WO1999062554A1 - Preparations de prevention / de traitement de maladies demyelinisantes auto-immunes - Google Patents

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WO1999062554A1
WO1999062554A1 PCT/JP1999/002818 JP9902818W WO9962554A1 WO 1999062554 A1 WO1999062554 A1 WO 1999062554A1 JP 9902818 W JP9902818 W JP 9902818W WO 9962554 A1 WO9962554 A1 WO 9962554A1
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fas
apoptosis
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antibody
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Takehiro Yatomi
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for an autoimmune demyelinating disease, which comprises a substance that suppresses apoptosis as an active ingredient.
  • Fas is a monoclonal antibody obtained by immunizing a mouse with human fibroblasts.
  • the Fas antibody (Yonehara S. et al., J. Ep. Med., 169, 1747—1756, 1989 And is a cell surface antigen that transmits apoptotic signals to cells. According to Itoh N. et al., The Fas gene was cloned, and it was found that Fas is a protein on the cell membrane of about 45 kD and its amino acid sequence belongs to the TNF receptor Yuichi family (Cel 66, 233-243, 1991).
  • mouse Fas gene was also cloned, and it was confirmed that Fas mRNA was expressed in the mouse thymus, liver, lung, heart, and ovary (Watanabe — Fukunaga, etc. J. Immunol., 148, 1274-1279, 1992).
  • Human Fas ligand is a polypeptide reported by Nagata et al. As an in vivo molecule that induces apoptosis in cells expressing Fas. (Takahashi T. et al., International Immunology, Vol. 6, pp. 157-157, pp. 1974, 1994). Human Fas ligand is a type II glycoprotein with a molecular weight of about 40 kD belonging to the TNF family, and is considered to form a trimer in vivo, like TNF (Tanaka M. et al., EMB ⁇ J ourna, Vol. 14, 1 129–1 135, 1995). Human Fas ligands include rat Fas ligands (Suda T.
  • Human Fas ligand recognizes not only human Fas but also mouse Fas and induces apoptosis. be able to. Conversely, rat Fas ligand and mouse Fas ligand can also recognize human Fas and induce apo! ⁇ Cis.
  • Fas-mediated apo-cis signal transduction Studies on the mechanism of intracellular signaling of apoptosis via Fas have been advanced, and it interacts with the intracellular domain of Fas, especially the domain called death domain (Death doma in) to transmit or transmit signals. Identification and cloning of suppressors have been reported, suggesting that interleukin-11-converting enzyme (ICE) -related thiol protease may contribute to Fas-mediated apo-cis signal transduction. Have been.
  • ICE interleukin-11-converting enzyme
  • apoptosis especially Fas-mediated apoptosis
  • Fas-mediated apoptosis is associated with various diseases and physiological phenomena.
  • apoptosis especially Fas-mediated apoptosis
  • hepatic cell death in viral fulminant hepatitis and certain autoimmune diseases abnormalities of Fas-mediated apoptosis Possible involvement has been suggested.
  • FasZF as ligand system may be responsible for functions other than apoptosis, for example, neutrophils and inflammatory effects (Kayagaki N. et al. 28, 667-675, 1996).
  • An autoimmune disease is a disease caused by autoreactive lymphocytes reacting and attacking a self-antigen, and has various symptoms. Under normal conditions, a living body does not show an excessive immune response to self-antigens, and thus self-tolerance is established.However, if the immune regulation function is abnormal, antibodies are produced against its own components or self-reaction occurs. Sexual lymphocytes appear. These self-reactive T cells are originally eliminated by apoptosis in the thymus, but accumulate there when they migrate to the periphery without being eliminated by some abnormality.
  • Autoimmune demyelinating disease is a disease caused by autoantibodies specific to the nervous system and caused by selective damage to the myelin sheath and its forming cells. Histologically, there is loss of myelin and cell infiltration around the vein. Clinical symptoms include neurological symptoms such as blindness, sensory disturbance, and paralysis of the extremities.
  • demyelinating inflammation such as multiple sclerosis that recurs and recurs may involve autoimmunity (De Keyser J , N eurology, 3 8 3 p. 74, 1988), as well as viral infection (Carp R. I. et al., Prog. Med. Viol., 24, 158-177, 1978). ing.
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic / therapeutic agent for a self-immune demyelinating disease by a novel mechanism of action that suppresses apoptosis. More specifically, the present invention provides a prophylactic / therapeutic agent and a method for treating an autoimmune demyelinating disease comprising a substance that inhibits apoptosis as an active ingredient.
  • the present inventors have intensively studied the relationship between apoptosis and the disease in order to rescue patients with autoimmune demyelinating disease, but the substance that suppresses apoptosis in an autoimmune demyelinating disease model has been studied. And found that the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following prophylactic and therapeutic agents.
  • a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune demyelinating disease containing a substance that suppresses apoptosis as an active ingredient.
  • autoimmune demyelinating disease is a disease in which demyelination occurs in the central nervous system.
  • autoimmune demyelinating disease is at least one selected from the group consisting of acute sporadic encephalomyelitis and multiple sclerosis. Therapeutic agent.
  • a method for preventing and treating an autoimmune demyelinating disease by administering a substance that suppresses apoptosis by administering a substance that suppresses apoptosis.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of FLIM58 on improving the disease state in a rat EAE model.
  • Figure 2 shows the effect of FLIM58 on improving weight loss in a rat EAE model.
  • the autoimmune demyelinating disease targeted by the preventive / therapeutic agent of the present invention includes various diseases. Roughly speaking, the disease is classified into diseases in which demyelination occurs in the central nervous system and diseases in which demyelination occurs in the peripheral nerve. Preferably, a disease in which a demyelinating condition occurs in the central nervous system is an object of the present invention.
  • Acute sporadic encephalomyelitis includes idiopathic acute sporadic encephalomyelitis, viral infectious acute sporadic encephalomyelitis or acute sporadic encephalomyelitis after vaccination.
  • Multiple sclerosis includes concentric sclerosis or neuromyelitis optica (Devic disease). These diseases, particularly multiple sclerosis, repeatedly remit and recur, but are the subject of the present invention at any time as a prophylactic agent during remission and as a therapeutic agent during relapse.
  • Acute inflammatory demyelinating polyradiculitis includes Gui 11 ain-Barrre syndrome and the like.
  • substances that suppress apoptosis suppress the apoptosis that occurs in each disease and bring about a therapeutic effect on the disease.
  • substances that suppress apoptosis suppress apoptosis that is occurring or is occurring in each situation, and prevent disease. Bring effect.
  • the prevention of the preventive / therapeutic agent of the present invention includes prevention in preventing a disease from occurring for the first time, and prevention of recurrence when the disease relapses after remission.
  • mammals other than humans may be included.
  • the substance that suppresses apoptosis used in the present invention is not particularly limited as long as it suppresses or inhibits apoptosis.
  • a substance that inhibits the binding of a Fs-angs gonist or a Fass-Fas ligand are not particularly limited as long as they block signal generation or transmission by Fas at any stage and suppress the function or biological action (particularly apoptosis) of the Fas / Fas ligand system.
  • a substance that suppresses the action, function, or expression of as ligand or Fa a substance that interacts with the extracellular domain of the Fas ligand or an extracellular domain of Fas, or that suppresses the interaction between the Fas ligand and Fas Influences the interaction between the intracellular region of the Fas cell and the intracellular factor interacting with it, or suppresses the activity of intracellular factors (eg, ICE-like protease) involved in the signaling of apoptosis via Fas. And those having various mechanisms of action. Also, it includes both proteinaceous high molecular substances and low molecular weight compounds.
  • a Fas derivative, an anti-Fas antibody, an anti-Fas ligand antibody, an antisense oligonucleotide against the Fas or Fas ligand gene which has an activity of suppressing Fas-mediated apoptosis, Or an antisense oligonucleotide to the mRNA of the Fas ligand, Substances that interact with the intracellular region or ICE inhibitors.
  • a Fas derivative, an anti-Fas antibody, or an anti-Fas ligand antibody which has an action to suppress apo1 ⁇ -cis through Fas, is used. preferable.
  • the anti-Fas antibody or anti-Fas ligand antibody is preferably an antibody having an antigen of Fas or Fas ligand derived from the subject to be treated.
  • an antibody using a human-derived Fas or Fas ligand as an antigen that is, an anti-human Fas antibody or an anti-human Fas ligand antibody is preferable.
  • the anti-Fas ligand antibody is preferably a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • Chimeric antibodies are preferably, for example, chimeric antibodies comprising a constant region from a human antibody and a variable region from a non-human antibody for human therapy.
  • the constant and framework regions (FR) are of human origin and the complementarity determining regions (CDR) are of non-human origin.
  • FR constant and framework regions
  • CDR complementarity determining regions
  • a reshaped human antibody human antibody
  • This is the result of replacing the complementarity-determining regions (CDRs) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, with the complementarity-determining regions of a human antibody.
  • Non-human antibodies can have biological disadvantages when used in human therapy, including relatively short circulating half-lives, lacking important immunoglobulin functional properties or being immunogenic.
  • monoclonal antibodies with antigenicity to humans of various mice or other organisms will be developed, after several initial or initial treatments with any of the different non-human antibodies, Even treatment for subsequent unrelated therapies may be ineffective due to cross-reactivity or may themselves be dangerous substances.
  • Chimeric or humanized antibodies overcome these.
  • the Fas gonist used in the present invention is preferably one that suppresses apoptosis of Fas-expressing cells by an appropriate Atsey method described in W095Z13293 or the like. This specification refers to this gazette and is incorporated herein by reference.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the molecular species of the antibody used in the present invention is not particularly limited. As long as it binds to an antigen and inhibits apoptosis via Fas, it may be a normal form of an antibody molecule or a fragment of an antibody. For example, Fab, F (ab ') 2 , Fv, or a single-chain Fv (SCFv) in which the Fv of the H chain and the L chain are linked by an appropriate linker so as to form a single chain may be used. Can be.
  • the anti-Fas ligand antibody or anti-Fas antibody used in the present invention can be prepared using known techniques.
  • the preparation method is described in International Patent Application Publication Nos. WO 95Z13293 and WO95Z02290. This specification refers to this gazette and is incorporated herein by reference.
  • the chimeric antibody that can be used in the present invention can be produced by using a known method for producing a chimeric body.
  • a method for producing a chimeric protein is described in Example 1 of International Patent Application Publication WO 95/13293. This document describes this gazette This is incorporated herein by reference.
  • Humanized antibodies for use in the present invention are described in Nature, et al., Nature, 332, 3232, 1998, European Patent Publication No. 02 39400, Quen et al., Pro. USA, Vol. 86, No. 10029, 1989, International Patent Application Publication Nos.WO 90/07861, W 092/11018, Co., etc., Proc. Natl. USA, 88, 2869, 1991, Co, etc., Nature, 351, 501, 1991 and Co, J. Immunol., 148, 1149, 1992 Etc. can be used.
  • the present description refers to this document, and is incorporated herein by reference.
  • Preferable examples of the present invention include a humanized anti-Fas ligand antibody having a CDR of a mouse antibody F919-9-9-18 antibody disclosed in Examples of International Patent Application Publication WO 97/02290. Can be
  • the Fas derivative used in the present invention is not particularly limited as long as it has at least an ability to bind to a Fas ligand or suppresses apoptosis caused by the Fas ligand.
  • the known Fas amino acid sequence has any mutation such as deletion, substitution, or addition of one or more amino acids, and maintains the binding activity to the Fas ligand while maintaining the biological activity of the FasZFas ligand system, particularly It includes those that suppress apoptosis through Fas. Specific examples include Fas mutants, truncated form Fas, chimeric proteins, fusion proteins, or chemically modified ones.
  • the origin of the Fas is not limited to animal species as long as it has the above-mentioned properties, but human origin is considered in consideration of antigenicity. It is preferred to use
  • Human Fas-Fc (hFas_Fc), which is a chimeric protein of the Fc region of human immunoglobulin, and the like.
  • the Fas derivative may be of any production method, and can be produced by a known sequence and a known gene recombination technique. For example, the preparation method is described in Example 1 of International Patent Application Publication No. WO 95/13293 and in Example of WO 97/42319. This specification refers to this gazette and is incorporated herein by reference.
  • Fas derivatives having a deletion at the N-terminus of Fas are also preferable, and among these, in particular, as of March 14, 1996, Ichigo-san, Ichigi-cho, Tsukuba 1-chome, Ichigi-cho, Ibaraki, Japan Deposited with the Biotechnology Research Institute (Accession No. P-15514 and Accession No. P-151515), and transferred from the original deposit to the international deposit on March 6, 1997 (Accession No. FERM BP — 58 54 and accession number FE RM BP — 58 55) Fas derivative sh Fas (nd 29) encoded by plasmids (pMl 304 and pMl 317) contained in E.
  • coli — F c and shF as ( nd29) -hinge discloses a known human Fas extracellular Fas cell in which the N-terminal amino acids 1 to 29 have been deleted. It is a derivative containing a region and has high activity and is a preferred example as an active ingredient of the agent for preventing or treating cirrhosis of the present invention.
  • the present specification refers to this document, and is incorporated herein by reference.
  • Fas derivatives used in the present invention can be prepared by a suitable Atsie method. It is found that the compound has a binding activity or an inhibitory activity on apoptosis via Fas.
  • the antisense oligonucleotide against the Fas or Fas ligand gene or the antisense oligonucleotide against the mRNA of the Fas or Fas ligand used in the present invention suppresses the expression of Fas or the Fas ligand.
  • the sequence is not limited. Examples thereof include antisense oligonucleotides of the Fs ligand disclosed in Example 20 of International Patent Application Publication No. WO95 / 13293. This specification refers to this gazette and is incorporated herein by reference.
  • the preventive and therapeutic agent for autoimmune demyelinating disease of the present invention can be used as a therapeutic agent for patients with autoimmune demyelinating disease.
  • it can be used as a preventive agent for autoimmune demyelinating disease in patients with systemic autoimmune disease or organ-specific autoimmune disease other than nervous system, virus infected or vaccinated, etc.
  • it can be used as a relapse preventive agent at the time of remission for autoimmune demyelinating diseases, especially diseases that repeatedly repeat remission and relapse such as multiple sclerosis.
  • the preventive / therapeutic agent for autoimmune demyelinating disease of the present invention is characterized by containing the above-mentioned substance for inhibiting apoptosis, and comprises at least one pharmaceutical carrier or medium, for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil , Mineral oil, higher alcohols, higher fatty acids or harmless organic solvents, etc., as required, excipients, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizing agents, anti-adsorption agents, stabilizers , A preservative, an antioxidant, a buffer, a tonicity agent or a soothing agent, etc., in an appropriate combination to form a pharmaceutical composition kit. It can be administered orally or parenterally, such as intravenously, intracoronarily, subcutaneously, intramuscularly, transdermally, by inhalation, rectally or topically.
  • sterile water for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil , Mineral oil, higher alcohols,
  • it can be administered parenterally, systemically or locally, rapidly or continuously.
  • the dosage for humans varies depending on the condition, age, and administration method of the patient, but it is necessary to select an appropriate amount.
  • an appropriate divided volume in the range of about 0.01 to 1.0 Omg ZKg. In this range, it is preferable to select an appropriate divided capacity in the range of about 0.01 to 10 OmgZKg.
  • the use of the agent for preventing or treating an autoimmune demyelinating disease of the present invention is not limited to these administration methods or dosages.
  • multiple appointments such as a Fs-angs gonist, a substance that suppresses the binding of a Fs-Fas ligand, or an anti-Fs ligand antibody. ⁇ It may be used in combination with a substance that controls one cis, or in combination with other drugs.
  • an injectable preparation may be a purified substance that suppresses apoptosis, for example, a Fas antagonist, a substance that suppresses the binding of a Fas-Fas ligand, or an anti-Fas ligand antibody or a solvent such as saline or buffer. Dissolved in water and, if necessary, add an anti-adsorption agent to make a formulation. In addition, it may be lyophilized for reconstitution before use, or may be formulated by adding a general excipient for lyophilization.
  • the apoptosis-suppressing substance used in the prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune demyelinating disease of the present invention is used in an autoimmune demyelinating disease model, particularly in the central nervous system as shown in Examples.
  • an autoimmune demyelinating disease model that causes the marrow, it shows an inhibitory effect on organ and tissue damage.
  • the effects of suppressing the damage to organs and tissues shown in the Examples are preventive effects, therapeutic effects, and their combined effects.
  • the effects can be shown by examining the disease in a relapse model.
  • experiments were performed using a mouse model, and thus, an anti-mouse Fas ligand antibody was used to demonstrate the effect of suppressing organ and tissue damage. The same effect as in the example can be expected by the human Fas ligand antibody.
  • the preventive / therapeutic agent for autoimmune demyelinating disease of the present invention has no toxicity as shown in the examples and can be used safely. That is, the preventive / therapeutic agent for autoimmune demyelinating disease of the present invention is expected to have a preventive, therapeutic or ameliorating effect on autoimmune demyelinating disease.
  • the method for producing the anti-Fas ligand antibody, the humanized anti-Fas ligand antibody and the Fas derivative of the present invention and the apoptosis-suppressing activity are disclosed in Examples of International Patent Applications WO 97Z02290 and WO 97/42319. .
  • Mouse Fas ligand extracellular region derived from soluble mouse Fs ligand WX 2 (J. Immunology, 157, 3918-3924, 1996)
  • a gene encoding a chimeric protein fused to the mouse CD40 ligand intracellular domain, transmembrane domain and part of the extracellular domain (78 amino acids from the N-terminus) is located downstream of the Human Elongation Factor 1 (EF) Promoter Seven plasmids were prepared (Mizushi ma-Nagata, Nucl eic Acids Research, 18, 5322, 1990).
  • the above plasmid was transfected into WR19L cells, and recombinant cells W40 LFL expressing mouse Fas ligand on the cell membrane were obtained and used as antigens for administration.
  • Armenian hamsters were used as immunized animals.
  • Freund's complete adjuvant and 1 X 10 7 cells of W40 LFL mixed administered subcutaneously Armenian hamsters, 2 X 1 0 7 amino W40 LFL suspended in PBS was administered subcutaneously after one month.
  • 5 ⁇ 10 s W40 LFL suspended in PBS were administered to the footpad.
  • the lymph node cells were removed and fused with mouse myeloma cells P3-X63-Ag8-U1 (P3-U1).
  • the hybridoma FLIM After selection with HAT medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine), the hybridoma FLIM, which has the activity of neutralizing the cytotoxicity of mouse Fas ligand in the culture supernatant from the grown hybridomas I got 58.
  • Hypridoma FL I M58 was cultured in serum-free medium, Hy bridoma-S FM (GI BCO BRL), and the culture supernatant was purified using a protein A column (PROS EP—A, Bioprocessing). Antibody FLIM 58 was obtained. The protein concentration was calculated from the absorbance at 280 nm.
  • Example 2 Toxicity test of anti-mouse Fas ligand antibody FLI ⁇ LI58 (1) Method
  • Anti-mouse F aS ligand antibody FLIM58 was administered via the tail vein at a dose of 100 mg Z3Om1 / kg.
  • the control group received physiological saline at a dose of 3 Oml / kg via the tail vein.
  • Each of the two strains had three cases per group.
  • the observation period was set to 7 days, and body weight measurement, hematology (red blood cells, white blood cells, platelets), blood biochemical tests (GOT, GPT, urea nitrogen), and visual necropsy were performed.
  • Body weight gain, hematological test values (red blood cells, white blood cells, platelets), and blood biochemical test values (GPTT, GPT, urea nitrogen) after administration of the FLIM 58-treated group No difference was found.
  • no abnormalities were found in the group administered with the anti-mouse Fs ligand antibody FLIM58 by autopsy findings by visual inspection.
  • Complete Freund's adjuvant (manufactured by Difco Laboratories) containing 1 mg Zm 1 of killed H37Ra tuberculosis (Difco Laboratories) 10 ml was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, and the resulting precipitate was treated with 1.6 ml Freund Incomplete adjuvant (Manufactured by Difco Laboratories) to produce a complete adjuvant having an increased concentration of killed H 37 Ra tuberculosis bacteria.
  • Guinea pig brain-derived myelin basic protein (Sigma) was dissolved in physiological saline to a concentration of 2.5 mgZm 1, and the above-mentioned complete adjuvant with an increased concentration of H37Ra tuberculosis-killed bacteria was added to 1: 1.
  • the mixture was mixed, and an emulsion was prepared using a Luer-lock type Hamilton gas evening syringe (manufactured by Chuo Chemical Industry).
  • mice Female, 11-week-old, Lewis rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 5 OmgZkg of pentobarbital (manufactured by Dainippon Pharmaceutical), and the above emulsion was applied to both hind limbs (Foot ad). 1 was administered respectively. Fourteen days later, the spleen was removed, loosened using tweezers, and centrifuged. The obtained cell precipitate was suspended in a 0.017M Tris-0.747% ammonium chloride solution, and only erythrocytes were hemolyzed. The remaining cells were washed with Hanks' solution (Nissui Pharmaceutical) to obtain spleen cells.
  • Hanks' solution Nasui Pharmaceutical
  • the disease state was scored based on the criteria shown in Table 1 below (Experimenta 1N eurology, 151, 221, pp. 22-228, 1995), and the effect of FLIM 58 administration was examined. .
  • the results are shown in FIGS.
  • the condition is d ay 5 to d ay 6 (days after transplantation 5 days to 6 days). The following day, the same shall apply hereinafter), and the disease state of the FLIM58-administered group was milder than that of the control group after day 6.
  • Weight loss associated with the onset of the disease state occurred from d ay 4 to d ay 5, and after d ay 5, the weight loss of the FLIM58-administered group was milder than that of the control group.
  • a 1: 1 emulsion of myelin basic protein and complete adjuvant was prepared in the same manner as in Example 3, and a 0.2 ml / Fot pad dose (0.2 mi rat) was administered to both feet of the rat under anesthesia.
  • OmgZkg of the anti-mouse Fs ligand antibody FLIM58 was administered via the tail vein 7 days after the splenocyte transplantation (day 7).
  • the control group received an equal amount of purified IgG derived from normal hamster monoglobulin. There were 5 cases in each group.
  • the disease state was scored based on the criteria in the table shown in Example 3, and the administration effect of FLIM58 was examined.
  • the therapeutic agent for preventing or treating autoimmune demyelinating diseases of the present invention which comprises a substance that inhibits apoptosis as an active ingredient, has an inhibitory effect on apoptosis, and particularly, Fas / represented by Fas-mediated cell death. It has a prophylactic or therapeutic effect on autoimmune demyelinating diseases involving apoptosis such as the biological action of the Fas ligand system. Therefore, the substance that suppresses apoptosis of the present invention is expected as a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune demyelinating diseases in which apoptosis is involved, such as death of cells mediated by Fas.

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Description

明 細 自己免疫性脱髄性疾患予防 ·治療剤 技術分野
本発明はアポトーシスを抑制する物質を有効成分として含有することを特徴と する自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤に関する。 背景技術
F a sは、 ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗 体である F a s抗体 （Yo n e h a r a S. 等、 J . E p. Me d. ， 169巻、 1747— 1756頁、 1989年） によって認識され、 アポト一シ スのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。 I t o h N. 等に よって、 F a s遺伝子がクロ一ニングされ、 F a sが約 45 kDの細胞膜上の蛋 白質であり、 そのアミノ酸配列から TNFレセプ夕一ファミリーに属することが 判明した （C e l し 6 6巻、 2 3 3— 243頁、 1 9 9 1年） 。 また、 マウス F a s遺伝子もクロ一ニングされ、 F a s mRNAが、 マウスの 胸腺、 肝、 肺、 心臓、 卵巣で発現していることが確認された （Wa t an ab e — Fukun ag a等、 J. Immuno l . , 148巻、 1274- 1279 頁、 1992年） 。
ヒト F a s リガンドは、 F a sを発現する細胞に対してアポトーシスを 誘導する生体内分子として、 N a g a t a等により報告されたポリぺプチ ドである （T a k a h a s h i T. 等、 I n t e r n a t i o n a l I mmu n o l o g y、 6巻、 1 5 6 7— 1 5 74頁、 1 9 94年） 。 ヒ ト F a sリガンドは、 TNFフアミリーに属する分子量約 40 kDの II型糖 んか蛋白質で、 TNFと同様に、 生体内で 3量体を形成すると考えられている (T a n a k a M. 等、 EMB〇 J o u r n a し 14巻、 1 1 29— 1 135頁、 1995年） 。 また、 ヒト F a sリガンドはラット F a sリガンド (S u d a T. 等、 Ce i l , 75巻、 1 169— 1 178頁、 1993年） やマウス F a s リガンド （T a k a h a s h i T. 等、 C e l 1， 7 6 巻、 969— 976頁、 1994年） と細胞外領域において高いホモロジ一を有 しており、 ヒト F a sリガンドはヒト F a sのみでなくマウス F a sをも認 識し、 アポトーシスを誘導することができる。 逆に、 ラット Fa sリガンド及び マウス F a sリガンドも、 ヒト F a sを認識してアポ! ^一シスを誘導することが できる。
また、 F a sを介するアポトーシスの細胞内シグナル伝達機序に関しても 研究が進んでおり、 F a sの細胞内領域、 特にデスドメイン （D e a t h doma i n) と呼ばれる領域と相互作用してシグナルを伝達または抑制する因 子の同定及びクローニングが報告されている他、 インターロイキン一 1変換酵素 (I CE) 関連チオールプロテア一ゼが F a sを介するアポ] シスのシグナル 伝達に寄与している可能性が示唆されている。
近年、 アポ] ^一シス、 特に F a sを介するアポトーシスと種々の疾患及び生理 現象との関連が示唆されている。 たとえば、 ウィルス性劇症肝炎における肝細胞 死及びある種の自己免疫疾患等において、 F a sを介するアポトーシスの異常が 関与する可能性が示唆されている。
また、 F a sZF a sリガンド系はアポトーシス以外の機能、 たとえば、 好中 球に作用して起炎症性に働く作用等も担っている可能性が示唆されている (Ka y a g a k i N. 等、 臨床免疫 28巻、 667— 675頁、 1996 年） 。
自己免疫疾患は、 自己反応性リンパ球が自己抗原に反応し攻撃することにより 起こる疾患であり様々な症状を呈する。 正常時は生体は自己抗原に対して過剰な 免疫反応を示さないため自己寛容が成立しているが、 免疫調節機能に異常が生じ ると自己の成分に対して抗体を産生したり、 自己反応性リンパ球が出現するよう になる。 この自己反応性 T細胞は、 本来、 胸腺においてアポトーシスにより除去 されるものであるが、 何らかの異常により排除されることなく末梢に移行すると そこで蓄積されるようになる。 また、 B細胞においても自己寛容が成立して おり、 自己反応性 B細胞もアポトーシスで除去されるが、 何らかの異常により除 去されることがない場合、 T細胞と同様に末梢に蓄積されることとなる。 このよ うな自己反応性リンパ球が自己免疫疾患を引き起こす原因となる。
自己免疫性脱髄性疾患は、 神経系に特異的な自己抗体により引き起こされ、 髄 鞘とその形成細胞が選択的に障害されて起こる疾患である。 組織学的には髄鞘の 消失、 静脈周囲の細胞浸潤が認められる。 臨床症状は失明、 感覚障害、 四肢の麻 痺などの神経症状等が挙げられる。
脱髄性疾患は詳細な原因は解明されておらず、 例えば寛解と再発を繰り 返す多発性硬化症等の脱髄性炎症の発症原因は、 自己免疫が関与する可能 性 （D e K e y s e r J . , N e u r o l o g y, 3 8巻， 3 7 1〜 3 74頁、 1 9 88年） の他に、 ウィルス感染 （C a r p R. I . 等、 P r o g. Me d. V i o l . ， 24巻， 158〜 177頁、 1978年） が示 唆されている。
従来の脱髄性疾患の治療は、 免疫抑制剤と ACTH (副腎皮質刺激ホルモン） を併用する等の非特異的な免疫抑制による治療法 （S a i d a K. 最新医学 10巻、 1963〜 1971頁 1991年） が挙げられるが、 この治療法で は長期的効果が認められず、 さらに慢性進行型には効果が得られていない (We i n e r等， Ne u r o l o g y 39巻、 1 143〜 1 149頁， 1 989年） 。 このため、 最近の治療では自己免疫 T細胞の活動を特異的に 抑制する方法として、 T細胞ワクチン （Be n— Nun A等、 Na t u r e, 292巻、 60〜6 1頁， 1 98 1年） 、 T細胞レセプ夕一ワクチン （ J . Immuno l , 152巻、 2510頁， 1994年、 J. Immuno l、 1 52巻、 2520頁， 1 994年） 、 経口免疫寛容 （S c i e n c e, 25 9巻、 1 3 2 1頁， 1 9 9 3年） 、 ペプチドアナログ （ I mmu n o 1. Tod ay, 14巻、 602〜609頁， 1993年） または抗 C D 4抗体等の 投与が検討されている。 しかし、 これら治療剤の一部 （T細胞レセプ夕ーヮクチ ン） において自己抗原反応性 T細胞の末梢血中の頻度を低下させる効果等が報告 されているにすぎず、 現状では著明な効果を示す結果は得られてはいない。 脊髄のホモジネ一トを結核死菌を含むフロイント完全アジュバントとともに皮 下接種すると感受性のある動物は 10〜14日後に後肢麻痺などの脳脊髄炎の症 状を発症する。 これが実験的自己免疫性脳脊髄炎 （e xp e r imen t a l a u t o i mmu n e e n c e p h a 1 omv e 1 i t i s、 E AE) の原形 である。 実験動物を脳由来の蛋白質抗原またはペプチドで感作することにより誘 導される代表的な自己免疫病モデルであり、 多発性硬化症および急性散在性脳脊 髄炎 （ADEM) の疾患モデルとして古くから精力的に研究されてきた。 これま で、 EAEの解析によって中枢神経系に発現するミエリン塩基性蛋白、 プロテオ リピッド蛋白などの自己抗原に特異的な T細胞が関与していることが （O t a K. 等、 Na t u r e, 346巻、 1 83〜 1 87頁， 1 990年） 明ら力、 になっている。
近年、 多発性硬化症と F a sZF a sリガンド系を介したアポトーシスの関連 についての研究が報告されいる。 S ame e r D. 等は、 ヒト多発性硬化症の 病変部位において、 ミクログリア細胞と浸潤 T細胞に F a sリガンドの発現を、 オリゴデンドロサイ トに F a sの発現を認めたと報告した （ J . E x p. Me d. , 184巻， 2361〜 2370頁， 1996年） 。 K imb e r l y A. 等 （ J . I mmu no し ， 158巻， 3096〜 3099頁， 1997 年） 及び H a n s p e t e r W. 等 （J . I mm u n o 1. , 1 58巻， 3100〜 3103頁， 1997年） は、 F a sまたは F a sリガンドの遺伝的 欠損マウスであるそれぞれ 1 p rマウスまたは g 1 dマウスを用いた多発性 硬化症の動物実験から、 F a s ZF a sリガンドを介したアポトーシスが多 発性硬化症に関与することを示唆した。 一方、 E i l e e n A. 等 （J . C l i n. I nv e s t. , 98巻， 1602〜 1612頁， 1996年） 及び Su z an a M. 等 （J. Exp. Me d. ， 186巻， 507〜 515頁， 1997年） は同じ 1 p rマウスまたは g 1 dマウスを用いた多発性硬化症の動 物実験から、 F a sZF a sリガンドを介したアポトーシスが多発性硬化症に関 与しないことを示唆した。 すなわち、 多発性硬化症の病態と F a s Z F a sリガ ンド系を介したアポト一シスの関連については、 研究者によって結果が異なり依 然不明のままであった。 また、 一般に脳組織は薬物の到達効率が悪く、 生体に投 与された F a s / F a sリガンドによるアポトーシスを抑制する薬剤が、 脳組織 内で F a s / F a sリガンドによるアポ 1 ^一シスを抑制できるかどうかも未知で あり、 遺伝的に F a sあるいは F a sリガンドを欠損したマウスと同じ結果が得 られるかどうかも不明であった。
現在までにアポトーシスを抑制することによる自己免疫性脱髄性疾患の予防 - 治療剤はなく、 また F a sリガンドに結合する治療剤も報告されていない。 発明の開示
本発明の課題は、 アポトーシスを抑制するという新規な作用機序による自己免 疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤を提供することである。 より詳しくは、 本発明は アポトーシスを抑制する物質を有効成分とする自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治 療剤及び治療方法を提供する。
本発明者らは、 自己免疫性脱髄性疾患患者を救うべく、 アポトーシスと当該疾 患の関連性を鋭意研究してきたが、 自己免疫性脱髄性疾患モデルにおいてァ ポトーシスを抑制する物質が病態を改善することを見出し、 本発明を完成し た。
すなわち、 本発明は、 下記の予防 ·治療剤に関するものである。
( 1 ) アポトーシスを抑制する物質を有効成分とする自己免疫性脱髄性疾患の 予防 ·治療剤。 (2) 前記アポトーシスを抑制する物質が F a sアン夕ゴニストである （1) に記載の予防 ·治療剤。
(3) 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s— F a sリガンドの結合を抑 制する物質である （1) または （2) に記載の予防 ·治療剤。
(4) 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s誘導体である （1) 〜 （3) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
(5) 前記アポトーシスを抑制する物質が抗 F a s リガンド抗体である (1) 〜 （3) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
(6) 前記自己免疫性脱髄性疾患が中枢神経系に脱髄が起きている疾患である (1) 〜 （5) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
(7) 前記自己免疫性脱髄性疾患が急性散在性脳脊髄炎及び多発性硬化症から なる群から選ばれる少なくとも 1つである （1) 〜 （5) のいずれかに記載の予 防 ·治療剤。
(8) アポトーシスを抑制する物質を投与する自己免疫性脱髄性疾患の予防 · 治療方法。
(9) 自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療のための医薬品を製造するためのァ ポト一シスを抑制する物質の使用。 図面の簡単な説明
図 1は、 FL I M58のラット EAEモデルにおける病態の改善効果を示すグ ラフである。
図 2は、 FL I M58のラット EAEモデルにおける体重減少の改善効果を示 すグラフである < 発明を実施するための最良の形態
以下にさらに詳細に本発明を説明する。
本発明の予防 ·治療剤の対象となる自己免疫性脱髄性疾患には種々の疾患が含 まれる。 大別すると脱髄状態が中枢神経に起きている疾患または脱髄状態が末梢 神経に起きている疾患に分類される。 好ましくは、 脱髄状態が中枢神経に起きて レ ^る疾患が本発明の対象となる。
脱髄状態が中枢神経に起きている疾患には急性散在性脳脊髄炎または多発性硬 化症等が含まれる。 急性散在性脳脊髄炎には特発性急性散在性脳脊髄炎、 ウィル ス感染性急性散在性脳脊髄炎またはワクチン接種後の急性散在性脳脊髄炎等が含 まれる。 多発性硬化症には同心円性硬化症または視神経脊髄炎 （D e v i c病） 等が含まれる。 これらの疾患、 特に多発性硬化症は、 寛解と再発を繰り返すが、 寛解時には予防剤として、 再発時には治療剤としてそのいずれの時期においても 本発明の対象となる。
脱髄状態が末梢神経に起きている疾患には慢性炎症性脱髄性多発性神経根炎ま たは急性炎症性脱髄性多発性神経根炎等が含まれる。 急性炎症性脱髄性多発性神 経根炎には G u i 1 1 a i n - B a r r e症候群等が含まれる。
これらの疾患において、 アポ! シスを抑制する物質が各疾患で起こっている アポトーシスを抑制し、 疾患の治療効果をもたらす。 また、 これらの疾患の寛解 時またはこれらの疾患の病態傾向を有する時に、 アポトーシスを抑制する物質が 各状況で起こっているまたは起こりつつあるアポトーシスを抑制し、 疾患の予防 効果をもたらす。
本発明の予防 ·治療剤の予防には、 疾患が初めて起こる事を防ぐ際の予防、 及 び疾患が寛解後に再燃する際の再発予防等が含まれる。
なお、 治療対象としてはヒトが重要であるが、 ヒ卜以外の哺乳類も含みう る。
本発明で使用されるアポトーシスを抑制する物質とは、 アポトーシスを抑制ま たは阻害するものであれば特に限定されない。
具体的には F a sアン夕ゴニストまたは F a s— F a sリガンドの結合を抑制 する物質がある。 これらは、 F a sによるシグナルの発生または伝達をいずれか の段階で遮断し、 F a s / F a s リガンド系の機能または生物作用 （特にァ ポトーシス） を抑制するものであれば特に限定されず、 F a sリガンド若しくは F a sの作用、 機能若しくは発現を抑制するもの、 F a sリガンド細胞外領域若 しくは F a s細胞外領域と相互作用するもの、 F a sリガンドと F a sの相互作 用を抑制するもの、 F a s細胞内領域とそれと相互作用する細胞内因子との相互 作用に影響するもの、 または F a sを介するアポトーシスのシグナル伝達に関す る細胞内因子 （例えば I C E様プロテアーゼ） の活性を抑制するもの等のさまざ まな作用機序を有するものが含まれる。 また、 タンパク質性の高分子物質または 低分子の化合物のいずれもが含まれる。
より具体的には、 F a sを介するアポトーシスを抑制する活性を有する、 F a s誘導体、 抗 F a s抗体、 抗 F a sリガンド抗体、 F a s若しくは F a sリ ガンドの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 F a s若しくは F a sリガンドの mR N Aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 F a sの 細胞内領域と相互作用する物質または I C E阻害剤が挙げられる。 ここで、 本発 明で用いるアポ卜一シスを抑制する物質としては、 F a sを介するアポ 1 ^一シス を抑制する作用を有する、 F a s誘導体、 抗 F a s抗体または抗 F a sリガンド 抗体が好ましい。 さらに、 抗 F a s抗体または抗 F a sリガンド抗体はその治療 対象由来のそれぞれ F a sまたは F a sリガンドを抗原とする抗体が好ましい。 例えば、 ヒ卜の治療にはヒト由来の F a sまたは F a sリガンドを抗原とする抗 体すなわち抗ヒト F a s抗体または抗ヒト F a sリガンド抗体が好ましい。
また、 抗 F a sリガンド抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。 キメ ラ抗体は、 例えばヒ卜の治療にはヒト抗体からの定常領域及び非ヒト抗体からの 可変領域からなるキメラ抗体が好ましい。 ヒト化抗体は、 例えばヒトの治療には 定常領域及びフレームワーク領域 （F R) がヒト由来で、 相補性決定領域 （C D R) が非ヒト由来であるのが好ましい。 さらに好ましくは、 再構成 （reshaped) したヒト型抗体 （ヒト抗体） を本発明に用いることができる。 これはヒト以外の 哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （C D R) をヒト抗体の相補性決 定領域へ置換したものである。 非ヒト抗体は、 ヒトの治療に用いる際には比較的 循環半減期が短い、 重要な免疫グロプリンの機能的特性を欠くまたは免疫原性を 有する等の生物学的短所が生じることがある。 さらに今後種々のマウス若しくは 他の生物のヒトに対する抗原性を有するモノクローナル抗体が開発されると、 い ずれかの異なった非ヒ卜抗体を用いた最初若しくは初期の数回の処置の後、 それ に続く関連のない療法のための処置でさえ、 交 ¾反応性のために効果がなかった り、 若しくはそれ自身が危険な物質となることがあり得る。 キメラ抗体またはヒ 卜化抗体はこれらを克服する。 また、 本発明で用いる F a sアン夕ゴニストは、 W095Z13293号公報 などに記載されている適当なアツセィ法において F a s発現細胞のアポト一シス を抑制するものが好ましい。 本明細書はこの公報を引用し、 これをもって本明細 書の一部とする。
なお、 本発明で用いられる抗体はポリクローナル抗体であってもモノクロ一ナ ル抗体であってもよく、 また、 本発明に使用される抗体の分子種は特に限定され ない。 抗原に結合し F a sを介するアポトーシスを阻害するかぎり、 通常の形態 の抗体分子であってもよいし、 抗体の断片も使用することができる。 例え ば、 F ab, F (ab' ) 2 ， F vまたは H鎖と L鎖の F vを一本鎖となるよう な適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (SCFv) も使用するこ とができる。 これらのうちでも特に平成 7年 6月 22日付で日本国茨城県つくば 巿東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P - 1 5002) 、 さらに平成 8年 5月 9日付で原寄託から国際寄託に移管し た （受託番号 FERM BP— 5535) ハイブリド一マ F 919— 9— 18に より産生されるマウス F 919-9- 18抗体が好ましい例である。
本発明で用いる抗 F a sリガンド抗体または抗 F a s抗体は、 公知技術を利用 して作製することが出来る。 例えば国際特許出願公開 WO 95Z13293号公 報及び W〇95Z02290号公報等に作成方法が記載されている。 本明細書は この公報を引用し、 これをもって本明細書の一部とする。
本発明で用いる事ができるキメラ抗体は、 既知のキメラ坊体の製造方法を用い て製造することができる。 例えば国際特許出願公開 WO 95/ 13293号公報 の実施例 1にキメラ蛋白質の作成方法が記載されている。 本明細書はこの公報を 引用し、 これをもって本明細書の一部とする。
本発明に用いるヒト化抗体は、 R i e c hmann し 等、 Na t u r e, 3 3 2巻、 3 2 3頁、 1 98 8年、 第 02 3 940 0号ヨーロッパ特許公 報、 Que e n等、 P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA, 86巻、 10029号、 1989年、 国際特許出願公開 WO 90/07861号公報、 W 092/11018号公報、 Co等、 P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA, 88巻、 2869頁、 1991年、 Co等、 Na t u r e、 351卷、 501頁、 1991年及び Co等、 J . Immuno l . 、 148巻、 1 149 頁、 1992年等に開示されている方法を用いて製造することができる。 本明細 書はこの文献を引用し、 これをもって本明細書の一部とする。 本発明の好適な例 としては、 国際特許出願公開 WO 97/02290号公報の実施例に開示されて いるマウス抗体 F 919— 9— 18抗体の CDRを有するヒト化抗 F a sリガン ド抗体が挙げられる。
本発明で使用されている F a s誘導体は、 少なくとも F a sリガンドとの結合 能を有するかまたは F a sリガンドによるアポトーシスを抑制するものであ れば、 特に限定されない。 公知の F a sアミノ酸配列中に 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加といった任意の変異を有し、 Fa sリガンドとの結合活性を 維持したまま、 F a sZF a sリガンド系の生物作用、 特に F a sを介するアポ トーシスを抑制するものが含まれる。 具体的には、 F a s変異体、 切断型 (t r unc a t e d f o r m) F a s、 キメラタンパク質、 融合タンパク質 または化学的に修飾されたもの等が含まれる。 なお、 その由来となる F a sは上 記の性質を有する限り、 その動物種を問わないが、 抗原性を考慮すればヒト由来 のものを使用するのが好ましい。
より具体的には、 公知の F a sの細胞外領域若しくは膜貫通領域を欠失し た F a s、 または F a s細胞外領域と他のタンパク質とのキメラタンパク質、 例 えばヒト F a s細胞外領域とヒト免疫グロプリンの F c領域のキメラタンパク質 であるヒト F a s— Fc (hF a s _F c) 等が挙げられる。 F a s誘導体は、 いずれの製法のものでも良く、 公知の配列及び公知の遺伝子組換技術等により製 造することができる。 例えば国際特許出願公開 W〇 95/13293号公報の実 施例 1及び W〇97/42319号公報の実施例中等に作成方法が記載されてい る。 本明細書はこの公報を引用し、 これをもって本明細書の一部とする。
また、 F a sの N末端に欠失を有する F a s誘導体も好ましく、 これらのうち でも特に平成 8年 3月 14日付けで日本国茨城県つくば巿東一丁目一番三号のェ 業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P— 15514及び受託番 号 P— 1 5 5 1 5) 、 さらに平成 9年 3月 6日付で原寄託から国際寄託に移 管 （受託番号 FERM B P— 58 54及び受託番号 F E RM BP— 58 55) されている大腸菌が含むプラスミド （pMl 304及び pMl 317) に コードされている F a s誘導体 s h F a s (n d 29) — F cおよび s hF a s (n d 2 9 ) -h i n g e (国際特許出願公開 WO 9 7 / 42 3 1 9号公 報） は、 公知のヒト F a sの N末端の 1番目から 29番目までのアミノ酸を欠失 した F a s細胞外領域を含有する誘導体であり、 活性が高く、 本発明の肝硬変の 予防 ·治療剤の有効成分として好適な例である。 本明細書はこの文献を引用し、 これをもって本明細書の一部とする。
これらの本発明に用いる F a s誘導体は、 適当なアツセィ法により F a sリガ ンドに結合活性または F a sを介するアポ卜一シスの抑制活性を有することがわ かる。
本発明で使用される F a s若しくは F a sリガンドの遺伝子に対するアンチセ ンスオリゴヌクレオチドまたは F a s若しくは F a sリガンドの mR N Aに対す るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 F a sまたは F a sリガンドの発現を抑 制するものであれば、 その配列は限定されない。 その例として国際特許出願公開 WO 9 5 / 1 3 2 9 3号公報の実施例 2 0に開示されている F a sリガンドのァ ンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。 本明細書はこの公報を引用し、 これをもって本明細書の一部とする。
本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤は、 自己免疫性脱髄性疾患患者 に対して治療剤として使用することが可能である。 また、 全身性自己免疫疾患若 しくは神経系以外の臓器特異的自己免疫疾患有する患者、 ゥィルス感染者または ワクチン接種者等に対して自己免疫性脱髄性疾患に対する予防剤として使用する ことが可能であり、 さらに自己免疫性脱髄性疾患、 特に多発性硬化症等の寛解と 再発を繰り返す疾患に対して寛解時に再発予防剤として使用することが可能であ る。
本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤は、 上述のアポトーシスを抑制 する物質を含有することを特徴とし、 少なくとも一種の医薬用担体または媒体、 例えば滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 鉱油、 高級アルコール、 高級脂肪酸または 無害性有機溶媒等、 さらには必要に応じて賦形剤、 着色剤、 乳化剤、 懸濁剤、 界 面活性剤、 溶解補助剤、 吸着防止剤、 安定化剤、 保存剤、 酸化防止剤、 緩衝剤、 等張化剤または無痛化剤等を適宜組み合わせて医薬組成物ゃキッ卜の形態を取る ことができ、 経口的に、 または静脈内、 冠動脈内、 皮下、 筋肉内、 経皮、 吸入、 直腸内若しくは局所等の非経口的に投与することができる。
好ましくは非経口的に、 全身または局部的に、 急速または持続的に投与するこ とができる。
ヒトに対する投与量は患者の病態、 年齢または投与方法により異なるが、 適宣 適当な量を選択することが必要である。 例えば、 全身投与の場合、 約 0 . 0 1〜 1， 0 0 O m g ZK gの範囲で適当な分割容量を選択することが可能である。 そ の範囲において約 0 . 0 1〜1 0 O m g ZK gの範囲で適当な分割容量を選択す ることが好ましい。 しかしながら、 本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 '治療 剤の使用はこれらの投与方法または投与量に限定されるものではない。 さらに、 F a sアン夕ゴニスト、 F a s— F a sリガンドの結合を抑制する物質若しくは 抗 F a sリガンド抗体等の複数のアポ！ ^一シスを制御する物質を組み合わせて使 用しても、 または他の薬剤と併用しても良い。
本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤は常法に従って製剤化すること ができる。 例えば注射用製剤は、 精製されたアポトーシスを抑制する物質例えば F a sアン夕ゴニスト、 F a s— F a sリガンドの結合を抑制する物質若しくは 抗 F a sリガンド抗体等を生理食塩水若しくは緩衝液等の溶剤に溶解し、 必要に 応じて吸着防止剤等を加えて製剤化する。 また、 使用前に溶解再構成するために 凍結乾燥させたり、 凍結乾燥のための一般的な賦形剤を加えたりして製剤化して も良い。
本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤に用いるアポト一シスを抑制す る物質は、 自己免疫性脱髄性疾患モデル、 特に実施例で示す様な中枢神経系に脱 髄を起こす脱髄性疾患モデルにおいて、 臓器及び組織の障害の抑制効果を示す。 実施例で示す臓器及び組織の障害の抑制効果は予防効果、 治療効果及びそれらの 合いまつた効果であるが、 病態の再発モデルで検討することにより再発予防効果 を示すことができる。 さらに、 実施例では、 マウスを用いたモデルで実験を行つ ているため、 抗マウス F a sリガンド抗体を使用し臓器及び組織の障害の抑制効 果を示しているが、 ヒトに用いる場合は抗ヒト F a sリガンド抗体により実施例 と同様の効果が期待できる。
なお、 本発明の自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療剤は、 実施例において示す とおり毒性がなく、 安全に使用できる。 すなわち、 本発明の自己免疫性脱髄性疾 患の予防 ·治療剤は、 自己免疫性脱髄性疾患に対して予防、 治療または改善作用 が期待される。
以下に実施例をもって、 本発明をいつそう具体的に説明するが、 これらは実施 の一例として示すものであり、 本発明はこれらにより何ら限定されるものではな レ 。 また、 以下の記載において用いる略号は当該分野において慣例として用いら れる略号に基づくものである。
本発明の抗 F a sリガンド抗体、 ヒト化抗 F a sリガンド抗体及び F a s誘導 体の製法及びアポトーシス抑制活性は国際特許出願公開 WO 97Z02290号 公報及び W097/42319号公報の実施例に開示されている。
実施例 1 抗マウス F a sリガンド抗体の作製、 生産及び精製
( 1) 抗マウス F a sリガンド抗体の作製
可溶型マウス F a sリガンド WX 2 ( J . Immuno l o gy, 1 57巻、 3918— 3924頁、 1996年） 由来のマウス F a sリガンド細胞外領域と マウス CD40リガンドの細胞内領域、 膜貫通領域および細胞外領域の一部 （N 末端から 78アミノ酸） を融合したキメラ蛋白質をコードする遺伝子をヒトエロ ンゲーシヨンファクタ一 （EF) プロモー夕の下流に有するプラスミドを作製し 7こ (M i z u s h i ma— N a g a t a, Nu c 1 e i c A c i d s Re s e a r c h, 18巻、 5322頁、 1990年） 。 上記プラスミドを WR 19 L細胞にトランスフエクトし、 細胞膜上にマウス F a sリガンドを発現して いる組換え細胞 W40 LFLを得て、 投与抗原として用いた。 免疫動物としてァ ルメニァハムスターを用いた。 フロイント完全アジュバントと混合した 1 X 107 個の W40 LFLをアルメニアハムスターの皮下に投与し、 1ヶ月後に P B Sに懸濁した 2 X 1 07 個の W40 L F Lを皮下に投与した。 さらに 1ケ 月後、 P B Sに懸濁した 5 X 1 0 s 個の W 40 L F Lをフットパッドに投与 した。 3日後、 リンパ節細胞を取り出し、 マウスミエローマ細胞 P 3—X63— Ag 8 -U 1 (P 3-U 1) と細胞融合した。 HAT培地 （ヒポキサンチン—ァ ミノプテリン一チミジン） による選択の後、 生育したハイプリ ドーマの中から、 その培養上清中にマウス F a sリガンドによる細胞障害性を中和する活性を有す るハイブリドーマ FL I M 58を得た。
(2) FL I M58の生産および精製
ハイプリ ドーマ FL I M58を無血清培地 Hy b r i d oma-S FM (G I BCO BRL) にて培養し、 その培養上清をプロテイン一 Aカラム （PROS EP— A、 B i op r o c e s s i n g) で精製し、 精製抗体 FL I M 58を得 た。 蛋白濃度は 280 nmの吸光度より算出した。 実施例 2 抗マウス F a sリガンド抗体 F L I λί 58の毒性試験 (1) 方法
雄性、 8週齢、 DBAZ1 Jマウスおよび C 3HZHeマウス （日本チヤ一ル ス · リバー製） を用いた。 抗マウス F a s リガンド抗体 F L I M 5 8を 100mgZ3 Om 1 /k gの用量で尾静脈から投与した。 またコントロール群 には生理食塩水を 3 Oml /k gの用量で尾静脈から投与した。 2種の系統とも に各群 3例とした。 観察期間を 7日間とし、 体重測定、 血液学的検査 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査 （GOT、 GPT、 尿素窒素） 、 肉眼によ る剖検を行った。
(2) 結果
抗マウス F a sリガンド抗体 F L I M 58投与群の投与後の体重増加、 血液学 的検査値 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査値 （G〇T、 GPT、 尿素窒素） はコントロール群と比べて差を認めなかった。 また、 肉眼による剖検 所見においても抗マウス F a sリガンド抗体 FL IM58投与群に異常は認めら れなかった。
実施例 3 抗マウス F a sリガンド抗体 FL I M58のラット EAEモデル （養 子免投モテリレ， ad op t i ve t r an s f e r mod e l) の病態改善効果
( 1 ) ラット養子免疫モデルの作製
1 mgZm 1の H 37 R a結核死菌を含有するフロイン卜完全アジュバン ト （D i f c o L a b o r a t o r i e s製） 1 0m lを 1 000回転、 5分間遠心し、 得られた沈殿を 1. 6m 1のフロイン卜不完全アジュバント (D i f c o L abo r a t o r i e s製） に再懸濁し、 H 37 R a結核死菌 濃度を高めた完全アジュバントを作製した。 モルモット脳由来ミエリン塩基性蛋 白 （S i gma製） を 2. 5 mgZm 1となるように生理食塩水に溶解し、 上述 の H37 R a結核死菌濃度を高めた完全アジュバントと 1 ： 1に混合し、 ルアー ロック型ハミルトンガス夕イトシリンジ （中央化学工業製） を用いてェマルジョ ンを作製した。
雌性、 1 1週齢、 L e w i sラットを 5 OmgZk gのペントバルビ夕一 ル （大日本製薬製） を腹腔内に投与して麻酔した後、 両後肢 （F o o t ad) に上述のェマルジヨン 0. lm 1をそれぞれ投与した。 14日後、 脾臓 を摘出し、 ピンセッ トを用いてほぐした後、 遠心し、 得られた細胞沈殿を 0. 017Mトリス— 0. 747 %塩化アンモニゥム溶液中に懸濁し、 赤血球の み溶血させた。 残った細胞をハンクス液 （日水製薬製） で洗浄し、 脾細胞と した。 脾細胞を 4 X 106 個 Zm 1の濃度で 25 g/m 1モルモッ卜脳由来ミ エリン塩基性蛋白、 2mM L—グルタミン （日水製薬製） 、 10%非働化 FB S ( J RH B i o s c i e n c e製） 含有 RPM 1 1640培地 （G I BC〇 B RL製） に植え込み、 5 %炭酸ガス存在下 3 7°Cで 3日間培養した。 脾細胞培養液を 1， 00 0回転、 5分間遠心した後、 細胞沈殿をハンクス 液に再懸濁した。 この脾細胞を、 雌性、 1 1週齢、 Lewi sラットに 1. 2 X 1 07 個 Z2m 1 Zラットの用量で腹腔内に移植して E A Eモデルを作製し た。
(2) 抗マウス F a sリガンド抗体 FL I M58の投与
1 OmgZk gの抗マウス F a sリガンド抗体 FL I M58を脾細胞移植の当 日 （d a y O) および移植 6日後 （ d a y 6 ) に尾静脈から投与した。 コン トロ一ル群には、 正常ハムス夕一ァ—グロブリン （ROCKLAND製） からプ 口ティン Aカラムを用いて精製した I gGを等量投与した。 各群 5例ずつと した。
(3) 評価
下記に示す表 1のクライテリアを基に病態をスコア化 （Exp e r ime n t a 1 N e u r o l o g y, 1 5 1巻， 22 1〜22 8頁， 1 99 5年） し、 F L I M 58の投与効果を調べた。
表 1 ラット EAEモデルの病態スコア
Figure imgf000023_0001
(4) 結果
結果を図 1及び図 2に示す。 病態は d ay 5〜d ay 6 (移植後日数 5日〜 6 日後、 以下同じ） に発生し、 d ay 6以降において FL I M58投与群の病態は コントロール群よりも軽度であった。 また、 病態発症に伴う体重減少は d ay 4 〜d ay 5から起こり、 d ay 5以降において FL I M58投与群の体重減少は コントロール群よりも軽度であった。
実施例 4 抗マウス F a sリガンド抗体 FL I M58のラット EAEモデル
(感作モテル、 a c t i v e l y i mm u n i z a t i o n mod e 1 ) の病態改善効果
(1) ラット感作モデルの作製
実施例 3と同様にミエリン塩基性蛋白と完全アジュバントの 1 ： 1ェマルジョ ンを作製し、 麻酔下でラットの両足に 0. lm i /F o o t p a dの用量 を （0. 2m i ラット） 投与した。
(2) 抗マウス F a sリガンド抗体 FL I M58の投与
1 OmgZk gの抗マウス F a sリガンド抗体 FL IM58を脾細胞移植 7日 後 （d ay 7) に尾静脈から投与した。 コントロール群には、 正常ハムスターァ 一グロブリン由来精製 I gGを等量投与した。 各群 5例ずっとした。
(3) 評価
実施例 3に示した表のクライテリアを元に病態をスコア化し、 FL I M58の 投与効果を調べた。
(4) 結果
病態は d ay 10に発生した。 F L I M 58投与群の病態はコントロール群よ りも軽度であった。 産業上の利用可能性
本発明のアポト一シスを抑制する物質を有効成分とする自己免疫性脱髄性疾患 の予防'治療剤は、 アポトーシスの抑制作用により、 特に F a sを介した細胞の 死に代表される F a s / F a sリガンド系の生物作用等のアポトーシスが関与す る自己免疫性脱髄性疾患の予防または治療効果を有する。 従って、 本発明のアポ トーシスを抑制する物質は、 F a sを介した細胞の死等、 アポトーシスが関与す る自己免疫性脱髄性疾患の疾患の予防 ·治療剤として期待される。

Claims

請求の範囲
1 . アポトーシスを抑制する物質を有効成分とする自己免疫性脱髄性疾患の
' 予防 ·治療剤。
5 2 . 前記アポトーシスを抑制する物質が F a sアン夕ゴニストである請求項 1に記載の予防 ·治療剤。
3 . 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s— F a sリガンドの結合を抑 制する物質である請求項 1または 2に記載の予防 ·治療剤。
4 . 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s誘導体である請求項 1〜3の0 いずれかに記載の予防 ·治療剤。
5 . 前記アポトーシスを抑制する物質が抗 F a sリガンド抗体である請求項 1〜 3のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
6 . 前記自己免疫性脱髄性疾患が中枢神経系に脱髄が起きている疾患である ことを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
5 7 . 前記自己免疫性脱髄性疾患が急性散在性脳脊髄炎及び多発性硬化症から なる群から選ばれる少なくとも 1つであることを特徴とする請求項 1〜5のいず れかに記載の予防 ·治療剤。
8 . アポトーシスを抑制する物質を投与する自己免疫性脱髄性疾患の予防 · 治療方法。
0 9 . 自己免疫性脱髄性疾患の予防 ·治療のための医薬品を製造するためのァ ポト一シスを抑制する物質の使用。
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