WO1999057269A1

WO1999057269A1 - Gene hrpi humain

Info

Publication number: WO1999057269A1
Application number: PCT/JP1999/002314
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Kishimoto; Shin-Ichiro Niwa; Kazuko Nishikawa
Original assignee: Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 1999-11-11
Also published as: EP1077258A4; EP1077258A1

Description

明細書ヒ卜 H R P I 技術分野

本発明は、肝癌において発現が顕著であり、また細胞周期や細胞分裂を制御している因子である蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該蛋白質に対する抗体に関する。背景技術

癌の発症は遺伝子の何らかの異常によって起こることが知られており、特に、遺伝子の転写レベルでの変動異常が癌の発症の主たる原因と考えられている。癌の発症機構の解明のため、発癌過程で発現状態が変化する蛋白質およびそれをコ —ドする遺伝子、または、組織間で発現状態が変化する蛋白質およびそれをコードする遺伝子の取得は 1 9 8 0年頃よりさかんに行われてきた。

本発明者は、国際出願公開番号 W〇 9 7 / 1 0 3 3 3号において、発癌過程で発現が増加する新規な蛋白質として H R P I蛋白質を、該蛋自質をコードする新規な遺伝子として H R P I遺伝子を、サブトラクシヨン法を活用して単離 ·同定して、それらの配列を開示した。発明の開示

本発明は、ヒトにおける H R P I蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を同定し、もって遺伝子工学的手法により該蛋白質および該遺伝子を作製、検出すること、さらに該蛋白質に対する抗体を提供することを課題とする。

本発明は、ヒト H R P I遺伝子の塩基配列を明らかにし、該塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。

また、本発明は、前記塩基配列の相補塩基配列か

レオチドをも提供する。 W また、本出願において、ヒト HRP I蛋白質（以降、単にヒト HRP Iという場合がある）の作製方法が開示される。具体的には、ヒト HRP I cDNAを導入した形質転換体にヒト HRP Iを作製させる方法が開示される。また、その作製方法により作製したヒト HRP Iが開示される。また、ヒト HRP Iのァミノ酸配列のうち 1または複数のアミノ酸を置換、欠失または付加したヒト HRP I の変異体の作製方法および該作製方法により作製されたヒト HRP Iの変異体が開示される。

また、本発明は、前記ヒト HRP Iをコードするポリヌクレオチドまたはヒト HRP I変異体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の相補塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドをも開示するものである。アンチセンスポリヌクレオチドはポリヌクレオチドに含まれるものであるが、本明細書において、特にアンチセンス鎖の塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを明示する場合にアンチセンスポリヌクレオチドという。アンチセンスポリヌクレオチドは、また、本発明は、ヒ卜 HRP Iもしくはヒト HRP I変異体をコードするポリヌクレオチドの全部または 12塩基以上からなる一部であるポリヌクレオチドを開示するものである。

このポリヌクレオチドは、コード領域の部分のものについては、それぞれヒト HRP Iまたはヒト HRP I変異体の部分長蛋白質を作製するために使用可能である。また、プロ一ブとしても使用可能である。

また、本発明は、ヒト HRP Iまたはヒト HRP I変異体をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドの全部または 12塩基以上からなるこのアンチセンスポリヌクレオチドは、それぞれヒト HRP Iまたはヒト HR P I変異体の生合成を阻害することが可能である。また、プローブとしても使用可能である。

また、本発明は、前記のボリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチドを含む）の誘導体を開示するものである。

また、本発明は、前記のポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチドを含む）を化学修飾したポリヌクレオチドを開示するものである。

また、本発明は、前記ヒト HRP Iおよびヒト HRP Iの変異体を認識する抗体を提供する。本出願において、ヒト HRP Iの抗原性、すなわち、ヒト HRP Iから抗体を作製することが可能であることが開示される。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト HRP Iを電気泳動した結果を示す。

図 2は、ヒト HRP Iをゥサギに投与して得られた抗血清でヒト HRP Iをゥエスタンブロッ卜した結果を示す。

図 3は、ヒトの各組織でのヒト HRP I mRNAの発現を、ノザンブロッティングにより調べた結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明のヒト HRP I遺伝子は、これを適当なベクタ一（例えば、 TAクロ一ニングベクタ一）に挿入した後、宿主（例えば、大腸菌）に導入することで形質転換体を作製することができる。そして、前記形質転換体を培養することにより、ヒト HRP Iを作製することができる。

自然の変異によりまたは人工の変異（例えば、 Mo l e c u l a r C l on i n g 2 nd Ed i t i on 15. 1 - 15. 1 13ページに記載の方法）により、ポリヌクレオチドがコ一ドするポリぺプチドの主たる機能に変化を与えることなく、該ポリヌクレオチド変化させることが可能である。この方法により、本発明のヒト HRP Iについても配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列における一または複数のァミノ酸を置換、欠失したァミノ酸配列または配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列に一または複数のアミノ酸を付加したアミノ酸配列からなる蛋白質、すなわちヒト HRP Iの変異体を作製することが可能である。また、ヒト HRP I蛋白質とその変異体との間のホモロジ一は、アミノ酸レべルで、 75 %以上 100 %未満であることが好ましい。

本発明のヒト HRP I蛋白質の変異体のアミノ酸配列は、該変異体をコードする遺伝子の塩基配列から決定することが可能である。例えば、市販のプログラム (例えば、 Ge n e t i x— Ma c (登録商標、ソフトウェアディべロブメント社製）を用いて可能である。

遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチドから生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。したがって、本発明のヒト HR P Iをコードするポリヌクレオチドとは、縮重の全てのパターンを含むものである。

配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DN Aは、天然に存在するヒトヒト HRP I c DNAである。

本発明は、前記ヒト HRP Iをコードするポリヌクレオチド（非翻訳領域を含む）のアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体を含むものである。該アンチセンスポリヌクレオチドは、ヒト HRP Iをコードするボリヌクレオチドに八ィブリダイズすることが可能なものであり、それがハイプリダイズするポリヌクレオチドがコ一ド領域のポリヌクレオチドであれば該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの生合成を阻害することが可能である。

ポリペプチドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドは、 1 5塩基以上からなることが好ましい。一方、細胞内に全長のアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませるのは、あまりに長くても不適である。細胞内にアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、ヒト HRP I蛋白質の生合成を阻害させる場合、 12塩基以上 30塩基以下、好ましくは 15塩基以上 25塩基以下、より好ましくは 18塩基以上 22塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレォチドを用いるのがよい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその一部分は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが、天然には存在しないものを含めて全て含まれる。代表的なものは、アンチセンス DNAとアンチセンス RNAである。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドについて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的とする DN Aや RN Aとの結合力、組織選択制、細胞透過性、ヌクレア一ゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なアンチセンスポリヌクレオチド誘導体が得られる。

ハイブリダィズのし易さの点では、一般的には、 R N Aのループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体を設計するとよいとされている。

また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤッビング部位、スプラィス部位の配列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがって、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体であって、ヒト H R P Iをコードする遺伝子または R N Aの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤッビング部位、スプライス部位の相補的な配列を含むものは、高い発現抑制効果が期待される。

現在一般的に知られている誘導体は、ヌクレア一ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも一つが高められた誘導体であることが好ましい。特に好ましくは、フォスフォロチォェ一ト結合を骨格構造として有する誘導体である。本発明のボリヌクレオチドおよびその誘導体についても、これらの機能または構造を有する誘導体が含まれる。

天然型のアンチセンスポリヌクレオチドは、化学合成機を使用して合成したり、ヒト H R P Iをコ一ドする遺伝子を铸型とする P C R法により作製することができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチォェ一卜型等、誘導体の中には、化学合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されている説明書にしたがつて操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィ —等を用いた H P L C法により精製することによって、目的のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体を得ることができる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、前記した方法により作製することができる。本発明のヒト H R P Iをコードするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまたはそれらの一部（連続する 1 2塩基以上の塩基配列からなるボリヌクレオチド）であるポリヌクレオチドは、 c D N Aライブラリ一等からヒト H R P I遺伝子をスクリーニングするためのプロ一ブとして使用可能である。このとき G C含有率が 3 0ないし 7 0 %のものが好適に使用可能である。また、連続する 15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。プロ —ブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であってもよい。通常、上記の塩基数以上の配列は特異性のある配列であると認識されている。該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用する c DNAライブラリ一としては、 mRNAから作製されたものが好ましく使用できる。，これらの c DNAライブラリ一からランダムサンプリングにより選択された一群の c DN Aを検索の試料とすることができる。また、市販のものでも使用可能である。

例えば、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列のうちの連続する 12塩基以上の塩基配列からなる DN Aまたは該 DN Aにハイブリダィズするポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）は、 c DNAライブラリ一等からヒト HR P I遺伝子をスクリーニングするためのプローブとして使用可能である。

また、本発明のヒト HRP Iをコードするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまたはそれらの一部であるポリヌクレオチドをプローブとして、各組織由来の mRNAについてノーザンブロットハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより、ヒト HRP I遺伝子由来の mRNAが発現している組織を見出すことが可能である。

DNA又は RNAを化学合成するときに、側鎖をメチル化すること、あるいはピオチン化すること、またはリン酸基部分の〇を S置換すること等の化学的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表の配列番号 2に記載の DN Aを化学合成するときに、該化学修飾を行い、配列表に示された DNAそのものと異なるものを合成することが可能である。

また、 c DNAライブラリーから取得された c DNAであっても放射性同位体で標識することも可能である。

したがって、本発明の DNA及び RNAは、上記の化学修飾された DNA、 R NAまたはアンチセンスポリヌクレオチドをその範囲に含むものである。化学修飾された DNAまたは RNAは、蛋白質をコ一ドする機能またはプローブとしての機能をいずれも発揮可能なものであり、化学修飾されたアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブまたは蛋白質の生合成を阻害する機能またはプローブとしての機能をいずれも発揮可能なものである。プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能である。本発明のヒト HRP I遺伝子を導入した形質転換体を培養して遺伝子の増幅または蛋白質の発現を行わせ、ヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体を作製させることが可能である。次に作製物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うことにより、本発明のヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体を精製することが可能である。

形質転換体の培養については、各種の教科書があり、本発明に記載の塩基配列に基づいてヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体を作製させることは、公知の方法により可能である。このとき、宿主としては、大腸菌等の細菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能であるが、特には動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入するには、リボソーム法、エレクトロボ一レ一シヨン法等を用いることができる。特に、核内微量注入法を用いることが好ましい。

得られた培養物からヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体を精製する精製方法には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィ一法や抗体クロマトグラフィー法等の各種ァフィ二ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィ一法および逆相クロマトダラフィ一法等があり、適宜選択して行えばよい。

また、製造段階において、製造するヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体は、他のポリぺプチドとの融合べプチドとして形質転換体に作製させてもよい。この場合は、精製工程において、ブロムシアン等の化学物質やプロテーゼ等の酵素で処理して、ヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質の変異体を切り出す操作が必要になる。

本発明は、ヒト HRP I蛋白質の抗原性について、実施例 3に例示するように、前記方法により得られたヒト HRP I蛋白質またはヒト HRP I蛋白質に特異的なァミノ酸配列からなるオリゴぺプチドをヒト以外の動物に免疫することで容易に抗体が得られるものであることを明らかにするものである。したがって、本発明のヒト HRP I蛋白質を認識する抗体（以降、ヒト HRP I抗体ということがある）は、ヒト HRP I蛋白質を該ヒト HRP I蛋白質が由来する動物およびヒト以外の動物に免疫感作することにより得られる抗体であって、該抗体が該ヒ卜 HRP I蛋白質を認識することがウエスタンブロッ卜法、 EL I S A法や免疫染色法（例えば、凍結標本やパラフィン標本の組織染色）等により確認される抗体をその範囲内に含む。

また、免疫原として、蛋白質の一部であっても該蛋白質の一部をゥシ血清アルブミンなどの他のキャリア一蛋白質に結合させたものを用いることは、よく用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプチド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一部としては、 8アミノ酸残基以上であることが好ましい。

抗原性が明らかとなった物質については、免疫感作によってポリクロ一ナル抗体が得られるならば、該免疫した動物のリンパ球を用いたハイプリドーマによりモノクローナル抗体が産生されることはよく知られている（『An t i b o d i e s A L a b o r a t o r y Manu a l』 (C o l d S p r i n g Ha r bo r L abo r a t o r y P r e s s, 1988) Ch a t e r 6)o したがって本発明のヒト HRP I抗体はモノクローナル抗体もその範囲内に含むものである。

本発明においては、抗体は活性フラグメントをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、具体的には、 F (a b' ) ₂ , F a ' , F ab, F vなどを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペプシンで分解すると F (a b') ₂ が得られ、パパインで分解すると F a bが得られる。 F (a b') ₂ を 2—メルカプトェ夕ノ —ルなどの試薬で還元して、モノョード酢酸でアルキル化すると F a b' が得られる。 F Vは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体活性フラグメントである。

これらの活性フラグメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメントに置換することでキメラ抗体が得られる。

ヒト HRP Iの検出については、抗体を用いる方法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。抗体を用いる方法としては具体的には、 ①標識されたヒト HRP I抗体を用いてヒト HRP Iを検出する方法、 ②ヒト HRP I抗体および該抗体の標識二次抗体を用いてヒト HRP Iを検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば放射性同位元素（R I)、酵素、アビジン又はピオチン、もしくは蛍光物質（F I TCやローダミン等）が利用される。

酵素反応を利用する方法としては、例えば、 EL I SA法、免疫凝集法、ゥェスタンプロット法を用いた免疫反応分子の同定方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。

以下に実施例を示し、さらに詳細に本発明を説明する。

(実施例 1 )

ヒト HRP I遺伝子の塩基配列およびヒト HRP Iのアミノ酸配列の決定

1. 配列表の配列番号 3に示すラットの HRP I遺伝子がコードするアミノ酸配列とホモロジ一の高いアミノ酸配列をコードする塩基配列とホモロジ一のある塩基配列を、イン夕一ネッ卜のゲノムネット WWWサーバー中の TB LAS TN (h t t p ： //www. b l a s t, g e nome, ad. j p) を使用して、 d b ESTから検索した。その結果、 W88946、 H 94887 , AA00 1 877、 W89062の番号で登録されている E S Tを抽出した。これらの ES Tを連結して得られた配列より以下の 4種類のプライマーを D Ν Α合成機（ A B I社製、モデル 392) を使用して作製した。

プライマー 1 : CTG GCA TTT TGG TGG TAA TGA G A G (配列表の配列番号 4に記載の塩基配列）

プライマー 2 : TCA GAC CTT TCC CAC CTG CTG T CT C (配列表の配列番号 5に記載の塩基配列）

プライマー 3 : GGG AAT AGA TGA CAT ACG TCA C A A G (配列表の配列番号 6に記載の塩基配列）

プライマー 4 ： GCT GTA GTC TAC ATG AGA ATA G A C (配列表の配列番号 7に記載の塩基配列）

2. ヒト胎児肝臓の Ma r a t h o n c D N Aライブラリー（クローンテツク社製）をついて、添付説明書に従い、まずプライマ一 1とアダプタ一配列で P CRを行い、得られた P CR産物について、プライマ一 2とアダプター配列で P CRを行った。また、同 c DNAライブラリーについてプライマ一 3とアダプタ一配列で PCRを行い、得られた P CR産物について、プライマ一 4とアダプタ —配列で P CRを行った。

3. 得られた PC R産物は、 0. 7 %ァガロース電気泳動で分離し、目的の増幅バンドを切り出し、 Ge ne C l e an (バイオ 101社製）で増幅 DNA を精製した後、 T Aクロ一ニングキット（インビトロジェン社製）を用いて、 p CRIIベクター（キットに添付されているもの）に組み込んだ。

4. 上記 3. で作製したベクターを大腸菌（JM109) に混合し、氷上で 3 0分間、 42°Cで 45分間、氷上で 3分間反応させた後、 SOC培地 90 0 I を加え、 37°0に1時間置き、該ベクターを大腸菌（JM109) に導入した。この大腸菌を L B寒天培地（ 100 μ gZm 1アンピシリン、 0. 1 mM I

PTG、 0. 004%X_g a l含有）に撒き、 37 °Cで 16時間培養した。形成されたコロニーのうち、白色のコロニ一を 2m 1の L B培地（ 100 g Zm 1アンピシリン含有）に植え、 37 °Cで 16時間培養した。

5. その後、 12000 r pm、 1分間遠心分離して集菌し、 M a g i c M i n i p r e p (登録商標、プロメガ社製）に従いプラスミド DNA溶液を回収した。

6. 回収した DNAについて、ダイ夕一ミネ一夕一 F Sシークェンシングキット（パーキンエルマ一社製）を使用して、以下の要領で塩基配列を決定した。

(1) キットに添付の説明書に従い、回収した DNAをシ一クエンスサンプルに調製した。

(2) 下記組成の系でキットの説明書に従い、 DNAの PCRを行った。铸型 DNA 600 ^ 1

プライマー DNA 3. 2 pmo 1

シークェンスミックス 8 1

合計反応液が 20 n 1になるように滅菌蒸留水を加えた。

(3) P CR反応液をフエノール/クロ口ホルム抽出した。

(4) 抽出物をエタノール沈殿にて精製し、乾燥させた。 (5)生成物を 3 a 1の 3 %ブル一デキストラン、 5 0mM EDTA、 8 0 % ホルムアミド溶液に溶解し、 9 5°Cで 2分間変性した後、氷冷し、シークェンス用サンプルとした。

(6) 得られたサンプルを 3 7 3ストレッチ DN Aシークェンサ一（パーキンエルマ一社製）にて解析し、塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号 2に示す。

7. 配列表の配列番号 2に記載した塩基配列から以下の配列のプライマーを D N A合成機を使用して作製した。

プライマ一 5 ： CAG AAC TCA TCA ACT GGA AAC A GC (配列表の配列番号 8に記載の塩基配列）

プライマ一 6 ： CTC TGG CTC CTC TCA TTA CCA C

C A (配列表の配列番号 9に記載の塩基配列）

8. ヒト肝臓 c DNAライブラリ一について、前記プライマ一 5および 6を使用して P CRを行った。

9. 得られた P CR産物（c DNA) に前記 3. から 7. に記載したのと同様の操作を行い、塩基配列を決定した。この塩基配列は、配列表の配列番号 2に示す列と一致した。したがって、この c DNAを全長のヒト HRP I c DNAと認めた。

1 0. 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からヒト HRP Iのァミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示す。

1 1. 前記ヒト HRP I c DNAを p CRIIベクタ一に挿入し、さらに該べク夕一を大腸菌 J M l 0 9に導入して形質転換体を作製した。この形質転換体をェ業技術院生命工学工業研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に平成 1 0年 3月 5日に寄託した。当該寄託はブダペスト条約に基づく寄託である。受託番号は、 FERM B P— 6 2 8 5である。

この塩基配列とホモロジ一のある塩基配列をイン夕一ネッ卜のゲノムネッ卜 W WWサーバー中の BLASTN (h t t p ： / www. g e n ome, a d. j p/S I T/BLAST. h tm l ) を使用して、 d b E STから検索した。その結果、 AF 0 2 346 6の番号で登録されている E STを抽出した。ヒト H RP Iのアミノ酸配列は、 AF 023466を含むが、それよりも 1. 8倍ほど長い。また、ヒト HRP I遺伝子の塩基配列は、 AF 023466とホモロジ一を有する力そのオープンリーディングフレームは 1. 8倍ほど長い。当然のことながら、 AF 023466の塩基配列またはアミノ酸配列からは、より長い塩基配列またはァミノ酸配列を予想することはできない。

(実施例 2 )

ヒト HRP I蛋白質の発現

1. 組み換えべクタ一の作製

ヒト HRP I cDNAにFLAG—ヒスチジン夕グを導入してpET3 aに組み込んだ。以下にその詳細を記す。

(1) まず、実施例 1の 1 1. で作製したヒト HRP I cDNAを挿入した pCRIIベクタ一を、 PCR法（『Cu r r e n t p r o t o c o l s i n mo l e c u l a r b i o l o gy』（G r e e n P u b l i s h i n g As s o c i a t e s and Wi l e y— I n t e r s c i e n c e, 19 87) c h a p t e r 15に記載）により、以下の塩基配列のプライマ一 7およびプライマー 8を用いて、ヒト HRP I遺伝子に付加する FLAG—ヒスチジンタグおよびヒト HRP I遺伝子の第一メチォニン部分をコードする塩基配列を N d e I認識部位として増幅した。

プライマ一 7 ： CAT ATG GAC TAC AAG GAC GAC G AT GAC AAG CAT C AC CAT C AC CAT C AC A TG TTA CCA TTG CAA GGT GCC CAG (配列表の配列番号 10に記載の塩基配列）

プライマー 8 : GGA TCC TTA GAG AGG TAC CCA G TT CCA CTG G (配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列）

(2) 増幅された遺伝子を 0. 7%ァガロース電気泳動した後、約 1 kb付近のバンドを切り出し、 Q i aqu i c k g e l e x t r a c t i on k i t (キアゲン社製）により精製した。精製された遺伝子を TAクロ一ニングキット（インビトロゲン社製）を用いて pCRIIベクタ一に導入した。 .

(3) 実施例 1の 4. から 6. に記載した方法でこのべクタ一から DNAを調製し、その塩基配列を確認した。

(4) 得られた DN Aから FLAG—ヒスチジンタグが付加されたヒト HRP I DNAを以下の組成の液中で 37°Cで 3時間反応させ、 Nd e lおよび B a mH Iで切り出した。

Nd e l (宝酒造社製） 1 ίΐ 1

B amH I (宝酒造社製） 1 n 1

10倍 K緩衝液（宝酒造社製） 5 i 1

滅菌蒸留水 38 1

合計 50 ^ 1

(5) 切り出された DNAを 0. 7 %ァガロース電気泳動した後、約 l kb付近のバンドを切り出し、 Q i aqu i c k g e l e x t r a c t i on k i t (キアゲン社製）により精製した。得られた精製 DNAの溶液を溶液 Aとした。

(6) pET3 aベクターを Nd e lおよび B amH Iで、前記（4) と同様にして、消化した。得られたベクターの溶液を溶液 Bとした。

(7) 溶液 Bに 5 1の 1M T r i s— HC 1 H8. 0およびの BAP (宝酒造社製）を加え、 65°Cで 30分間、続いて 37 °Cで 1時間脱リン酸化処理を行った。

(8) 脱リン酸化したベクタ一にフエノールクロ口ホルム処理を 3回行い、上澄みの水層を回収した。

(9) の 3M N aOAc (pH 5. 2 ) および 130 1の一 20 °C のエタノールを加え、ベクタ一をエタノール沈殿させ、さらに 15000 r pm で 20分間遠心分離した。

(10) 沈殿（ベクター）を 70 %エタノールで洗浄した後、乾燥させた。乾燥させたベクターを 40 1の滅菌水に溶かした。得られた溶液を溶液 Cとした。

(1 1) 溶液 Aと溶液 Cとを下記組成になるように混合し、ライゲ一シヨンキット Ve r. 2 (宝酒造社製）を使用して、 16°Cで 1時間反応させ、 FLAG

—ヒスチジンタグが付加されたヒト HRP I DNAを pET3 aに導入した。溶液 A 3 i 1

溶液 C 1 ix 1

滅菌水 6 1

ライゲーシヨンキット Ve r. 2 1 0 1

合計 20 1

(1 2) 実施例 1の 4. から 6. に記載した方法でこの p ET 3 aベクタ一から DNAを調製し、その塩基配列を確認した。ただし、 LB寒天培地には I PT Gおよび X— g a 1を添加しなかった。

2. FLAG—ヒスチジンタグ付加ヒト HRP Iの発現

( 1) 前記で得られた p ET 3 aに組み込まれた FLAG—ヒスチジンタグ H

RP I c DNAを以下の操作で大腸菌 BL 2 1 (DE 3) に導入した。

(2) 前記（1) で作製した大腸菌をアンピシリン 1 0 0 gZm 1を含む L B培地で培養し、分光光度計（ベックマン社製）で測定した濁度が 6 0 0 nmの波長で 0. 5になった時点で、 0. 5mMになるように I PTGを加え HRP I 蛋白質の発現誘導を行った。

(3) 2時間後、大腸菌を回収し、 Ly s i s Bu f f e rに懸濁した後、ソニケ一シヨンした。その後、 B e c km a n O t i ma XL— 8 0を使用し、 5 0. 2 T i 口一夕一で 1 8 00 0 r pm、 4°Cで 1 5分間遠心分離した。

(4) 沈殿物を 6 M塩酸グアジニンに溶解し、 N i—ァガロース（キアゲン社製）を用いて、取り扱い説明書の通りに精製した。

(5) 精製された蛋白質を SDS—ポリアクリルアミド電気泳動し、クマシ一ブリリアントブル一で染色した。結果を図 1に示す。約 3 5 kDの位置にバンドが見られ、精製がうまく行われたことが確認された。

(実施例 3 )

ヒト HRP I蛋白質を認識する抗体の作製

1. 抗原の作製ペプチド A：配列表の配列番号 1に記載のヒト HRP I蛋白質のアミノ酸配列の 7 3番目の Th rから 9 8番目の T r ρまでの 2 6アミノ酸からなるペプチド _c ペプチド B ：配列表の配列番号 1に記載のヒト HRP I蛋白質のアミノ酸配列の 185番目の I l eから 209番目の Th rまでの 25アミノ酸の N末端にシスティン（Cy s) を付加したアミノ酸からなるペプチド。

システィンの付加はスカシ貝へモシァニン（KHL) と結合させるために付加した。合成は岩城硝子（株）に委託した。

合成したペプチド 2 mgをマレイミド化 KLH (ピアス社製） 2mgに結合させた。反応はピアス社のキッ卜の説明書に記載の方法にしたがった。

(2) 実施例 2で作製したヒト HRP I蛋白質を lmgZm 1の濃度で 1 m 1 調製し、これを抗原として用いた。

2. 免疫

抗原（ペプチド A、ペプチド Bまたはヒト HRP I蛋白質）について、抗原液 ( 1 mg/m 1 ) 100 1、 PBS 0. 5 m 1を及びフロイントコンプリ一トアジュバンド（ディフコ社製） 0. 5mlをシリンジに取り、混合してェマルジョンとし、ゥサギの背に 4箇所に分けて皮下接種した。

1週間後、 2回目の免疫を行った。 2回目からはアジュバンドをフロイントインコンプリートアジュバンド（ディフコ社製）に変えて免疫を行った。その他の操作は 1回目と同様である。 2回目以降は 1週間間隔を開けて、合計 6回免疫を行った。

3. 抗体の精製

最終免疫の 1週間後、採血した。この血液を室温で 3時間静置し、十分に血液凝固を行った後、 3， 000 r pmで 5分間遠心分離を行い、上清（血清）を回収した。

この血清に飽和硫安を最終濃度が 50%になるように加えて塩祈した。このサンプルを遠心分離して、抗体が含まれる画分を沈殿させた。その後、沈殿物を P BSに溶解し、さらに PB Sに対して塩折した。

その後、ペプチド抗原を投与したゥサギから得られた血清の塩析物について、プロテイン Gセファロ一スカラム（登録商標、フアルマシア社製）を用いて、抗体をァフィ二ティ一精製した。その結果、全量で 37 Omgの I gG画分が得られた。前記 I gG画分およびヒト HRP I蛋白質を投与したゥサギから得られた血清の塩析物のぞれぞれについて、免疫に使用したペプチドまたは蛋白質を N H S— 活性化セファロース（フアルマシア社製）に添付のマニュアルにしたがい結合させて作製したカラムそ使用してァフィ二ティー精製した。その結果、全量で 5 m gの精製抗体が得られた。

4. 抗体の力価の測定

得られた精製抗体の力価を EL I S Aにて測定した。

(1) 抗原液（ペプチド A、ペプチド Bまたはヒト HRP I蛋白質の各溶液）をそれぞれ 25 n g/m 1に P B Sで希釈して、 96ゥエル EL I S Aプレー卜 (キセノバインド（Xe nob i nd) 登録商標、キセノポア社製）の各ゥエルに 50 1ずつ分注し、 4 °Cで一晩放置した。

(2) 坊原液を捨て、蒸留水で 4倍に希釈したブロックエース（登録商標、大日本製薬社製）を各ゥエルに 200 ^ 1ずつ分注し、室温で 2時間放置することによりブロッキングを行った。

(3) ブロッキング液を捨て、一次抗体として精製抗体を添加した。精製抗体は、 96ゥエルの 1列目から順に、 l O ^ugZmし 5 z g/mし 2. 5 z g Zm 1、 · · · と PB Sで倍々希釈した液を、 12列目まで各ゥエルに 50 1 ずつ分注した。 12列目の抗体濃度は約 0. 5 ^gノ m lとなる。なお、コントロールには、免疫していないゥサギから精製した I gGを用いた。各抗体の分注後、室温で 1時間反応させた。

(4) 抗体液を捨て、 0. 05 %Twe e n 20/P B Sでプレートを 4回洗浄し、次いで二次抗体液として PBSで 1000倍希釈したピオチン化ゥサギ I gG抗体（ベクタ一社製）各ゥエルに 50 1ずつ分注した。その後、室温で 3 0分間反応させた。

(5) 二次抗体を捨てた後、 0. 05 %Twe e n 20/PB Sでプレートを 4回洗浄し、 1000倍希釈した ABC液（ベクタ一社製）を各ゥエルに 50 μ 1ずつ分注した。その後、室温で 30分間放置した。

(6) ABC液を捨てた後、 0. ◦ 5%Twe e n 20ZPBSでプレートを 4回洗浄し、オルトフエ二レンジァミン（OPD) — H₂0₂ZP B Sを各ゥェルに 100 1ずつ分注した。十分に発色させた後、 2 N硫酸で反応を止めた後、 490 nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）にて測定した。

この結果、ぺプチド Aを投与して得られた抗体およびべプチド Bを免疫して得られた抗体のいずれも、抗体の力価はコントロールに比べて高かった。

5. ウエスタンブロッ卜

ヒ卜 HRP I蛋白質を投与して得られた抗血清を 10000倍希釈したものおよび P r o t o B 1 o t Π APシステム（プロメガ社製）を使用してウェス夕ンブロットを行った。結果を図 2に示す。図 2に示すように、抗血清をを 10 000倍希釈（1 ngZl 0 1) しても、 l ngのヒト HRP I蛋白質を検出することが可能であった。

(実施例 4)

ノ一ザンブロッティング

1. プローブの作製

配列表の配列番号 2に塩基配列を示すヒト HRP I cDNAのコード領域部分を PC Rにより増幅し、標識してノーザンプロッティングのプローブとした。以下に操作を示す。

(1) プライマーの合成

実施例 2で使用したプライマ一 7およびプライマー 8を、蒸留水で 20 pmo l Z x lに調製した。これを PCRプライマ一として用いて、以下の PCR操作 ¾τί了つ†：。

(2) PCR

ヒト HRP I c DNAが導入されたベクター p ET 3 aを P CRの铸型とし、プライマ一 7およびプライマ一 8を使用して、 Ta k a r a T a q p o 1 (登録商標、宝酒造社製）を使用して以下の条件で行った。

94°Cに 1分間おいた。

次いで「94°Cで 45秒間、続いて 60°Cで 2分間、続いて 72°Cで 2分間」のサイクルを 30回繰り返した。その後、 4°Cに置いて P CR操作を完了した。

PCRの反応液の組成は下記の通りとした。 0. 5 n g/ / 1 ヒト HRP I pET3 a 1 1

Taq p o 1 (宝酒造社製） 0. 1 / 1

10倍濃度 P C R緩衝液（宝酒造社製） 2 H 1

dNTP m i x (宝酒造社製） 1. 6 x 1

プライマ一 7 2 1

プライマ一 8 2 1

滅菌蒸留水 1 1. 3 1

合計 20 1

?。1産物を0. 7 %ァガロースゲル上で電気泳動した。

ゲルから PCR産物（以下、フラグメント Αという）を切り出し、 Ge n eC l e an (バイオ 101社製）でフラグメント Aを回収して、ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。その結果、フラグメント Aの DNA液の濃度は、 25 n g 1と推定された。

(3) 標識

フラグメント Aの DNA液 5 1に滅菌蒸留水 4 1を加えて 98°Cに 10分間おいた。その後、氷上で冷却し、フラグメント Aを変性させた。

この変性フラグメント Aをランダムラベリングキット（ベ一リンガ一マンハイム社製）を使用して、下記の組成の液中に 37°Cに 30分間おいた後、 65°Cに 10分間おいて標識した。

変性フラグメント A 9 1

d A, G, TTP mi x (ベ一リンガーマンハイム社製） 3 1

反応液 m i x (ベ一リンガーマンハイム社製） 2 a 1

d-32 P-dCTP (フアルマシアアマシャム社製） 5 a 1

クレノウ液（ベ一リンガーマンハイム社製） 1 1

合合計計 20 1

この液から標識フラグメント Aを G— 5 s精製した。スウイングロ一夕一でカラムを 3000 r pmで 1分間回転させ、パッキングを行った。そのカラムに標識フラグメント A液を 20 X 1添加し、 3000 r p mで 2分間カラムを回転させ、 T 50 Eで溶出して標識フラグメント Aを分離した。

2. ハイブリダィゼ一シヨン

( 1) プレ八イブリダィゼーシヨン

mRNAを固定したメンブラン（ヒト MTN (登録商標）（クローンテック社製）を、下記組成のハイブリダィゼーシヨン液 1 Om 1に入れて、 42°Cで 1 5 0分おき、変性サケ精子 DN Aでメンブラン上をブロッキングした。

ハイブリダーゼ一ション液

5倍濃度 S S P E

1 0倍濃度 D e n h a r t d ' s液

2 %SDS、 5 0 %ホルムアミド

1 0 0 g/m 1変性サケ精子 DN A

(2) ハイプリダイゼ一ション

前記ハイブリダィゼーシヨン液 2 Om lに標識フラグメント A液を 7 1加え、よくかき混ぜた。

角形シャーレにハイブリダィゼーシヨン液を 5m 1ずつ加え、上記メンブランをシャーレに 1枚ずつ入れ、各メンブランの上にビニールシートを置き、 42°C で一晩（約 1 5時間）ハイブリダィズさせた。

ハイブリダイゼ一ション液を捨て、洗浄液（ 2倍濃度 S S C：、 0. 1 % SD S) をシャーレに加え、室温で 5分間洗浄することを 4回繰り返した。

(3) オートラジオグラム

このメンブランを放射線感光紙に 1 6時間さらして、オートラジオグラフを取つた。結果を図 3に示す。図 3より明らかなように、、肝臓および腎臓ではひと HRP I mRNAが発現していたが、他の臓器（心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋および膝臓）では発現が見られなかった。その他の臓器についても発現を調べたが、肝臓および腎臓以外の臓器ではヒト HRP I mRNAの発現は見られなかった。産業上の利用の可能性

本発明のヒト HRP I、その変異体およびそれらの部分蛋白質ならびにヒト H R P Iをコードするポリヌクレオチド（配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む）、その一部分であるポリヌクレオチドおよびそれらのアンチセンス鎖のポリヌクレオチドは癌の形成機構の解明に有用である。また、本出願明細書中では詳しく説明していないが、本発明者はラット HRP I 抗体を使用した実験により、ヒト HRP Iは中心体に局在していることを明らかにしている。したがって、ヒト HRP Iは細胞周期の研究や細胞分裂を制御している因子の研究に有用である。

本発明の抗体は、癌の形成機構の解明や診断に使用可能である。また、細胞周期の研究や肝臓培養細胞の分裂を制御する因子の研究に使用可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を少なくとも有する蛋白質。

2 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列における一または複数のァミノ - 酸を置換、欠失してなるアミノ酸配列または配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列における一または複数のアミノ酸を付加してなるアミノ酸配列からなる蛋

3 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載の蛋白質をコ―ドするポリヌクレオチド。

4 . 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。

5 . 請求の範囲第 3項または第 4項に記載のポリヌクレオチドのうちの一部であって、連続する 1 2塩基以上からなるポリヌクレオチド。

6 . 請求の範囲第 3項または第 4項に記載のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるァンチセンスポリヌクレオチドのうちの一部であつて、連続する 1 2塩基以上からなるポリヌクレオチド。

7 . 請求の範囲第 5項または第 6項に記載のポリヌクレオチドの誘導体。

8 . 化学修飾された請求の範囲第 5項ないし第 7項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載の蛋白質を認識する抗体。