WO2000007982A1 - Derives satures et insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif - Google Patents

Derives satures et insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif Download PDF

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WO2000007982A1
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carbon atoms
hydrogen atom
derivative
group
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PCT/FR1999/001846
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Marie-Hélène Charles
Nadia Piga
Nicole Battail-Poirot
Laurent Veron
Thierry Delair
Bernard Mandrand
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Bio Merieux
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala

Definitions

  • the present invention relates to new abietane derivatives, new conjugates derived from abietane and their uses.
  • the new derivatives include the basic skeleton of abietane which corresponds to the formula below
  • said molecule comprising in position 18 a reactive functional group Z.
  • the new abietane derivatives can be used in a large number of analyzes. For example, they can be used directly or indirectly for the development of new diagnostic tests; in the follow-up of an infection, for example a viral infection; in monitoring and / or dosing chemicals and in particular potentially polluting products. In diagnostic tests, they can be used either as markers, or to constitute a universal solid phase, or for the production of monoclonal or polyclonal antibodies usable for diagnostic purposes. As such, they can advantageously replace biotin to develop new diagnostic tests. Indeed, these are chemical molecules that are not found in humans, in particular in serum, which means that they make it possible to avoid potential interactions with biological molecules.
  • the abietane derivatives according to the invention being chemically relatively inert, they can be used as markers in numerous assays for assaying chemical compounds without disturbing the physical properties and / or chemical and / or physico-chemical thereof. In terms of synthesis, being monofunctional, they are easily synthesized chemically.
  • the new abietane derivatives can be used as markers in an immunoassay test for example for the assay and / or quantification of antibodies specific for an antigen in a biological sample by competitive technique.
  • the antigen is fixed on a solid phase, such as for example represented by a well of a microtiter plate.
  • the biological sample to be assayed and a determined quantity of an antibody conjugated to an abietane derivative are added to the solid phase, and the formation of antigen / antibody complexes conjugated to an abietane derivative is detected. using an antibody directed against the abietane derivative, said antibody being labeled with any suitable marker.
  • abietane derivatives can be used as markers in a test for the assay and / or quantification of an antigen in a biological sample by competitive technique.
  • an antibody specific for the antigen to be assayed is fixed on a solid phase and to the solid phase thus constituted is added both the biological sample capable of containing the desired antigen and a predetermined amount of a derivative antigen conjugated to an abietane derivative.
  • the formation of antibody / antigen derivative complexes conjugated to an abietane derivative is then demonstrated by the addition of an antibody directed against the abietane derivative, said antibody being labeled with any suitable marker.
  • abietane derivatives can be used as markers in a sandwich technique for the search for an antigen or an antibody in a sample.
  • the complex i mun antibody / antigen of the sample is demonstrated by complexation with a second antibody conjugated to an abietane derivative or by complexation with a second antigen conjugated to an abietane derivative and the revelation is carried out using an antibody directed against the labeled abietane derivative, said antibody being labeled with any suitable marker.
  • the abietane derivatives mentioned above are coupled to a biological molecule, such as a selected protein among antibodies, antigens and polypeptides, directly or indirectly. Indirectly, they are coupled via compounds having at least two reactive functions, identical or different, such as spacer arms or natural or synthetic polymers defined in more detail below.
  • the abietane derivatives thus coupled are used in a diagnostic reagent.
  • the subject of the present invention is also a reagent further comprising an abietane derivative coupled to a protein chosen from polypeptides, antigens and antibodies.
  • the invention also relates to the use of such a reagent in a diagnostic test and to a composition further comprising a reagent as defined above.
  • antibodies directed against an abietane derivative are immobilized on a solid phase or support, directly or indirectly, and a polypeptide or an oligonucleotide is modified by fixing at one of its ends a derivative of l 'abietane.
  • the antibody complex directed against the abietane derivative / derivative of abietane-polypeptide or the antibody complex directed against the abietane derivative / derivative of abietane-oligonucleotide is then used according to the usual sandwich techniques or by competition .
  • the universal solid phase consists of the solid phase / antibody assembly directed against an abietane derivative.
  • the present invention therefore also has for ob and a device comprising, in addition to the solid phase or support, a polyclonal or monoclonal antibody directed against an abietane derivative, said antibody being immobilized directly or indirectly. on said solid phase or support.
  • a device comprising, in addition to the solid phase or support, a polyclonal or monoclonal antibody directed against an abietane derivative, said antibody being immobilized directly or indirectly. on said solid phase or support.
  • the antibody is a monoclonal antibody obtained according to known techniques, by reference to that described in Example 10.
  • the derivatives of the invention can be used for the determination and / or monitoring of chemicals in a liquid medium, in particular in an aqueous medium, by sandwich technique or by competition technique as described above for diagnostic tests.
  • R 1 , R :, R 3 and R 4 independently of each other, represent a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an aryl radical preferably comprising from 6 to 20 carbon atoms carbon, optionally substituted; an alkene radical comprising from 7 to 10 carbon atoms; an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms; an optionally substituted aminoacyl or peptidyl radical, or R 1 and
  • R 2 or R 3 and R 4 together can form a ring or a heterocycle;
  • R 5 represents a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkene radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an aryl radical, optionally substituted, comprising of 6 to
  • R 6 represents a hydrogen atom, a halogen, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkene radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, a radical aryl, optionally substituted, comprising from 6 to 20 carbon atoms
  • R 7 represents a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkene radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms
  • R 8 represents a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkene radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms
  • R 8 represents a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkene radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an alkyne radical compris
  • R 9 is chosen from -CN, -CNO, -CNS, -NCO and -NCS; on the condition of
  • Z does not represent any of the following radicals: -COOH, -NCO, -CONH 2 - CN,
  • N-benzylamide N-alpha-phenylethylamide, N-alpha-phenylpropylamide, N, N-dibenzylamide, N-beta-phenylethylamide, N-ethyl-N-benzylamide, N-methyl-N-phenylamide, anilide, and
  • X ' represents a halogen atom, a group lower alkyl, a haloalkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a nitro group, a carbonyl group, a carboalkoxy group and a methyl group,
  • R 5 does not represent H, nor a methyl, ethyl or benzyl radical
  • saturated abietane derivative is meant a derivative having the abietane skeleton mentioned above in which the three cycles and the lateral group in position 13 do not contain any unsaturation, independently of the definition of Z.
  • unsaturated derivative one understands a derivative having the abietane skeleton in which at least one of the three rings and / or the lateral group in position 13 has an unsaturation.
  • an unsaturated derivative mention may be made of those whose skeleton is chosen from the skeletons of abietic acid, dehydroabietic acid, neoabietic acid, independently of the definition of Z.
  • the alkyl radicals mentioned above preferably comprise from 1 to 6 carbon atoms. They can be linear or branched. Preferably, these are linear radicals. An alkyl radical may be interrupted by one or more heteroatoms and / or substituted or unsubstituted.
  • aryl radicals mentioned above preferably contain from 6 to 14 carbon atoms. They may be cyclic or heterocyclic compounds, optionally substituted, in particular by heteroatoms or groups of heteroatoms, such as nitro, sulfonic and sulfonate groups.
  • -COONR 3 R 4 represents an ester of N-hydroxysuccinimide
  • -COR b represents an acid chloride
  • -CONR 1 R 2 represents an N-substituted amide group in which R 1 and R ⁇ independently of one another represents a hydrogen atom or a polyethylene glycol radical and advantageously a tetra or hexaethylene glycol radical or also an optionally substituted peptidyl radical comprising from 2 to 6 aminoacyl residues.
  • the peptidyl radical is a glycyl-glycine radical and advantageously the glycyl-glycine radical is substituted by N-hydroxysuccinimide;
  • -COOR 5 preferably represents a polyethylene glycol ester and advantageously a tetra or hexaethylene glycol ester.
  • the present invention also relates to new conjugates derived from abietane which correspond to the general formula (II)
  • Z represents a radical as defined in the preceding formula (I);
  • X represents a spacer arm chosen from an aliphatic chain (CH 2 ) n in which n is an integer between 0 and 10 and preferably equal to 6, an ethylene glycol or a polyethylene glycol, preferably a tetra or hexaethylene glycol, a residue aminoacyl or peptidyl and in particular a peptide chain comprising from 2 to 10 amino acids;
  • Y represents a polymer chosen from proteins, polypeptides, polynucleotides or oligonucleotides and chemical polymers; provided that if said conjugate comprises an unsaturated derivative of abietane Y is not BSA.
  • polymer By polymer is meant a molecule or a macromolecule consisting of at least two monomer units.
  • a protein is a macromolecule, of natural origin or obtained by synthesis or by genetic recombination technique, having an average molecular mass of at least 200 daltons.
  • a polypeptide corresponds to a chain of at least two amino acids, preferably from 2 to 20 amino acids and its equivalents; said polypeptides being obtained and / or by chemical synthesis and / or by fragmentation of a native protein using appropriate restriction enzymes and / or by genetic recombination.
  • a polypeptide is said to be equivalent with respect to a reference polypeptide if it exhibits substantially the same properties, and in particular the same antigenic, immunological, enzyme and / or molecular recognition properties.
  • a polynucleotide or oligonucleotide corresponds to a sequence of at least two monomer units, in particular of at least five monomers and, preferably of 5 to 22 monomers, advantageously of 18 to 22 monomers and preferably of 20 monomers, characterized by the sequence information of natural nucleic acids, capable of hybridizing under predetermined conditions to a nucleotide fragment, the sequence being able to contain monomers of different structures and to be obtained by chemical synthesis and / or by fragmentation of a natural nucleic acid and / or by genetic recombination.
  • a monomer can be a natural nucleotide of nucleic acid whose constituent elements are a nitrogenous base, a sugar and a phosphate group, or a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; for example, the modification can take place at the base level, generating modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine,, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine , bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization; at the sugar level for example by replacing at least one deoxyribose with a polyamide (PE Nielsen et al., Science, 254,1497-1500 (1991)); at the phosphate group, for example by replacing it with esters chosen from esters of diphosphate, of alkyl and arylphosphonate and of phosphorothioate. These modifications can be taken in combination.
  • modified bases such as inosine, methyl-5
  • informational sequence is meant any ordered sequence of monomers, the chemical nature and order in a reference direction constitute information corresponding to that of natural nucleic acids.
  • a chemical polymer corresponds to the chain of at least two identical or different monomer units. Preferably, it has an average molecular weight of between 1000 and 100,000.
  • This polymer is preferably chosen from homopolymers of maleic anhydride, copolymers based on maleic anhydride, copolymers based on N-vinylpyrrolidone and polysaccharides .
  • the polymer is chosen from poly (maleic anhydride-ethylene), poly (maleic anhydride-propylene), poly (maleic anhydride-methyl vinyl ether) (AMVE); N-vinyl pyrrolidone-N-acryloxysuccinimide (NVP-NAS) and polysaccharides.
  • X is advantageously chosen from an aliphatic chain (CH 2 ) n in which n is an integer equal to 6, an ethylene glycol, a tetra or hexaethylene glycol, a peptidyl residue comprising from 2 to 10 amino acids; and Y represents a polymer chosen from BSA, oligonucleotides from 18 to 22 seas, homopolymers of maleic anhydride, copolymers based on maleic anhydride, copolymers based on N-vinylpyrrolidone, polysaccharides.
  • the polymer is chosen from 20-sea oligonucleotides and in particular the oligonucleotide called under the reference SEQ ID NO 2 and described later in Example 5, poly (random anhydride-ethylene), poly (maleic anhydride -propylene), poly (maleic anhydride-methyl vinyl ether) (AMVE) and N-vinyl pyrrolidone-N-acryloxysuccinimide (NVP-NAS).
  • the polymer is coupled to at least one protein and / or a polypeptide and / or an oligonucleotide.
  • the new conjugates derived from abietane can be used in a large number of analyzes.
  • said conjugates derived from abietane are used in diagnostic tests, such as immunological tests or in tests using probe technology; in the follow-up of an infection, for example a viral infection; in monitoring and / or dosing chemicals and in particular potentially polluting products.
  • they can be used in an immunological diagnostic test as markers as previously described for abietane derivatives or in tests using probe technology for the detection and / or quantification of a fragment of nucleic acid in a biological sample.
  • probe technology they can be used interchangeably as capture and / or detection probes.
  • sandwich technology they can be used as a detection probe according to the following protocol: a capture probe is immobilized on a solid support, the capture phase thus formed is brought into contact with the target sequence of the sample and with a conjugate derived from abietane which consists of an oligonucleotide coupled to a derivative of abietane. The complex possibly formed is then detected by the addition of an antibody directed against the abietane derivative, said antibody being labeled with any appropriate marker. They can also be used as a capture probe.
  • the conjugate derived from abietane which consists of an oligonucleotide coupled to a derivative of abietane is immobilized on a solid support.
  • the capture phase thus formed is brought into contact with the target sequence of the sample and the complex possibly formed is detected by a detection probe marked with any appropriate marker.
  • Capture can be carried out directly or indirectly, ie either the conjugate is immobilized directly on the solid support, or it is immobilized indirectly by coupling to an antibody directed against the abietane derivative, fixed beforehand on the support solid.
  • the sandwich technique can be carried out in one step or two steps.
  • the conjugates of the invention can be used for the detection of a target sequence in a sample both as a capture and detection probe. It is within the capacity of those skilled in the art to define the sequence and the length of the conjugate oligonucleotide as a function of the sequence of the target sought in the sample. It is also within the reach of those skilled in the art to define capture and / or detection probes specific for the target sought.
  • the present invention therefore also relates to a reagent and a diagnostic composition comprising said reagent, the latter comprising:
  • R 1 , R 2 , R J and R 4 independently of each other, represent a hydrogen atom, an alkyl radical comprising from 1 to 10 carbon atoms, an aryl radical preferably comprising from 6 to 20 carbon atoms, optionally substituted ; an alkene radical comprising from 7 to 10 carbon atoms; an alkyne radical comprising from 1 to 10 carbon atoms; an optionally substituted aminoacyl or peptidyl radical, or R 1 and R 2 or R 3 and R 4 together can form
  • the conjugates of the invention can also be used to develop universal capture phases.
  • antibodies directed against an abietane derivative are immobilized, directly or indirectly, on a solid phase or support and the conjugate oligonucleotide of the invention is modified by attachment to one of its ends, preferably at the level of the 5 'end, of an abietane derivative.
  • the universal solid phase consists of the solid phase / antibody assembly directed against an abietane derivative.
  • Another object of the invention is therefore a device comprising, in addition to the phase or the solid support, a polyclonal or monoclonal antibody immobilized directly or indirectly on the phase or the solid support.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody obtained according to known techniques and in particular according to the technique described in Example 10.
  • a conjugate of the invention comprising a chemical polymer can also be used as a marker or to develop a universal capture phase, as described above.
  • a conjugate of the invention can be used as an immunogen, for the immunization of suitable organisms, such as animals, for the production of monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the invention therefore also relates to a reagent and a diagnostic composition further comprising said monoclonal or polyclonal antibodies and preferably monoclonal antibodies obtained according to known techniques, such as that described in Example 10.
  • the invention also comprises use of said reagent in a diagnostic test.
  • a conjugate of the invention can be used for the dosing and / or monitoring of chemicals, by competition technique or by the so-called sandwich technique.
  • the subject of the present invention is also a composition further comprising a conjugate of the invention and a polyclonal or monoclonal antibody obtained by immunization of suitable organisms with the aid of the above-mentioned immunogen, preferably an anti-monoclonal antibody abietic acid obtained by immunization of an animal according to known techniques, such as that described subsequently in Example 10.
  • the invention also relates to the use of a composition as defined above for the determination and / or the chemical monitoring.
  • the appended figure represents the signals obtained during the detection in ELISA of the alpha feto-protein antigen either by use of a polyclonal anti-alpha foeto-protein antibody (round symbols), or by use of a conjugate of the invention AMVE / hydrazide abietic acid / anti-alpha foeto-protein polyclonal antibody (square symbols).
  • AMVE / hydrazide abietic acid / anti-alpha foeto-protein polyclonal antibody square symbols.
  • the amounts of alpha foeto-protein in ng / ml are shown the amounts of alpha foeto-protein in ng / ml and on the ordinate the OD at 492 nm.
  • abietic acid is recrystallized before synthesizing the chloride.
  • a 100 ml three-necked flask under a nitrogen atmosphere 1.2 grams of abietic acid (3.97 mmol-leq) are dissolved in 10 ml of anhydrous toluene and cooled to 0 ° C. 3 eq or 1 ml of chloride of oxalyl are added in solution in 3 ml of anhydrous toluene
  • the yield is quantitative.
  • the medium is diluted in 250 ml of water and then washed three times with 50 ml of ether. After acidification with 2N HCl, the compound is extracted three times with 50 ml of ether. The ethereal phase is washed with saturated NaCl, dried over Na 2 S0 4 , then filtered. The gross yield is 86%.
  • the abietic acid is activated beforehand in the form of chloride, as described in example 3.
  • 0.53 g of hydrazide t-BOC (4 mmol) is dissolved in 10 ml of toluene anhydride to which 0.6 ml are added ( 2 eq) of triethylamine under a nitrogen atmosphere.
  • 1 eq of acid chloride in solution in toluene are added dropwise at the temperature of 0 ° C.
  • the reaction is left for 18 h at room temperature. After which, the appearance of a precipitate is observed.
  • the medium is acidified by adding 4 ml of 1N HCl, the precipitate is filtered through sintered glass.
  • the medium is diluted in 50 ml of ether and after drying over Na 2 S0 4 , the organic phase is evaporated under vacuum and dried with the pump.
  • the product is filtered through 20 times the weight of silica, eluting with a hexane / acetone mixture (80/20). The product is isolated with a yield of 47%.
  • the hydrazide t-BOC is cleaved in anhydrous dioxane by a solution of anhydrous HCl at 4M in the dioxane-anhydrous. After 20 h at room temperature, a precipitate appears. A bubbling of nitrogen makes it possible to entrain the remaining HCl. Evaporation with rotavap removes acid and dioxane. The residue is then taken up in ether and then filtered through sintered glass. The crude yield is 54%.
  • Oligonucleotides are synthesized on an automatic device 394 from the company APPLIED BIOSYSTEMS using phosphoramidite chemistry according to the manufacturer's protocol. To allow the coupling of a oligonucleotide to the N-hydroxysuccinimide ester of abietic acid at a well-determined position, reactive functions are introduced on the oligonucleotide via link arms compatible with automatic synthesis, as described in patent FR 93 07093 whose teaching is included for reference.
  • SEQ ID NO 2 ATGTCACGAG CAATTAAGCG 20 seas
  • beta nucleotides are natural nucleotides (the glycosidic bond is in the anomeric beta form).
  • Alpha nucleotides are unnatural nucleotides (the glycosidic bond is in the alpha anomeric form).
  • the oligonucleotides containing the alpha nucleotides were prepared according to the technique described in the PCT patent application WO88 / 04301, the content of which is incorporated by reference.
  • Tr represents the retention time in minutes for the oligonucleotide under the conditions described in the patent FR 93 07093 cited above.
  • the oligonucleotide is taken up in double-distilled water and analyzed by reverse phase HPLC on an RP300 column with the following eluent: TEAA 0, IM - TEAA 0, 1M / CH 3 CN (50/50) .
  • the profile of the chromatogram shows the presence of unmodified oligonucleotide and a mass of more hydrophobic peaks containing the oligonucleotide coupled to the ester.
  • the yield estimated by integrating the area of the peaks and considering that the molecular extinction coefficients are identical is 40%.
  • Example 7 Coupling of the glycyl-glycine hydrazide derivative on the AMVE polymer
  • the conjugate obtained will be injected into mice to induce an immune response and the production of monoclonal antibodies, as described in Example 10.
  • Example 9 Coupling of the Ester C 28 H 39 0 6 N 3 on the BSA
  • the protocol is identical to that described in the previous example.
  • the coupling involves 40 or 80 eq of NHS esters.
  • the conjugates obtained will be injected into mice to induce an immune response and the production of monoclonal antibodies, as described in the example which follows.
  • An abietic acid antigen coupled to BSA as described in Examples 10 and 11 respectively is used as the immunogen.
  • Each of the antigens was injected into female mice of the BALB / C species and of the BALB / C BYJICO strain.
  • the mice are immunized 15 days apart using three intraperitoneal injections combining respectively 50 ⁇ g of antigen and the complete Freund's adjuvant for the 1st injection and the incomplete Freund's adjuvant for the other injections.
  • the fusion is carried out with the myeloma line SP2 / 0-AG14, according to the conventional technique described by Kolher and Milstein (Nature 256, 495-497 1975).
  • the cells were cultured using a base medium: Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM) supplemented with sodium bicarbonate (3024 mg / 1), 10% fetal calf serum (SVF), pH 6.7 to 7, 3.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco Medium
  • SVF fetal calf serum
  • additional reagents were added: insulin 4 mg / 1, 2-mercaptoethanol (10 ⁇ M), ethanolamine (20 ⁇ M), penicillin
  • the heteroploid cells obtained were subcultured every two or three days and frozen in the added IMDM medium. 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO marketed by Sigma) first at -80 ° C for 24 to 72 hours, then stored in liquid nitrogen at -180 ° C. The cell concentration is 3.6 x 10 6 cells per vial (2 x 10 6 cells / ml).
  • FCS fetal calf serum
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the production of antibodies in vivo was carried out by intraperitoneal injection of the hybridoma lines obtained in female mice having from 4 to 6 weeks old, of the BALB / C species, of the BALB / C BYJICO strain.
  • a screening was carried out by the indirect ELISA technique as follows: Maxisorb NUNC polystyrene plates (sold by the company Polylabo Paul Block under the reference 4-39454) are sensitized with 100 ⁇ l of abietic acid coupled to an oligonucleotic (ODN) as described in Example 2 at 0.25 ⁇ g / ml of abietic acid-ODN in PBS x 3 buffer (0.45 M NaCl; 0.15 M sodium phosphate; pH 7.0). The plates were incubated overnight at 22 ° C or one hour at 37 ° C.
  • ODN oligonucleotic
  • the plates were saturated with 100 ⁇ l of PBS buffer (50 mM phosphate and 150 mM NaCl, pH 7.2) added with 1% of milk extract lyophilized (Regulated) for 1 hour at 37 ° C.
  • 100 ⁇ l of antibody, diluted in 0.05% PBS-Tween 20 were added and incubated for one hour at 37 ° C.
  • 100 ⁇ l of anti-total mouse immunoglobulins conjugated with alkaline phosphatase Jackson Laboratories reference 115-055-062
  • diluted to 1/2000 in 1% PBS-BSA buffer phosphate buffered saline-bovine serum albumin
  • the revelation was carried out by addition of 100 ⁇ l of p-nitrophenylphosphate ((pNPP), marketed by bioMérieux, reference 60002990) at a concentration of 2 mg / ml in DEA-HCl (marketed by bioMérieux, reference 60002989), pH 9.8, and incubation for 30 minutes at 37 ° C. The reaction was then blocked with 100 ⁇ l of NaOH IN. Three washes were carried out between each step with 300 ⁇ l of 0.05% PBS-Tween 20 and an additional washing was carried out in distilled water before adding the pNPP.
  • pNPP p-nitrophenylphosphate
  • the N-hydroxysuccinimide derivative is coupled to an anti-AFP monoclonal antibody in a 0.1M sodium borate buffer mixture, pH 9.2, containing 8% by volume of dimethyl sulfoxide.
  • the antibody / derivative molar ratio is 1/45.
  • the reaction medium is stirred for 4 hours at ambient temperature, before being dialyzed against PBS. - Immunological evidence of the grafting of the abietic acid derivative on the antibody.
  • a mouse monoclonal antibody directed against abietic acid obtained according to Example 10 is diluted to the concentration of 10 ⁇ g / ml in a 50 mM carbonate buffer.
  • the wells of a NUNC MAXISORB microtiter plate are sensitized with this antibody for two hours at 37 ° C.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • solutions of AMVE complexes / anti-alpha foeto-protein rabbit polyclonal antibody / abietic acid hydrazide derivative diluted in PBS-Tween containing 10% by volume horse serum are incubated for one hour at 37 ° C. Two detection possibilities are possible at this level of experience:
  • This example shows that polymers carrying abietic acid can be detected by a sandwich technique.
  • Example 15 Amplification of the detection signal of the alpha foeto-protein antigen by the mixed complexes AMVE / hydrazide derivative of abietic acid / polyclonal anti-alpha foeto-protein antibody.
  • a mouse monoclonal antibody directed against the alfa feto-protein (AFP) is diluted to the concentration of 10 ⁇ g / ml in a 50 mM carbonate buffer.
  • the wells of a NUNC MAXISORB microtiter plate are sensitized for two hours at 37 ° C. with this antibody.
  • solutions of AFP antigen diluted in PBS-Tween containing 10% by volume of horse serum are incubated for one hour at 37 ° C.
  • two detection methods can be envisaged, either in a non-amplified manner, or by using the mixed complex previously obtained to increase the signal level.
  • the polyclonal anti-AFP antibody conjugated with Peroxidase diluted 1/3000 ° in PBS-Tween containing 10% by volume of horse serum is incubated for one hour at 37 ° C.
  • the enzyme substrate, o-phenylene diamine is added, the colorimetric reaction is stopped by adding IN sulfuric acid.
  • the intensity of the coloration is read at 492 nm on an Axia Micro-reader, bioMérieux.
  • the optical density (OD) values, read at 492 nm on the Axia micro- bioMérieux reader, for the samples are reported in the attached figure.
  • the antigen phase was obtained as described in Example 11, then incubation for one hour at 37 ° C. increasing concentrations of hormone dissolved in a 5 ⁇ g / ml solution of an anti-abietic acid antibody in PBS-Tween containing 10% by volume of horse serum. After washing with PBS Tween, a mouse anti-antibody coupled to peroxidase in solution in PBS Tween - horse is incubated for one hour at 37 ° C. After washing, the enzyme substrate, o-phenylene diamine, is added. The colorimetric reaction is stopped by adding IN sulfuric acid. The intensity of the coloration is read at 492 nm on an Axia Micro-reader, bioMérieux.

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Abstract

L'invention concerne un dérivé saturé ou insaturé de l'abiétane de formule générale (I), dans laquelle Z est choisi parmi -COOR?5, -CONR1R2¿, -COONR?3R4, -COR6¿, -CON, -COOR5, -CHOHR?7, -SR8, -OR8¿, -CN, -CNO, -CNS, -NCO, -NCS, -R?1R2CR9; où R1, R2, R3 et R4¿ représentent un atome d'hydrogène, un alkyle en C¿1?-C10, un aryle en C6-C20, éventuellement substitué; un alcène en C7-C10; un alcyne en C1-C10; un aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R?1 et R2 ou R3 et R4¿ ensemble peuvent former un cycle ou un hétérocycle; R5 représente un hydrogène, un alkyle en C¿1?-C10, un alcène en C1-C10, un alcyne en C1-C10, un aryle, éventuellement substitué en C6-C20; R?6¿ représente un hydrogène, un halogène, un alkyle en C¿1?-C10, un alcène en C1-C10, un alcyne en C1-C10, un aryle, éventuellement substitué en C6-C20; R?7¿ représente un hydrogène, un alkyle en C¿1?-C10, un alcène en C1-C10, un alcyne en C1-C10; R?8¿ représente un hydrogène, un alkyle en C¿1?-C10, un alcène en C1-C10, un alcyne en C1-C10; et R?9¿ est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS; un conjugué dérivé et l'utilisation de ce dérivé et de ce conjugué dans une composition diagnostique, un réactif et un dispositif.

Description

DERIVES SATURES ET INSATURES DE L'ABIETANE, CONJUGUES DERIVES ET UTILISATIONS DANS UNE COMPOSITION DIAGNOSTIQUE,
UN REACTIF ET UN DISPOSITIF
La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de l'abiétane, de nouveaux conjugués dérivés de l'abiétane et leurs utilisations.
Les nouveaux dérivés comprennent le squelette de base de l'abiétane qui répond à la formule ci-dessous
Figure imgf000003_0001
ladite molécule comprenant en position 18 un groupement fonctionnel réactif Z.
Les nouveaux dérivés de l'abiétane sont utilisables dans un grand nombre d'analyses. A titre d'exemple, ils peuvent être utilisés directement ou indirectement pour le développement de nouveaux tests de diagnostic ; dans le suivi d'une infection, par exemple d'une infection virale ; dans le suivi et/ou le dosage de produits chimiques et en particulier de produits potentiellement polluants. Dans des tests de diagnostic , ils peuvent être utilisés soit comme marqueurs, soit pour constituer une phase solide universelle, soit pour la production d' anticorps monoclonaux ou polyclonaux utilisables à des fins diagnostiques. A ce titre, ils peuvent avantageusement se substituer à la biotine pour développer de nouveaux tests de diagnostic. En effet, il s'agit de molécules chimiques que l'on ne retrouve pas chez l'être humain, en particulier dans le sérum, ce qui signifie qu' ils permettent d' éviter de potentielles interactions avec des molécules biologiques .
Dans le dosage et/ou le suivi de produits chimiques, les dérivés de l'abiétane selon l'invention étant chimiquement relativement inertes, ils peuvent être utilisés comme marqueurs dans de nombreux tests de dosage de composés chimiques sans perturber les propriétés physiques et/ou chimiques et/ou physico-chimiques de ces derniers . Sur le plan de la synthèse, étant monofonctionnels, ils sont aisément synthétisables de façon chimiospécifique .
A titre d'exemple, on développera maintenant quelques applications des nouveaux dérivés de l'abiétane dans des tests de dosages i munologiques :
Utilisation desdits dérivés comme marqueurs dans un test de diagnostic :
Les nouveaux dérivés de l'abiétane peuvent être utilisés comme marqueurs dans un test d' immunoanalyse par exemple pour le dosage et/ou la quantification d'anticorps spécifiques d'un antigène dans un échantillon biologique par technique de compétition. A cet effet, l'antigène est fixé sur une phase solide, telle que par exemple représentée par un puits d'une plaque de microtitration. L'échantillon biologique à doser et une quantité déterminée d'un anticorps conjugué à un dérivé de l'abiétane sont ajoutés à la phase solide, et on détecte la formation de complexes antigène / anticorps conjugués à un dérivé de l'abiétane à l'aide d'un anticorps dirigé contre le dérivé de l'abiétane, ledit anticorps étant marqué par tout marqueur approprié. De manière similaire, les dérivés de l'abiétane peuvent être utilisés comme marqueurs dans un test pour le dosage et/ou la quantification d'un antigène dans un échantillon biologique par technique de compétition. Dans ce cas, un anticorps spécifique de l'antigène à doser est fixé sur une phase solide et on ajoute à la phase solide ainsi constituée à la fois l'échantillon biologique susceptible de contenir l'antigène recherché et une quantité prédéterminée d'un dérivé de l'antigène conjugué à un dérivé de l'abiétane. La formation des complexes anticorps / dérivé de l'antigène conjugué à un dérivé de l'abiétane est ensuite mise en évidence par l'addition d'un anticorps dirigé contre le dérivé de l'abiétane, ledit anticorps étant marqué par tout marqueur approprié. De même, les dérivés de l'abiétane sont utilisables comme marqueurs dans une technique sandwich pour la recherche d'un antigène ou d'un anticorps dans un échantillon. A cet effet, le complexe i mun anticorps/antigène de l'échantillon est mis en évidence par complexation avec un second anticorps conjugué à un dérivé de l'abiétane ou par complexation avec un second antigène conjugué à un dérivé de l'abiétane et la révélation est effectuée à l'aide d'un anticorps dirigé contre le dérivé de l'abiétane marqué, ledit anticorps étant marqué par tout marqueur approprié.
Les dérivés de l'abiétane précités sont couplés à une molécule biologique, telle qu'une protéine choisie parmi les anticorps, les antigènes et les polypeptides, directement ou indirectement. Indirectement, ils sont couplés par l'intermédiaire de composés ayant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes, tels que des bras espaceurs ou des polymères naturels ou de synthèse définis plus en détail ci-après. Les dérivés de l'abiétane ainsi couplés sont utilisés dans un réactif pour le diagnostic. Ainsi, la présente invention a aussi pour objet un réactif comprenant en outre un dérivé de l'abiétane couplé a une protéine choisie parmi les polypeptides, les antigènes et les anticorps.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un tel réactif dans un test de diagnostic et une composition comprenant en outre un reactif tel que défini ci-dessus.
Utilisation des dérives de l'abiétane pour la constitution d'une phase solide universelle :
A titre d'exemple, des anticorps dirigés contre un dérivé de l'abiétane sont immobilisés sur une phase ou support solide, directement ou indirectement, et un polypeptide ou un oligonucléotide est modifié par fixation à une de ses extrémités d'un dérive de l'abiétane. Le complexe anticorps dirige contre le dérivé de l'abiétane / dérivé de l' abiétane-polypeptide ou le complexe anticorps dirige contre le dérivé de l'abiétane / dérivé de l' abiétane-oligonucléotide est ensuite utilisé selon les techniques usuelles sandwich ou par compétition. La phase solide universelle est constituée par l'ensemble phase solide / anticorps dirigé contre un dérivé de l'abiétane. La présente invention a donc également pour ob et un dispositif comprenant outre la phase ou support solide un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre un dérivé de l'abiétane, ledit anticorps étant immobilise directement ou indirectement sur ladite phase ou support solide. De préférence, l'anticorps est un anticorps monoclonal obtenu selon des techniques connues, à titre de référence celle décrite dans l'exemple 10.
Les dérivés de l'invention peuvent être utilisés pour le dosage et/ou le suivi de produits chimiques dans un milieu liquide, en particulier dans un milieu aqueux, par technique sandwich ou par technique de compétition comme décrit précédemment pour les tests de diagnostic.
Aussi, la présente invention a pour objet de nouveaux dérivés saturés ou insaturés de l'abiétane répondant à la formule générique (I) :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle Z est choisi dans le groupe consistant en -COOR5, -CONRαR2, -COONRV, -COR6, -CON, -COOR5, -CHOHR7, -SR8, -OR8, -CN, -CNO, -CNS, -NCO, -NCS, -RXR2CR9 ; dans lesquels R1 , R:, R3 et R4, indépendamment les uns des autres représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle de préférence comprenant de 6 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué; un radical alcène comprenant de 7 à 10 atomes de carbone; un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; un radical aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R1 et
R2 ou R3 et R4 ensemble peuvent former un cycle ou un heterocycle ; R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à
20 atomes de carbone; R6 représente un atome d'hydrogène, un halogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; R8 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; et
R9 est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS ; à la condition que
(a) si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé saturé :
Z ne représente pas l'un quelconque des radicaux suivants : -COOH, -NCO, -CONH2 - CN,
N-benzylamide, N-isopropylamide, N-cyclohexylamide, N-cyclopentylamide, N-alpha- phényléthylamide, N, -dibenzylamide, N-méthyl- N-cyclohexylamide, N-méthyl-N-phénylamide, N-phényl-N-benzylamide, anilide, et -CONH[- (CH2)m-C6H5-nX' n] où m est égal à 0 ou 1, n est égal à 1, 2 ou 3, et X' représente un atome d'halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe haloalkyle, un groupe hydroxyle, un groupe alcoxy inférieur, un groupe nitro, un groupe carbonyle, un groupe carboalcoxy et un groupe méthyle, et
(b) si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé insaturé : - Z ne représente pas l'un quelconque des radicaux suivants : -COOH, N- isopropylamide,
N-méthyl-N-cyclohexylamide, N-cyclohexylamide, N-décylamide, N-dodécylamide, -pentadécylamide, N-allylamide, N,N-diallylamide,
N-cycloheptylamide, N-cyclopentylamide,
N-benzylamide, N-alpha-phényléthylamide, N-alpha-phénylpropylamide, N, N-dibenzylamide, N-béta-phényléthylamide, N-éthyl-N-benzylamide, N-méthyl-N-phénylamide, anilide, et
-CONH[-(CH2)m-C6H5-πX'π] où m est égal à 0 ou 1, n est égal à 1, 2 ou 3, et X' représente un atome d'halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe haloalkyle, un groupe hydroxyle, un groupe alcoxy inférieur, un groupe nitro, un groupe carbonyle, un groupe carboalcoxy et un groupe méthyle,
Si Z représente -COOR5, R5 ne représente ni H, ni un radical méthyle, éthyle ou benzyle,
Si Z représente -CONR^2, et si l ' un de R1 et R2 représente H, l ' autre de R1 et R2 ne représente pas H, et s i l ' un de R1 et R2 représente le radical éthyle, l'autre de R1 et R2 ne représente pas le radical éthyle,
Si Z représente -COR6 ou -CHOH *R7, R6 et R7 ne représentent pas H. Par dérivé saturé de l'abiétane, on entend un dérivé ayant le squelette de l'abiétane précité dans lequel les trois cycles et le groupe latéral en position 13 ne comportent aucune insaturation, indépendamment de la définition de Z. Par dérivé insaturé, on comprend un dérivé ayant le squelette de l'abiétane dans lequel au moins l'un des trois cycles et/ou le groupe latéral en position 13 comporte une insaturation. A titre d'exemple de dérivé insaturé, on peut citer ceux dont le squelette est choisi parmi les squelettes de l'acide abiétique, de l'acide déhydroabiétique, de l'acide néoabiétique, indépendamment de la définition de Z.
Les radicaux alkyles mentionnés ci-dessus comprennent de préférence de 1 à 6 atomes de carbone. Ils peuvent être linéaires ou ramifiés. De préférence, ce sont des radicaux linéaires. Un radical alkyle peut être interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou substitué ou non substitué.
Les radicaux aryles mentionnés précédemment comprennent de préférence de 6 à 14 atomes de carbone. Il peut s'agir de composés cycliques ou hétérocycliques, éventuellement substitués, en particulier par des hétéroatomes ou des groupes d' hétéroatomes, tels que des groupements nitro, sulfonique et sulfonate.
Avantageusement, -COONR3R4 représente un ester de N-hydroxysuccinimide, -CORb représente un chlorure d'acide, -CONR1R2 représente un groupement amide N-substitué dans lequel R1 et R^ indépendamment l'un de l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical polyéthylèneglycol et avantageusement un radical tétra ou hexaéthylèneglycol ou encore un radical peptidyle éventuellement substitué comprenant de 2 à 6 résidus aminoacyles. De préférence, le radical peptidyle est un radical glycyl-glycine et avantageusement le radical glycyl-glycine est substitué par la N-hydroxysuccinimide ; -COOR5 de préférence représente un ester de polyéthylèneglycol et avantageusement un ester de tétra ou hexaéthylèneglycol.
La présente invention a aussi pour objet de nouveaux conjugués dérivés de l'abiétane qui répondent à la formule générale (II)
Figure imgf000011_0001
dans laquelle, Z représente un radical tel que défini dans la formule (I) précédente ; X représente un bras espaceur choisi parmi une chaîne aliphatique (CH2)n dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 10 et de préférence égal à 6, un éthylène glycol ou un polyéthylèneglycol, de préférence un tétra ou hexaéthylèneglycol, un résidu aminoacyle ou peptidyle et en particulier une chaîne peptidique comprenant de 2 à 10 acides aminés; Y représente un polymère choisi parmi les protéines, les polypeptides, les polynucléotides ou oligonucléotides et les polymères chimiques ; à la condition que si ledit conjugue comprend un dérivé insature de l'abiétane Y ne soit pas la BSA.
Par polymère, on entend une molécule ou une macromolécule constituée d'au moins deux unités monomères. Ainsi, une protéine, est une macromolécule, d'origine naturelle ou obtenue par voie de synthèse ou par technique de recombinaison génétique, présentant une masse moléculaire moyenne d'environ au moins 200 daltons.
Un polypeptide correspond a un enchaînement d' au moins deux acides aminés, de préférence de 2 a 20 acides aminés et ses équivalents ; lesdits polypeptides étant obtenus et/ou par voie de synthèse chimique et/ou par fragmentation d'une protéine native à l'aide d'enzymes de restriction appropriées et/ou par recombinaison génétique. Un polypeptide est dit équivalent par rapport à un polypeptide de référence s'il présente sensiblement les mêmes propriétés, et notamment les mêmes propriétés antigéniques, îmmunologiques, enzy ologiques et/ou de reconnaissance moléculaire. Est notamment équivalent à un polypeptide de référence : tout polypeptide possédant une séquence dont au moins un acide aminé est substitué par un acide aminé analogue, c'est à dire un acide aminé qui présente sensiblement les mêmes caractéristiques physicochimiques qu'un acide aminé de référence ; tout polypeptide présentant une séquence peptidique équivalente, obtenue par variation naturelle ou induite du polypeptide de référence et/ou du fragment nucleotidique codant pour ledit polypeptide ; un mimotope, tout polypeptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un ou plusieurs acides aminés de la série D et vice versa ; tout polypeptide dans la séquence duquel on a introduit une modification des chaînes latérales d'au moins un acide aminé, telle que par exemple une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; tout polypeptide dans la séquence duquel une ou des liaisons peptidiques ont été modifiées, comme par exemple les liaisons carba, rétro, inverso, rétro-inverso, méthylène- oxy et tout polypeptide dont au moins un antigène est reconnu par un anticorps dirigé contre un peptide de référence .
Un polynucléotide ou oligonucléotide correspond à un enchaînement d'au moins deux unités monomères, en particulier d'au moins cinq monomères et, de préférence de 5 à 22 monomères, avantageusement de 18 à 22 monomères et préférentiellement de 20 monomères, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptible de s'hybrider dans des conditions prédéterminées à un fragment nucleotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu par voie de synthèse chimique et/ou par fragmentation d'un acide nucléique naturel et/ou par recombinaison génétique. Ainsi, un monomère peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont une base azotée, un sucre et un groupement phosphate, ou un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, , la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou tout autre base modifiés permettant l'hybridation ; au niveau du sucre par exemple par le remplacement d'au moins un desoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al., Science, 254,1497-1500 (1991)) ; au niveau du groupement phosphate par exemple par son remplacement par des esters choisis parmi les esters de diphosphate, d' alkyl et arylphosphonate et de phosphorothioate. Ces modifications peuvent être prises en combinaison.
Par " séquence informationnelle ", on entend toute suite ordonnée de monomères, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information correspondant à celle des acides nucléiques naturels .
Un polymère chimique correspond à l'enchaînement d'au moins deux unités monomères, identiques ou différentes. De préférence, il présente une masse moléculaire moyenne comprise entre 1000 et 100 000. Ce polymère est de préférence choisi parmi les homopolymères d'anhydride maléique, les copolymères à base d'anhydride maléique, les copolymères à base de N-vinylpyrrolidone et les polysaccharides . En particulier, le polymère est choisi parmi les poly (anhydride maléique-éthylène) , les poly (anhydride maléique-propylène) , les poly (anhydride maléique-méthyl-vinyléther) (AMVE) ; le N-vinyl pyrrolidone-N-acryloxysuccinimide (NVP-NAS) et les polysaccharides .
Selon l'invention, X est avantageusement choisi parmi une chaîne aliphatique (CH2)n dans laquelle n est un nombre entier égal à 6, un éthylène glycol, un tétra ou hexaéthylèneglycol, un résidu peptidyle comprenant de 2 à 10 acides aminés; et Y représente un polymère choisi parmi la BSA, les oligonucléotides de 18 à 22 mers, les homopolymères d'anhydride maléique, les copolymères à base d'anhydride maléique, les copolymères à base de N-vinylpyrrolidone , les polysaccharides. En particulier, le polymère est choisi parmi les oligonucléotides de 20 mers et en particulier l' oligonucléotide dénommé sous la référence SEQ ID NO 2 et décrit ultérieurement dans l'exemple 5, les poly (anhydride aléique-éthylène) , les poly (anhydride maléique-propylène) , les poly (anhydride maléique-méthyl- vinyléther) (AMVE) et le N-vinyl pyrrolidone-N- acryloxysuccinimide (NVP-NAS) . Avantageusement, le polymère est couplé à au moins une protéine et/ou un polypeptide et/ou un oligonucléotide.
Les nouveaux conjugués dérivés de l'abiétane sont utilisables dans un grand nombre d'analyses. A titre d'exemple, lesdits conjugués dérivés de l'abiétane sont utilisés dans des tests de diagnostic, tels que des essais immunologiques ou dans des essais utilisant la technologie des sondes ; dans le suivi d'une infection, par exemple d'une infection virale ; dans le suivi et/ou le dosage de produits chimiques et en particulier de produits potentiellement polluants. A titre d'exemple, ils peuvent être utilisés dans un test de diagnostic immunologique comme marqueurs comme décrit au préalable pour les dérivés de l'abiétane ou dans des essais utilisant la technologie des sondes pour la détection et/ou la quantification d'un fragment d'acide nucléique dans un échantillon biologique.
Dans la technologie des sondes, ils peuvent être utilisés indifféremment comme sondes de capture et/ou de détection. Ainsi dans la technologie dite sandwich, ils peuvent être utilisés comme sonde de détection selon le protocole suivant : une sonde de capture est immobilisée sur un support solide, la phase de capture ainsi constituée est mise en contact avec la séquence cible de l'échantillon et avec un conjugué dérivé de l'abiétane qui consiste en un oligonucléotide couplé à un dérivé de l'abiétane. Le complexe éventuellement forme est ensuite détecté par addition d'un anticorps dirigé contre le dérivé de l'abiétane, ledit anticorps étant marqué par tout marqueur approprié. Ils peuvent être également utilisés comme sonde de capture. A cet égard, le conjugué dérivé de l'abiétane qui consiste en un oligonucléotide couplé à un dérivé de l'abiétane est immobilisé sur un support solide. La phase de capture ainsi constituée est mise en contact avec la séquence cible de l'échantillon et le complexe éventuellement formé est détecté par une sonde de détection marquée par tout marqueur approprié. La capture peut être réalisée directement ou indirectement, c'est à dire soit le conjugue est immobilisé directement sur le support solide, soit il est immobilisé indirectement par couplage à un anticorps dirigé contre le dérivé de l'abiétane, fixé au préalable sur le support solide. Bien entendu, la technique sandwich peut être effectuée en une étape ou deux étapes. De même, les conjugués de l'invention peuvent être utilisés pour la détection d'une séquence cible dans un échantillon à la fois comme sonde de capture et de détection. Il est à la portée de l'homme de l'art de définir la séquence et la longueur de l' oligonucléotide du conjugué en fonction de la séquence de la cible recherchée dans l'échantillon. Il est également à la portée de l'homme de l'art de définir des sondes de capture et/ou de détection spécifiques de la cible recherchée.
La présente invention a donc également pour objet un réactif et une composition diagnostique comprenant ledit réactif, ce dernier comprenant :
- un dérivé saturé ou insaturé de l'abiétane répondant à la formule (I) précédente dans laquelle Z est choisi dans le groupe consistant en -COOR5, -CONTER2, -COONR3R4, -COR°,-CON, -COOR", -CHOHR , -SR8, -OR8, -CN, -CNO, -CNS, -NCO, -NCS, -RX R ; où R1, R2, RJ et R4, indépendamment les uns des autres représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle de préférence comprenant de 6 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué ; un radical alcène comprenant de 7 à 10 atomes de carbone ; un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; un radical aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R1 et R2 ou R3 et R4 ensemble peuvent former un cycle ou un heterocycle ; R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R6 représente un atome d'hydrogène, un halogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; R8 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; et R3 est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS ; à la condition que si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé insaturé, Z ne représente pas un radical acide carboxylique, ou - un conjugue tel que défini précédemment. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un reactif de l'invention dans un test de diagnostic.
Les conjugues αe l'invention peuvent être utilises également pour développer des phases de capture universelles. Par exemple, des anticorps diriges contre un dérive de l'abiétane sont immobilises, directement ou indirectement, sur une phase ou un support solide et l' oligonucléotide du conjugue de l'invention est modifie par fixation a une de ses extrémités, de préférence au niveau de l'extrémité 5', d'un dérive de l'abiétane. La phase solide universelle est constituée par l'ensemble phase solide / anticorps dirige contre un dérive de l'abiétane. Un autre objet de l'invention est donc un dispositif comprenant outre la phase ou le support solide un anticorps polyclonal ou monoclonal immobilise directement ou indirectement sur la phase ou le support solide. L'anticorps est de préférence un anticorps monoclonal obtenu selon des techniques connues et en particulier selon la technique décrite dans l'exemple 10.
Un conjugue de l' invention comprenant un polymère chimique peut également être utilise comme marqueur ou pour développer une phase de capture universelle, comme décrit précédemment. Un conjugue de l'invention peut être utilise comme immunogène, pour l'immunisation d'organismes appropriés, tels que des animaux, pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux. L'invention a donc aussi pour objet un reactif et une composition diagnostiques comprenant en outre lesdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux et de préférence des anticorps monoclonaux obtenus selon des techniques connues, comme celle décrite à l'exemple 10. L'invention comprend également l'utilisation dudit reactif dans un test de diagnostic. Par ailleurs, un conjugué de l'invention peut être utilisé pour le dosage et/ou le suivi de produits chimiques, par technique de compétition ou par la technique dite sandwich. Ainsi, la présente invention a également pour objet une composition comprenant en outre un conjugué de l'invention et un anticorps polyclonal ou monoclonal obtenu par immunisation d'organismes appropriés à l'aide de l' immunogène précité, de préférence un anticorps monoclonal anti-acide abiétique obtenu par immunisation d'un animal selon des techniques connues, telles que celle décrite ultérieurement dans l'exemple 10. L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition telle que définie précédemment pour le dosage et/ou le suivi de produits chimiques.
La figure annexée représente les signaux obtenus lors la détection en ELISA de l'antigène alpha foeto- protéine soit par utilisation d'un anticorps polyclonal anti- alpha foeto-protéine (symboles ronds) , soit par utilisation d'un conjugué de l'invention AMVE/acide abiétique hydrazide/ anticorps polyclonal anti-alpha foeto-protéine (symboles carrés) . En abscisse sont représentées les quantités d'alpha foeto-protéine en ng/ml et en ordonnée les DO à 492 nm.
Exemple 1 : synthèse de l'ester N- hydroxysuccinimide de l'acide abiétique
Figure imgf000020_0001
Dans un ballon monocol de 100 ml sous atmosphère d'azote, 1 gramme d'acide abiétique (3,3 mmol-1 équivalent
(1 eq) ) est dissout dans 40 ml de CH2C12 à la température de 0° C. 1,1 eq de N-hydroxysuccimmide est ajouté. 1 eq de DDC est ensuite ajouté goutte à goutte, soit 0,825 ml d'une solution à 4 mol/1 dans du CH2C12 anhydride. La réaction est effectuée pendant 5 h à -20° C, puis le milieu est dilué dans 200 ml d' éther et ensuite précipité pendant 24 h à -20° C. Après filtration sur verre fritte, les eaux mères sont évaporées. La purification est effectuée sur 75 fois le poids de silice en éluant avec le mélange pentane/AcEtOH/CHCl3 (65/25/10). 0,0998 gramme de l'ester C24H3304N est récupéré, soit un rendement de 75%. C24H33XN
Mw=399.54 g/mole.
IR: (cm-1) 2957 (CH3,CH2,CH) ; 1777 (C=0 cycle NHS) ; 1740 (C=0 amide) .
RMN;
1H (ppm)
5,74 (s, CH) ; 5,3 (d, CH) ; 2,79 (s, CH2, NHS); 1,29 (s, CH3) ; 1,01 (d, CH3) ; 0,98 (d, CH3) ; 0,82 (s, CH3) . 13C (ppm)
173,5 (C=0) ; 169,2 (C=0) ; 145 (C quater.); 135,2 (C quater.); 122,4 (CH=) ; 120,4 (CH=) ; 25,6 (CH2 du NHS) . Exemple 2 : synthèse d' un dérivé glycyl-glycine activé de l'acide abiétique
La synthèse est effectuée selon le schéma réactionnel décrit ci-dessous :
Figure imgf000021_0001
Synthèse du chlorure d'acide (i):
L'acide abiétique est recristallisé avant de synthétiser le chlorure. Dans un ballon tricol de 100 ml sous atmosphère d'azote, 1,2 gramme d'acide abiétique (3,97 mmol-leq) sont dissous dans 10 ml de toluène anhydre et refroidi à 0° C. 3 eq soit 1ml de chlorure d'oxalyle sont additionnés en solution dans 3 ml de toluène anhydre
. Après 15 min à 0° C, la réaction est laissée 2 h à température ambiante. Le milieu est cannulé dans un ballon monocol et le toluène est éliminé sous vide partiel, puis séché 2 h sous vide. Le produit sera utilisé tel quel pour l'étape suivante. La disparition totale de l'acide est contrôlée en chromatographie sur couche mince
(pentane/AcEtOH/CHCl3 : 65/25/10) . Par infrarouge, l'apparition d'une bande à 1775 cm"1 montre la présence de chlorure d'acide (0=C-C1), ce qui confirme la disparition de la bande acide à 1700 cm"1 et de la bande OH à 3000 cm-1.
Le rendement est quantitatif.
Couplage de l'ester éthylique du glycyl- glycine (ii) :
1,95 gramme de l'ester éthylique du glycyl-glycine sous la forme d' hydrochlorure (9,92 mmol-1 eq) est dissous en présence de triéthylamine (2 eq) dans 30 ml de diclorométhane anhydre (distillé sur hydrure de calcium) dans un flacon tricol de 100 ml sous azote. Le chlorure de l'acide abiétique (9,92 mmol-leq) solubilisé dans 15 ml de dichlorométhane anhydre est additionné lentement à la solution précédente. La réaction est laissée 7 h à température ambiante. Les sels d' amodium sont précipités dans 200 ml d'éther, puis filtrés sur verre fritte. Des lavages sont effectués avec HCl 0, 1M, puis la phase organique est lavée par une solution saturée de NaCl avant d'être séchée sur Na2S0 . Après filtration, le solvant est éliminé sous vide partiel. Le rendement global sur les deux étapes est de 83%.
Saponification de l'ester éthylique du glycyl- glycine (iii) :
La saponification est réalisée en dissolvant environ 2 grammes d'ester dans 30 ml d' éthanol et en ajoutant lentement environ 5 ml de NaOH. Au bout de 2 h, l'ester a totalement disparu, ce qui est confirmé par les spots de Rf sur silice (éluant 70/30 : éther / acétone) (Rf ester=0,6 Rf acide=0) . Le milieu est dilué dans 250 ml d'eau puis lavé trois fois avec 50 ml d' éther. Après acidification par HC1 2N, le composé est extrait par trois fois avec 50 ml d' éther. La phase éthérée est lavée avec du NaCl saturé, séchée sur Na2S04, puis filtrée. Le rendement brut est de 86%.
Activation du dérivé glycyl-glycine sous forme d'ester N-hydroxysuccinimide (iv) : 0,2645 gramme de l'acide obtenu dans l'étape précédente (0,635 mmoles-1 eq) est dissous dans 40 ml de CH2C12/ puis 0,111 gramme de N-hydroxysuccinimide est ajouté. Le milieu est refroidi sous atmosphère d'azote à 0° C et 0,63 ml de DCC en solution à 1M dans CH2C12 est versé en une fois. La réaction est maintenue à température ambiante pendant 5 h et la dicyclohexylurée est précipitée à -20° C pendant 24 h. Le produit
Figure imgf000023_0001
est filtré sur 20 fois le poids de silice en éluant par un mélange éther / acétone (80/20) . Le rendement est de 20%. SM (FAB+)
Figure imgf000023_0002
MH+ (calc.)= 514.29169 g/mole. MH+ (exp.)= 514.29171 g/mole.
IR: (cm-1) 1643 (C=0 amide II) 1740 (C=0 amide) 1784, 1823 (C=0 NHS) 2937 (CH3, CH2, CH) 3389 (NH amide)
RMN: :H: (ppm)
0.79 (s, CH3) , 0.95 (d, J=l .6 Hz, CH3) , 0.98 (d, J=1.4 Hz, CH3) , 1.25 (s, CH3) , 2.79 (CH2, N- hydroxysuccinimide) , 4.34 (d, J=5, 6 Hz, CH2) , 5,3 (CH) , 5.74 (s, CH) .
13C: (ppm)
Exemple 3 : Synthèse d'un dérivé hydrazide de l'acide abiétique
L'acide abiétique est activée au préalable sous forme de chlorure, comme décrit dans l'exemple 3. 0,53 g d' hydrazide t-BOC (4 mmoles) est dissout dans 10 ml de toluène anhydride auquel sont ajoutées 0,6 ml (2 eq) de triéthylamine sous atmosphère d'azote. 1 eq de chlorure d'acide en solution dans le toluène sont ajoutés au goutte à goutte à la température de 0° C. La réaction est laissée pendant 18 h à température ambiante. Après quoi, on observe l'apparition d'un précipité. Le milieu est acidifié par ajout de 4 ml de HCl 1 N, le précipité est filtré sur verre fritte. Le milieu est dilué dans 50 ml d' éther et après séchage sur Na2S04, la phase organique est évaporée sous vide et séchée à la pompe. Le produit est filtré sur 20 fois le poids de silice en éluant avec un mélange hexane / acétone (80/20) . Le produit est isolé avec un rendement de 47 %.
L' hydrazide t-BOC est clivé dans le dioxane anhydre par une solution d'HCl anhydre à 4M dans le dioxane-anhydre . Après 20 h à température ambiante, un précipité apparaît. Un bullage d'azote permet d'entraîner l'HCl restant. L' évaporation au rotavap élimine l'acide et le dioxane. Le résidu est ensuite repris dans de l' éther puis filtré sur verre fritte. Le rendement en brut est de 54 %.
Exemple 4 : Synthèse d'un dérivé glycyl-glycine hydrazide de l'acide abiétique
1 ml d'hydrate d'hydrazine (19 mmole-21 eq) en solution dans 5 ml de dioxane anhydre sont agités vigoureusement. 0,4777 g d'ester obtenu selon l'exemple 3 (0,93 mmol-1 eq) en solution dans 45 ml de dioxane anhydre sont ajoutés en 1 h 30. Un précipité apparaît après 50 min de réaction. Après 4 h de réaction, le milieu est précipité dans 250 ml d' éther, la filtration permet d'isoler un composé qui est repris dans CHC13 puis séché sous vide après concentration. La dissolution dans CHC13 est suivie d'une reprécipitation dans l' éther et 200 mg de produit sont isolés, soit un rendement de 49 %.
IR: ( cm" 1 )
1655 (C=0 amide II)
2932 (CH3, CH2, CH) 3319 (NH, NH2 bande large)
Exemple 5 : couplage de l'ester N- hydroxysuccinimide de l'acide abiétique sur un oligonucléotide
Des oligonucléotides sont synthétisés sur un appareil automatique 394 de la société APPLIED BIOSYSTEMS en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Pour permettre le couplage d'un oligonucléotide à l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide abiétique sur une position bien déterminée, des fonctions réactives sont introduites sur l' oligonucléotide par l'intermédiaire de bras de liaison compatibles avec la synthèse automatique, comme décrit dans le brevet FR 93 07093 dont l'enseignement est inclus à titre de référence.
Les oligonucléotides suivants ont été synthétisés
Figure imgf000026_0001
SEQ ID NO 1 :
ACTAAAAACT AGTAATGCAA AG 22 mers
SEQ ID NO 2 : ATGTCACGAG CAATTAAGCG 20 mers
SEQ ID NO 3 :
ACTAAAAACT AGNAATGCAA AG 22 mers
SEQ ID NO 4 :
ACCCCGAGAT TTACGTTATG T 21 mers SEQ ID NO 5 :
TïTTTTTτττ ττττττττττ 20 mers
(*) les nucléotides bêta sont des nucléotides naturels (la liaison glycosidique est sous la forme anomérique bêta) . Les nucléotides alpha sont des nucléotides non naturels (la liaison glycosidique est sous la forme anomérique alpha) . Les oligonucléotides contenant les nucléotides alpha ont été préparés selon la technique décrite dans la demande de brevet PCT WO88/04301, dont le contenu est incorporé à titre de référence.
(**) Tr représente le temps de rétention en minutes de l' oligonucléotide dans les conditions décrites dans le brevet FR 93 07093 cité précédemment.
200 μg de l' oligonucléotide de synthèse SEQ ID NO 2 sont dissous dans 25 μl de tampon carbonate, 0,2 M/NaCl 0,15 M, pH=8,8. 500 μl d'une solution de l'ester C24H3304N à 2,5 mg/ml dans du DMSO anhydre sont ajoutés à la solution de l' oligonucléotide . Le mélange est agité vigoureusement puis laissé pendant 4 h à 50°C sur un thermo-mixeur. 10 μl NH4C1 IM pH=6 sont ajoutés en fin de réaction. Le milieu est séché au speed-vac, puis repris dans de l'eau. Trois extractions par du butanol sont effectuées pour éliminer ce qui n'a pas réagi. Après lyophilisation, le l' oligonucléotide est repris dans de l'eau bidistillée et analysé par HPLC en phase inverse sur une colonne RP300 avec l' éluant suivant : TEAA 0, IM - TEAA 0, 1M/CH3CN (50/50) . Le profil du chromatogramme montre la présence d'oligonucléotide non modifié et un massif de pics plus hydrophobes contenant l' oligonucléotide couplé à l'ester. Le rendement estimé par intégration de l'aire des pics et en considérant que les coefficients d'extinction moléculaire sont identiques est de 40%.
Exemple 6 : Couplage de l'ester C28H39θ6N3 sur un oligonucléotide
Le protocole est identique à celui décrit dans l'exemple 5. 20% de rendement en produit isolé sont obtenus après les extractions au butanol. La purification est effectuée en HPLC. Exemple 7 : Couplage du dérivé glycyl-glycine hydrazide sur le polymère AMVE
100 μl (1 mg) d'une solution à 10 mg/ml d'AMVE dans le DMSO anhydre sont mis à réagir avec 200 μl (0,2 mg) d' hydrazide glycyl-glycine d'acide abiétique en présence de 20 μl de DIEA et 680 ml de DMSO. La réaction est laissée 17 h à 37 ° C.
Exemple 8 : Couplage de l'ester C24H3304N sur la
BSA
20 mg de BSA (fraction 5-Sigma) sont dissous dans 1 ml de tampon carbonate 0,2 M/NaCl 0, 5 M, pH = 8,2. A 40 μl de cette solution (1,212 x 10"8 mol) sont ajoutés 960 μl d'une solution d'ester obtenu selon l'exemple 1 à 1 mg/ml (soit 200 eq) dans le DMSO anhydre. Après agitation vive, l'épendorf est agité pendant 5 h à 37° C sur un thermomixeur. Le mélange est dilué dans un grand volume d'eau, puis filtré sur Centricom (nom commercial) PM30 à 7 TPM. L'opération est répétée 3 fois pour éliminer l'ester n'ayant pas réagi et les produits d'hydrolyse, ainsi que pour entraîner le DMSO. Le résidu est séché au speed-vac puis repris dans un volume de 1 ml d'eau bidistillée. Le conjugué est dosé après dilution en mesurant la DO à 280 nm.
Le conjugué obtenu sera injecté à des souris pour induire une réponse immunitaire et la production d'anticorps monoclonaux, comme décrit dans l'exemple 10. Exemple 9 : Couplage de l'ester C28H3906N3 sur la BSA
Le protocole est identique à celui décrit dans l'exemple précédent. Le couplage met en jeu 40 ou 80 eq d'esters NHS. Les conjugués obtenus seront injectés à des souris pour induire une réponse immunitaire et la production d'anticorps monoclonaux, comme décrit dans l'exemple qui suit.
Exemple 10 : Obtention d'anticorps monoclonaux anti-acide abiétique
Un antigène de l'acide abiétique couplé sur de la BSA comme décrit respectivement dans les exemples 10 et 11 est utilisé comme immunogène. Chacun des antigènes a été injecté à des souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/C BYJICO. Les souris sont immunisées à 15 jours d'intervalle à l'aide de trois injections par voie intrapéritonéale associant respectivement 50 μg d'antigène et de l'adjuvant complet de Freund pour la lere injection et de l'adjuvant incomplet de Freund pour les autres injections. La fusion est réalisée avec la lignée myélomateuse SP2/0-AG14, selon la technique classique décrite par Kolher et Milstein (Nature 256, 495-497 1975) .
Les cellules ont été cultivées en utilisant un milieu de base: Iscove's Modified Dulbecco Médium (IMDM) additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/1), de 10% de sérum de veau foetal (SVF) , pH 6,7 à 7,3. Les réactifs additionnels suivants ont été ajoutés: insuline 4 mg/1, 2- mercaptoéthanol (10 μM) , éthanolamine (20 μM) , pénicilline
(100 U/ml), et streptomycine (50 μg/ml). Les cellules hétéroploldes obtenues ont été sub-cultivées tous les deux ou trois jours et congelées dans le milieu IMDM additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et 10% de diméthylsulfoxide (DMSO commercialisé par Sigma) d'abord à -80°C pendant 24 à 72 heures, puis conservées dans de l'azote liquide à -180°C. La concentration cellulaire est de 3,6 x 106 cellules par ampoule (2 x 106 cellules/ml) .
La production d'anticorps in vivo a été effectuée par injection intrapéritonéale des lignées d'hybridomes obtenues dans des souris femelles ayant de 4 à 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/C BYJICO.
Exemple 11 : Criblage des anticorps anti-acide abiétique
Un criblage a été effectué par la technique ELISA indirect comme suit : des plaques de polystyrène Maxisorb NUNC (commercialisées par la société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454) sont sensibilisées avec 100 μl d'acide abiétique couplé à un oligonucleotique (ODN) comme décrit dans l'exemple 2 à 0,25 μg/ml d'acide abiétique-ODN dans du tampon PBS x 3 (NaCl 0,45 M ; phosphate de sodium 0,15 M ; pH7,0). Les plaques ont été incubées une nuit à 22°C ou une heure à 37° C. Les plaques ont été saturées avec lOOμl de tampon PBS (50mM phosphate et 150mM NaCl, pH 7,2) additionné de 1% d'extrait de lait lyophilisé (Régilait) durant 1 heure à 37°C. 100 μl d'anticorps, dilués dans du PBS-Tween 20 à 0,05 % ont été ajoutés et incubés une heure à 37°C. 100 μl d' immunoglobulines anti- Ig totales de souris conjuguées à la phosphatase alcaline (Jackson Laboratories référence 115-055-062) dilués au 1/2000 dans du tampon PBS-BSA 1% (phosphate buffer saline- bovine sérum albumine) ont été ajoutés et incubés pendant une heure à 37 °C. La révélation a été effectuée par addition de 100 μl de p-nitrophénylphosphate ( (pNPP) , commercialisé par bioMérieux, référence 60002990) à la concentration de 2 mg/ml dans de la DEA-HCl (commercialisé par bioMérieux, référence 60002989), pH 9,8, et incubation pendant 30 minutes à 37°C. La réaction a ensuite été bloquée avec 100 μl de NaOH IN. Trois lavages ont été effectués entre chaque étape avec 300 μl de PBS-Tween 20 à 0,05 % et un lavage supplémentaire a été réalisé en eau distillée avant d'ajouter le pNPP .
Exemple 12 : Couplage de l'ester C28H3906N3 sur un anticorps anti-alpha-foeto-protéine (anti-AFP)
Le dérivé N-hydroxysuccinimide est couplé à un anticorps monoclonal anti-AFP dans un mélange tampon borate de sodium 0,1M pH 9,2 contenant 8% en volume de diméthylsulfoxide . Le rapport molaire anticorps / dérivé est 1/45. Le milieu réactionnel est agité 4 heures à température ambiante, avant d'être dialyse contre du PBS. - Mise en en évidence immunologique du greffage du dérivé de l'acide abiétique sur l'anticorps.
Les puits d'une plaque de icrotitration NUNC MAXISORB sont sensibilisés pendant deux heures à 37°C avec une solution de l'anticorps obtenu précédemment dilué à lOμg/ml dans un tampon carbonate 50 mM. Après lavage au PBS- 0.5% Tween 20, des solutions d'anticorps anti-acide abiétique marqués à la peroxydase dilués dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval sont incubées une heure à 37°C. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène diamine, la réaction colori étrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue à 492 nm sur un lecteur Axia Micro-reader, bioMérieux. Les signaux spécifiques obtenus sont de 2500 milliabsorbances . Exemple 13 : Couplage du dérivé glycyl-glycine hydrazide sur polymère et greffage sur anticorps antialpha foeto protéine (AFP)
10 μl (150 μg) d'une solution à 15 mg/ml d'AMVE dans du DMSO anhydre sont mis à réagir avec 10 μl (2 μg) d' hydrazide glycyl-glycine de l'acide abiétique en présence de 980 μl de DMSO anhydre. Le mélange est agité vivement pendant 5 min, puis 15 μl de ce milieu sont additionnés à 1 ml d'anticorps anti-AFP polyclonal à 0,5 mg/ml dans un tampon Tris 50 mM, pH = 9,2. Le couplage est effectué pendant 1 nuit à 37° C.
Exemple 14 : Couplage de l'acide abiétique et d'un anticorps polyclonal de lapin anti-alpha foeto-protéine sur la copolymère AMVE
Dans 1 ml de di éthylsulfoxide (DMSO) , sont dissoutes successivement 22 nmoles de copolymère AMVE (masse molaire 67 000 g/mole) puis 16 μmoles du dérivé hydrazide issu de l'exemple 3. Après 20 minutes d'agitation du mélange réactionnel à température ambiante, 15 μl de la solution sont prélevés et ajoutés à 1 ml de solution d'anticorps à 0,5 g/1 dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 9,2. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures. Les conjugués sont conservés en l'état à +4°C.
Le greffage de l'acide abiétique et de l'anticorps polyclonal sur le copolymère AMVE est contrôlé par un test immunologique comme suit :
Un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'acide abiétique obtenu selon l'exemple 10 est dilué à la concentration de 10 μg/ml dans un tampon carbonate 50 mM. Les puits d'une plaque de microtitration NUNC MAXISORB sont sensibilises avec cet anticorps pendant deux heures à 37°C. Apres lavages au PBS (Phosphate Buffer Saline) - 0.5% Tween 20, des solutions de complexes AMVE/anticorps polyclonal de lapin anti-alpha foeto-protéme/déπvé hydrazide de l'acide abiétique dilues dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval sont incubées une heure à 37°C. Deux possibilités de détection sont possibles à ce niveau de l'expérience :
- Détection de la fixation du dérivé hydrazide de l'acide abiétique
Apres trois lavages au PBS-Tween, on incube une heure a 37°C avec un anticorps monoclonal anti-acide abiétique conjugue a la Peroxydase dilué au 1/1500° dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène dia me, la reaction colorimétrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue a 492 nm sur un lecteur Axia Micro- reader, bioMérieux. Les valeurs de Densité Optique obtenues sont de 2500 milliAbsorbance pour les échantillons et de 170 pour le contrôle négatif, prouvant ainsi que le dérive nydrazide de l'acide abiétique s'est bien fixé sur le polymère.
- Détection de la fixation de l'anticorps polyclonal sur le copolymère AMVE.
Apres trois lavages au PBS-Tween, on incube une heure a 37°C avec un anticorps anti-anticorps de chèvre conjugue à la Peroxydase dilue au 1/3000° dans du PBS- Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène diamme, la réaction colorimétrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue à 492 nm sur un lecteur Axia Micro-reader, bioMérieux. Les valeurs de Densité Optique lues sont de 2500 milliAbsorbance pour les échantillons et de 25 pour le contrôle négatif, prouvant ainsi que l'anticorps polyclonal anti AFP s'est bien fixé sur le polymère.
Cet exemple montre que l'on peut détecter par une technique sandwich des polymères porteurs de l'acide abiétique .
Exemple 15 : Amplification du signal de détection de l'antigène alpha foeto-protéine par les complexes mixtes AMVE/dérivé hydrazide de l'acide abiétique / anticorps polyclonal anti-alpha foeto- protéine .
Un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'alfa fceto-protéine (AFP) est dilué à la concentration de 10 μg/ml dans un tampon carbonate 50 mM. Les puits d'une plaque de microtitration NUNC MAXISORB sont sensibilisés pendant deux heures à 37 °C avec cet anticorps. Après lavage au PBS - 0.5% Tween 20, des solutions d'antigène AFP dilué dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval sont incubées une heure à 37°C. A ce stade deux procédés de détection sont envisageables, soit d'une façon non amplifiée, soit en utilisant le complexe mixte précédemment obtenu pour accroître le niveau de signal. - Détection simple de l'antigène AFP
Après trois lavages au PBS-Tween, on incube une heure à 37°C l'anticorps polyclonal anti-AFP conjugué à la Peroxydase dilué au 1/3000° dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène diamine, la réaction colorimétrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue à 492 nm sur un lecteur Axia Micro-reader, bioMérieux. Les valeurs de densité optique (DO), lues à 492 nm sur l'Axia micro- reader de bioMérieux, pour les échantillons sont rapportées dans la figure annexée.
- Détection amplifiée par le polymère de 1' antigène AFP Après trois lavages au PBS-Tween, on fait incuber une heure à 37 °C le conjugué mixte polymère / acide abiétique hydrazide / anticorps polyclonal anti-AFP dilué au 1/50° dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval. Après lavages, on incube pendant une heure à 37°C un anticorps anti-acide abiétique marqué à la peroxydase. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène diamine. La réaction colorimétrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue à 492 nm sur un lecteur Axia Micro-reader, bioMérieux. Les valeurs de DO, lues à 492 nm sur l'Axia micro-reader de bioMérieux, pour les échantillons sont rapportées dans la figure annexée.
Les résultats montrent que l'utilisation de polymère permet d'amplifier les signaux de détection lors de l'utilisation d'une technique ELISA.
Exemple 16 : Essai en compétition avec des hormones naturelles
Un test ELISA en compétition a été effectué selon la technique décrite dans le brevet FR 93 07093 cité précédemment en utilisant les hormones naturelles T3, T4, progestérone, testostérone et oestradiol. Bien que les hormones stéroldiennes présentent une analogie de structure avec l'acide abiétique, il ne faut pas que les anticorps développés présentent des réactions croisées avec ces hormones.
La phase antigène a été obtenue comme décrit dans l'exemple 11, puis on incube une heure à 37°C des concentrations croissantes d'hormone dissoute dans une solution à 5 μg/ml d' un anticorps anti-acide abiétique dans du PBS-Tween contenant 10% en volume de sérum de cheval. Après lavages au PBS Tween, un anticorps anti- anticorps de souris couplé à la peroxydase en solution dans du PBS Tween - cheval est incubé une heure à 37°C. Après lavages, on ajoute le substrat enzymatique, o-phénylène diamine La réaction colorimétrique est stoppée par ajout d'acide sulfurique IN. L'intensité de la coloration est lue à 492 nm sur un lecteur Axia Micro- reader, bioMérieux.
Les résultats montrent qu'il n'y a pas d' inhibition avec les hormones stéroldiennes telles que œstradiol, testostérone et progestérone. Par contre on observe une réaction croisée avec les hormones thyroïdiennes T3 et T4. On obtient 25% d'inhibition pour une concentration de 0,33 μmole/ml d'hormone ce qui est bien au delà des concentrations physiologiques en hormone totale (c'est à dire libre et liée) qui sont respectivement de 2 - 4 nmole/1 pour la T3 et 50 - 100 nmole/1 pour la T4. Ces résultats permettent de conclure que les anticorps anti-acide abiétique sont très spécifiques et peuvent être utilisés dans le domaine de l'analyse sans risque de réaction croisée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé saturé ou insaturé de l'abiétane de formule générale (I)
Figure imgf000037_0001
dans laquelle Z est choisi dans le groupe consistant en -COOR5, -CONRX2, -COONR3R4, -COR6, -CON, -COOR5, -CHOHR7, -SR8, -OR8, -CN, -CNO, -CNS, -NCO, -NCS, -R1R2CR9 ; où R1, R2, RJ et R4, indépendamment les uns des autres représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle de préférence comprenant de 6 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué ; un radical alcène comprenant de 7 à 10 atomes de carbone ; un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; un radical aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R1 et R2 ou R3 et R4 ensemble peuvent former un cycle ou un heterocycle R° représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R° représente un atome d'hydrogène, un halogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; R8 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; et R9 est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS ; à la condition que
(a) si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé saturé :
- Z ne représente pas l'un quelconque des radicaux suivants : -COOH, -NCO, -CONH2, -CN, N-benzylamide, N-isopropylamide,
N-cyclohexylamide, N-cyclopentylamide, N- alphal-phényléthylamide, N, N-dibenzylamide, N- méthyl-N-cyclohexylamide, N-méthyl-N- phénylamide, N-phényl-N-benzylamide, anilide, et
-CONH[- (CH2)m-C6H5-nX'n] où m est égal à 0 ou 1, n est égal à 1, 2 ou 3, et X' représente un atome d'halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe haloalkyle, un groupe hydroxyle, un groupe alcoxy inférieur, un groupe nitro, un groupe carbonyle, un groupe carboalcoxy et un groupe méthyle, et (b) si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé insaturé :
- Z ne représente pas l'un quelconque des radicaux suivants : -COOH, N-isopropylamide, N-méthyl-N-cyclohexylamide, N-cyclohexylamide,
N-décylamide, N-dodécylamide, N-pentadécylamide, N-allylamide, N, N-diallylamide,
N-cycloheptylamide, N-cyclopentylamide,
N-benzylamide, N-alpha-phényléthylamide, N-alpha-phénylpropylamide, N, -dibenzylamide,
N-béta-phényléthylamide, N-éthyl-N-benzylamide, N-méthyl-N-phénylamide, anilide, et -CONH[- (CH2)π-CόH5-nX où m est égal à 0 ou 1, n est égal à 1, 2 ou 3, et X' représente un atome d'halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe haloalkyle, un groupe hydroxyle, un groupe alcoxy inférieur, un groupe nitro, un groupe carbonyle, un groupe carboalcoxy et un groupe méthyle, - Si Z représente -COOR5, R5 ne représente ni H, ni un radical méthyle, éthyle ou benzyle,
- Si Z représente -CONRX2, et si l'un de R1 et R2 représente H, l'autre de R1 et R2 ne représente pas H, et si l'un de R1 et R2 représente le radical éthyle, l'autre de R1 et R2 ne représente pas le radical éthyle,
- Si Z représente -COR6 ou -CHOH R7, R6 et R7 ne représentent pas H.
2. Dérivé selon la revendication 1, dans lequel le radical alkyle comprend 6 atomes de carbone et le radical aryle comprend de 6 à 14 atomes de carbone.
3. Dérivé selon les revendications 1 et 2, dans lequel -COONR3R4 représente un ester de N-hydroxysuccinimide, -COR6 représente un chlorure d'acide, -CONR ) l τR représente un groupement amide N-substitué dans lequel R1 et R2 indépendamment l'un de l'autre représente un atome d'hydrogène, un radical polyéthylèneglycol, un radical peptidyle éventuellement substitué comprenant de 2 à 6 résidus aminoacyles et -COOR5 est un ester de polyéthylèneglycol .
4. Dérivé selon la revendication 3, dans lequel R1 et R2 indépendamment l'un de l'autre représente un atome d'hydrogène, un radical tétraéthylèneglycol, un radical hexaéthylèneglycol ou un radical glycyl-glycine et -COOR5 est choisi parmi les esters de tétraéthylèneglycol et d' hexaéthylèneglycol .
5. Dérivé selon la revendication 4, dans lequel le radical glycyl-glycine est substitué par la N-hydroxysuccinimide .
6. Conjugué dérivé de l'abiétane selon la formule (II)
Figure imgf000040_0001
dans laquelle Z es t choisi dans le groupe consistant en -COOR5, -C0NR lXn 2, ™T 3R\ -COR6 , -CON, -COOR5, -CH0HR7, -SRd, -OR8, -CN, -CNO, CNS , -NCO, -NCS ,
-RαR2CR9 dans lesquels R1, R:, RJ et R4, indépendamment les uns des autres représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle comprenant de 6 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué ; un radical alcène comprenant de 7 à 10 atomes de carbone ; un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; un radical aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R1 et R2 ou R3 et R4 ensemble peuvent former un cycle ou un heterocycle ; R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne e comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; RD représente un atome d'hydrogène, un halogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; Rb représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; et R9 est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS ;
X est choisi parmi une chaîne aliphatique (CH2)n dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 10, un éthylène glycol ou un polyéthylèneglycol,, un résidu aminoacyle ou peptidyle;
Y représente un polymère choisi parmi les protéines, les polypeptides, les oligonucléotides ou polynucléotides et les polymères chimiques ; à la condition que si ledit conjugué comprend un dérivé insaturé de l'abiétane Y ne soit pas la BSA.
7. Conjugué selon la revendication 6, dans lequel -COONR3R4 représente un ester de N-hydroxysuccinimide, -COR6 représente un chlorure d'acide, -CONR:R" représente un groupement amide N-substitué dans lequel R1 et R2 indépendamment l'un de l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical peptidyle éventuellement substitué comprenant de 2 à 6 résidus aminoacyles.
8. Conjugué selon la revendication 6, dans lequel le radical peptidyle est un radical glycyl-glycine et avantageusement le radical glycyl-glycine est substitué par la N-hydroxysuccinimide.
9. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 6, 7 ou 8, dans lequel X est choisi parmi
(CH2)6, un éthylèneglycol, un polyéthylèneglycol, un radical peptidyle comprenant de 2 à 10 résidus aminoacyles et Y représente un polymère choisi parmi la BSA, les oligonucléotides de 18 à 22 mers, les homopolymères d'anhydride maléique, les copolymères à base d'anhydride maléique, les copolymères à base de N-vinylpyrrolidone et les polysaccharides.
10. Conjugué selon la revendication 9, dans lequel le polymère est choisi parmi les oligonucléotides de 20 mers et avantageusement l' oligonucléotide SEQ ID NO 2, les poly (anhydride maléique-éthylène) , les poly (anhydride maléique-propylène) , les poly (anhydride maléique-méthyl- vinyléther) (AMVE) et le N-vinyl pyrrolidone-N- acryloxysuccinimide (NVP-NAS) .
11. Conjugué selon la revendication 10, dans lequel le polymère est couplé à au moins une protéine et/ou un polypeptide et/ou un oligonucléotide.
12. Procédé pour l'obtention d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, selon lequel on immunise un organisme approprié, selon des techniques connues, avec un conjugué tel que défini dans les revendications 6 à 11.
13. Réactif, comprenant en outre un dérivé saturé ou insaturé de l'abiétane répondant à la formule (I)
Figure imgf000043_0001
dans laquelle Z est choisi dans le groupe consistant en -COORD, -CONRX\ -COONR >3J πR4" -CORb,-CON,
-COOR5, -CH0HR7, -SR8, -OR8, -CN, -CNO, -CNS, -NCO, -NCS, -R1R2CR9 ; où R1, R2, R3 et R4, indépendamment les uns des autres représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle de préférence comprenant de 6 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué ; un radical alcène comprenant de 7 à 10 atomes de carbone ; un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; un radical aminoacyle ou peptidyle éventuellement substitué, ou R1 et R2 ou R3 et R4 ensemble peuvent former un cycle ou un heterocycle ; Rα représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R" représente un atome d'hydrogène, un halogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical aryle, éventuellement substitué, comprenant de 6 à 20 atomes de carbone; R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; Rb représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle un radical alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcène comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alcyne comprenant de 1 à 10 atomes de carbone; et R' est choisi parmi -CN, -CNO, -CNS, -NCO et -NCS ; à la condition que si ledit dérivé de l'abiétane est un dérivé insaturé, Z ne représente pas un radical acide carboxylique, ledit dérivé étant couplé à une protéine choisie parmi les polypeptides, les antigènes et les anticorps.
14. Réactif, comprenant en outre un anticorps monoclonal ou polyclonal obtenu selon le procédé de la revendication 12, ledit anticorps étant immobilisé sur un support solide et/ou marqué par tout marqueur approprié.
15. Utilisation d'un réactif tel que défini selon les revendications 13 et/ou 14 dans un test de diagnostic.
16. Composition diagnostique comprenant en outre un réactif tel que défini selon les revendications 13 et/ou 14.
17. Réactif, comprenant en outre un conjugué tel que défini selon les revendications 6 à 11.
18. Utilisation d'un réactif tel que défini selon les revendications 14 et/ou 17 dans un test de diagnostic.
19. Composition diagnostique comprenant en outre un réactif tel que défini selon les revendications 14 et/ou 17.
20. Dispositif comprenant outre un support solide un anticorps monoclonal ou polyclonal obtenu selon le procédé de la revendication 12 immobilisé directement ou indirectement sur ledit support solide.
21. Composition pour le dosage et/ou le suivi de produits chimiques comprenant en outre un conjugué tel que défini dans les revendications 6 à 11 et un anticorps obtenu selon le procédé de la revendication 12.
22. Composition selon la revendication 21, dans laquelle ledit conjugué comprend un polymère tel que défini dans l'une des revendication 10 et 11.
23. Utilisation d'une composition selon les revendications 21 et 22 dans un test pour le dosage et/ou le suivi de produits chimiques.
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