WO1999038013A2 - Verfahren zur gleichzeitigen identifizierung von proteinen und ihren bindungspartnern - Google Patents

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WO1999038013A2
WO1999038013A2 PCT/DE1999/000220 DE9900220W WO9938013A2 WO 1999038013 A2 WO1999038013 A2 WO 1999038013A2 DE 9900220 W DE9900220 W DE 9900220W WO 9938013 A2 WO9938013 A2 WO 9938013A2
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Liming Ge
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Jocelyne H. Ng
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Xerion Pharmaceuticals Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the invention relates to a method for the simultaneous identification of proteins and their specific binding partners.
  • the invention relates to a method for the simultaneous identification of all proteins from a biological source and their corresponding binding partners and thus the simultaneous elucidation of the structure and function of all proteins from a biological source.
  • ESTs Expression Sequence Tags
  • gene expression does not fully correspond to mRNA production.
  • ESTs contain RNA splice intermediates, and the final mRNA content depends crucially on the stability of the mRNAs. Due to differences in the translation height, the stability, the splice pattern, post-transcriptional and post-translational modifications, the final protein product can usually not be predicted from the corresponding mRNAs or ESTs.
  • the function of some proteins can be determined by their interaction with other proteins whose function is known.
  • Methods such as the yeast two-hybrid technique (Phizicky, EM and Fields, S., Microbiological Rev., 59: 94-1 23, 1 995) and the phage display technique (Hag, V. and Ge, L., PCT / - EP97 / 00931, 1 996) for a mutual search of gene banks can be used to determine such interactions.
  • the yeast two-hybrid method offers the possibility of studying proteins and their interactions in a eukaryotic host; however, the method has the disadvantage that the interaction takes place only in the yeast cell nucleus and can only be applied to non-secreted proteins.
  • the phage display method overcomes these problems, the proteins are not expected to be in their native form since post-translational modifications may occur.
  • antibodies are most commonly used because of their high specificity and affinity. So ligand-receptor interactions can be caused by blocking antibodies be blocked.
  • antibodies can only be raised against foreign antigens. For example, it is difficult or even impossible to generate human antibodies that are useful in antibody-based therapies against antigens of human origin. However, antibodies are expensive and complex to produce and clean.
  • protein banks in particular antibody banks (single-chain Fv / scFV and Fab), and peptide banks are functionally expressed on the surface of filamentous bacteriophage particles in a phage display system (cf. Smith, GP, Science , 228: 1 31 5-131 7, 1 985).
  • the scFvs, Fabs, proteins or peptides are fused to a component of a surface protein of the phage, whereby the binding of the scFvs, Fabs, protein or peptide of interest can take place.
  • the genes that encode the presented proteins are packaged in the phage particles, and so the protein products bind directly to their genetic information.
  • Human scFv phage libraries have been widely used for the isolation of therapeutically important antibodies (cf. Vaughan, T. J. et al., Nature Biotechnol. 14: 309-314, 1 996).
  • WO 94/26787 and WO 97/22972 describe the isolation of antibodies from combinatorial antibody banks against unpurified and previously unidentified cell surface antigens or intracellular disease-specific antigens.
  • cell surface antigens can be determined using the method according to WO 94/26787; the unknown antigens cannot be identified directly.
  • antigen-specific antibodies must first be made available from a selection process. In a first step, therefore, antigen-specific antibodies must be selected before the unknown antigens can be identified.
  • the present invention is therefore based on the object of a method
  • the aim of the method is to be able to functionally record all proteins from a biological source.
  • the proteome status of a biological sample should therefore be able to be determined.
  • the method should be applicable to all possible binding partners of a protein.
  • the method should also allow the identification of the functionally characterized proteins.
  • the process should be simple, quick and inexpensive to carry out and should be suitable for mass screening and automation.
  • the method according to the invention is intended to allow rapid, clear and simple diagnosis of metabolic diseases and the identification of drug effects.
  • the method according to the invention is intended to be able to create a database of proteins and their respective specific binding partner. This database is intended to support the identification of prototype drugs.
  • a method for the simultaneous identification of a protein and its binding partner which is characterized in that a) isolating and separating proteins or protein aggregates from a biological source, b) immobilizing the separated proteins or protein aggregates on a surface, c ) incubating a combinatorial bank with the proteins or protein aggregates immobilized on a surface, d) separating those members of the combinatorial bank that bind to the immobilized proteins from unbound members of the bank, e) the complexes of protein and binding partner bound to the surface are isolated from the combinatorial library, f) the proteins in the complexes thus isolated are identified using a combination of a physicochemical method, and g) if necessary, the isolated binding partners are enriched.
  • the method is preferably carried out in such a way that in step a) the biological sample is solubilized in a suitable buffer and the sample is separated using a protein separation method selected from 2D gel electrophoresis, perfusion chromatography, liquid chromatography or capillary electrophoresis.
  • the separated proteins are further preferably immobilized on the cavities of a microtiter plate or blotted on a membrane or captured with microspheres coated with specific antibodies.
  • protein aggregates denotes an amalgamation of several proteins. This association can be the result of a functional association of several proteins, e.g. Enzymes of the Krebs cycle, which are linked to form a functional unit on which the conversion of the substrate into the end product takes place via several intermediate stages.
  • the merger can also be the result of the separation process and includes e.g. proteins eluting in a chromatographic peak linked by a common retention time.
  • Random peptide banks are preferably used as the combinatorial bank, (scFv) Banks of the immunoglobulin superfamily, protein display banks, combinatorial chemical banks, RNA or DNA banks.
  • Step g) is preferably carried out in such a way that a bacterial host is infected with the isolated proteins in order to multiply selected phage particles, and the selected protein binding partners are sequenced, or the selected binding partners are identified by means of unique sequence connections (tag).
  • proteins and their binding partners can be identified at the same time if, without prior purification and identification, proteins are incubated after separation with a combinatorial bank and the complexes of protein and binding partner thus obtained are subjected to a physico-chemical identification process.
  • the protein samples are derived directly from their biological sources, no expensive, time-consuming or risky protein production is required. Since the selection step takes place in one step, no enrichment of the bank or a subsequent selection is required. The method according to the invention is therefore ideal for the production of protein-specific antibodies or peptides on a large scale. Any combinatorial bank can also be used.
  • the method of protein identification and generation of protein-specific subbanks can be carried out as a parallel method. As a result, the method according to the invention was suitable on a large scale for protein identification.
  • the method according to the invention can be carried out with any combinatorial bank, e.g. Protein bank, peptide bank, cDNA bank, mRNA bank, bank with organic molecules, scFv bank with immunoglobulin superfamily, protein display bank etc.
  • the banks can present: all types of proteins, e.g. Structural proteins, enzymes, receptors, ligands, all types of peptides including modifications, DNAs, RNAs, combinations of DNAs and RNAs, hybrids of peptides and RNA or DNA, all types of organic molecules, e.g. Steroids, alkaloids, natural substances, synthetic substances etc.
  • the presentation can take place in different ways, e.g. as a phage display system (e.g. filamentous phages such as M 1 3, fl, fd etc., lambda phage display, viral display etc.), presentation on bacterial surfaces, ribosomes etc.
  • the combinatorial bank can be constructed by: a) constructing random peptide banks in which banks can be presented, b) constructing scFv banks or banks of any members of the immunoglobulin superfamily in which members of the banks can be presented , c) Construction of protein banks in which proteins are presented
  • the proteins to be identified according to the invention can come from any biological source, e.g. from healthy or diseased tissues, cell cultures, organ specimens, body fluids, biopsy samples of all kinds, organ cultures, microorganisms, plant specimens, etc.
  • the present invention thus allows the simultaneous identification of proteins with and without prior purification, and the selection of members of combinatorial banks that interact with these proteins. This makes it easy to determine the function of the proteins via their specific binding partners.
  • the identification of proteins from an expression family complements or even replaces the method for identifying genes: the identification of proteins in their native state confirms the corresponding gene sequences or identifies possible post-transcriptional and post-translational modifications.
  • Ed The identification of most or all proteins from a not sequenced or partially sequenced ⁇ biological sample accelerates Bemühun ⁇ gen for determining a Genzielsequenz or eliminates the costly process of gene sequencing.
  • the information on the protein level reflects the biological see an organism's identity better than information at the genomic level.
  • the identification of all proteins of a biological sample reflects the relevant information about the biological state of the sample and thus of the examined organism or part of the organism. Furthermore, it can be expected that the variation in the occurrence of a protein is dynamic, ie it is influenced by endogenous and exogenous factors. It is not possible to derive this additional information from the sequencing of the genome or the mRNA (see above).
  • specifically interacting members of a combinatorial bank can be determined simultaneously against most or even all proteins of a given biological sample. This replaces the complex process of gene isolation, subcloning, expression and purification of the recombinant protein. Furthermore, with the currently known methods, it is not only complex and difficult to isolate specific members of a combinatorial bank against a protein, but it is also uncertain whether all proteins can be expressed and whether the expressed proteins are actually in their native form. For example, it is well known that the glycosylation pattern of proteins of eukaryotic origin crucially depends on the hosts chosen for expression. Furthermore, it is practically impossible to obtain specifically interacting members of a bank against most or all of the proteins from complex biological samples simultaneously using previously known methods.
  • the present invention enables the use of any combinatorial bank, for example protein, peptide or antibody banks or DNA and RNA banks or even synthetic organic molecular banks provided with a code sequence (Brenner, S. and Lerner, RA, Proc. Natl. Acad USA, 89.5381 -5383, 1 992).
  • any combinatorial bank for example protein, peptide or antibody banks or DNA and RNA banks or even synthetic organic molecular banks provided with a code sequence (Brenner, S. and Lerner, RA, Proc. Natl. Acad USA, 89.5381 -5383, 1 992).
  • the invention thus has, for example, the following technical applications: a) Isolation of proteins which are specific for proteins from a biological sample and creation of a protein-protein interaction bank (for example a network of signal-transmitting metabolic pathways if proteins of the combinatorial bank of the same biological one Source originate as the sample) or a pathogen-host database (eg if proteins from the combinatorial bank belong to the pathogen and the sample is the host), b) isolation and identification of protein-specific peptides, with the aim of identifying potential peptide agonists or - antagonists or peptidomimetic molecules for the design of new drugs, c) isolation and identification of recombinant antibodies with the above Based on the application spectrum mentioned, d) isolation and identification of protein-specific DNA or RNA molecules, which are suitable for applications from protein knock-out for function determination to drug development, and e) isolation and identification of small organic molecules, the direct Molecules for drug development are.
  • a protein-protein interaction bank for example a network of signal-transmit
  • the method according to the invention allows simple and rapid diagnosis of metabolic diseases.
  • diagnostics are only performed on a special protein or metabolic product.
  • hereditary diseases only very special mutations in one gene are tested, but with uncertainty.
  • diagnostics with several proteins or metabolites, such methods are expensive and time-consuming and only allow limited information about the disease.
  • Monitoring the proteome status of a biological sample allows, as stated above, the determination of the current status in a biological tissue.
  • the proteome status of a tissue can now be determined simply, quickly and reliably. For this purpose, a protein-specific is
  • cal bank or subbank of a tissue such as the liver, lungs, stomach, etc. generated and possibly amplified many times.
  • a bank will then immobilized on a suitable surface, for example made of glass, plastic, a semiconductor chip of an optical fiber or a CD in a manner known per se.
  • the binding of the proteins to their related subbanks, which are immobilized on the appropriate surface can be detected using known detection methods, e.g. B. BIAcore chips.
  • the biological sample can also be immobilized on the surface of such a chip.
  • the surface itself is preferably subdivided into a number of microcompartments, each subdivision being assigned to a special protein, the combinatorial subbank of which was previously generated.
  • the protein-specific antibody or protein subbanks are added to each compartment.
  • the bound antibodies or peptides can be identified by their fused peptide tags. From the signals (qualitative / quantitative) thus obtained, a corresponding disease of the tissue or organ can then be concluded by comparison with the signal pattern of a normal sample.
  • Diagnostic chips of this type can be produced specifically for diagnosing organ and tissue conditions, infections and diseases of all kinds. Such a chip can also be used to examine metabolic states in plants, microorganisms, etc. With such a chip, conditions such as a fresh heart attack, a stomach ulcer, tissue necrosis, infections such as hepatitis, tropical diseases, AIDS, autoimmune diseases of all kinds, etc. can be diagnosed quickly and specifically.
  • Such a diagnostic chip can be offered in the form of a ready-to-use kit
  • kits comprises a corresponding tissue or organ specific chip on which a corresponding protein bank is immobilized, equipment for sampling, eg syringe, scalpel etc. as well as a vessel for carrying out the incubation between chip and sample and instructions for carrying out and evaluating.
  • Appropriate ready-to-use kits can be produced specifically.
  • the protein sample from the respective biological source is first solubilized and separated. Any method known to a person skilled in the art in the field of protein separation can be used for this purpose. 2D gel electrophoresis is preferred. The protein sample thus separated is then blotted onto a surface, preferably a membrane. It is not necessary to identify the proteins at this stage.
  • the next step is to incubate a combinatorial bank, for example from a peptide or antibody-like molecules or proteins, which are expressed on the surface of filamentous phage particles, with the membrane onto which the separated protein sample is blotted.
  • the incubation can be carried out according to conditions known to a person skilled in the art.
  • the combinatorial bank can be produced, for example, by combinatorial chemical methods such as randomized oligo cassettes and can be isolated from any biological source (for example cDNA or antibodies from immunized animals).
  • the incubation conditions are chosen so that some of the proteins in the bank bind to the individual proteins in the separated sample.
  • the conditions to be applied specifically to the respective case can be determined by a person skilled in the art by simple routine tests.
  • proteins, peptides or antibody-like molecules are used in an in vitro in a polysome display system (Mattheakis, LC et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 9022-9026, 1 994 ) are presented, or DNA or RNA molecular banks, which were generated by means of SELEX or similar systems (Tuerk, C, and Gold, L. Science, 249: 505-51 0, 1 990), or combinatorial banks of organic molecules with the incubated separate immobilized molecules. The incubation is carried out so that a part of the members of the bank binds to the individual separated proteins in the sample.
  • the membrane is then washed thoroughly to ensure that only those members of the library that are specific for the separated proteins remain attached.
  • the washing conditions depend on the bound proteins and the bank used.
  • the spots corresponding to the proteins to be identified are excised and the filamentous phage particles bound to the proteins are eluted.
  • the selected phage particles are either saved or used to infect relevant host cells to multiply the selected bank members.
  • the genetic information corresponding to the bound members of the bank can be obtained directly by PCR or identified by their unique code sequence.
  • the blotted membrane is reversed
  • the proteins blotted onto the membrane are identified by any physico-chemical method for protein identification known to a person skilled in the art.
  • the identity of the proteins of interest is preferably mass spectrometrically (as described, for example, in Siuzdak, G., Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press, Inc., 1 996) with subsequent protein or EST database search (for example according to Mann, M., in Microcharacterization of Proteins, ed. R. Kellner, F. Lottsspeich, HE Meyer, VCH Weinheim, 1 994).
  • the proteins are then cleaved enzymatically or chemically in the gel.
  • the slit batch can then be analyzed as such completely by mass spectrometry or can be analyzed beforehand by means of micro column liquid chromatography (LC).
  • the mass spectrometric analysis can be carried out in various ways known per se, e.g. with an ionization source such as an electrospray (Chapman, JR, et al., Methods in Molecular Biology, 61, JR Chapman ed., Humana Press Inv. Totowa NJ, USA, 1,996) including nanoelectrospray (Wilm. M. and Mann, M ., Anal. Chem. 68, 1 -8, 1 996) and matrix-assisted laser desorption and ionization (MAL-
  • an ionization source such as an electrospray (Chapman, JR, et al., Methods in Molecular Biology, 61, JR Chapman ed., Humana Press Inv. Totowa NJ, USA, 1,996) including nanoelectrospray (Wilm. M. and Mann, M ., Anal. Chem. 68, 1 -8, 1 996) and matrix-assisted laser desorption and
  • peptides from the cleavage batch are insufficient to clearly identify the identity of the protein from the database, further fragmentation in the mass spectrometer, such as, for example, by decay according to the source in MALDI-TOF, MS / MS (tandem mass spectrometry), MS n further sequence information for database research can be obtained. The results of the search are then confirmed by identifying the peptide fragments not used for the search in the mass spectrum.
  • proteins or protein families can be identified by de novo sequencing (e.g. according to Shevchenko, A., et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1 1, 101 5-1024, 1 997).
  • de novo sequencing e.g. according to Shevchenko, A., et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1 1, 101 5-1024, 1 997).
  • the following methods are available, for example:
  • a database on the protein-protein interaction or the ligand-target molecule interaction can be created on the basis of the identified proteins or protein complexes and their related binding partners and is also an object of the invention.
  • the separated proteins can be identified either in the immobilization or the separation step.
  • mitochondrial diseases More than 100 mitochondrial diseases are known. Some of these diseases occur in connection with aging processes or neurological processes. Examples include heart failure, dementia or schizophrenia. Some of these diseases are caused by mutations in the mitochondrial or nuclear DNA that encodes most of the mitochondrial structural and regulatory proteins. It is therefore important to identify all mitochondrial proteins and monitor their expression in both healthy and diseased tissues.
  • the mitochondria from bovine heart were analyzed according to Smith, A.L., Methods Enzymol. 10, 81-86, 1 967. Submitochondrial particles were made therefrom according to Cattell et al., Biochem J., 1 25, 1 69-1 77, 1 971. The proteins were extracted from the mitochondria and submitochondrial particles by the chloroform / methanol extraction method according to Fearnley I, and Walker, J.E., Biochem 26, 8247-8251, 1,987.
  • the chloroform / methanol extract contained about 15 proteins.
  • the various proteins were gel-filtered over Toyopearl HW-55 in a chloroform / methanol / water mixture (46: 46: 8 by volume) at 60 mM Extracted ammonium acetate, pH 7.
  • the separated protein sample was dissolved in a chloroform / methanol / aqueous formic acid solvent (4: 4: 1 by volume).
  • the samples were placed directly into a mass spectrometer over a continuous flow support made of the same solvent or using the nano-electrospray technique (Wilm, MS, and Mann, M., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 1 36, 1 67 -1 80, 1 994).
  • the nano-electrospray technique Wang, MS, and Mann, M., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 1 36, 1 67 -1 80, 1 994.
  • approximately 2 ⁇ of the protein solution was transferred into a gold-plated capillary drawn out to an approximately 1 ⁇ m nozzle.
  • a major advantage of this process is the lower material requirements compared to more conventional ionization methods.
  • the mass spectra were recorded and corresponding molecular weights were calculated.
  • the identity of the proteins can be determined using tandem mass spectrometry. Partial amino acid sequences were determined by tandem MS of several intact proteolipid ions by fragmentation of the molecular ions in the mass spectrometer by collision with argon gas. A span of the amino acid sequence was obtained from the mass differences between adjacent ions in the series of peaks in the mass spectrum. The sequence thus obtained was then used to screen the sequences of the SWISSPROT protein bank using the PEPTIDE SEARCH program (Mann, M. et al., Biol. Mass Spec, 22, 338-345, 1 993) and the Identity with the program MAC-PROMASS (Lee, TD, and Vemuri, S., Biomed. Environ.
  • Mass Spectrom. 1 9, 639-645, 1 990 was confirmed.
  • the proteins were individually trypsinized according to Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 93: 14440-14444, 1,996 split. An aliquot of the supernatant was removed and analyzed using MALDI peptide mapping (Shevchenko, loc. Cit.).
  • the PEPTIDE SEARCH program was used to compare the peptide mass mapping of the isolated protein. In cases where peptide mass mapping did not lead to unambiguous identification, the samples were examined using nanoelectrospray mass spectrometry.
  • the peptide mixture was micro-cleaned on a capillary made of 50 nl Porous R2 resin (PerSeptive Biosystem, Framingham, MA). The peptides were washed and then eluted in a step gradient with 0.5 ⁇ ⁇ 50% methanol in 5% formic acid into a nanoelectrospray capillary. This capillary was transferred to a mass spectrometer and the sample was sprayed for about 20 minutes. During this period, peptide ions emerging from the mass spectrum were selected, isolated and fragmented in the collision chamber of the mass spectrometer. From the tandem mass spectra, short sequence pieces were assembled to peptide sequence tags and compared with a protein sequence database or an EST database using PEPTIDE SEARCH.
  • Cytochrome oxidase with eight subunits can be identified from the enzyme pool in bovine mitochondria.
  • the partial sequence of subunit 2 corresponds to the sequence known from the literature (Tzagoloff, A., 1 982, Mitochondria, 1 1 1 -1 30, Plenum Press New York).
  • variable region of the light and heavy chains of the antibodies were genetically fused via a linker sequence which encodes (Gly 4 Ser) 3.5 (according to Clackson T. et al, Nature 352, 624-628, 1 991; Ge, L. et al., in CAK Borrebaeck (ed.) Antibody Engineering 2nd ed., Oxford University Press, New York, 1,994).
  • a human antibody bank can also be constructed from non-immunized donors (cf. Barbas III, loc. Cit.) Or consensus sequences (EP-A-951 1 30 21).
  • an scFv bank can also be constructed which is derived from a single sequence with randomized CDRH3 according to Barbas III et al., Gene, 1 37: 57-62, 1 993.
  • the Fab banks were constructed according to Huse et al., Science 246: 1 275-1 281, 1 989.
  • Example 2 An aliquot of each of the fractionated proteins of Example 1 was blotted onto a PVDF membrane and labeled for identification. The membrane was blocked with 3% fat-free milk powder and UV-inactivated M 1 3 phage. One on
  • a filamentous phage presented scFv or Fab library was blocked with the membrane containing the various fractionated proteins mixed for an hour. Then the membrane was washed extensively. Each of the labeled proteins was excised from the membrane and the bound phages were eluted with 0.1M TEA or HCl for 10 min and neutralized. Alternatively, the excised membrane pieces were soaked with PCR buffer and the eluate was used as a template for the PCR reaction using a flanking pair of primers that allowed amplification of the scFv or Fab genes. The specificity of the scFvs or Fabs presented on the surface of the bound phage was determined by means of ELISA or Western blotting. Alternatively, the amplified PCR fragments were subcloned into an expression vector and the crude extract was tested for binding by means of ELISA or Western blotting.
  • the samples from fractionated mitochondrial proteins were separated by 2D gel electrophoresis.
  • the gel was stained with Coomassie protein and the spots were identified as in Example 1 ben beschrie ⁇ by MALDI and nanospray.
  • the codon ATG As shown in Fearnley and Walker, the codon ATG, a universal isoleucine codon, encodes methionine in bovine heart mitochondria at both the initiation and elongation levels. This information can only be obtained by direct sequencing of the gene and protein.
  • the 2D electrophoresis gels were blotted onto a PVDF membrane and screened with a phage antibody bank as described in Example 2.
  • the protein spots marked by irreversible staining of the corresponding 2D gel were cut out and the bound phage particles were eluted as described above.
  • Peptide banks were constructed according to methods known per se (cf., for example, Devlin, JJ et al., Science, 249. 404-406, 1 990).
  • the peptides presented can be genetically engineered with either gene III (glll), the minor coat protein of filamentous phages, which is used to attach the phage to the f pilus of E. coli and to penetrate the Host membrane is responsible, or the gene VIII (gVIII), the main coat protein, are fused.
  • the selected peptides are more affinity variants when presented on glll than when presented on gVIII due to the capture effect .
  • the fractionated samples of the mitochondrial proteins from Example 1 were separated by means of 2D gel electrophoresis or column chromatography. The fractionated proteins were blotted onto a membrane as described. The membrane was blocked and the phage peptide library was added directly to the membrane. The peptides specific for individual proteins were isolated as described in Example 1.
  • a bovine heart cDNA library was obtained from Stratagene (Cat. # 937722) and presented using the SurfZAP vector (Stratagene).
  • Bovine heart tissue is homogenized according to standard methods known to a person skilled in the art.
  • the homogenate is separated using a 2D gel electrophoresis and a combinatorial antibody phage bank is brought into contact with the separated homogenate and protein-specific subbanks are isolated as in Example 2.
  • the separated protein samples on the gel are blotted and each protein spot is decorated using mass spectrometry as in Example 1 identifi ⁇ .
  • the bovine heart homogenate is immobilized on microtiter plates. The number
  • the cavities correspond to the subbanks created in stage A.
  • the antibody subbanks are added and incubated so that part of each bank binds to the homogenate in each cavity.
  • the wells are washed and the bound antibodies are identified by the peptide tags fused to the antibodies.
  • protein samples from any biological source can be immobilized on any solid surface and can be detected with antibody or peptide libraries.
  • antibody and peptide banks can also be immobilized on solid surfaces, and the protein samples are brought into contact with the surface and processed by physicochemical methods such as e.g. Chemiluminescence detected.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung eines Proteins und seines Bindungspartners, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Proteine oder Proteinaggregate aus einer biologischen Quelle isoliert und auftrennt; b) die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate auf einer Oberfläche immobilisiert; c) eine kombinatorische Bank mit den auf einer Oberfläche immobilisierten Proteinen oder Proteinaggregaten inkubiert; d) diejenigen Mitglieder der kombinatorischen Bank, die an die immobilisierten Proteine binden, von nicht-gebundenen Mitgliedern der Bank trennt; e) die an die Oberfläche gebundenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner aus der kombinatorischen Bank isoliert; f) die Proteine in den so isolierten Komplexen mit einer Kombination aus einem physikalisch-chemischen Verfahren identifiziert; und g) gegebenenfalls die isolierten Bindungspartner anreichert. Die vorliegende Erfindung erlaubt somit die gleichzeitige Identifizierung von Proteinen mit und ohne vorherige Reinigung, sowie die Auswahl von Mitgliedern kombinatorischer Banken, die mit diesen Proteinen wechselwirken. Dadurch läßt sich auf einfache Weise die Funktion der Proteine über ihre spezifischen Bindungspartner ermitteln.

Description

Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung von Proteinen und ihren Bindungspartnern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung von Proteinen und ihren spezifischen Bindungspartnern. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung aller Proteine einer biologischen Quelle und ihrer entsprechenden Bindungspartner und somit die gleichzeitige Aufklärung von Struktur und Funktion aller Proteine aus einer biologischen Quelle.
Fortschritte in dem Humangenomprojekt führten zu einer nahezu unübersehbaren Menge von Daten aus den Genomen verschiedenster Organismen. Das vollständige Genom des Menschen wird vermutlich im Jahr 2003 sequenziert sein. Gegenwärtig ist das Genom von elf Mikroorganismen entschlüsselt. Eine genomische Sequenz erlaubt jedoch keine Aussage dahingehend, ob gegebene Proteine tatsächlich exprimiert werden, und wie sie im biologischen Gewebe funktionieren. Da die Proteine als die tatsächlichen funktioneilen Gegenstücke der Gene den jeweiligen biologischen Zustand ihres Wirts bestimmen, spiegelt eine direkte Identifizierung der Proteine viel genauer den Zustand der biologischen Quellen des Wirts (i.e. des jeweiligen aktiven Genoms) wieder als die entsprechenden Gensequenzen.
Die Sequenzierung der mRNAs über cDNAs oder über Codesequenzen für die Expression (Expression Sequence Tags; ESTs) ergibt eine potentielle Korrelation zwischen den in einer biologischen Quelle produzierten mRNAs und ihren Proteinäquivalenten. Dieses Vorgehen wird gegenwärtig an häufigsten angewendet. Jedoch entspricht bekanntlich die Genexpression nicht völlig der mRNA-Produk- tion. So enthalten ESTs RNA-Spleißintermediate, und der endgültige mRNA- Gehalt hängt entscheidend von der Stabilität der mRNAs ab. Aufgrund von Unterschieden in der Translationshöhe, der Stabilität, des Spleißmusters, post- transkriptioneller und posttranslationeller Modifikationen kann das Proteinendprodukt meist nicht aus den entsprechenden mRNAs oder ESTs vorhergesagt werden. Beispielsweise wurde ein Korrelationsfaktor von 0,43 (i.e. keine Entsprechung im Verhältnis eins zu eins) zwischen der gebildeten mRNA und der tatsächlichen Menge an GST-/r-Protein, das in den verschiedenen Geweben exprimiert wird (Anderson, L, IBC's International Conference on proteomics, Boston, MA, 1 997) . Auf ähnliche Weise fand sich keine Korrelation zwischen der mRNA-Produktion und dem Vorkommen der Proteine unter 23 in der menschlichen Leber gebildeten Proteinen (Large Scale Biology)
Um die Funktion unbekannter Proteine zu identifizieren wurden verschiedene Methoden angewendet. Beispiele hierfür sind der Vergleich unbekannter Proteine mit sequenzhomologen Proteinen ähnlicher Funktion, Antisense-Technik, Knockout-Tiermodelle oder der Einsatz transgener Tiere. Jedoch läßt sich mit diesen Methoden die Funktion interessierender Proteine nicht direkt identifizieren (z.B. beim homologen Vergleich), oder das Verfahren ist aufwendig, zeitraubend und damit wenig geeignet für ein Massenscreening (z.B. bei Knock-out oder trans- genen Tieren). Proteinproben lassen sich mittels 2D-Gelelektrophorese auftrennen, und die Proteine können mittels Massenspektrometrie in Kombination mit EST- und Protein-Datenbankrecherchen identifiziert und bestätigt werden. Je mehr ESTs ermittelt werden, desto leichter wird es möglich, das Protein in voller Länge nur über Peptidfragmente zu identifizieren. Jedoch führt die Identifikation der Proteine und ihrer Modifikationen nicht zur Ermittlung ihrer Funktion.
Die Funktion einiger Proteine kann über ihre Wechselwirkung mit anderen Proteinen, deren Funktion bekannt ist, bestimmt werden. Methoden wie die Hefe-zwei-Hybrid-Technik (Phizicky, E.M. und Fields, S., Microbiological Rev., 59:94-1 23, 1 995) und die Phagendisplay-Technik (Hag, V. und Ge, L., PCT/- EP97/00931 , 1 996) für ein wechselseitiges Absuchen von Genbanken können angewendet werden, um derartige Wechselwirkungen zu ermitteln. Beispielsweise bietet das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren die Möglichkeit, Proteine und ihre Wechselwirkungen in einem eukaryotischen Wirt zu untersuchen; das Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, daß die Wechselwirkung nur im Hefezellkern stattfindet und nur auf nicht-sezernierte Proteine angewendet werden kann. Obwohl das Phagen-Display- Verfahren diese Probleme überwindet, ist nicht zu erwarten, daß die Proteine in ihrer nativen Form vorliegen, da möglicherweise posttrans- lationelle Modifikationen stattfinden.
Die am häufigsten verwendete funktionelle Analyse beruht auf immunologischen Methoden, z.B. histochemische Analyse, FACS oder Immunpräzipitation. Wegen ihrer hohen Spezifität und Affinität werden am häufigsten Antikörper eingesetzt. So können Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen durch blockierende Antikörper blockiert werden. Jedoch können unter Verwendung herkömmlicher Methoden Antikörper nur gegen fremde Antigene erzeugt werden. Beispielsweise ist es schwierig oder sogar unmöglich, menschliche Antikörper zu erzeugen, die in auf Antikörpern beruhenden Therapien gegen Antigene menschlichen Ursprungs nützlich sind. Antikörper sind jedoch in der Herstellung und Reinigung teuer und aufwendig.
Um die entsprechenden Bindungspartner für ein Antigen zu ermitteln, werden Proteinbanken, insbesondere Antikörperbanken (einkettiges Fv/scFV und Fab), und Peptidbanken funktionell auf der Oberfläche von filamentösen Bakterio- phagenteilchen in einem Phagen-Display-System exprimiert (vgl Smith, G.P., Science, 228: 1 31 5-131 7, 1 985) . Die scFvs, Fabs, Proteine oder Peptide werden an eine Komponente eines Oberflächenproteins des Phagen fusioniert, wodurch die Bindung des interessierenden scFvs, Fabs, Proteins oder Peptids stattfinden kann. Die Gene, die die präsentierten Proteine codieren, werden in die Phagenteilchen verpackt, und so binden die Proteinprodukte direkt an ihre genetische Information. Menschliche scFv-Phagenbanken wurden zur Isolierung therapeutisch wichtiger Antikörper vielfach verwendet (vgl. Vaughan, T. J. et al., Nature Biotechnol. 14:309-314, 1 996).
Es konnte auch gezeigt werden, daß Antikörper mit hoher Affinität und Spezifi- tät gegen Selbstantigene aus den menschlichen kombinatorischen Antikörperbank isoliert werden können (Griffiths A.D. et al.,EMBL J. , 1 2:725-734, 1 993) . Jedoch sind bei all diesen Technologien gereinigte Proteine in beträchtlicher Menge erforderlich, wodurch sie nur auf die in größter Menge vorkommenden Proteine oder Proteine, die rekombinant hergestellt werden können, angewendet werden können. Obwohl es möglich ist, Antikörper oder Peptide gegen Proteine auf der Zelloberfläche zu richten, muß die Identität dieser Proteine bekannt sein.
Die WO 94/26787 und die WO 97/22972 beschreiben die Isolierung von Antikörpern aus kombinatorischen Antikörperbanken gegen nicht gereinigte und zuvor nicht identifizierte Zelloberflächenantigene bzw. intrazelluläre krankheitsspezifische Antigene. Nach dem Verfahren gemäß der WO 94/26787 können jedoch nur Zelloberflächenantigene ermittelt werden; die unbekannten Antigene können nicht direkt identifiziert werden. Bei dem Verfahren gemäß der WO 97/2- 2972 müssen zuerst antigenspezifische Antikörper aus einem Selektionsprozeß verfügbar gemacht werden. Daher müssen in einer ersten Stufe antigenspezifische Antikörper selektioniert werden, bevor die unbekannten Antigene identifiziert werden können.
Es besteht somit ein Bedarf nach einem Verfahren, alle in einer ausgewählten biologischen Quelle produzierten Proteine direkt abtrennen und funktionell identifizieren zu können. Mit einem derartigen Verfahren ließen sich alle Proteine, die den Phänotyp der biologischen Quelle, z.B. Gewebe, Mikroorganismen, Zellkulturen etc. bestimmen, direkt identifizieren und funktionell charakterisieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, mit dem gleichzeitig Proteine und ihre spezifischen Bindungspartner aus einer kombinatorischen Bank isoliert werden können, ohne daß eine vorherige Trennung, Reinigung und Identifizierung der Proteine erforderlich sind. Mit dem Verfahren sollen alle Proteine aus einer biologischen Quelle funktionell erfaßt werden können. Es soll also der Proteomstatus einer biologischen Probe ermittelt werden können. Das Verfahren soll auf alle möglichen Bindungspartner eines Proteins anwendbar sein. Ferner soll das Verfahren zusätzlich die Identifizierung der funktionell charakterisierten Proteine erlauben. Das Verfahren soll einfach, schnell und kostengünstig durchzuführen sein und sich für ein Massens- creening und zur Automatisierung eignen. Ferner soll das erfindungsgemäße Verfahren eine rasche, eindeutige und einfache Diagnostik von Stoffwechselkrankheiten sowie die Identifizierung von Arzneimittelwirkungen erlauben. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren soll eine Datenbank aus Proteinen und ihrem jeweiligen spezifischem Bindungspartner erstellt werden können. Diese Datenbank soll die Ermittlung von Arzneimittelprototypen unterstützen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung eines Proteins und seines Bindungspartners gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Proteine oder Proteinaggregate aus einer biologischen Quelle isoliert und auftrennt, b) die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate auf einer Oberfläche immobilisiert, c) eine kombinatorische Bank mit den auf einer Oberfläche immobilisierten Proteinen oder Proteinaggregaten inkubiert, d) diejenigen Mitglieder der kombinatorischen Bank, die an die immobilisierten Proteine binden, von nicht-gebundenen Mitgliedern der Bank trennt, e) die an die Oberfläche gebundenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner aus der kombinatorischen Bank isoliert, f) die Proteine in den so isolierten Komplexen mit einer Kombination aus einem physikalisch-chemischen Verfahren identifiziert, und g) gegebenenfalls die isolierten Bindungspartner anreichert.
Bevorzugt wird das Verfahren derart durchgeführt, daß man bei Schritt a) die biologische Probe in einem geeigneten Puffer solubiiisiert und die Probe unter Verwendung eines Proteintrennverfahrens ausgewählt aus 2D-Gelelektro-pho- rese, Perfusionschromatographie, Flüssigchromatographie oder Kapillarelektrophorese auftrennt. Weiter bevorzugt werden die aufgetrennten Proteine auf den Kavitäten einer Mikrotiterplatte immobilisiert oder auf eine Membran geblottet oder mit mit spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen eingefangen.
Der Ausdruck Proteinaggregate bezeichnet einen Zusammenschluß mehrerer Proteine. Dieser Zusammenschluß kann das Ergebnis einer funktionellen Assoziation mehrerer Proteine sein, z.B. Enzyme des Krebs-Zyklus, die zu einer funktioneilen Einheit verbunden sind, an der die Umwandlung des Substrats in das Endprodukt über mehrere Zwischenstufen erfolgt. Der Zusammenschluß kann aber auch das Ergebnis des Trennverfahrens sein, und umfaßt z.B. in einem chromatographischen Peak eluierende Proteine, die durch eine gemeinsame Retentionszeit verbunden sind.
Bevorzugt verwendet man als kombinatorische Bank Random-Peptid-Banken, (scFv)Banken der Immunglobulinsuperfamilie, Protein-Display-Banken, kombinatorische chemische Banken, RNA- oder DNA-Banken. Bevorzugt wird Schritt g) so durchgeführt, daß man einen bakteriellen Wirt mit den isolierten Proteinen infiziert, um ausgewählte Phagenteilchen zu vermehren, und die ausgewählten Proteinbindungspartner sequenziert, oder die ausgewählten Bindungspartner durch einzigartige Sequenzanknüpfungen (tag) identifiziert.
Uberaschenderweise wurde gefunden, daß Proteine und ihre Bindungspartner gleichzeitig identifiziert werden können, wenn man ohne vorherige Reinigung und Identifzierung Proteine nach Auftrennung mit einer kombinatorichen Bank inkubiert und die so erhaltenen Komplexe aus Protein und Bindungpartner einem physikalisch-chemischen Identifizierungsverfahren unterwirft.
Da sich erfindungsgemäß die Proteinproben direkt von ihren biologischen Quellen ableiten, wird keine teure, zeitaufwendige oder risikobehaftete Proteinproduktion benötigt. Da der Selektionsschritt in einer Stufe erfolgt, werden keine Anreicherung der Bank oder eine anschließende Selektion benötigt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher ideal zur Produktion von proteinspezifischen Antikörpern oder Peptiden in großem Umfang. Ferner kann jede kombinatorische Bank eingesetzt werden.
Da die aufgetrennten Proteine/Proteinkomplexe direkt aus dem Gel oder in immobilisierter Form unter Verwendung von Massenspektrometrie identifiziert werden können, kann das Verfahren der Proteinidentifizierung und Erzeugung proteinspezifischer Subbanken als paralleles Verfahren durchgeführt werden. Dadurch eignete sich das erfindungsgemäße Verfahren für Proteinidentifizierungen in großem Umfang.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jeder beliebigen kombinatorischen Bank durchgeführt werden, z.B. Proteinbank, Peptidbank, cDNA-Bank, mRNA- Bank, Bank mit organischen Molekülen, scFv-Bank mit Immunglobulinsuperfamilie, Proteindisplay-Bank etc.. In den Banken können präsentiert sein: alle Arten von Proteinen, z.B. Strukturproteine, Enzyme, Rezeptoren, Liganden, alle Arten von Peptiden einschließlich Modifikationen, DNAs, RNAs, Kombinationen von DNAs und RNAs, Hybride von Peptiden und RNA oder DNA, alle Arten von organischen Molekülen, z.B. Steroide, Alkaloide, Naturstoffe, synthetische Stoffe etc. Die Präsentation kann auf verschiedene Arten erfolgen, z.B. als Phagen-Display-System (z.B. filamentöse Phagen wie M 1 3, fl,fd etc., lambda- Phagen-Display, virales Display etc.), Präsentation auf Bakterienoberflächen, Ribosomen etc.
Die kombinatorische Bank kann hergestellt werden durch: a) Konstruktion von Random-Peptid-Banken, in denen Banken präsentiert werden können, b) Konstruktion von scFv-Banken oder Banken von beliebigen Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie, in denen Mitglieder der Banken präsentiert werden können, c) Konstruktion von Proteinbanken, in denen Proteine präsentiert werden
können, d) Konstruktion von kombinatorischen chemischen Banken, in denen organi- sche Moleküle der Banken präsentiert werden können, e) Konstruktion von RNA- oder DNA-Banken in denen die ausgewählten Mitglieder der Banken isoliert und über geeignete Oligoprimer amplifiziert werden können. Derartige Verfahren sind einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Die erfindungsgemäß zu identifizierenden Proteine können aus jeder biologischen Quelle stammen, z.B. aus gesunden oder erkrankten Geweben, Zellkulturen, Organpräparaten, Körperflüssigkeiten, Biopsieproben aller Art, Organkulturen, Mikroorganismen, Pflanzenpräparate, etc.
Die vorliegende Erfindung erlaubt somit die gleichzeitige Identifizierung von Proteinen mit und ohne vorherige Reinigung, sowie die Auswahl von Mitgliedern kombinatorischer Banken, die mit diesen Proteinen wechselwirken. Dadurch läßt sich auf einfache Weise die Funktion der Proteine über ihre spezifischen Bindungspartner ermitteln.
Die Identifizierung von Proteinen einer Expressionsfamilie ergänzt oder ersetzt sogar das Verfahren zur Identifizierung von Genen: Die Identifizierung von Proteinen in ihrem nativen Zustand bestätigt die entsprechenden Gensequenzen oder identifiziert mögliche posttranskriptionelle und posttranslationelle Modifikationen. Die Identifizierung der meisten oder aller Proteine aus einer nicht sequen¬ zierten oder teilweise sequenzierten biologischen Probe beschleunigt Bemühun¬ gen zur Ermittlung einer Genzielsequenz oder vermeidet den aufwendigen Prozeß der Gensequenzierung. Die Information auf der Proteinebene spiegelt die biologi- sehe Identität eines Organismus besser wieder als die Information auf genomischer Ebene. So spiegelt die Identifizierung aller Proteine einer biologischen Probe die relevante Information über den biologischen Zustand der Probe und damit des untersuchten Organismus bzw. Teil des Organismus wieder. Ferner ist zu erwarten, daß die Variation im Vorkommen eines Proteins dynamisch ist, i.e. sie wird von endogenen und exogenen Faktoren beeinflußt. Es ist nicht möglich, diese Zusatzinformation aus der Sequenzierung des Genoms oder der mRNA abzuleiten (s.o.).
Ferner können erfindungsgemäß spezifisch miteinander wechselwirkende Mitglieder einer kombinatorischen Bank gegen die meisten oder gar alle Proteine einer gegebenen biologischen Probe gleichzeitig ermittelt werden. Dies ersetzt das aufwendige Verfahren der Genisolierung, Subklonierung, Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins. Ferner ist es mit den gegenwärtigen bekannten Methoden nicht nur aufwendig und schwierig, spezielle Mitglieder einer kombinatorischen Bank gegen ein Protein zu isolieren, sondern es ist auch unsicher, ob alle Proteine exprimiert werden können und ob die exprimierten Proteine tatsächlich in ihrer nativen Form vorliegen. Beispielsweise ist gut bekannt, daß das Glycosylierungsmuster von Proteinen eukaryotischen Ursprungs entscheidend von den zur Expression gewählten Wirten abhängt. Ferner ist es praktisch nicht möglich, spezifisch wechselwirkende Mitglieder einer Bank gegen die meisten oder alle Proteine aus komplizierten biologischen Proben gleichzeitig unter Verwendung bisher bekannter Methoden zu erhalten.
Diese Kombinationen aus Protein und spezifischem Mitglied einer kombinatori- sehen Bank kann verwendet werden, um den Proteomstatus der Probe und nicht nur von einigen wenigen Proteinen gleichzeitig zu überwachen. Dieser Fortschritt in der Proteomüberwachung soll die Ermittlung von Angriffsorten von Arzneimitteln und von pharmazeutischen Leitsubstanzen zur Weiterentwicklung zu Arzneimitteln beschleunigen, da die meisten Erkrankungen, die gegenwärtig therapiert werden, multifaktorieller Genese sind, d.h. mehr als ein Protein an ihrer Genese beteiligt ist.
Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Anwendung jeder kombinatorischen Bank, z.B. Protein-, Peptid- oder Antikörperbanken oder DNA- und RNA- Banken oder sogar mit einer Codesequenz versehene synthetische organische Molekülbanken (Brenner, S. und Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89,5381 -5383, 1 992). Die Erfindung besitzt somit beispielsweise die folgenden technischen Anwendungsmöglichkeiten: a) Isolierung von Proteinen, die für Proteine aus einer biologischen Probe spezifisch sind, und Erstellung einer Protein-Protein-Wechselwirkungsbank (z.B. Netzwerk von signalübertragenden Stoffwechselwegen, wenn Proteine der kombinatorischen Bank von der gleichen biologischen Quelle stammen wie die Probe) oder einer Krankheitserreger-Wirt-Datenbank (z.B. wenn Proteine der kombinatorischen Bank dem Krankheitserreger angehören und die Probe der Wirt ist), b) Isolierung und Identifizierung proteinspezifischer Peptide, mit dem Ziel der Ermittlung potentieller Peptid-agonisten oder -antagonisten oder peptido- mimetischer Moleküle zum Design von neuen Arzneimitteln, c) Isolierung und Identifizierung rekombinanter Antikörper mit den vorste- hend genannten Anwendungsspektren, d) Isolierung und Identifizierung proteinspezifischer DNA- oder RNA-Molekü- le, die für Anwendungen von Protein-Knock-out zur Funktionsermittlung bis zur Arzneimittel-entwicklung geeignet sind, und e) Isolierung und Identifizierung kleiner organischer Moleküle, die direkte Moleküle für die Entwicklung von Anzneimitteln sind.
Es ist klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur das Verständnis biologische Prozesse beschleunigt, sondern auch die Aufklärung von Krankheitsmechanismen und die gezielte Entwicklung neuer Arzneimittel beschleunigt.
Ferner erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine einfache und rasche Diagnose von Stoffwechselerkrankungen. Gegenwärtig wird Diagnostik nur an einem speziellen Protein oder Stoffwechselprodukt durchgeführt. Bezüglich Erbkrankheiten werden nur ganz spezielle Mutationen in einem Gen getestet, jedoch mit unsicherer Aussagekraft. Obwohl es möglich ist, eine Diagnostik mit mehreren Proteinen oder Metaboliten durchzuführen, sind derartige Verfahren teuer und zeitaufwendig und erlauben nur eine begrenzte Information über die Krankheit. Die Überwachung des Proteomstatus einer biologischen Probe erlaubt - wie vorstehend ausgeführt - die Feststellung des aktuellen Zustands in einem biologischen Gewebe. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nun der Proteomstatus eines Gewebes einfach, schnell und zuverlässig ermittelt werden. Dazu wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine proteinspezifi¬
sche Bank oder Subbank eines Gewebes, z.B. der Leber, der Lunge, des Magens etc. erzeugt und gegebenenfalls vielfach amplifiziert. Eine derartige Bank wird dann auf einer geeigneten Oberfläche, z.B. aus Glas, Kunststoff, einem Halbleiterchip einer optischen Faser oder einer CD in an sich bekannter Weise immobilisiert. Die Bindung der Proteine an ihre verwandten Subbanken, die auf der geeigneten Oberfläche immobilisiert sind, können unter Verwendung bereits bekannter Nachweisverfahren, nachgewiesen werden z. B. BIAcore-Chips. Umgekehrt kann auch die biologische Probe auf der Oberfläche eines derartigen Chips immobilisiert werden. Die Oberfläche selbst wird bevorzugt in mehrere Mi- krokompartimente unterteilt, wobei jede Unterteilung einem speziellen Protein zugeordnet wird, dessen kombinatorische Subbank zuvor erzeugt worden ist. Nach Abwaschen überschüssiger nicht gebundener Probenlösung werden die proteinspezifischen Antikörper- oder Proteinsubbanken jedem Kompartiment zugesetzt. Die gebundenen Antikörper oder Peptide können durch ihre fusionierten Peptid-Tags identifiziert werden. Aus den so erhaltenen Signalen (qualitativ/quantitativ) kann dann durch Vergleich mit dem Signalmuster einer normalen Probe auf eine entsprechende Erkrankung des Gewebes bzw. Organs geschlossen werden. Derartige Diagnosechips können zur Diagnose von Organ- und Gewebszuständen, Infektionen und Krankheiten aller Art gezielt angefertigt werden. Ferner kann ein solcher Chip auch zur Untersuchung von Stoffwechselzuständen in Pflanzen, Mikroorganismen etc. verwendet werden. So lassen sich mit einem solchen Chip gezielt und rasch Zustände wie ein frischer Herzinfarkt, ein Magengeschwür, eine Gewebsnekrose, Infektionen wie z.B. Hepatitis, Tropenkrankheiten, AIDS, Autoimmunerkrankungen aller Art etc. diagnostizieren.
Ein derartiger Diagnosechip kann in Form eines gebrauchsfertigen Kits angeboten
werden. Ein derartiges Kit umfaßt einen entsprechenden gewebs- bzw. organ- spezifischen Chip, auf den eine entsprechende Proteinbank immobilisiert ist, eine Ausrüstung zur Probenahme, z.B. Spritze, Skalpell etc. sowie ein Gefäß zur Durchführung der Inkubation zwischen Chip und Probe und Anleitungen zur Durchführung und Auswertung. Entsprechende gebrauchsfertige Kits können gezielt hergestellt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zuerst die Proteinprobe aus der jeweiligen biologischen Quelle solubiiisiert und aufgetrennt. Hierzu kann jedes auf dem Gebiet der Proteinabtrennung einem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist die 2D-Gelelektrophorese. Die so aufgetrennte Proteinprobe wird anschließend auf eine Oberfläche, bevorzugt eine Membran, geblottet. Es ist nicht notwendig, die Proteine in dieser Stufe zu identifizieren.
Als nächster Schritt wird eine kombinatorische Bank z.B. aus einem Peptid oder antikörperartigen Molekülen oder Proteinen, die auf der Oberfläche von filamen- tösen Phagenteilchen exprimiert sind, mit der Membran, auf die die aufgetrennte Proteinprobe geblottet ist, inkubiert. Die Inkubation kann nach einem Fachmann bekannten Bedingungen durchgeführt werden. Die kombinatorische Bank kann z.B. durch kombinatorische chemische Methoden wie randomisierte Oligo- kassetten, hergestellt werden und aus jeder biologischen Quelle (z.B. cDNA oder Antikörper aus immunisierten Tieren) isoliert werden. Die Inkubationsbedingungen werden dabei so gewählt, daß ein Teil der Proteine in der Bank an die einzelnen Proteine in der aufgetrennten Probe bindet. Die speziell auf den jeweiligen Fall anzuwendenden Bedingungen können von einem Fachmann durch einfache Routineversuche ermittelt werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Proteine, Peptide oder antikörperartige Moleküle, die in einem in vitro in einem Polysom-Display-System (Mattheakis, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91 , 9022-9026, 1 994) präsentiert sind, oder DNA- oder RNA-Molekülbanken, die mittels SELEX oder ähnlichen Systemen (Tuerk, C, und Gold, L. Science, 249: 505-51 0, 1 990) erzeugt wurden, oder kombinatorische Banken organischer Moleküle mit den getrennten immobilisierten Molekülen inkubiert. Die Inkubation wird so ausgeführt, daß ein Teil der Mitglieder der Bank an die einzelnen getrennten Proteine in der Probe bindet.
Anschließend wird die Membran gründlich gewaschen, um zu gewährleisten, daß nur die Mitglieder der Bank, die für die getrennten Proteine spezifisch sind, haften bleiben. Die Waschbedingungen richten sich nach den jeweils gebundenen Proteinen und der verwendeten Bank. Die Flecken, die zu identifizierenden Proteinen entsprechen, werden ausgeschnitten und die an die Proteine gebundenen filamentösen Phagenteilchen werden eluiert. Die ausgewählten Phagenteilchen werden entweder aufbewahrt oder zur Infektion relevanter Wirtszellen verwendet, um die ausgewählten Mitglieder der Bank zu vermehren. Alternativ kann die genetische Information, die den gebundenen Mitgliedern der Bank entspricht, direkt mittels PCR gewonnen oder über ihre einzigartige Codesequenz identifiziert werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird die geblottete Membran rever¬
sibel mit kolorimetrischen oder lumineszierenden Farbstoffen angefärbt und die gefärbten Proteinflecken werden automatisch analysiert. Die Farbe wird entfernt und die Membran wird verwendet, um die präsentierte Bank durchzumustern. Die nun nicht mehr sichtbaren Proteinflecken werden automatisch registriert und ausgeschnitten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die auf die Membran geblotteten Proteine nach einem beliebigen, einem Fachmann bekannten physikalisch-chemischen Verfahren zur Proteinidentifizierung identifiziert.
Bevorzugt wird erfindungsgemäß die Identität der interessierenden Proteine massenspektrometrisch (wie z.B. in Siuzdak, G., Mass Spectrometry for Biotech- nology, Academic Press, Inc., 1 996 beschrieben) mit anschließender Proteinoder EST-Datenbankrecherche (z.B. nach Mann, M., in Microcharacterization of Proteins, Hrsg. R. Kellner, F. Lottspeich, H.E. Meyer, VCH Weinheim, 1 994) identifiziert. Die Proteine werden anschließend im Gel enzymatisch oder chemisch gespalten. Der Spaltansatz kann dann als solcher vollständig massenspektrometrisch analysiert werden oder vorher mittels Mikrosäulen-Flüssigchromato- graphie (LC) analysiert werden. Die massenspektrometrische Analyse kann auf verschiedene, an sich bekannte Arten durchgeführt werden, z.B. mit einer lonisierungsquelle wie einem Elektrospray (Chapman, J.R., et al., Methods in Molecular Biology, 61 , JR Chapman Hrsg., Humana Press Inv. Totowa NJ, USA, 1 996) einschließlich Nanoelektrospray (Wilm. M. und Mann, M., Anal. Chem. 68, 1 -8, 1 996) und matrixunterstützter Laserdesorption und Ionisierung (MAL-
DI) (Siuzdak, G. Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press Inc. 1 996) oder eine Kombination aus Massenanalysatoren wie Triple, Quadrupol, Flugzeit, Magnetsektor, Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Resonanz und Quadropol-Ioneneinfang.
Wenn die Peptide aus dem Spaltansatz nicht ausreichen, die Identität des Proteins eindeutig aus der Datenbank zu identifizieren, kann durch eine weitere Fragmentierung im Massenspektrometer wie z.B. durch Zerfall nach der Quelle in MALDI-TOF, MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie), MSn eine weitere Sequenzinformation für die Datenbankrecherche erhalten werden. Die Ergebnisse der Recherche werden dann durch Identifizieren der für die Recherche nicht verwendeten Peptidfragmente im Massenspektrum bestätigt.
Alternativ können die Proteine oder Proteinfamilien durch de novo-Sequenzierung (z.B. nach Shevchenko, A., et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1 1 , 101 5-1024, 1 997) identifiziert werden. Dazu stehen beispielsweise die folgenden Methoden zur Verfügung:
1 ) Verwendung der Mikrosäulen-LC zur Auftrennung der Peptide im Spaltansatz (Dongre, A., et al., TIBTECH, 1 5, 418-425, 1 997), gefolgt von einer automatischen Datengewinnung basierend auf vorgewählten Bedingungen und einem Computer-Algorithmus, um die Datenbank abzusuchen, wobei eine Korrelationsanalyse verwendet wird, um die Sequenzen der Datenbank dem Ergebnis der Tandem-Massenspektroskopieanalyse anzupassen. Das verwendete Massenspektrometer besitzt eine Elektrospray-
lonisationsquelle.
2) Analyse des kompletten Spaltansatzes (Shevchenko, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 1 4440-14445, 1 996) mittels MALDI mit verzögerter Extraktion und Automatisierung unter Verwendung eines Realzeit-Fuzzy- logic-Algorithmus, um die Massenspektren zu erhalten, und eines Software-Bindeglieds zu einer automatischen Datenbankrecherche. Proteine, die hier nicht identifiziert werden, werden dann einer Nanoelektrospray-Tan- dem-Massenspektrometrie mit Stammionenscanning (Wilm M. et al., Anal. Chem., 68, 527-533, 1 996) unterworfen. Sequenzmarker (Mann, M., TIBS, 21 , 494-495, 1 996) werden dann zum Absuchen der Datenbank verwendet.
Eine Datenbank über die Protein-Protein-Wechselwirkung oder die Liganden- Zielmolekül-Wechselwirkung kann aufgrund der identifizierten Proteine oder Proteinkomplexe und ihrer verwandten Bindungspartner erstellt werden und ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Figur 1 zeigt in einem Fließschema des erfindungsgemäßen Verfahrens im Überblick. Die Identifizierung der getrennten Proteine kann entweder in der Immobilisierungs- oder der Trennstufe erfolgen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher ohne sie zu beschränken. Beispiel 1
A. Identifizierung der Proteine aus den Mitochondrien
Mehr als 100 mitochondriale Erkrankungen sind bekannt. Einige dieser Erkrankungen treten im Zusammenhang mit Alterungsprozessen oder neurologischen Prozessen auf. Beispiele hierfür sind Herzversagen, Demenz oder Schizophrenie. Einige dieser Erkrankungen werden durch Mutationen der mitochondrialen oder nuklearen DNA, die die meisten der Struktur- und Regulatorproteine der Mitochondrien codiert, verursacht. Es ist somit wichtig, alle mitochondrialen Proteine zu identifizieren und ihre Expression sowohl in gesunden als auch erkrankten Geweben zu überwachen.
Im vorliegenden Beispiel wurden Mitochondrien aus gesunden Rinderherzen untersucht.
Die Mitochondrien aus Rinderherz wurden gemäß Smith, A.L., Methods Enzy- mol. 10, 81 -86, 1 967, präpariert. Submitochondriale Teilchen wurden daraus gemäß Cattell et al., Biochem J., 1 25, 1 69-1 77, 1 971 hergestellt. Die Proteine wurden aus den Mitochondrien und submitochondrialen Teilchen nach dem Chloroform/Methanol-Extranktionsverfahren gemäß Fearnley I., und Walker, J.E., Biochem 26, 8247-8251 , 1 987 extrahiert.
Der Chloroform/Methanolextrakt enthielt etwa 1 5 Proteine. Die verschiedenen Proteine wurden durch Gelfiltration über Toyopearl HW-55 in einem Chloroform/- Methanol/Wassergemisch (46:46:8, bezogen auf das Volumen) mit 60 mM Ammoniumacetat, pH 7 extrahiert.
Die aufgetrennte Proteinprobe wurde in einem Lösungsmittel aus Chloroform/- Methanol/wäßrige Ameisensäure (4:4: 1 , bezogen auf das Volumen) aufgelöst. Die Proben wurden direkt in ein Massenspektrometer über einen kontinuierlichen Fließträger aus dem gleichen Lösungsmittel oder unter Verwendung der Nano- elektrospray-Technik (Wilm, M.S., und Mann, M., Int. J. Mass Spektrom. Ion Processes, 1 36, 1 67-1 80, 1 994) injiziert. Bei der zuletzt genannten Technik wurden etwa 2 μ\ der Proteinlösung in eine goldplattierte, zu einer etwa 1μm Düse ausgezogene Kapillare überführt. Ein Hauptvorteil dieses Verfahrens ist der geringere Materialbedarf, verglichen mit herkömmlicheren lonisierungsmethoden. Die Massenspektren wurden aufgezeichnet, und entsprechende Molekulargewichte wurden berechnet.
Die Identität der Proteine kann mittels Tandem-Massenspektrometrie bestimmt werden. Aminosäureteilsequenzen wurden mit Tandem-MS mehrerer intakter Proteolipidionen durch Fragmentierung der Molekülionen im Massenspektrometer durch Kollision mit Argongas bestimmt. Aus den Massenunterschieden zwischen benachbarten Ionen in der Reihe der Peaks in dem Massenspektrum wurde eine Spanne der Aminosäuresequenz erhalten. Die so erhaltene Sequenz wurde dann verwendet, um die Sequenzen der SWISSPROT-Proteinbank durchzumustern, wobei das Programm PEPTIDE SEARCH (Mann, M. et al., Biol. Mass Spec, 22, 338-345, 1 993) verwendet wurde, und die Identität mit dem Programm MAC- PROMASS (Lee, T.D., und Vemuri, S., Biomed. Environ. Mass Spectrom., 1 9, 639-645, 1 990) bestätigt wurde. Alternativ wurden die Proteine einzeln mit Trypsin gemäß Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 14440-14444, 1 996 gespalten. Ein Aliquot des Überstands wurde entnommen und mittels MALDI-Peptidmapping analysiert (Shevchenko, a.a.O.) . Das Programm PEPTIDE SEARCH wurde verwendet, um die Peptidmassenkartierung des isolierten Proteins zu vergleichen. In Fällen, in denen die Peptidmassenkartierung zu keiner eindeutigen Identifizierung führte, wurden die Proben mittels Nanoelektrospray-Massenspektrometrie untersucht. Das Peptidgemisch wurde auf einer Kapillare aus 50 nl Porös R2-Harz (PerSepti- ve Biosystem, Framingham, MA) mikrogereinigt. Die Peptide wurden gewaschen und dann in einem Stufengradienten mit 0,5 μ\ 50% Methanol in 5% Ameisensäure in eine Nanoelektrospraykapillare eluiert. Diese Kapillare wurde in ein Massenspektrometer überführt und die Probe wurde etwa 20 min versprüht. In dieser Zeitspanne wurden aus dem Massenspektrum hervorgehende Peptidionen ausgewählt, isoliert und in der Kollisionskammer des Massenspektrometers fragmentiert. Aus den Tandem-Massenspektren wurden kurze Sequenzstücke zu Peptidsequenztags aneinandergefügt und mit einer Proteinsequenzdatenbank oder einer EST-Datenbank unter Verwendung von PEPTIDE SEARCH verglichen.
Aus dem Enzympool in Rindermitochondrien kann Cytochromoxidase mit acht Untereinheiten (36, 21 , 1 9, 14, 1 2,5, 1 1 , 10 und 6 kDa) identifiziert werden. Die Teilsequenz der Untereinheit 2 entspricht der aus der Literatur (Tzagoloff, A., 1 982, Mitochondria, 1 1 1 -1 30, Plenum Press New York) bekannten Sequenz. B. Konstruktion der scFv- oder Fab-Bank
Die Sequenzen der variablen Region der leichten und schweren Ketten der Antikörper wurden genetisch über eine Linkersequenz, die (Gly4Ser)3.5 codiert, fusioniert (nach Clackson T. et al, Nature 352, 624-628, 1 991 ; Ge, L. et al., in C.A. K. Borrebaeck (Hrsg.) Antibody Engineering 2. Aufl., Oxford University Press, New York, 1 994). Alternativ kann auch eine menschliche Antikörperbank aus nicht immunisierten Spendern (vgl. Barbas III, a.a.O.) oder Consensusse- quenzen (EP-A-951 1 30 21 ) konstruiert werden. Ferner kann auch eine scFv- Bank, die sich von einer einzelnen Sequenz mit randomisiertem CDRH3 gemäß Barbas III et al., Gene, 1 37: 57-62, 1 993 ableitet, konstruiert werden. CDRH3 kann unter Verwendung von NNK (N = A,C,G,T in gleichen molaren Verhältnissen, K = G und C) oder mit Codon-bezogener Mutagenese (vgl. US-A-5 264 563; Virnekäs, B., et al., Nuc. Acids Res., 22,5600-5607, 1 994) randomisiert werden.
Die Fab-Banken wurden gemäß Huse et al., Science 246: 1 275-1 281 , 1 989 konstruiert.
C. Selektion von Antikörpern gegen die getrennten Proteine
Ein Aliquot jedes der fraktionierten Proteine von Beispiel 1 wurde auf eine PVDF- Membran geblottet und zur Identifizierung markiert. Die Membran wurde mit 3% fettfreiem Milchpulver und UV-inaktivierten M 1 3-Phagen blockiert. Eine auf
einem filamentösen Phagen präsentierte scFv- oder Fab-Bank wurde mit der blockierten, die verschiedenen fraktionierten Proteine enthaltenden Membran eine Stunde vermischt. Dann wurde die Membran ausgiebig gewaschen. Jedes der markierten Proteine wurde aus der Membran ausgeschnitten, und die gebundenen Phagen wurden mit 0, 1 M TEA oder HCI 10 min eluiert und neutralisiert. Alternativ wurden die ausgeschnittenen Membranstücke mit PCR-Puffer getränkt, und das Eluat wurde als Matrize für die PCR-Reaktion unter Verwendung eines flankierenden Primerpaares, das die Amplifikation der scFv- oder Fab-Gene erlaubte, verwendet. Die Spezifität der auf der Oberfläche des gebundenen Phagen präsentierten scFvs oder Fabs wurde mittels ELISA oder Western Blot- ting bestimmt. Alternativ wurden die amplifizierten PCR-Fragmente in einen Expressionsvektor subcloniert und der Rohextrakt auf Bindung mittels ELISA oder Western Blotting getestet.
Beispiel 2
A. Identifizierung der mitochondrialen Proteine aus dem 2D-Gel mittels Massenspektrometrie
Die Proben aus fraktionierten mitochondrialen Proteinen wurden durch 2D- Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie angefärbt, und die Proteinflecken wurden mittels MALDI und Nanospray wie in Beispiel 1 beschrie¬ ben identifiziert.
Einer der Proteinflecken wurde als Rindermitochondriengenprodukt ND2, eine Komponente der NADH-Dehydrogenase, identifiziert. Die N-terminale Sequenz
stimmt mit der entsprechenden Sequenz aus der Literatur überein (Feamley, und Walker, a.a.O.).
Wie in Fearnley und Walker gezeigt, codiert das Codon ATG, ein universelles Isoleucincodon, in Rinderherzmitochondrien sowohl bei der Inititations- als auch bei der Elongationsstufe Methionin. Diese Information kann nur über die direkte Sequenzierung des Gens und Proteins erhalten werden.
B. Selektion von Antikörpern gegen die mit dem 2D-Gel getrennten Proteine
Die 2D-Elektrophoresegele wurden auf eine PVDF-Membran geblottet und mit einer Phagen-Antikörperbank wie in Beispiel 2 beschrieben abgesucht. Die durch irreversible Anfärbung des entsprechenden 2D-Gels markierten Proteinflecken wurden ausgeschnitten und die gebundenen Phagenteilchen wurden wie vorstehend beschrieben eluiert.
Beispiel 3
A. Konstruktion von Peptidbanken
Peptidbanken wurden nach an sich bekannten Verfahren konstruiert (vgl. z.B. Devlin, J.J. et al., Science, 249. 404-406, 1 990). Im Gegensatz zur scFv- oder Fab-Phagenbank können die präsentierten Peptide genetisch entweder mit dem Gen III (glll), dem Minorhüllprotein von filamentösen Phagen, das für das Andok- ken des Phagen an den f-Pilus von E. coli und das Durchdringen der Wirtsmembran verantwortlich ist, oder dem Gen VIII (gVIII), dem Haupthüllprotein, fusioniert werden. Da pro Phagenteilchen nur 3-5 Kopien von glllp im Gegensatz zu 2-3000 Kopien von gVlllp vorhanden sind, können mehr Kopien des gleichen Peptids über eine gVIII-Fusion als über eine glll-Fusion präsentiert werden, sind die ausgewählten Peptide als Folge des Einfangeffekts bei Präsentation auf glll eher hochaffine Varianten als bei Präsentation auf gVIII.
B. Selektion der Peptide gegen die getrennten Proteine
Die fraktionierten Proben der mitochondrialen Proteine aus Beispiel 1 wurden mittels 2D-Gelelektrophorese oder Säulenchromatographie getrennt. Die fraktionierten Proteine wurden wie beschrieben auf eine Membran geblottet. Die Membran wurde blockiert und die Phagen-Peptid-Bank wurde direkt zu der Membran gegeben. Die für individuelle Proteine spezifischen Peptide wurden wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Beispiel 4
A. Konstruktion einer Rinderherz-cDNA-Bank
Eine Rinderherz-cDNA-Bank wurde von Stratagene (Kat. # 937722) bezogen und unter Verwendung des SurfZAP-Vektors (Stratagene) präsentiert.
B. Selektion von cDNA gegen die getrennten Proteine
Die fraktionierten Proben der mitochondrialen Proteine aus Beispiel 1 wurden
mittels 2D-Gelelektrophorese oder Säulenchromatographie getrennt. Die fraktionierten Proteine wurden wie beschrieben auf eine Membran geblottet. Die Membran wurde blockiert und die Phagen-cDNA-Bank wurde direkt zu der Membran gegeben. Die für individuelle Proteine spezifische cDNA wurden wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Beispiel 5
A. Erzeugung kombinatorischer Rinderherzprotein-spezifischer Antikörperbanken
Rinderherzgewebe wird nach einem Fachmann bekannten Standardmethoden homogenisiert. Das Homogenat wird unter Verwendung einer 2D-Gelelektropho- rese getrennt und eine kombinatorische Antikörper-Phagenbank wird mit dem getrennten Homogenat in Kontakt gebracht und proteinspezifische Subbanken werden wie in Beispiel 2 isoliert.
B. Identifizierung der Rinderherzproteine
Die auf dem Gel getrennten Proteinproben werden geblottet und jeder Proteinfleck wird unter Verwendung von Massenspektrometrie wie in Beispiel 1 identifi¬ ziert.
C. Expressionsprofil der Rinderproteine unter Verwendung der immobilisierten
Proteinproben
Das Rinderherzhomogenat wird auf Mikrotiterplatten immobilisiert. Die Anzahl
der Kavitäten entspricht dabei der in Stufe A erzeugten Subbanken. Nach Blockierung der Kavitäten mit geeigneten Puffern werden die Antikörpersubbanken zugesetzt und so inkubiert, daß ein Teil jeder Bank an das Homogenat in jeder Kavität bindet. Die Kavitäten werden gewaschen und die gebundenen Antikörper werden durch die an die Antikörper fusionierten Peptidtags identifiziert.
Es ist offensichtlich, daß mit geeigneten Modifikationen Proteinproben jeder biologischen Quelle auf jeder festen Oberfläche immobilisiert werden können und mit Antikörper- oder Peptidbanken nachgewiesen werden können. Umgekehrt können auch Antikörper- und Peptidbanken auf festen Oberflächen immobilisiert werden, und die Proteinproben werden mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und durch physikalisch-chemische Verfahren wie z.B. Chemilumineszenz nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung eines Proteinsteins eines und seines Bindungspartners, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Proteine oder Proteinaggregate aus einer biologischen Quelle isoliert und auftrennt, b) die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate auf einer Oberfläche immobilisiert, c) eine kombinatorische Bank mit den auf einer Oberfläche immobilisierten Proteinen oder Proteinaggregaten inkubiert, d) diejenigen Mitglieder der kombinatorischen Bank, die an dieimmobi- lisierten Proteine binden, von nicht-gebundenen Mitgliedern der Bank trennt, e) die an die Oberfläche gebundenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner aus der kombinatorischen Bank isoliert, f) die Proteine in den so isolierten Komplexen mit einer Kombination aus einem physikalisch-chemischen Verfahren identifiziert, und g) gegebenenfalls die isolierten Bindungspartner anreichert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Quelle ein Organpräparat, eine Biopsieprobe, eine Körperflüssigkeit eines Lebewesens, eine Zellkultur, ein Mikroorganismus oder ein Pflanzenpräpa¬ rat ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Schritt a) die biologische Probe in einem geeigneten Puffer solubiiisiert und die Probe unter Verwendung eines Proteintrennverfahrens ausgewählt aus 2D-Gelelektrophorese, Perfusionschromatographie, Flüssigchromatographie oder Kapillarelektrophorese auftrennt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) die aufgetrennten Proteine auf den Kavitäten einer Mikrotiterplatte immobilisiert oder auf eine Membran blottet oder mit mit spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen einfängt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als kombinatorische Bank Random-Peptid-Banken, Banken der Immunglobulin-superfamiiie, Protein-Display-Banken, kombinatorische chemische Banken, RNA- oder DNA-Banken verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Schritt d) die gebundenen Mitglieder der Bank direkt eluiert oder die in die Phagenpartikel, die die gebundenen Proteine präsentieren, gepackte DNA mit der PCR amplifiziert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt g) einen bakteriellen Wirt mit den isolierten Phagen infiziert, um ausgewählte Phagenteilchen zu vermehren, und die ausgewählten Proteinbindungspartner sequenziert, oder die ausgewählten Bindungspartner durch einzigartige Sequenzanknüpfungen (Tag) identifiziert.
8. Verfahren nach einem der Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate mittels Massen- spektrometrie oder durch direktes Sequenzieren identifiziert.
9. Datenbank, umfassend Proteine und ihre spezifischen Bindungspartner und erhalten nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
1 0. Datenbank nach Anspruch 9 zur Verwendung zur gezielten Diagnose von Stoff Wechselerkrankungen.
1 1 . Verwendung einer Datenbank nach Anspruch 9 zur Entwicklung von Arzneimitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 die Bindung einer Arzneimittelmodellverbindung an die Proteine eines Krankheitserregers ermittelt und die so erhaltenen Bindungsdaten qualitativ auswertet.
1 2. Diagnosechip, dadurch gekennzeichnet, daß er eine nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhaltene proteinspezifische Bank oder Subbank eines menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Gewebes immobilisiert an eine Oberfläche enthält.
1 3. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Diagnosechip nach Anspruch 1 2 zusammen mit einer Probenahmevorrichtung, einem Reaktionsgefäß, Kalibrationskurven und Gebrauchsanweisung enthält.
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