WO1999036782A1 - Rezeptorbindungsassays und reagenziensatz zum nachweis von tsh-rezeptor- autoantikörpern - Google Patents

Rezeptorbindungsassays und reagenziensatz zum nachweis von tsh-rezeptor- autoantikörpern Download PDF

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WO1999036782A1
WO1999036782A1 PCT/EP1999/000159 EP9900159W WO9936782A1 WO 1999036782 A1 WO1999036782 A1 WO 1999036782A1 EP 9900159 W EP9900159 W EP 9900159W WO 9936782 A1 WO9936782 A1 WO 9936782A1
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tshr
btsh
receptor
rhtshr
test tube
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PCT/EP1999/000159
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French (fr)
Inventor
Andreas Bergmann
Joachim Struck
Nils Morgenthaler
Wolfgang WEGLÖHNER
Jörg-Michael HOLLIDT
Original Assignee
B.R.A.H.M.S Diagnostica Gmbh
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to improved receptor binding assays for the determination of TSH receptor autoantibodies (TSHR-Auto-Ab) which occur in thyroid autoimmune diseases, in particular in Graves' disease.
  • TSHR-Auto-Ab TSH receptor autoantibodies
  • Tg thyroglobulin
  • TPO thyroid peroxidase
  • TSHR TSH receptor
  • the TSH receptor is a receptor located in the thyroid membrane to which the hormone T ⁇ H (thyroid-stimulating hormone or thyreotropin) released by the pituitary gland - 2 - binds and thereby triggers the release of the actual thyroid hormones, especially the thyroxine.
  • the TSH receptor belongs to the receptor family of the G protein-coupled glycoprotein receptors with a large amino terminal extra-cellular domain, which also includes the LH / CG and FSH receptors.
  • the chemical structure of the TSH receptor ie the sequence of the DNA coding for it and the deduced amino acid sequence of the receptor itself, was elucidated at the end of 1989 (cf. Libert F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
  • TSI thyroid stimulating immunoglobulin
  • autoantibodies can also be determined using competitive receptor binding assays, in particular radio receptor assays, for example using the TRAK-Assay ® from BRAHMS Diagnostica GmbH.
  • TSH receptor autoantibodies TSHR-Auto-Ab
  • this conventional method is used in such a way that the autoantibodies to be determined are obtained from a serum sample in the liquid phase with a radioactively labeled bovine TSH ( 125 I-bTSH) around the binding sites of a solubilized porcine TSH receptor (porc.TSHR) can compete (see Southgate, K. et al., Clin. Endocrinol. (Oxford) 20, 539-541 (1984); Matsuba T.
  • the solubilized porc.TSHR used is separated from the liquid phase with a precipitation reagent and a subsequent centrifugation step after the incubation has ended.
  • the receptor-bound 125 I-bTSH is determined by measuring the radioactivity bound in the sediment.
  • TBII thyrotropin-binding inhibitory immunoglobulin
  • TSH receptor autoantibodies have various disadvantages, which can be attributed to the quality or availability of the assay components used, abnormalities occurring in the sera of individual patients, which can falsify the measurement results in the known assays are that the binding ability of TSH receptor preparations is generally very sensitive to changes in the receptor or in the biomolecules bound by it.
  • Patent DE 43 28 070 Cl describes a type of receptor binding assay which works according to the coated tube technique, in which the difficulty in producing labeled or immobilized functional receptor preparations is avoided by adding components of a to the solid phase competitive reaction system binds, which to a certain extent represents a "shadow" of the actual receptor binding reaction.
  • the method principle disclosed has proven to be too complicated and therefore not very practical for the creation of assays for routine clinical diagnosis.
  • the general statements in the cited patent on the problem of receptor binding assays in general and of those for the determination of TSH receptor autoantibodies in particular are expressly referred to in addition.
  • EP-B-0 488 170 discloses cell-free receptor binding tests in which recombinant fusion receptors consist of an amino-terminal receptor protein and a carrier protein, in particular the constant part (Fc) of the heavy chain
  • Immunoglobulins can be used, which are coupled to a solid phase by means of an antiserum or a monoclonal antibody.
  • the receptors discussed do not belong to the
  • Carrier protein that is the Fc part of an immunoglobulin for
  • Receptor binding assays with the aid of which autoantibodies are to be determined, are unsuitable, since the autoantibodies themselves belong to the immunoglobulins and can bind to the immobilization system.
  • rhTSHR human TSHR preparations
  • EP-A 0 719 858 also describes a method for producing a functional rhTSHR using a myeloma cell line.
  • the application mentions, in general, speculative form, the possibility of generating monoclonal antibodies using the rhTSHR polypeptide produced and makes the proposal to use such antibodies for immobilization, among other things - 7 - of the rhTSHR and to use it when determining TSHR-Auto-Ab.
  • the actual production and selection of such monoclonal antibodies is not described, nor is it specifically shown that, according to the proposal, it is actually possible to immobilize a rhTSHR with the possibly available monoclonal antibodies without loss of functionality and in this form when determining TSHR -Auto-Ab to use.
  • EP-A 0 719 858 cannot be reworked.
  • Monoclonal antibodies are not mentioned in the underlying publication (Matsuba et al., J. Biochem. 118, pp. 265-270 (1995)).
  • the different antibodies - 8 - were tested for their binding behavior towards the TSH receptor or recombinantly generated partial sequences thereof and in particular also with regard to their ability to disrupt the binding of TSH to different forms or fragments of the TSH receptor.
  • a partial recombinant TSH receptor as prepared above is subsequently folded and now tested for its suitability for binding radioactively labeled bTSH. To do this, it is reacted in the liquid phase with radioactively labeled bTSH.
  • an antibody is then added as part of a precipitation system which was generated by immunization of rabbits with a conjugate of a partial peptide which contains amino acids 357 to 372 of the complete TSH receptor sequence and from which it was found that it did not inhibit the binding of bTSH to the unfolded partial recombinant TSH receptor (Desai RK et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 77: 658-663, 1993).
  • the added antibody or the complexes containing it and bound radioactively labeled bTSH are then precipitated with the aid of protein A, which binds non-specifically to any antibody. Under the experimental conditions, the binding of protein A to the receptor-bound antibody does not appear to impair simultaneous bTSH binding.
  • the immobilization of the TSHR complexes takes place with the aid of an affinity gel to which a sequential monoclonal anti-hTSHR mAb is bound.
  • the emphasis of the teaching of the application 196 51 093.7 is on increasing the clinical value of the TSHR-Auto-Ab determination, especially when using the conventional crude solubilized TSHR preparations.
  • mice are immunized for the purpose of antibody formation not with an antigen of a peptide nature, but by intramuscular injection of a DNA plasmid construct coding for the hTSHR. In this way, new monoclonal antibodies with high affinity for the native hTSHR are obtained.
  • This technique has proven to be very valuable and is also used in the context of the present application in particular for the production of anti-hTSHR mAb which recognize conformational epitopes.
  • a preferred reagent set which contains at least one of the components (i) and (ii) according to claim 13.
  • TSH thyroid stimulating hormone (Thyreotropin). If the abbreviation TSH is used without further additives, it is not a specific product, but the binding or function of the hormone is discussed in a general way. - 13 - bTSH Bovines (ie derived from cattle) TSH. Preparation which is used as a tracer in assays for the determination of autoantibodies against the TSH receptor (in particular radioiodinated or, as described here, labeled with a chemiluminescent label, in particular an acridium ester label; however, it is within the scope of the present invention use any other known label).
  • I-bTSH Radioiodinated bTSH used as competitor.
  • 125 I-bTSH stands in particular for a product as obtained in accordance with DE 42 37 430 Cl or EP 0 668 775 B1 and part of the TRAK-Asay ® from Fa BRAHMS Diagnostica GmbH is.
  • hTSH Human TSH Occurs only in very low concentrations of 0.2-4 mU / 1 in healthy serum / plasma. However, the hTSH concentration may be significantly increased in sera from hypothyroid patients. The disturbances in autoantibody measurements caused by increased hTSH levels (of more than 20 mU / l) are discussed in the description and neutralized by special measures. The current state of knowledge on the structure of hTSH is summarized in Grossmann et al. , Endocrine Reviews, Vol.18, 1997, pp. 476-501.
  • TSHR The TSH receptor, a glycoprotein receptor anchored in the thyroid membrane. If the abbreviation TSHR is used without further additions, it is not a specific product, but the function of the receptor or its binding participation becomes more general - 14 - discussed form.
  • porc.TSHR Extractively obtained solubilized crudes receptor preparation from porcines. Is used in the radioreceptor precipitation assays of the prior art for the determination of autoantibodies against the TSHR (conventional TRAK-Assay ® from BRAHMS Diagnostica GmbH) as a specific binder.
  • rhTSHR Genetically engineered (recombinant) polypeptide which has the amino acid sequence of a naturally occurring human TSHR at least to such an extent that it can be called a "functional human TSH receptor", which means that it is related to the binding of autoantibodies against the TSHR or hTSH to a significant extent like the naturally occurring human TSHR. If the abbreviation rhTSHR is used without further additions, it is not a specific product, ie rhTSHR can stand for any recombinant complete, more or less glycosylated polypeptide, a partial sequence of a sufficient length or a genetically engineered fusion product thereof (as it is e.g.
  • rhTSHR a product simply referred to as "rhTSHR” is available as crude detergent-solubilized membrane preparation, ie in the form obtained by conventional solubilization of membranes of the cells used for expression of the recombinant polypeptide using detergents.
  • rhTSHR rhTSHR preparation selectively bound (immobilized) to a solid phase.
  • the binding can take place via a suitable antibody, but in the case of fusion products it can also take place via a special peptide residue, for example a biotin residue.
  • the solid phase can be the wall of a test tube (coated tube or CT technique), but can also be a suitable suspended solid phase.
  • rhTSHR (imm) * Via a selected anti-hTSHR mAb, immobilized rhTSHR bound to a solid phase (see above) and bound in a bound form by washing foreign components. Also known as "affinity cleaned rhTSHR”.
  • TSHR-Auto-Ab In biological samples, especially human serum or plasma, detectable autoantibodies against the TSH receptor.
  • the detection of stimulating such TSHR-Auto-Ab is particularly important for the diagnosis of Graves 'disease (English: Graves' disease).
  • a commercial assay (radioreceptor assay) for the determination of TSHR-Auto-Ab is the TRAK-Assay ® from BRAHMS Diagnostica GmbH.
  • Anti-hTSHR-mAb monoclonal antibody that binds to rhTSHR. Without further explanations, it can be of a sequential nature with regard to its binding behavior, as described, for example, in the earlier application DE 196 51 093.7. - 16 - is written, but it can also be conformal in nature. The selection of certain such anti-hTSHR mAb for the implementation of the assays according to the invention is described in more detail in the application. If special anti-hTSHR mAbs are used in the tests, they are identified by an identification number explained in the application. If a slightly modified, less specific abbreviation (e.g. simply anti-TSHR-Ab) is used, an unnecessary restriction to monoclonal Ab against human TSHR should be avoided at this point.
  • a slightly modified, less specific abbreviation e.g. simply anti-TSHR-Ab
  • Anti-bTSH-Ab Antibodies of unclear origin which occur in human sera or plasma and which react with bTSH to form immune complexes and thus influence the binding of bTSH to the assay components or the measurement result obtained (cf. Y.Ochi et al., Acta Endocrinologica (Copenh) 1989, 120: 773-777; S. Sakata et al., J. Endocrinol. Invest. 14: 123-130, 1991; T. Inui, Thyroid, Vol. 6: 295-299, 1996).
  • the well-known competitive receptor binding assays which are all designed as radio receptor assays, contain the following basic assay components in addition to the required standards and buffer solutions:
  • PEG precipitant polyethylene glycol
  • the interference of pathologically high hTSH concentrations in individual patient samples can be neutralized by adding certain commercially available antibodies (anti-hTSH-Ab) to the sample-containing measurement solution, which selectively bind hTSH and do not cross-react with the bTSH used as competitor.
  • anti-hTSH-Ab certain commercially available antibodies
  • third substances is advantageous for the binding of bTSH to rhTSHR preparations, e.g. of certain serum components that could be characterized as components of a serum fraction that only contains substances with molecular weights of ⁇ 10,000 d.
  • Some of the low molecular weight substances that improve binding, in particular dissolved inorganic ions, could be identified more precisely. It could be shown that inorganic ions, however, when complexed by EDTA, i.e. bound in solid complexes that do not have the stated effect.
  • the fact that the method according to the invention allows the TSHR-Auto-Ab and the labeled competitor bTSH from the measurement solution to be bound directly to a solid-phase-bound, affinity-purified rhTSHR (imm) * means that not only is the measurement of the signal obtained compared to a precipitation assay in the desired
  • the assay design can basically be changed by going from a one-step assay (a single measurement solution obtained by successive pipetting without intermediate solid-liquid separation) to a two-step assay, in which the implementation is carried out of rhTSHR (imm) * with the sample and the implementation with the marked competitor bTSH in two successive steps, separated by a solid-liquid separation.
  • rhTSHR affinity-purified rhTSHR (imm) * plastic surfaces, in particular the walls of plastic test tubes for CT technology, microparticles, magnetic particles, filters, polymer gel materials and other known solid phase supports can be used.
  • the TSHR auto-off determination can also be automated by the method according to the invention.
  • the assay design can thus be adapted in such a way that it can be carried out on known automated systems (see, for example, the Elecsys system from Boehringer Mannheim or the ACS 180 system from Chiron).
  • the samples are pipetted, incubated in receptor-coated test tubes, then the liquid reaction mixture is suctioned off or decanted and a second solution with the labeled bTSH, for example 125 I-bTSH, is added. After the prescribed incubation, the usual final solid-liquid separation then takes place, after which the signal can be measured, if necessary after triggering the signal, by adding suitable reagents.
  • the pipetting step sequence given by way of example for a two-step assay is variable and can be replaced, for example, by the pipetting sequence of a one-step assay (2.1.1), possibly without prior immobilization of the rTHSR.
  • Figure 3 The standard curve for the measurement of TSHR-Auto-Ab under
  • a human chronic leukemia cell line was stably transfected with a bicistronic vector, which contained the cDNA for the complete human TSH receptor, and grown in suspension culture in a manner analogous to conventional procedures.
  • Orientative tests with other systems showed that the special expression system is not critical and with essentially the same success with the expression system described in EP-A-0 719 858, which works with myeloma cell lines, or with the Vacciniavi described in PCT / EP97 / 06121 - rus / HeLa cell expression system can be worked.
  • the rhTSHR could also be obtained with the warm-blooded blood cells described in EP-B1-0 433 509 in a quality which made it possible to carry out the teaching of this application.
  • the material obtained became 30 at 100,000 g centrifuged min.
  • the sediment obtained was rehomogenized in 20 ml of buffer (10 mM HEPES; 2% Triton-X-100; pH 7.5) while repeating the procedure described and centrifuged again at 100,000 g for 30 min.
  • the supernatant obtained, which contained the crude solubilized rhTSHR preparation, was portioned and stored at -80 ° C. until further use.
  • BTSH chemiluminescence-labeled with acridinium ester was prepared as follows: 100 ⁇ g bTSH (50-60 IU / mg protein, in 20 mM sodium phosphate; pH 7.0) were mixed with 10 ⁇ l acridinium ester (Behringwerke AG, Marburg; see EP 0 257 541 Bl; 1 mg / ml in acetonitrile) for 15 min at room temperature and then prepared by HPLC on a Waters-Protein Pak SW 125 column (eluent: 0.1 M ammonium acetate; pH 5.5; flow rate: 0 , 6 ml / min). All fractions from the column effluent with UV absorption at 280 nm and 368 nm were collected. The pooled protein fraction was stored at -80 ° C until further use in receptor binding assays.
  • TSHR-Auto-Ab Standards for the determination of TSHR-Auto-Ab were prepared by mixing TSHR-Auto-Ab positive sera with known antibody content and autoantibody-free human sera, each adjusted to 0.05% sodium azide and stored at 4 ° C. until further use .
  • the standards were calibrated using the TRAK assay "from BRAHMS Diagnostica GmbH. 1.4 Anti-hTSHR mAb Collection and Selection
  • a collective of monoclonal mouse antibodies against the TSH receptor was prepared using various immunization methods as described in the literature (JS Dallas et al., Endocrinology 134, No. 3, pp. 1437-1445 (1994) - immunization with extracellular receptor domain produced recombinantly by the baculovirus method; LB Nicholson et al., J. Mol. Endocrinol. (1996) 16, pp. 159-190 - immunization with that generated in prokaryote cells or by the baculovirus method extracellular receptor domain; Johnstone AP et al., Mol. Cell. Endocrinol.
  • the bTSH / - rhTSHR complex is only precipitated to the extent that it has bound to the antibody to be examined. Accordingly, the radioactivity found in the centrifugation segment represents the amount of bTSH / rhTSHR complex that was bound by the respective AnthTSHR mAb.
  • Polystyrene tubes coated with goat anti-mouse antibodies were used to immobilize the respective anti-hTSHR mAbs (Kit component of the DYNOtest ® TBG from BRAHMS Diagnostica GmbH) with 100 ng each of the antihTSHR mAb to be examined with the identification numbers 1 to 11 in 200 ⁇ l PBS for 2 h at room temperature. Then 2 ml of PBS was added and the liquid tube content was decanted. The coated test tubes obtained were then directly incubated with the reaction solution described above, which contained the bTSH / rhTSHR complex (100 ⁇ l), for 1 hour with shaking at 300 rpm.
  • the test tubes were then washed twice with 2 ml of washing buffer (10 mM HEPES; 0.1 Triton X-100; pH 7.5) and the radioactivity fixed on the surface of the test tubes was measured.
  • the binding values obtained in the testing of the anti-hTSHR mAb 1-11 according to methods 1.4.3 and 1.4.4 are given in Table 1 below, the radioactivity of the sediment from the PEG precipitation according to 1.4.1 being the reference value was set at 100%.
  • the non-specific bindings, ie the radioactivity in the presence of an excess of unlabelled bTSH, are subtracted from all the data shown.
  • mapping is based on the fact that it is determined to which synthetic partial peptide sequences of the hTSHR the binds the respective antibody to be examined.
  • Partial sequences of the hTSHR sequence comprising 13 amino acids each were produced in the form of synthetic peptides.
  • the partial sequences were chosen so that the entire hTSHR sequence is imaged and two successive sequences overlap by nine amino acids (eg peptide 1: amino acids 1 to 13; peptide 2: amino acids 4 to 16; peptide 3: amino acids 7 to 19, etc .).
  • the synthetic peptides were then synthesized side by side in the form of approx. 2 x 2 mm "spots" on cellulose paper. This method of peptide production is an established process and is commercially used i.a. by the company JERINI Biotools GmbH, Berlin. For explanation, reference is made to the following references: R.
  • the substrate solution used for visualization was obtained as follows: 6 mg of nitro blue tetrazolium (SIGMA No. N-6876) were dissolved in 6 ml of dimethylformamide. 2.5 mg of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (SIGMA No. B-8503) was dissolved in 0.5 ml of dimethylformamide. 4 ml of the described nitro blue tetrazolium solution, 400 ⁇ l of the 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate solution and 160 ⁇ l of one
  • IM MgCl 2 solution was dissolved in 36 ml of substrate solution from the ELItest ® Anti-TG from BRAHMS Diagnostica GmbH, No. 944638. The solution obtained was put on the cellulose paper.
  • a crude solubilized rhTSHR preparation according to 1.1 was treated with 100 mM HEPES; 0.5% Triton X-100; 0.5% bovine serum albumin
  • coated tubes 200 ⁇ l of the rhTSHR dilution obtained was mixed with 100 ng of the above anti-hTSHR mAb No. 9, and the solution obtained was placed in polystyrene tubes, the walls of which were coated with goat anti-mouse antibodies (mouse - IgG binding capacity about 100 ng) were coated, given and incubated at 4 ° C for 20 h.
  • goat anti-mouse antibodies mouse - IgG binding capacity about 100 ng
  • test tubes used are those which are part of the DYNOtest "TBG kit from B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH.
  • the tubes were filled with 2 ml of washing buffer (10 mM HEPES; 0.1% Triton X-100; pH 7.5), decanted and then dried in a vacuum dryer for 4 h. Unwanted accompanying substances were removed by the washing step, so that the tubes had a highly affinity-purified rhTSHR (rhTSHR (imm) * ) on their walls.
  • washing buffer 10 mM HEPES; 0.1% Triton X-100; pH 7.5
  • Unwanted accompanying substances were removed by the washing step, so that the tubes had a highly affinity-purified rhTSHR (rhTSHR (imm) * ) on their walls.
  • the tubes were used in the determinations described below. They were stored at 4 ° C until used.
  • Triton X-100 5 ⁇ g anti-hTSH-Ab (see 3.2); pH 7.5).
  • the two-step process there is no contact between the sample and the marked bTSH, so that anti-bTSH-Ab no longer represent a disruptive factor, especially if the second step is carried out without serum. For this reason, the two-step variant is currently preferred for carrying out TSHR-Auto-Ab.
  • hTSH normally occurs in extremely low, non-interfering concentrations in human sera.
  • pathologically elevated hTSH concentrations can occur in the hypothyroid state.
  • FIG. 1 shows, at pathologically high hTSH concentrations, the binding of the labeled bTSH is influenced by competition with the hTSH.
  • an hTSH antibody By adding an hTSH antibody to the sample solution, the influence of the presence of hTSH in the sample is eliminated.
  • a suitable hTSH antibody is the commercially available antibody with the article no. 5404 from Oy Medix Biochemica Ab, Finland. The influence of increased hTSH concentrations is eliminated by adding an excess of such an antibody (for example 5 ⁇ g / test). Since the hTSH antibody mentioned shows no cross-reaction with bTSH, it can also be added to the sample solution in the one-step assay variant (cf. 2.1, step 2.) and leads to the same improvement in the measurement results.
  • FIGS. 2 and 3 show the standard curves obtained using the standards according to 1.3 when using 125 I-bTSH (FIG. 2) or acridinium ester-labeled bTSH (FIG. 3).
  • the zero standard is a pool serum of healthy people with thyroid glands;
  • Standards 400 to 3 are mixtures of pool sera from healthy thyroid and Graves' disease patients.
  • the calibration was carried out using the conventional TRAK-Assay ® from BRAHMS Diagnostica.
  • TSHR-Auto-Ab reduce the binding of the labeled bTSH to the surface of the Test tubes in a concentration-dependent manner, starting from
  • the invention enables methods for determining TSHR-Auto-Ab to be improved both with regard to the exclusion of physiological disturbing factors which could falsify the measurement results in previous assays, and in particular in practical terms.

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Abstract

Verbesserte Rezeptorassays zum Nachweis von TSHR-Auto-Ab nutzen immobilisierte, affinitätsgereinigte rTSHR-Präparate als spezifischen Binder. Dadurch sowie durch neue Maßnahmen zur Neutralisierung pathologisch erhöhter hTSH Spiegel in den Seren (Zusatz von Anti-hTSH-Ab) und/oder zur Eliminierung des Einflusses von Anti-bTSH-Ab (durch ein Zweischritt-Protokoll) wird die Zuverlässigkeit von Assays der genannten Art erhöht, und es eröffnet sich die Möglichkeit, die Assaybestandteile in gebrauchsfertiger und/oder gut standardisierter Form, auch für eine automatische Abarbeitung, herzustellen und in den Verkehr zu bringen.

Description

REZEPTORBINDUNGSASSAYS UND REAGENZIENSATZ ZUM NACHWEIS VON
TSH-REZEPTOR-AUTOANTIKÖRPERN
10
15
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Rezeptor- bindungsassays zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TSHR-Auto-Ab) , die bei Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen, insbesondere beim Morbus Basedow, auftreten.
20
Es ist bekannt, daß zahlreiche Erkrankungen, an denen die Schilddrüse beteiligt ist, Autoimmunerkrankungen sind, bei denen Autoantikörper gegen molekulare Strukturen der Schilddrüse gebildet werden, die im Zusammenhang mit der Erkrankung 25 beginnen, als Autoantigene zu wirken. Die wichtigsten bekannten Auotantigene der Schilddrüse sind dabei Thyreoglobulin (Tg) , die Schilddrüsenperoxidase (TPO) und insbesondere der TSH- Rezeptor (TSHR) (vgl. Furmaniak J et al . , Autoimmunity 1990, Vol. 7, S. 63-80) .
30
Der TSH-Rezeptor ist ein in der Schilddrüsenmembran lokalisierter Rezeptor, an den das von der Hypophyse ausgeschüttete Hormon TΞH (Thyroid-stimulierendes Hormon oder Thyreotropin) - 2 - bindet und dadurch die Ausschüttung der eigentlichen Schilddrüsenhormone, insbesondere des Thyroxins, auslöst. Der TSH- Rezeptor gehört zur Rezeptor-Familie der G-Protein-gekoppelten Glykoprotein-Rezeptoren mit einer großen aminoterminalen extra- zellulären Domäne, zu der auch der LH/CG- und der FSH-Rezeptor gehören. Eine Aufklärung der chemischen Struktur des TSH- Rezeptors, d.h. der Sequenz der für ihn codierenden DNA sowie der daraus ableitbaren Aminosäuresequenz des Rezeptors selbst, gelang Ende 1989 (vgl. Libert F. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1250-1255; Nagayama Y. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1184-1190; vgl. auch EP-A-0433509 bzw. WO-A- 91/09121; sowie O-A-91/09137; O-A-91/10735 und WO-A-91/03483 ; ferner Yuj i Nagayama & Basil Rapoport, in: Molecular Endocrino- logy, Vol. 6 No. 2, S. 145-156 und die darin zitierte Litera- tur) .
Es ist allgemein bekannt, daß bei der als Morbus Basedow (englisch: Graves' disease) bekannten Schilddrüsen-Autoimmunerkrankung stimulierende Autoantikörper eine Rolle spielen, die gegen der TSH-Rezeptor gebildet werden und mit diesem so wechselwirken, daß die Schilddrüse stimuliert wird, was sich als Schilddrüsenüberfunktion (Hyperthyreose) äußert. Die Bestimmung von Autoantikörpern gegen den TSH-Rezeptor hat somit für die Diagnose des Morbus Basedow eine erhebliche klinische Bedeutung.
TSHR-Auto-Ab werden in biologischen Proben bisher im wesentlichen nach zwei Verfahrensprinzipien bestimmt (vgl. z.B Morgenthaler N.G. at al . , J Clin Endocrinol Metab 81: 3155-3161 (1996) ) :
Bei Zeilstimulationstests äußert sich die Anwesenheit von stimulierenden TSHR-Auto-Ab, die in der Literatur häufig mit der Abkürzung TSI (TSI = thyroid stimulating immunoglobulins) bezeichnet werden, dadurch, daß bestimmte Funktionen von geeigneten Zellen, die in ihrer Zellmembran natürliche oder rekombinante TSHR aufweisen und mit einer Autoantikörper enthaltenden Probe in Kontakt kommen, durch Stimulation ausgelöst oder verstärkt werden, insbesondere die Bildung von cA P (cyclischem Adenosinmonophosphat) . Bei diesen auch als Bioassays bezeichneten Tests wird selektiv die stimulierende Wirkung gemessen, die Messung ist jedoch außerordentlich aufwendig und daher für die klinische Routinediagnostik wenig geeignet .
Alternativ dazu können Autoantikörper auch unter Verwendung von kompetitiven Rezeptorbindungsassays, insbesondere Radiorezep- torassays, bestimmt werden, z.B. unter Verwendung des TRAK- Assay® der B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH. Zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TSHR-Auto-Ab) wird nach diesem herkömmlichen Verfahren so vorgegangen, daß man die zu bestimmenden Autoantikörper aus einer Serumprobe in flüssiger Phase mit einem radioaktiv markierten bovinen TSH (125I-bTSH) um die Bindungsstellen eines solubilisierten porcinen TSH- Rezeptors (porc.TSHR) konkurrieren läßt (vgl. Southgate, K. et al., Clin. Endocrinol . (Oxford) 20, 539-541 (1984); Matsuba T. et al., J. Biochem.118 , S.265-270 (1995); EP 719 858 A2 ; Produktinformation zum TRAK-Assay® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH). Um das an die porc .TSHR-Präparation gebundene 125I-bTSH zu bestimmen, wird nach Abschluß der Inkubation der eingesetzte solubilisierte porc.TSHR mit einem Fällungsreagens und einem anschließenden Zentrifugierschritt von der flüssigen Phase abgetrennt. Die Bestimmung des Rezeptor-gebundenen 125I-bTSH erfolgt durch Messung der im Sediment gebundenen Radioaktivität. Da die Bestimmung auf einer Konkurrenz (Kompetition) zwischen 125I-bTSH und den zu bestim- menden Autoantikörpern um gemeinsame Bindungsstellen auf dem porc.TSHR beruht, werden bei diesem Verfahren alle solchen und nur solche Autoantikörper erfaßt, die tatsächlich mit bTSH kompetieren. Solche kompetierenden, zur Inhibierung der TSH- Bindung befähigten Autoantikörper werden in der Literatur auch als TBII (TBII = thyrotropin-binding inhibitory immunoglobulin) bezeichnet, und das Ausmaß ihrer Aktivität wird auch als prozentuale sogenannte TBII-Aktivität angegeben. Die bisher bekannten kompetitiven Radiorezeptorassays zum Nachweis von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern weisen verschiedene Nachteile auf, die auf die Qualität bzw. Verfügbarkeit der verwendeten Assaykomponenten, in den Seren einzelner Patienten vorkommende Anomalitäten, die in den bekannten Assays die Meßergebnisse verfälschen können, sowie darauf zurückzuführen sind, daß die Bindungsfähigkeit von TSH-Rezeptorpräparationen generell sehr empfindlich auf Veränderungen des Rezeptors oder der von ihm gebundenen Biomoleküle reagiert. Die Bindung von Biomolekülen von peptidischer oder proteinischer Natur, z.B. von Hormonen oder auch Autoantikörpern, an Rezeptoren ist in der Regel sehr komplexer Natur, und die Ausbildung einer spezifischen Bindung zwischen Rezeptor und Biomolekül ist sehr viel empfindlicher gegenüber strukturellen Veränderungen insbesondere des Rezeptors, als das bei einem üblichen Bindungspaar Antigen/Antikörper der Fall ist, das Grundlage der meisten Immunoassays ist, bei denen Rezeptoren keine Rolle spielen. Versuche, den TSH-Rezeptor zu immobilisieren und/oder zu markieren, führten bisher in der Regel zu strukturellen Veränderungen, die die Funktionalität des Rezeptors stark beeinträchtigen. Das hat zur Folge, daß bisher kaum nacharbeitbare Beschreibungen einer praktischen Umsetzung zahlreicher Assay-Grundtypen, die bei Immunoassays unter Ausnutzung einer Antikörper/Antigen-Bindung zur Verfügung stehen, für den Fall von Rezeptorbindungsassays zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab veröffentlicht wurden, so daß derartige andere Assaytypen in der Praxis für die TSHR-Auto-Ab-Bestimmung noch nicht genutzt werden können. Das gilt insbesondere für solche Assaytypen, bei denen mit immobilisierten Bindungspartnern gearbeitet wird und am Ende der Messung direkt die Konzentration einer an eine Festphase gebundenen Markierung bestimmt wird oder bei denen zur Markierung voluminöse Moleküle wie Enzyme, Enzymsubstrate oder Chemilumineszenzlabel verwendet werden. Da die Messung einer an eine Festphase gebundenen Markierung Grundlage der meisten Assay-Automaten für Reihenmessungen ist, sind die bekannten Assays zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikör- pern bisher nicht auf derartigen Automaten durchführbar.
In dem Patent DE 43 28 070 Cl ist ein Typ eines Rezeptorbindungsassays, der nach der Coated-Tube-Technik arbeitet, beschrieben, bei dem die Schwierigkeit der Herstellung von markierten bzw. immobilisierten funktionalen Rezeptorpräparationen dadurch umgangen wird, daß man an die Festphase Bestandteile eines kompetitierenden Reaktionsystems bindet, das gewissermaßen einen "Schatten" der eigentlichen Rezeptorbin- dungsreaktion darstellt. Für die Schaffung von Assays für die klinische Routinediagnostik hat sich das offenbarte Verfahrensprinzip jedoch als zu kompliziert und daher wenig praktikabel erwiesen. Auf die allgemeinen Ausführungen in der genannten Patentschrift zur Problematik von Rezeptorbindungsassays im allgemeinen und von solchen zur Bestimmung von TSH-Rezeptor- Autoantikörpern im speziellen wird ergänzend ausdrücklich Bezug genommen.
Aus der EP-B-0 488 170 sind zellfreie Rezeptorbindungstests bekannt, bei denen rekombinante Fusionsrezeptoren aus einem aminoterminalen Rezeptorprotein und einem Trägerprotein, insbesondere dem konstanten Teil (Fc) der schweren Kette eines
Immunglobulins, eingesetzt werden, die mittels eines Antiserums oder eines monoklonalen Antikörpers an eine feste Phase gekoppelt sind. Die diskutierten Rezeptoren gehören nicht zur
Klasse der hochmolekularen G-Protein gekoppelten Glykoprotein-
Rezeptoren. Ferner ist eine Immobilisierung durch Bindung eines
Trägerproteins, das der Fc-Teil eines Immunglobulins ist, für
Rezeptorbindungsassays, mit deren Hilfe Autoantikörper bestimmt werden sollen, wenig geeignet, da die Autoantikörper selbst zu den Immunglobulinen gehören und an das Immobilisierungssystem binden können.
Bestimmte Nachteile der herkömmlichen Assays haben auch damit zu tun, daß zur Bestimmung humaner TSHR-Auto-Ab Reaktionspartner unterschiedlicher tierischer Herkunft, d.h. solubili- sierte porcine TSHR-Präparationen in Verbindung mit markiertem bTSH, verwendet wurden. Die genannten Assaykomponenten zeichnen sich zwar durch eine gute gegenseitige Bindung aus und ermöglichen eine Erfassung z.B. von etwa 80% bis 90% der bei Morbus Basedow vorkommenden humanen TSHR-Auto-Ab. Die gegenüber einer 100%igen Erfassung der nachzuweisenden TSHR-Auto-Ab verminderte klinische Wertigkeit ist jedoch vermutlich mindestens teilweise auch darauf zurückzuführen, daß die in Patientenseren vorkommenden Autoantikörper gegen den humanen TSHR gerichtet sind, jedoch aufgrund ihrer Bindung an eine porcine TSHR-Präparation bestimmt werden. Totz der grundsätzlichen Verfügbarkeit von rekombinant erzeugten humanen TSHR- Präparationen (rhTSHR) wurden derartige rhTSHR in klinischen Assays noch nicht eingesetzt, da evtl. zu erwartende Vorteile durch zahlreiche neue praktische Nachteile entwertet wurden. Insbesondere war es bisher genausowenig wie im Falle des porc.TSHR möglich, einen funktionalen, nativen rhTSHR in Assays in festphasengebundener (immobilisierter) oder markierter Form einzusetzen.
Aus den Veröffentlichungen W.B.Minich, M.Behr, und U.Loos, Exp Clin Endocrinol Diabetes 105, 282-290 (1997) sowie "70thAnnual Meeting of the American Thyroid Association" , 15.-19.10.1997, Abstract No . 89 bzw. W.B. Minich, J. D.Weymayer, U.Loos, Thyroid, Vol.8, 3-7 (1998) (im Druck) ist es bekannt, daß es möglich ist, einen rekombinanten humanen Fusions-TSHR über einen gentechnologisch angefügten Peptidrest zu immobilisieren und in dieser Form in TSHR-Auto-Ab-Bestimmungen zu verwenden. Eine entsprechende zusammenfassende Offenbarung findet sich auch in der nicht vorveröffentlichten Internationalen Patentan- meidung WO 98/20343.
In der EP-A 0 719 858 wird ferner ein Verfahren zur Herstellung eines funktionalen rhTSHR mit Hilfe einer Myelom-Zellinie beschrieben. Die Anmeldung erwähnt in allgemeiner, spekulativer Form die Möglichkeit, unter Verwendung des hergestellten rhTSHR-Polypeptids monoklonale Antikörper zu erzeugen, und macht den Vorschlag, solche Antikörper u.a. zur Immobilisierung - 7 - des rhTSHR zu verwenden und davon bei der Bestimmung von TSHR- Auto-Ab Gebrauch zu machen. Es wird jedoch weder die tatsächliche Herstellung und Selektion derartiger monoklonaler Antikörper beschrieben, noch wird konkret gezeigt, daß es dem Vorschlag entsprechend tatsächlich möglich ist, mit den ggf. erhältlichen monoklonalen Antikörpern einen rhTSHR ohne Funktionalitätsverlust zu immobilisieren und in dieser Form bei der Bestimmung von TSHR-Auto-Ab zu nutzen. Die Offenbarung von EP-A 0 719 858 ist insoweit nicht nacharbeitbar. In der zugrunde liegenden issenschaffliehen Veröffentlichung (Matsuba et al . , J. Biochem.118, S.265-270 (1995)) werden monoklonale Antikörper nicht erwähnt.
Nachdem die Molekülstruktur des TSH-Rezeptors aufgeklärt war, wurden mit dem Ziel der Aufklärung der für die TSH-Bindung und die Antikörperbindung zuständigen Epitope des TSH-Rezeptors von zahlreichen Arbeitsgruppen monoklonale und polyklonale
Antikörper gegen vollständige rhTSHR-Polypeptide, gegen den
(ohne das Signalpeptid 398 Aminosäuren umfassenden) N-termina- len extrazellulären Teil solcher Rezeptoren und gegen Konjugate kürzerer Rezeptorpeptid-Teilsequenzen hergestellt (vgl. z.B.
N.G.Morgenthaler at al . , J Clin Endocrinol Metab 81: 3155-3161
(1996); Seetharamaiah GS et al . , Endocrinology 134, No . 2, S.
549-554 (1994); Desai RK et al . , J. Clin. Endocrinol. Metab. 77:658-663, 1993; Dallas JS et al . , Endocrinology 134, No. 3, S. 1437-1445 (1994); Johnstone AP et al . , Mol. Cell. Endocrinol. 105 (1994), R1-R9; Seetharamaiah GS et al . , Endocrinology 136, No. 7, S. 2817-2824 (1995); Nicholson LB et al . , J. Mol. Endocrinol. (1996) 16, S. 159-170; Ropars A et al . , Cell. Immunol . 161, S.262-269 (1995); Ohmori M et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 174, No .1 (1991), S.399-403; Endo T. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, No.3 (1991), S.1035- 1041; Costagliola S et al . , Endocrinology 128, No.3, S.1555- 1562, 1991; Marion S et al . , Endocrinology 130, No.2, S.967-975 (1992); J. Sanders et al . , J. Endocrinol. Invest . 19 (Suppl. No.6); 1996 und weitere, in den genannten Literaturstellen zitierte Veröffentlichungen) . Die verschiedenen Antikörper - 8 - wurden auf ihr Bindungsverhalten gegenüber dem TSH-Rezeptor bzw. rekombinant erzeugten Teilsequenzen davon und insbesondere auch im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die Bindung von TSH an verschiedene Formen bzw. Fragmente des TSH-Rezeptors zu stören, geprüft . Da die verschiedenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper durch Immunisierung unterschiedlicher Tiere und/oder unter Verwendung von rekombinantem Material aus unterschiedlichen Expressionssystemen erzeugt worden waren und außerdem bei den Bindungstests häufig rekombinant erzeugte TSH-Rezeptoren unterschiedlichen Ursprungs bzw. Teilpeptide davon verwendet wurden, und da es sich ferner herausstellte, daß für die Bindung zahlreicher Antikörper die Glykolisierung und/oder korrekte Faltung der Rezeptorpeptide entscheidend sein dürfte, ist die Epitopstruktur von nativen TSH-Rezeptoren und das epitopspezifische Bindungsverhalten der in den polyklonalen Autoantikörperpopulationen humaner Seren vorkommenden Auto- antikörpern noch nicht umfassend geklärt.
In der Veröffentlichung Dallas JS et al . , Endocrinology 134, No. 3, S. 1437-1445 (1994) wird beispielsweise ein mit Hilfe des Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystems hergestellter partieller rekombinanter TSH-Rezeptor, der die Aminosäuren der extrazellulären Domäne des humanen TSH-Rezeptors ohne das N- terminale Signalpeptid aufweist, dazu verwendet, Kaninchen zu immunisieren, und aus den gebildeten Immunglobulinfraktionen werden affinitätschromatographisch unter Verwendung synthetischer Peptide mit jeweils ca. 20 Aminosäuren spezifische Antikörperfraktionen gewonnen. Diese werden dann u.a. auf ihre Eignung untersucht, in einem kommerziellen Rezeptorbindungs- assay die Bindung von TSH einen solubilisierten porcinen TSH- Rezeptor zu blockieren. Die Antikörper zeigten keine stimulato- rische Aktivität.
In der Veröffentlichung Seetharamaiah GS et al . , Endocrinology 136, No. 7, S. 2817-2824 (1995) wird beschrieben, wie der gleiche partielle rekombinante TSH-Rezeptor wie in der vorstehenden Veröffentlichung zur Immunisierung von Mäusen und - 9 - zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen einzelne Epitope des TSH-Rezeptors nach Standardtechniken eingesetzt wurde. Eine ähnliche Vorgehensweise ist beschrieben in Nicholson LB et al . , J. Mol. Endocrinol. (1996) 16, S. 159-170.
Gemäß Seetharamaiah GS et al . , Endocrinology 134, No. 2, S. 549-554 (1994) wird ein wie vorstehend hergestellter partieller rekombinanter TSH-Rezeptor nachträglich gefaltet und nunmehr auf seine Eignung getestet, radioaktiv markiertes bTSH zu binden. Dazu wird er in flüssiger Phase mit radioaktiv markiertem bTSH umgesetzt. Um den entstanden Komplex möglichst quantitativ aus der Reaktionsmischung abzutrennen, wird dann als Teil eines Fällungssystems ein Antikörper zugesetzt, der durch Immunisierung von Kaninchen mit einem Konjugat eines Teilpeptids, das die Aminosäuren 357 bis 372 der vollständigen TSH-Rezeptorsequenz enthält, erzeugt wurde und von dem festgestellt worden war, daß er die Bindung von bTSH an den ungefalteten partiellen rekombinanten TSH-Rezeptor nicht inhibierte (Desai RK et al . , J. Clin. Endocrinol. Metab. 77:658-663, 1993) . Der zugesetzte Antikörper bzw. die ihn und gebundenes radioaktiv markiertes bTSH enthaltenden Komplexe werden dann mit Hilfe von Protein A, das unspezifisch an jegliche Antikörper bindet, ausgefällt. Unter den Versuchsbedingungen scheint die Bindung von Protein A an den rezeptorgebundenen Antikörper die gleichzeitige bTSH-Bindung nicht zu beeinträchtigen.
In der älteren, nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung 196 51 093.7 wird ferner erstmals ein praktisch funktionsfähiger kompetitiver Festphasen-Rezeptorassay zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab beschrieben, bei dem so gearbeitet wird, daß man die zu bestimmenden TSHR-Auto-Ab und markiertes bTSH bzw. ggf. auch einen markierten monoklonalen Antikörper um Bindungsstellen eines solubilisierten TSHR konkurrieren läßt und die gebildeten TSHR-Komplexe mittels eines immobilisierten mono- klonalen Antikörpers an eine Festphase bindet. In der Anmeldung 196 51 093.7 werden dabei solche monoklonalen Antikörper, die relativ kurze Aminosäure-Sequenzen des TSHR erkennen, in - 10 -
Verbindung mit cruden solubilisierten porcinen oder ggf. auch rekombinanten TSHR-Präparaten verwendet. Die Immobilisierung der TSHR-Komplexe erfolgt im Ausführungsbeispiel mit Hilfe einer Affinitätsgels, an das ein sequentieller monoklonaler Anti-hTSHR-mAb gebunden ist. Das Schwergewicht der Lehre der Anmeldung 196 51 093.7 liegt auf der Erhöhung der klinischen Wertigkeit der TSHR-Auto-Ab Bestimmung, insbesondere bei Verwendung der herkömmlichen cruden solubilisierten TSHR- Präparationen . Auf den Inhalt der genannten Anmeldung wird, insbesondere was mögliche Assayvariationen angeht, jedoch ergänzend ausdrücklich Bezug genommen.
Ein besonderes Verfahren zur Gewinnung von Anti-hTSHR-mAb ist ferner beschrieben von S . Costagliola und G.Vassart in J.Endo- crinol. Invest . 20 (Suppl. to no.5), Abstract 4, (1997). Gemäß diesem Verfahren erfolgt eine Immunisierung von Mäusen zum Zwecke der Antikörperbildung nicht mit einem Antigen peptidi- scher Natur, sondern durch intramuskuläre Injektion eines für den hTSHR kodierenden DNA-Plasmidkonstrukts . Es werden auf diese Weise neue monoclonale Antikörper mit hoher Affinität zum nativen hTSHR erhalten. Diese Technik hat sich als sehr wertvoll erwiesen und wird auch im Rahmen der vorliegenden Anmeldung insbesondere zur Herstellung von Anti-hTSHR-mAb genutzt, die konformationelle Epitope erkennen.
Ergänzend sei angemerkt, daß die mit Antikörpern gegen rekombinante TSH-Rezeptoren oder deren Teile gewonnenen Erkenntnisse zu dem Vorschlag führten, zur Bestimmung von TSH- Rezeptor-Autoantikörpern ein drittes, an sich bekanntes Verfahrensprinzip in Form eines Immunpräzipitationsassays zu nutzen, bei dem als Reagens zur Fällung eine Präparation eines extrazellulären Teils eines rekombinanten, durch Einbau von 35S- Methionin markierten TSH-Rezeptors verwendet wird. Bei einem solchen Assay besteht weder eine Selektivität für TSI noch für TBII. (N.G.Morgenthaler at al . , J Clin Endocrinol Metab 81: 700-706 (1996) ) . Die Herstellung des 35S-markierten Rezeptors durch in vitro-Translation ist jedoch außerordentlich aufwendig und teuer, und es gibt keine Meßgeräte, die für eine klinische Routinemessung der von 35S emittierten Strahlung geeignet sind. Das Verfahren ist daher als Meßverfahren für die klinische Routinediagnostik nicht geeignet.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Rezeptorbin- dungsassay zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern zu schaffen, der die beschriebenen Nachteile derartiger kompetiti- ver Rezeptorbindungsassays des Standes der Technik nicht aufweist und von hoher klinischer Wertigkeit ist.
Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten Rezeptorbindungsassay zur Bestimmung von TSH- Rezeptor-Autoantikörpern zu schaffen, bei dem die aus den Reaktionspartnern des Bestimmungsverfahrens gebildeten TSH- Rezeptor-Komplexe direkt in festphasengebundener Form erhalten werden, so daß auch eine automatisierte Durchführung derartiger Rezeptorbindungsassays möglich wird.
Insbesondere ist es ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Rezeptorbindungsassays zum Nachweis von TSH- Rezeptor-Autoantikörpern so zu gestalten, daß bestimmte Störungen der Messung durch anomale Serumbestandteile effektiv ausgeschaltet werden und eine optimale Bindung der Reaktions- partner des Bestimmungsverfahrens gewährleistet ist.
Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die zur Durchführung derartiger verbesserter Rezeptorbindungsassays in der klinischen Routinediagnostik erforderlichen Reagenziensätze (Kits) zu schaffen.
Die genannten Aufgaben werden bei einem kompetitiven Rezeptorbindungsassay gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 wenigstens teilweise durch Radiorezeptorassays gelöst, die die im Kennzeichen des Anspruchs 1 wiedergegebenen Merkmale aufweisen.
Im Rahmen der zur Lösung der o.g. Aufgabe führenden Unter- - 12 - suchungen wurden ferner verschiedene Erkenntnisse gewonnen, die die Bindung von TSH, insbesondere bTSH, an rhTSHR betreffen und in die nachfolgend im experimentellen Teil beschriebenen Tests eingegangen sind.
Derartige vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen verbesserten Rezeptorbindungsassays sind auch Unteransprüchen zu entnehmen, insbesondere in Verbindung mit den detaillierteren Erläuterungen in der nachfolgenden Beschreibung.
Die Aufgabe der Schaffung eines Reagenziensatzes zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung wird durch einen bevorzugten Reagenziensatz gelöst, der wenigstens jeweils einen der Bestandteile (i) und (ii) gemäß Anspruch 13 enthält.
In der Einleitung und im nachfolgenden Teil dieser Anmeldung werden die verwendeten Reagenzien bzw. Analyten/Biomoleküle in der Regel mit verschiedenen Abkürzungen gekennzeichnet, die stets in den folgenden Bedeutungen zu verstehen sind, es sei denn, es ergibt sich aus dem konkreten Zusammenhang für den Fachmann ausnahmsweise etwas anderes . Die Verwendung der speziellen Angaben erfolgt dabei aus Gründen der exakten Beschreibung der durchgeführten Versuche und Messungen, bedeutet jedoch nicht, daß die beschriebenen Ergebnisse und Schluß- folgerungen nur für den beschriebenen Spezialfall gelten. Zahlreiche der vermittelten Informationen sind vielmehr für den Fachmann in ihrer allgemeineren Bedeutung klar erkennbar.
Erläuterungen zu den verwendeten Abkürzungen:
TSH = Thyroidstimulierendes Hormon (Thyreotropin) . Wird die Abkürzung TSH ohne weitere Zusätze verwendet, handelt es sich nicht um ein bestimmtes Produkt, sondern die Bindung bzw. Funktion des Hormons wird in allgemeiner Form diskutiert . - 13 - bTSH Bovines (d.h. aus Rindern gewonnenes) TSH. Präparat, das in Assays zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen den TSH-Rezeptor als Tracer eingesetzt wird (insbesondere radioiodiert oder, wie hierin beschrieben, mit einem Chemi- lumineszenzlabel , insbesondere einem Acridi- niumesterlabel, markiert; es liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, irgendein bekanntes anderes Label zu verwenden) .
;I-bTSH Radioiodiertes, als Kompetitor eingesetztes bTSH. Im Zusammenhang mit der Beschreibung von Assays der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH steht 125I-bTSH insbesondere für ein Produkt, wie es gemäß DE 42 37 430 Cl bzw. EP 0 668 775 Bl erhalten wird und Bestandteil des TRAK-As- say® der Fa. B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH ist.
hTSH Humanes TSH. Kommt im Serum/Plasma Gesunder nur in sehr geringen Konzentrationen 0,2-4 mU/1 vor. In Seren von hypothyreoten Patienten kann die hTSH-Konzentration jedoch signifikant erhöht sein. Die durch erhöhte hTSH-Spiegel (von mehr als 20 mU/1) hervorgerufenen Störungen von Autoantikörper-Messungen werden in der Beschreibung diskutiert und durch spezielle Maßnahmen neutralisiert. Der gegenwärtige Kenntnisstand zur Struktur von hTSH findet sich zusammengefaßt in Grossmann et al . , Endocrine Reviews, Vol.18, 1997, S. 476-501.
TSHR Der TSH-Rezeptor, ein in der Schilddrüsenmembran verankerter Glykoproteinrezeptor . Wird die Abkürzung TSHR ohne weitere Zusätze verwendet, handelt es sich nicht um ein bestimmtes Produkt, sondern die Funktion des Rezeptors bzw. seine Bindungsbeteiligung wird in allgemeiner - 14 - Form diskutiert .
porc.TSHR = Aus Schilddrüsen von Schweinen (porcines) extraktiv gewonnenes solubilisiertes crudes Rezeptorpräparat. Wird in den Radiorezeptor-Prä- zipitationsassays des Standes der Technik zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen den TSHR (herkömmlicher TRAK-Assay® der Fa. B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH) als spezifischer Binder eingesetzt .
rhTSHR Gentechnisch erzeugtes (rekombinantes) Polypep- tid, das die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden humanen TSHR wenigstens in einem solchen Ausmaße aufweist, daß es als "funktionaler humaner TSH-Rezeptor" bezeichnet werden kann, was bedeutet, daß es sich bezüglich der Bindung von Autoantikörpern gegen den TSHR bzw. von hTSH in signifikantem Ausmaß wie der natürlich vorkommende humane TSHR verhält. Wird die Abkürzung rhTSHR ohne weitere Zusätze verwendet, handelt es sich nicht um ein bestimmtes Produkt, d.h. rhTSHR kann für irgendein rekombinantes vollständiges, mehr oder weniger glykosyliertes Polypeptid, eine Teilsequenz einer ausreichenden Länge oder ein gentechnologisch erzeugtes Fusionsprodukt davon stehen (wie es z.B. in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP97/06121 beschrieben wird) . Ohne weitere Erläuterungen liegt ein einfach als "rhTSHR" bezeichnetes Produkt als crude deter- genssolubilisierte Membranpräparation vor, d.h. in der Form, wie sie durch konventionelle Solubilisierung von Membranen der zur Expression des rekombinanten Polypeptids verwendeten Zellen unter Verwendung von Detergenzien erhalten wird. - 15 - rhTSHR (imm) = Selektiv an eine Festphase gebundenes (immobilisiertes) rhTSHR-Präparat . Die Bindung kann - wie in der Beschreibung nachfolgend genauer beschrieben - über einen geeigneten Antikörper erfolgen, kann aber im Falle von Fusionsprodukten auch über einen besonderen Peptidrest, z.B. einen Biotinrest, erfolgen. Die Festphase kann die Wand eines Teströhrchens (Coated-Tube- oder CT-Technik) sein, kann aber auch eine geeignete suspendierte Festphase sein.
rhTSHR(imm)* = Über einen ausgewählten Anti-hTSHR-mAb an eine Festphase (s.o.) gebundener und in gebundener Form durch Waschen von Fremdbestandteilen gereinigter immobilisierter rhTSHR. Wird auch als "äffinitätsgereinigter rhTSHR" bezeichnet.
Ab Antikörper
TSHR-Auto-Ab In biologischen Proben, insbesondere humanem Serum oder Plasma, nachweisbare Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor. Der Nachweis stimulierender derartiger TSHR- Auto-Ab (in der Literatur auch abgekürzt TSI = thyroid stimulating immunglobulins) ist insbesondere für die Diagnose des Morbus Basedow (englisch: Graves' disease) von Bedeutung. Ein kommerzieller Assay (Radiorezeptorassay) zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab ist der TRAK-Assay® der Fa. B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH.
Anti-hTSHR-mAb = Monoklonaler Antikörper, der an rhTSHR bindet . Ohne weitere Erläuterungen kann er, was sein Bindungsverhalten angeht, sequentieller Natur sein, wie z.B. in der älteren Anmeldung DE 196 51 093.7 be- - 16 - schrieben wird, er kann jedoch auch kon- formativer Natur sein. Die Selektion bestimmter derartiger Anti-hTSHR-mAb für die Verwirklichung der erfindungsgemäßen Assays wird in der Anmeldung näher beschrieben. Werden in den Versuchen spezielle Anti-hTSHR-mAb verwendet, werden sie durch eine in der Anmeldung erläuterte Kennummer gekennzeichnet. Wird eine leicht abgewandelte, weniger spezifische Abkürzung (z.B. einfach Anti-TSHR-Ab) verwendet, soll eine an dieser Stelle unnötige Beschränkung auf monoklonale Ab gegen den humanen TSHR vermieden werden.
Anti-bTSH-Ab In humanen Seren bzw. Plasma vorkommende Antikörper ungeklärten Ursprungs, die mit bTSH unter Bildung von Immunkomplexen reagieren und damit die Bindung von bTSH an die Assaykomponenten bzw. das erhaltene Meßergebnis beeinflussen (vgl. Y.Ochi et al . , Acta Endocrinologica (Copenh) 1989, 120: 773-777; S.Sakata et al . , J. Endocrinol . Invest. 14: 123-130, 1991; T. Inui, Thyroid, Vol .6 : 295-299, 1996).
Wie im einleitenden Teil erläutert wurde, enthalten die bekannten kompetitiven Rezeptorbindungsassays, die alle als Radiorezeptorassays ausgestaltet sind, neben den benötigten Standards und Pufferlösungen folgende grundlegenden Assaybestandteile :
(i) Eine TSH-Rezeptor-Präparation als spezifischen Binder, in den herkömmlichen Assays insbesondere einen aus Schweine- Schilddrüsenmembranen gewonnenen solubilisierten nativen porcinen TSH-Rezeptor (porc.TSHR), (ii) 1 5I-bTSH, das mit TSH- Rezeptor-Autoantikörpern aus einer Serumprobe oder Plasmaprobe (TBII) um gemeinsame Bindungsstellen an dem verwendeten TSH- Rezeptor konkurriert und (iii) ein Mittel zur Abtrennung des gebildeten TSHR-Komplexes von der flüssigen Reaktionslösung, das im Falle des herkömmlichen Assay das Fällungsmittel Polyethylenglykol (PEG) ist.
Es ist ein die vorliegende Erfindung gegenüber dem bekannten Stand der Technik auszeichnendes Merkmal, daß experimentell gezeigt wurde, daß es möglich ist, anstelle einer solubilisier- ten TSHR-Präparation einen funktionalen rhTSHR (d.h. einen humanen rekombinanten TSH-Rezeptor) in affinitätsgereinigter Form zu verwenden, der selektiv an einer Festphase immobilisiert ist, ohne daß die Bindungsfähigkeit des affinitäts- gereinigten rhTSHR (rhTSHR (imm) *) gegen die zu bestimmenden TSHR-Auto-Ab und markiertes bTSH nennenswert beeinträchtigt ist. Mit dieser Erkenntnis wurde die Voraussetzung geschaffen, einen in mehrfacher Hinsicht noch weiter verbesserten Rezeptor- bindungsassay zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab zu entwickeln, bei dem die Bestimmung der Menge des gebundenen markierten bTSH direkt in festphasengebundener Form erfolgen kann. Bei der genaueren Untersuchung der Bindung von bTSH an die neuartige TSHR-Präparation wurden zusätzliche wertvolle Erkenntnisse gewonnen, die in die Erfindung bzw. ihre bevorzugten Aus- führungsformen Eingang gefunden haben. Nähere Einzelheiten sind dem experimentellen Teil zu entnehmen. Die wichtigsten der genannten weiteren Erkenntnisse sind:
1. Der Störeinfluß von pathologisch hohen hTSH-Konzen- trationen in einzelnen Patientenproben läßt sich durch Zusatz von bestimmten kommerziell erhältlichen Antikörpern (Anti-hTSH- Ab) zur probenhaltigen Meßlösung neutralisieren, die selektiv hTSH binden und nicht mit dem als Kompetitor eingesetzen bTSH kreuzreagieren .
2. Wenn man die Bestimmung als "Zweischritt-Bestimmung" durchführt, indem man markiertes bTSH in einem nachgeschalteten Schritt mit einem vorher gebildeten und von der ursprünglichen Meßlösung abgetrennten Komplex aus TSHR-Auto-Ab und dem affinitätsgereinigten rhTSHR(imm)* reagieren läßt, kann sich eine mögliche Anwesenheit von Anti-bTSH-Ab in der Patientenprobe nicht mehr störend auswirken.
3. Die oben unter 2. aufgeführte neue Erkenntnis ermöglicht es, die Umsetzung mit bTSH im zweiten Assayschritt mit einem exakt standardisierbaren, von Serum freien bTSH-Reagens durchzuführen .
4. Für die Bindung von bTSH an rhTSHR-Präparationen ist die Anwesenheit von Drittsubstanzen vorteilhaft, z.B. von bestimmten Serumbestandteilen, die als Bestandteile einer Serumfraktion, die nur Substanzen mit Molekulargewichten von <10.000 d enthält, charakterisiert werden konnten. Einige der niedermolekularen Substanzen, die die Bindung verbessern, insbesondere gelöste anorganische Ionen, konnten genauer identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, daß anorganische Ionen jedoch bei Komplexierung durch EDTA, d.h. in festen Komplexen gebunden, die genannte Wirkung nicht aufweisen.
Dadurch, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine Bindung der TSHR-Auto-Ab und des markierten Kompetitors bTSH aus der Meßlösung direkt an einen festphasengebundenen, affinitäts- gereinigten rhTSHR (imm)* gestattet, wird nicht nur die Messung des erhaltenen Signals gegenüber einem Präzipitationsassay im gewünschten Sinne praktisch vereinfacht, sondern das Assayde- sign kann grundsätzlich verändert werden, indem man von einem Einschritt -Assay (eine einzige, durch aufeinanderfolgende Pipettierungen ohne zwischenzeitliche Fest-Flüssig-Trennung erhaltene Meßlösung) zu einem Zweischritt -Assay übergeht, bei dem man die Umsetzung von rhTSHR (imm)* mit der Probe und die Umsetzung mit dem markierten Kompetitor bTSH in zwei aufeinanderfolgenden, durch eine Fest-Füssig-Trennung voneinander abgesetzten Schritten durchführt.
Als Festphasenträger für den affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* können Kunststoffoberflächen, insbesondere die Wände von Kunststoff-Teströhrchen für die CT-Technik, Mikropartikel, Magnetpartikel, Filter, Polymergelmaterialien und andere bekannte Festphasenträger eingesetzt werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die TSHR-Auto-Ab-Bestimmung auch automatisierbar. So kann das Assaydesign so angepaßt werden, daß es an bekannten automatisierten Systemen durchführbar ist (vgl. z.B. Elecsys-System der Firma Boehringer Mannheim oder ACS 180 -System von Chiron) . Bei derartigen automatisierten Systemen werden im Rahmen einer automatischen Abarbeitung die Proben in rezeptorbeschichtete Teströhrchen pipettiert, inkubiert, dann wird die flüssige Reaktionsmischung abgesaugt oder dekantiert, und es wird eine zweite Lösung mit dem markierten bTSH, z.B. 125I-bTSH, zugesetzt. Nach der vσrge- schriebenen Inkubation erfolgt dann die übliche abschließende Fest -Flüssigtrennung, wonach das Signal, gegebenenfalls nach Signalauslösung durch Zugabe geeigneter Reagenzien, gemessen werden kann. Die beispielhaft für einen Zweischritt-Assay angegebene Pipettierschrittfolge ist dabei variabel und z.B. durch die Pipettierfolge eines Einschritt-Assays (2.1.1), ggf. auch ohne vorherige Immobilisierung des rTHSR, ersetzbar.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in ihren verschiedenen Aspekten anhand von konkreten Ausführungsbeispielen und Versuchsergebnissen unter Bezugnahme auf acht Figuren noch näher erläutert . Auf die allgemeinen Erläuterungen im Zusammenhang mit den beschriebenen Versuchen wird ausdrücklich als Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwiesen.
Dabei zeigen die Figuren in Form verschiedener Diagramme:
Figur 1 :
Die Abhängigkeit der Bindung von 15I-bTSH an einen affinitätsgereinigten rhTSHR(imm)* , der in einem vorgeschalte- ten Umsetzungsschritt mit Serum mit steigenden Anteilen hTSH behandelt worden war (Kurvenzug -■-) , wobei ein Teil der Seren (Kurvenzug -A-) zusätzlich einen Überschuß eines selektiven Anti-hTSH-Ab enthielt;
Figur 2 :
Die Standardkurve für die Messsung von TSHR-Auto-Ab unter Verwendung von 125I-bTSH und von einem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* in einem Zweischritt -Verfahren.
Figur 3 : Die Standardkurve für die Messsung von TSHR-Auto-Ab unter
Verwendung von einem mit einem Akridiniumester chemilu- mineszenz -markierten bTSH und von einem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* in einem Zweischritt -Verfahren.
Figur 4 :
Die Ergebnisse der Messung von Patientenseren (100 Kontrollseren; 70 Seren von Morbus Basedow-Patienten) nach dem Zweischritt -Verfahren unter Verwendung von 125I-bTSH und affinitätsgereinigtem rhTSHR (imm) * .
Die nachfolgenden Beschreibungen von Herstellungs- und Meßexperimenten gliedern sich wie folgt:
1. Herstellung/Auswahl der verwendeten Assaykompσnenten;
2. Inkubationsprotokolle für 2 Meßverfahren unter Verwendung von markiertem bTSH und äffinitätsgereinigtem rhTSHR (imm) * nach einer Einschritt- und Zweischritt -Technik; und
3. Ergebnisse der Messung von TSHR-Auto-Ab in Standardproben bzw. Patientenseren unter Verwendung von erfindungsgemäßen Teströhrchen, die mit affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* beschichtet sind, nach dem Prinzip der Kompetition mit markiertem bTSH. 1. Materialien
1.1 Herstellung einer Präparation eines kruden solubilisierten rhTSHR
Um den rhTSHR in hoher Ausbeute in einer Saugetierzellinie zu exprimieren, wurde eine humane chronische Leukämiezellinie analog zu gängigen Arbeitsweisen mit einem bicistronischen Vektor, der die cDNA für den vollständigen humanen TSH-Rezeptor enthielt, stabil transfiziert und in Suspensionskultur gezüchtet. Orientierende Versuche mit anderen Systemen zeigten, daß das spezielle Expressionssystem nicht kritisch ist und mit im wesentlichen gleichem Erfolg auch mit dem in EP-A-0 719 858 beschriebenen, mit Myelom-Zellinien arbeitenden Expressionssystem oder mit dem in PCT/EP97/06121 beschriebenen Vacciniavi- rus/HeLa-Zellen-Expressionssystem gearbeitet werden kann. Auch mit den in EP-B1-0 433 509 beschriebenen Warmblüterzellen konnte der rhTSHR in einer Qualität erhalten werden, die eine Durchführung der Lehre dieser Anmeldung ermöglichte. Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse ist es jedoch wichtig, daß die Expression des humanen TSH-Rezeptors in Säugetierzellen erfolgt, wobei vorzugsweise solche zu verwenden sind, die in Suspension gezüchtet werden können und hohe rhTSHR-Ausbeuten liefern.
Zellen, die den exprimierten rhTSHR in ihrer Zellmembran enthielten, wurden zur Gewinnung einer solubilisierten rhTSHR- Präparation aufgeschlossen, wie genauer beschrieben wird in S. Costagliola et al . , J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 1540-1544 (1992) , wobei alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt wurden. Und zwar wurden jeweils 109 Zellen in 50mM HEPES (4- (2- Hydroxyethyl) -1-piperazin-ethansulfonsäure) ; pH 7,5 aufgeschlossen. Der Aufschluß erfolgte unter Zuhilfenahme eines Potter-Homogenisators (Fa. B Braun Melsungen AG) durch zehnfaches Auf- und Abbewegen des Kolbens bei einer Drehzahl von 900 U/min. Das erhaltene Material wurde bei 100.000 g 30 min zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wurde in 20 ml Puffer (10 mM HEPES; 2% Triton-X-100 ; pH 7,5) unter Wiederholung der beschriebenen Arbeitsweise rehomogenisiert und wiederum 30 min bei 100.000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand, der die krude solubilisierte rhTSHR-Präparation enthielt, wurde portioniert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
1.2 Herstellung von markiertem bTSH
1.2.1 125I-bTSH
125I-bTSH wurde wie in den Patenten DE 42 37 430 Cl bzw. EP 0 668 775 Bl beschrieben, hergestellt.
1.2.2 Mit Akridiniumester chemilumineszenz-markiertes bTSH
Mit Akridiniumester chemilumineszenz-markiertes bTSH wurde wie folgt hergestellt: 100 μg bTSH (50-60 IU/mg Protein,- in 20 mM Natriumphosphat; pH 7,0) wurden mit 10 μl Akridiniumester (Fa. Behringwerke AG, Marburg; vgl. EP 0 257 541 Bl; 1 mg/ml in Acetonitril) für 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt und anschließend mittels HPLC an einer Waters-Protein Pak SW 125- Säule präpariert (Laufmittel: 0,1 M Ammoniumacetat ; pH 5,5; Flußrate: 0,6 ml/min) . Alle Fraktionen des Säulenausflusses mit einer UV-Absorption bei 280 nm und 368 nm wurden gesammelt. Die gepoolte Proteinfraktion wurde bis zur weiteren Verwendung in Rezeptorbindungsassays bei -80 °C gelagert.
1.3 Standards
Standards für die Bestimmung von TSHR-Auto-Ab wurden durch Mischen von TSHR-Auto-Ab-positiven Seren mit bekanntem Antikörpergehalt und Autoantikörper-freien Humanseren hergestellt, jeweils auf 0,05% Natriumazid eingestellt und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Die Kalibrierung der Standards erfolgte am TRAK-Assay" der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH. 1.4 Anti-hTSHR-mAb-Gewinnung und Selektion
Es wurde ein Kollektiv monoklonaler Maus-Antikörper gegen den TSH-Rezeptor unter Anwendung verschiedener Immunisierungs- methoden wie in der Literatur beschrieben, hergestellt (J.S. Dallas et al . , Endocrinology 134, No. 3, S. 1437-1445 (1994) - Immunisierung mit nach dem Baculovirus -Verfahren rekombinant hergestellter extrazellulärer Rezeptordomäne; L.B. Nicholson et al., J. Mol. Endocrinol. (1996) 16, S. 159-190 - Immunisie- rung mit der in Prokaryonten-Zellen oder nach dem Baculovirus- Verfahren erzeugten extrazellulären Rezeptordomäne; Johnstone A.P. et al . , Mol. Cell. Endocrinol. 105 (1994), R1-R9; - Immunisierung mit verschiedenen rekombinanten TSHR-Polypepti- den; Immunisierung mit synthetischen Rezeptorpeptid-Konjugaten; J. Sanders et al . , J. Endocrinol. Invest . 19 (Suppl. to No. 6): 1996, Abstract 33 - Immunisieren mit in E.Coli erzeugten, TSHR- Fragmente enthaltenden Fusionsproteinen; sowie insbesondere S. Costagliola und G. Vassart, J. Endocrinol. Invest. 20 (Suppl. to No. 5) : 1997, Abstract No. 4 - Immunisierung von Mäusen mit einem DNA-Konstrukt) .
Die Selektion sowie Gewinnung einzelner Klone erfolgte wie in den jeweiligen zitierten Literaturstellen beschrieben bzw. nach allgemein bekannten Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper. Die Reinigung der verschiedenen erhaltenen monoklonalen Antikörper erfolgte mittels Protein A-Affinitäts- chromatographie . Elf der erhaltenenen Anti-hTSHR-mAb wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, einen vorher erzeugten Komplex aus rhTSHR und 125I-bTSH zu binden.
Dazu wurde in einem ersten Schritt 12SI-bTSH (36.000 cpm Totalaktivität) mit dem solubilisierten rhTSHR (ca. 1 ng) in einem Gesamtvolumen von 100 μl inkubiert, das 50 mM HEPES; pH 7,5; 10.000 IU/ml Heparin; 10 mM CaCl2; 0,2% Triton X-100 enthielt (vgl. die nachfolgenden Versuchsergebnisse) . Zur Kontrolle der unspezifischen Bindung wurde in separaten Ansätzen je 0,1 IU/ml unmarkiertes bTSH zugesetzt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Bestimmung der Bindung bTSH/- rhTSHR nach drei unterschiedlichen Methoden:
1.4.1 Isolierung von vorher gebildeten bTSH/rhTSHR-Komplexen mittels PEG-Präzipitation (Gewinnung eines Bezugswerts)
Der obigen Reaktionslösung wurden 2 ml PEG-Fällungsreagenz aus dem TRAK-Assay® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH zugesetzt. Anschließend wurde zentrifugiert (10 min bei 2.000 g) , der Überstand wurde dekantiert, und es wurde die im Sediment verbliebene Radioaktivität gemessen. Es wurde eine quantitative Fällung des gebildeten bTSH/rhTSHR-Komplexes festgestellt.
1.4.2 Immunpräzipitation von vorher gebildeten bTSH/rhTSHR- Komplexen mit den zu prüfenden An i-hTSHR-mAb
Zu der obigen Reaktionslösung wurden jeweils 10 μg (in 50 μl des zur Erzeugung des bTSH/rhTSHR-Komplexes verwendeten Puffers) des jeweiligen zu untersuchenden Anti-hTSHR-mAb zugesetzt, und nach einer einstündigen Inkubation wurden als Fällungsreagenz 100 μl Protein A (aus HENNING-Test® anti-TPO der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH) zugegeben, 15 min inkubiert und schließlich 2 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) zugegeben, wonach zentrifugiert wurde (15 min bei 2.000 g) . Durch die Zugabe von Protein A werden alle in der Reaktionsmischung enthaltenen Antikörper ausgefällt. Der bTSH/- rhTSHR-Komplex wird nur insoweit ausgefällt, als er an den zu untersuchenden Antikörper gebunden hat. Demzufolge repräsentiert die im Zentrifugationssegment zu findende Radioaktivität die Menge an bTSH/rhTSHR-Komplex, die von dem jeweiligen Anti- hTSHR-mAb gebunden wurde.
1.4.3 Bindung von vorher gebildeten bTSH/rhTSHR-Komplexen mit Hilfe immobilisierter Anti-hTSHR-mAb (CT-Technik)
Zur Immobilisierung der j eweiligen Anti - hTSHR -mAbs wurden mit Ziegen-anti -Maus -Antikörper beschichtete Polystyrolröhrchen (Kit-Bestandteil des DYNOtest® TBG der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH) mit je 100 ng der zu untersuchenden Anti- hTSHR-mAb mit den Kennummern 1 bis 11 in 200μl PBS 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 2 ml PBS zugegeben, und der flüssige Röhrcheninhalt wurde dekantiert. Die erhaltenen beschichteten Teströhrchen wurden dann direkt mit der oben beschriebenen Reaktionslösung inkubiert, die den bTSH/rhTSHR-Komplex enthielt (100 μl) , und zwar 1 h unter Schütteln bei 300 U/min. Danach wurden die Teströhrchen zweimal mit je 2ml Waschpuffer (10 mM HEPES; 0,1 Triton X-100; pH 7,5) gewaschen, und die auf der Oberfläche der Teströhrchen fixierte Radioaktivität wurde gemessen. Als vollständige Bindung des bTSH/rhTSHR-Komplexes wird der bei der PEG-Fällung erhaltene Radioaktivitätswert eingesetzt, abzüglich der getrennt ermittelten unspezifischen Bindung: (B-UB) = 10.490 - 433 cpm = 10.057 cpm. Dieser Wert entspricht einem B/T-Wert (gebundene Radioaktivität zu eingesetzter Gesamtradioaktivität) von 28 %.
Die bei der Prüfung der Anti-hTSHR-mAb 1-11 erhaltenen Bindungswerte nach den Verfahren 1.4.3 und 1.4.4 werden in der nachfolgenden Tabelle Nr. 1 angegeben, wobei die Radioaktivität des Sediments der PEG-Fällung gemäß 1.4.1 als Bezugswert mit 100% angesetzt wurde. Bei allen gezeigten Daten sind die unspezifischen Bindungen, d.h. die Radioaktivität in Anwesen- heit eines Überschusses an unmarkiertem bTSH, abgezogen.
Tabelle 1
Figure imgf000028_0001
Erläuterungen zu Tabelle 1 :
* Die Werte sind jeweils angegeben als prozentuale Fällung des maximal fällbaren bTSH/rhTSHR-Komplexes (100% = Präzi- pitation bei PEG-Fällung) ;
bestimmt wie beschrieben von Johnstone, A. P. et al . , Mol. Cell. Endocrinol. 105 (1994), R1-R9;
*** vgl. die nachfolgenden Versuche zur Kartierung der Bindungsstellen von Anti-hTSHR-mAb (Maus)
1.4.4. Kartierung der Bindungsstellen von Anti-hTSHR-mAb (Maus)
Das Prinzip der Kartierung beruht darauf, daß festgestellt wird, an welche synthetischen Teilpeptidsequenzen des hTSHR der jeweilige zu untersuchende Antikörper bindet.
1.4.4.1 Herstellung eines Kollektivs von Peptiden, die Teilsequenzen des hTSHR entsprechen.
Es wurden jeweils 13 Aminosäuren umfassende Teilsequenzen der hTSHR-Sequenz in Form synthetischer Peptide hergestellt. Die Teilsequenzen wurden dabei so gewählt, daß die gesamte hTSHR- Sequenz abgebildet wird und je zwei aufeinanderfolgende Sequenzen um neun Aminosäuren überlappen (z.B. Peptid 1: Aminosäuren 1 bis 13; Peptid 2: Aminosäuren 4 bis 16; Peptid 3: Aminosäuren 7 bis 19 usw.) . Die synthetischen Peptide wurden dann nebeneinander in Form von ca. 2 x 2 mm großen "Spots" auf Zellulosepapier synthetisiert. Dieses Verfahren der Peptidher- Stellung ist ein etabliertes Verfahren und wird kommerziell u.a. von der Firma JERINI Biotools GmbH, Berlin, angeboten. Zur Erläuterung wird verwiesen auf die folgenden Literaturstellen: R. Frank, Peptides 1990, 151-152; A. Furga et al . , Int. J. Peptide Protein Res. 37, 1991, 487-493; R. Frank, Tetrahedron Vol. 48, Nr. 42, 9217-9232, 1992. Das Papier mit den Peptid- spots wurde 1 h bei Raumtemperatur in 20 ml sogenannter "Blockierungslösung" inkubiert (Blockierungslösung: 50 MTris; pH 8,0; 50 mM NaCl ; 0,05% Tween 20; 5% Saccharose; 1 x Blocking Reagent der Firma Cambridge Research Biochemicals, Nr. SU- 07- 250) .
1.4.4.2 Charakterisierung der Anti-hTSHR-mAb 1 bis 11
Dem gemäß 1.4.4.1 präparierten Zellulosepapier wurden dann 20 μl einer Lösung zugesetzt, die einen der zu untersuchenden Anti-hTSHR-mAb 1-11 in einer Konzentration von 10 μg/ml enthielt. Anschließend wurde 3h bei Raumtemperatur unter Schwenken inkubiert, danach dekantiert. Das Papier wurde 6 x mit 5 ml "Waschpuffer" gewaschen (Waschpuffer: 50 mM Tris; pH 8,0; 50 mM NaCl ; 0,05% Tween) . Dann wurden 20 ml der obigen Blockierungslösung zugegeben, die 5μl Ziege-anti-Maus-IgG- alkalische Phosphatase-Konjugat der Firma BIORAD, Nr. 172-1015 in frisch verdünntem Zustand enthielt. Es wurde wiederum 2 h bei Raumtemperatur unter Schwenken inkubiert . Dann wurde wiederum dekantiert, und das Papier wurde 6 x mit 5 ml des obigen Waschpuffers gewaschen.
Durch Zugabe einer Substratlösung, die mit der Antikörpergebundenen alkalischen Phosphatase reagiert, wurden schließlich diejenigen Peptide identifiziert, an die der jeweilige untersuchte Anti-hTSHR-mAb gebunden hatte. Die zur Sichtbarmachung verwendete Substratlösung wurde wie folgt erhalten: 6 mg Nitro Blue Tetrazolium (SIGMA Nr. N-6876) wurden in 6 ml Dimethyl- formamid gelöst. 2,5 mg 5-Brom-4-chlor-3 -indolylphosphat (SIGMA-Nr. B-8503) wurden in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst. 4 ml der beschriebenen Nitro Blue Tetrazolium-Lösung, 400 μl der 5-Brom-4-chlor-3 -indolylphosphatlösung sowie 160 μl einer
I M MgCl2-Lösung wurden in 36 ml Substratlösung aus dem ELItest® Anti-TG der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH, Nr. 944638, gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf das Zellulosepapier gegeben.
Nach 20 min bei Raumtemperatur waren diejenigen Peptidspots, an die der untersuchte Anti-hTSHR-mAb gebunden hatte, aufgrund der Substratreaktion violett angefärbt. Die den angefärbten Spots entsprechenden Peptide wurden auf diese Weise als Bindungsstellen des untersuchten Anti-hTSHR-mAb identifiziert. Die auf diese Weise ermittelten Bindungsstellen der untersuchten Anti-hTSHR-mAb sind in der letzten Spalte der obigen Tabelle 1 aufgeführt. Die Anti-hTSHR-mAb mit den Nummern 9, 10 und 11 banden an keines der vorgelegten Peptide, was als Hinweis darauf anzusehen ist, daß diese Antikörper 9, 10 und
II solche sind, die ausschließlich konformationelle Strukturen des rhTSHR erkennen. Die genannten "konformationellen" Anti- hTSHR-mAbs 9, 10 und 11 waren dabei nach dem Verfahren von S. Costagliola und G. Vassart gemäß Veröffentlichung in J. Endocrinol. Invest. 20 (Suppl. 2, No. 5) 1997, Abstract 4 durch Immunisierung von Mäusen mit einem hTSHR-DNA-Konstrukt erhalten worden . Bei den oben unter 1.4.3 beschriebenen Versuchen zur Bindung des bTSH/rhTSHR-Komplexes mit den verschiedenen Anti-hTSHR-mAb hatte sich gezeigt, wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, daß die meisten Antikörper, obwohl in einem erheblichen Überschuß eingesetzt (10 μg Antikörper gegenüber ca. 1 ng rhTSHR!) , nicht in der Lage waren, den bTSH/rhTSHR-Komplex vollständig zu präzipitieren. Lediglich die Antikörper 9, 10 und 11 ermöglichten eine vollständige Fällung des genannten bTSH/rhTSHR- Komplexes, und diese erwiesen sich bei der Kartierung als "kon- formationeile" Antikörper, d.h. solche, die keine bestimmten Peptidesequenzen erkennen, sondern ausschließlich konformatio- nelle Strukturen. Für die Entwicklung eines erfindungsgemäßen Coated-Tube-Assays, bei dem TSHR-Auto-Ab mit Hilfe eines immobilisierten rhTSHR bestimmt werden sollen, wurden daher vorzugsweise die genannten konformationellen Antikörper 9, 10 und 11, die die höchste Bindung lieferten, berücksichtigt.
Es ist jedoch zu betonen, daß die genannten konformationellen Antikörper sich zwar ganz besonders gut zur Immobilisierung von rhTSHR eigneten, daß jedoch auch die restlichen Anti-hTSHR-mAb 1-8 funktionierten, wobei jedoch sehr niedrige Bindungsniveaus erhalten wurden. Derartige monoklonale Antikörper können allein oder gegebenenfalls auch in Form eines Gemischs von zwei oder mehr Anti-hTSHR-mAb zur Bindung von rhTSHR unter Präsentation unterschiedlicher hTSHR-Epitope eingesetzt werden, um im Sinne der Offenbarung in der Patentanmeldung 196 51 093.7 gegebenenfalls zusätzliche Autoantikörper-Subpopulationen im Test zu erfassen und dadurch gegebenenfalls die klinische Wertigkeit zu erhöhen, wenn das sich als erstrebenswert erweisen sollte.
1.5 Immobilisieren und Affinitätsreinigen des rhTSHR unter Gewinnung von Teströhrchen für einen Coated-Tube-Assay zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab
Eine krude solubilisierte rhTSHR-Präparation gemäß 1.1 wurde mit 100 mM HEPES; 0,5% Triton X-100; 0,5% Rinderserumalbumin
(BSA) ; pH 7,5% verdünnt, bis unter Verwendung der Reagenzien des kommerziellen TRAK-Assays® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH bei der gemäß der Arbeitsvorschrift des genannten Assays durchgeführten PEG-Fällung eine etwa 30%ige Bindung des 125I-bTSH erhalten wurde.
Zur Herstellung von beschichteten Röhrchen wurden 200 μl der erhaltenen rhTSHR-Verdünnung mit 100 ng des obigen Anti-hTSHR- mAb Nr. 9 versetzt, und die erhaltene Lösung wurde in Polysty- rolröhrchen, deren Wände mit Ziege-anti-Maus-Antikörpern (Maus- IgG-Bindekapazität ca. 100 ng) beschichtet waren, gegeben und bei 4°C 20 h inkubiert.
Die verwendeten Teströhrchen sind solche, wie sie Bestandteil des Kits DYNOtest" TBG der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH sind.
Nach der Inkubation wurden die Röhrchen mit 2 ml Waschpuffer (10 mM HEPES; 0,1% Triton X-100; pH 7,5) gefüllt, dekantiert und danach in einem Vakuumtrockner für 4 h getrocknet. Durch den Waschschritt wurden unerwünschte Begleitsubstanzen entfernt, so daß die Röhrchen auf ihren Wänden einen hoch affinitätsgereinigten rhTSHR (rhTSHR (imm) *) aufwiesen. Die Röhrchen wurden in die nachfolgend beschriebenen Bestimmungen eingesetzt. Bis zu ihrer Verwendung wurden sie bei 4°C gelagert.
2. Pipettier- und Inkubations-Protokolle
Um das Bindungsverhalten von bTSH an das neuartige affinitäts- gereinigte rhTSHR-Rezeptorpräparat (rhTSHR (imm) *) genauer zu untersuchen, wurden unter Verwendung der wie oben unter 1.5 beschrieben erhaltenen Teströhrchen mit dem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* verschiedene Kontrollversuche durchgeführt, wobei eines der folgenden Pipettier-/Inkubations-Protokolle zur Anwendung kam : 2.1 Einschritt-Assay
1. Pipettiere die Probe (Patientenserum, Standardserum oder Nullstandardserum; 100 μl) in rhTSHR(imm)* beschichtetes
Teströhrchen.
2. Pipettiere dazu 125I-bTSH bzw. Akridiniumester-markiertes bTSH, jeweils in 100 μl 100 mM HEPES; 20 mM EDTA; 0 , 5 mM N-Ethylmaleinimid (NEM) ; 0,1 mM Leupeptin; 1% BSA; 0,5%
Triton X-100; 5 μg Anti-hTSH-Ab (vgl.3.2); pH 7,5).
3. Inkubiere 2 h unter Schütteln (300 U/min) bei Raumtemperatur.
Wasche zweimal mit je 2 ml Waschpuffer, dekantiere.
5. Messe die an der Wand des Teströhrchens fixierte Radio- aktiviät in einem γ-Counter bzw. löse die Lumineszenzreak- tion aus und messe die Chemilumineszenz-Lichtausbeute mit einem geeigneten Luminometer, z.B. Berthold LB 952.
2.2 Zweischritt-Assay
1. Pipettiere in ein rhTSHR (imm) "-beschichtetes Teströhrchen Puffer (200 μl; 100 mM HEPES; 20 mM EDTA; 0 , 5 mM NEM; 0,1 mM Leupeptin; 1% BSA; 0,5% Triton X-100; 5 μg Anti-hTSH- Ab; pH 7,5).
2. Pipettiere die Probe (Patientenserum, Standardserum oder Nullstandardserum; 100 μl) .
3. Inkubiere 2 h unter Schütteln (300 U/min) bei Raumtemperatur.
Pipettiere 2 ml Waschpuffer (vgl. oben), dekantiere 5. Pipettiere 200 μl einer markiertes bTSH (125I-bTSH oder Akridiniumester-markiertes bTSH) enthaltenden Pufferlösung
(10 mM HEPES; 10.000 IU/ml Heparin; 10 mM Calciumchlorid; 1% BSA; 0,1% Triton X-100; pH 7,5).
6. Inkubiere 1 h unter Schütteln (300 U/min) bei Raumtemperatur.
7. Wasche die Röhrchen bei Verwendung von 12SI-bTSH zweimal mit 2 ml Waschpuffer bzw. bei Verwendung des Akridiniume- ster-markierten bTSH viermal mit 1 ml Waschpuffer.
8. Messe die an der Wand des Teströhrchens fixierte Radioaktivität in einem γ-Counter bzw. löse die Lumineszenzre- aktion aus und messe die Chemilumineszenz -Lichtausbeute mit einem geeigneten Luminometer, z.B. Berthold LB 952.
3. Bestimmung von TSHR-Auto-Ab in Patientenseren
3.1 Zweischritt-Assay zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab und seine Vorteile
Durch verschiedene Kontrollversuchen abgesicherte Erkenntnisse ermöglichen es, die TSHR-Auto-Ab-Bestimmung unter Verwendung von rhTSHR (imm) "-beschichteten Teströhrchen als Zweischritt- Assay durchzuführen, bei dem im zweiten Schritt ein serumfreies und daher gut standardisierbares markiertes bTSH-Präparat eingesetzt wird. Der Einsatz von markiertem bTSH in einem zweiten Assay-Schritt in Abwesenheit aller nicht an den immobilisierten rhTSHR gebundenen Probenbestandteile schließt sicher eine Meßwertverfälschung durch Anti-bTSH-Ab aus, die in signifikantem Ausmaße in verschiedenen Patientenseren vorkommen (vgl. obige Erläuterung zu Anti-bTSH-Ab) .
Derartige Anti-bTSH-Ab in Patientenseren führen gemäß dem herkömmlichen Assay-Protokoll zu "falsch" erniedrigten Meßwerten für die TSHR-auto-Ab-Konzentration, da derartige Antikörper zusammen mit dem gebundenen markierten bTSH bei der PEG-Fällung mit ausgefällt werden und eine zu niedrige Bindung von TSHR-Auto-Ab vortäuschen.
Bei der Messung nach dem o.g. Einschritt-Assay-Protokoll führt die Anwesenheit von Anti-bTSH-Ab zu "falsch" erhöhten Meßwerten, da zuwenig markiertes bTSH an die Wände des Teströhrchens gebunden wird.
Im Zweischritt-Verfahren kommt es zu keinem Kontakt zwischen der Probe und dem markierten bTSH, so daß Anti-bTSH-Ab keinen Störfaktor mehr darstellen, und zwar insbesondere dann, wenn im zweiten Schritt serumfrei gearbeitet wird. Derzeit wird daher die Zweischrit -Variante für die Durchführung von TSHR- Auto-Ab bevorzugt.
3.2 Verhinderung einer Meßverfälschung durch pathologisch erhöhte hTSH-Konzentrationen in Patientenseren.
Aufgrund der Verwendung eines humanen TSHR-Präparats als Rezeptorbinder war zu prüfen, ob die Ergebnisse der Bestimmungen von TSHR-Auto-Ab unter Verwendung der o.g. beschichteten Teströhrchen durch die Anwesenheit von hTSH in Patientenproben gestört werden kann. hTSH kommt normalerweise in Humanseren in außerordentlich geringen, nicht störenden Konzentrationen vor. Es ist jedoch bekannt, daß im hypothyreoten Zustand pathologisch erhöhte hTSH-Konzentrationen vorkommen können.
Ein von hTSH befreites Serum (Skandibodies, USA) wurde zur Gewinnung definierter Probenlösungen mit steigenden Mengen an hTSH (Boehringer Mannheim, Deutschland) versetzt. Die erhaltenen Seren wurden als Proben nach dem obigen Zweischritt-Assay- Protokoll (2.2) vermessen.
Wie Fig. 1 zeigt, kommt es bei pathologisch hohen hTSH- Konzentrationen zu einer Beeinflussung der Bindung des markierten bTSH durch Kompetition mit dem hTSH. Indem man der Probenlösung einen hTSH-Antikörper zusetzt, wird der Einfluß der Anwesenheit von hTSH in der Probe aufgehoben. Ein geeigneter hTSH-Antikörper ist der kommerziell erhältliche Antikörper mit der Artikel-Nr. 5404 der Firma Oy Medix Biochemica Ab, Finnland. Durch Zusatz eines Überschusses eines derartigen Antikörpers (z.B. 5 μg/Test) wird der Einfluß von erhöhten hTSH-Konzentrationen beseitigt. Da der genannte hTSH- Antikörper keine Kreuzreaktion mit bTSH zeigt, kann er der Probenlösung auch bei der Einschritt-Assay-Variante (vgl. 2.1, Schritt 2.) zugesetzt werden und führt zur gleichen Verbesserung der Meßergebnisse.
3.3 Verbesserter Assay zur TSHR-Auto-Ab Bestimmung und seine Prüfung in der Praxis
Unter Berücksichtigung aller obigen Erkenntnisse wurde somit ein neuartiger Assay zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab in Patientenseren bzw. -plasmen erhalten, dessen Zuverlässigkeit durch Vermessen eines Kollektivs von Patientenseren überprüft werden konnte, wobei das Zweischritt-Assay- Inkubationsprotokoll (2.2) zur Anwendung kam.
3.3.1 Standardkurven
Die Figuren 2 und 3 zeigen die unter Verwendung der Standards gemäß 1.3 erhaltenen Standardkurven bei Verwendung einmal von 125I-bTSH (Fig.2) bzw. von Akridiniumester-markiertem bTSH (Fig.3) . Der Nullstandard ist dabei ein Poolserum von Schilddrüsen-gesunden Menschen; Standards 400 bis 3 sind Mischungen aus Poolseren von Schilddrüsen-gesunden und von Morbus Basedow- Patienten. Die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung des herkömmlichen TRAK-Assay® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica.
3.3.2 Messung von Patientenseren
Unabhängig von der Art der Markierung des bTSH reduzieren TSHR- Auto-Ab die Bindung des markierten bTSH an die Oberfläche der Teströhrchen in konzentrationsabhängiger Weise, wobei schon ab
3 U/1 ein deutlich positives Signal feststellbar war.
Nach dem beschriebenen Zweischritt-Assay-Protokoll (2.1.2) wurden 100 Kontrollseren Schilddrüsen-gesunder und 70 Seren von
Morbus Basedow-Patienten vermessen. Die Ergebnisse sind in Fig.
4 gezeigt. Es ist deutlich die starke Differenzierung zwischen Seren von Patienten mit Morbus Basedow, die TSHR-Auto-Ab enthalten, und Schilddrüsen-gesunden Kontrollpersonen zu erkennen.
Die Erfindung ermöglicht eine Verbesserung von Verfahren zur Bestimmung von TSHR-Auto-Ab sowohl im Hinblick auf einen Ausschluß von physiologischen Störfaktoren, die die Meßergeb- nisse in bisherigen Assays verfälschen konnten, als auch insbesondere in praktischer Hinsicht. Gestützt auf die Lehre in der vorliegenden Anmeldung ist es erstmals möglich, alle oder wenigstens die meisten Reagenzien für die Durchführung eines solchen Verfahrens in gebrauchsfertiger Form herzustellen und zu Anwendern zur Verfüung zu stellen (z.B. in Form vorbeschichteter Teströhrchen und standardisierter, serumfreier Markierungsreagenzien) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TSHR-Auto-Ab) in einer biologischen Probe mit Hilfe eines Rezptorbindungsassays, bei dem man die Probe mit (i) einem TSH- Rezeptor-Präparat (TSHR-Präparat) und (ii) markiertem bovinem TSH (bTSH) umsetzt, und bei dem man die Anwesenheit und/oder Menge der zu bestimmenden TSHR-Auto-Ab in der biologischen Probe auf der Basis der gebundenen Menge an markiertem bTSH in dem von der flüssigen Phase abgetrennten Komplex aus bTSH bzw. TSHR-Auto-Ab mit dem TSHR ermittelt,
dadurch gekennzeichnet, daß man als TSHR-Präparat einen funktionalen rekombinanten TSH-Rezeptor (rTSHR) verwendet, der mit Hilfe eines selektiven Antikörpers gegen den TSH-Rezeptor (Anti-TSHR-Ab) an eine feste Phase gebunden, im gebundenen Zustand durch Waschen gereinigt und auf diese Weise in einen affinitätsgereinigten immobilisierten rTSHR (rTSHR (imm) *) überführt wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als funktionalen rekombinanten TSH-Rezeptor einen funktionalen rekombinanten humanen TSH-Rezeptor (rhTSHR) verwendet und als selektiven Antikörper wenigstens einen monoklonalen Antikörper gegen den humanen TSH-Rezeptor (Anti-hTSHR-mAb) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Phase die Wände von Teströhrchen verwendet, die mit einem tierspezifischen Antikörper zur Bindung des Anti- TSHR-Ab vorbeschichtet sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der monoklonalen Antikörper ein monoklonaler Antikörper gegen den humanen TSH-Rezeptor
(Anti-hTSHR-mAb) ist, der nur konformationelle Strukturen des rhTSHR erkennt, wie er nach der Technik der Immunisierung mit einem DNA-Konstrukt erhältlich ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekenn- zeichnet, daß man den Rezeptorbindungsassay als Einschritt- Assay in einem mit einem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* beschichteten Teströhrchen durchführt, bei dem man durch Pipettieren (i) der serumhaltigen Probe und (ii) einer Pufferlösung, die das markierte bTSH-Präparat enthält, eine einzige Reaktionslösung herstellt, diese nach einer Inkubation für einen ausreichenden Zeitraum aus dem Teströhrchen entfernt, das Teströhrchen wäscht und die an die Wände des Teströhrchens gebundene Markierung auf an sich bekannte Weise mißt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rezeptorbindungsassay als Zweischritt- Assay in einem mit einem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* beschichteten Teströhrchen durchführt, bei dem man (i) im ersten Schritt nur die Probe und einen Puffer pipettiert, inkubiert, danach dekantiert und die Teströhrchen wäscht und (ii) im zweiten Schritt eine Pufferlösung, die das markierte bTSH-Präparat enthält, in das Teströhrchen gibt, nach einer Inkubation für einen ausreichenden Zeitraum die flüssige Phase aus dem Teströhrchen entfernt, das Teströhrchen wäscht und die an die Wände des Teströhrchen gebundene Markierung auf an sich bekannte Weise mißt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man es in automatisierter Form durchführt, wobei man als Festphase suspendierte Partikel verwendet, die mit einem selektiven Anti-TSHR-Ab beschichtet sind, und daß man die Präparation des rTSHR und die Probe so zusetzt, daß zeitweise eine beide genannten Assaykomponenten enthaltende Probenlösung gebildet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet , daß man das markierte bTSH im zweiten Schritt in einer serumfreien Pufferlösung zugibt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung der Probe mit dem affi- nitätsgereinigten rhTSHR (imm)* in Gegenwart mindestens eines Antikörpers gegen humanes TSH (Anti-hTSH-Ab) durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 9 in Rückbeziehung auf Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der mindestens eine Antikörper gegen humanes TSH so ausgewählt ist, daß er nicht mit bovinem TSH kreuzreagiert.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden TSH-Rezeptor-Auto- antikörper rezeptorstimulierende Autoantikörper sind, deren Auftreten in einem Humanserum für den Morbus Basedow charakteristisch ist.
12. Verfahren zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TSHR-Auto-Ab) in einer biologischen Probe mit Hilfe eines
Rezptorbindungsassays, bei dem man die Probe mit (i) einem TSH- Rezeptor-Präparat (TSHR-Präparat) und (ii) markiertem bovinem TSH (bTSH) umsetzt, und bei dem man die Anwesenheit und/oder Menge der zu bestimmenden TSHR-Auto-Ab in der biologischen Probe auf der Basis der gebundenen Menge an markiertem bTSH in dem von der flüssigen Phase abgetrennten Komplex aus bTSH bzw. TSHR-Auto-Ab ermittelt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rezeptorbindungsassay als Zweischritt-Assay in einem Teströhrchen durchführt, das mit einem affinitätsgereinigten rhTSHR (imm)* oder einem immobilisierten Fusions-rhTSHR beschichtet ist, bei dem man (i) im ersten Schritt eine Probe, die einen Zusatz eines Anti-hTSH- Antikörpers enthält, und einen Puffer pipettiert, inkubiert, danach die flüssige Phase aus dem Teströhrchen entfernt und die Teströhrchen wäscht und (ii) im zweiten Schritt eine serumfreie Pufferlösung, die das markierte bTSH-Präparat enthält, in das Teströhrchen gibt, nach einer Inkubation für einen ausreichen- - 39 - den Zeitraum die flüssige Phase aus dem Teströhrchen entfernt, das Teströhrchen wäscht und die an die Wände des Teströhrchen gebundene Markierung auf an sich bekannte Weise mißt .
13. Reagenziensatz zur Durchführung eines kompetitiven Rezeptorbindungsassays nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er, neben weiteren üblichen Komponenten eines derartigen Reagenziensatzes, wenigstens enthält: (i) mit einem rhTSHR in Form eines affinitätsgereinigten immobilisierten rhTSHR oder eines immobilisierten
Fusions-TSHR beschichtete Teströhrchen, (ii) markiertes TSH oder einen markierten spezifischen TSH- Rezeptor-Antikörper in einer serumfreien Pufferlösung.
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