WO1999041362A1 - Appareil pour preparation de genotheque immobilisee, appareil pour amplification de gene, procede de regulation de temperature et procede de comparaison systematique des genes - Google Patents

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immobilized
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gene amplification
cooling means
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Kojiro Takahashi
Michifumi Tanga
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Toyo Kohan Co., Ltd.
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    • B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the present invention relates to a reaction apparatus used for various reactions involving heating with a small amount of solution in a molecular biology-related field or a biochemistry-related field such as genetic engineering, protein engineering, cell engineering, developmental engineering, and immunology.
  • a molecular biology-related field or a biochemistry-related field
  • genetic engineering protein engineering
  • cell engineering cell engineering
  • developmental engineering and immunology.
  • the present invention relates to a method, a gene amplification method, a method for systematically comparing genes and an apparatus used therefor, and an immobilized DNA library used for the method.
  • the I 5 (PCR) method is widely used.
  • a tube-shaped plastic reaction vessel containing a reaction solution is inserted into an aluminum block, etc., and a lid is placed to prevent the reaction solution from evaporating water.
  • the thermal cycle is controlled a predetermined number of times in the order of annealing temperature and DNA synthesis temperature.
  • the present invention is simple in operation, capable of quickly raising and cooling a temperature, It is an object of the present invention to provide a gene amplification device and a gene amplification method capable of performing the heat cycle in a short time.
  • the apparatus for preparing an immobilized DNA library comprises a reactor body having a recess for inserting a container (a reactor body in which a container is inserted, and a lid provided with heating and cooling means and cooling means attached to an upper portion of the reactor body) And a container, wherein the container is formed of a chemically modified base.
  • the gene amplification device of the present invention comprises: a reactor main body having a concave portion into which a container is inserted; a lid attached to an upper portion of the reactor main body, provided with heating / cooling means, and cooling means; and (5) Wherein the container is formed of a chemically modified substrate.
  • the gene amplification device of the present invention includes: a reactor main body having a recess formed therein for inserting a container; and a heating / cooling means mounted on an upper portion of the reactor main body, and a lid provided with a cooling means.
  • the apparatus is characterized in that the container is formed of a substrate on which a gene is immobilized and has a thickness of ⁇ .
  • the substrate is preferably a solid substrate
  • the container is preferably an exploded type
  • the container is preferably a cassette type.
  • a signal from the temperature measuring unit 61 is input to a computer control unit 64, and the computer control unit 64 compares the signal with a pre-input program chart.
  • the temperature control unit 62 of the heating / cooling unit 51 and the temperature control unit 63 of the cooling unit 52 are driven.
  • the substrate on which the DNA of the present invention is immobilized is a substrate used in these apparatuses.
  • the method for cryopreserving a substrate of the present invention is characterized by cryopreserving a substrate on which DNA is immobilized.
  • the method for systematically comparing genes of the present invention is characterized in that a plurality of immobilized DNA libraries are placed in a container.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a state where the gene amplification device of the present invention is opened.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view taken along the line A- ⁇ of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view taken along the line BB of FIG.
  • FIG. 4 is a schematic view of the assembly of the container.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing a cross-sectional state of the gene amplification device of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing temperature control of the gene amplification device of the present invention.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of preparation of an immobilized cDNA library and gene amplification.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram 15 of preparation of an immobilized gDNA library and gene amplification.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a state where the gene amplification device of the present invention is opened.
  • FIG. 2D is a schematic cross-sectional view taken along the line AA of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view taken along the line BB of FIG.
  • FIG. 4 is a schematic view of the assembly of the container.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing a cross-sectional state of the gene amplification device of the present invention.
  • reference numeral 10 denotes a reactor main body
  • 11 denotes a concave portion formed in the reactor main body.
  • the reactor main body 10 is desirably formed of a chemically stable polymer material such as an acrylic resin or a polystyrene resin.
  • At least one recess 11 is provided in the reactor body, for example, cylindrical, triangular or square. Polygonal pillars and the like are preferred.
  • the container 12 is preferably made of a substrate 41 having good thermal conductivity, for example, a ceramic substrate such as a diamond substrate, aluminum nitride, or silicon carbide, or a metal substrate such as aluminum or stainless steel.
  • a ceramic substrate such as a diamond substrate, aluminum nitride, or silicon carbide
  • a metal substrate such as aluminum or stainless steel.
  • diamond-like carbon, carbon, carbon compound, and the like, in which diamond is partially formed are also preferable.
  • a plastic substrate such as polycarbonate or fluororesin is preferable. Further, it is also preferable that the substrate is formed by combining the above substrates.
  • the container 12 only needs to have a bottom, and it is preferable that the container 12 can be easily embedded and removed from the concave portion 11.
  • the bottom of the base 41 and the side wall of the container 12 be disassembled.
  • the base in the case of a rectangular column-shaped container, the base can be disassembled into a base having one bottom and four side walls.
  • a substrate 41 having a side of about 5 to 1 Omm and a thickness of about 0.1 mm is used, for example, as shown in FIG. 4 (b), a synthetic resin base.
  • the container 12 can be assembled with the bottom 43 and the side wall 44 in the holder 42 (see (c)).
  • the container 12 in which at least one of the bottom and side walls is formed by fixing the gene on the substrate.
  • cassette type By connecting some of these containers (cassette type), a plurality of containers can be buried in and removed from the plurality of recesses 11 with a single touch, thereby improving the operation efficiency.
  • cassette type The specific embodiment of the cassette type will be described in detail in the section of the immobilized DNA library described later.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing a cross-sectional state of the gene amplification device of the present invention.
  • (a) is a schematic explanatory view showing a mode in which a lid 50 is installed on the upper part of the reactor main body 10.
  • (B) is a schematic cross-sectional view taken along the line C-C shown in (a) of FIG.
  • 50 is a lid
  • 51 is heating / cooling means
  • 52 is a cooling means.
  • 0 is desirably formed of a chemically stable polymer material such as an acrylic resin or a polystyrene resin.
  • the heating / cooling means 51 is a means for heating and cooling the container 12 by contacting the container 12 and preferably uses a Peltier element, an electric heater, an infrared lamp, or the like. This
  • the cooling means 52 is a unit provided with a pipe or a cooling fan for flowing cooling water or cool air, and is a means for rapidly cooling the container 12.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing temperature control of the gene amplification device of the present invention.
  • the temperature of the container 12 is controlled by the temperature control unit 62 of the heating / cooling unit 51 and the temperature control unit 63 of the cooling unit 52 based on information from the temperature measurement unit 61. . That is, a signal from the temperature measurement unit 61 provided directly in contact with the bottom or the side wall of the container 12 is input to the computer control unit 64, and the computer control unit 64 is input in advance.
  • Program chart (heating rate, holding temperature, holding time, cooling rate
  • the temperature controller 62 of the heating / cooling means 51 and the temperature controller 63 of the cooling means 52 are driven.
  • a 5 mm square (0.1 mm thick) diamond tip 41 was used as a die ZD diamond substrate. Using one diamond chip 41 on the bottom and four on the side wall, as shown in FIG. 4, it was assembled on the side wall of a synthetic resin base holder 42 to obtain a container 12. The diamond tip 41 used for this side wall had already been chemically modified with an organic carboxylic acid. Thereafter, the lid 50 was placed above the reactor main body 10.
  • adenine (A) or cytosine (C) having an amino group is required at the 3 'end of oligo dT, TM and at the 5' end of oligonucleotide.
  • ADC-R- represents a diamond chip chemically modified with an organic carboxylic acid.
  • an immobilized oligonucleotide having a target restriction enzyme site (see FIG. 8) was immobilized on the surface of a diamond chip 41 in the same manner as in the case of Oligo d T-described above.
  • the reaction solution for chemical immobilization was exchanged at a low temperature of 0 to 4 ° C with a reaction solution containing the hybrid oligonucleotide and the desired restriction enzyme at 25 ". After dicing, raise the temperature to 37 ° C and cut the semi-immobilized oligonucleotides with restriction enzymes. Was made.
  • the immobilized cDNA library prepared above or the immobilized gDNA library prepared above was placed on the surface of the diamond chip 41.
  • cassette-type immobilized DNA Library.
  • ⁇ can be efficiently investigated by systematically comparing the above-mentioned 2 to 2 using these cassette type immobilized DNA libraries.
  • the cassette-type immobilized DNA library was washed with TE buffer and a 70-75% ethanol aqueous solution regardless of whether it was subjected to the PCR process or not. If it is soaked in 100% ethanol and stored frozen, it can be used semi-permanently as required by comparative data.
  • the side wall of the container 12 was composed of the cassette-type immobilized DNA library prepared with the above-mentioned immobilized cDNA library or gDNA library. After thoroughly washing the container 1 second inner surface with TE buffer, and sets the primers to DN A amplification purposes, it was added to the PCR reaction solution containing the four nucleotides and DN A polymerase c
  • annealing temperature for binding single-stranded DNA to DNA primer approximately 1 minute at 45 ° C
  • extension of DNA strands with heat-resistant DNA polymerase was controlled in sequence to the DNA amplification temperature to be performed (74 ° C for about 2 minutes), and these temperature changes were repeated for 30 cycles, and PCR was performed (see Fig. 7, Fig. 8 ⁇ ).
  • a cassette-type immobilized DNA library was prepared.A system was provided in which the required number of gene amplification devices could be arranged in parallel. Can be solved. In this case, for example, in the case of processing 50 samples, it is preferable to arrange 5 sets of the gene amplifying apparatus of the present invention 15 in parallel.
  • the temperature of the reaction solution in the reaction vessel can be quickly raised and cooled, so that DNA amplification can be performed in a very short time. It can also be applied to automatic 2J0 gene diagnosis equipment.
  • the two most important technical points in the development of an automated gene diagnostic device are the production of a cassette-type immobilized library that can be used semi-permanently, and the efficiency of gene amplification and the gene amplification device with excellent specificity. Development.
  • the device of the present invention can directly control the temperature of the PCR reaction solution using a substrate such as diamond having high thermal conductivity, so that the temperature control efficiency of PCR is remarkably improved and the required time is reduced. Not only can it be significantly shortened, but it can also increase PCR efficiency, such as specific amplification of the target DNA.
  • a substrate having high thermal conductivity is used as the substrate of the present invention, in addition to high thermal conductivity, chemical
  • the immobilized DNA library is extremely stable Once a cassette-type immobilized DNA library is prepared, a semi-permanent DNA library that can be used repeatedly can be provided.

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Description

明 細 書 固定化 D N Aライブラリー作製装置、 遺伝子増幅装置、 温度制御方法及び遺伝子 を系統的に比較する方法 技術分野
本発明は、 遺伝子工学、 蛋白質工学、 細胞工学、 発生工学、 免疫学等の、 分子 生物学関連分野や生化学関連分野等において、 微量の溶液で加熱を伴う各種反応 に使用する反応装置に関する。 より詳しくは、 固定化 D N Aライブラリー作製方
( 0 法、 遺伝子増幅方法、 遺伝子を系統的に比較する方法及びそれらに用いる装置、 さらにはそれに用いる固定化 D N Aライブラリーに関する。
背景技術
従来、 遺伝子増幅する手段として、 ポリメラーゼ ·チェイン ' リアクション
I 5 ( P C R ) 法が広く用いられている。 この P C R法は、 反応溶液をいれたチュー ブ状のプラスチック反応容器をアルミプロックなどの中に挿入し、 反応溶液の水 分蒸発を防止するため蓋をし、 アルミブロックの温度を、 熱変性温度、 ァニーリ ング温度、 D N A合成温度の順に熱サイクルを所定の回数コントロールするとい うものである。
20 しかしながら、 このような従来の P C R法に用いられた装置では、 熱容量が大 きく熱伝導性が悪いブラスチック反応容器が用レ、られており、 しかもアルミブ口 ック自体を温度コントロールするため、 昇温や冷却に時間がかかるという問題点 があった。
また、 反応溶液の温度制御が完全ではないため、 目的とする D N Aの複製収量
2- が低いという問題点もあった。
本発明は、 上記問題点に鑑み、 操作が簡単で、 昇温や冷却を迅速に行え、 反応 の熱サイクルを短時間で行える遺伝子増幅装置及び遺伝子増幅方法を提供するこ とを技術的課題とする。
また、 このような装置に用いることが好適な D N Aを固定化した基体及び固定 化 D N Aライブラリー作製方法を提供することも、 本発明の技術的課題である。 さらに、 上記装置を用いて遺伝子を系統的に比較をする方法を提供することも、 本発明の技術的課題である。
発明の概要
本発明の固定化 D N Aライブラリ一作製装置は、 容器を挿入する凹部が形成さ ( 0 れた反応器本体と、 この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 '冷却手段、 冷却 手段を設けた蓋部とが設けられた装置であって、 前記容器は、 化学修飾された基 体で形成されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子増幅装置は、 容器を挿入する凹部が形成された反応器本体と、 この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 ·冷却手段、 冷却手段を設けた蓋部と ( 5 が設けられた装置であって、 前記容器は、 化学修飾された基体で形成されている ことを特徴とする。
本発明の遺伝子増幅装置は、 容器を揷入する凹部が形成された反応器本体と、 この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 '冷却手段、 冷却手段を設けた蓋部と が設けられた装置であって、 前記容器は、 遺伝子を固定化した基体で形成されて ζθ いることを特徴とする。
これらの装置は、 前記基体が、 固体状の基体であることが望ましく、 前記容器 が分解型であることが望ましく、 前記容器がカセット型であることが望ましい。 本発明の遺伝子増幅装置の温度制御方法は、 温度測定部 6 1からの信号をコン ピュータ制御部 6 4に入力し、 コンピュータ制御部 6 4は予め入力されたプ口グ ^ ラムチャートと比較し、 加熱 ·冷却手段 5 1の温度制御部 6 2と冷却手段 5 2の 温度制御部 6 3とを駆動させることを特徴とする。 本発明の D N Aを固定化した基体は、 これらの装置で用いる基体であることを 特徴とする。
本発明の基体を冷凍保存する方法は、 D N Aを固定化した基体を冷凍保存する ことを特徴とする。
？ 本発明の遺伝子を系統的に比較する方法は、 複数個の固定化 D N Aライブラリ 一を容器内に設置してするものであることを特徴とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の遺伝子増幅装置を開蓋した状態を示す概略平面図である。 図 ! ϋ 2は、 図 1の A— Α断面概略図である。 図 3は、 図 1の B— B断面概略図である。
図 4は、 容器の組立概略図である。 図 5は、 本発明の遺伝子増幅装置の断面状態 を示す概略断面図である。 図 6は、 本発明の遺伝子増幅装置の温度制御を示す概 略図である。 図 7は、 固定化 c D N Aライブラリーの作成及び遺伝子増幅の説明 図である。 図 8は、 固定化 g D N Aライブラリーの作成及び遺伝子増幅の説明図 15 である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子増幅装置を図面を用いて説明する。
図 1は、 本発明の遺伝子増幅装置を開蓋した状態を示す概略平面図である。 図 2 D は、 図 1の A— A断面概略図である。 図 3は、 図 1の B— B断面概略図である。
図 4は、 容器の組立概略図である。 図 5は、 本発明の遺伝子増幅装置の断面状態 を示す概略断面図である。
図 1〜図 3において、 1 0は反応器本体、 1 1は反応器本体内に形成された凹 部である。 反応器本体 1 0は、 化学的に安定な、 たとえばアクリル樹脂、 ポリス ^ チレン樹脂等の高分子材料で形成されることが望ましい。 凹部 1 1は反応器本体 内に少なく とも 1個設けられており、 たとえば、 円筒状、 三角もしくは四角等の 多角柱状などのものが好ましい。
容器 1 2は、 熱伝導性のよい基体 4 1、 たとえばダイヤモンド基体、 窒化アル ミ、 炭化珪素などのセラッミタス基体や、 アルミニウム、 ステンレススチール等 の金属基体から構成されていることが好ましい。
あるいは、 一部にダイヤモンドが形成されたダイヤモンドライク 'カーボン、 炭 素、 炭素化合物なども好ましい。 また、 ポリカーボネートやフッ素樹脂等のブラ スチック基体等も好ましい。 さらに上記基体を組み合わせたもので形成されてい ることも好ましい。
容器 1 2は底付きのものであればよく、 凹部 1 1に埋設 ·取外しが容易に行える ことが好ましい。
また、 容器 1 2は、 基体 4 1を底や側壁を分解型にしておくことも好ましく、 たとえば四角柱状の容器であれば、 底 1枚、 側壁 4枚の基体に分解できる。 たと えば図 4の （a ) に示すように、 一辺が 5〜 1 O mm程度で厚みが 0 . 1 mm程 度の基体 4 1を、 たとえば （b ) に示すように、 合成樹脂製の基体ホルダー 4 2 内の底 4 3と側壁 4 4とに組み立てて容器 1 2とすることができる （ （c ) 参 照） 。
この場合、 容器 1 2は、 底、 側壁の少なくとも 1枚は上記基体上に遺伝子を固 定化したもので形成されているものを用いることが好ましい。
さらに、 これらの容器をいくつか連結して （カセット型） 、 複数の容器を複数 の凹部 1 1にワンタッチで埋設 ·取外しできるようにして、 操作の効率化を図る こともできる。 このカセッ ト型の具体的態様については後述の固定化 D N Aライ ブラリーの部分で詳述する。
図 5は、 本発明の遺伝子増幅装置の断面状態を示す概略断面図である。 図 5に おいて、 （a ) は、 反応器本体 1 0の上部に蓋部 5 0を設置する態様を示した概 略説明図である。 （b ) は、 図 5の （a ) に示す C一 C断面概略図である。 図 5 において、 5 0は蓋部、 5 1は加熱 ·冷却手段、 5 2は冷却手段を示す 蓋部 5 0は、 化学的に安定な、 たとえばアク リル樹脂、 ポリスチレン樹脂等の高分子材 料で形成されることが望ましい。
加熱 ·冷却手段 5 1は、 容器 1 2と接触して容器 1 2を加熱 ·冷却する手段で あり、 ペルチェ素子、 電熱ヒータ、 赤外線ランプ等を用いるのが好ましい。 この
5 加熱 ·冷却手段 5 1を、 容器 1 2と直接的に接触させて設置することによって容 器 1 2の温度を直接的に制御できるので、 従来の増幅装置よりも温度制御精度が よい。 冷却手段 5 2は、 冷却水や冷風を流通させるパイブや冷却ファンを設置し たュニットであり、 容器 1 2を急速に冷却するための手段である。
図 6は、 本発明の遺伝子増幅装置の温度制御を示す概略図である。 図 6におい
I C て、 容器 1 2の温度制御は、 温度測定部 6 1からの情報に基づき加熱 ·冷却手段 5 1の温度制御部 6 2と冷却手段 5 2の温度制御部 6 3とによつて行われる。 す なわち容器 1 2の底もしくは側壁に直接的に接して設けられた温度測定部 6 1か らの信号をコンピュータ制御部 6 4に入力し、 コンピュータ制御部 6 4は予め入 力されてあるプログラムチャート （昇温速度、 保持温度、 保持時間、 降温速度
I 等） と比較し、 加熱 ·冷却手段 5 1の温度制御部 6 2と冷却手段 5 2の温度制御 部 6 3を駆動させる。
実施例
本発明の実施例を図 7及び図 8を用いてさらに詳細に説明する。
容器 1 2として 5 mm四方 （厚さ 0 . 1 mm) のダイヤモンドチップ 4 1をダイ ZD ャモンド基体として用いた。 このダイヤモンドチップ 4 1を、 底に 1枚と側壁に 4枚使用して、 図 4に示すように、 合成樹脂製の基体ホルダー 4 2の側壁に組み 立てて容器 1 2とした。 この側壁に使用したダイヤモンドチップ 4 1にはすでに 有機カルボン酸で化学修飾済みのものを用いた。 その後蓋部 5 0を、 反応器本体 1 0上部に設置した。
2 (固定化 D N Aライブラリ一の作製）
次に、 固定化 D N Aライブラリーの作製例を図 7 , 図 8を用いて説明する、 ま ず、 有機カルボン酸で化学修飾した 4枚のダイヤモンドチップ 4 1を用いて構成 した容器 1 2内の溶液と接触するダイヤモンドチップ 4 1表面に、 mRNA (me ssenger RNA:メッセンジャー RNA) の場合はォリゴー d T , B 。 を、 一方 gD NA (genomic DNA:染色体 DNA) の場合は目的の制限酵素部位を持ったオリゴ ヌクレオチドを、 まず化学的なエステル結合反応によって固定化した （図 7、 図 8参照） 。 これらの固定化反応のためには、 ォリゴー dT,™ では 3' 末端側 及びオリゴヌクレオチドでは 5 ' 末端側がアミノ基を有するアデニン （A) かシ トシン （C) であることが要求される。 なお、 図 7、 図 8において、 " ADC— R— " で示す記号は、 有機カルボン酸を化学修飾したダイヤモンドチップを表す。 Ό 次に、 c DNA (complementary DNA) ライブラリーでの場合は、 組織 ·細胞か ら抽出した全 RN A溶液を加えて 0〜4°Cの低温で mRNAを固定化オリゴー d T, «-2。 にハイブリダィズさせた後に、 37〜60°Cの範囲内での適当な一定温 度で逆転写酵素 （Reverse Transcriptase： RT) によって c D N A合成を行った。 このときの c DNAは、 固定化オリゴ一 d Τ , κ— 2。 の 5' へ向けての延長反応さ
)5 せ固定化したものを用いた。
合成された固定化 c DN Αと mRNAとのハイブリダイズ状態にある溶液を 9 0°Cに昇温させて mRNAを脱ハイブリダィズした後、 反応溶液を T r i s— E DTA(TE)緩衝液に交換し、 再度 0〜4°Cの低温にしてエタノール洗浄し、 一 本鎖 DN Aの状態の精製された固定化 c DN Aライブラリーを作製した （図 7参 ζΌ 照） 。
gDNAライブラリーでの場合は、 まず、 目的の制限酵素部位を持った固定側 オリゴヌクレオチド （図 8参照） を上記のォリゴー d T - の場合と同様にダ ィャモンドチップ 4 1の表面に固定化した。 次に、 その化学的な固定化のための 反応溶液を 0〜 4 °Cの低温でハイブリ側ォリゴヌクレオチドと目的の制限酵素を 25" 含む反応溶液に交換した。 そして、 オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーシ ョン後、 3 7 °Cにまで昇温して半固定化されたオリゴヌクレオチドの制限酵素切 断を行った。
制限酵素切断後に、 再度反応容器を 0〜4°Cの低温にして、 目的の制限酵素で 断片化した g DN Aとライゲーシヨン酵素 （Ligase) を含む反応溶液に交換し、 再び温度を 3 7°Cにまで上昇させてライゲーシヨン反応を行い、 一本鎖 DNAの 状態の g DN Aライブラリーを作製した （図 8参照） 。
なお、 ダイヤモンドチップ 4 1の表面上に上記作製された固定化 c DN Aライ ブラリー或いは上記作製された固定化 g D N Aライブラリ一を、
①多検体での同種の組織 ·細胞の遺伝子変異の比較、
②同一検体での各組織 ·細胞の遺伝子発現変動の比較、
10 ③同一検体での治療 ·手術等に伴う余後経過に対応する遺伝子発現変動の比較、 等を目的として、 それぞれを別の容器内に設置することができる。
たとえば①の場合は、 同種の組織 ·細胞の遺伝子変異の比較をするために、 多 検体 （固定化 DNAライブラリーを有した複数のダイヤモンドチップ） を、 別の 容器中に設置し、 これらの複数の容器を連結した 1カセットとする。 そしてこれ 15 らのカセットを反応器本体に埋設する。 さらにこれらのカセットを 2カセット以 上を系統的に作れば、 効率的に多検体の比較を行うことができる。
本発明では、 これらの複数の容器を連結した 1カセットあるいは複数のカセッ カセッ トを集合体にして、 これらのそれぞれの容器内に固定化 DN Aライブラリ 一を設置したものを、 カセット型固定化 DNAライブラリーとする。 本発明では αθ これらのカセッ ト型固定化 DNAライブラリーを用いて、 前記①〜②の比較を系 統的に行うことによって、 遺伝子の変動を効率的に調査できる。
そして、 このカセット型固定化 DNAライブラリ一は、 P CR過程に供しなか つた場合でも供した場合でも、 その容器を TE緩衝液及び 7 0〜 7 5%のェタノ ール水溶液で十分に洗浄後、 1 00%エタノールに浸潤して冷凍保存すれば、 比 ιζ 較データ等の要求に応じて半永久的に利用可能である。
(固定化 DNAライブラリーを用いての遺伝子増幅） 上記の固定化 c DNAライブラリー又は gDNAライブラリーで作製したカセ ット型固定化 DN Aライブラリーで容器 1 2の側壁を構成した。 この容器 1 2内 面を TE緩衝液で十分に洗浄後、 増幅目的の DN Aに対するプライマーをセット し、 4種のヌクレオチド及び DN Aポリメラーゼを含む P C R反応溶液を加えた c
5" その後、 容器 12を、 二本鎖の DNAを一本鎖 DNAに分離させる熱変性温度
(95°0で約1. 5分間） 、 一本鎖 DN Aと DNAプライマとを結合させるァニ 一リング温度 （ 45 °Cで約 1分間） 、 耐熱性 D N Aポリメラーゼにより D N A鎖 の伸長反応を行わせる DN A増幅温度 （74°Cで約 2分間） にそれぞれ順に温度 制御し、 これらの温度変化を 30サイクル繰り返し PC Rを行った （図 7, 図 8 ιθ 参照） 。
なお、 多検体の遺伝子診断を一度に短時間で可能にするためには、 このカセッ ト型固定化 DNAライブラリー作製 ·遺伝子増幅装置を必要な数だけ並列的に配 置できる形のシステムを提供することで解決できる。 この場合は、 例えば、 50 試料の処理では、 5組の本発明の遺伝子増幅装置を並列的に配置した形にするこ 15 とが好ましい。 産業上の利用可能性
本発明の装置を用いれば、 反応容器内の反応溶液を昇温や冷却を迅速に行うこ とができるので、 非常に短時間で DNAの増幅を行うことができる。 また、 自動 2J0 化遺伝子診断装置にも適用可能である。 すなわち、 自動化遺伝子診断装置の開発 において技術的に最も重要な 2点は、 半永久的に利用可能なカセッ ト型固定化ラ ィブラリ一の作製及び遺伝子増幅の効率 ·特異性の優れた遺伝子増幅装置の開発 である。
前記の両方の問題点は、 ライブラリー作製から PC Rまでの一連の操作を温度 制御が、 同一基体でもってできるという最高の利点から、 現状では最も簡便、 小 型で高性能な形の自動化カセット型固定化 DN Aライブラリー作製及び遺伝子増 幅装置を提供することができる。
すなわち、 本発明の装置を用いれば、 D N A固定化反応の直接的な温度制御に 加えて、 D N Aライブラリ一を固定化したダイヤモンドチップをそのまま利用し ての遺伝子増幅に関する直接的な温度制御も可能である。
5 さらに本発明の装置は、 高熱伝導性のダイヤモンドなどの基体を用いての P C R反応溶液の直接的な温度制御を行うことができるので、 P C Rの温度制御効率 を格段に進歩させて所要時間を大幅に短縮することができるのみならず、 目的 D N Aの特異的増幅といった P C R効率も上昇させることができる。
また、 本発明の基体に高熱伝導性の基体を用いれば、 高熱伝導性の他に、 化学
1C 試薬に对して安定である点、 耐熱性に優れている点、 放射線照射によるダメージ が少ない点等のダイヤモンドの特性を利用することにより、 作製された固定化 D N Aライブラリ一は非常に安定なものとなり、 一度カセット型固定化 D N Aライ ブラリ一を作製すれば、 何度の繰返し利用も可能な半永久的な D N Aライブラリ 一を提供することができる。
! 5 なお、 ダイヤモンド基体の高熱伝導性を利用して、 化学修飾していないダイヤ モンド基体等のチップを本発明の増幅装置内にセットして、 従来行われている P C R法を行うこともできる。

Claims

請 求 の 範 囲
1、 容器を挿入する凹部が形成された反応器本体と、
この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 ·冷却手段、 冷却手段を設けた蓋部と が設けられた装置であって、 前記容器は、 化学修飾された基体で形成されている 固定化 D N Aライブラリ一作製装置。
2、 容器を挿入する凹部が形成された反応器本体と、
この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 ·冷却手段、 冷却手段を設けた蓋部と が設けられた装置であって、 前記容器は、 化学修飾された基体で形成されているC 遺伝子増幅装置。
3、 容器を揷入する凹部が形成された反応器本体と、
この反応器本体の上部に取付けられ、 加熱 ·冷却手段、 冷却手段を設けた蓋部と が設けられた装置であって、 前記容器は、 遺伝子を固定化した基体で形成されて いる遺伝子増幅装置。
i5
4、 前記基体が、 固体状の基体である請求項 1〜3のいずれかに記載の装置。
5、 前記容器が分解型である請求項 1〜4のいずれかに記載の装置。
6、 前記容器がカセット型である請求項 1〜5のいずれかに記載の装置。
7、 請求項 1〜6のいずれかに記載の装置において、
温度測定部 6 1からの信号をコンピュータ制御部 6 4に入力し、 コンピュータ制 Ζΰ 御部 6 4は予め入力されたプログラムチャートと比較し、 加熱 ·冷却手段 5 1の 温度制御部 6 2と冷却手段 5 2の温度制御部 6 3とを駆動させる遺伝子増幅装置 の温度制御方法。
8、 請求項 1〜 6記載のいずれかの装置で用いる D N Αを固定化した基体。 9， D N Aを固定化した基体を冷凍保存する方法。
1 0、 複数個の固定化 D N Aライブラリーを容器内に設置し、 遺伝子を系統的 に比較する方法。
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