DE19802576A1 - Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung von Proteinen und ihren Bindungspartnern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung von Proteinen und ihren spezifischen Bin­ dungspartnern. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung aller Pro­ teine einer biologischen Quelle und ihrer entsprechenden Bindungspartner und somit die gleichzeitige Aufklärung von Struktur und Funktion aller Proteine aus einer biologi­ schen Quelle.

Fortschritte in dem Humangenomprojekt führten zu einer na­ hezu unübersehbaren Menge von Daten aus den Genomen ver­ schiedenster Organismen. Das vollständige Genom des Men­ schen wird vermutlich im Jahr 2003 sequenziert sein. Ge­ genwärtig ist das Genom von elf Mikroorganismen entschlüs­ selt. Eine genomische Sequenz erlaubt jedoch keine Aussage dahingehend, ob gegebene Proteine tatsächlich exprimiert werden, und wie sie im biologischen Gewebe funktionieren. Da die Proteine als die tatsächlichen funktionellen Gegen­ stücke der Gene den jeweiligen biologischen Zustand ihres Wirts bestimmen, spiegelt eine direkte Identifizierung der Proteine viel genauer den Zustand der biologischen Quellen des Wirts (i.e. des jeweiligen aktiven Genoms) wieder als die entsprechenden Gensequenzen.

Die Sequenzierung der mRNAs über cDNAs oder über Codese­ quenzen für die Expression (Expression Sequence Tags; ESTs) ergibt eine potentielle Korrelation zwischen den in einer biologischen Quelle produzierten mRNAs und ihren Proteinäquivalenten. Dieses Vorgehen wird gegenwärtig an häufigsten angewendet. Jedoch entspricht bekanntlich die Genexpression nicht völlig der mRNA-Produktion. So enthal­ ten ESTs RNA-Spleißintermediate, und der endgültige mRNA- Gehalt hängt entscheidend von der Stabilität der mRNAs ab. Aufgrund von Unterschieden in der Translationshöhe, der Stabilität, des Spleißmusters, posttranskriptioneller und posttranslationeller Modifikationen kann das Proteinend­ produkt meist nicht aus den entsprechenden mRNAs oder ESTs vorhergesagt werden. Beispielsweise wurde ein Korrelati­ onsfaktor von 0,43 (i.e. keine Entsprechung im Verhältnis eins zu eins) zwischen der gebildeten mRNA und der tat­ sächlichen Menge an GST-π-Protein, das in den verschiede­ nen Geweben exprimiert wird (Anderson, L., IBC's Interna­ tional Conference on proteomics, Boston, MA, 1997). Auf ähnliche Weise fand sich keine Korrelation zwischen der mRNA-Produktion und dem Vorkommen der Proteine unter 23 in der menschlichen Leber gebildeten Proteinen (Large Scale Biology).

Um die Funktion unbekannter Proteine zu identifizieren wurden verschiedene Methoden angewendet. Beispiele hierfür sind der Vergleich unbekannter Proteine mit sequenzhomolo­ gen Proteinen ähnlicher Funktion, Antisense-Technik, Knock-out-Tiermodelle oder der Einsatz transgener Tiere. Jedoch läßt sich mit diesen Methoden die Funktion interes­ sierender Proteine nicht direkt identifizieren (z. B. beim homologen Vergleich), oder das Verfahren ist aufwendig, zeitraubend und damit wenig geeignet für ein Massenscree­ ning (z. B. bei Knock-out oder transgenen Tieren).

Proteinproben lassen sich mittels 2D-Gelelektrophorese auftrennen, und die Proteine können mittels Massenspektro­ metrie in Kombination mit EST- und Protein-Datenbankre­ cherchen identifiziert und bestätigt werden. Je mehr ESTs ermittelt werden, desto leichter wird es möglich, das Pro­ tein in voller Länge nur über Peptidfragmente zu identifi­ zieren. Jedoch führt die Identifikation der Proteine und ihrer Modifikationen nicht zur Ermittlung ihrer Funktion.

Die Funktion einiger Proteine kann über ihre Wechselwir­ kung mit anderen Proteinen, deren Funktion bekannt ist, bestimmt werden. Methoden wie die Hefe-zwei-Hybrid-Technik (Phizicky, E.M. und Fields, S., Microbiological Rev., 59: 94-123, 1995) und die Phagendisplay-Technik (Ilag, V. und Ge, L., PCT/EP97/00931, 1996) für ein wechselseitiges Absuchen von Genbanken können angewendet werden, um derar­ tige Wechselwirkungen zu ermitteln. Beispielsweise bietet das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren die Möglichkeit, Proteine und ihre Wechselwirkungen in einem eukaryotischen Wirt zu untersuchen; das Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, daß die Wechselwirkung nur im Hefezellkern stattfindet und nur auf nicht-sezernierte Proteine angewendet werden kann. Obwohl das Phagen-Display-Verfahren diese Probleme über­ windet, ist nicht zu erwarten, daß die Proteine in ihrer nativen Form vorliegen, da möglicherweise posttranslatio­ nelle Modifikationen stattfinden.

Die am häufigsten verwendete funktionelle Analyse beruht auf immunologischen Methoden, z. B. histochemische Analyse, FACS oder Immunpräzipitation. Wegen ihrer hohen Spezifität und Affinität werden am häufigsten Antikörper eingesetzt. So können Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen durch bloc­ kierende Antikörper blockiert werden. Jedoch können unter Verwendung herkömmlicher Methoden Antikörper nur gegen fremde Antigene erzeugt werden. Beispielsweise ist es schwierig oder sogar unmöglich, menschliche Antikörper zu erzeugen, die in auf Antikörpern beruhenden Therapien ge­ gen Antigene menschlichen Ursprungs nützlich sind. Anti­ körper sind jedoch in der Herstellung und Reinigung teuer und aufwendig.

Um die entsprechenden Bindungspartner für ein Antigen zu ermitteln, werden Proteinbanken, insbesondere Antikörper­ banken (einkettiges Fv/scFV und Fab), und Peptidbanken funktionell auf der Oberfläche von filamentösen Bakterio­ phagenteilchen in einem Phagen-Display-System exprimiert (vgl. Smith, G.P., Science, 228: 1315-1317, 1985). Die scFvs, Fabs, Proteine oder Peptide werden an eine Kompon­ ente eines Oberflächenproteins des Phagen fusioniert, wo­ durch die Bindung des interessierenden scFvs, Fabs, Pro­ teins oder Peptids stattfinden kann. Die Gene, die die präsentierten Proteine codieren, werden in die Phagenteil­ chen verpackt, und so binden die Proteinprodukte direkt an ihre genetische Information. Menschliche scFv-Phagenbanken wurden zur Isolierung therapeutisch wichtiger Antikörper vielfach verwendet (vgl. Vaughan, T.J. et al., Nature Bio­ technol. 14: 309-314, 1996).

Es konnte auch gezeigt werden, daß Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität gegen Selbstantigene aus den menschlichen kombinatorischen Antikörperbank isoliert wer­ den können (Griffiths A.D. et al., EMBL J., 12: 725-734, 1993). Jedoch sind bei all diesen Technologien gereinigte Proteine in beträchtlicher Menge erforderlich, wodurch sie nur auf die in größter Menge vorkommenden Proteine oder Proteine, die rekombinant hergestellt werden können, ange­ wendet werden können. Obwohl es möglich ist, Antikörper oder Peptide gegen Proteine auf der Zelloberfläche zu richten, muß die Identität dieser Proteine bekannt sein.

Die WO 94/26787 und die WO 97/22972 beschreiben die Iso­ lierung von Antikörpern aus kombinatorischen Antikörper­ banken gegen nicht gereinigte und zuvor nicht identifi­ zierte Zelloberflächenantigene bzw. intrazelluläre krank­ heitsspezifische Antigene. Nach dem Verfahren gemäß der WO 94/26787 können jedoch nur Zelloberflächenantigene ermit­ telt werden; die unbekannten Antigene können nicht direkt identifiziert werden. Bei dem Verfahren gemäß der WO 97/22972 müssen zuerst antigenspezifische Antikörper aus einem Selektionsprozeß verfügbar gemacht werden. Daher müssen in einer ersten Stufe antigenspezifische Antikörper selektioniert werden, bevor die unbekannten Antigene iden­ tifiziert werden können.

Es besteht somit ein Bedarf nach einem Verfahren, alle in einer ausgewählten biologischen Quelle produzierten Pro­ teine direkt abtrennen und funktionell identifizieren zu können. Mit einem derartigen Verfahren ließen sich alle Proteine, die den Phänotyp der biologischen Quelle, z. B. Gewebe, Mikroorganismen, Zellkulturen etc. bestimmen, di­ rekt identifizieren und funktionell charakterisieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrun­ de, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem gleichzeitig Proteine und ihre spezifischen Bindungspartner aus einer kombinatorischen Bank isoliert werden können, ohne daß eine vorherige Trennung, Reinigung und Identifizierung der Proteine erforderlich sind. Mit dem Verfahren sollen alle Proteine aus einer biologischen Quelle funktionell erfaßt werden können. Es soll also der Proteomstatus einer biolo­ gischen Probe ermittelt werden können. Das Verfahren soll auf alle möglichen Bindungspartner eines Proteins anwend­ bar sein. Ferner soll das Verfahren zusätzlich die Identi­ fizierung der funktionell charakterisierten Proteine er­ lauben. Das Verfahren soll einfach, schnell und kostengün­ stig durchzuführen sein und sich für ein Massenscreening und zur Automatisierung eignen. Ferner soll das erfin­ dungsgemäße Verfahren eine rasche, eindeutige und einfache Diagnostik von Stoffwechselkrankheiten sowie die Identifi­ zierung von Arzneimittelwirkungen erlauben. Mit dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren soll eine Datenbank aus Proteinen und ihrem jeweiligen spezifischem Bindungspartner erstellt werden können. Diese Datenbank soll die Ermittlung von Arzneimittelprototypen unterstützen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung eines Proteins und seines Bindungspartners gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• a) Proteine oder Proteinaggregate aus einer biologischen Quelle isoliert und auftrennt,
• b) die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate auf einer Oberfläche immobilisiert,
• c) eine kombinatorische Bank mit den auf einer Oberflä­ che immobilisierten Proteinen oder Proteinaggregaten inkubiert,
• d) diejenigen Mitglieder der kombinatorischen Bank, die an die immobilisierten Proteine binden, von nicht­ gebundenen Mitgliedern der Bank trennt,
• e) die an die Oberfläche gebundenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner aus der kombinatorischen Bank iso­ liert,
• f) die Proteine in den so isolierten Komplexen mit einer Kombination aus einem physikalisch-chemischen Verfah­ ren identifiziert, und
• g) gegebenenfalls die isolierten Bindungspartner anrei­ chert.

Bevorzugt wird das Verfahren derart durchgeführt, daß man bei Schritt a) die biologische Probe in einem geeigneten Puffer solubilisiert und die Probe unter Verwendung eines Proteintrennverfahrens ausgewählt aus 2D-Gelelektro­ phorese, Perfusionschromatographie, Flüssigchromatographie oder Kapillarelektrophorese auftrennt. Weiter bevorzugt werden die aufgetrennten Proteine auf den Kavitäten einer Mikrotiterplatte immobilisiert oder auf eine Membran geblottet oder mit mit spezifischen Antikörpern be­ schichteten Mikrokügelchen eingefangen.

Der Ausdruck Proteinaggregate bezeichnet einen Zusammen­ schluß mehrerer Proteine. Dieser Zusammenschluß kann das Ergebnis einer funktionellen Assoziation mehrerer Proteine sein, z. B. Enzyme des Krebs-Zyklus, die zu einer funktio­ nellen Einheit verbunden sind, an der die Umwandlung des Substrats in das Endprodukt über mehrere Zwischenstufen erfolgt. Der Zusammenschluß kann aber auch das Ergebnis des Trennverfahrens sein, und umfaßt z. B. in einem chroma­ tographischen Peak eluierende Proteine, die durch eine ge­ meinsame Retentionszeit verbunden sind.

Bevorzugt verwendet man als kombinatorische Bank Random- Peptid-Banken, (scFv) Banken der Immunglobulinsuperfamilie, Protein-Display-Banken, kombinatorische chemische Banken, RNA- oder DNA-Banken. Bevorzugt wird Schritt g) so durch­ geführt, daß man einen bakteriellen Wirt mit den isolier­ ten Proteinen infiziert, um ausgewählte Phagenteilchen zu vermehren, und die ausgewählten Proteinbindungspartner se­ quenziert, oder die ausgewählten Bindungspartner durch einzigartige Sequenzanknüpfungen (tag) identifiziert.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Proteine und ihre Bindungspartner gleichzeitig identifiziert werden können, wenn man ohne vorherige Reinigung und Identifizierung Pro­ teine nach Auftrennung mit einer kombinatorischen Bank in­ kubiert und die so erhaltenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner einem physikalisch-chemischen Identifizie­ rungsverfahren unterwirft.

Da sich erfindungsgemäß die Proteinproben direkt von ihren biologischen Quellen ableiten, wird keine teure, zeitauf­ wendige oder risikobehaftete Proteinproduktion benötigt. Da der Selektionsschritt in einer Stufe erfolgt, werden keine Anreicherung der Bank oder eine anschließende Selek­ tion benötigt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher ideal zur Produktion von proteinspezifischen Anti­ körpern oder Peptiden in großem Umfang. Ferner kann jede kombinatorische Bank eingesetzt werden.

Da die aufgetrennten Proteine/Proteinkomplexe direkt aus dem Gel oder in immobilisierter Form unter Verwendung von Massenspektrometrie identifiziert werden können, kann das Verfahren der Proteinidentifizierung und Erzeugung pro­ teinspezifischer Subbanken als paralleles Verfahren durch­ geführt werden. Dadurch eignete sich das erfindungsgemäße Verfahren für Proteinidentifizierungen in großem Umfang.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jeder beliebigen kombinatorischen Bank durchgeführt werden, z. B. Protein­ bank, Peptidbank, cDNA-Bank, mRNA-Bank, Bank mit organi­ schen Molekülen, scFv-Bank mit Immunglobulinsuperfamilie, Proteindisplay-Bank etc. In den Banken können präsentiert sein: alle Arten von Proteinen, z. B. Strukturproteine, En­ zyme, Rezeptoren, Liganden, alle Arten von Peptiden ein­ schließlich Modifikationen, DNAs, RNAs, Kombinationen von DNAs und RNAs, Hybride von Peptiden und RNA oder DNA, alle Arten von organischen Molekülen, z. B. Steroide, Alkaloide, Naturstoffe, synthetische Stoffe etc. Die Präsentation kann auf verschiedene Arten erfolgen, z. B. als Phagen- Display-System (z. B. filamentöse Phagen wie M13, fl,fd etc., lambda-Phagen-Display, virales Display etc.), Prä­ sentation auf Bakterienoberflächen, Ribosomen etc.

Die kombinatorische Bank kann hergestellt werden durch:

• a) Konstruktion von Random-Peptid-Banken, in denen Banken präsentiert werden können,
• b) Konstruktion von scFv-Banken oder Banken von beliebigen Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie, in denen Mitglieder der Banken präsentiert werden können,
• c) Konstruktion von Proteinbanken, in denen Proteine prä­ sentiert werden können,
• d) Konstruktion von kombinatorischen chemischen Banken, in denen organische Moleküle der Banken präsentiert werden können,
• e) Konstruktion von RNA- oder DNA-Banken in denen die aus­ gewählten Mitglieder der Banken isoliert und über geeig­ nete Oligoprimer amplifiziert werden können.

Derartige Verfahren sind einem Fachmann auf dem Gebiet be­ kannt.

Die erfindungsgemäß zu identifizierenden Proteine können aus jeder biologischen Quelle stammen, z. B. aus gesunden oder erkrankten Geweben, Zellkulturen, Organpräparaten, Körperflüssigkeiten, Biopsieproben aller Art, Organkultu­ ren, Mikroorganismen, Pflanzenpräparate, etc.

Die vorliegende Erfindung erlaubt somit die gleichzeitige Identifizierung von Proteinen mit und ohne vorherige Rei­ nigung, sowie die Auswahl von Mitgliedern kombinatorischer Banken, die mit diesen Proteinen wechselwirken. Dadurch läßt sich auf einfache Weise die Funktion der Proteine über ihre spezifischen Bindungspartner ermitteln.

Die Identifizierung von Proteinen einer Expressionsfamilie ergänzt oder ersetzt sogar das Verfahren zur Identifizie­ rung von Genen: Die Identifizierung von Proteinen in ihrem nativen Zustand bestätigt die entsprechenden Gensequenzen oder identifiziert mögliche posttranskriptionelle und posttranslationelle Modifikationen. Die Identifizierung der meisten oder aller Proteine aus einer nicht sequen­ zierten oder teilweise sequenzierten biologischen Probe beschleunigt Bemühungen zur Ermittlung einer Genzielse­ quenz oder vermeidet den aufwendigen Prozeß der Gensequen­ zierung. Die Information auf der Proteinebene spiegelt die biologische Identität eines Organismus besser wieder als die Information auf genomischer Ebene. So spiegelt die Identifizierung aller Proteine einer biologischen Probe die relevante Information über den biologischen Zustand der Probe und damit des untersuchten Organismus bzw. Teil des Organismus wieder. Ferner ist zu erwarten, daß die Va­ riation im Vorkommen eines Proteins dynamisch ist, i.e. sie wird von endogenen und exogenen Faktoren beeinflußt. Es ist nicht möglich, diese Zusatzinformation aus der Se­ quenzierung des Genoms oder der mRNA abzuleiten (s. o.).

Ferner können erfindungsgemäß spezifisch miteinander wech­ selwirkende Mitglieder einer kombinatorischen Bank gegen die meisten oder gar alle Proteine einer gegebenen biolo­ gischen Probe gleichzeitig ermittelt werden. Dies ersetzt das aufwendige Verfahren der Genisolierung, Subklonierung, Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins. Fer­ ner ist es mit den gegenwärtigen bekannten Methoden nicht nur aufwendig und schwierig, spezielle Mitglieder einer kombinatorischen Bank gegen ein Protein zu isolieren, son­ dern es ist auch unsicher, ob alle Proteine exprimiert werden können und ob die exprimierten Proteine tatsächlich in ihrer nativen Form vorliegen. Beispielsweise ist gut bekannt, daß das Glycosylierungsmuster von Proteinen eu­ karyotischen Ursprungs entscheidend von den zur Expression gewählten Wirten abhängt. Ferner ist es praktisch nicht möglich, spezifisch wechselwirkende Mitglieder einer Bank gegen die meisten oder alle Proteine aus komplizierten biologischen Proben gleichzeitig unter Verwendung bisher bekannter Methoden zu erhalten.

Diese Kombinationen aus Protein und spezifischem Mitglied einer kombinatorischen Bank kann verwendet werden, um den Proteomstatus der Probe und nicht nur von einigen wenigen Proteinen gleichzeitig zu überwachen. Dieser Fortschritt in der Proteomüberwachung soll die Ermittlung von An­ griffsorten von Arzneimitteln und von pharmazeutischen Leitsubstanzen zur Weiterentwicklung zu Arzneimitteln be­ schleunigen, da die meisten Erkrankungen, die gegenwärtig therapiert werden, multifaktorieller Genese sind, d. h. mehr als ein Protein an ihrer Genese beteiligt ist.

Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Anwendung jeder kombinatorischen Bank, z. B. Protein-, Peptid- oder Antikörperbanken oder DNA- und RNA-Banken oder sogar mit einer Codesequenz versehene synthetische organische Mole­ külbanken (Brenner, S. und Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5381-5383, 1992). Die Erfindung besitzt somit beispielsweise die folgenden technischen Anwendungsmög­ lichkeiten:

• a) Isolierung von Proteinen, die für Proteine aus einer biologischen Probe spezifisch sind, und Erstellung einer Protein-Protein-Wechselwirkungsbank (z. B. Netzwerk von signalübertragenden Stoffwechselwegen, wenn Proteine der kombinatorischen Bank von der gleichen biologischen Quelle stammen wie die Probe) oder einer Krankheitserre­ ger-Wirt-Datenbank (z. B. wenn Proteine der kombinatori­ schen Bank dem Krankheitserreger angehören und die Probe der Wirt ist),
• b) Isolierung und Identifizierung proteinspezifischer Pep­ tide, mit dem Ziel der Ermittlung potentieller Peptid­ agonisten oder -antagonisten oder peptidomimetischer Mo­ leküle zum Design von neuen Arzneimitteln,
• c) Isolierung und Identifizierung rekombinanter Antikörper mit den vorstehend genannten Anwendungsspektren,
• d) Isolierung und Identifizierung proteinspezifischer DNA- oder RNA-Moleküle, die für Anwendungen von Protein- Knock-out zur Funktionsermittlung bis zur Arzneimittel­ entwicklung geeignet sind, und
• e) Isolierung und Identifizierung kleiner organischer Mo­ leküle, die direkte Moleküle für die Entwicklung von Arzneimitteln sind.

Es ist klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur das Verständnis biologische Prozesse beschleunigt, sondern auch die Aufklärung von Krankheitsmechanismen und die ge­ zielte Entwicklung neuer Arzneimittel beschleunigt.

Ferner erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine einfa­ che und rasche Diagnose von Stoffwechselerkrankungen. Ge­ genwärtig wird Diagnostik nur an einem speziellen Protein oder Stoffwechselprodukt durchgeführt. Bezüglich Erbkrank­ heiten werden nur ganz spezielle Mutationen in einem Gen getestet, jedoch mit unsicherer Aussagekraft. Obwohl es möglich ist, eine Diagnostik mit mehreren Proteinen oder Metaboliten durchzuführen, sind derartige Verfahren teuer und zeitaufwendig und erlauben nur eine begrenzte Informa­ tion über die Krankheit. Die Überwachung des Proteomstatus einer biologischen Probe erlaubt - wie vorstehend ausge­ führt - die Feststellung des aktuellen Zustands in einem biologischen Gewebe. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nun der Proteomstatus eines Gewebes einfach, schnell und zuverlässig ermittelt werden. Dazu wird nach dem er­ findungsgemäßen Verfahren eine proteinspezifische Bank oder Subbank eines Gewebes, z. B. der Leber, der Lunge, des Magens etc. erzeugt und gegebenenfalls vielfach amplifi­ ziert. Eine derartige Bank wird dann auf einer geeigneten Oberfläche, z. B. aus Glas, Kunststoff, einem Halbleiter­ chip einer optischen Faser oder einer CD in an sich be­ kannter Weise immobilisiert. Die Bindung der Proteine an ihre verwandten Subbanken, die auf der geeigneten Oberflä­ che immobilisiert sind, können unter Verwendung bereits bekannter Nachweisverfahren, nachgewiesen werden z. B. BIA- core-Chips. Umgekehrt kann auch die biologische Probe auf der Oberfläche eines derartigen Chips immobilisiert wer­ den. Die Oberfläche selbst wird bevorzugt in mehrere Mi­ krokompartimente unterteilt, wobei jede Unterteilung einem speziellen Protein zugeordnet wird, dessen kombinatorische Subbank zuvor erzeugt worden ist. Nach Abwaschen über­ schüssiger nicht gebundener Probenlösung werden die pro­ teinspezifischen Antikörper- oder Proteinsubbanken jedem Kompartiment zugesetzt. Die gebundenen Antikörper oder Peptide können durch ihre fusionierten Peptid-Tags identi­ fiziert werden. Aus den so erhaltenen Signalen (qualitativ/quantitativ) kann dann durch Vergleich mit dem Signalmuster einer normalen Probe auf eine entsprechende Erkrankung des Gewebes bzw. Organs geschlossen werden. Derartige Diagnosechips können zur Diagnose von Organ- und Gewebszuständen, Infektionen und Krankheiten aller Art ge­ zielt angefertigt werden. Ferner kann ein solcher Chip auch zur Untersuchung von Stoffwechselzuständen in Pflan­ zen, Mikroorganismen etc. verwendet werden. So lassen sich mit einem solchen Chip gezielt und rasch Zustände wie ein frischer Herzinfarkt, ein Magengeschwür, eine Gewebsnekro­ se, Infektionen wie z. B. Hepatitis, Tropenkrankheiten, AIDS, Autoimmunerkrankungen aller Art etc. diagnostizie­ ren.

Ein derartiger Diagnosechip kann in Form eines gebrauchs­ fertigen Kits angeboten werden. Ein derartiges Kit umfaßt einen entsprechenden gewebs- bzw. organspezifischen Chip, auf den eine entsprechende Proteinbank immobilisiert ist, eine Ausrüstung zur Probenahme, z. B. Spritze, Skalpell etc. sowie ein Gefäß zur Durchführung der Inkubation zwi­ schen Chip und Probe und Anleitungen zur Durchführung und Auswertung. Entsprechende gebrauchsfertige Kits können ge­ zielt hergestellt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zuerst die Pro­ teinprobe aus der jeweiligen biologischen Quelle solubili­ siert und aufgetrennt. Hierzu kann jedes auf dem Gebiet der Proteinabtrennung einem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist die 2D-Gelelektrophorese. Die so aufgetrennte Proteinprobe wird anschließend auf eine Oberfläche, bevorzugt eine Membran, geblottet. Es ist nicht notwendig, die Proteine in dieser Stufe zu identifi­ zieren.

Als nächster Schritt wird eine kombinatorische Bank z. B. aus einem Peptid oder antikörperartigen Molekülen oder Proteinen, die auf der Oberfläche von filamentösen Phagen­ teilchen exprimiert sind, mit der Membran, auf die die aufgetrennte Proteinprobe geblottet ist, inkubiert. Die Inkubation kann nach einem Fachmann bekannten Bedingungen durchgeführt werden. Die kombinatorische Bank kann z. B. durch kombinatorische chemische Methoden wie randomisierte Oligokassetten, hergestellt werden und aus jeder biologi­ schen Quelle (z. B. cDNA oder Antikörper aus immunisierten Tieren) isoliert werden. Die Inkubationsbedingungen werden dabei so gewählt, daß ein Teil der Proteine in der Bank an die einzelnen Proteine in der aufgetrennten Probe bindet. Die speziell auf den jeweiligen Fall anzuwendenden Bedin­ gungen können von einem Fachmann durch einfache Rou­ tineversuche ermittelt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Proteine, Pep­ tide oder antikörperartige Moleküle, die in einem in vitro in einem Polysom-Display-System (Mattheakis, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022-9026, 1994) präsen­ tiert sind, oder DNA- oder RNA-Molekülbanken, die mittels SELEX oder ähnlichen Systemen (Tuerk, C., und Gold, L. Science, 249: 505-510, 1990) erzeugt wurden, oder kombina­ torische Banken organischer Moleküle mit den getrennten immobilisierten Molekülen inkubiert. Die Inkubation wird so ausgeführt, daß ein Teil der Mitglieder der Bank an die einzelnen getrennten Proteine in der Probe bindet.

Anschließend wird die Membran gründlich gewaschen, um zu gewährleisten, daß nur die Mitglieder der Bank, die für die getrennten Proteine spezifisch sind, haften bleiben. Die Waschbedingungen richten sich nach den jeweils gebun­ denen Proteinen und der verwendeten Bank. Die Flecken, die zu identifizierenden Proteinen entsprechen, werden ausgeschnitten und die an die Proteine gebundenen filamen­ tösen Phagenteilchen werden eluiert. Die ausgewählten Pha­ genteilchen werden entweder aufbewahrt oder zur Infektion relevanter Wirtszellen verwendet, um die ausgewählten Mit­ glieder der Bank zu vermehren. Alternativ kann die geneti­ sche Information, die den gebundenen Mitgliedern der Bank entspricht, direkt mittels PCR gewonnen oder über ihre einzigartige Codesequenz identifiziert werden.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird die geblot­ tete Membran reversibel mit kolorimetrischen oder lumines­ zierenden Farbstoffen angefärbt und die gefärbten Protein­ flecken werden automatisch analysiert. Die Farbe wird ent­ fernt und die Membran wird verwendet, um die präsentierte Bank durchzumustern. Die nun nicht mehr sichtbaren Pro­ teinflecken werden automatisch registriert und ausge­ schnitten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die auf die Membran geblotteten Proteine nach einem belie­ bigen, einem Fachmann bekannten physikalisch-chemischen Verfahren zur Proteinidentifizierung identifiziert.

Bevorzugt wird erfindungsgemäß die Identität der interes­ sierenden Proteine massenspektrometrisch (wie z. B. in Si­ uzdak, G., Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press, Inc., 1996 beschrieben) mit anschließender Protein- oder EST-Datenbankrecherche (z. B. nach Mann, M., in Micro­ characterization of Proteins, Hrsg. R. Kellner, F. Lottspeich, H.E. Meyer, VCH Weinheim, 1994) identifi­ ziert. Die Proteine werden anschließend im Gel enzymatisch oder chemisch gespalten. Der Spaltansatz kann dann als solcher vollständig massenspektrometrisch analysiert wer­ den oder vorher mittels Mikrosäulen-Flüssigchromatographie (LC) analysiert werden. Die massenspektrometrische Analyse kann auf verschiedene, an sich bekannte Arten durchgeführt werden, z. B. mit einer Ionisierungsquelle wie einem Elek­ trospray (Chapman, J.R., et al., Methods in Molecular Bio­ logy, 61, JR Chapman Hrsg., Humana Press Inv. Totowa NJ, USA, 1996) einschließlich Nanoelektrospray (Wilm. M. und Mann, M., Anal. Chem. 68, 1-8, 1996) und matrixunter­ stützter Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) (Siuzdak, G. Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press Inc. 1996) oder eine Kombination aus Massenanalysatoren wie Triple, Quadrupol, Flugzeit, Magnetsektor, Fourier- Transformations-Ionenzyklotron-Resonanz und Quadropol- Ioneneinfang.

Wenn die Peptide aus dem Spaltansatz nicht ausreichen, die Identität des Proteins eindeutig aus der Datenbank zu identifizieren, kann durch eine weitere Fragmentierung im Massenspektrometer wie z. B. durch Zerfall nach der Quelle in MALDI-TOF, MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie), MSⁿ eine weitere Sequenzinformation für die Datenbankrecherche erhalten werden. Die Ergebnisse der Recherche werden dann durch Identifizieren der für die Recherche nicht verwende­ ten Peptidfragmente im Massenspektrum bestätigt.

Alternativ können die Proteine oder Proteinfamilien durch de novo-Sequenzierung (z. B. nach Shevchenko, A., et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 11, 1015-1024, 1997) identifiziert werden. Dazu stehen beispiels­ weise die folgenden Methoden zur Verfügung:

• 1) Verwendung der Mikrosäulen-LC zur Auftrennung der Pep­ tide im Spaltansatz (Dongre, A., et al., TIBTECH, 15, 418-425, 1997), gefolgt von einer automatischen Datenge­ winnung basierend auf vorgewählten Bedingungen und ei­ nem Computer-Algorithmus, um die Datenbank abzusuchen, wobei eine Korrelationsanalyse verwendet wird, um die Sequenzen der Datenbank dem Ergebnis der Tandem-Massen­ spektroskopieanalyse anzupassen. Das verwendete Massen­ spektrometer besitzt eine Elektrospray-Ionisati­ onsquelle.
• 2) Analyse des kompletten Spaltansatzes (Shevchenko, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14440-14445, 1996) mittels MALDI mit verzögerter Extraktion und Auto­ matisierung unter Verwendung eines Realzeit-Fuzzy-logic- Algorithmus, um die Massenspektren zu erhalten, und ei­ nes Software-Bindeglieds zu einer automatischen Daten­ bankrecherche. Proteine, die hier nicht identifiziert werden, werden dann einer Nanoelektrospray-Tandem-Mas­ senspektrometrie mit Stammionenscanning (Wilm M. et al., Anal. Chem., 68, 527-533, 1996) unterworfen. Sequenz­ marker (Mann, M., TIBS, 21, 494-495, 1996) werden dann zum Absuchen der Datenbank verwendet.

Eine Datenbank über die Protein-Protein-Wechselwirkung oder die Liganden-Zielmolekül-Wechselwirkung kann aufgrund der identifizierten Proteine oder Proteinkomplexe und ih­ rer verwandten Bindungspartner erstellt werden und ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die Fig. 1 zeigt in einem Fließschema des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens im Überblick. Die Identifizierung der ge­ trennten Proteine kann entweder in der Immobilisierungs- oder der Trennstufe erfolgen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 A. Identifizierung der Proteine aus den Mitochondrien

Mehr als 100 mitochondriale Erkrankungen sind bekannt. Ei­ nige dieser Erkrankungen treten im Zusammenhang mit Alte­ rungsprozessen oder neurologischen Prozessen auf. Bei­ spiele hierfür sind Herzversagen, Demenz oder Schizophre­ nie. Einige dieser Erkrankungen werden durch Mutationen der mitochondrialen oder nukleären DNA, die die meisten der Struktur- und Regulatorproteine der Mitochondrien co­ diert, verursacht. Es ist somit wichtig, alle mitochon­ drialen Proteine zu identifizieren und ihre Expression so­ wohl in gesunden als auch erkrankten Geweben zu überwa­ chen.

Im vorliegenden Beispiel wurden Mitochondrien aus gesunden Rinderherzen untersucht.

Die Mitochondrien aus Rinderherz wurden gemäß Smith, A.L., Methods Enzymol. 10, 81-86, 1967, präpariert. Submi­ tochondriale Teilchen wurden daraus gemäß Cattell et al., Biochem J., 125, 169-177, 1971 hergestellt. Die Proteine wurden aus den Mitochondrien und submitochondrialen Teil­ chen nach dem Chloroform/Methanol-Extraktionsverfahren gemäß Fearnley I., und Walker, J.E., Biochem 26, 8247-8251, 1987 extrahiert.

Der Chloroform/Methanolextrakt enthielt etwa 15 Proteine. Die verschiedenen Proteine wurden durch Gelfiltration über Toyopearl HW-55 in einem Chloroform/Methanol/Wassergemisch (46 : 46 : 8, bezogen auf das Volumen) mit 60 mM Ammoniumace­ tat, pH 7 extrahiert.

Die aufgetrennte Proteinprobe wurde in einem Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol/wäßrige Ameisensäure (4 : 4 : 1, bezo­ gen auf das Volumen) aufgelöst. Die Proben wurden direkt in ein Massenspektrometer über einen kontinuierlichen Fließträger aus dem gleichen Lösungsmittel oder unter Ver­ wendung der Nanoelektrospray-Technik (Wilm, M.S., und Mann, M., Int. J. Mass Spektrom. Ion Processes, 136, 167-180, 1994) injiziert. Bei der zuletzt genannten Technik wurden etwa 2 µl der Proteinlösung in eine goldplattierte, zu einer etwa 1 µm Düse ausgezogene Kapillare überführt. Ein Hauptvorteil dieses Verfahrens ist der geringere Ma­ terialbedarf, verglichen mit herkömmlicheren Ionisierungs­ methoden. Die Massenspektren wurden aufgezeichnet, und entsprechende Molekulargewichte wurden berechnet.

Die Identität der Proteine kann mittels Tandem-Massenspek­ trometrie bestimmt werden. Aminosäureteilsequenzen wurden mit Tandem-MS mehrerer intakter Proteolipidionen durch Fragmentierung der Molekülionen im Massenspektrometer durch Kollision mit Argongas bestimmt. Aus den Massenun­ terschieden zwischen benachbarten Ionen in der Reihe der Peaks in dem Massenspektrum wurde eine Spanne der Ami­ nosäuresequenz erhalten. Die so erhaltene Sequenz wurde dann verwendet, um die Sequenzen der SWISSPROT-Proteinbank durchzumustern, wobei das Programm PEPTIDE SEARCH (Mann, M. et al., Biol. Mass Spec., 22, 338-345, 1993) verwendet wurde, und die Identität mit dem Programm MACPROMASS (Lee, T.D., und Vemuri, S., Biomed. Environ. Mass Spectrom., 19, 639-645, 1990) bestätigt wurde.

Alternativ wurden die Proteine einzeln mit Trypsin gemäß Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14440-14444, 1996 gespalten. Ein Aliquot des Überstands wurde entnommen und mittels MALDI-Peptidmapping analysiert (Shevchenko, a.a.O.). Das Programm PEPTIDE SEARCH wurde verwendet, um die Peptidmassenkartierung des isolierten Proteins zu vergleichen. In Fällen, in denen die Peptid­ massenkartierung zu keiner eindeutigen Identifizierung führte, wurden die Proben mittels Nanoelektrospray-Massen­ spektrometrie untersucht. Das Peptidgemisch wurde auf ei­ ner Kapillare aus 50 nl Poros R2-Harz (PerSeptive Biosy­ stem, Framingham, MA) mikrogereinigt. Die Peptide wurden gewaschen und dann in einem Stufengradienten mit 0,5 µl 50% Methanol in 5% Ameisensäure in eine Nanoelektrospray­ kapillare eluiert. Diese Kapillare wurde in ein Massen­ spektrometer überführt und die Probe wurde etwa 20 min versprüht. In dieser Zeitspanne wurden aus dem Massenspek­ trum hervorgehende Peptidionen ausgewählt, isoliert und in der Kollisionskammer des Massenspektrometers fragmentiert. Aus den Tandem-Massenspektren wurden kurze Sequenzstücke zu Peptidsequenztags aneinandergefügt und mit einer Pro­ teinsequenzdatenbank oder einer EST-Datenbank unter Ver­ wendung von PEPTIDE SEARCH verglichen.

Aus dem Enzympool in Rindermitochondrien kann Cytochro­ moxidase mit acht Untereinheiten (36, 21, 19, 14, 12,5, 11, 10 und 6 kDa) identifiziert werden. Die Teilsequenz der Untereinheit 2 entspricht der aus der Literatur (Tzagoloff, A., 1982, Mitochondria, 111-130, Plenum Press New York) bekannten Sequenz.

B. Konstruktion der scFv- oder Fab-Bank

Die Sequenzen der variablen Region der leichten und schwe­ ren Ketten der Antikörper wurden genetisch über eine Lin­ kersequenz, die (Gly₄Ser)_3-5 codiert, fusioniert (nach Clackson T. et al, Nature 352, 624-628, 1991; Ge, L. et al., in C.A.K. Borrebaeck (Hrsg.) Antibody Engineering 2. Aufl., Oxford University Press, New York, 1994). Alterna­ tiv kann auch eine menschliche Antikörperbank aus nicht immunisierten Spendern (vgl. Barbas III, a.a.O.) oder Con­ sensussequenzen (EP-A-951 130 21) konstruiert werden. Fer­ ner kann auch eine scFv-Bank, die sich von einer einzelnen Sequenz mit randomisiertem CDRH3 gemäß Barbas III et al., Gene, 137: 57-62, 1993 ableitet, konstruiert werden. CDRH3 kann unter Verwendung von NNK (N= A,C,G,T in gleichen mo­ laren Verhältnissen, K=G und C) oder mit Codon-bezogener Mutagenese (vgl. US-A-5 264 563; Virnekäs, B., et al., Nuc. Acids Res., 22, 5600-5607, 1994) randomisiert werden.

Die Fab-Banken wurden gemäß Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989 konstruiert.

C. Selektion von Antikörpern gegen die getrennten Proteine

Ein Aliquot jedes der fraktionierten Proteine von Beispiel 1 wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und zur Identifi­ zierung markiert. Die Membran wurde mit 3% fettfreiem Milchpulver und UV-inaktivierten M13-Phagen blockiert. Ei­ ne auf einem filamentösen Phagen präsentierte scFv- oder Fab-Bank wurde mit der blockierten, die verschiedenen fraktionierten Proteine enthaltenden Membran eine Stunde vermischt. Dann wurde die Membran ausgiebig gewaschen. Je­ des der markierten Proteine wurde aus der Membran ausge­ schnitten, und die gebundenen Phagen wurden mit 0,1 M TEA oder HCl 10 min eluiert und neutralisiert.

Alternativ wurden die ausgeschnittenen Membranstücke mit PCR-Puffer getränkt, und das Eluat wurde als Matrize für die PCR-Reaktion unter Verwendung eines flankierenden Pri­ merpaares, das die Amplifikation der scFv- oder Fab-Gene erlaubte, verwendet. Die Spezifität der auf der Oberfläche des gebundenen Phagen präsentierten scFvs oder Fabs wurde mittels ELISA oder Western Blotting bestimmt. Alternativ wurden die amplifizierten PCR-Fragmente in einen Expressi­ onsvektor subcloniert und der Rohextrakt auf Bindung mit­ tels ELISA oder Western Blotting getestet.

Beispiel 2 A. Identifizierung der mitochondrialen Proteine aus dem 2D-Gel mittels Massenspektrometrie

Die Proben aus fraktionierten mitochondrialen Proteinen wurden durch 2D-Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie angefärbt, und die Proteinflecken wurden mittels MALDI und Nanospray wie in Beispiel 1 beschrieben identifiziert.

Einer der Proteinflecken wurde als Rindermitochondriengen­ produkt ND2, eine Komponente der NADH-Dehydrogenase, iden­ tifiziert. Die N-terminale Sequenz stimmt mit der ent­ sprechenden Sequenz aus der Literatur überein (Fearnley, und Walker, a.a.O.).

Wie in Fearnley und Walker gezeigt, codiert das Codon ATG, ein universelles Isoleucincodon, in Rinderherzmitochondri­ en sowohl bei der Inititations- als auch bei der Elongati­ onsstufe Methionin. Diese Information kann nur über die direkte Sequenzierung des Gens und Proteins erhalten wer­ den.

B. Selektion von Antikörpern gegen die mit dem 2D-Gel ge­ trennten Proteine

Die 2D-Elektrophoresegele wurden auf eine PVDF-Membran geblottet und mit einer Phagen-Antikörperbank wie in Bei­ spiel 2 beschrieben abgesucht. Die durch irreversible An­ färbung des entsprechenden 2D-Gels markierten Proteinflec­ ken wurden ausgeschnitten und die gebundenen Phagenteil­ chen wurden wie vorstehend beschrieben eluiert.

Beispiel 3 A. Konstruktion von Peptidbanken

Peptidbanken wurden nach an sich bekannten Verfahren kon­ struiert (vgl. z. B. Devlin, J.J. et al., Science, 249. 404-406, 1990). Im Gegensatz zur scFv- oder Fab-Phagenbank können die präsentierten Peptide genetisch entweder mit dem Gen III (gIII), dem Minorhüllprotein von filamentösen Phagen, das für das Andocken des Phagen an den f-Pilus von E. coli und das Durchdringen der Wirtsmembran verantwort­ lich ist, oder dem Gen VIII (gVIII), dem Haupthüllprotein, fusioniert werden. Da pro Phagenteilchen nur 3-5 Kopien von gIIIp im Gegensatz zu 2-3000 Kopien von gVIIIp vorhan­ den sind, können mehr Kopien des gleichen Peptids über ei­ ne gVIII-Fusion als über eine gIII-Fusion präsentiert wer­ den, sind die ausgewählten Peptide als Folge des Einfan­ geffekts bei Präsentation auf gIII eher hochaffine Vari­ anten als bei Präsentation auf gVIII.

B. Selektion der Peptide gegen die getrennten Proteine

Die fraktionierten Proben der mitochondrialen Proteine aus Beispiel 1 wurden mittels 2D-Gelelektrophorese oder Säu­ lenchromatographie getrennt. Die fraktionierten Proteine wurden wie beschrieben auf eine Membran geblottet. Die Membran wurde blockiert und die Phagen-Peptid-Bank wurde direkt zu der Membran gegeben. Die für individuelle Pro­ teine spezifischen Peptide wurden wie in Beispiel 1 be­ schrieben isoliert.

Beispiel 4 A. Konstruktion einer Rinderherz-cDNA-Bank

Eine Rinderherz-cDNA-Bank wurde von Stratagene (Kat. # 937722) bezogen und unter Verwendung des SurfZAP-Vektors (Stratagene) präsentiert.

B. Selektion von cDNA gegen die getrennten Proteine

Die fraktionierten Proben der mitochondrialen Proteine aus Beispiel 1 wurden mittels 2D-Gelelektrophorese oder Säu­ lenchromatographie getrennt. Die fraktionierten Proteine wurden wie beschrieben auf eine Membran geblottet. Die Membran wurde blockiert und die Phagen-cDNA-Bank wurde di­ rekt zu der Membran gegeben. Die für individuelle Proteine spezifische cDNA wurden wie in Beispiel 1 beschrieben iso­ liert.

Beispiel 5 A. Erzeugung kombinatorischer Rinderherzprotein-spezifi­ scher Antikörperbanken

Rinderherzgewebe wird nach einem Fachmann bekannten Stan­ dardmethoden homogenisiert. Das Homogenat wird unter Ver­ wendung einer 2D-Gelelektrophorese getrennt und eine kom­ binatorische Antikörper-Phagenbank wird mit dem getrennten Homogenat in Kontakt gebracht und proteinspezifische Sub­ banken werden wie in Beispiel 2 isoliert.

B. Identifizierung der Rinderherzproteine

Die auf dem Gel getrennten Proteinproben werden geblottet und jeder Proteinfleck wird unter Verwendung von Massen­ spektrometrie wie in Beispiel 1 identifiziert.

C. Expressionsprofil der Rinderproteine unter Verwendung der immobilisierten Proteinproben

Das Rinderherzhomogenat wird auf Mikrotiterplatten immobi­ lisiert. Die Anzahl der Kavitäten entspricht dabei der in Stufe A erzeugten Subbanken. Nach Blockierung der Kavitä­ ten mit geeigneten Puffern werden die Antikörpersubbanken zugesetzt und so inkubiert, daß ein Teil jeder Bank an das Homogenat in jeder Kavität bindet. Die Kavitäten werden gewaschen und die gebundenen Antikörper werden durch die an die Antikörper fusionierten Peptidtags identifiziert.

Es ist offensichtlich, daß mit geeigneten Modifikationen Proteinproben jeder biologischen Quelle auf jeder festen Oberfläche immobilisiert werden können und mit Antikörper- oder Peptidbanken nachgewiesen werden können. Umgekehrt können auch Antikörper- und Peptidbanken auf festen Ober­ flächen immobilisiert werden, und die Proteinproben werden mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und durch physika­ lisch-chemische Verfahren wie z. B. Chemilumineszenz nach­ gewiesen.

Claims (13)

1. Verfahren zur gleichzeitigen Identifizierung eines Pro­ teins und seines Bindungspartners, dadurch gekennzeich­ net, daß man

• a) Proteine oder Proteinaggregate aus einer biologischen Quelle isoliert und auftrennt,
• b) die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate auf einer Oberfläche immobilisiert,
• c) eine kombinatorische Bank mit den auf einer Oberflä­ che immobilisierten Proteinen oder Proteinaggregaten inkubiert,
• d) diejenigen Mitglieder der kombinatorischen Bank, die an die immobilisierten Proteine binden, von nicht­ gebundenen Mitgliedern der Bank trennt,
• e) die an die Oberfläche gebundenen Komplexe aus Protein und Bindungspartner aus der kombinatorischen Bank iso­ liert,
• f) die Proteine in den so isolierten Komplexen mit einer Kombination aus einem physikalisch-chemischen Verfah­ ren identifiziert, und
• g) gegebenenfalls die isolierten Bindungspartner anrei­ chert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Quelle ein Organpräparat, eine Biopsie­ probe, eine Körperflüssigkeit eines Lebewesens, eine Zellkultur, ein Mikroorganismus oder ein Pflanzenpräpa­ rat ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Schritt a) die biologische Probe in einem geeigneten Puffer solubilisiert und die Probe unter Verwendung eines Proteintrennverfahrens aus­ gewählt aus 2D-Gelelektrophorese, Perfusionschromato­ graphie, Flüssigchromatographie oder Kapillarelektro­ phorese auftrennt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man in Schritt b) die aufgetrennten Proteine auf den Kavitäten einer Mikrotiterplatte immo­ bilisiert oder auf eine Membran blottet oder mit mit spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen einfängt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als kombinatorische Bank Random- Peptid-Banken, Banken der Immunglobulin-superfamilie, Protein-Display-Banken, kombinatorische chemische Ban­ ken, RNA- oder DNA-Banken verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man bei Schritt d) die gebundenen Mit­ glieder der Bank direkt eluiert oder die in die Phagen­ partikel, die die gebundenen Proteine präsentieren, ge­ packte DNA mit der PCR amplifiziert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man in Schritt g) einen bakteriellen Wirt mit den isolierten Phagen infiziert, um ausgewählte Phagenteilchen zu vermehren, und die ausgewählten Pro­ teinbindungspartner sequenziert, oder die ausgewählten Bindungspartner durch einzigartige Sequenzanknüpfungen (Tag) identifiziert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die aufgetrennten Proteine oder Proteinaggregate mittels Massenspektrometrie oder durch direktes Sequenzieren identifiziert.

9. Datenbank, umfassend Proteine und ihre spezifischen Bindungspartner und erhalten nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Datenbank nach Anspruch 9 zur Verwendung zur gezielten Diagnose von Stoffwechselerkrankungen.

11. Verwendung einer Datenbank nach Anspruch 9 zur Ent­ wicklung von Arzneimitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 die Bindung einer Arzneimittelmodellverbindung an die Proteine eines Krankheitserregers ermittelt und die so erhaltenen Bindungsdaten qualitativ auswertet.

12. Diagnosechip, dadurch gekennzeichnet, daß er eine nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhal­ tene proteinspezifische Bank oder Subbank eines mensch­ lichen, tierischen oder pflanzlichen Gewebes immobili­ siert an eine Oberfläche enthält.

13. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Diagnosechip nach Anspruch 12 zusammen mit einer Probenahmevorrich­ tung, einem Reaktionsgefäß, Kalibrationskurven und Ge­ brauchsanweisung enthält.