KR100678980B1 - Ｄｎａ를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법 - Google Patents

Ｄｎａ를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온도상승이나 냉각이 신속하고, 열사이클을 단시간에 행할 수 있는 조작이 간단한 고정화 DNA 라이브러리제작장치 또는 유전자증폭장치를 이용하여 DNA를 고정화한 세라믹, 금속, 탄소화합물 및 플라스틱 중에서 선택되는 1 이상으로 구성되는 기질을 냉동보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 고정화 DNA 라이브러리 제작장치는, 용기를 삽입하는 오목부를 갖는 반응기본체(10)와, 이 반응기본체상부에 가열·냉각수단(51), 냉각수단(52)을 설치한 덮개부(50)와, 유전자를 고정한 기질(41)로 구성되는 용기(12)로 이루어진다. 이 장치는, 온도측정부(61)로부터의 신호를 컴퓨터제어부(64)가 프로그램챠트와 비교하여, 가열·냉각수단(51)의 온도제어부(62)와 냉각수단(52)의 온도제어부(63)를 구동시킨다.

Description

ＤＮＡ를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법{A METHOD FOR REFREGERATING AND PRESERVING SUBSTRATES FOR IMMOBILIZING DNA}
도 1은 본 발명의 덮개를 개방시킨 상태의 유전자증폭장치를 나타낸 개략의 평면도이다.
도 2는 도 1의 A-A선의 단면 개략도이다.
도 3은 도 1의 B-B선의 단면 개략도이다.
도 4는 용기의 조립 개략도이다.
도 5는 본 발명의 유전자증폭장치의 단면상태를 나타낸 개략 단면도이다.
도 6은 본 발명의 유전자증폭장치의 온도제어를 나타낸 개략도이다.
도 7은 고정화 cDNA 라이브러리의 제작 및 유전자증폭의 설명도이다.
도 8은 고정화 gDNA 라이브러리의 제작 및 유전자증폭의 설명도이다.
본 발명은 유전자공학, 단백질공학, 세포공학, 발생공학, 면역학 등의 분자생물학관련분야나 생화학관련분야 등에서, 미량의 용액으로 가열을 동반하는 각종 반응에 사용하는 반응장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 고정화 DNA 라이브러 리제작방법, 유전자증폭방법, 유전자를 계통적으로 비교하는 방법 및 이들에 사용하는 장치, 또한 그것에 이용하는 고정화 DNA 라이브러리에 관한 것이다.
종래, 유전자를 증폭하는 수단으로서, 폴리머라아제 체인 리액션(PCR)법이 널리 이용되어지고 있다. 이 PCR법은 반응용액을 넣은 튜브상의 플라스틱반응용기를 알루미늄블록 등의 안에 삽입하고, 반응용액의 수분증발을 방지하기 위한 덮개를 씌우고, 알루미늄블록의 온도를 열변성온도, 어닐링온도, DNA합성온도의 순서로 열사이클을 소정 회수 제어한다라는 것이다.
그러나, 이러한 종래의 PCR법에 이용된 장치에서는, 열용량이 크고 열전도성이 나쁜 플라스틱반응용기가 이용되고 있고, 게다가 알루미늄블록자체를 온도제어하기 때문에, 승온이나 냉각에 시간이 걸린다는 문제점이 있었다.
또, 반응용액의 온도제어가 완전하지 않으므로, 목적으로 하는 DNA의 복제수량이 낮다는 문제점도 있었다.
본 발명은, 상기 문제점을 감안하여, 조작이 간단하고, 승온이나 냉각을 신속하게 행할 수 있고, 반응의 열사이클을 단시간에 행할 수 있는 유전자증폭장치 및 유전자증폭방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
또, 이러한 장치에 이용하는 것이 적합한 DNA를 고정화한 기질 및 고정화 DNA 라이브러리제작방법을 제공하는 것도 본 발명의 기술적 과제이다.
또한, 상기 장치를 이용해서 DNA를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법 및 유전자를 계통적으로 비교하는 방법을 제공하는 것도 본 발명의 기술적 과제이다.
본 발명의 고정화 DNA 라이브러리제작장치는, 용기를 삽입하는 오목부가 형성된 반응기본체와, 이 반응기본체의 상부에 부착되고, 가열·냉각수단, 냉각수단을 설치한 덮개부가 설치된 장치로서, 상기 용기는 화학수식된 기질로 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자증폭장치는 용기를 삽입하는 오목부가 형성된 반응기본체와, 이 반응기본체의 상부에 부착되고, 가열·냉각수단, 냉각수단을 설치한 덮개부가 설치된 장치로서, 상기 용기는 화학수식된 기질로 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자증폭장치는, 용기를 삽입하는 오목부가 형성된 반응기본체와, 이 반응기본체의 상부에 부착되고, 가열·냉각수단, 냉각수단을 설치한 덮개부가 설치된 장치로서, 상기 용기는 유전자를 고정화한 기질로 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.
이들 장치는, 상기 기질이 고체상 기질인 것이 바람직하고, 상기 용기가 분해형인 것이 바람직하고, 상기 용기가 카셋트형인 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자증폭장치의 온도제어방법은 온도측정부(61)로부터의 신호를 컴퓨터제어부(64)에 입력하고, 컴퓨터제어부(64)는 미리 입력된 프로그램챠트와 비교하여, 가열·냉각수단(51)의 온도제어부(62)와 냉각수단(52)의 온도제어부(63)를 구동시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 DNA를 고정화한 기질은 이들의 장치에서 이용하는 기질인 것을 특 징으로 한다.
본 발명의 DNA를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법은, 합성수지제의 기질홀더와, 바닥 1장 및 측벽 4장의 기질을 조립하여 구성한 용기; 상기 용기를 삽입하는 오목부가 형성된 반응기본체; 및 이 반응기본체의 상부에 부착되고, 가열·냉각수단, 냉각수단을 설치한 덮개부가 설치된 고정화 DNA 라이브러리제작장치 또는 유전자증폭장치를 이용하여 DNA를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법으로서, (a) 유기카르본산으로 화학수식된 5장의 기질에 DNA를 고정화하는 단계; (b) 트리스-에틸렌-디아민 테트라아세트산(Tris-EDTA) 완충액과 70~75% 에탄올 용액을 함유하는 용액으로 상기 기질을 세정하는 단계; (c) 100% 에탄올에 상기 기질을 담그는 단계; (d) 100% 에탄올에서 상기 기질을 냉동보존하는 단계; 및 (e) 상기 고정화 DNA 라이브러리제작장치 또는 상기 유전자증폭장치의 용기에 상기 기질을 배치하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자를 계통적으로 비교하는 방법은 복수개의 고정화 DNA 라이브러리를 용기내에 설치해서 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자증폭장치를 도면을 이용해서 설명한다.
도 1은 본 발명의 덮개를 개방시킨 상태의 유전자증폭장치를 나타낸 개략 평면도이다. 도 2는 도 1의 A-A선의 단면 개략도이다. 도 3은 도 1의 B-B선의 단면 개략도이다. 도 4는 용기의 조립개략도이다. 도 5는 본 발명의 유전자증폭장치의 단면상태를 나타낸 개략 단면도이다.
도 1 내지 도 3에 있어서, 도면부호 10은 반응기본체, 11은 반응기본체내에 형성된 오목부이다. 반응기본체(10)는 화학적으로 안정된, 예를 들면, 아크릴수지, 폴리스티렌수지 등의 고분자재료로 형성되는 것이 바람직하다. 오목부(11)는 반응기본체내에 적어도 1개 설치되어 있고, 예를 들면, 원통형상, 삼각 또는 사각 등의 다각기둥형상 등의 것이 바람직하다.
용기(12)는 열전도성이 우수한 기질(41), 예를 들면 다이아몬드기질, 질화알루미늄, 탄화규소 등의 세라믹기질이나, 알루미늄, 스테인레스스틸 등의 금속기질로 구성되어 있는 것이 바람직하다.
또는, 일부에 다이아몬드가 형성된 다이아몬드 라이크 카본, 탄소, 탄소화합물 등도 바람직하다. 또, 폴리카보네이트나 불소수지 등의 플라스틱기질 등도 바람 직하다. 또한 상기 기질을 조합한 것으로 형성되어 있는 것도 바람직하다.
용기(12)는 바닥이 부착된 것이면 좋고, 오목부(11)에 착탈이 용이한 것이 바람직하다.
또, 용기(12)는 기질(41)을 바닥이나 측벽을 분해형으로 해 두는 것도 바람직하고, 예를 들면 4각기둥상의 용기이면, 바닥 1장, 측벽 4장의 기질로 분해할 수 있다. 예를 들면 도 4의 (a)에 나타내듯이, 한 변이 5∼10mm정도이고, 두께가 0.1mm정도인 기질(41)을, 예를 들면 도 4의 (b)에 나타내듯이 합성수지제의 기질홀더(42)안의 바닥(43)과 측벽(44)에 조립해서 용기(12)로 할 수 있다.(도 4의 (c)참조.)
이 경우, 용기(12)의 바닥, 측벽의 적어도 한 장은 상기 기질상에 유전자를 고정화한 것으로 형성되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 이들의 용기를 몇 개를 연결해서(카셋트형), 복수의 용기를 복수의 오목부(11)에 원터치로 착탈할 수 있도록 해서, 조작의 효율화를 꾀할 수도 있다. 이 카셋트형의 구체적 양태에 대해서는 후술하는 고정화 DNA 라이브러리의 부분에서 상세하게 설명한다.
도 5는 본 발명의 유전자증폭장치의 단면상태를 나타낸 개략 단면도이다. 도 5에 있어서, (a)는 반응기본체(10)의 상부에 덮개부(50)를 설치하는 형태를 나타낸 개략 설명도이다. 도 5의 (b)는 도 5의 (a)에 나타낸 C-C선의 단면 개략도이다. 도 5에 있어서, 50은 덮개부, 51은 가열·냉각수단, 52는 냉각수단을 나타낸다. 덮개부(50)는 화학적으로 안정된, 예를 들면 아크릴수지, 폴리스티렌수지 등의 고분자 재료로 형성되는 것이 바람직하다.
가열·냉각수단(51)은 용기(12)와 접촉해서 용기(12)를 가열·냉각하는 수단이고, 펠티에소자, 전열히터, 적외선램프 등을 이용하는 것이 바람직하다. 이 가열·냉각수단(51)을 용기(12)와 직접적으로 접촉시켜 설치함으로써 용기(12)의 온도를 직접적으로 제어할 수 있으므로, 종래의 증폭장치보다 온도제어정밀도가 좋다. 냉각수단(52)은 냉각수나 냉풍을 유통시키는 파이프나 냉각팬을 설치한 유닛이고, 용기(12)를 급속히 냉각하기 위한 수단이다.
도 6은 본 발명의 유전자증폭장치의 온도제어를 나타낸 개략도이다. 도 6에 있어서, 용기(12)의 온도제어는, 온도측정부(61)로부터의 정보에 근거해서 가열·냉각수단(51)의 온도제어부(62)와 냉각수단(52)의 온도제어부(63)에 의해 행해진다. 즉 용기(12)의 바닥 또는 측벽에 직접적으로 접해서 설치된 온도측정부(61)로부터의 신호를 컴퓨터제어부(64)에 입력하고, 컴퓨터제어부(64)는 미리 입력되어 있는 프로그램챠트(온도상승속도, 유지온도, 유지시간, 온도하강속도 등)와 비교하여, 가열·냉각수단(51)의 온도제어부(62)와 냉각수단(52)의 온도제어부(63)를 구동시킨다.
(실시예)
본 발명의 실시예를 도 7 및 도 8을 이용해서 더욱 상세히 설명한다.
용기(12)로서 5mm×5mm(두께 0.1mm)의 다이아몬드칩(41)을 다이아몬드기질로서 이용했다. 이 다이아몬드칩(41)을 바닥에 1장과 측벽에 4장 사용해서, 도 4에 나타내듯이, 합성수지제의 기질홀더(42)의 측벽에 조립해서 용기(12)로 했다. 이 측벽에 사용한 다이아몬드칩(41)에는 이미 유기카르본산으로 화학수식이 끝난 것을 이용했다. 그후 덮개부(50)를 반응기본체(10)상부에 설치했다.
(고정화 DNA 라이브러리제작)
다음에, 고정화 DNA 라이브러리의 제작예를 도 7, 도 8을 이용해서 설명한다. 먼저, 유기카르본산으로 화학수식된 4장의 다이아몬드칩(41)을 이용해서 구성한 용기(12)안의 용액과 접촉하는 다이아몬드칩(41)표면에 mRNA(messenger RNA:메신저RNA)의 경우에는 올리고-dT16 -20를, 한편 gDNA(genomic DNA: 염색체DNA)의 경우에는 목적의 제한효소부위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 먼저 화학적 에스테르결합반응에 의해 고정화했다(도 7, 도 8참조). 이들 고정화반응을 위해서는, 올리고-dT16-20에서는 3'말단측 및 올리고뉴클레오티드에서는 5'말단측이 아미노기를 갖는 아데닌(A)이거나 시토신(C)인 것이 요구된다. 또, 도 7, 도 8에 있어서, "ADC-R-"로 나타낸 기호는, 유기카르본산으로 화학수식된 다이아몬드칩을 나타낸다.
다음에, cDNA(complementary DNA) 라이브러리에서의 경우는, 조직·세포에서 추출한 모든 RNA용액을 첨가해서 0∼4℃의 저온에서 mRNA를 고정화 올리고-dT16 -20에 하이브리다이즈시킨 후에, 37∼60℃의 범위내에서의 적당한 일정온도로 역전사효소(Reverse Transcriptase:RT)에 의해 cDNA합성을 행했다. 이때의 cDNA는 고정화 올리고-dT16 -20의 5'를 향해 연장반응시켜 고정화한 것을 이용했다.
합성된 고정화cDNA와 mRNA의 하이브리다이즈상태에 있는 용액을 90℃로 온도상승시켜 mRNA를 탈하이브리다이즈한 후, 반응용액을 Tris-EDTA(TE)완충액으로 교 환하고, 다시 0∼4℃의 저온으로 해서 에탄올세정하고, 단일 사슬 DNA의 상태의 정제된 고정화 cDNA 라이브러리를 제작했다(도 7참조).
gDNA 라이브러리에서의 경우는, 먼저, 목적의 제한효소부위를 갖는 고정측 올리고뉴클레오티드(도 8참조)를 상기 올리고-dT16 -20의 경우와 동일하게 다이아몬드칩(41)의 표면에 고정화했다. 다음에, 그 화학적인 고정화를 위한 반응용액을 0∼4℃의 저온에서 하이브리드측 올리고뉴클레오티드와 목적의 제한효소를 함유하는 반응용액으로 교환했다. 그리고, 올리고뉴클레오티드사이를 하이브리다이즈한 후, 37℃까지 온도상승해서 반고정화된 올리고뉴클레오티드의 제한효소를 절단했다.
제한효소 절단후에, 다시 반응용기를 0∼4℃의 저온으로 해서, 목적의 제한효소로 단편화한 gDNA와 라이게이션효소(Ligase)를 함유한 반응용액으로 교환하고, 다시 온도를 37℃까지 상승시켜 라이게이션반응을 행하고, 단일 사슬 DNA상태의 gDNA 라이브러리를 제작했다(도 8참조).
또, 다이아몬드칩(41)의 표면상에 상기 제작된 고정화 cDNA 라이브러리 또는 상기 제작된 고정화 gDNA 라이브러리를,
①다수 검체에서의 동종의 조직·세포의 유전자변이의 비교,
②동일 검체에서의 각 조직·세포의 유전자발현변동의 비교,
③동일 검체에서의 치료·수술 등에 따른 시간경과에 대응하는 유전자발현변동의 비교,
등을 목적으로 해서, 각각을 다른 용기안에 설치할 수 있다.
예를 들면 ①의 경우는, 동종의 조직·세포의 유전자변이의 비교를 하기 위해, 다수 검체(고정화 DNA 라이브러리를 가진 복수의 다이아몬드칩)를, 다른 용기안에 설치하고, 이들 복수의 용기를 연결한 1카셋트로 한다. 그리고 이들 카셋트를 반응기본체에 매설한다. 또한 이들 카셋트를 2카셋트이상을 계통적으로 만들면, 효율적으로 다수 검체의 비교를 행할 수 있다.
본 발명에서는, 이들 복수의 용기를 연결한 1카셋트 또는 복수의 카셋트를 집합체로 해서, 이들 각각의 용기안에 고정화 DNA 라이브러리를 설치한 것을 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리로 한다. 본 발명에서는 이들 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리를 이용해서, 상기 ①∼②의 비교를 계통적으로 행함으로써, 유전자의 변동을 효율적으로 조사할 수 있다.
그리고, 이 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리는, PCR과정에 제공하지 않은 경우나, 제공한 경우라도, 그 용기를 TE완충액 및 70∼75%의 에탄올수용액으로 충분히 세정한 후, 100%에탄올에 침윤해서 냉동보존하면, 비교데이터 등의 요구에 따라 반영구적으로 이용가능하다.
(고정화 DNA 라이브러리를 이용한 유전자증폭)
상기 고정화 cDNA 라이브러리 또는 gDNA 라이브러리로 제작한 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리로 용기(12)의 측벽을 구성했다. 이 용기(12)의 내면을 TE완충액으로 충분히 세정한 후, 증폭목적의 DNA에 대한 프라이머를 셋트하고, 4종의 뉴클레오티드 및 DNA 폴리머라아제를 포함하는 PCR반응용액을 첨가했다.
그후, 용기(12)를 2사슬 DNA를 단일 사슬 DNA로 분리시키는 열변성온도(95℃ 에서 약 1.5분간), 단일 사슬 DNA와 DNA프라이머를 결합시키는 어닐링온도(45℃에서 약 1분간), 내열성 DNA폴리머라아제에 의해 DNA사슬의 신장반응을 행하게 하는 DNA증폭온도(74℃에서 약 2분간)로 각각 순서대로 온도제어하고, 이들의 온도변화를 30사이클 반복하여 PCR를 행했다(도 7, 도 8 참조).
또, 다수 검체의 유전자진단을 한 번에 단시간에 가능하게 하기 위해서는, 이 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리 제작·유전자 증폭장치를 필요한 수만큼 병렬적으로 배치할 수 있는 형의 시스템을 제공함으로써 해결할 수 있다. 이 경우에는, 예를 들면 50시료의 처리에서는, 5세트의 본 발명의 유전자증폭장치를 병렬로 배치한 형으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 장치를 이용하면, 반응용기내의 반응용액을 승온이나 냉각을 신속하게 행할 수 있으므로, 매우 단시간에 DNA의 증폭을 행할 수 있다. 또, 자동화 유전자 진단장치에도 적용가능하다. 즉, 자동화 유전자 진단장치의 개발에 있어서 기술적으로 가장 중요한 두 가지 점은, 반영구적으로 이용가능한 카셋트형 고정화 라이브러리의 제작 및 유전자증폭의 효율·특이성이 우수한 유전자 증폭장치의 개발이다.
상기 두 개의 문제점은, 라이브러리제작에서 PCR까지의 일련의 조작이 동일기질에 의해 온도제어가 가능하다라는 최고의 이점으로부터, 현상황에서는 가장 간편하고, 소형이며 고성능의 자동화 카셋트형 고정화 DNA 라이브러리제작 및 유전자증폭장치를 제공할 수 있음으로써, 해소된다.
즉, 본 발명의 장치를 이용하면, DNA고정화반응의 직접적인 온도제어 이외에도에, DNA라이브러리를 고정화한 다이아몬드칩을 그대로 이용한 유전자증폭에 관한 직접적인 온도제어도 가능하다.
또한 본 발명의 장치는 고열전도성의 다이아몬드 등의 기질을 이용한 PCR반응용액의 직접적인 온도제어를 행할 수 있으므로, PCR의 온도제어효율을 현격히 진보시켜 소요시간을 대폭 단축할 수 있을 뿐만 아니라, 목적의 DNA의 특이적 증폭이라는 PCR효율도 상승시킬 수 있다.
또, 본 발명의 기질에 고열전도성의 기질을 이용하면, 고열전도성외에, 화학시약에 대해서 안정적이다는 점, 내열성이 우수하다는 점, 방사선조사에 의한 손상이 적다는 점 등의 다이아몬드의 특성을 이용함으로써 제작된 고정화 DNA 라이브러리는 매우 안정된 것으로 되고, 한 번 카셋트형 고정화 DNA라이브러리를 제작하면, 몇 번이나 반복해서 이용할 수 있는 반영구적인 DNA라이브러리를 제공할 수 있다.
또, 다이아몬드기질의 고열전도성을 이용해서, 화학수식되어 있지 않은 다이아몬드기질 등의 칩을 본 발명의 증폭장치안에 셋트해서 종래 행해지고 있는 PCR법을 행할 수도 있다.

Claims (1)

  1. 합성수지제의 기질홀더와, 바닥 1장 및 측벽 4장의 기질을 조립하여 구성한 용기; 상기 용기를 삽입하는 오목부가 형성된 반응기본체; 및 이 반응기본체의 상부에 부착되고, 가열·냉각수단, 냉각수단을 설치한 덮개부가 설치된 고정화 DNA 라이브러리제작장치 또는 유전자증폭장치를 이용하여 DNA를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법으로서,
    (a) 유기카르본산으로 화학수식된 5장의 기질에 DNA를 고정화하는 단계;
    (b) 트리스-에틸렌-디아민 테트라아세트산(Tris-EDTA) 완충액과 70~75% 에탄올 용액을 함유하는 용액으로 상기 기질을 세정하는 단계;
    (c) 100% 에탄올에 상기 기질을 담그는 단계;
    (d) 100% 에탄올에서 상기 기질을 냉동보존하는 단계; 및
    (e) 상기 고정화 DNA 라이브러리제작장치 또는 상기 유전자증폭장치의 용기에 상기 기질을 배치하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA를 고정화한 기질을 냉동보존하는 방법
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