KR20220134516A

KR20220134516A - 전세포 당단백질체 분석 방법

Info

Publication number: KR20220134516A
Application number: KR1020227019993A
Authority: KR
Inventors: 위안 마오; 스루티 나약
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-05
Also published as: CA3154703A1; IL294843A; CN115151823A; AU2021213774A1; WO2021155077A1; JP2023512401A; EP4097482A1; US20210239706A1; MX2022008653A; BR112022010499A2

Abstract

본 개시는 당단백질체학에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 막 단백질과 세포기질 단백질 모두의 당단백질, 당질화 부위, 당펩티드 단편, 및 글리칸 조성 중 하나 이상을 결정하는 방법을 제공한다. 본원의 방법은 전세포 당질화의 식별 및 분석을 위해 막 및 세포기질 단백질의 추출을 종 또는 샘플 유형과 독립적으로 가능하게 하는 단일 가공 방법을 사용한다.

Description

전세포 당단백질체 분석 방법

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2020년 1월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/968,536호의 우선권의 이익을 주장하고 그 내용 전체는 참조로서 본원에 통합된다.

기술분야

본 개시는 당단백질체학에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 막 단백질과 세포기질 단백질 모두의 당단백질, 글리코사이트, 당펩티드, 및 글리칸 조성을 결정하는 방법을 제공한다. 본원의 방법은 전세포 당질화의 확인 및 정량적 분석을 위해 막 및 세포기질 단백질의 추출을 가능하게 하는 단일 가공 방법을 사용한다.

완전한 게놈 서열 및 큰 부분 서열 데이터베이스는 종 내의 모든 유전자를 식별할 능력이 있다. 그러나, 유전자 서열만으로는 유전자와 유전자 산물(단백질)이 특정 생물학적 과정 또는 기능을 수행하기 위해 어떻게 협력하는지 설명하지 못하기 때문에 유전자 코드만으로는 생물학적 및 임상적 과정을 설명할 수 없다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 유전자 단백질 산물(들)의 양 또는 활성을 예측하지 않으며 단백질의 변형에 대해 설명하지도 않는다. 따라서, 단백질의 생리학적 상태 또는 세포 또는 유기체의 구성을 완전히 이해하기 위해서는 단백질 및 이들의 번역 후 변형의 정량적 분석이 요구된다.

당질화는 잘 알려진 번역 후 변형으로서, 이에 의해 글리칸(즉, 올리고당 사슬)이 세포 단백질에 공유 부착된다. 당질화는 단백질의 폴리펩티드 골격을 따라 특정 위치에서 발생한다. 당질화에는 두 가지 주요 유형이 있다: 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착된 O-결합 올리고당을 특징으로 하는 당질화; 및 Asn-X-Ser/Thr 서열에서 아스파라긴 잔기에 부착된 N-결합 올리고당을 특징으로 하는 당질화 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음). 당질화는 많은 세포내 성분(예를 들어, 핵, 세포기질, 골지 및 소포체)이 관여하는 다양한 과정이다. 예를 들어, N-결합 올리고당과 O-결합 올리고당 모두의 말단 잔기인 N-아세틸뉴라믹산(즉, 시알산)은 핵에서 합성된다. 또한, 당류 및 N-결합 올리고당은 세포기질에서 합성된다. 그러나, 대부분의 단백질의 N-결합 당질화와 O-결합 당질화는 소포체(ER)와 골지에서 발생한다. 예를 들어 Van Kooyk 등의 문헌[Front. Immunol. (2013) 4:451] 참조.

당질화는 단백질 안정성, 효소 활성, 및 단백질-단백질 상호작용과 같은 단백질 기능에 영향을 미친다. 따라서, 당질화는 단백질 품질 제어의 중요한 성분이며, 접착 및 신호 전달에 관여하는 것을 포함하여 성숙한 막 단백질에서 중요한 기능적 역할을 한다. 따라서, 대부분의 연구는 막 단백질 단독의 당단백질체 분석에 중점을 둔다.

막 단백질의 당질화에 대한 연구는, 단리 동안 종종 응집 및 손실을 초래하는 일체형 막 단백질의 막관통 도메인(들)의 소수성을 포함하는 막 단백질의 고유한 물리적 특성에 의해 복잡해졌다. 따라서, 세포막 및 세포기질 둘 다로부터 당단백질을 프로파일링하고 분석하는 방법은 완전한 당단백질체를 결정하는 데 중요하고, 이는 당단백질을 평가하기 위한 보다 일관되고 재현 가능한 수단으로 이어질 것이다.

본 방법은, 전세포의 질량-분광분석 기반의 당단백질 분석에 사용하기 위한 단일 공정에서, 세포의 세포내 구획(세포기질) 및 막(들) 둘 다로 유래된 온전한 당단백질이 복합 세포 샘플로부터 효율적이고 일관되게 단리될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.

본 개시의 일 양태에서, 당단백질을 프로파일링 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 세포로부터 단백질의 세포기질 분획을 단리하고 세포로부터 단백질의 막 분획을 단리하기 위해 세포를 포함하는 샘플을 가공하는 단계, 및 (b) 막 분획 내 단백질에 대한 질량 분광분석을 수행하여 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하고, 세포기질 분획 내 단백질에 대한 질량 분광분석을 수행하여 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 샘플은 포유류 세포를 포함하는 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 인간 세포의 샘플 또는 쥣과 세포의 샘플이다. 일 구현예에서, 샘플은 인간 세포의 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 쥣과 세포의 샘플이다. 소정의 구현예에서, 샘플은 부착 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 세포의 현탁액이다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 세포를 포함하는 연조직 샘플이다. 다른 구현예에서, 샘플은 세포를 포함하는 경조직 샘플이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)을 사용하여 막 분획 내 당단백질의 프로파일 및 세포의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다.

소정의 구현예에서, 상기 방법의 가공하는 단계는 샘플 유래의 세포를 제1 세제를 포함하는 투과화 용액과 혼합하여 샘플 내 세포의 원형질 막을 투과화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투과화 용액은 세포 막을 투과화시켜 세포 구획으로부터 세포기질 단백질을 방출시킬 수 있지만 막으로부터 막관통 단백질은 방출시키지 않을 정도로 충분히 순한(mild) 제1 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 하나 이상의 비이온성 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.1%~0.2%의 비이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비이온성 세제는, 예를 들어, Triton-X 100, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (노니데트 P-40, NP-40, IGEPAL CA-630), 폴리소르베이트 20(Tween-20), 또는 사포닌이다. 일 양태에서, 투과화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 투과화 완충액이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 혼합물을 원심분리하여 투과화된 세포의 제1 펠릿, 및 단백질의 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계를 포함한다.

추가의 구현예에서, 상기 방법은 단백질의 세포기질 분획으로 구성된 상청액을 수집하는 단계, 및 투과화된 세포의 제1 펠릿을 제2 세제를 포함하는 가용화 용액에 현탁시켜 세포로부터 가용화된 막 단백질을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 투과화된 세포로부터 막 단백질을 가용화할 수 있는 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 가용화 용액은 하나 이상의 이온성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 0.1%~1.0%(w/v)의 농도로 이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이온성 세제는, 예를 들어, 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)이다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 SDS 및 데옥시콜산나트륨을 포함한다. 특정 구현예에서, 가용화 용액은 SDS, 데옥시콜산나트륨, 및 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함한다. 하나의 경우에, 가용화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 가용화 완충액(Solubilization Buffer)이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

일부 경우에, 상기 방법은 가용성 막 단백질로 이루어진 현탁액을 원심분리하여 (제2) 펠릿 및 단백질의 막 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계, 및 상청액을 수집하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질의 막 분획 및/또는 단백질의 세포기질 분획 중 어느 하나의 질량 분광분석에 의해 세포로부터 식별된 당단백질의 프로파일은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다: 막 분획에서 단백질을 분해하여 막 분획으로부터 펩티드 단편의 샘플을 수득하는 단계 및/또는 세포기질 분획에서 단백질을 분해하여 세포기질 분획으로부터 펩티드 단편의 샘플을 수득하는 단계. 소정의 구현예에서, 분해는 필터 보조 샘플 제조(FASP: Filter Assisted Sample Preparation)에 의해 수행된다.

구현예에서, 상기 방법은 세포의 막 분획 및/또는 세포의 세포기질 분획으로부터 풍부한 당질화된 펩티드를 수득하기 위해, 단백질의 막 분획 및/또는 세포기질 분획 유래의 펩티드 단편의 샘플로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 단백질의 막 분획 및/또는 세포기질 분획 유래의 펩티드 단편의 샘플은 이온-페어링 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 렉틴 친화도 크로마토그래피, 또는 하이드라지드 포획을 통해 당질화되지 않은 펩티드를 제거함으로써 풍부해진다. 특정 구현예에서, 단백질의 세포기질 분획 유래의 펩티드 단편의 샘플은 이온-페어링 HILIC에 의해 풍부해진다. 또 다른 구현예에서, 단백질의 막 분획 유래의 펩티드 단편의 샘플은 이온-페어링 HILIC에 의해 풍부해진다.

일부 구현예에서, 본 방법은 당단백질 또는 펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 샘플을 접촉시킴으로써 세포기질 분획 유래의 펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 방출된다. 또 다른 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 샘플을 접촉시킴으로써 단백질의 막 분획 유래의 당펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 방출된다.

소정의 구현예에서, 당단백질을 프로파일링하는 방법은, 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편의 질량 분광 분석을 수행하여 막 분획 내 당단백질의 프로파일 및/또는 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 당단백질 프로파일은 당단백질의 목록을 식별한다. 소정의 구현예에서, 당단백질 프로파일은 다음 당단백질 특성 중 하나 이상을 식별한다: 당질화 부위, 분획 내 당단백질의 양, 글리칸 조성물, 또는 당단백질의 풍부도.

추가의 구현예에서, 당단백질을 프로파일링하는 상기 방법은 단백질체 데이터베이스를 대상으로 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터를 검색하여 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획에 대한 당단백체 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질체 데이터베이스는 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스 또는 Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스이다. 일 구현예에서, 세포 샘플은 인간 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스에서 검색된다. 또 다른 구현예에서, 세포 샘플은 쥣과 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는 Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스에서 검색된다.

또 다른 구현예에서, 당단백질을 프로파일링하는 상기 방법은 단백질체 데이터베이스 및 글리칸 데이터베이스를 대상으로 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터를 검색하여 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획에 대한 당단백체 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 세포 샘플은 인간 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는, 각각의 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및 당질화 부위를 식별하기 위해, Byonic™ 인간 글리칸 데이터베이스와 같은 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스 및 인간 글리칸 데이터베이스에서 검색된다. 또 다른 구현예에서, 세포 샘플은 쥣과 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는, 각각의 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및/또는 당질화 부위를 식별하기 위해, Uniprot 쥣과 단백질체 데이터베이스 및 쥣과 글리칸 데이터베이스, 예를 들어 Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스에서 검색된다.

또 다른 구현예에서, 각각의 분획 또는 전세포에서 고유한 수의 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸, 및/또는 당단백질을 수득하기 위해, 본 방법을 사용해 수득된 세포의 세포질 분획 내 당단백질의 프로파일 및 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 비교한다.

본 개시는 또한, 본 발명의 방법이 모든 샘플 또는 모든 샘플 제제에 대한 단백질의 변동성을 결정하는 데 사용될 수 있음을 인식한다. 예를 들어, 본 발명자들은 단백질 생산, 단백질 위치, 또는 단백질의 번역 후 변형에 있어서의 변동이 모든 샘플 또는 이의 제제에 존재하는지 여부를 결정하는 데 본 방법이 사용될 수 있음을 보여주었다.

따라서, 본 개시의 또 다른 양태에서, 샘플 또는 샘플의 제제 간의 단백질 변동을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 단백질 변동을 검출하는 상기 방법은 (a) 세포로부터 단백질의 세포기질 분획을 단리하고 제1 샘플의 세포로부터 단백질의 막 분획을 단리하기 위해 세포를 포함하는 제1 샘플을 가공하는 단계, 및 (b) 세포로부터 단백질의 세포기질 분획을 단리하고 제2 샘플의 세포로부터 단백질의 막 분획을 단리하기 위해 세포로 구성된 제2 샘플을 가공하는 단계, 및 (c) 제1 샘플의 세포 유래의 세포기질 분획 및 막 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하기 위해 제1 샘플의 세포기질 및 막 분획 내 단백질을 분해하는 단계, 및 (d) 제2 샘플의 세포 유래의 세포기질 분획 및 막 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하기 위해 제2 샘플의 세포기질 및 막 분획 내 단백질을 분해하는 단계, 및 (e) (예를 들어 검출 가능한 마커로) 제1 샘플의 세포기질 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 제2 샘플의 세포기질 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 표지된 세포기질 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 수득하는 단계, 및 (f) 제1 샘플의 막 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 제2 샘플의 막 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 표지된 막 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 표지된 막 펩티드 분획의 혼합물을 수득하는 단계, 및 (g) 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물에서 세포기질 펩티드 단편을 검출하고, 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물에서 막 펩티드 단편을 검출하여, 제1 샘플 및 제2 샘플 간에 세포기질 단백질 및/또는 막 단백질의 총량에 임의의 변동이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

소정의 구현예에서, 제1 및 제2 샘플의 세포를 가공하는 단계는 샘플 중 하나 유래의 세포를 제1 세제를 포함하는 투과화 용액과 혼합하여 샘플 내 세포의 원형질 막을 투과화시키는 단계를 포함한다. 그런 다음, 이러한 가공은 다른 샘플의 세포를 대상으로 수행되게 된다. 일부 구현예에서, 투과화 용액은 세포 막을 투과화시켜 세포 구획으로부터 세포기질 단백질을 방출시킬 수 있지만 막으로부터 막관통 단백질은 방출시키지 않을 정도로 충분히 순한(mild) 제1 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 하나 이상의 비이온성 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.1%~0.2%의 비이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비이온성 세제는, 예를 들어, Triton-X 100, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (노니데트 P-40, NP-40, IGEPAL CA-630), 폴리소르베이트 20(Tween-20), 또는 사포닌이다. 일 양태에서, 투과화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 투과화 완충액이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

소정의 구현예에서, 상기 방법은 (각 샘플의) 투과화된 혼합물 각각을 원심분리하여 투과화된 세포의 제1 펠릿, 및 단백질의 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계를 포함한다.

추가의 구현예에서, 상기 방법은 세포의 각각의 개별 샘플의 단백질의 세포기질 분획으로 구성된 상청액을 수집하고, 별도로, 투과화된 세포의 제1 펠릿 각각을 제2 세제를 포함하는 가용화 용액에 현탁시켜 세포로부터 가용화된 막 단백질을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 투과화된 세포로부터 막 단백질을 가용화할 수 있는 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 가용화 용액은 하나 이상의 이온성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 0.1%~1.0%(w/v)의 농도로 이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이온성 세제는, 예를 들어, 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)이다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 SDS 및 데옥시콜산나트륨을 포함한다. 특정 구현예에서, 가용화 용액은 SDS, 데옥시콜산나트륨, 및 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함한다. 하나의 경우에, 가용화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 가용화 완충액(Solubilization Buffer)이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

일부 경우에, 상기 방법은 샘플 또는 샘플 제제 각각의 가용성 막 단백질로 이루어진 현탁액 각각을 원심분리하여 (제2) 펠릿의 세트 및 샘플 각각의 단백질의 막 분획을 포함하는 상청액 세트를 수득하는 단계, 및 상청액을 수집하는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이, 샘플들 간 또는 샘플 제제들 간의 단백질 변동를 검출하는 상기 방법은 각각의 분획을, 예컨대 검출 가능한 마커로 표지하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 세포기질 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 상이하다. 소정의 구현예에서, 세포의 제1 및 제2 샘플(또는 이의 제제)로부터 수득한 세포기질 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 동일하다. 다른 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 막 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 상이하다. 일부 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 막 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 세포액 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커는 서로 상이하며, 동일한 검출 가능한 마커는 세포의 제1 및 제2 샘플 또는 이의 제제의 막 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 각각의 세포기질 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커는 각각의 막 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커와 동일하다.

일부 구현예에서, 검출 가능한 마커는 일차 아민(-NH2 기) 잔기 및 리신 잔기를 공유 표지하는 동중원소 검출 가능한 마커이다. 소정의 구현예에서, 동중원소 검출 가능한 마커는, 샘플 식별 및 펩티드의 정량화를 위해 질량 분광분석에서 검출할 수 있는 중동위원소를 함유한다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드는 Thermo Scientific™ Tandem Mass Tag(TMT) Sytem (Thermo Scientific™)에 기술된 것과 같은 동중원소 검출 가능한 마커로 표지되며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은 표지된 세포기질 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플(또는 이의 제제)의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계, 및 표지된 막 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플(또는 이의 제제)의 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물에 대해 질량 분광분석을 수행하여 제1 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일 및 제2 샘플의 분해된 단백질의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하되, 상기 프로파일 각각은 임의로 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 포함된 당단백질의 목록을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 방법은 세포기질 펩티드 단편의 혼합물 각각으로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하여, 당질화된 펩티드 단편이 풍부한 제1 샘플 및 제2 샘플로부터 세포기질 펩티드 단편의 집합체(collection)를 수득하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 당질화되지 않은 펩티드 단편을 막 펩티드 단편의 혼합물 각각으로부터 분리하여, 당질화된 펩티드 단편이 풍부한 제1 샘플 및 제2 샘플로부터 막 펩티드 단편의 집합체를 수득한다.

일부 경우에, 세포기질 펩티드 단편의 혼합물 및/또는 막 펩티드 단편의 혼합물 유래의 펩티드 단편의 샘플은 이온-페어링 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 렉틴 친화도 크로마토그래피, 또는 하이드라지드 포획을 통해 당질화되지 않은 펩티드를 제거함으로써 풍부해진다. 특정 구현예에서, 세포기질 펩티드 단편의 혼합물은 이온-페어링 HILIC에 의해 풍부해진다. 또 다른 구현예에서, 단백질의 막 분획 단편의 혼합물은 이온-페어링 HILIC에 의해 풍부해진다.

일부 구현예에서, 본 방법은 당단백질 또는 펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 혼합물을 접촉시킴으로써 세포기질 펩티드 단편의 혼합물의 풍부한 펩티드 단편 샘플로부터 방출된다. 또 다른 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 혼합물을 접촉시킴으로써 풍부한 막 펩티드 단편의 혼합물로부터 방출된다.

도 1a~1b는 부착 세포의 막 및 세포기질 유래의 당단백질의 예시적인 질량 분광분석을 도시한다. 접착 세포는 충분히(confluence) 성장시킨 다음 수확하였다. 수확된 세포를 본 방법에 따라 가공하고, 막 분획의 단백질의 단백질(A) 및 세포기질 분획의 단백질(B)을 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의해 분석하였다. 분석된 분획에서 검출된 각 당펩티드 단편에 대해 관찰된 질량 스펙트럼(19-36)을 인간 단백질 서열 데이터베이스 및 Byonic™ 인간 글리칸 데이터베이스와 비교하여 각 분획에 존재하는 당펩티드에 대한 펩티드 스펙트럼 일치(PSM)를 수득하였다.
도 2a~2d는 전세포 당단백질 프로파일을 얻기 위한, 부착 세포의 막 및 세포기질 유래의 당단백질의 예시적인 질량 분광분석을 도시한다. (a) 부착 세포 제제의 막 분획 및 세포기질 분획에서 검출된 총수의 당단백질의 LCMS 분석은, 세포 막에 고유한 307개의 당단백질, 세포의 세포기질 분획에 고유한 49개의 당단백질, 및 예시적인 부착 세포 샘플의 세포질 분획 및 막 분획 모두에서 발견되는 180개의 당단백질을 나타낸다. (b) LCMS 분석은 부착 세포 제제의 막 분획 및 세포기질 분획에서 검출된 당질화 부위(글리코사이트)의 총 수를 결정하였다. 세포의 막 분획에서 569개의 고유 글리코사이트가 식별되었고, 세포의 세포기질 분획에서 40개의 고유 글리코사이트가 검출되었으며, 세포막 분획과 세포기질 분획 모두의 단백질에서 325개의 고유 글리코사이트가 식별되었다. (c) LCMS는 세포의 막 분획에서 3641개의 고유 당펩티드를 검출하였고, 가공된 세포의 세포기질 분획에서 348개의 고유 당펩티드를 검출하였고, 1165개의 당펩티드가 예시적인 부착 세포 샘플의 세포기질 분획과 막 분획 모두에서 식별되었다. (d) LCMS 분석은 세포의 막 분획에서 25개의 고유 글리칸을 식별하였고, 세포의 세포기질 분획에서 1개의 고유 글리칸을 식별하였고, 예시적인 부착 세포 샘플의 세포기질 분획과 막 분획 모두에서 95개의 글리칸을 식별하였다.
도 3a~3b는 쥣과 간 조직 샘플로부터 수득한 세포의 막 및 세포기질 유래의 당단백질의 질량 분광분석을 도시한다. 간 연조직 샘플을 수득하고 본 방법에 따라 가공하여 각각의 간 조직 샘플로부터 단백질의 세포기질 분획 및 단백질의 막 분획을 수득하였다. 막 분획의 단백질(a) 및 세포기질 분획의 단백질(b)을 LCMS에 의해 분석하였다. 분석된 분획에서 검출된 각 당펩티드 단편에 대해 관찰된 질량 스펙트럼(19-36)을 예측 질량 스펙트럼 데이터베이스 및 Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스와 비교하여 펩티드 스펙트럼 일치(PSM)를 수득하였다.
도 4a~4d는 쥣과 간 조직 샘플로부터 수득한 세포의 막 및 세포기질 유래의 당단백질의 질량 분광분석을 통해 전세포 당단백질 프로파일을 생성하는 것을 도시한다. (a) 간 조직 세포 제제의 막 분획 및 세포기질 분획에서 검출된 총수의 당단백질의 LCMS 분석은, 간 세포 막에 고유한 212개의 당단백질, 간 세포의 세포기질 분획에 고유한 89개의 당단백질, 및 간 세포 샘플의 세포질 분획 및 막 분획 모두에서 발견되는 359개의 당단백질을 나타낸다. (b) LCMS 분석은 간 조직에서 수득한 세포 제제의 막 분획 및 세포기질 분획에서 검출된 당질화 부위(글리코사이트)의 총 수를 결정하였다. 세포의 막 분획에서 555개의 고유 글리코사이트가 식별되었고, 세포의 세포기질 분획에서 317개의 고유 글리코사이트가 검출되었으며, 막 분획과 세포기질 분획 모두의 단백질에서 577개의 고유 글리코사이트가 식별되었다. (c) LCMS는 간 세포의 막 분획에서 331개의 고유 당펩티드 단편를 검출하였고, 가공된 간 조직 세포의 세포기질 분획에서 1592개의 고유 당펩티드 단편을 검출하였고, 2646개의 당펩티드 단편이 샘플의 세포기질 분획과 막 분획 모두에서 식별되었다. (d) LCMS 분석은 간 세포의 막 분획에서 41개의 고유 쥣과 글리칸을 식별하였고, 세포의 세포기질 분획에서 20개의 고유 글리칸을 식별하였고, 시험한 간 조직 세포 샘플의 세포기질 분획과 막 분획 모두에서 145개의 쥣과 글리칸을 식별하였다.
도 5a~5b는 인간 부착 세포로부터 수득한 복제 세포기질 분획 및 막 분획에서 샘플 가공의 재현성을 도시한다. 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법을 사용해 (a) 인간 K562 세포 유래의 막 분획의 복제 제제에 존재하는 모든 단백질 및 (b) 인간 K562 세포 유래의 세포기질 분획의 복제 제제에 존재하는 모든 단백질의 HCD MS/MS 스펙트럼에서 생성된 검출 가능한 마커 생성 신호(즉, TMT 리포터 이온)의 강도를 측정한다. 그래프에 플로팅된 값은 마커 신호 강도의 Log2이다. 막 제제 및 세포기질 제제 각각에 대해 0.99를 초과하는 상관 계수(R2)는 부착 세포로부터 펩티드의 세포기질 분획 및 막 분획을 단리하기 위한 가공 방법이 매우 일관되고 재현 가능함을 나타낸다.
도 6a~6b는 쥣과 간 세포로부터 수득한 복제 세포기질 분획 및 막 분획에서 샘플 가공의 재현성을 도시한다. 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법을 사용해 (a) 간 연조직의 쥣과 간 세포 유래의 막 분획의 복제 제제에 존재하는 모든 단백질 및 (b) 간 연조직의 쥣과 간 세포 유래의 세포기질 분획의 복제 제제에 존재하는 모든 단백질의 HCD MS/MS 스펙트럼에서 생성된 검출 가능한 마커 생성 신호(즉, TMT 리포터 이온)의 강도를 측정한다. 그래프에 플로팅된 값은 마커 신호 강도의 Log2이다. 막 제제 및 세포기질 제제 각각에 대해 0.98을 초과하는 상관 계수(R2)는 연조직 샘플로부터 펩티드의 세포기질 분획 및 막 분획을 단리하기 위한 가공 방법이 매우 일관되고 재현 가능함을 나타낸다.

본 발명자들은 다수의 세포 구획에서 발현되는 단백질의 당질화를 프로파일링하기 위한 방법을 개발하였는데, 상기 방법은 임의의 생물학적 시스템에서 당질화의 전체론적 (전세포) 프로파일을 식별하고 당질화의 정량화를 가능하게 한다.

따라서, 본 개시의 일 양태에서, 당단백질을 프로파일링하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 세포기질 분획, 막 분획, 및 전세포에서 당단백질의 프로파일을 수득하기 위한, 세포 샘플 유래 단백질의 세포기질 분획의 질량 분광분석 기반 단백질체 분석; 및 세포 유래 단백질의 막 분획의 질량 분광분석 기반 단백질체 분석을 포함한다. 보다 구체적으로, 세포의 세포내 구획(세포기질) 및 막(들)의 온전한 당단백질을, 전세포 또는 이의 개별 분획의 질량 분광분석 기반 당단백질체 분석에 사용하기 위해, 복합 세포 샘플로부터 단일 공정으로 효율적으로 및 일관되게 단리할 수 있다는 것이 본원에서 입증되었다.

본 방법은, 세포 종(예를 들어, 인간, 마우스, 조류, 랫트)과 독립적으로 세포의 부착 샘플, 세포 현탁액, 조직 샘플(경 조직 및 연 조직)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 유형의 샘플에 적용될 수 있다.

본 방법을 사용함으로써, 본 발명자들은 또한, 세포 샘플을 가공하여 제1 샘플 또는 샘플 제제로부터 세포의 세포기질 분획 및 세포의 막 분획을 수득할 수 있고; 제1 샘플 또는 샘플 제제의 이러한 세포기질 분획 및 막 분획 내 단백질 농도를 제2 샘플 또는 제1 샘플의 제2 제제로부터 수득한 것들과 비교하여, 단백질 생산, 단백질 위치, 또는 단백질의 번역 후 변형에 있어서 변동이 존재하는지 여부를 모든 샘플 또는 샘플 제제에 대해 결정할 수 있다는 것을 발견하였다.

정의.

본원에서 사용되는 바와 같이, 다음의 용어는 표시된 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는(“a”, “an”, 및 “the”), 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 이들이 지칭하는 용어의 복수의 형태를 구체적으로 포함한다. 용어 “약”은 대략, 범위 내, 대충, 또는 언저리를 의미하도록 본원에서 사용된다. 용어 “약”이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값 위 및 아래로 경계를 연장시킴으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 “약”은 20%의 분산에 의해 언급된 값 위 및 아래에 있는 숫자 값을 변경하도록 본원에서 사용된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 여전히, 명확성 및 참조 용이성을 위한 소정의 용어가 아래에 정의된다.

“펩티드”란 개별 아미노산 잔기를 함께 연결하여 형성된 짧은 중합체를 의미하며, 여기서 하나의 아미노산 잔기와 제2 아미노산 잔기 사이의 연결은 아미드 결합 또는 펩티드 결합으로 불린다. 펩티드 또는 펩티드 단편은 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함한다. 펩티드는 더 짧다는 점에서 폴리펩티드와 구별된다. 한 펩티드의 C’ 말단 아미노산 잔기와 제2 펩티드의 N’ 말단 아미노산 잔기 사이의 아미드 결합 또는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개의 펩티드는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 폴리펩티드를 형성한다.

“폴리펩티드” 또는 “단백질”이란 개별 아미노산 잔기를 연결하여 형성된 긴 중합체를 의미하며, 여기서 하나의 아미노산 잔기와 제2 아미노산 잔기 사이의 연결은 아미드 결합 또는 펩티드 결합으로 불린다. 폴리펩티드 또는 단백질은 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하지만; 다수의 폴리펩티드는 아미드 또는 펩티드 결합을 통해 함께 연결되어 훨씬 더 긴 단백질을 형성할 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 다음을 포함하는 자연 발생 변형, 예컨대 번역후 변형에 의해 변형될 수 있다: 인산화, 지방 아실화, 프리닐화, 황산화, 하이드록실화, 아세틸화, 탄수화물 첨가, 보결분자단(prosthetic group) 또는 보조인자의 첨가, 이황화 결합의 형성, 단백질 분해, 거대분자 복합체로의 조립 등.

“펩티드 단편”은 일반적으로 더 큰 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “당폴리펩티드”, “당펩티드”, “당질화 펩티드”, “당단백질” 또는 “당질화 단백질”은 공유 결합된 탄수화물기(”글리칸”)를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 탄수화물 또는 글리칸은 단당류, 올리고당류, 또는 다당류일 수 있다. 프로테오글리칸은 상기 의미 내에 포함된다. 당폴리펩티드, 당질화 폴리펩티드, 당단백질, 또는 당질화 단백질은 다른 번역 후 변형을 추가로 함유할 수 있다. “당펩티드 단편”은, 펩티드 단편이 공유 결합된 탄수화물을 보유하는 더 큰 폴리펩티드의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된 펩티드 단편을 지칭한다. 단백질은 일반적으로 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기(O-연결)의 측쇄 또는 아스파라긴 잔기(N-연결)의 측쇄에서, 잘 알려진 효소 메커니즘에 의해 당질화된다. N-결합된 당질화 부위는 일반적으로, N-X-S/T로서 기술될 수 있는 서열 모티프에 속하며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.

“샘플”은 하나 이상의 세포, 단백질, 펩티드, 또는 펩티드 단편을 포함하는 임의의 유체, 조직, 기관, 또는 이의 일부분을 의미한다. 샘플은 생검에 의해 수득된 조직 절편이거나, 현탁액 중의 세포 또는 조직 배양에 삽입되거나 조조직 배양에 적합한 세포일 수 있다. 샘플은 생물학적 유체 시편, 예컨대 혈액, 혈청 또는 혈장, 뇌척수액, 소변, 타액, 정액 혈장, 췌장액, 모유, 폐 세척물 등일 수도 있다. 샘플은 추가적으로 진핵 세포를 포함하는 임의의 종의 세포 추출물일 수 있다. 조직 또는 생물학적 세포 샘플은 원하는 경우, 특정 세포 유형, 세포의 일부를 함유하는 분획으로 추가로 분획화될 수 있다. 따라서, 소정의 경우에, 샘플은 배양 중인 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.

용어 “표지” 또는 “표지화”는 둘 이상의 엔티티 사이의 결합 상호작용을 지칭한다. 2개의 엔티티, 예를 들어, 분자와 분자 또는 분자와 펩티드가 서로 결합되는 경우, 이들은 직접 결합되거나, 즉 서로 직접 결합되거나, 간접적으로 결합되거나, 즉 중간 연결 모이어티 또는 엔티티의 사용을 통해 결합될 수 있다. 어느 경우든, 결합은, 예를 들어 전자쌍 공유를 통한 공유 결합이거나; 예를 들어 이온 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용, 반데르 발스 힘, 또는 이들의 조합을 통한 비공유 결합일 수 있다. 소정의 경우에, 표지는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출 가능하다.

당단백질 프로파일링 방법 .

본 방법에 따르면, 샘플의 세포 집단을 가공하여 세포의 세포기질 분획 및 세포의 막 분획을 수득하고, 세포 분획의 각각은 질량 분광분석에 의해 분석되는 단백질 또는 펩티드를 함유한다. 그런 다음, 단백질 또는 펩티드로부터 수득된 질량 스펙트럼 정보를 분석하거나, 단백질을 암호화하는 아미노산 서열로 이루어진 데이터베이스 및/또는 알려진 글리칸, 당펩티드, 당단백질, 또는 당질화 부위(글리코사이트)의 질량 스펙트럼을 포함하는 글리칸 데이터베이스에 대해 검색한다. 이러한 분석의 결과로서, 세포기질 분획, 막 분획, 및 전세포의 당단백질 프로파일을 세포에 대해 식별할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 방법에 따라 가공하기 위한 세포 샘플은 진핵 세포 샘플이며, 상기 진핵 세포는 다음을 포함하는 동물로부터 수득된 것을 포함하되 이들로 한정되지 않는다: 인간 및 다른 영장류(침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류를 포함함); 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 가축; 개 및 고양이와 같은 집 가축; 마우스, 랫트, 및 기니 피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물; 닭, 칠면조 및 기타 가금류, 오리, 거위 등과 같은 가축 조리, 야생 조류, 및 사냥용 조류. 소정의 구현예에서, 진핵 세포는 포유동물로부터 수득된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 인간 세포의 샘플 또는 마우스 세포의 샘플이다. 일 구현예에서, 샘플은 인간 세포의 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 쥣과 마우스 샘플이다.

소정의 구현예에서, 샘플은 부착 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 세포의 현탁액이다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 세포를 포함하는 연조직 샘플이다. 다른 구현예에서, 샘플은 세포를 포함하는 경조직 샘플이다. 조직 또는 세포는 신선한 것이거나, 당업자에게 공지된 방법에 의해 냉동되거나, 건조되거나, 배양되거나, 탈수되거나, 보존되거나, 유지될 수 있다.

실시예 1 및 실시예 2에 도시된 바와 같이, 세포 샘플은 인간 부착 세포의 샘플일 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 배양물 중에서 성장되고, 상기 방법에서의 가공 및 사용을 위해 수확된다. 일반적으로, 세포 샘플은 적어도 약 400 μg의 단백질, 적어도 400 μg의 단백질, 적어도 500 μg의 단백질, 적어도 600 μg, 적어도 700 μg, 적어도 800 μg, 적어도 900 μg, 적어도 1000 μg, 적어도 1100 μg, 적어도 1200 μg, 또는 적어도 1300 μg의 단백질을 생성하기에 수적으로 충분해야 한다. 특정 구현예에서, 세포 샘플은 적어도 1200 μg의 단백질을 생성해야 한다.

다른 구현예에서, 본 방법에 사용하기 위한 세포 샘플은 적어도 300 μg의 막 단백질 및 적어도 700 μg의 세포기질 단백질을 생성한다. 소정의 구현예에서, 세포는 적어도 400 μg의 막 단백질 및 적어도 800 μg의 세포기질 단백질을 생성한다.

소정의 구현예에서, 본 방법에 사용하기 위한 세포 샘플은 적어도 2.5 x 10⁶개의 세포, 적어도 3.0 x 10⁶개의세포, 적어도 3.5 x 10⁶개의세포, 적어도 4.0 x 10⁶개의 세포, 적어도 4.5 x 10⁶개의 세포, 적어도 5.0 x 10⁶개의 세포, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 2.5 x 10⁶개의 세포가 본 방법에서 사용하기 위해 가공된다.

다른 경우에, 샘플은 세포를 함유하는 조직 샘플일 수 있다. 실시예 1 및 실시예 3에 도시된 바와 같이, 조직 샘플은 포유류(예를 들어, 마우스) 세포를 포함하는 연조직 샘플일 수 있다. 조직 샘플이 사용되는 구현예에서, 적어도 15 mg의 조직이 수득되어야 한다. 소정의 구현예에서, 적어도 25 mg, 적어도 30 mg, 적어도 35 mg, 적어도 40 mg, 적어도 45 mg 또는 적어도 50 mg의 조직이 가공된다. 특정 구현예에서, 적어도 20 mg의 조직이 가공된다. 일부 구현예에서, 15 mg 내지 80 mg의 조직이 가공되고, 20 mg 내지 80 mg의 조직, 20 mg 내지 70 mg의 조직, 20 mg 내지 60 mg의 조직, 20 mg 내지 50 mg의 조직, 20 mg 내지 40 mg의 조직, 25 mg 내지 45 mg의 조직, 25 mg 내지 35 mg의 조직, 또는 30 mg 내지 40 mg의 조직이 본 방법에 따라 가공에 사용된다. 일 구현예에서, 20 mg 내지 40 mg의 연조직이 가공된다. 특정 구현예에서, 약 30 mg의 조직이 본 방법에 따라 가공된다.

본 방법에서, 샘플을 가공하여 세포로부터 세포기질 분획을 분리하고, 세포로부터 막 분획을 분리한다. 본원에서 사용되는 용어 “세포기질 분획(cytosol fraction)” 또는 “세포질 분획(cytoplasmic fraction)”은, 예를 들어, 세포질, 단백질(당단백질 포함), 핵산, 펩티드, 당류 및 지방과 같은 분자를 포함하지만, 일반적으로 원형질 막 또는 핵 막과 같은 막에서 배타적으로 발견되는 세포의 요소를 포함하지 않는 세포의 일부분(또는 샘플 내 세포의 집합체)이다. 다양한 구현예에서, 용어 세포기질 분획은 세포의 세포질에서 발견되는 단백질 또는 펩티드 또는 당단백질 또는 당펩티드를 포함하지만, 본질적으로 세포의 막에서 일반적으로 발견되는 단백질 또는 펩티드가 없는 세포(들)의 일부분을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 “막 분획(membrane fraction)”은, 예를 들어 세포의 원형질 막 또는 핵 막과 같은 막 또는 이의 구획에서 일반적으로 발견되는 지질, 단백질(당단백질 포함), 펩티드, 및 당류를 포함하는 세포의 일부분(또는 샘플 내 세포의 집합체)이다. 다양한 구현예에서, 용어 막 분획은 당단백질 또는 당펩티드를 포함하여 세포의 막에서 발견되는 단백질 또는 펩티드를 포함하지만, 본질적으로 세포질 단백질 또는 펩티드가 없는 세포(들)의 일부분을 의미한다.

본 발명의 방법에 따르면, 세포기질 분획은 샘플을 가공함으로써 수득된다. 다양한 구현예에서, 가공은 샘플 내의 세포 막을 투과화시키는 세제가 포함된 투과화 용액과 샘플을 접촉시켜 세포로부터 세포기질 단백질을 방출시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 투과화 용액은 세포 막을 투과화시켜 세포 구획으로부터 세포기질 단백질을 방출시킬 수 있지만 막으로부터 막관통 단백질은 방출시키지 않을 정도로 충분히 순한(mild) 제1 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 하나 이상의 비이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비이온성 세제는, 예를 들어, 2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올 (Triton-X 100), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (노니데트 P-40, NP-40, IGEPAL CA-630), 폴리소르베이트 20(Tween-20), 또는 사포닌이다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 Triton-X 100을 포함한다. 다른 구현예에서, 투과화 용액은 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투과화 용액은 폴리소르베이트20(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투과화 용액은 사포닌, 즉 CAS 8047-15-2의 화학 물질 고유 번호(chemical abstract services reference number)를 갖는 트리테르펜 글리코시드를 포함한다. 일 양태에서, 투과화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 투과화 완충액이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

투과화 용액 중의 비이온성 세제의 농도는, 예를 들어 투과화 용액 중의 비이온성 세제의 유형 또는 수, 또는 투과화 용액의 추가 성분에 따라 달라질 수 있다. 본 방법에 따라 사용된 투과화 용액 중의 비이온성 세제의 농도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.05%~0.25%(w/v)의 비이온성 세제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.10%~0.20%(w/v)의 비이온성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.1%~0.15%의 비이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 투과화 용액은 0.15%~0.20%의 비이온성 세제를 포함한다. 일 구현예에서, 투과화 용액은 0.10%~0.20%의 비이온성 세제를 포함한다.

일부 구현예에서, 투과화 용액은 약 0.05%, 약 0.10%, 약 0.15%, 약 0.20%, 또는 약 0.25%의 비이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 투과화 용액은 0.10%의 비이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 투과화 용액은 0.20%의 비이온성 세제를 포함한다.

조직 샘플의 양 또는 세포의 양 당 사용되는 투과화 용액의 양은 투과화 용액의 조성, 샘플의 양, 샘플의 유형, 및/또는 예를 들어 조직 샘플의 물리적 상태(예를 들어, 경조직, 연조직, 탈수되었는지, 신선한지, 냉동되었는지)에 따라 달라진다. 그럼에도 불구하고, 본 방법에 사용된 투과화 완충액의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

생성된 투과화된 샘플은 세포기질 분획 및 막 분획의 혼합물 또는 환경(milieu)을 포함하는 용액으로 구성된다. 소정의 구현예에서, 용액은, 예를 들어 와동(vortexing) 또는 진탕(shaking)에 의해 혼합될 수 있다.

그런 다음, 이 용액을 원심분리하여 투과화된 세포의 펠릿, 및 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득한다. 소정의 구현예에서, 용액은 상청액으로부터 투과화된 세포의 펠릿을 분리하기에 충분한 시간 동안 약 16,000 g에서 원심분리된다. 일부 구현예에서, 용액은 약 16,000 g에서 적어도 10분, 적어도 8분, 적어도 6분, 또는 적어도 5분 동안 원심분리된다. 다른 구현예에서, 샘플은 약 16,000g에서 5분 내지 20분, 10분 내지 20분, 10분 내지 15분, 또는 12분 내지 18분 동안 원심분리된다.

특정 구현예에서, 용액은, 세포기질 분획을 함유하는 상청액으로부터 투과화된 세포의 펠릿을 분리하기 위해 16,000 g에서 15분 동안 원심분리된다.

세포의 단백질의 세포기질 분획으로 구성된 상청액은 피펫팅 또는 흡인과 같은, 당업자에 의해 공지된 수단에 의해 수집된다.

그런 다음, 투과화된 세포의 펠릿을 제2 세제가 포함된 가용화 용액과 접촉시켜 세포로부터 가용화된 막 단백질을 포함하는 현탁액을 형성한다.

일반적으로, 가용화 용액은 투과화된 세포로부터 막 단백질을 투과화할 수 있는 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 가용화 용액은 하나 이상의 이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이온성 세제는, 예를 들어, 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)이다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 SDS 및 데옥시콜산나트륨을 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 이온성 세제 SDS 및 데옥시콜산나트륨 뿐만 아니라, 예를 들어, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 및 다른 성분(예를 들어, 염화나트륨(NaCl) 및 트리스 HCl)과 같은 비이온성 세제를 포함한다.

일 구현예에서, 가용화 용액은 SDS를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 데옥시콜산나트륨을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 CHAPS를 포함한다. 하나의 경우에, 가용화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 가용화 완충액(Solubilization Buffer)이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

가용화 용액 중의 이온성 세제의 농도는, 예를 들어 가용화 용액 중의 세제의 유형 또는 수, 또는 가용화 용액의 추가 성분에 따라 달라질 수 있다. 본 방법에 따라 사용되는 가용화 용액 중의 이온성 세제의 농도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.05%~1.5%의 이온성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 용액의 0.1%~1.0%(w/v)의 농도로 이온성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.1%~0.5%의 이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.1%~0.2%의 이온성 세제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.2%~1.0%의 이온성 세제를 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.5%~1.0%의 이온성 세제를 포함한다.

소정의 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 또는 약 1.2%(w/v)의 이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 가용화 용액은 0.1%의 이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 가용화 용액은 0.2%의 이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 가용화 용액은 0.3%의 이온성 세제를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 가용화 용액은 0.4%의 이온성 세제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.5%의 이온성 세제를 포함한다. 여전히 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.6%의 이온성 세제를 포함한다. 다른 구현예에서, 가용화 용액은 0.7%의 이온성 세제를 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.8%의 이온성 세제를 포함한다. 여전히 또 다른 구현예에서, 가용화 용액은 약 0.9%의 이온성 세제를 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 약 1.0%의 이온성 세제를 포함한다.

예를 들어, 가용화 용액이 SDS를 포함하는 구현예에서, SDS의 농도는 약 0.1%~1.0%(w/v)일 수 있다. 가용화 용액이 데옥시콜산나트륨을 포함하는 구현예에서, 데옥시콜산나트륨의 농도는 약 0.5%~1.0%일 수 있다. 가용화 용액이 N-라우릴 사르코신을 포함하는 구현예에서, N-라우릴 사르코신의 농도는 약 0.5%~1.0%일 수 있다. 가용화 용액이 CHAPS를 포함하는 구현예에서, CHAPS의 농도는 약 0.2%~1.0%일 수 있다. 구현예에서, 가용화 용액이 SDS 및 데옥시콜산나트륨 뿐만 아니라 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, NaCl, 및 트리스 HCl을 포함하는 경우, 가용화 용액 중의 SDS의 농도는 약 0.1%이고, 가용화 용액 중의 데옥시콜산나트륨의 농도는 0.5%~1.0%이고, NaCl의 농도는 약 100~175 mM이며, 트리스 HCl의 농도는 중성 pH(예: pH 8)에서 약 25~75 mM이다.

조직의 중량 또는 세포의 양 당 사용되는 가용화 용액의 양은 샘플의 양, 샘플의 유형, 및/또는 예를 들어 조직 물리적 샘플의 상태(예를 들어, 경조직, 연조직, 탈수되었는지, 신선한지, 냉동되었는지)에 따라 달라진다. 그럼에도 불구하고, 본 방법에 사용되는 가용화 완충액의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

소정의 구현예에서, 가용화된 막 단백질의 현탁액은, 예를 들어 와동 또는 진탕에 의해 혼합될 수 있다.

그런 다음, 가용화된 막 단백질의 현탁액을 원심분리하여 펠릿, 및 막 분획을 포함하는 상청액을 수득한다. 소정의 구현예에서, 가용화된 막 단백질의 현탁액은 상청액으로부터 펠릿을 분리하기에 충분한 시간 동안 약 16,000 g에서 원심분리된다. 일부 구현예에서, 현탁액은 약 16,000 g에서 적어도 10분, 적어도 8분, 적어도 6분, 또는 적어도 5분 동안 원심분리된다. 다른 구현예에서, 현탁액은 약 16,000g에서 5분 내지 20분, 10분 내지 20분, 10분 내지 15분, 또는 12분 내지 18분 동안 원심분리된다.

특정 구현예에서, 가용화된 막 단백질의 현탁액은, 막 분획을 함유하는 상청액으로부터 펠릿을 분리하기 위해 16,000 g에서 15분 동안 원심분리된다.

세포의 단백질의 막 분획으로 구성된 상청액은 피펫팅 또는 흡인과 같은, 당업자에 의해 공지된 수단에 의해 수집된다.

세포기질 분획 및 막 분획의 질량 분광분석 .

본 방법에 따라 당단백질의 프로파일을 수득하기 위해 (즉, 막 분획으로부터 당단백질의 프로파일을 수득하고 세포기질 분획으로부터 당단백질의 프로파일을 수득하기 위해), 수집된 막 분획(들) 및 세포기질 분획(들)을 질량 분광분석에 의해 분석하여 질량 스펙트럼을 수득한다.

일부 구현예에서, 단백질의 막 분획 및/또는 단백질의 세포기질 분획의 질량 분광분석에 의해 식별된 당단백질의 프로파일은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다: 막 분획에서 단백질을 분해하여 막 분획으로부터 펩티드 단편의 샘플을 수득하는 단계 및/또는 세포기질 분획에서 단백질을 분해하여 세포기질 분획으로부터 펩티드 단편의 샘플을 수득하는 단계.

일부 구현예에서, 질량 스펙트럼 정보는 막 분획 또는 세포기질 분획 내의 단백질로부터 생성되는 당단백질 단편 또는 당펩티드 단편으로부터 수득된다. 예를 들어, 분획 중의 당단백질은, 예컨대 하나 이상의 프로테아제 및/또는 브롬화시안(cyanogen bromide)과 같은 화학 단백질 절단 시약에 의해 단편화될 수 있다. 단백질 단편화용으로 알려진 프로테아제의 비-포괄적인 목록은 다음을 포함한다: 트립신(Pro가 뒤에 위치하지 않는 한 은(argentine) 또는 리신에서 절단함), 키모트립신(Pro가 뒤에 위치하지 않는 한 Phe, Trp, 또는 Tyr 뒤에서 절단함), 엘라스타아제(Pro가 뒤에 위치하지 않는 한 Ala, Gly, Ser, 또는 Val 뒤에서 절단), 펩신(Phe 또는 Leu 뒤에서 절단함), 및 써몰리신(Pro가 앞에에 위치하지 않는 한 Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, 또는 Val 앞에서 절단함)을 포함한다. 단백질을 단편으로 분해하는 데 사용될 수 있는 프로테아제의 보다 포괄적인 목록은 Riviere와 Tempst.의 문헌[Curr Protoc Protein Sci. Vol. 0 pp. 11.1.1-11.1.19 (1995)]의 표 11.1.1 및 11.1.3에 제공되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

단백질은, 단백질분해 효소가 아닌 특정 화학 단백질 절단 시약으로 처리함으로써, 질량 분광분석에 적합한 더 작은 단편으로 분해될 수 있다. 예를 들어 G. Allen의 문헌[Sequencing of Proteins and Peptides, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9. Elsevier 1989] 3장을 참조한다. 이러한 화학 단백질 절단 시약은 브롬화시안, BNPS-스카톨, o-요오드소벤조산, 희석산(예를 들어, 희석 HCl) 등을 포함하만 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들어, 단백질은 브롬화시안에 의해 Met 잔기에서 절단되거나, 시안 후에는 Cys 잔기에서 절단되거나, BNPS-스카톨 또는 o-요오드소벤조산 등에 의해 Trp 잔기 뒤에서 절단될 수 있다. 단백질 단편은 HCl과 같은 희석 산에 노출됨으로써 생성될 수도 있다. 질량 분광분석에 의해 단백질 서열을 결정하기 위해 부분 산 가수분해를 사용하는 예가 Zhong 등에 의해 제공된다(Zhong H 등의 문헌[J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16(4):471-81, 2005], 그 전체가 참조로서 통합됨). Zhong 등의 전술한 문헌에서는 질량 분광분석에 의한 시퀀싱을 위해, 물 중 25% 트리플루오로아세트산을 이용한 마이크로파 보조 산 가수분해를 사용해 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin)을 단편화하였다. Wang N, 및 Li L.의 문헌[J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 21(9):1573-87, 2010]을 또한 참조하고, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

단백질은 하나의 프로테아제로 처리함으로써, 둘 이상의 프로테아제의 조합으로 치료함으로써, 화학 절단 시약으로 처리함으로써, 둘 이상의 화학 절단 시약으로 처리함으로써, 또는 프로테아제와 화학 절단 시약의 조합으로 처리함으로써 단편화될 수 있다. 반응은 승온 상태에서 또는 승압 상태에서 발생할 수 있다. 예를 들어 Lopez-Ferrer D 등의 문헌[J. Proteome. Res. 7(8):3276-81, 2008]을 참조한다(그 전체는 참조로서 통합됨). 단편화가 완료되는 것을 허용하여, 분해 시약에 의해 절단될 수 있는 모든 결합에서 단백질을 분해하거나; 의도적으로 단편화가 완료되지 않도록 분해 조건을 조정하여, 항체 가변 영역 서열을 해독하는 데 특히 유용할 수 있는 더 큰 단편을 생성하거나; 클레노브 단편(Klenow fragment)을 만들기 위해 대장균 DNA 중합효소 I로 수행한 것과 같이, 분해 조건을 조정하여 단백질을 도메인 내로 부분적으로 분해할 수 있다. 분해 수준을 조정하기 위해 변경할 수 있는 조건은 특히, 지속 기간, 온도, 압력, pH, 단백질 변성 시약의 부재 또는 존재, 특정 단백질 변성제(예: 우레아, 구아니딘 HCl, 세제, 산 절단성 세제, 메탄올, 아세토니트릴, 기타 유기 용매), 변성제의 농도, 절단 시약의 양 또는 농도 또는 분해 대상 단백질에 대한 상대 중량 비를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질을 절단하는 데 사용되는 시약(즉, 프로테아제 또는 화학 단백질 절단 시약)은 완전히 비특이적인 시약이다. 이러한 시약을 사용하면, 펩티드의 N-말단, 펩티드의 C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에서 아무런 제약이 없을 수 없다. 예를 들어, 펩티드 서열의 일 단부 또는 타 단부에서 (둘 다는 아님) 트립신 절단 부위를 갖도록 제한된, 부분적으로 단백질 분해된 서열이 본원에 기술된 다양한 방법에 사용될 수 있다.

소정의 구현예에서, 분해는 실시예 1에 기술된 것과 같은 필터 보조 샘플 제조(FASP: Filter Assisted Sample Preparation)에 의해 수행된다.

그런 다음, 다양한 구현예에서, 당질화되지 않은 단백질을 각 분획 내 당단백질로부터 분리하기 위해 세포기질 분획(들) 및 막 분획(들)으로부터 수득된 단백질 단편 또는 단백질을 분획화함으로써, 세포기질 단편 또는 당펩티드 단편에 대해 질량 분광분석으로 분석할, 세포기질 분획 및 막 분획 각각의 샘플 및 단백질이 “풍부”해질 수 있다.

소정의 경우에, 단백질의 세포기질 분획 또는 단백질의 막 분획 유래의 펩티드 단편은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC), 렉틴 친화도 크로마토그래피, 또는 하이드라지드 포획을 통해 당펩티드로부터 당질화되지 않은 펩티드를 분리함으로써 풍부해진다. 특정 구현예에서, 세포기질 분획 유래의 펩티드 단편의 샘플은 HILIC에 의해 풍부해진다.

실시예 1에 나타낸 바와 같이, 예시적인 구현예에서, 단백질의 막 분획(들) 및 세포기질 분획(들) 유래의 펩티드 단편은 HILIC에 의해 풍부해진다. 여기서, 세포기질 분획 및 막 분획으로부터의 펩티드 단편은 아미드 컬럼 상에서 개별적으로 분리하고, 막 분획 및 세포기질 분획 유래의 단백질의 각각의 분리된 하위집합(분획)을 수집하였다. 그런 다음, 당질화된 펩티드 단편을 함유하는 하위집합을 추가 사용을 위해 단리하였다.

일부 구현예에서, 본 방법은 당단백질 또는 당펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 샘플을 접촉시킴으로써 단백질의 세포기질 분획 유래의 당펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 방출된다. 또 다른 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 샘플을 접촉시킴으로써 단백질의 막 분획 유래의 당펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 방출된다.

특정 구현예에서, N-결합된 글리칸은 펩티드-N-글리코시다아제 F(PNGase F)에 의해 당펩티드 단편 또는 당단백질로부터 방출된다.

본 개시의 방법은 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 당단백질의 양 또는 유형을 식별하고/하거나 정량화하는 데 사용될 수 있다. 당단백질 또는 당펩티드 단편을 식별하고 정량화하는 데 특히 유용한 방법은 질량 분광분석(MS)이다. 본 개시의 방법은, 예를 들어 MS 분석을 사용하여, 정성적으로 당단백질 또는 당펩티드 단편을 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 당펩티드 단편은, 예를 들어 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의한 정량적 분석을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 마커를 사용하여 표지될 수 있다.

구현예에서, 당단백질 또는 당펩티드 단편의 정량적 분석이 필요한 경우, 세포기질 분획 및 막 분획 내의 당단백질 또는 당펩티드 단편이 검출 가능한 마커로 표지된다. 예를 들어, 본 방법에서 사용하기에 적합한 검출 가능한 마커는 2개의 분획에서 폴리펩티드를 (차별적으로) 식별하는데 사용될 수 있는 상이한 질량의 화학적으로 동일한 시약이 생성될 수 있도록, 동위원소를 혼입하는 데 적합한 화학적 성질을 갖는 화학적 모이어티이다.

동위원소는 전통적으로 다수의 화학적, 효소적, 및 대사 표지 방법에 의해 펩티드 및 단백질에 혼입되어 왔다. 동위원소 표지를 위한 효소적 방법은 일반적으로¹⁸O-표지된 물에서 트립신을 분해함으로써 펩티드 카르복시 말단에 ¹⁸O 동위원소를 첨가한다. 안정한 동위원소는 세포 배양물(안정적 동위원소 세포 배양물, SILAC) 중의 단백질에 대사적으로 혼입될 수 있다. SILAC 방법은 중동위원소-표지된 아미노산 또는 비-중동위원소-표지된 아미노산, 즉, 비표지된 아미노산 또는 가벼운 아미노산을 단백질에 대사적으로 혼입한다. 사용될 수 있는 중동위원소는 ¹³O, ¹⁵N, ⁷⁴Se, ⁷⁶Se, ⁷⁷Se, ⁷⁸Se, ⁸²Se, ¹⁸O, 및 ²H와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 안정한 동위원소이다. 동위원소의 대사적 혼입에 사용된 예시적인 SILAC 기술은, 중동위원소-표지된 아미노산으로 보충된 배지로 배양된 대장균(E. coli)을 사용하여 동위원소-표지된 단백질 또는 연결된 폴리펩티드(QConCat)를 발현한다.

또 다른 일반적인 표지 방법은 절대 정량화(AQUA) 방법에 화학적으로 합성된 동위원소 표지된 펩티드를 사용하는 것이다. AQUA 방법은 분석 대상인 생물학적 샘플에 알려진 양의 동위원소 표지된 펩티드를 도입하여, 표지되지 않은 펩티드의 상대적 정량화를 허용한다. 절대 정량화는 안정한 동위원소 표지된 펩티드를 사용해 표준 곡선을 생성하는, 고전적인 동위원소 희석 측정에 의해 달성될 수 있다.

예를 들어, 동중원소 태그(isobaric tag) 또는 동위원소 태그(즉, 검출 가능한 마커)는 하나 이상의 원자에서 안정한 동위원소의 혼입을 허용하는 적절한 조성을 갖는다. 특히 유용한 안정한 동위원소 쌍은 수소 및 중수소이며, 이는 질량 분광분석을 사용하여 각각 경량 및 중량 형태로서 쉽게 구별될 수 있다. 중량 및 경량 형태가 질량 분광분석을 사용하여 구별될 수 있는 한, ¹³C,¹⁵N,¹⁷O,¹⁸O 또는³⁴S와 같은 다수의 동위원소 원자 중 어느 하나가 동위원소 태그에 혼입될 수 있다. 다른 예시적인 동위원소 태그, 예컨대 Gygi 등에 의해 기술된 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민계 링커 및 이의 관련 중수소화된 형태, 2,2′,3,3′,11,11′,12,12′-옥타듀테로-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 등도 당업자에게도 알려져 있을 것이다(Gygi 등의 문헌[Nature Biotechnol. 17:994-999 (1999)], 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨).

대안적으로, 동위원소 또는 동중원소 화학 태그, 예를 들어, 동위원소 디메틸화, iCAT, iTRAQ, 또는 TMT 시약을 사용해 샘플 또는 분획 중의 펩티드를 표지하여 상대 정량화를 위한 내부 기준 펩티드 표준을 생성할 수 있다. 이들 방법은 펩티드 및/또는 단백질에 화학적 태그를 접합 및/또는 공유 부착한다.

펩티드 동위원소 표지 및 단백질 동위원소 표지 모두는 상대 및 절대 MS 정량화에 적용 가능하다.

실시예 1에 나타낸 바와 같이, 샘플의 세포기질 분획(들) 및 막 분획(들) 유래의 단백질 및/또는 펩티드 단편을 Tandem Mass Tag™(TMT) 시스템(Thermo Scientific™)을 사용하여 표지하였다. 사용된 예시적인 검출 가능한 표지(Tandem Mass Tag)는 펩티드의 1차 아민(-NH2 기) 또는 리신 잔기를 공유적으로 표지하는 동중원소 검출 가능한 마커이다. 예시적인 동중원소 검출 가능한 마커는, 샘플 식별 및 펩티드의 정량화를 위해 질량 분광분석에서 검출할 수 있는 중동위원소를 함유한다.

당단백질을 프로파일링하는 본 발명의 방법은, 샘플의 세포기질 분획 및 막 분획의 각각으로부터 수득된 펩티드 단편의 질량 분광분석을 수행하여 막 분획에서 당단백질의 프로파일 및/또는 막 분획에서의 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다.

질량 스펙트럼 정보는 수집된 분획 또는 이로부터 생성된 펩티드 단편의 질량 분광분석에 의해 수득될 수 있다. 질량 분광계는 이온화된 개별 분자의 질량 대 전하(m/z) 비를 측정할 수 있는 기기로서, 연구원들이 미지의 화합물을 식별하고, 알려진 화합물을 정량화하고, 분자의 구조 및 화학적 특성을 설명할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 샘플을 단리하고 기기 상에 로딩함으로써 질량 분광분석이 시작된다. 로딩 후, 샘플을 증발시킨 다음 이온화한다. 이어서, 이온을 자기장에 노출시킴으로써 질량 대 전하 비에 따라 분리한다. 일부 구현예에서, 섹터 기기(sector instrument)가 사용되며, 이온은, 이온이 기기의 전자기장을 통과할 때, 이온의 질량 대 전하 비와 직접적으로 상관되는, 이온 궤적의 편향 크기에 따라 정량화된다. 다른 구현예에서, 이온 질량 대 전하 비는 이온이 사중극자를 통과할 때 측정되거나, 3차원 또는 선형 이온 트랩 또는 Orbitrap에서, 또는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량분광계(Fourier transform cyclotron resonance mass spectrometer)의 자기장에서 이들의 움직임에 기초하여 측정된다. 기기는 각 이온의 상대 풍부도를 기록하며, 이는 원래 샘플의 화학적 조성, 분자 조정, 및/또는 동위원소 조성을 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 비행 시간(time-of-flight) 기기가 사용되는데, 이는 전기장을 사용해 동일한 전위를 통해 이온을 가속시키고, 각각의 이온이 검출기에 도달하는 데 까지 걸린 시간을 측정한다. 이러한 접근법은 각 이온의 전하가 균일하다는 것에 의존하므로, 각 이온의 동역학 에너지는 동일할 것이다. 이 시나리오에서 속도에 영향을 미치는 유일한 변수는 질량이며, 이온이 가벼울수록 더 빠른 속도로 이동하여 결과적으로 검출기에 더 빨리 도달한다. 생성된 데이터는 질량 스펙트럼 또는 히스토그램, 강도 대 질량-대-전하 비로 표시되며, 피크는 이온화된 단백질 또는 펩티드 단편을 나타낸다.

질량 분광분석 단계가 수행된 후, 샘플 또는 이의 분획에 대한 다수의 질량 스펙트럼이 생성된다. 그러나, 질량 분광계로 분석되는 분획 또는 샘플 내에 정말 많은 상이한 당단백질, 글리칸, 글리코사이트 및/또는 당펩티드가 있고, 이들 각각이 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 감안할 때, 실제 당단백질, 글리칸 조성, 및 당펩티드는 식별하기 어려울 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 서열의 예측 질량 스펙트럼과 상관될 단백질/펩티드의 데이터베이스 또는 검색 엔진(예: UNIPROT 데이터베이스) 및 글리칸 및/또는 글리칸 및/또는 당단백질 검색 엔진(예: Byonic™ 또는 SimGlycan)을 통해 실제 질량 스펙트럼 데이터를 비교하거나 검색하여 당단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 수득하는 단계를 포함한다.

보다 구체적으로, 데이터베이스 또는 검색 엔진의 예측 질량 스펙트럼 정보를 위에서 생성된 실제 당단백질 또는 당펩티드 단편으로부터 관찰된 질량 스펙트럼 정보와 상관시킴으로써, 식별된 실제 질량 스펙트럼에 상응하는 데이터베이스 내 당단백질, 글리칸, 당펩티드, 또는 글리코사이트를 선택할 수 있다.

“상관(correlating)”이란, 본 방법에 따라 제조된 세포기질 및/또는 막 분획 중의 펩티드 단편 또는 당단백질로부터 유래된 관찰된 질량 스펙트럼 정보, 및 데이터베이스로부터 유래된 예측 질량 스펙트럼 정보를 상호 참조하고 서로에 대해 비교함으로써, 세포기질 및/또는 막 분획 중의 펩티드 단편 또는 당단백질에 상응하는 펩티드 단편 또는 당단백질을 데이터베이스로부터 식별하거나 선택할 수 있게 하는 것을 의미한다.

특정 구현예에서, 상관 방법은 세포기질 또는 막 분획으로부터 기록된 질량 스펙트럼을 예측 스펙트럼 정보와 비교하여 일치를 식별하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 기록된 스펙트럼 각각을 데이터베이스로부터 유래된 예측 질량 스펙트럼의 집합체에 대해 검색할 수 있으며, 여기서 각각의 예측 스펙트럼은 데이터베이스의 펩티드 서열 또는 글리칸과 식별 가능하게 연관되어 있다. 일치가 발견되면(즉 기록된 질량 스펙트럼이 예측 질량 스펙트럼과 일치하면), 각각의 예측 질량 스펙트럼이 데이터베이스 내의 펩티드 서열과 식별 가능하게 연관되기 때문에, 기록된 질량 스펙트럼이 이의 일치 펩티드 서열을 발견했다고 말하며, 이러한 일치는 본원에서 “펩티드 스펙트럼 일치” 또는 “PSM”으로도 지칭된다. 검색 및 일치 대상 스펙트럼의 수가 많기 때문에, 이러한 검색 및 일치 방법은, 각각의 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및/또는 당질화 부위를 식별하기 위해 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스, Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스, Byonic™ 인간 글리칸 데이터베이스, 및/또는 Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스와 같은 컴퓨터 실행 함수 및 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.

일부 구현예에서, 당단백질 프로파일은 당단백질의 목록을 식별한다. 소정의 구현예에서, 당단백질 프로파일은 다음 특성 중 하나 이상을 식별한다: 당질화 부위, 분획 내 당단백질의 양, 글리칸 조성물, 또는 당단백질의 풍부도.

추가의 구현예에서, 당단백질을 프로파일링하는 상기 방법은 단백질체 데이터베이스를 대상으로 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터를 검색하여 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획에 대한 당단백체 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질체 데이터베이스는 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스 또는 Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스이다.

일 구현예에서, 세포 샘플은 인간 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스에서 검색된다.

또 다른 구현예에서, 세포 샘플은 쥣과 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는 Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스에서 검색된다.

다양한 구현예에서, 당단백질을 프로파일링하는 단계는 단백질체 데이터베이스 및 글리칸 데이터베이스를 대상으로 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 기록된 질량 스펙트럼 데이터를 검색하여 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획에 대한 당단백체 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 세포 샘플은 인간 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는, 각각의 분획에서 글리코펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및 당질화 부위를 식별하기 위해, Byonic™ 인간 글리칸 데이터베이스와 같은 Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스 및 인간 글리칸 데이터베이스에서 검색된다. (실시예 2 참조).

또 다른 구현예에서, 세포 샘플은 쥣과 세포를 포함하고, 단백질의 세포기질 분획 및/또는 단백질의 막 분획의 질량 스펙트럼 데이터는, 각각의 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및/또는 당질화 부위를 식별하기 위해, Uniprot 쥣과 단백질체 데이터베이스 및 쥣과 글리칸 데이터베이스, 예를 들어 Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스에서 검색된다. (실시예 3 참조).

“고유 수(unique number of)”란, 분획 또는 샘플에서 관찰된 구별되는 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸, 및/또는 당단백질의 수를 의미한다.

샘플들 또는 이의 제제들 간의 단백질 변동을 검출하기 위한 방법.

본 개시는 또한, 본 방법이 모든 샘플 또는 모든 샘플 제제에 대한 단백질의 변동성을 결정하는 데 사용될 수 있음을 인식한다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 단일 공정에서 세포기질 및 세포막으로부터 당단백질을 일관되게 단리한다는 것을 보여주었으며, 예를 들어 모든 샘플 또는 이의 제제에 대해 단백질 생산, 단백질 위치, 또는 단백질의 번역 후 변형에 있어서 변동이 존재하는 지 여부를 결정하기 위해 이러한 방법이 사용됨을 확인하였다.

따라서, 본 개시의 또 다른 양태에서, 샘플 또는 샘플의 제제 간의 단백질 변동을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 단백질 변동을 검출하기 위한 상기 방법은 (a) 세포가 포함된 제1 샘플의 세포로부터 단백질의 세포기질 분획을 단리하고, 상기 세포로부터 단백질의 막 분획을 단리하기 위해 제1 샘플을 가공하는 단계, 및 (b) 세포로 구성된 제2 샘플의 세포로부터 단백질의 세포기질 분획을 단리하고 단백질의 막 분획을 단리하기 위해 제2 샘플을 가공하는 단계, 및 (c) 제1 샘플의 세포의 세포기질 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하고 막 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하기 위해 제1 샘플의 세포기질 및 막 분획 내 단백질을 분해하는 단계, 및 (d) 제2 샘플의 세포의 세포기질 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하고 막 분획으로부터 펩티드 단편을 수득하기 위해 제2 샘플의 세포기질 및 막 분획 내 단백질을 분해하는 단계, 및 (e) (검출 가능한 마커로) 제1 샘플의 세포기질 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 제2 샘플의 세포기질 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 표지된 세포기질 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 (또는 이들의 제제의) 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 수득하는 단계, 및 (f) 검출 가능한 마커로) 제1 샘플의 막 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 제2 샘플의 막 분획 내 펩티드 단편을 표지하고, 표지된 막 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 표지된 막 펩티드 분획의 혼합물을 수득하는 단계, 및 (g) 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물에서 세포기질 펩티드 단편을 검출하고, 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물에서 막 펩티드 단편을 검출하여, 제1 샘플 및 제2 샘플 간에 세포기질 단백질 및/또는 막 단백질의 총량에 임의의 변동이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

세포기질 및 막 분획은 본원에 기술된 바와 같이 조달된다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 세포기질 분획은 샘플을 가공함으로써 수득된다. 다양한 구현예에서, 가공은 샘플 내의 세포 막을 투과화시키는 제1 세제가 포함된 투과화 용액과 샘플을 접촉시켜 세포로부터 세포기질 단백질을 방출시키는 단계를 포함한다.

다양한 구현예에서, 가공은 샘플 내의 세포 막을 투과화시키는 세제가 포함된 투과화 용액과 샘플을 접촉시켜 세포로부터 세포기질 단백질을 방출시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투과화 용액은 세포 막을 투과화시켜 세포 구획으로부터 세포기질 단백질을 방출시킬 수 있지만 막으로부터 막관통 단백질은 방출시키지 않을 정도로 충분히 순한(mild) 제1 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 하나 이상의 비이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비이온성 세제는, 예를 들어, 2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올 (Triton-X 100), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (노니데트 P-40, NP-40, IGEPAL CA-630), 폴리소르베이트 20(Tween-20), 또는 사포닌이다. 소정의 구현예에서, 투과화 용액은 Triton-X 100을 포함한다. 다른 구현예에서, 투과화 용액은 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투과화 용액은 폴리소르베이트20(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 투과화 용액은 사포닌, 즉 CAS 8047-15-2의 화학 물질 고유 번호(chemical abstract services reference number)를 갖는 트리테르펜 글리코시드를 포함한다. 일 양태에서, 투과화 용액은 Mem-PER™ 막 Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Scientific™)에 기술된 투과화 완충액이며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

조직의 중량 또는 세포의 양 당 사용되는 투과화 용액의 양은 샘플의 양, 샘플의 유형, 및/또는 예를 들어 조직 물리적 샘플의 상태(예를 들어, 경조직, 연조직, 탈수되었는지, 신선한지, 냉동되었는지)에 따라 달라진다. 그럼에도 불구하고, 본 방법에 사용된 투과화 완충액의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

생성된 투과화된 샘플(들)은 세포기질 분획 및 막 분획의 혼합물 또는 환경을 갖는 용액을 포함한다. 소정의 구현예에서, 용액은, 예를 들어 와동(vortexing) 또는 진탕(shaking)에 의해 혼합될 수 있다.

특정 구현예에서, 용액은, 세포기질 분획을 함유하는 상청액으로부터 투과화된 세포의 펠릿(들)을 분리하기 위해 16,000 g에서 15분 동안 원심분리된다.

그런 다음, 투과화된 세포의 펠릿(들)을 제2 세제가 포함된 가용화 용액과 접촉시켜 세포로부터 가용화된 막 단백질을 포함하는 현탁액을 형성한다. 일반적으로, 가용화 용액은 투과화된 세포로부터 막 단백질을 가용화할 수 있는 세제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 가용화 용액은 하나 이상의 이온성 세제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이온성 세제는, 예를 들어, 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)이다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 SDS 및 데옥시콜산나트륨을 포함한다. 일 구현예에서, 가용화 용액은 이온성 세제 SDS 및 데옥시콜산나트륨 뿐만 아니라, 예를 들어, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 및 다른 성분(예를 들어, 염화나트륨(NaCl) 및 트리스 HCl)과 같은 비이온성 세제를 포함한다.

샘플들 간 또는 샘플 제제들 간의 단백질 변동를 검출하는 방법은 각각의 분획을 (예컨대 검출 가능한 마커로) 표지하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 표지하는 단계는 검출 가능한 마커와 샘플 또는 이의 제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 세포기질 분획의 각각은 동일하거나 상이한 검출 가능한 마커로 표지될 수 있다. 하나의 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 세포기질 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 상이하다. 일부 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 세포기질 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 동일하다. 소정의 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 막 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 상이하다. 일부 경우에, 세포의 제1 및 제2 샘플로부터 수득된 막 분획 각각에 대한 검출 가능한 마커는 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 세포액 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커는 서로 상이하며, 동일한 검출 가능한 마커는 세포의 제1 및 제2 샘플의 막 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 각각의 세포기질 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커는 각각의 막 분획에서 펩티드 단편을 표지하는 데 사용되는 검출 가능한 마커와 동일하다.

일부 구현예에서, 표지하는 단계는 1차 아민(-NH2 기) 및/또는 리신 잔기를 공유적으로 표지하는 동중원소 검출 가능한 마커와 펩티드 단편 또는 단백질을 접촉시키는 것을 포함한다. 소정의 구현예에서, 동중원소 검출 가능한 마커는, 샘플 식별 및 펩티드의 정량화를 위해 질량 분광분석에서 검출할 수 있는 중동위원소를 함유한다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드는 Thermo Scientific™ Tandem Mass Tag(TMT) Sytem (Thermo Scientific™)에 기술된 것과 같은 동중원소 검출 가능한 마커로 표지되며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

전술한 바와 같이, 다양한 구현예에서, 샘플 또는 샘플 제조로부터 분해된 펩티드의 표지된 세포기질 분획을 조합하였다. 예를 들어, 인간 부착 세포 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 막 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플 또는 이의 제제 유래의 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물을 수득하였다. 추가로, 인간 부착 세포 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 세포기질 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플 또는 이의 제제 유래의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 수득하였다. (실시예 4 참조).

또 다른 구현예에서, 마우스 간 조직 샘플 또는 이의 제제로부터 수득한 연조직 유래의 분해된 단백질의 TMT 표지된 분획을 조합하였다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 마우스 간으로부터 수득한 연조직 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 막 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플 또는 이의 제제 유래의 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물을 수득하였다. 추가로, 마우스 간으로부터 수득한 연조직 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 세포기질 분획을 혼합하여 제1 및 제2 샘플 또는 이의 제제 유래의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 수득하였다.

다른 구현예에서, 검출 가능한 마커는 바이신코닌산(BCA)의 존재 하에 펩티드 결합 및 아미노산(즉, 시스테인, 시스틴, 트립토판, 및 티로신)의 존재를 식별하는 것들과 같은 측색 마커이다. 이러한 구현예에서, 각 샘플의 각각의 분획 유래의 표지된 단백질은 562 nm에서 가시광 분광 광도계 상에서 검출된다. 샘플 내 총 단백질의 검출 및 정량화를 위한 BCA 검정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 하나의 이러한 BCA 검정은, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 통합된 BCA™ Protein Assay Kit(Pierce™)에 제시된 것과 같은 BCA™ 단백질 검정이다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은 표지된 세포기질 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계, 및 표지된 막 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플의 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 표지된 세포기질의 혼합물에 대해 질량 분광분석을 수행하여 제1 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일 및 제2 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하되, 상기 프로파일 각각은 임의로 당질화 부위, 글리코펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 포함된 당단백질의 목록을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 당단백질 또는 펩티드 단편의 풍부한 샘플로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 혼합물을 접촉시킴으로써 세포기질 펩티드 단편의 혼합물의 풍부한 펩티드 단편 샘플로부터 방출된다. 또 다른 구현예에서, 글리칸은 아미다아제와 같은 글리코시다아제와 혼합물을 접촉시킴으로써 풍부한 막 펩티드 단편의 혼합물로부터 방출된다.

소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 혼합된 세포기질 분획 및 막 분획 각각으로부터 수득된 펩티드 단편의 질량 분광분석을 수행하여 당단백질 프로파일을 수득하도록 구성될 수도 있다.

질량 스펙트럼 정보는 전술한 것과 같이, 수집된 분획 또는 이로부터 생성된 펩티드 단편의 질량 분광분석에 의해 수득될 수 있다.

실시예

실시예 1. 물질 및 방법.

샘플 가공. 인간 부착 세포 샘플로부터 단백질 추출. 인간 K562 골수 세포(ATCC® CCL-243™)를 제조자 프로토콜에 따라 세포 배양 배지에서 충분히 성장시켰다. 2.5×10⁶개의 K562 세포를 수확하고, 5 mL의 1x 인산염 식염수 완충액(PBS)에 재현탁하고, 300 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 생성된 세포 펠릿을 2 mL의 세포 세척액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)으로 세척하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1.5 mL의 세포 세척액에 재현탁하였다. 생성된 혼합물을 2 mL 원심분리관에 옮기고 300 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 0.4 mL의 투과화 완충액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)을 첨가하고, 세포 펠릿과 투과화 완충액을 와동시켜 균질한 현탁액을 생성하였다. 그런 다음, 현탁액을 4℃에서 10분 동안 일정하게 혼합하면서 인큐베이션하여 투과화된 세포로부터 세포기질 단백질을 방출시켰다. 그런 다음, 투과화된 세포의 균질한 현탁액을 16,000 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 투과화된 세포 유래 단백질의 세포기질 분획을 함유하는 상청액을 수집하고 새로운 수용기에 옮겼다.

K562 세포 샘플로부터 단백질의 막 분획을 수득하기 위해, 투과화된 세포의 펠릿을 0.25 mL의 가용화 완충액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)에 재현탁하고 피펫팅에 의해 혼합하였다. 그런 다음, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 일정하게 혼합하면서 인큐베이션하여 가용화된 막 단백질을 용액으로 방출시켰다. 그런 다음, 현탁액을 16,000 × g에서 15분 동안 원심분리하고, 세포 유래 단백질의 막 분획을 함유하는 상청액을 수집하고 새로운 수용기에 옮겼다.

쥣과 간 (연질) 조직 샘플로부터 단백질 추출. 약 30 mg의 마우스 연조직을 5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 4 mL의 세포 세척액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)으로 세척하고, 잠깐 동안 와동하고, 세포 세척액은 버렸다. 간 조직 샘플을 작은 조각으로 절단하여 2 mL 조직 분쇄관에 옮겼다. 1 mL의 투과화 완충액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)을 첨가하고, 샘플을 균질화시켜 균일한 현탁액을 수득하였다. 1 mL의 투과화 완충액을 현탁액에 첨가하고, 균질한 현탁액을 새로운 튜브에 옮기고, 4℃에서 10분 동안 일정하게 혼합하면서 인큐베이션하여 투과화된 세포로부터 세포기질 단백질을 방출시켰다. 그런 다음, 투과화된 세포의 균질한 현탁액을 16,000 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 간 세포 유래 단백질의 세포기질 분획을 함유하는 상청액을 수집하고 새로운 수용기에 옮겼다.

연 조직 샘플로부터 단백질의 막 분획을 수득하기 위해, 투과화된 간 세포의 펠릿을 1.0 mL의 가용화 완충액(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo Scientific™)에 재현탁하고 피펫팅에 의해 혼합하였다. 그런 다음, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 일정하게 혼합하면서 인큐베이션하여 가용화된 막 단백질을 용액으로 방출시켰다. 그런 다음, 현탁액을 16,000 × g에서 15분 동안 원심분리하고, 간 세포 유래 단백질의 막 분획을 함유하는 상청액을 수집하고 새로운 수용기에 옮겼다.

부착 세포 샘플 또는 연 조직 샘플로부터 수득된 단백질의 세포기질 분획 및 막 분획을, 분획에서 단백질 함량을 확인하기 위해, 각각의 분획에서 총 단백질의 비색 검출 및 정량화를 위한 바이신코닌산(BCA) 단백질 검정을 제조자 프로토콜(BCA™ Protein Assay Kit, Pierce™, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨)에 따라 수행하였다.

단백질 분해. 위에서 수득한 K562 세포기질 분획 유래의 800 μg의 세포기질 단백질 및 K562 세포기질 분획 유래의 400 μg의 막 단백질을 다음과 같이 분해하였다.

추가로, 간 조직의 세포기질 분획으로부터의 400 μg의 세포기질 막 단백질 및 쥣과 간 연조직 샘플로부터 수득한 막 분획으로부터의 400 μg의 막 단백질을 다음 프로토콜에 따라 분해하였다.

모든 단백질 분획을 필터 보조 시료 제조(FASP)에 의해 분해하였다. 간략하게, 0.5 M 디티오트레이톨(DTT) 용액을 첨가하고 57℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 각 분획 내의 단백질을 감소시켰다. 100 mM 트리스 HCl 중 200 μl의 8M 우레아 용액을 첨가하여 Microcon-30 Ultracel 필터(EMD Millipore™)를 평형화시키고 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하였다. 각각의 단백질 분획을 적절히 표지된 필터 상에 로딩하고, 14,000 x g에서 20℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 다음으로, 100 μl의 6 mM 요오드아세트아미드를 각 필터에 첨가하고, 600 rpm에서 1분 동안 혼합하고, 암소에서 30분 동안 혼합하지 않고 인큐베이션하였다. 그런 다음, 각 필터를 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하고, 100 μl의 8M 우레아 용액을 각 필터에 첨가하고, 각 필터를 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 다음으로, 100 μl의 100 mM 중탄산암모늄을 각 필터에 첨가하고, 각 필터를 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 트립신 프로테아제를 100 mM 중탄산암모늄에서 희석하여 1:100 비율의 효소 대 단백질을 수득하였다. 50 μl 프로테아제 용액을 각 필터에 첨가하고 600 rpm에서 1분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 각각의 필터(분획)를 실온에서 밤새 인큐베이션하여 막 단백질 및 세포기질 단백질을 각각의 분획에서 분해하였다.

그런 다음, 필터를 새로운 수집 튜브에 옮기고 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 분해된 단백질(펩티드 단편)을 50 μl의 0.5 M NaCl을 사용하여 각 필터로부터 용리시켰다. 각각의 용리액을 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이 단계를 반복하여 펩티드 단편 수율을 증가시켰다. 펩티드 용리액을 0.2% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용해 산성화시키고, C18 Sep-Pak® 컬럼 크로마토그래피(Flinn Scientific)를 사용해 탈염하였다.

펩티드의 표지화. 질량 분광분석에 의한 당단백질의 정량적 분석을 위한, 제조사의 프로토콜에 따라 Tandem Mass Tag™(TMT) 시스템(Thermo Scientific™)을 사용하여 펩티드를 표지하였다. 간략하게, 무수 에탄올에서 재구성한 41 μL의 TMT 표지 시약(Thermo Scientific™)을 위에서 수득한 분해된 펩티드의 각 분획에 첨가하였다. 사용된 예시적인 검출 가능한 마커(Tandem Mass Tag)는 펩티드의 1차 아민(-NH2 기)를 공유적으로 표지하는 동중원소 검출 가능한 마커이다. 동중원소 검출 가능한 마커는, 샘플 식별 및 펩티드의 정량화를 위한 질량 분광분석에서 검출할 수 있는 중동위원소를 함유한다. 분해된 펩티드 분획과 표지의 각 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 8 μL의 5% 하이드록실아민을 각 혼합물에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션하여 반응물을 퀀칭시켰다.

필요에 따라, 접착 세포 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 세포기질 분획은 본 방법의 소정의 양태에서 사용하도록 조합하였다. 필요에 따라, 접착 세포 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 막 분획은 본 방법의 소정의 양태에서 사용하도록 조합하였다.

필요에 따라, 마우스 간으로부터 수득한 연조직 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 세포기질 분획은 본 방법의 소정의 양태에서 사용하도록 조합하였다. 필요에 따라, 마우스 간으로부터 수득한 연조직 샘플 유래의 분해된 펩티드의 TMT 표지된 막 분획은 본 방법의 소정의 양태에서 사용하도록 조합하였다.

인큐베이션 후, 각각의 표지된 분해된 펩티드 분획을 C18 Sep-Pak® 컬럼 크로마토그래피(Flinn Scientific)를 사용하여 탈염하고, 과량을 표지를 제거하였다.

이온-페어링 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)에 의한 세포기질 및 막의 분해된 펩티드의 분획화. 여기서, 세포기질 펩티드 단편 샘플 또는 막 펩티드 단편 샘플 유래의 분해된 펩티드를, 분획 수집기(ACQUITY UPLC^® System, Waters Inc.)가 구비된 Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 TSKgel® Amide-80 HR HPLC 컬럼(Sigma Aldrich®) 상에서 개별적으로 분획화하였다. 세포기질 또는 막 펩티드의 분획을 구배 분리 전체에 걸쳐 1분마다 수집하였다. 분해된 펩티드의 각 세포기질 및 막 샘플에 대한 분획 19~36을 당질화된 펩티드 단편에서 풍부하게 함으로써, 추가 분석을 위해 분리하였다.

질량 분광분석 및 당단백질체 스펙트럼 분석. 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편의 각 분획을 UltiMate™ 3000 RSLCnano(Thermo Scientific™) 저속 액체 크로마토그래피시스템을 사용하여 25 cm Acclaim™ PepMap™ C18 액체 크로마토그래피 컬럼(Thermo Scientific™) 상에 로딩하고 Q Exactive™ HF-X 질량 분광분석기(ThermoScientific™) 내로 용리하였다.

당질화된 펩티드 단편의 각 분획에 대한 원시 질량 스펙트럼 데이터를 Proteome Discoverer™ 2.2. 소프트웨어(Thermo Scientific™)를 사용해 Byonic™ 질량 분광분석 검색 엔진 및 데이터베이스에 대해 비교하여 당단백질을 식별하고 정량화하였다. 분석을 위해, 펩티드 질량 내성을 MS1의 경우 10 ppm으로, MS2의 경우 20 ppm으로 유지하였다.

전술한 부착 KK562 샘플과 같은 인간 세포 샘플의 경우, Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스에 대해 질량 스펙트럼 데이터를 검색하였고, Byonic™ 인간 글리칸 데이터베이스를 사용하여 각 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및 글리코실화 부위를 식별하였다.

전술한 마우스 간 조직 샘플과 같은 쥣과 세포 샘플의 경우, Uniprot 마우스 단백질체 데이터베이스에 대해 질량 스펙트럼 데이터를 검색하였고, Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스를 사용하여 각 분획에서 당펩티드, PSM, 당단백질, 글리칸 조성, 및 글리코실화 부위를 식별하였다. 각각의 경우에, Byonic™ 펩티드 점수 <300 및 Byonic™ Log 확률 점수 <2로 식별된 펩티드는 제외하였다.

실시예 2. 부착 인간 세포의 전세포 당단백질 프로파일링.

인간 K562 골수 세포(ATCC® CCL-243™)를 충분히 성장시키고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 2.5x10⁶개의 세포를 함유하는 샘플을 가공하여 세포로부터 단백질의 세포기질 분획 및 세포로부터 단백질의 막 분획을 수득하였다. 그런 다음, 단백질의 세포기질 분획 및 단백질의 막 분획 각각을 분해하고, 위에서 전술한 바와 같이 동중원소로 표지하여, 세포 샘플 유래 펩티드 단편의 세포기질 분획 및 세포 샘플 유래 펩티드 단편의 막 분획을 생성하였다.

당질화되지 않은 펩티드를 분획으로부터 분리하여 세포기질 및/또는 막 펩티드 단편의 각 분획을 풍부화시키고, 상기 실시예 1에 표시된 바와 같이 이온-페어링 HILIC에 의해 분획화하였다. 분획 19~36을 단리하고, 글리코시다아제(예를 들어, PNGaseF와 같은 아미다아제)를 사용하여 풍부화된 당단백질로부터 글리칸을 제거하였다.

각 분획에 대해 LC-MS를 수행하여 세포기질 분획 및 막 분획에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 수득하였다. Byonic 인간 글리칸 데이터베이스 및 검색 엔진을 사용하여 질량 스펙트럼 데이터를 추가로 분석한 다음, UNIPROT 인간 단백질체 데이터베이스와 비교하여 샘플 유래 인간 세포의 세포기질 분획의 당단백질 프로파일, 샘플 유래 인간 세포의 막 분획의 당단백질 프로파일, 및 전세포 당단백질 프로파일을 수득하였다.

LC-MS 데이터를 인간 단백질 데이터베이스에 대해 평가하여, 샘플에 존재하는 펩티드를 식별하는 데 사용된 펩티드-스펙트럼 일치(PSM)를 생성하였다. 도 1a를 비롯하여 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, 당펩티드 단편의 총 수를 K562 세포의 막 분획으로부터 식별하고, 분석된 각 분획(19~36)에 대한 질량 스펙트럼에 의해 식별된 각 당펩티드에 대해 PSM을 결정하였다.

분석된 막 단백질 분획의 각 분획에 대한 LC-MS 및 상응하는 PSM에 의해 식별된 당펩티드 단편
분획 수	PSM	당펩티드 단편
19	20	7
20	78	9
21	76	26
22	248	73
23	695	187
24	1369	336
25	2217	530
26	3065	741
27	3907	964
28	4545	1120
29	4703	1166
30	4085	1025
31	3341	861
32	2352	670
33	1137	362
34	505	192
35	108	76
36	6	4

PSM(당펩티드 단편과 일치하는 식별된 펩티드 스펙트럼의 총 수) 값은 각 분획에서 식별된 당펩티드 단편의 총 수보다 높으며, 이는 당펩티드가 반복적으로 식별되었음을 나타낸다.

아래 표 2는 본 방법이 샘플의 막 분획에 존재하는 당단백질을 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, 각 당단백질의 풍부도는 PSM 점수에 기초하여 식별된다.

PSM에 따라 K562 세포의 막 분획에 존재하는 가장 풍부한 당단백질 50개의 목록.
단백질 명칭	PSM 수
저산소증 상향 조절된 단백질 1	2062
리소좀-연관 막 당단백질 2의 이소형 LAMP-2C	1759
양이온-독립적 만노오스-6-포스페이트 수용체	1682
리소좀-연관 막 당단백질 1	1627
바시긴	939
트랜스페린 수용체 단백질 1	852
칼루메닌의 이소형 3	727
프롤릴 4-하이드록실라아제 서브유닛 알파-1	682
막관통 9 상과 구성원 3	658
인테그린 베타-1의 이소형 3	648
트랜스로콘-연관 단백질 서브유닛 알파	606
엔도플라스민	582
프로사포신의 이소형 Sap-mu-9	563
수용체-형 티로신-단백질 인산분해효소 C	548
시냅토피신-유사 단백질 1	472
4F2 세포 표면 항원 중쇄	451
구순열 및 구개 막관통 단백질 1-유사 단백질	435
프로콜라겐 갈락토실트랜스퍼라아제 1	406
소르틸린	387
니카스트린	382
프레닐시스테인 산화효소 1	360
돌리칠-디포스포올리고사카라이드--단백질 글리코실트랜스퍼라아제 서브유닛 STT3B	348
인테그린 알파-5	342
팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1	339
핵 기공 막 당단백질 210	321
단백질 Sel-1 상동체 1	319
특성화되지 않은 단백질	312
카복시펩티다아제 D	308
글리코포린-A	286
전환 성장 인자, 베타-1 전단백질	286
수송 및 골지 조직 단백질 1 상동체	282
백혈구 표면 항원 CD47 (단편)	278
나트륨/칼륨 수송 ATPase 서브유닛 베타-3	269
렙틴 수용체의 이소형 A	267
다기능 프로콜라겐 리신 하이드록실라아제 및 글리코실트랜스퍼라아제 LH3	254
프롤릴 3-하이드록실라아제 1의 이소형 3	251
지방세포 원형질 막-연관 단백질	249
UDP-포도당:당단백질 글루코실트랜스퍼라아제 1	222
디스인테그린 및 금속단백분해효소 도메인-함유 단백질 17	221
양이온-의존적 만노오스-6-포스페이트 수용체	219
세라미드 합성효소 2	216
디펩티딜 펩티다아제 1	203
STIM1L	203
결절 조절제 3	201
막관통 단백질 106B	201
디스인테그린 및 금속단백분해효소 도메인-함유 단백질 10	199
플렉신-B2	197
GPI 트랜스아미다아제 성분 PIG-T	196
비트로넥틴	185
골지 장치 단백질 1의 이소형 3	175

또한, 도 1b 및 아래 표 3은 K562 세포의 세포기질 분획으로부터 식별된 당펩티드 단편의 총 수, 및 분석된 각 세포기질 펩티드 분획(19~36)에 대한 질량 스펙트럼에 의해 확인된 각 당펩티드에 대한 PSM을 보여준다.

분석된 세포기질 단백질 분획의 각 분획에 대한 LC-MS 및 상응하는 PSM에 의해 식별된 당펩티드 단편
분획 수	글리코 PSM	당단백질 단편
19	27	11
20	69	16
21	92	30
22	107	43
23	184	68
24	207	80
25	352	137
26	553	205
27	628	241
28	752	279
29	1372	446
30	1301	473
31	856	320
32	428	193
33	96	52
34	42	25
35	10	11
36	2	5

표 4는 본 방법이 샘플의 세포기질 분획에 존재하는 당단백질을 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 다시, 각 당단백질의 풍부도는 PSM 점수에 기초하여 식별된다.

PSM에 따라 K562 세포의 세포기질 분획에 존재하는 가장 풍부한 당단백질 50개의 목록.
단백질 명칭	PSM 수
저산소증 상향 조절된 단백질 1	843
디펩티딜 펩티다아제 1	405
프로사포신의 이소형 Sap-mu-9	361
팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1	328
리소좀-연관 막 당단백질 2의 이소형 LAMP-2C	322
리소좀-연관 막 당단백질 1	312
칼루메닌의 이소형 3	290
카텝신 D	197
프롤릴 4-하이드록실라아제 서브유닛 알파-1	182
세르핀 H1	164
단백질 CREG1	159
베타-갈락토시다아제	157
포스포리파아제 D3	152
STON1-GTF2A1L 번역 초과	147
엔도플라스민	146
감마-글루타밀 가수분해 효소	139
N-아세틸글루코사민-6-설파타아제	138
트랜스페린 수용체 단백질 1	128
양이온-독립적 만노오스-6-포스페이트 수용체	122
금속단백분해효소 억제제 1	100
프롤릴 3-하이드록실라아제 1	96
UDP-포도당:당단백질 글루코실트랜스퍼라아제 1	85
카텝신 L1	81
카복시펩티다아제	75
막관통 9 상과 구성원 3	75
칼루메닌의 이소형 4	69
산 세라미다아제 (단편)	66
전환 성장 인자, 베타-1 전단백질	63
다기능 프로콜라겐 리신 하이드록실라아제 및 글리코실트랜스퍼라아제 LH3	56
다낭성 신장 질환 2-유사 2 단백질	54
트랜스로콘-연관 단백질 서브유닛 알파	54
소르틸린	49
연골-연관 단백질	47
구순열 및 구개 막관통 단백질 1-유사 단백질	46
바시긴	45
시냅토피신-유사 단백질 1	45
베타-헥소스아미니다아제 서브유닛 베타	44
리보뉴클레아제 T2	42
베타-헥소스아미니다아제	39
리소좀산 인산분해효소	39
디펩티딜-펩티다아제 1	38
디스인테그린 및 금속단백분해효소 도메인-함유 단백질 10	37
메세섬유-연관 당단백질 4	37
글리코포린	36
토신-4A	35
수송 및 골지 조직 단백질 1 상동체	35
나트륨/칼륨 수송 ATPase 서브유닛 베타-3	34
시알리다아제-1	31
알파-갈락토시다아제	30
EGF-유사 도메인을 갖는 시스테인-풍부 단백질 2의 이소형 6	30

그런 다음, 인간 K562 세포 샘플의 막 및 세포기질 분획에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 비교하여 세포기질 분획 및 막 분획 각각에서 당질화 부위(글리코사이트), 당펩티드 단편(당펩티드), 글리칸 조성(글리칸), 및 당단백질의 총 수를 정량적으로 식별하였다. 아래의 도 2a~2d 및 표 5 참조.

인간 세포의 정량적 전세포 당단백질체 분석.
샘플	당단백질	글리코사이트	당펩티드	글리칸 조성
막 분획	487	894	4806	120
세포기질 분획	229	365	1513	96
전세포 고유	536	934	5154	121

데이터는, 본 방법이 K562 세포의 세포기질 분획에서 365개의 당질화 부위, 1513개의 당펩티드 단편, 229개의 당단백질, 및 96개의 글리칸을 성공적으로 식별하였고, 894개의 당질화 부위, 4806개의 당펩티드 단편, 487개의 당단백질, 및 120개의 글리칸을 K562 세포 주의 막 분획으로 식별하였음을 보여준다.

또한, 막 분획에서 식별된 894개의 글리코실화 부위 및 K562 세포의 세포기질 분획에서 식별된 365개의 당질화 부위 중, 각 분획에서 당질화 부위의 83%(각각, 740개 및 303개)를 개별 HILIC 분획의 탈당질화 및 LCMS 분석에 의해 검증하였다.

추가적으로, 스펙트럼 데이터의 추가 분석은, 도 2a~2d에 도시된 바와 같이, 전세포(세포기질 분획 식별 및 막 분획 식별을 합친 것)에서 총 934개의 고유 당질화 부위, 5154개의 고유 당펩티드 단편, 536개의 고유 당단백질, 및 가능한 132개의 인간 글리칸 중 121개를 식별하였음을 보여준다.

실시예 3. 마우스 연조직의 전세포 당단백질 프로파일링.

쥣과 간 조직을 수득하고, 30 mg의 연조직 샘플을 균질화하고, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 가공하여 간 세포로부터 단백질의 세포기질 분획 및 간 세포로부터 단백질의 막 분획을 수득하였다. 그런 다음, 단백질의 세포기질 분획 및 단백질의 막 분획 각각을 분해하고, 위에서 전술한 바와 같이 동중원소로 표지하여, 세포 샘플 유래 펩티드 단편의 세포기질 분획 및 세포 샘플 유래 펩티드 단편의 막 분획을 생성하였다.

당질화되지 않은 펩티드를 분획으로부터 제거하여 세포기질 및/또는 막 펩티드 단편의 각 분획을 풍부화시키고, 상기 실시예 1 및 2에 표시된 바와 같이 이온-페어링 HILIC에 의해 분획화하였다. 분획 19~36을 단리하고, 글리코시다아제(예를 들어, 아미다아제, PNGaseF)를 사용하여 풍부화된 당단백질로부터 글리칸을 제거하였다.

각 분획에 대해 LC-MS를 수행하여 세포기질 분획 및 막 분획에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 수득하였다. Byonic™ 포유류 글리칸 데이터베이스 및 검색 엔진을 사용하여 질량 스펙트럼 데이터를 추가로 분석한 다음, UNIPROT 인간 마우스 데이터베이스와 비교하여 샘플 유래 쥣과 간 세포의 세포기질 분획의 당단백질 프로파일, 샘플 유래 인간 세포의 막 분획의 당단백질 프로파일, 및 전세포 당단백질 프로파일을 수득하였다.

LC-MS 데이터를 쥣과 단백질 데이터베이스에 대해 평가하여, 샘플에 존재하는 펩티드를 식별하는 데 사용된 펩티드-스펙트럼 일치(PSM)를 생성하였다. 도 3a를 비롯하여 아래 표 6에 나타낸 바와 같이, 당펩티드 단편의 총 수를 마우스 간 세포의 막 분획으로부터 식별하고, 분석된 각 분획(19~36)에 대한 질량 스펙트럼에 의해 식별된 각 당펩티드에 대해 PSM을 결정하였다.

분석된 막 단백질 분획의 각 분획에 대한 LC-MS 및 상응하는 PSM에 의해 식별된 당펩티드 단편
분획 수	글리코 PSM	당펩티드 단편
19	40	16
20	100	23
21	523	81
22	1140	183
23	1392	319
24	2891	592
25	4387	816
26	5409	1125
27	6136	1280
28	7716	1563
29	7282	1515
30	6223	1291
31	4724	1122
32	2602	621
33	1182	290
34	413	114
35	162	49
36	47	27

아래 표 7은 본 방법이 연조직 샘플의 막 분획에 존재하는 당단백질을 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, 각 당단백질의 풍부도는 PSM 점수에 기초하여 식별된다

PSM에 따라 마우스 간 조직 세포의 막 분획에 존재하는 가장 풍부한 당단백질 50개의 목록.
단백질 명칭	PSM 수
디펩티딜 펩티다아제 4	1896
아미노펩티다아제 N	1771
프레닐시스테인 산화효소	1704
저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1	1648
CEA-관련 세포 부착 분자 1	1519
리소좀-연관 막 당단백질 2의 이소형 LAMP-2B	1311
UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라아제 1-1	1219
디펩티딜-펩티다아제 1	1181
카복실에스테라아제 3A	1136
리소좀-연관 막 당단백질 1	1136
코르티코스테로이드 11-베타-탈수소효소 이소자임 1	1100
피레트로이드 가수분해 효소 Ces2a	1053
N-지방-아실-아미노산 합성효소/가수분해 효소 PM20D1	1044
뮤리노글로불린-1	1032
저산소증 상향 조절된 단백질 1	859
카르복실에스테라아제 1D	852
리소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 가수분해 효소	821
인테그린 알파-1	797
스캐빈저 수용체 클래스 B 구성원 1	770
혈소판 당단백질 4	697
H-2 클래스 I 조직적합성 항원, K-B 알파 사슬	645
엔도플라스민	613
저친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II	585
카르복실에스테라아제 1F	565
세린 프로테아제 억제제 A3K	565
면역글로불린 중쇄 불변 mu (단편)	551
리소좀 막 단백질 2	551
카복시펩티다아제	527
인테그린 베타-1의 이소형 2	521
아릴아세트아미드 탈아세틸화효소	508
UDF-글루쿠로노실트랜스퍼라아제 2A3	502
합토글로빈	484
UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라아제 3A2	484
카르복실에스테라아제 3B	440
혈청 파라옥소나아제/아릴에스테라아제 1	436
양이온-의존적 만노오스-6-포스페이트 수용체	428
세포 부착 분자 1	427
플렉신-B2	404
바시긴	400
ADP-리보실 시클라아제/환형 ADP-리보오스 가수분해효소 1	373
트랜스로콘-연관 단백질 서브유닛 베타 (단편)	372
키니노겐-1	361
산 세라미다아제	339
주요 요단백 3	325
카르복시산 에스테르 가수분해 효소	314
GDH/6PGL 내질 이작용성 단백질	314
임신 구역 단백질	309
프로사포신	308
단백질 Sel-1 상동체 1	307
티오레독신 도메인-함유 단백질 15	306

또한, 도 3b 및 아래 표 8은 마우스 간 조직 세포의 세포기질 분획에서 검출된 당펩티드 단편의 총 수, 및 분석된 각 세포기질 펩티드 분획(19~36)에 대한 질량 스펙트럼에 의해 확인된 각 당펩티드에 대한 PSM을 식별한다.

분석된 세포기질 단백질 분획의 각 분획에 대한 LC-MS 및 상응하는 PSM에 의해 식별된 당펩티드 단편
분획 수	글리코 PSM	당펩티드 단편
19	37	9
20	193	39
21	493	95
22	387	75
23	1745	231
24	2761	493
25	4216	686
26	4935	924
27	5470	1097
28	6429	1172
29	4301	622
30	3601	755
31	2739	575
32	1233	253
33	405	100
34	134	50
35	24	9
36	23	5

표 9는 본 방법이 세포를 함유하는 조직 샘플의 세포기질 분획에 존재하는 당단백질을 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 다시, 각 당단백질의 풍부도는 PSM 점수에 기초하여 식별된다.

PSM에 따라 연조직으로부터 수득한 간 세포의 세포기질 분획에 존재하는 가장 풍부한 당단백질 50개의 목록.
단백질 명칭	PSM 수
카복실에스테라아제 3A	1994
뮤리노글로불린-1	1664
임신 구역 단백질	1264
디펩티딜-펩티다아제 1	1237
저산소증 상향 조절된 단백질 1	1065
피레트로이드 가수분해 효소 Ces2a	1009
면역글로불린 중쇄 불변 mu (단편)	972
카복시펩티다아제	914
MCG1051009	903
엔도플라스민	901
합토글로빈	835
전 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1	818
알파-1-항트립신 1-4	808
카르복실에스테라아제 1D	739
카텝신 D	727
주요 요단백 3	702
리소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 가수분해 효소	634
카르복실에스테라아제 3B	632
리소좀-연관 막 당단백질 2의 이소형 LAMP-2B	610
카르복실에스테라아제 1F	547
피브리노겐 베타 사슬	518
비오티니다아제	496
카복시펩티다아제 Q	496
예측된 유전자 20425	486
단백질 이황화-이성질화효소 A2	472
카르복시산 에스테르 가수분해 효소	445
GDH/6PGL 내질 이작용성 단백질	409
리소좀-연관 막 당단백질 1	408
군 XV 포스포리파아제 A2	396
리소좀 알파-글루코시다아제	388
키니노겐-1	378
피레트로이드 가수분해 효소 Ces2a	372
카텝신 Z	362
프레닐시스테인 산화효소	362
아연-알파-2-당단백질	361
프로사포신	353
리소좀 알파-만노시다아제	346
UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라아제 1-1	340
아릴아세트아미드 탈아세틸화효소	330
카르복실에스테라아제 3B (단편)	330
카르복실에스테라아제 1E	285
N-아세틸글루코사민-6-설파타아제	280
간 카르복실에스테라아제 1	278
엑토뉴클레오시드 삼인산 이인산가수분해효소 5	277
추정 포스포리파아제 B-유사 2	236
양이온-의존적 만노오스-6-포스페이트 수용체	234
카텝신 L1	230
열충격 70 kDa 단백질 1-유사	216
소포체 아미노펩티다아제 1	212
알파-1-산 당단백질 1	207

그런 다음, 세포기질 분획 및 막 분획 각각에서 당질화 부위(글리코사이트), 당펩티드 단편(당펩티드), 글리칸 조성(글리칸), 및 당단백질의 총 수를 정량적으로 식별하기 위해, 연조직 샘플 유래 쥣과 간 세포의 막 및 세포기질 분획에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 비교하였다. 도 4a~4d 및 아래의 표 10 참조.

쥣과 세포의 정량적 전세포 당단백질체 분석.
샘플	당단백질	글리코사이트	글리칸 조성	당펩티드
막 분획	571	1132	186	5957
세포기질 분획	448	894	165	4238
전세포 고유	660	1449	206	7549

데이터는, 본 방법이 쥣과 간 세포 세포기질 분획에서 894개의 당질화 부위, 4238개의 당펩티드 단편, 448개의 당단백질, 및 165개의 글리칸을 성공적으로 식별하였고, 1132개의 당질화 부위, 5957개의 당펩티드 단편, 571개의 당단백질, 및 186개의 글리칸을 쥣과 간 세포의 막 분획으로 식별하였음을 보여준다.

추가적으로, 스펙트럼 데이터의 추가 분석은, 도 4a~4d에 도시된 바와 같이, 전세포(세포기질 분획 식별 및 막 분획 식별을 합친 것)에서 총 1449개의 고유 당질화 부위, 7549개의 고유 당펩티드 단편, 660개의 고유 당단백질, 및 가능한 304개의 포유류 글리칸 중 206개를 식별하였음을 보여준다.

종합하면, 본원의 데이터는, 세포가 수득되는 종 또는 샘플 유형에 독립적으로, 단백질의 구획화된 당질화의 완전한 분석을 생성하는 데 본 방법이 사용될 수 있음을 보여준다. 따라서, 본 방법은 임의의 생물학적 시스템에서 당질화의 전체 세포 분석을 제공하고 당질화의 정량화를 가능하게 한다.

실시예 4: 인간 부착 세포를 가공하여 막 및 세포기질 단백질 분획을 수득하는 것의 재현 가능성.

인간 K562 골수 세포(ATCC® CCL-243™)를 충분히 성장시키고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 2.5x10⁶개의 세포를 함유하는 샘플을 가공하여 세포 유래 단백질의 2개의 세포기질 분획 복제물 및 세포 유래 단백질의 2개의 막 분획 복제물을 수득하였다. 인간 K562 세포 샘플의 각 복제 분획(세포기질 및 막)을 상기 실시예 1에 제시된 바와 같이 필터 보조 샘플 제조(FASP)에 의해 별도로 분해하였다. 그런 다음, 생성된 세포기질 펩티드 단편 및 막 펩티드 단편의 분획을, 실시예 1에 제시된 바와 같이 Tandem Mass Tag™(TMT) 시스템(Thermo Scientific™)을 사용해 동중원소 검출 가능한 마커로 표지하였다. 세포기질 복제물로부터 표지된 세포기질 펩티드 단편을 수집하고 합쳐서, 두 복제 분획 모두의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 생성하였다. 막 복제물로부터 표지된 막 펩티드 단편을 수집하고 합쳐서, 두 복제 막 분획 모두의 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물을 생성하였다.

그런 다음, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석을 사용해, 인간 K562 세포 유래의 세포기질 분획의 복제 제제에 존재하는 복제 세포기질 분획 내 모든 세포기질 펩티드 단편을 비롯하여 인간 K562 세포 유래의 막 분획의 복제 제제에 본재하는 복제 막 분획 내 모든 막 펩티드 단편의 검출 가능한 마커 생성 신호들(즉, TMT 리포터 이온)의 강도를 측정하였다. 도 5a 및 도 5b 참조. 도 5a 및 5b는 HCD MS/MS 스펙트럼에서 검출된, 인간 K562 부착 세포로부터 수득한 막 분획 복제물(M1 및 M2) 및 세포기질 분획 복제물(C1 및 C2) 내 모든 단백질로부터의 리포터 이온 강도의 산포도를 보여준다.

세포기질 복제 제제들 간의 선형 관계 및 막 복제 제제들 간의 선형 관계는, 막 제제 및 세포기질 제제 각각에 대해 0.99를 초과하는 상관 계수(R2)를 나타낸다. 이들 데이터는, 부착 세포로부터 단백질의 세포기질 분획 및 막 분획을 수득하기 위한 가공 방법이 매우 일관되고 재현 가능함을 보여준다.

실시예 5: 쥣과 간 조직 샘플을 가공하여 막 및 세포기질 단백질 분획을 수득하는 것의 재현 가능성.

쥣과 간 연조직 샘플을 균질화하고, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 가공하여 쥣과 간 세포 유래 단백질의 2개의 세포기질 분획 복제물 및 쥣과 간 세포 유래 단백질의 2개의 막 분획 복제물을 수득하였다. 실시예 4에서 전술한 바와 같이, 쥣과 조직 샘플의 각 복제 분획(세포기질 및 막)을 필터 보조 샘플 제조(FASP)에 의해 별도로 분해하였다. 그런 다음, 생성된 세포기질 펩티드 단편 및 막 펩티드 단편의 분획을 Tandem Mass Tag™(TMT) 시스템(Thermo Scientific™)을 사용해 표지하였다. 세포기질 복제물로부터 표지된 세포기질 펩티드 단편을 수집하고 합쳐서, 두 복제 분획 모두의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 생성하였다. 막 복제물로부터 표지된 막 펩티드 단편을 수집하고 합쳐서, 두 복제 막 분획 모두의 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물을 생성하였다.

그런 다음, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석을 사용해, 쥣과 조직 세포 유래의 세포기질 분획의 복제 제제에 존재하는 복제 세포기질 분획 내 모든 세포기질 펩티드 단편을 비롯하여 쥣과 조직 세포 유래의 막 분획의 복제 제제에 본재하는 복제 막 분획 내 모든 막 펩티드 단편의 검출 가능한 마커 생성 신호들의 강도를 측정하였다. 도 6a 및 도 6b 참조.

도 6a 및 6b는 쥣과 간 조직 샘플로부터 단리한 간 세포로부터 수득한 막 분획 복제물(M1 및 M2) 및 세포기질 분획 복제물(C1 및 C2) 내 모든 단백질의 HCD MS/MS 스펙트럼에서 검출된 리포터 이온 강도의 산포도를 보여준다. 세포기질 복제 제제들 간의 선형 관계 및 막 복제 제제들 간의 선형 관계는, 막 제제 및 세포기질 제제 각각에 대해 0.98을 초과하는 상관 계수(R2)를 나타낸다. 이들 데이터는, 연조직 샘플로부터 단백질의 세포기질 분획 및 막 분획을 수득하기 위한 가공 방법도 매우 일관되고 재현 가능함을 보여준다.

Claims

당단백질을 프로파일링하는 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 샘플을 가공하여 세포의 세포기질 분획 및 세포의 막 분획을 단리하는 단계, 및
(b) 막 분획 내 단백질의 질량 분광분석을 수행하여 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하고, 세포기질 분획 내 단백질의 질량 분광분석을 수행하여 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 가공하는 단계는
(i) 샘플 유래의 세포를 제1 세제를 포함하는 투과화 용액과 혼합하여 샘플 내 세포의 원형질 막을 투과화시키는 단계;
(ii) 단계 (i)로부터의 혼합물을 원심분리하여 투과화된 세포를 포함하는 제1 펠릿, 및 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터의 상청액을 수집하고, 단계 (ii)로부터의 제1 펠릿을 제2 세제를 포함하는 가용화 용액에 현탁시켜 현탁액을 형성하는 단계로서, 제2 세제는 세포로부터 막 단백질을 가용화하는, 단계;
(iv) 단계 (iii)으로부터의 현탁액을 원심분리하여 제2 펠릿 및 막 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)로부터의 상청액을 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 가용화 용액은 이온성 세제를 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 이온성 세제는 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제3항에 있어서, 가용화 용액은 0.1% 내지 1.0% (w/v)의 농도로 이온성 세제를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 투과화 용액은 비이온성 세제를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 비이온성 세제는 Triton-X 100, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리소르베이트 20(Tween-20), 사포닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제6항에 있어서, 투과화 용액은 0.1% 내지 0.2% (w/v)의 농도로 비이온성 세제를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 막 분획 내 당단백질의 프로파일은
(1) 막 분획 내 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 수득하는 단계;
(2) 단계 (1)의 펩티드 단편으로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하여, 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편을 수득하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 수득된 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편의 질량 분광분석을 수행하여 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되며, 여기서 프로파일은 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 임의로 포함된 당단백질의 목록을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일은
(1) 세포기질 분획 내 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 수득하는 단계;
(2) 단계 (1)의 펩티드 단편으로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하여, 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편을 수득하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 수득된 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편의 질량 분광분석을 수행하여 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되며, 여기서 프로파일은 당질화 부위, 당질화된 펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 임의로 포함된 당단백질의 목록을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 단계 (1)에서의 분해는 필터-보조식 샘플 제제를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 단계 (1)에서의 분해는 필터-보조식 샘플 제제를 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 단계 (2)에서 막 분획의 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하는 상기 단계는 이온-페어링 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 렉틴 친화도 크로마토그래피, 또는 하이드라지드 포획을 수행하는 것을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 단계 (2)에서 세포기질 분획의 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하는 상기 단계는 이온-페어링 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 렉틴 친화도 크로마토그래피, 또는 하이드라지드 포획을 수행하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 세포는 포유류 세포인, 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)의 샘플은 적어도 2.5 x 10⁶개의 세포를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 단계 (a)의 샘플은 조직 샘플이고, 가공하는 단계는 (i) 조직 샘플을 균질화하는 단계를 단계 (a) 앞에 추가로 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 조직 샘플은 적어도 20 mg의 조직을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 막 분획 유래의 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편을 글리코시다아제로 처리하여 글리칸을 방출하는, 방법.
제10항에 있어서, 세포기질 분획 유래의 당질화된 펩티드가 풍부한 펩티드 단편을 글리코시다아제로 처리하여 글리칸을 방출하는, 방법.
제19항에 있어서, 글리코시다아제는 아미다아제인, 방법.
제20항에 있어서, 글리코시다아제는 아미다아제인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 질량 분광분석은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석인, 방법.
제1항에 있어서, 당단백질의 프로파일은 단백질체 데이터베이스 및 글리칸 데이터베이스에 대해 질량 분광분석의 결과를 검색함으로써 수득되는, 방법.
제1항에 있어서, 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
샘플들 간의 단백질 변동을 검출하기 위한 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 제1 샘플을 가공하여 세포의 세포기질 분획 및 세포의 막 분획을 단리하는 단계;
(b) 세포를 포함하는 제2 샘플을 가공하여 세포의 세포기질 분획 및 세포의 막 분획을 단리하는 단계;
(c) 단계 (a)로부터의 세포기질 분획 및 막 분획 내 단백질을 분해하여 제1 샘플의 세포기질 펩티드 단편을 수득하는 단계;
(d) 단계 (b)로부터의 세포기질 분획 및 막 분획 내 단백질을 분해하여 제2 샘플의 세포기질 펩티드 단편을 수득하는 단계;
(e) 제1 샘플 유래의 세포기질 펩티드 단편을 제1 검출 가능한 마커로 표지하고, 제2 샘플 유래의 세포기질 펩티드 단편을 제2 검출 가능한 마커로 표지하고, 표지된 세포기질 펩티드 단편들을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물을 수득하는 단계;
(f) 제1 샘플 유래의 막 펩티드 단편을 제3 검출 가능한 표지로 표지하고, 제2 샘플 유래의 막 펩티드 단편을 제4 검출 가능한 표지로 표지하고, 표지된 막 펩티드 단편들을 혼합하여 제1 및 제2 샘플의 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물을 수득하는 단계; 및
(g) 단계 (e)로부터의 표지된 세포기질 단백질의 혼합물에서 표지된 세포기질 펩티드 단편을 검출하고; 단계 (f)로부터의 표지된 막 단백질 혼합물에서 표지된 막 펩티드 단편을 검출하여, 제1 샘플과 제2 샘플 간의 세포기질 단백질의 변동 및 막 단백질의 변동을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서,
가공하는 단계 (a)는:
(i) 제1 샘플 유래의 세포를 제1 세제를 포함하는 투과화 용액과 혼합하여 제1 샘플 내 세포의 원형질 막을 투과화시키는 단계;
(ii) 단계 (i)로부터의 혼합물을 원심분리하여 제1 샘플의 투과화된 세포를 포함하는 제1 펠릿, 및 제1 샘플의 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
(iii) 단계 (ii)로부터의 상청액을 수집하고, 단계 (ii)로부터의 제1 펠릿을 제2 세제를 포함하는 가용화 용액에 현탁시켜 현탁액을 형성하는 단계로서, 제2 세제는 제1 샘플의 세포로부터 막 단백질을 가용화하는, 단계;
(iv) 단계 (iii)으로부터의 현탁액을 원심분리하여 제2 펠릿 및 제1 샘플의 세포의 막 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)로부터의 제1 샘플의 세포의 막 분획을 포함하는 상청액을 수집하는 단계를 포함하고,
가공하는 단계 (b)는:
(aa) 제2 샘플 유래의 세포를 제1 세제를 포함하는 투과화 용액과 혼합하여 제2 샘플 내 세포의 원형질 막을 투과화시키는 단계;
(bb) 단계 (aa)로부터의 혼합물을 원심분리하여 제2 샘플의 투과화된 세포를 포함하는 펠릿, 및 제1 샘플의 세포기질 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계;
(cc) 단계 (bb)로부터의 상청액을 수집하고, 단계 (bb)로부터의 펠릿을 제2 세제를 포함하는 가용화 용액에 현탁시켜 현탁액을 형성하는 단계로서, 제2 세제는 제2 샘플의 세포로부터 막 단백질을 가용화하는, 단계;
(dd) 단계 (cc)으로부터의 현탁액을 원심분리하여 또 다른 펠릿 및 제2 샘플의 세포의 막 분획을 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및
(ee) 단계 (dd)로부터의 제2 샘플의 세포의 막 분획을 포함하는 상청액을 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 가용화 용액은 이온성 세제를 포함하는, 방법.
제28항에 있어서, 이온성 세제는 도데실황산나트륨(SDS), 데옥시콜산나트륨, N-라우릴 사르코신, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제28항에 있어서, 가용화 용액은 0.1% 내지 1.0% (w/v)의 농도로 이온성 세제를 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 투과화 용액은 비이온성 세제를 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 비이온성 세제는 Triton-X 100, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리소르베이트 20(Tween-20), 사포닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제31항에 있어서, 투과화 용액은 0.1% 내지 0.2% (w/v)의 농도로 비이온성 세제를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 단계 (e)로부터의 표지된 세포기질 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하고, 단계 (f)로부터의 표지된 막 펩티드의 혼합물의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플의 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제34항에 있어서, 제1 및 제2 샘플의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일은
(1) 질량 분광분석을 수행하기 전에, 표지된 세포기질 펩티드 단편의 혼합물로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하여, 당질화된 펩티드가 풍부한 샘플로부터 표지된 세포기질 펩티드 단편의 집합체 샘플을 수득하는 단계; 및
(2) 단계 (g) 전에, 단계 (1)에서 수득된 제1 및 제2 샘플 유래의 표지된 세포기질 펩티드 단편의 풍부한 샘플의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플 유래의 세포기질 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되며, 여기서 상기 프로파일은 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 임의로 포함된 당단백질의 목록을 포함하는, 방법.
제34항에 있어서, 제1 및 제2 샘플의 막 분획 내 당단백질의 프로파일은
(1) 질량 분광분석을 수행하기 전에, 표지된 막 펩티드 단편의 혼합물로부터 당질화되지 않은 펩티드 단편을 분리하여, 당질화된 펩티드가 풍부한 샘플로부터 표지된 막 펩티드 단편의 집합체 샘플을 수득하는 단계; 및
(2) 단계 (g) 전에, 단계 (1)에서 수득된 제1 및 제2 샘플 유래의 표지된 막 펩티드 단편의 풍부한 샘플의 질량 분광분석을 수행하여 제1 및 제2 샘플 유래의 막 분획 내 당단백질의 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되며, 여기서 상기 프로파일은 당질화 부위, 당펩티드, 글리칸 조성, 및 당단백질의 풍부도 중 하나 이상이 임의로 포함된 당단백질의 목록을 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 세포는 포유류 세포인, 방법.
제26항에 있어서, 단계 (a)의 제1 샘플 및 단계 (b)의 제2 샘플은 각각 적어도 2.5 x 10⁶개의 세포를 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 단계 (a)의 제1 샘플 및 단계 (b)의 제2 샘플은 각각 조직 샘플이고, 가공하는 단계 (a)와 (i) 및 단계 (b)와 (aa) 전에 각각의 조직 샘플을 균질화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 각각의 조직 샘플은 적어도 20 mg의 조직을 포함하는, 방법.