Spodoptera fnig ⁇ erda 9-cell lysate infected with wild-type baculovirus, as a neg control *.
  • Sf9 cell lysate e pNP is ⁇ r ⁇ -nitrophenyl
  • Bzl is benzyl e oct l, 0- (CH 2) s -C0 2 Me
  • LacNAc-pNP denotes ⁇ -azet ⁇ llaktosam ⁇ n-p-n ⁇ trophen> l
  • the enzyme was subcloned in FastBac-HTc vector (Life Technologies), transfected in 5 x 10 6 Sf9 cells and 72 h after infection in 1 ml of a 2% Triton X-100 containing phosphate buffer (pH 7.4) on ice during 15 The cytoplasmic and solubilized membrane fraction was obtained with centrifugation at 300 xg for 5 min.
  • the ⁇ 3GnT activity was with 10 ⁇ l of the cell lysate in 50 ⁇ l of a 50 mM cacodylate buffer, pH 7.0, 20 mM MnCl 2 , 5% Me 2 SO, 0 75 mM ATP, 0 5 mM UDP-GlcNAc with addition of 5 x 10 4 cpm of UDP- [ 1 C] GlcNAc (Amersham) and various acceptor substrates measured. The reaction was stopped by adding 0 5 ml of ice-cold water.
  • reaction products were separated from the starting materials by hydrophobic chromatography on Sep-Pak Cis columns (Waters) in the case of the use of acceptors with hydrophobic aglycone (Hennet T et al, J Biol Chem 1998, 273, 5S-65) in the case of the use of lactose, N-acetyllactosamine, Gal- ⁇ l, 3-GlcNAc-. ⁇ / - Azetvllaktos amine (lac- ⁇ -tetraose) and Gal-ßl, 4-GlcNAc-N-Azet ⁇ llactosamine (lac-N-neotetraose), the reaction products on AG1-X8 columns (Bio-Rad) were washed by excluding 2 Volumes were collected (2 ml) (Malissard, M, et al, Eur J Biochem 1996, 239, 340-348) The hydrolysis of UDP-GlcNAc in cell ly
  • Fig. 2 Pohlactosamine synthase activity of the 3GnT according to the invention
  • the ⁇ bb 2 shows the property of the 3GnT according to the invention to effectively implement the tetrasacchand acceptor lac- ⁇ -neo-tetraose. This finding proves that the 3GnT enzyme can both mitigate and prolong polylactosamine chains
  • the anomeric trace of the Glc residue showed three intramo - lecular crosspeaks at ⁇ 3 604 (Glc Hl, H-3), 3.573 (Glc Hl, H-5), and 3 338 (Glc Hl, H-2 (TOCSY Transfer)) Finally, the anomeric trace of the GlcNAc residue alongside showed three intramolecular crosspeaks (GlcNAc Hl, H-3, ⁇ 3 557, GlcNAc Hl, H-5, ⁇ 3 446, GlcNAc Hl.H-2 (TOCSY transfer), ⁇ 3 74), an intermolecular crosspeak between GlcNAc Hl and Gal H-3 ( ⁇ 3 71) Detection of the product GlcNAc (ß l-3) Gal (ßl-4) Glc (ß l-OBn)
  • Fig. 3 600 MHz ID (a) and 2D ROESY (200ms) (b) l E NMR spectrum of the isolated trisaccharide GIcNAc (ßl-3) GaI (ßl-4) Glc (ßl-OBn) (CBA).
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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Gen, welches für die UDP-N-Acetylglukosaminyl: β1,4 Galaktosid: β1,3N-Acetylglukosaminyltransferase (3GnT) kodiert. Die enzymatische Aktivität und Spezifität ist von allen bisher publizierten Glykosyltransferasen verschieden. Die Erfindung umfasst isolierte DNA-Moleküle und -Konstrukte einschliesslich ihrer Derivate, welche für die 3GnT kodieren (als 3GnT-DNA bezeichnet), wie auch Klonierungs- und Expressionsvektoren, welche diese 3GnT-DNA enthalten, sowie Zellen, welche mit diesen Vektoren transfektiert sind und Methoden der Rekombination zur Gewinnung dieser DNA. Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zur Synthese von Di-, Oligo- und Polysacchariden mit dem repetitiven Element N-acetylglukosamin(β1→3)Galaktose(β1→4) durch Gewinnung und Anwendung des rekombinanten Enzyms aus transfektierten Zellen, die mit 3GnT-DNA, einschliesslich ihrer Derivate, transfektiert sind. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Diagnose genetischer Änderungen bei Tier und Mensch, der Herstellung von Antisense-Proben und 'Targeting' Vektoren zur Erzeugung genveränderter Tiere.

Description

UDP-N-Azetylglukosaminyl:ßl,4 Galaktosid: ßl 3N-A_zetyldukosaminvitrans- ferase (Polylaktosaminyl Typ)
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet C (Chemie, Hüttenwesen). Im engeren Sinn betrifft die Erfindung das Gebiet der Biotechnologie und der rekombinanten DNA-Technik. Die Erfindung betrifft die Klonierung einer Nukleinsaure, welche für eine neuartige Glykosyltransferase kodiert. Die Glykosyltransferasen zahlen zu derjenigen Klasse von Enzymen, welche an den Gly- kosylierungsmechanismen beteiligt sind. Diese gehören zu den wichtigsten biosynthetischen Eigenschaften der lebenden Zelle und und sind vor allem an posttranslatorischen Veränderungen von Proteinen beteiligt. Zudem berühren die erfindungsgemässen Nukleinsäuren auch die Synthese der Glykosaminoglykane (oder, synonym dazu, Proteoglykane).
Im Besonderen betrifft die Erfindung eine Familie von ähnlichen DNA'-Sequenzen (Nukleinsäuren), von welchen eine die Spezifität aufweist, welche sie zusammen mit einer ßl,4Galaktosyltransferase (Almeida, R et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 31979-91 ; Sato T., et al, Proc Natl Acad Sei U S A 1998, 95, 472-7, Sato T. et al, Biochem. Biophys Res. Commun 1998, 244, 637-641) zur Synthese von Polylaktosaminoglykanen bz Keratan befähigt. Die Erfindung bezieht sich auf das Gen, die daraus in vitro abgeleitete cDNA, DNA Konstrukte mit ähnlicher Aktivität, rekombinante Plasmide, welche dieses Gen, bzw. cDNA enthalten, sowie Produktionsplasmide zur Herstellung des rekombinanten Enzyms mit Hilfe der Transfektion und Transformation sowie alle Methoden zur Identifikation von Pofymorphismen bei Menschen und Tieren und der Herstellung von Antisense-Polynukleotiden und sogenannten Targeting Vektoren zur Herstellung von genveränderten Tieren
' DNA In diesem Schriftstück steht DNA für
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Acid, zu deutsch Desoxyribonukleinsäure Stand der Technik
Alle Literaturzitate in diesem Schriftstück beziehen sich auf die Gesamtheit der zitierten Literatur- stelle
Die Ghkosylierung ist eine der wichtigsten posttranslatorischen Veränderungen der kovalenten Proteinstruktur überhaupt. Sie beginnt nach der eigentlichen ribosomalen Proteinsynthese und der Translokation des neugebildeten Proteins in das endoplasmatische Reticulum durch die Uebertra- gung eines prafomierten Oligosaccharids (Glc3Man9GlcNAc2)2 auf das Protein Dieser Mechanis- mus, der in der Evolution von der Backerhefe bis zum menschlichen Organismus sehr ähnlich ablauft und unter dem Begriff der / -Glykosylierung in der Literatur eingehend beschrieben ist (Gly- coproteins, Montreuil J , Vliegenthart, J F G & Schachter, H , Hsg, Elsevier, Lausanne, 1995), bildet die Vorstufe zum Glykosylierungsprozess, welcher im Golgi-Apparat stattfindet Im Golgi Apparat findet zudem noch die sog Ö-Glykosylierung statt Die Glykosylierungsprozesse im Gol- gi-Apparat führt zur Ausbildung spezifischer Glykanstrukturen, welche bei zahlreichen biochemischen und physiologischen Phänomenen beteiligt sind (Varki, A , Glycobiology 1993, 3, 97-130). Sowohl O- wie jV-gebundene Glykane weisen in gewissen Zellen und bei bestimmten Entwicklungsstufen verlängerte Antennen auf, welche aus der Repetition eines Disaccharid-Motivs entstehen, nämlich des Galßl,4GlcNAcßl,3Galßl,4GlcNAc3 (Glycoproteins and Disease, Montreuil I, Vliegenthart, J F G & Schachter, H , Hsg, Elsevier, Lausanne, 1996) Dieses Motiv führt in variabler Lange zu einer Struktur, welche zusammenfassend als Polylaktosaminoglykane bezeichnet werden Die gleiche Struktur findet sich als Glykangrundgerust im Keratan, einem Glykosamino- glykan mit bestimmter Verteilung im Organ (Cornea. Knorpel) (Roden L in The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Lennarz, W J , Hsg, Plenum Press, New York, 1980, S 314- 318)
Die Polylaktosaminoglykane sind auch bei krankhaften Prozessen gefunden worden, wie bei der viralen Transformation von Zellen (Kobata A in Glycoproteins and Disease, Montreuil J , Vliegenthart. J F G & Schachter, H , Hsg, Elsevier, Lausanne, 1996, S 21 1-227 ) und bei der Karzi- nogenese (Yamashita K. &. Kobata A , ibidem, S 1 7-210) Maligne transformierte Zellen erwer- ben neuartige Adhasions und Erkennung-Eigenschaften im Verbund mit anderen Zellen (Metasta-
2 Glc3Man,GlcNAc; heisst GhikosesMannose^Λ'-azet lglukosainin;
3 Galß l.4GlcNAcß l.3Galß l .4GlcNAc heisst Galaktosc i =>4 \-azet) lglukosaιuιnß l 3 Galaktoscß 1 =>4 V- azet\ lghιkosaιιιιn sierung und Invasivitat), bei welchen das Glykanmuster der malignen Zelle von grosser Bedeutung ist (Ya ashita K & Kobata A , ibidem, S. 229-239)
Bei der Entstehung der Entzündung spielen Glykan-Selectin Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle So ist beschrieben worden, dass Leukocyten ein Glykoprotein enthalten (PSGL- 1)4, welches eine bestimmte O-glykosidische Struktur aufweist, welches Polylaktosaminoglykane enthält (Liu, W et al , J Biol Chem 1998, 273, 7078-7087) Diese sind bei der Erkennung des P- Selectins auf der endothelialen Oberflache der Gefasse, welche das entzündete Gebiet versorgen, beteiligt (McEver, R. and Cummings, R.D., J Clin. Invest. 1997, 100, 485-492}. Deshalb fokus- sieren einige pharmazeutische Firmen ihre Anstrengungen auf das Gebiet dieser Wechselwirkung, mit dem Ziel, spezifische Inhibitoren zu entwickeln
Daraus ergibt sich ein Anwendungsgebiet dieser Enzyme, welche in vivo an der Synthese biospezifischer Erkennungsstrukturen beteiligt sind. Sie können für die in vitro Synthese ahnlicher Strukturen nutzbar gemacht werden Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in der Herstellung von Glycosaminoglycanen (Proteoglyca- ne). Diese bilden einen wesentlichen Teil der extrazellularen Matrix. Zu diesen Stoffen zahlt Ke- ratan und seine Derivate Diese enthalten im Glycanteil als Bauelement das Disaccharid N- Azetylglukosaminßl- >3GaIaktoseßl-=>4. Dieses Disaccharid bildet als repetitives Strukturelement Glykanketten von variabler Lange. Diese konnten bisher in vitro enzymatisch nicht synthetisiert werden, da das Enzym, welches effizient die Λ''-Azetylglukosaminßl-=>3Galaktose Bin- düng katalysiert, nicht verfügbar war
PSGL-1 steht für P-Sclectin Gl>koprotcιn Lιgand-1 Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung humaner und muriner DNA, welche für die UDP-Λ'-Azetylglukosaminyl:ß l,4 Galaktosid ß l ,3/V-Azetylglukosaminyltransferase (Polylaktos- aminyl Typ, nachfolgend kurz als 3GnT bezeichnet) kodiert mit der zugehörigen cDNA und der genomischen DNA. Die Spezifität des Enzyms bezieht sich auf das Donor-Substrat (UDP-N- Azetylglukosamin) und das Akzeptorsubstrat jV-Azetyllaktosamin und alle Glykokonjugate, welche diese Struktur terminal exponieren. Die komplette Nukeotidsequenz ist auf Abb. 1 angegeben.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung betrifft die Nukleotidsequenz der humanen Variante Nukleotid 1 bis 990 (Seq ED-Nr. la), welche als konserviert bezeichnet wird und alle Funktions- konservierten Sequenz- Varianten. Eine zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft die Nukleotidsequenz der murinen Form des Enzyms (Seq ED-Nr. lb) und alle Funktions-konservierten Sequenz- Varianten. Auch betrifft die Erfindung isolierte Nukleinsäuren, welche mit den Sequenzen Nr. 1 hybridisieren können einschliesslich daraus abgeleitete Fragmente oder Varianten mit konservierter Sequenz oder Funktion. Unter Hybridisierung sind auch Bedingungen eingeschlossenen, welche einer mittleren Stringenz entsprechen.
Eine dritte Ausführungsform entspricht der Sequenz des humanen Proteins, welches durch Translation5 der erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz entsprechend der Seq ID-Nr la erhalten wird. Diese Aminosauresequenz (Seq ID-Nr.2a) ist durch das offene Leseraster (ORF, open reading frame) definiert mit Beginn beim Meti (Aminosäure 1 ) bis Pro329, (Aminosäure 329) In einer vierten Ausführungsform entspricht die murine Sequenz (Seq ID Nr. 2b) derjenigen der Aminosäuren mit Beginn beim Meti (Aminosäure 1 ) bis Pro325 (Aminosäure 325), welche durch das offene Leseraster der erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz entsprechend der Seq ED Nr. lb definiert ist.
In einer fünften Ausfuhrungsform der erfindungsgemässen Sequenz Seq ID Nr. 2a beginnt die Sequenz bei Arg31 bis Aminosäure Prθ329 (Seq ID Nr. 3a) In einer sechsten Ausführungsform der erfindungsgemässen Sequenz Seq ID Nr. 2b beginnt die Sequenz bei Arg:,ι bis Aminosäure Pro325 (Seq ID Nr 3b)
Unter Translation wird in diesem Schriftstück eine kolineare Übersetzung der Nukleinsäuresequenz in eine Aminosauresequenz entsprechend dem universellen genetischen Code bezeichnet In einem damit zusammenhangenden Aspekt beschreibt die Erfindung DNA-Konstrukte, welche die 3GnT-Sequenzen enthalten, einschliesslich aber nicht ausschliesslich solcher, welche die 3GnT Sequenz mit einer transkriptions-regulatorischen Sequenz mit oder ohne Polyadenylierungssignal verknüpft Solche DNA-Konstrukte weren auch als "Vektoren" bezeichnet. Zellen, welche mit diesen Vektoren transient oder stabil transfektiert sind, sind in der Beschreibung eingeschlossen Ebenso Viren und Bakteriophagen, welche die 3GnT-Sequenzen enthalten, sind in der Beschreibung eingeschlossen. Die Erfindung schliesst auch die Methoden zur Produktion von 3GnT Poly- peptiden ein. Diese beruhen a) auf der Einführung des 3GnT Gens, bzw. cDNA oder eines davon abgeleiteten Konstruktes in eine Wirtszelle; b) die für die Gewinnung eines aktiven und/oder im- munoreaktiven rekombinanten 3GnT-Polypeptids geeigneten Bedingungen sowie c) für die Isolierung des rekombinanten Produktes. Ebenso schliesst die Erfindung die Herstellung einer Zellinie ein, welche die 3GnT stabil exprimiert unter Einbezug des dazu erforderlichen Transfers der cDNA ensprechend der Sequenzen gemass Seq ID Nr. la, bzw lb, oder eines Fragmentes dieser cDNAs, welche für ein Protein entsprechend der Sequenz 2a, bzw 2b codiert oder eines Frag- mentes, das enzymatisch aktiv ist oder sich zur Kristallisierung eignet. Eingeschlossen sind die Bedingungen zur Selektion und zum Wachstum der die 3GnT exprimierenden Wirtszellen sowie zur ihrer Identifikation Diese Zellen können zur Herstellung des rekombinanten Enzyms gebraucht werden, das als Katalysator zur Herstellung von Glykanen verwendet werden kann. Diese cDNA kann auch dazu verwendet werden, Zeil-Linien oder ex vivo gewonnene Zellen stabil zu transfektieren und damit ihre Adhasions- und Erkennungseigenschaften zu verandern. Auch können solchermassen stabil transfektierte Zellen zur Expression von Glykoproteinen eingesetzt werden, welche durch die Expression der 3GnT mit Polylaktosaminoglykanen substitutiert werden Auch sind alle Anwendungen zur Herstellung von Keratan und seiner Derivate eingeschlossen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Isolierung von 3GnT Polypeptiden, welche die Se- quenzen Nr 2a und 2b bzw 3a und 3b oder funktionskonservierte Teile derselben enthalten oder entsprechende Sequenzen, die mit einem weiteren Peptid im Leseraster fusioniert sind. Unter diesen Peptiden sind ohne Ausschliesslichkeit speziell diejenigen bevorzugt, welche für die Reinigung der rekombinanten 3GnT hilfreich sind
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Methoden, welche zur Entdeckung von Mutationen in der codierenden Region des Gens gebraucht werden, indem genomische DNA von Patienten beispielsweise aus Blutzellen analysiert wird In einer Ausfuhrungsform umfasst das Verfahren die
Isolierung der Patienten-DNA, die Amplifikation mittels PCR von Exonabschnitten des 3GnT- Gens, die Sequenzierung des amplifizierten Abschnittes und die Feststellung einer möglichen
Struktur- oder Promotormutation und die Verknüpfung mit der Pathogenese der Krankheit.
Detaillierte Darstellung der Erfindung
Definitionen:
1 "Nukleinsäuren" oder "Polynukleotide" bezeichnen in diesem Schriftstück Polymere aus Purin- und Pyrimidinbasen einer beliebigen Lange, entweder als Polyribonukleotide, Polydesoxyribonu- kleotide oder Mischungen beider Diese umfassen Einzel- und Doppelstrange, beispielsweise DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA-Hybride. Ebenso sind atypische Basen miterwahnt 2 "cDNA" (Kopie DNA oder Komplementare DNA) bezeichnet in diesem Schriftstück ein DNA Molekül, eine DNA oder ein davon abgeleiteter Klon, welche enzymatisch aus einer Boten-RNA (mRNA) als Matrize synthetisiert worden sind. Ein "DNA Konstrukt" ist ein DNA Molekül oder ein Klon eines solchen Moleküls, entweder doppel- oder einzelstrangig, welches Segmente enthalt, die in dieser Weise in der Natur nicht vorkommen. Ein nicht begrenzendes Beispiel ist eine cDNA oder eine DNA, welche keine Introns enthält und direkt mit einer exogenen DNA-Sequenz verknüpft ist
3 Ein "Plasmid" oder generell ein "Vektor" ist ein DNA Konstrukt, welches genetische Information enthalt, die zur Replikation in einer Wirtszelle benotigt wird Solche Plasmide oder Vektoren enthalten im allgemeinen die für die Expression bestimmte Gensequenz und zusatzlich Sequenzen, welche die Expression fordern, unter Einschluss von Promotoren und Transkriptions- Initiationsstellen Das Plasmid kann linear oder zirkulär angeordnet sein Im vorliegenden Schriftstuck sind als Vektoren auch DNA-Konstrukte eingeschlossen, w elche als "targeting vectors" bezeichnet werden Diese werden zur gezielten Geninaktivation oder zur Uberexpression eines Gens in \ivo verwendet 4 Nukleinsäuren sind miteinander "hybridisierbar", wenn mindestens ein Strang mit einem anderen unter bestimmten Bedingungen der Stringenz einen Doppelstrang bildet Die Stringenz wird unter anderem bestimmt durch a) die Temperatur wahrend des Hybridisierungsexperimentes mit oder ohne Waschschritt, b) die Ionenstarke und Polarität (zB Formamid) der H bridisierungs- und Waschlosungen Die Hybridisierung erfolgt nur bei signifikanter Komplementaπtat der Basen, je nach Stringenz können allerdings Abweichungen von der Komplementaritat toleriert v\ erden Ty-
6 Als Matrize wird in diesem Schriftstück eine RNA- oder DNA-Sequenz bezeichnet, welche für s\ nthetisc e Reaktionen zur Herstellung
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DNA-Kopien werden, der englische Ausdnick ist "template" pischerv.eιse erfolgt eine Hybridisierung zweier Strange bei hoher Stringenz (z B in wassriger Losung mit 0, 1 x SSC bei 65 °C) nur, wenn eine hohe Komplementaritat über die gesamte Lange vorliegt Mittlere Stringenz (z B in wassriger Losung mit 0,5 x SSC bei 50 C) und tiefer Stringenz (z B in wassriger Losung mit 1 x SSC bei 40 C) erfordert entsprechend ein geringeres Mass an Komplementaritat zwischen den hybridisierenden Strängen (lx SSC entspricht einer Losung von 0 15 M NaCl, 0.015 M Na Zitrat)
5. Eine "isolierte" Nukleinsaure oder ein "isoliertes" Polypeptid bezeichnet in diesem Schriftstück eine Substanz der entsprechenden Stoffklasse, welche aus ihrer ursprunglichen Umgebung entfernt worden ist, beispielsweise ihrer naturlichen Umgebung, sofern dieser Stoff in der Natur vor- kommt Die Isolierung bezeichnet einen Vorgang, bei welchem mindestens 50% der anderen Komponenten aus dem ursprunglichen Gemisch entfernt worden sind, vorzugsweise jedoch über 90%
6 Als "Sonde" bezeichnet man eine Nukleinsaure, welche mit einem bestimmten Sequenzabschnitt des zu untersuchenden Gens hybridisiert 7 Eine "abgeleitete" Nukleinsaure bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, welche einem bestimmten Abschnitt einer Sequenz entspricht. Dies sind Sequenzen, welche als homolog, ahnlich, komplementär (d h "antisense") oder sequenz-konserviert oder f nktions-konserviert bezeichnet sind. Sequenz-konserviert sind solche Varianten, bei welchen ein oder mehrere Änderungen von Nu- kleotiden eines bestimmten Kodons keine Änderungen der Aminosauresequenz an dieser Stelle nach sich ziehen Funktions-konservierte Varianten der 3GnT sind solche, bei welchen Mutationen einzelner Aminosäuren die Konformation und die Enzymaktivitat unter Einschluss der Sub- stratspezifitat nicht beeinflusst, diese Mutationen betreffen unter anderen Austausche von Aminosäuren mit ahnlichen physiko-chemischen Eigenschaften, wie den sauren, basischen oder hydrophoben oder anderen S Ein "Donor-Substrat" ist ein Molekül, welches von der Transferase erkannt wird und welches für die Enzymkatalyse einen TV-Azetylglukosamin-Rest beitragt Für die 3GnT ist das Donorsub- strat UDP-GlcNAc7 Ein "Akzeptorsubstrat" ist ein Molekül, auf welches der GlcNAc-Rest durch die 3GnT übertragen wird Typischerweise wird dabei der GlcNAc-Rest in einer ß l=->3 glykosidi- schen Bindung auf einen ß-anomerisch konfigurierten Galaktose-Rest übertragen Dieser Galakto- se-Rest ist beispielsweise Teil eines N- oder O-gebundenen Glykans, ohne andere Möglichkeiten auszuschliessen
UDP-GlcNAc steht für Uridindiphospho-V-aze glukosamin 9 GKkokonjugate sind Biomolekule, welche komplex verknüpfte Glykane enthalten Diese Stoffe umfassen Glykoproteine, Glykolipide und Proteoglykane (bzw Glykosaminoglykane) Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes DNA-Molekul unter Einschluss genomischer DNA und der cDNA, welche für eine UDP-N- Azetylglukosaminyl ß 1 ,4 Galaktosid ß 1 ,3N- Azetylglukosamin transferase (Polylaktosaminyl Typ) kodiert Die cDNA der 3GnT wurde so kloniert. dass die Sequenzahnlichkeiten einer Familie von ßl ,3Galaktosyltransferasen als Grundlage zur Identifikation von funktions-undefinierten EST8-Sequenzen verwendet worden sind Mit solchen Sequenzen wurde eine in unserem Labor entwickelte menschliche Genbank auf das Vorliegen ahnlicher Sequenzen geprüft. Eine Sequenz, welche ein offenes Leseraster aufwies, wurde in einem Expressionsvektor zusammen mit einer spezifischen Bindungssequenz von 6 Histidi- nen9in Insekten-Zellen exprimiert. Das exprimierte Produkt, welches den His-tag enthielt, wurde in einem Enzymansatz, der als Donorsubstrate sowohl UDP-Galaktose als auch UDP-GlcNAc zusammen mit dem Akzeptorsubstrat LAcNAc10 enthielt, auf seine Funktion geprüft Es erwies sich überraschenderweise, dass die gemessene Aktivität ausschliesslich auf die Zugabe des UDP- GlcNAc's zurückzuführen war Dieser Befund, dass eine cDNA, welche mit einer Genfamilie der ß l,3Galactosyltransferasen (Hennet T et al , J. Biol. Che 1998, 273, 58-65) homolog ist, als Donorsubstrat nicht UDP-Galactose sondern UDP-N-Azetylglucosamin erkennt, aber mit den bekannten jV-Azetylglucosaminyltransferasen keine Homologie aufweist, ist neuartig
Angaben zu den Reagenzien, DNA, Vektoren und Wirtszellen
Bei der Erarbeitung vorhegender Erfindung wurden viele herkömmliche Techniken der Molekular- und Zellbiologie verwendet Diese Techniken entsprechen dem allgemeinen Wissenstand und werden unter anderem im folgenden Standardwerk im Detail beschrieben- Sambrook et al , 1989, Molecular Cloning A laboratory Manual, 2 Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
Die Erfindung umfasst alle Nukleinsaure Sequenzen entsprechend den erfindungsgemässen Sequenzen dargestellt als Seq ID-Nr la, bzw lb und davon abgeleitete Fragmente Die Fragmente sind mindestens S Nukleotide lang, bevorzugt sind aber mindestens 12 Nukleotide und noch mehr bevorzugt 15 bis 20 Nukleotide Die Erfindung umfasst des weiteren alle Nukleinsaurederivate
EST heisst "Evpressed sequence tag" und bezeichnet Undefinierte DNA-Sequenzen welche aus der systematischen Erfassung
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Transkription abgeleitet worden sind Diese EST Sequenzen sind in einer öffentlich zug nglichen Datenbank abrufbar
Diese aus 6 linear angeordneten Histidinc werden in diesem Schriftstück als His-tαg bezeichnet 10 LacNAc steht für
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entsprechend den erfindungsgemässen Sequenzen, welche unter den Stringenzbedingungen von 1 x SSC, 40 °C mit der Seq ID Nr. la bzw lb hybridisieren, bevorzugt sind Hybridisierungsbedin- gungen von 0,5 x SSC, 50 °C und noch mehr bevorzugt solche von 0, 1 x SSC bei 65 °C Die Nukleinsäuren können unmittelbar aus Zellen isoliert werden Als Alternative kann auch die PCR Methode verwendet werden, um die erfindungsgemässen Nukleinsäuren zu gewinnen, entweder durch Gebrauch von isolierter RT nach reverser Transkription oder genomischer DNA als Matrize Die für die PCR notwendigen Primer können auf Grund der erfindungsgemässen Sequenzen hergestellt und durch Einführung von Sequenzen für Restriktionsschnittstellen ergänzt werden Die erfindungsgemässen Sequenzen können am 5', bzw 3' Ende naturliche oder heterologe flankierende Sequenzen mit oder ohne Expressions-regulierende Abschnitte wie Promotoren, Enhan- cers, Bindungsstellen, Polyadenylierungssequenzen, Introne, 3'- oder 5' nicht kodierende Sequenzen und ahnliches enthalten Die Nukleinsäuren können auch entsprechend dem allgemeinen Wissensstand modifiziert werden wie durch Methylierung, "Capping", Einführen von Nukleinsaure- Analoga, Veränderungen der Phosphodiesterbrucken durch Einführen von ungeladenen Methyl- phosphonaten, Phosphotriestern, Phosphoroamidaten, Carbamate usw und mit geladenen Brük- ken (wie z B Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw) Die Nukleinsäuren können eine oder mehrere kovalente Substituenten besitzen, wie z. B. Proteine (wie Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Polyl-L-Lysine), Interkalatoren (wie z B. Akridin, Psoralen usw ), Chelatoren (wie Metallchelatoren, radioaktive Metalle, Eisen etc) und alkylierende Substanzen Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren und ihre Derivate können weiter als Methyl- oder Athyl-phosphotriester oder als Alkylphosphoramidate verändert werden Ebenso können sie mit einem Marker wie radioaktive Isotope, fluoreszierende Stoffe, Biotin usw versehen werden
Brauchbare Sonden, welche auf Grund der erfindungsgemässen Nukleinsäuren entwickelt werden, enthalten also mindestens 8 Nukleotide, welche in der Seq ID la bzw lb oder Sequenzen- oder Funktions-konservierte Analogsequenzen oder Komplementarsequenz vorkommen und die mit einem oben erwähnten Marker versehen sind
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsaure- Vektoren, welche die erfindungsgemässen Sequenzen oder Derivate und Fragmente davon enthalten Eine breite Zahl von Vektoren, inklusive Plasmide und Viren sind für die Replikation und/oder Expression in verschiedenen Wirtszellen beschrieben worden, diese können sowohl für die Gentherapie als auch für die Klonierung und für die Proteinexpression eingesetzt werden Rekombinante Klonierungs\ ektoren enthalten oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonierung oder die Expression, ein oder mehrere Selektionsmarker in der Wirtszelle wie beispielsweise für die Antibioticaresistenz, dazu eine oder mehrere Expressionskassetten. Die eingefügten Sequenzen können nach Standartmethoden synthetisiert, aus naturlichen Quellen oder als Hybride isoliert werden Die Verknüpfung der kodierenden Abschnitte der erfindungsgemässen Nukleinsäuren mit regulierenden Nukleinsaureelementen oder mit anderen Protein-kodierenden Nukleinsäuren kann mit bekannten Methoden erfolgen Geeignete Wirtszellen können mit irgendeiner geeigneten Methode transfektiert werden, wie z B durch Elektroporation, CaC^-vermittelte DNA Aufnahme, Liposom-verpackte DNA, Infektion mit Pilzen, Mikroinjektion, virale Infektion usw.
Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Archaebakterien, Pilze, vor allem Hefen, Pflanzen und tierische Zellen Besonders interessant sind Saccharomyces cerevtsiae, Saccharomyces ponώe, Pichia pastoris, Insekten-Zellen, Neurospora, CHO Zellen, COS Zellen, HeLa Zellen und im- mortalisierte myeloische und lymphoide Zelllinien Bevorzugte Replikationssysteme umfassen M13, SV40, Baculovirus, Lambda, Retro-und Adenovirus. Eine grosse Zahl von Transkriptionsi- nitiations- und Terminationssequenzabschnitte sind bekannt und auch nachgewiesenermassen für die Expression von heterologen Proteinen wirksam Beispiele solcher Abschnitte, ihre Isolierung und Mutagenisierung sind im Fachbereich bekannt Unter geeigneten Bedingungen können Wirtszellen rekombinante 3GnT und Derivate davon exprimieren und deshalb als Quelle für die Pro- duktion dieses Enzyms verwendet werden
Mit Vorteil uerdenDNA-Konstrukte, welchen ein Transkriptions-regulierendes Element zur 3GnT kodierenden Sequenz beigefügt ist, verwendet. Dieser Promotor kann Operatorabschnitte und/oder ribosomale Bindungsstellen enthalten Nicht erschöpfend aufgezahlt fallen darunter bakterielle Promotoren, welche mit E. coli kompatibel sind wie ß-Laktamase (Penicillinase) Pro- motor, Laktose Promotor, Tryptophan Promotor, Arabinose BAD Operon Promotor, Lambda- abgeleiteter P, Promotor und N Gen Ribosomen Bindungsstelle; zudem der hybride tac Promotor aus den Sequenzen der Tryptophan und Lac UV5 Promotoren. Darunter fallen Hefepromotoren wie diejenigen für die 3-Phosphoglyzeratkinase, die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, die Galaktokinase (GAL1 ), dieGalaktoseepimerase, die saure Phosphatase (PH05) und Alkohol- dehydrogenase (ADH) Für höhere eukaryontische Zellen fallen darunter die Promotoren für den Simian Virus 40 (SV40), Rous Sarkoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV), bovinem Papilloma Virus (BVPV) und CMV (Zytomegalievirus) Ebenfalls gehören dazu die entsprechenden Terminator- und PoK -A kodierenden Sequenzen, sowie Enhancer-Sequenzen, welche die Expression erhohen können Peptidsequenzen, welche die Sekretion der rekombinanten 3GnT erleichtern wie
Signalsequenzen, Praprosequenzen usw sind eingeschlossen und allgemein bekannt Die Erfindung betnfft auch Nukleinsäuren, welche für die Wildtyp-Form oder eine abgeleitete Form der 3GnT kodieren, und welche in die Zellen transfektiert werden und mit der endogenen DNA der Zelle homolog oder nicht homolog rekombinieren
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, welche als Sonden zur Entdeckung der 3GnT in anderen Spezies als den hier erwähnten und durch die Seq ID Nr la bzw lb spezifizierten munnen und humanen Formen, gebraucht werden
Polypeptide und Antikörper
Die Erfindung betrifft isolierte Peptide und Polypeptide, für welche die erfindungsgemässen Nu- kleinsauresequenzen kodieren Bevorzugt sind Peptide mit mindestens fünf Aminosäuren Nukleinsäuren, welche für Proteine kodieren, können zur Expression rekombinanter Polypeptide in intakten Zellen oder in vitro Translationssystemen verwendet werden Die zur Expression ver- wendeten Nukleinsäuren können neben den herkömmlichen molekularbiologischen Methoden auch chemisch synthetisiert werden Die erfindungsgemässen Polypeptide mit den Seq-ED Nr 2a bzw 2b inklusive der Funktions-konservierten Varianten können aus natürlichen Organismen bzw Zellen, oder aus Organismen bzw Zellen, welche die rekombinante 3GnT heterolog expri- trueren, isoliert werden Die Organismen sind beispielsweise transgene Mause, welche das 3GnT Gen uberexpnmieren oder Nutztiere, welche das 3GnT Transgen in der Milchdruse expπmieren Die Zellen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Insekten, Pflanzen und tierische Zellen Die heterolog expπmierten Polypeptide können auch als Fusionsproteine expπmiert werden Die Methoden zur Isolierung von Polypeptiden sind allgemein bekannt Nicht begrenzend aufgezahlt fallen darunter praparative Gel-Elektrophorese, praparative isoelektrische Fokussierung, HPLC, FPLC, Gel Filtration, lonenaustauschchromatographie, Aussalzen und Affinitatschroma- tographie Zur erleichterten Isolierung der rekombinanten 3GnT kann das Enzym mit einer Bindungsstelle gekoppelt werden, wie eine Polyhistidin-Sequenz von 4-8 Histidinresten (sog "His- Tag", wobei die bevorzugte Variante 6 His-Reste enthalt), oder Epitope für die Bindung von monoklonalen Antikörpern wie das FLAG-Epitop oder Myc-Epitop und andere Bevorzugt ist eine Immunaffinitatschromatographie mit Antikörpern gegen das rekombinante Enzym selber
Das Enzym kann als Hybridenzym expπmiert werden, wobei es direkt an ein anderes Enzym gekoppelt wird zur Erleichterung der Katalyse Bevorzugte Varianten sind mit einer ß l 4Galactos>ltransferase gekoppelte 3GnT zur Herstellung des eratan- und Polylactosamingly- cangerustes Diese
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können entweder als Fusionsproteine oder als getrennte Proteine mit oder ohne "internal ribosomal entry sites" getrennte bicistronischen Vektoren exprimiert werden Bevorzugte bicistronische Vektoren sind solche, bei denen die Reihenfolge der Expression zu einer Angleichung der katalytischen Aktivität der exprimierten Produkte fuhren Solche Hybridenzyme können auch in multicistronischen Vektoren, welche noch für andere Proteine wie Resistenzmarker und/oder andere Glykosyltransferasen kodieren, enthalten sein Die erfindungsgemässen Polypeptide können im Sinne posttranslatorischer Modifikationen verändert werden, wie durch Phosphorylierung, Sulfatierung, Acylierung und Glycosylierung Auch kunstliche Veränderungen wie der Einbau radioaktiver Isotope beispielsweise durch metabolische Markierung oder die Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen sind eingeschlossen Ebenso fallen darunter Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen wie dem "Green fluorescent protein" Die Erfindung betrifft Antikörper, welche immunogene Komponenten der 3GnT erkennen Diese Antikörper können zur spezifischen Bindung des Enzyms mit oder ohne Neutralisation seiner Aktivität eingesetzt erden. Unter den Antikörpern gegen die erfindungsgemässen Polypeptide fallen sowohl mono- wie polyklonale Antikörper Solche Antikörper werden durch in vivo Immunisierung von Tieren wie Mause, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Esel und andere gewonnen oder durch in vitro Immunisierung von immunkompetenten Zellen. Die dazu verwendeten Antigene als Teile der 3GnT werden entweder aus naturlichen oder heterologen Quellen gewonnen Die Antikörper selber können auch rekombinant hergestellt oder biochemisch aus schweren und leichten Ketten ge- bildet werden Die Antikörper betreffen Hybπdantikorper, bei welchen die Ketten mit zwei verschiedenen Spezifitaten gegen die 3GnT verbunden werden, univalente Antikörper und FAß sowie (FAB)2 Fragmente Die verschiedenen Antikorperformen sind in der Literatur beschrieben Ihre Reinigung erfolgt bevorzugt über Affinitatschromatographie, die erwähnten Methoden zur Polypeptidreinigung finden auch für die Reinigung von spezifischen Antikörpern Anwendung Die Antikörper können zur Quantifizierung der erfindungsgemässen Polylpeptide angewendet werden Die dazu verwendeten Methoden sind Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) oder Radioimmunoassays (RIA) welche mit verschiedenen Enzymen/Substraten bzw Isotopen durchgeführt erden Diese Methoden sind in der Literatur beschrieben
Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele illustriert Beispiele:
(Die Abbildungen befinden sich am Ende des Patentantrags)
Beispiel 1:
Klonierung der 3GnT. einer mit der ßl.3Ga!T Genfamilie homologen cDNA Mit Hilfe des tblastx Algorithmus wurden EST-Sequenzen, welche mit denjenigen der Mause ßl,3Galaktosyltransferase-Familie (Hennet T et al , J Biol Chem 1998, 273, 58-65) Ähnlichkeit aufweisen, in der EST-Sektion der GenBank identifiziert Die menschliche und murine 3GnT cDNA wurde mit Hilfe eines 367 bp11 Fragments, welches aus der EST Identifikations Nr AA150140 abgeleitet worden ist, aus einer menschlichen Fotalgehirnbank (CLONTECH) bzw einer Gehirnbank neugeborener Mause (Stratagene) isoliert Die dazu benotigte Sonde wurde mit Hilfe der PCR12 aus 50 ng menschlicher T Zeil cDNA als Matrize mit folgendem Primerpaar 5'- GCGACTACTACCTGCCCTACG-3' und TCCCTTCTCTGGCAAGCACT-3' mit 30 Zyklen bei 95 °C für 45 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 45 s hergestellt
Beispiel 2
Sequenzierung der 3GnT cDNA Die humane und murine cDNA, welche wie im Beispiel 1 beschrieben aus den entsprechenden Genbanken isoliert worden ist, wurde gemass der Dideoxy- Kettenterminations ethode (Sanger F., Science 1981, 214,1205-1210) unter Benutzung des Enzyms Sequenase 2 0 (USB) sequenziert Die dazu benotigten Primer sind in der Tabelle 1 aufge- führt
" bp steht für Basenpaare, kbp steht für kilo-Basenpaar , : PCR bezeichnet Pohmerase Chain Reacüon Tabelle 1: Primer für
Humane 3GnT Murine 3GnT
5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (M13 rev) 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' ( 13 rev)
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (T7) δ'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-S' (T7)
5'-CAATGGGTTCAGTGACTTG-3' 5'-AACCTCACGGCCAAGGTCCTG-3'
5'-AGCGACCACAAGCGTGGCTG-3' S'-GGATGCTTGGCCTGTGTCAG-S'
5'-AGGTAGTAGTCGCAGAGTTG-3' S'-CAAGCATCCTGAACAATCTG-S1
5'-GTGAGGTTTTCGTAGGCGTC-3' 5'-CATCCAGCCAGGTCAGCATG-3'
Die Sequenz der humanen 3GnT ist als Seq-ED Nr. la, diejenige der murinen als Seq-ED Nr. lb vollständig beschrieben.
Beispiel 3
Proteinsequenzvergleich: Schema 4 vergleicht die Protein Sequenzen der Maus 3GnT mit den bekannten Maus ß3Gal-Ts, als sog. "ClustalW alignment. Konservierte Aminosäure werden mit schwarzem Hintergrund dargestellt. Die weisse Pfeile zeigen die Cysteine, welche unter den ß3Gal-Ts konserviert sind und der schwarzer Pfeil zeigt die einzige Cystein-Stelle, die in den fünf
Proteinen konserviert ist.
Schema 4: Sequenzvergleiche der vier urinen homologen ß l,3Ga!actosyItransferasen mit der erfindungsgemässen murinen 3GnT (entsprechend Seq-ID Nr. 2b)
20 40 60 80
P3G.IT-I MASVSCLYVLSWCWASA YL : 23 ß3GslT-M MLQRRRHCCFAKMTSPRSLLRTPLTGVLSLVFLFAMFLFFNHHDWLPGRPGFKENPVTYTFGFSTKSETNHSSL : 80
P3GHΓΓ-III MAPAVLTALPNRMSLRSLKSLLLLSLLSFL : 31 MPLSLFRRVLLAVLLLVIIWTLFG : 24 p3GnT
Figure imgf000017_0001
Beispiel 4
Die Expression der GnT im Organismus: Die exprimierten mRNAs wurden mit Hilfe der Northern blot Analyse unter Anwendung kommerziell erhältlicher Analysefilter (englisch "blot"), auf welchen die elektrophoretisch aufgetrennten mRNA's verschiedener Organe immobilisiert sind (CLONTECH), durchgefühπ. Um DNA-Sonden mit erhöhtem GC-Gehalt zu vermeiden, wurden 3'-Fragmente der murinen und humanen 3GnT präpariert. Ein Sac -Pstl 668 bp-Fragment der murinen ß3GnT cDNA und ein 367 bp Fragment der Region der humanen ß3GnT cDNA zwischen Nukleotid 616 and 977 wurden mit [α-3 P]-CTP phosphoryliert (Hartmann Analytics, Braunschweig, Germany) mit "random priming" (Sambrook et al , 1989, Molecular Cloning A laboratory Manual, 2 Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) und mit den Poly(A)' RNA Filter (blots) hybridisiert Die Filter (blots) wurden in 0, 1 x SSC, 0 1% SDS bis zu 55 °C gewaschen and für vier Tage in Verstärkerkassetten bei -70 °C exponiert
Abb. 1: Expression der erfindungsgemässen 3GnT in verschiedenen Geweben der Maus und des Menschen (Northern Blot Analyse)
Die Abb 1 zeigt das Resultat. Jede Spur zeigt ca 2 μg Poly(A)τ RNA Links sind die RNA Gro- ssenmarker in kb angegeben. In allen untersuchten menschlichen Organen wurden drei Transkripte (1,6, 2,4, und 3,3 kb als stärkstes Signal) gefunden Bei der Maus wurde ein 2,2 kb Tran- skript in den meisten Geweben gefunden, dazu eine schwächer exprimierte Form von 3,7 kb in der Lunge und Niere. Schwache Signale fand man in der Leber und im Skelettmuskel.
Beispiel 5
Expression der 3GnT Ein EcoRl-XhoI 1,9 kbp Fragment wurde aus einer menschlichen 3GnT cDNA welche für ein Protein entsprechend der Seq ID Nr 3 kodiert, abgeleitet und im FastBac- HTc Vektor (Life Technologies), welcher mit EcoP -XhoI vorher linearisiert worden ist, subklo- niert Das Maus EcoRI-XhoI Gen wurde als StuI-StuI 1 kbpFragment, welches der kodierenden Region ohne cytoplasmatische und Transmembrandomane entspricht, im FastBac-HTc Vektor subkloniert Rekombinante Baculoviren wurden mit der Transposon-vermittelten Rekombination entsprechend des vom Hersteller empfohlenen Protokolls hergestellt
Die Insekten-Zellen wurden mit einer MOI13 von 10 infiziert und bei 27 °C wachsen gelassen bis zur Messung der 3GnT Aktivität.
1 MOI bezeichnet "πiuluphcitΛ of infection" Beispiel 6
Messung der .-Aktivität der rekombinanten 3GnT
5 x 106 Insekten-Zellen, welche mit dem Wildtyp oder mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert worden waren, wurden 72 h nach Infektion mit 2% Triton X- 100 in 1 ml Phosphat-Puffer wahrend 15 min auf Eis lysiert Das Lysat wurde in Gegenwart von UDP-1 C-GlcNAc als Donor- und LacNAc-pNP14 (Toronto Research) als Akzeptorsubstrat wahrend 60 min bei 37 °C unter Zugabe folgender Ingredienzien inkubiert 10 μl des Zell-Lysates in 50 μl eines 50 mM Kakodylat Puffers, pH 7.0, 20 mM MnCl2, 5% Me2SO, 0 75 mM ATP, 0 5 mM UDP-GlcNAc mit Zugabe von 5 x 104 cpm von UDP-[1 C]GlcNAc (Amersham) und verschiedenen Akzeptorsubstraten Die Reaktion wurde gestoppt durch Verdünnung mit 0,4 ml eiskaltem H 0 Das Enzymgemisch wurde auf eine SeP-Pak Säule gegeben, gewaschen und das haftende Produkt mit Methanol eluiert und mit Flussigscintillationszahlung gemessen Folgende Resultate wurden erhoben (siehe Tabelle
2)
Tabelle 2: Substratspezifität der erfindungsgemässen 3GnT
Akzeptoren Sf9" Wildtyp 3GnTd pmol'min gprot
Galßl-4GlcNAc-pNPc 5 mM 6 1,478
Galßl-4Glc-bzlrf 5 mM 4 1,034
Galß GlcNAc-octyr 2 mM 5 284
Galßl-3GlcNAc-octyl 2 mM 5 8
Galßl-3GalNAc-octyl 2 mM 5 4
Galα-pNP 5 mM 4 89
Galß-pNP 5 mM 4 26
GalNAcα-bzl 5 mM 4 5
GalNAcß-bzl 5 mM 5 6
GlcNAcα-bzl 5 mM 4 4
GlcNAcß-bzl 5 mM 1 1 7
GlcNAcßl-3GalNAc-bzl 5 mM 8 5
Sf9 steht für Spodoptera fnigφerda 9-Zell-Lysat mit Wildtyp Baculovirus infiziert, als neg Kontrolle * . Sf9 Zell-Lysat (mit 3GnT-rekombinantem Baculovirus infiziert) e pNP ist αrα-nitrophenyl bzl ist benzyl e oct l, 0-(CH2)s-C02Me
LacNAc-pNP bezeichnet Λ-azet\llaktosamιn-p-nιtrophen>l Beispiel 7
PoKlactosaminsvnthase- Aktivität der 3GnT
Das Enzym wurde im FastBac-HTc vector (Life Technologies) subkloniert, in 5 x 106 Sf9 Zellen transfektiert und 72 h nach Infektion in 1 ml eines 2% Triton X-100-haltιgen Phosphatpuffers (pH 7,4) auf Eis wahrend 15 min l siert Die zytoplasmatische und solubüisierte Membranfraktion wurde mit Zentπfugation bei 300 x g wahrend 5 min gewonnen Die ß3GnT Aktivität wurde mit 10 μl des Zelllysates in 50 μl eines 50 mM Kakodylat Puffers, pH 7,0, 20 mM MnCl2, 5% Me2SO, 0 75 mM ATP, 0 5 mM UDP-GlcNAc mit Zugabe von 5 x 104 cpm von UDP- [1 C]GlcNAc (Amersham) und verschiedenen Akzeptorsubstraten gemessen Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe on 0 5 ml eiskalten Wassers Die Reaktionsprodukte wurden von den Edukten durch hydrophobe Chromatographie an Sep-Pak Cis Säulen (Waters) getrennt im Falle des Gebrauch von Akzeptoren mit hydrophobem Aglycon (Hennet T et al , J Biol Chem 1998, 273, 5S-65) Im Falle der Anwendung von Laktose, N-Azetyllaktosamin, Gal-ßl,3-GlcNAc-.Λ/- Azetvllaktosamin (lac-Λ -tetraose) und Gal-ßl,4-GlcNAc-N-Azet\llaktosamιn (lac-N-neo- tetraose), wurden die Reaktionsprodukte an AG1-X8 Säulen (Bio-Rad) gereimgt, indem 2 ausgeschlossene Volumina gesammelt wurden (2 ml) (Malissard, M , et al , Eur J Biochem 1996, 239, 340-348) Die H drolyse von UDP-GlcNAc in Zell-Lysaten wurde in Enzymansatzen ohne Akzeptorsubstrate gemessen Die [14C]-markιerten Produkte wurden mit Flussigszintülationszah- lung gemessen(Rackbeta, Pharmacia) Die Resultate sind auf Abb 6 aufgeführt
Abb. 2: Pohlactosaminsynthase-Aktivität der erfindungsgemässen 3GnT
Die λbb 2 zeigt die Eigenschaft der erfindungsgemässen 3GnT, den Tetrasacchand- Akzeptor lac-Λ-neo-tetraose effektiv umzusetzen Dieser Befund beweist, dass das 3GnT Enzym Polylakto- saminketten sowohl mitieren wie auch verlangern kann
Beispiel 8
Identifikation des erfindungsgemässen 3GnT-Produktes mit Massenspektrometπe und Mefhvhe- rungsanalyse Um den Bindungstyp der von der erfindungsgemässen 3GnT katalysierten glykosidischen Bindung zu bestimmen, wurde eine Inkubation mit Gal(ßl-4)Glc(ßl-OBzl) al Akzeptor im grossen Massstab durchgeführt Die Inkubationsbedingungen entsprachen denjenigen unter Beispiel 6 Das Tn- sacchaπdprodukt wurde mit HPLC isoliert und mit verschiedenen Methoden anal\ siert Seine molekulare Masse wurde nach Permethylierung mit dem positiv-Ionen Modus MALDI TOF Massen Spektrometrie bestimmt. Die erhobene Bruttoformel war HexNAcHex2Bn (m z 798,
([M-Na]*) Die Methylierungsanalyse zeigte die Gegenwart von 4'-substituierten Glc, 3'- substituierten Gal, und terminales GlcNAc. damit konnte die (l-3)-Bindung zwischen GlcNAc und Gal bewiesen werden
Beispiel 9
Identifikation des erfindungsgemässen 3GnT-Produktes mit Magnetresonanzspektrometrie15
Um die Richtigkeit der unter Beispiel 7 beschriebenen Analyse zu bestätigen und um die anomere Konfiguration des von der erfindungsgemässen 3GnT übertragenen Zuckers zu bestimmen, wurden ID und 2D H NMR Experimente durchgeführt. Die am meisten distal verlagerten Signale im ID Η NMR Spektrum (Fig 3a) des Trisaccharids gehorten zur Benzyl Gruppe (δ 7 431, 4 930 (Jgem 11 6 Hz), 4 755 (Jgem 1 1 6 Hz) Mit Hilfe von 2D TOCSY (20 und 100 ms) und ROESY Expenmenten konnten die drei anomeren Doppelsignale bei δ 4 673 ( J! 2 8 6 Hz), 4 546 ( J 8 0 Hz), und 4 423 (3Λ2 8 0 Hz) den Strukturen ß-GlcNAc, ß-Glc, bzw ß-Gal, zugeordnet werden. Das ROESY Spektrum (200 ms, Fig. 3b) erlaubte die Bestimmung der zwei glykosidischen Bindungen. Die anomere Spur des Gal Restes zeigte neben zwei innermolekularen "Crosspeaks" (Gal H-l,H-3,δ 3.71, Gal H-l,H-2 (TOCSY Transfer), δ 3 573), einen intermolekularen crosspeak zwischen Gal H-l und Glc H-4 (δ 3 639) Die anomere Spur des Glc Restes zeigte drei intramo- lekulare crosspeaks bei δ 3 604 (Glc H-l,H-3), 3.573 (Glc H-l,H-5), und 3 338 (Glc H-l,H-2 (TOCSY Transfer)) Schliesslich zeigte die anomere Spur des GlcNAc Restes neben drei intramolekularen crosspeaks (GlcNAc H-l,H-3, δ 3 557, GlcNAc H-l,H-5, δ 3 446, GlcNAc H-l.H-2 (TOCSY Transfer), δ 3 74), einen intermolekularen crosspeak zwischen GlcNAc H-l und Gal H- 3 (δ 3 71) Zusammenfassend ergeben die Resultate den Nachweis des Produktes GlcNAc(ß l- 3)Gal(ßl-4)Glc(ß l-OBn)
Abb. 3: 600-MHz ID (a) und 2D ROESY (200ms) (b) lE NMR Spektrum des isolierten Trisaccharids GIcNAc(ßl-3)GaI(ßl-4)Glc(ßl-OBn) (C-B-A).
15 Die Magnetresonanzspektrometrie wird in diesem Schriftstück als NMR (Nuclear magneüc resonance) bezeichnet

Claims

Patentansprüche
1 Eine isolierte Nukleinsaure, welche für die UDP-N-Azetylglukosaminyl ß l,4 Galaktosid ß l,3iV-Azetylglukosaminyltransferase (Polvlaktosaminyl Typ) kodiert, gemass Seq-ED Nr la bzw lb
2. Eine von der Nukleinsaure nach Anspruch 1 abgeleitete Nukleinsaure 3 Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz gemass Anspruch 1 enthalt
4. Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz gemass Anspruch 2 enthalt
5. Eine Zelle, welche ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 3 enthalt. 6 Eine Zelle, welche ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 4 enthalt.
7. Ein Verfahren zur Herstellung von 3GnT-Polypeptiden dadurch gekennzeichnet, dass a) ein isoliertes DNA-Molekul, welches für die 3GnT kodiert oder ein davon abgeleitetes Konstrukt in eine Wirtszelle eingeführt wird, b) die Wirtszelle unter die für die Expression von 3GnT gunstigen Bedingungen kultiviert wird c) die 3GnT, welche von den Wirtszellen produziert wird, isoliert wird
8. Ein Verfahren für die Herstellung von Di-oder Oligosacchariden dadurch gekennzeichnet, a) dass die genannten Di-oder Oligosaccharide die Struktur GlcNAcßl=>3Gal enthalten b) dass enzymatisch aktive, nach Anspruch 7 hergestellte 3GnT UDP-GlcNAc als Donorsubstrat und ßGal-terminierte Akzeptorsubstrate erkennt und den GlcNAc-Rest übertragt 9 Ein Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass Glykanketten beliebiger Lange, welche das Disaccharid GlcNAcß l= 3Gal als repetitives Element enthalten, in vitro hergestellt werden, indem dem Reaktionsansatz zusatzlich eine ßl,4Galaktosyltransferase mit UDP-
Galaktose als Donorsubstrat zugegeben wird.
10 Ein Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Glykanketten beliebiger Lange, welche das Disaccharid GlcNAcß l= 3Gal als repetitives Element enthalten, in vivo hergestellt werden, indem die Zelle zusatzlich mit einer ßl,4Galaktosyltransferase transfektiert wird.
PCT/CH1999/000365 1998-08-20 1999-08-06 UDP-N-AZETYL GLUKOSAMINYL: β1,4 GALAKTOSID: β1,3N-AZETYL GLUKOSAMINYL TRANSFERASE (POLYLAKTOSAMINYL TYP) WO2000011190A2 (de)

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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DATABASE EMBL [Online] Accession Nbr AI039596, 1. Juli 1998 (1998-07-01) "oy02c10.x1 Soares_senescent_fibroblasts_NbHSF Homo sapiens cDNA clone IMAGE:1664658 3' similar to contains TAR1.b1 TAR1 repetitive element ;, mRNA sequence." XP002130022 *
KAWASHIMA H ET AL: "Purification and characterization of UDP-GlcNAc:Galb1-4Glc(NAc) b-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase (poly-N-acetyllactosamine extension enzyme) from calf serum." JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., Bd. 268, Nr. 36, 25. Dezember 1993 (1993-12-25), Seiten 27118-27126, XP002130020 AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD., US ISSN: 0021-9258 in der Anmeldung erw{hnt *
ZHOU D ET AL: "A b-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase with poly-N-acetyllactosamine synthase activity is structurally related to b-1,3-galactosyltransferases." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA., Bd. 96, Januar 1999 (1999-01), Seiten 406-411, XP002130021 NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON., US ISSN: 0027-8424 *

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