WO1999020781A1 - Procede de preparation de xylitol - Google Patents

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WO1999020781A1
WO1999020781A1 PCT/JP1998/004672 JP9804672W WO9920781A1 WO 1999020781 A1 WO1999020781 A1 WO 1999020781A1 JP 9804672 W JP9804672 W JP 9804672W WO 9920781 A1 WO9920781 A1 WO 9920781A1
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WO
WIPO (PCT)
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genus
xylitol
streptomyces
arabitol
gluconobacter
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PCT/JP1998/004672
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masakazu Sugiyama
Shunichi Suzuki
Yasuhiro Mihara
Kenichi Hashiguchi
Kenzo Yokozeki
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • Xylitol is useful in the fields of food and medicine. Scenic technology The demand for xylitol, a naturally occurring sugar alcohol, is expected to increase in the future. Xylitol is lower in calories than sugar, but has a sweetness comparable to that of sucrose, making it a promising low-calorie sweetener. In addition, it has anti-erosive properties and can be a carious preventive sweetener. In addition, xylitol is used as a wheel fluid in the treatment of diabetes because it does not raise blood sugar levels.
  • xylitol is produced industrially mainly by hydrogenation of D-xylose as described in US Pat. No. 4,008,825.
  • D-xylose is obtained by hydrolyzing hardwood, straw, corn cobs, oat hulls, and other xylan-rich plant materials.
  • -Xylose has the problem of high price. This is due to the high production costs. For example, the purity of D-xylitol produced is low due to the low yield of hydrolysis of plant material. For this reason, after the hydrolysis treatment, an ion exchange treatment is performed to remove the acid and the dye used for the hydrolysis. In addition, D-xylose is crystallized to remove other hemicellulosic sugars. Further purification is needed to obtain D-xylose suitable for food. These ion exchange treatments and crystallization treatments increase production costs.
  • a method for producing xylitol in which starting materials are easily available and the amount of generated waste is small, is desired.
  • methods have been developed to produce xylitol using other pentitols as a starting material.
  • One of the readily available pentitols is D-arabitol, which is prepared using yeast. (Can. J. Microbiol., 31, 1985, 467-471, J. Gen. Microbiol., 139, 1993, 1047-1054) o
  • xylitol production using the above-mentioned) -arabitol as a raw material can produce xylitol in high yield, but requires a multi-step reaction step, which complicates the process. However, it was not economically satisfactory.
  • DISCLOSURE OF THE INVENTION The problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing xylitol using D-arabitol as a raw material, and to provide the production method with a simple process.
  • the present inventors have found a bacterium having an activity of directly converting!-Arabitol to xylitol, completed the present invention, and solved the above problems.
  • the present invention is characterized in that a microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter and having the ability to convert D-arabitol to xylitol is allowed to act on D-arabitol, and the resulting xylitol is collected. This is a method for producing xylitol.
  • the present invention provides a microorganism which belongs to gluconobacter's suboxydans, gluconobacter's oxydans or acetopacchus xylinum, and has the ability to convert D-arabitol to xylitol, acting on D-arabitol to produce the microorganism.
  • This is a method for producing xylitol, which involves collecting xylitol.
  • the present invention relates to achromopactor, agrobacterium, arsobacter—genus, azotobacter sp., Brevibacterium II, corynebacterium, ervinia, flavopacterium, micrococcus, nocardia, Microorganisms that belong to the genus Planococcus, Pseudomonas or Rhodococcus and have the ability to convert D-arabitol to xylitol!
  • the present invention relates to a chromosome illuminator, a piscous suspension, an agrobacterium, a mefacience, an agrobacterium, a radio bac, an arslobacta, a parafiraineus, an arslobacta, a hydrocarboglutamicus, an azot. Yuichi Baku • Indica, Brevibacterium ketoglu Mimic, Corynebacterium • Faciens, Elvinia / Amiguchi Bora, Flavopacterium 'Peregrinum, Flavobacterium fucatum, Micrococcus' sp.
  • D-arabitol is a microorganism belonging to Nocardia 'opa power, Planococcus' sinus sinus, Pseudomonas' or Xinxia or M. dococcus erythus, and capable of converting D-arabitol to xylitol.
  • the present invention relates to the genus Morganella, Actinomadoura, Actinomyces or Streptomyces, wherein a microorganism having an ability to convert D-arabitol to xylitol is acted on D-arabitol to produce xylitol.
  • the present invention relates to Morganella 'Morganii, Actinomadoura' Madoura, Actinomyces' Biolaseo chromogenes, Streptomyces' Serikara ', Streptomyces' Flaveras, Streptomyces' Griseolus, Streptomyces lividas Olivatheus, Streptomyces 'Est Naxensis, Streptomyces virginie, Streptomyces • Antipioticus, Streptomyces' Kakao or Streptomyces-has the ability to convert to Ravendure and D-arabitol to xylitol
  • the present invention will be misrepresented.
  • the microscopic substances that can be used in the present invention are gluconobacter, acetobacta, lactobacco bacterium, agrobacterium ⁇ , alsulobacta, genus azotopacta, brevibacterium, corynebacterium -, Ervinia, Flavopacteria, Micrococcus ⁇ , Nocardia ⁇ , Planococcus ⁇ , Pseudomonas ⁇ , Rhodococcus ⁇ , Morganella ⁇ , Actinomadoura ⁇ , Actinomyces or Streptomyces It is a microorganism that has the ability to convert to xylitol. Specific examples of the microorganisms include Gluconobactor suboxydans, Gluconobacter oxydance,
  • examples of the non-permanent strains of microorganisms used in the present invention include the following strains.
  • Flavobacterium peregrinum (Flavobacterium peregrinum) CC 1080-A Flavobacterium fucatum AJ2478
  • Mouth Dococcus' Eris Mouth police (Rhodococcus erythropol is) ATCC 11048 Morirekanera ⁇ Morganel la morgani i AJ2771
  • Streptomyces lavendulae ATCC8664 Flavobacterium peregrinum CC 1080-A and Micrococcus sp. CCM825 is a Czechoslovak collection of ob- Collection of Microorganisms, available from Tvrdeho 14, Brno CS-602 00, Czechoslovakia).
  • Flavobacterium fucatum AJ2478 was established on April 25, 1983 by the Ministry of International Trade and Industry, Ministry of Industry and Technology, and the Institute of Microbiological Technology (currently, the Ministry of International Trade and Industry) U3, Hi gash i 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarak i 305-8566, Japan), granted accession number FERM P-7053, based on the Budapest Treaty on September 9, 1998 ⁇ 3 Transferred to last deposit and given accession number FERM BP-6492.
  • Streptomyces virginiae (AJ9053) was deposited on January 16, 1998 with the Institute of Microbial Industry and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (currently the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry) and commissioned. It has been assigned the number FERM P-16587 and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on September 9, 1998, and given the accession number FERM BP-6495.
  • Nocardia opaca NCIB9409 is the National Collection of Industrial and Marine Bacteria. The dwelling unit if NCIMB Lts., Torry Research Station 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DG, United Kingdom).
  • Erwinia amylovora IF012687, Actinomyces violaceochromogenes IF013100 and Streptomyces lvidans IF013385 are the most important ingredients in the institute. (Institute for Fermentation, Osaka., 17-8D, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan).
  • Corynebacterium 'Faciens (Corynebacterium fasciens) IAM1079, Gluconobacter oxydans IAM1842 and Gluconobacter oxydans IAM1839 is an in situ-to-cell molecular Institute of Molecular and Cellular Biosciences (Formerly, Institute of Applied Microbiology), Address: Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan It is available from The University of Tokyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan.
  • the medium for culturing these microorganisms is not particularly limited, and may be a normal medium containing ordinary carbon sources, nitrogen sources, inorganic ions, and, if necessary, organic nutrients.
  • carbon source carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids, and others are appropriately used.
  • Nitrogen sources include ammonia gas, aqueous ammonia, and ammonia Pum salt, nitrate and others are used.
  • a phosphorus source a potassium salt, a sodium salt or the like of phosphoric acid is used.
  • a magnesium ion, a potassium ion, an iron ion, a manganese ion, a sulfate ion and others are appropriately used as needed.
  • organic nutrients, vitamins, amino acids, etc. and lever extract, yeast extract, malt extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, etc. containing these are used as appropriate.
  • the culture conditions There are no particular restrictions on the culture conditions.For example, under aerobic conditions, the pH and temperature are within the range of 5 to 8 and the temperature is 25 to 40 ° C.
  • Culture may be performed. By contacting the microorganism thus cultured with D-arabitol, xylitol can be produced in the reaction solution.
  • the “microorganism” may be a cell itself or a processed product of the cell as long as it has the ability to convert D-arabitol to xylitol. Specifically, a culture containing bacterial cells, the cells isolated and recovered from the culture, the cultured cells, the treated cells, the cells treated with acetone or freeze-dried, etc. A fraction or a purified enzyme fraction, or a “stabilized product” of these processed products is obtained.
  • the reaction usually gives good results at temperatures between 20 and 60 ° C, preferably between 30 and 40 ° C, at pH 4.0 to 9.0, preferably at pH 6.5 to 7.5.
  • the pH of the reaction solution is prevented from lowering by adding calcium Kate to the reaction solution, for example, to 23 ⁇ 4 (w / v)
  • the yield of xylitol can be increased. May be possible.
  • either a static reaction or a stirring reaction can be employed.
  • the reaction time varies depending on conditions such as the activity of the cells used and the concentration of D-arabitol, but is preferably 1 to 100 hours.
  • a carbon source is added during the reaction, the amount of xylitol produced may increase.
  • a carbon source is added to the reaction solution.
  • the carbon source to be added include sugars, sugar derivatives, alcohols, aldehydes, and organic acids.
  • sugar examples include glucose, fructose, sucrose, and lactose.
  • sugar derivatives include sugar alcohols such as sorbitol, mannitol, and glycerol, and aldonic acids such as gluconic acid.
  • alcohols as alcohols,
  • These carbon sources may be used alone, or two or more arbitrary carbon sources may be used as a mixture.
  • the amount of these carbon sources to be added varies depending on conditions such as the activity of the cells used and the concentration of D-arabitol, but is 0.5 to 30% (w / v) in total, preferably 0.5 to 10% (w / v). ) Gives favorable results.
  • the reduction reaction of D-xylulose can be efficiently performed by directly adding NAD or NADH to the reaction system. Let it proceed.
  • a bacterium which succumbs to Gluconobacter genus or Acetobacter ⁇ ⁇ ⁇ as the microorganism NADH, Achromobacter ⁇ , Agrobacterium ⁇ , Arslobacta ⁇ , Azotobacter ⁇ , Brevibacterium are used.
  • Xylitol produced in the culture solution as described above is collected and separated from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, a method of removing solids by centrifugation, filtration, etc., followed by decolorization and desalting with activated carbon or an ion exchange resin, and crystallization from the solution can be employed.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the raw materials D-arabitol and The generated xylitol was analyzed by high performance liquid chromatography (HP LC) under the following conditions. Column: Shodex SC1211 [Showa Denko KK]
  • RI detector Example 1 Ordinary bouillon (Eiken ⁇ ⁇ product) Dispense medium (pH 7.0) 1 ⁇ 21 containing 1.8% (w / v) into a test tube and heat at 120C for 20 minutes. did. Separately sterilized D-arabitol, xylitol, and D-xylose were added to this medium to 1% each. The bacterial suspensions shown in Table 1 were in contact with the medium, and cultured at 30 ° C for 2 days with shaking. The cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • Each of the cultured cells was suspended in a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.0) to a wet weight of 5% (w / v).
  • Glass beads manufactured by Biospec products, 0.1 diameter in diameter
  • the bacterial suspension was disrupted using a Multi-Beads Shocker MB-200 (manufactured by Yasui Kikai). Crushing was performed at 3000 rpm for 3 minutes, and the cell suspension thus obtained was used as a crude enzyme solution in the following conversion reaction.
  • Rhodococcus erythropol is ATCC11048 5.5 11.0
  • Example 2 Medium containing yeast extract (Yeast Extract) 0.2% (w / v), meat extract (Meat Extract) 0.2%, peptone (Peptone) 0.4%, NaCl 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate 0.2% (pH 7.2) Dispense 50ml into a 500ml flask, 120. C, heat sterilized for 20 minutes. Separately sterilized D-arabitol, xylitol, and D-xylose were added to this medium to a concentration of 1%. The cells shown in Table 2 were inoculated into this medium, and cultured with shaking at 30 ° C for 2 days. The cells were collected from the culture by centrifugation, Was washed once.
  • Each culture was suspended in a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.0) at a wet weight of 5% (w / v).
  • Glass beads Biospec products, 0.1 thigh in diameter
  • Crushing was performed at 3000 rpm for 3 minutes, and the obtained cell suspension was used as a crude enzyme solution in the following conversion reaction.
  • This medium was inoculated with Gluconobacter oxysidans ATCC621, Gluconobacter saboxydans NRRLB-755 and Acetobacter xylinum ATCC14851, and cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • Example 4 A medium (pH 7.0) containing potato dextrose (Difco) 2.4% / v), yeast extract (Difco) 3%, meat extract (Difco) 0.5%, and glycerol 1.5% in 500ml Sakaguchi The mixture was dispensed into a flask and sterilized by heating at 120 ° C. for 15 minutes. Separately sterilized D-arabitol, xylitol and D-xylose were added to this medium to 1%, and calcium carbonate to 2.0%. This medium was inoculated with Gluconobacter oxydans ATCC621, and cultured with shaking at 30 for 3 days. Cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • Example 5 500 ml Sakaguchi flask containing 40 ml of a medium (pH 7.0) containing 2.4% (w / v), 3% of yeast extract (Difco), 0.5% of meat extract (Difco) and 1.5% of glycerol And sterilized by heating at 120 ° C for 15 minutes. Separately sterilized D-arabitol, xylitol, and D-xylose were added to this medium to 1%, and calcium carbonate to 2.0%.
  • Gluconobacter The oxydance N-dish LB-755 and Acetopaku Yuichi xylinum ATCC14851 were inoculated, respectively, and cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • Acetobacter xylinum ATCC 14851 32 64
  • Example 6 50 ml of a medium (pH 7.0) containing potato dextrose (product of Difco) 2.4% (w / v), yeast extract (Difco) 3%, meat extract (Difco) 0.5%, and glycerol 1.5 was divided into 500 ml Sakaguchi flasks. It was poured and sterilized by heating at 120 ° C for 15 minutes. After the D-arabitol solution was sterilized at 120 ° C. for 15 minutes, it was added to the above medium so as to be 3.0. Further, calcium carbonate lg was subjected to dry heat sterilization at 200 ° C. for 120 minutes and added to the above medium. This medium was inoculated with Gluconobacter evening oxydans ATCC621, and cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Cells were collected from the culture by centrifugation and washed once with physiological saline.
  • D-arabitol is dissolved in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 6.0) to a concentration of 5% (w / v), and the above washed cells are added with about 10% (w / v) by wet weight. It was added so that it might become. 10 ml of this reaction solution was placed in a test tube, and a shaking reaction was performed at 30 ° C. After 24 hours reaction, centrifuge After the cells were further removed, xylitol produced was quantified by HPLC. Table 6 shows the results. As shown in Table 6, xylitol was produced and accumulated from D-arabitol. Table 6 Concentration and yield of xylitol produced by the reaction Strain Concentration of xylitol produced (g / 1) Reaction yield (3 ⁇ 4)
  • xylitol can be produced by a simple process using D-arabitol as a raw material.

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Description

明細書 キシリ トールの製造法 技術分野 本発明は、 キシリ トールの製造法に関する。 キシリ トールは、 食品、 医薬分野 等で有用である。 景技術 天然に存在する糖アルコールであるキシリ トールの需要は今後増加することが 予想される。 キシリ トールは、 ^糖よりもカロリーが低いが蔗糖に匹敵する甘味 を呈し、 低カロリー甘味料として将来有望である。 加えて、 抗ぅ蝕性を有してお り、 虫歯予防甘味料となりうる。 さらに、 キシリ 卜一ルは血糖値を上昇させない ため、 糖尿病治療の際の輪液として利用されている。
現在、 キシリ 卜一ルは主として米国特許^ 4, 008, 825に記載されるような D-キシ ロースの水素添加により工業生産されている。 料となる D-キシロースは、 硬木、 藁、 とうもろこしの穂軸、 オート麦の外皮、 その他キシランに富んだ植物材料を 出発材料とし、 これを加水分解することによって^られる。
しかし、 植物材料を加水分解して得られる!)-キシロースは価格が高いという問 題点がある。 これは、 生産コストが高いことによる。 例えば、 植物材料の加水分 解処理の収率が低いため、 生成する D-キシリ トールの純度は低くなる。 このため、 加水分解処理後に、 イオン交換処理をして加水分解に用いた酸および色素を除去 する。 さらに、 D-キシロースを結晶化して他のへミセルロース性糖類を除去する。 食品に適する D-キシ口一スを得るためにはさらなる精製が必要となる。 これらィ ォン交換処理および結晶化処理が生産コストの上昇につながる。
この問題点を解決するため、 出発材料が容易に手に入り、 かつ生じる廃棄物の 量が少ないキシリ トールの製造法が望まれている。 例えば、 他のペンチトールを 出発原料としてキシリ トールを生産する方法が開発されてきた。 容易に手に入る ペンチトールのひとつが D-ァラビトールであり、 D-ァラビトールは酵母を用いて 製造できる (Can. J. Microbiol . , 31, 1985, 467-471, J. Gen. Microbiol . , 139, 1993, 1047-1054) o
そこで、 D-ァラビトールを原料とするキシリ トール生産法がいくつか開発され ている。 Applied Microbiology. , 18, 1969， 1031-1035 には、 デバリオミセス · ハンゼニイ （Debaryomyces hansenii) ATCC20121を用いて、 発酵によりグルコ一 スから！)-ァラビトールを生産し、 次に、 ァセトパク夕一 'サブォキシダンス （Ac etobacter suboxydans) を用いて同 D-ァラビトールを D-キシルロースに変換し、 さらにキャンディダ ·ギリエルモンディ ' ヴァリ. ソャ （Candida gui 11 iermond ii var. soya) を同！)-キシルロースに作用させキシリ トールに変換する方法が報 告されている。
また、 ヨーロッパ特許出願公開第 403392号 （出願人ロケッテ ' フレレス（Roque tte Freres)) および同第 421882 ¾ (出願人ロケッテ ·フレレス（Roquette Frere s) ) には、 耐浸透圧酵母を用いて！) -ァラビトールを発酵生産し、 次にァセトバク 夕一属細菌、 グルコノバクタ一屈細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて同 D-ァ ラビトールを!)-キシルロースに変換し、 次いで同キシルロースにグルコース （キ シロース） ィソメラ一ゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物を生 成し、 さらに生成したキシロース/キシルロースに水素添加してキシリ トールに 変換する方法が開示されている。 また、 同キシロース/キシルロース混合物中の キシロースを予備濃縮し、 これに水素添加してキシリ トールに変換する方法が開 示されている。
しかし、 上記])-ァラビトールを原料とするキシリ トール生産法は、 高収率でキ シリ トールを生成することができるが、 多段階の反応ステップを必要とするため にプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、 そのため経済的にも満足のい くものではなかった。 発明の開示 本発明が解決しょうとする課題は、 D-ァラビトールを原料としてキシリ トール を製造する方法であって、 かつ、 プロセスが単純な同製造法を提供することにあ る。 鋭意検討の結果、 本発明者らは!)-ァラビトールをキシリ トールに直接変換する 活性を持つ菌を見出し、 本発明を完成させ、 前記課題を解決した。
すなわち本発明は、 グルコノバクター属またはァセ トパクター属に属し、 D -ァ ラビトールをキシリ トールに変換する能力を持つ微生物を D-ァラビトールに作用 させ、 生成するキシリ トールを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法 である。
さらに本発明は、 グルコノバクタ一 'サブォキシダンス、 グルコノバクタ一 ' ォキシダンスまたはァセ 卜パク夕一 · キシリナムに属し、 D-ァラビトールをキシ リ トールに変換する能力を持つ微生物を D-ァラビトールに作用させ、 生成するキ シリ トールを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法である。
また本発明は、 ァクロモパクター屈、 ァグロバクテリウム属、 ァルスロバクタ —属、 ァゾトバクタ一腐、 ブレビバクテリウム厲、 コリネバクテリウム属、 エル ビニァ属、 フラボパクテリゥム屈、 ミクロコッカス屈、 ノカルディア属、 プラノ コヅカス厲、 シユードモナス厲またはロ ドコッカス属に属し、 D-ァラビトールを キシリ トールに変換する能力を持つ微生物を！)-ァラビトールに作用させ、 生成す るキシリ トールを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法である。 さらに本発明は、 ァクロモバク夕一 ' ピスコ一サス、 ァグロパクテリゥム ' ヅ メファシエンス、 ァグロパクテリゥム ' ラジオバク夕一、 ァルスロバクタ一 'パ ラフイネウス、 ァルスロバクタ一 · ヒ ドロカーボグルタミカス、 ァゾ卜バク夕一 • インディカス、 ブレビバクテリウム · ケトグル夕ミカム、 コリネバクテリゥム • ファシエンス、 エルビニァ · アミ口ボーラ、 フラボパクテリゥム 'ペレグリナ ム、 フラボバクテリウム · フカタム、 ミクロコッカス ' s p . C C M 8 2 5 , ノカルディア 'ォパ力、 プラノコッカス 'ュ一シナタス、 シュ一ドモナス ' シン キサン夕または口 ドコッカス ·エリス口ポリスに属し、 D-ァラビトールをキシリ トールに変換する能力を持つ微生物を D-ァラビトールに作用させ、 生成するキシ リ トールを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法である。
また本発明は、 モルガネラ属、 ァクチノマドウラ属、 ァクチノマイセス属また はストレブトマイセス属に厲し、 D-ァラビトールをキシリ トールに変換する能力 を持つ微生物を D-ァラビトールに作用させ、 生成するキシリ トールを採取するこ P JP 8/ 672
4
とを特徴とするキシリ トールの製造法である。
さらに本発明は、 モルガネラ 'モルガ二、 ァクチノマドウラ 'マドウラ、 ァク チノマイセス ' ビオラセォクロモゲネス、 ス トレプトマイセス 'セリカラ一、 ス 卜レプトマイセス ' フラベラス、 ストレプトマイセス ' グリセオラス、 ス トレプ トマイセス · リビダンス、 ス トレブトマイセス ·オリバセウス、 ストレプトマイ セス '夕ナシェンシス、 ス トレブトマイセス ·バージニェ、 ストレプトマイセス • アンチピオティカス、 ストレプトマイセス ' カカオィまたはストレプトマイセ ス - ラベンデュレに Sし、 D-ァラビトールをキシリ トールに変換する能力を持つ 微生物を D-ァラビトールに作川させ、 生成するキシリ トールを採取することを特 徴とするキシリ トールの ¾迠法である。 以下本発明を詐細に【 |リ jする。
本発明に川いられる微^物は、 グルコノバクタ一屈、 ァセ トバクタ一厲、 ァク 口モバク夕一^、 ァグロバクテリウム厲、 ァルスロバクタ一厲、 ァゾトパクター 属、 ブレビバクテリウム屈、 コリネバクテリウム厲、 エルビニァ属、 フラボパク テリゥム厲、 ミクロコッカス厲、 ノカルディア厲、 プラノコッカス属、 シュ一ド モナス厲、 ロ ドコッカス屈、 モルガネラ屈、 ァクチノマドウラ厲、 ァクチノマイ セス属またはス トレプトマイセス履に属し、 D-ァラビトールをキシリ トールに変 換する能力を持つ微生物である。 上記微生物として具体的には、 グルコノバクタ一 ·サブォキシダンス、 グルコ ノバクタ一 ·ォキシダンス、
ァセ卜パクター ·キシリナム、
ァクロモバク夕一 ' ピスコ一サス、
ァグロパクテリゥム · ヅメファシエンス、 ァグロパクテリゥム · ラジオバク夕 一、 ァルスロバクタ一 'パラフイネウス、
ァルスロバクタ一 · ヒ ドロ力一ボグル夕ミカス、
ァゾ卜パクター · ィンディカス、
ブレビパクテリゥム ·ケトグルタミカム、
コリネバクテリゥム · ファシエンス、 CTJP 72
5
エルビニァ ·ァミロボ一ラ、
フラボパクテリゥム 'ペレグリナム、 フラボパクテリゥム · フカタム、 ミクロコッカス - sp. CCM825、
ノカルディア ·ォパ力、
プラノコヅカス ·ユーシナタス、
シュ一ドモナス · シンキサン夕、
ロ ドコ ヅカス ，エリス口ポリス、
モルガネラ ·モルガ二、
ァクチノマドウラ 'マドウラ、
ァクチノマイセス ' ビオラセォクロモゲネス、
ストレプトマイセス 'セリカラー、 ス トレプトマイセス ' フラベラス、 ストレ プトマイセス · グリセオラス、 ス トレプトマイセス · リビダンス、 ストレプトマ イセス 'オリバセウス、 ス 卜レプトマイセス ' 夕ナシェンシス、 ストレブトマィ セス 'バージニェ、 ス トレプトマイセス ' アンチピオティカス、 ストレプトマイ セス 'カカオィ、 ストレプ卜マイセス ' ラベンデュレ等が挙げられる。 さらに、 本発明に川いられる微生物の Π休的な [ '株としては、 以下のような菌 株が挙げられる。
グルコノバクタ一 .サブォキシダンス（Gluconobacter suboxydans) NRRLB-755 グルコノバクタ一 ·ォキシダンス（Gluconobacter oxydans) ATCC621
グルコノバクタ一 'ォキシダンス（Gluconobacter oxydans) I AM 1842
グルコノバクタ一'ォキシダンス（Gluconobacter oxydans) I AM 1839
ァセ トバク夕一 . キシリナム（Acetobacter xylinum) ATCC14851
ァクロモバク夕一 · ビスコーサス（Achromobacter viscosus) ATCC 12448 ァグロバクテリウム · ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens) ATCC2778 ァグロバクテリウム . ラジオパクター（Agrobacterium radiobacter) ATCC4718 ァルスロバクタ一 'ノ、。ラフイネウス（Arthrobacter paraffineus) ATCC15590 アルスロバクタ一バラフイネウス（Arthrobacter paraffineus) ATCC15591 ァルスロパクター 'ノ ラフイネウス（Arthrobacter paraffineus) ATCC19064 ァルスロバクタ一'ノ ラフイネウス（Arthrobacter paraffineus) ATCC19065 ァ レスロノ、ク夕ー · ヒ ドロカーボグソレ夕ミカス (Arthrobacter hydrocarboglutam icus ) ATCC15583
ァ V トバク夕一 · ィンディカス（Azotobacter indicus ) ATCC9037
フ"レビノ クテリゥム ·ケ卜グノレ夕ミカム（Brevibacterium ketoglutamicum) ATCC
15587
ブレビバクテリウム 'ケトグル夕ミカム（Brevibacterium ketoglutamicum) ATCC 15588
コリネノ クテリゥム · ファシエンス（Corynebacterium fasciens) IAM1079 エルビニァ · アミロボ一ラ（Erwinia amylovora) IF012687
フラボパクテリゥム 'ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum) CC 1080-A フラボパクテリゥム · フカタム（Flavobacterium fucatum) AJ2478
ミクロコヅカス · s p - (Micrococcus sp. ) CCM825
ノカルディア ·ォパカ（Nocardia opaca) NCIB9409
プラノコヅカス ·ューシナ夕ス (Planococcus eucinatus) AJ1656
シュ一ドモナス · シンキサン夕（Pseudomonas synxantha) ATCC796
口 ドコッカス 'エリス口ポリス（Rhodococcus erythropol is) ATCC 11048 モリレカネラ ■モ レガ二 (Morganel la morgani i ) AJ2771
ァクチノマドウラ -マドウラ (Actinomadura madurae) ATCC 19425
ァクチノマイセス · ビオラセォクロモゲネス (Actinomyces violaceocnromogene s) IF013100
ストレプトマイセス セリカラー (Streptomyces coel icolor) ATCC10147 ス トレブトマイセス フラベラス （Streptomyces flavelus) AJ9012
ストレプトマイセス グリセオラス (Streptomyces griseolus ) NRRL B-1062 ス トレプトマイセス リビダンス (Streptomyces l ividans) IF013385 ストレプトマイセス オリバセウス ( Streptomyces ol ivaceus ) ATCC21379 ストレプトマイセス 夕ナシェンシス（Streptomyces tanashiensis) ATCC15238 ストレプトマイセス ノ 一ジニ工 (Streptomyces virginiae ) AJ9053
ス トレプトマイセス カス ( Streptomyces antioioticus ) NRRL 3 ストレプトマイセス ' カカオィ （Streptomyces cacaoi ) ATCC19093
ストレプ卜マイセス · ラベンデュレ （Streptomyces lavendulae ) ATCC8664 フラボパクテリゥム ·ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum) CC 1080-A およびミクロコヅカス · s p . (Micrococcus sp. ) CCM825は、 チェコスロバヅク • コレクション · ォブ ·マイクロオーガ二ズムズ（Czechoslovak Col lection of Microorganisms、 住所 Tvrdeho 14, Brno CS-602 00, Czechoslovakia)から入手 可能である。
フラボパクテリゥム · フカタム（F lavobacterium fucatum) AJ2478は、 1983年 4 月 25日に通商産業省工^技術院微生物工業技術研究所 （現通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所） （住所 卜 3, Hi gash i 1-chome , Tsukuba-shi , Ibarak i 305-8566 , Japan) に 託され、 受託番号 FERM P- 7053が付与され、 1998年 9月 9日にブダぺスト条約に Λづく Π3際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 6492が付 与されている。
プラノコッカス 'ュ一シナタス（Planococcus euc inatus ) AJ1656は、 1987年 1月
19曰に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （現通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所） に寄託され、 受託番号 FERM P- 9133が付与され、 1998年 9 月 9日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移^され、 受託番号 FERM BP-6493が 付与されている。
モルガネラ ·モルガ二 ( Morganel la morgani i ) AJ2771は、 1998年 1月 16日に通 商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （現通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所） に寄託され、 受託番号 FERM P- 16594が付与され、 1998年 9月 9日 にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERMP BP- 6496が付与さ れている。
ストレプトマイセス · フラベラス （Streptomyces f lavelus ) AJ9012は、 1998年
1月 16日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （現通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所） に寄託され、 受託番号 FERM P- 16585が付与され、 1998 年 9月 9日にブダぺス卜条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 64 94が付与されている。
ストレプトマイセス 'パージニェ （Streptomyces virginiae) AJ9053は、 1998 年 1月 16日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （現通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所） に寄託され、 受託番号 FERM P- 16587が付与され、 19 98年 9月 9日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 6495が付与されている。
ノカルディア 'ォパカ（Nocardia opaca) NCIB9409は、 ナショナル 'コレクショ ン ·ォブ · ィンダストウリアル ' アンド 'マリン 'バクテリア （ National Coll ections of Industrial and Marine Bacteria.、 住戸 if NCIMB Lts. , Torry Resea rch Station 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom) から入手可 能である。
エルビニァ 'アミ口ボーラ（Erwinia amylovora) IF012687、 ァクチノマイセス •ビオラセォクロモゲネス (Actinomyces violaceochromogenes) IF013100 およ びス トレプトマイセス · リビダンス （Streptomyces l ividans ) IF013385 は、 ィ ンシュティチュ一卜 · フォア . ファーメンテーシヨン ·ォォサ力 （Institute fo r Fermentation, Osaka.、 所 17-8D, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532， Japan) から入手可能である。
コリネバクテリゥム ' ファシエンス（Corynebacterium fasciens) IAM1079, グ ルコノバクタ一 'ォキシダンス（Gluconobacter oxydans) IAM1842およびグルコノ バク夕一 .ォキシダンス（Gluconobacter oxydans ) IAM1839は、 インシュティチュ ―ト ·ォブ ·モレキュラー ' アンド 'セルラ一 ·バイオサイエンス （旧ィンシュ ティチュ一ト ·ォブ ·アプライ ド ·マイクロバイオロジー） （Institute of Mol ecular and Cellular Biosciences. (Formerly, Institute of Applied Microbi ology)、 住所： 日本国東京都文京区弥生一丁目東京大学 （The university of To kyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan) から入手可能である。
これらの微生物を培養する培地は格別の制限はなく、 通常の炭素源、 窒素源、 無機イオン、 更に必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。 炭素源として は、 グルコース等の炭水化物、 グリセロール等のアルコール類、 有機酸、 その他 が適宜使用される。 窒素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニ ゥム塩、 硝酸塩その他が用いられる。 リン源としてはリン酸のカリウム塩、 ナト リウム塩等が使用される。 無機イオンとしては、 マグネシウムイオン、 カリウム イオン、 鉄イオン、 マンガンイオン、 硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使用さ れる。 有機栄養源としては、 ビタミン、 アミノ酸等及びこれらを含有するレバ一 エキス、 酵母エキス、 麦芽エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ 一、 カゼイン分解物、 その他が適宜用いられる。
また、 D-ァラビトールからキシリ トールを生成する反応を触媒する酵素群の誘 導剤として!)-キシロース、 D-キシルロース、 D-ァラビトール、 キシリ トールなど の糖類や糖アルコールを培地に添加することによって、 D-ァラビトールをキシリ トールに変換する活性が向上する場合がある。
培養条件にも格別の制限はなく、 例えば、 好気的条件下 pH5~8及び温度 25〜40 °Cの範囲内で pH及び温度を適、'' 1に制限しつつ 12〜 72時問程度培養を行なえばよい。 かくして培養された微生物を、 D-ァラビトールに接触反応させることにより、 反応液中にキシリ トールを生成することができる。 本発明の方法において前記 「微生物」 は、 菌体そのものであってもよいし、 D-ァラビトールをキシリ トール に変換する能力を有する限り菌体の処理物であってもよい。 具体的には、 菌体を 含む培養物、 該培養物から分離 ·回収した !¾体、 体 ¾定化処理物、 アセトン 処理または凍結乾燥等した菌体、 体破砕液、 1 休破砕液の分画物もしくは精製 酵素画分、 又はこれらの処理物の^定化物^が^げられる。
反応は通常、 温度 20〜60°C、 望ましくは 30〜40°Cで、 pH4.0〜9.0望ましくは pH 6.5〜7. 5で好結果を与える。 尚、 反応液には、 応液に K酸カルシウムを例えば 2¾ (w/v)となるように添加するなどして、 反応時の pHの低下を防ぐと、 キシリ トール の収率を高めることができる場合がある。 反応には、 静地反応あるいは撹はん反 応のいずれの方法も採用し得る。 反応時間は、 使用する菌体の活性、 D-ァラビト —ル濃度などの条件によって異なるが、 1〜100時間が望ましい。
反応の際に炭素源を添加して反応を行うと、 キシリ トールの生成量が向上する 場合がある。 特に、 ァセトパク夕一属細菌又はグルコノバクタ一属細菌を用いる 場合は、 反応液に炭素源を添加することが好ましい。 添加する炭素源としては糖、 糖の誘導体、 アルコール類、 アルデヒド類、 および有機酸類等が挙げられる。 糖 としてはグルコース、 フルク トース、 スクロース、 ラク ト一スが挙げられる。 糖 の誘導体としてはソルビトール、 マンニトール、 グリセロール等の糖アルコール、 グルコン酸等のアルドン酸等が挙げられる。 また、 アルコール類としてはメ夕ノ
—ル、 エタノール、 プロパノール、 イソプロピルアルコール、 1，4一ブタンジォー ル、 2，3—ブタンジオールなどが、 アルデヒ ド類としてはホルムアルデヒ ド、 ァセ トアルデヒ ド、 プロピオンアルデヒド、 イソブチルアルデヒ ド、 グリセロアルデ ヒ ドなどが、 また有機酸類としてはギ酸、 クェン酸、 フマル酸、 リンゴ酸などが 挙げられる。 これらの炭素源は、 単独で使用してもよく、 任意の 2種または 3種 以上の炭素源を混合物として使用してもよい。 これら炭素源の添加量は、 使用す る菌体の活性、 D-ァラビトール濃度などの条件によって異なるが、 合計で 0.5〜3 0%(w/v)、 好ましくは 0.5〜10%(w/v)が好ましい結果を与える。
また、 微生物として、 菌休破砕液などの菌体処理物を用いる場合には、 前記反 応系に NADまたは NADHを ϋΐί接添加することによつても、 D-キシルロースの還元反応 を効率的に進行させることができる。 尚、 この場合、 微生物としてグルコノバク 夕一属またはァセ トパクター厲に屈する細菌を用いる場合は NADHを、 ァクロモバ クター厲、 ァグロバクテリウム厲、 ァルスロバクタ一屈、 ァゾ卜パクター屈、 ブ レビバクテリウム属、 コリネバクテリウム厲、 エルビニァ厲、 フラボバクテリウ ム属、 ミクロコッカス厲、 ノカルディア属、 プラノコッカス厲、 シユードモナス 属、 ロ ドコヅカス厲、 モルガネラ属、 ァクチノマドウラ厲、 ァクチノマイセス厲 またはストレプトマイセス属に属する細菌を用いる場合は NADを添加することが好 ましい。
上記のようにして培養液中に生成したキシリ トールは、 常法に従って反応液よ り採取分離される。 具体的には、 遠心分離、 ろ過等により固形物を除去した後、 活性炭、 イオン交換樹脂により脱色、 脱塩し、 その溶液から結晶化する方法が採 用できる。 発明を実施するための最良の形態 以下、 実施例にて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらの例に限 定されるものではない。 なお、 本実施例において、 原料の D-ァラビトールおよび 生成したキシリ トールは、 高速液体クロマトグラフィー （HP L C) により、 下 記の条件にて分析した。 カラム ： Shodex SC1211 〔昭和電工社製品〕
移動層： 50% ァセトニトリル/ 50% 50ppm Ca- EDTA水溶液
流 速： 0.8 ml/分
温 度： 60°C
検 出： RI検出器 実施例 1 普通ブイヨン（栄研化 ^礼製品） 1.8% (w/v)を含む培地 (pH 7.0) ½1を試験管 に分注し、 120C、 20分問加熱滅 L した。 この培地に、 別滅菌した D-ァラビトール、 キシリ トール、 D-キシロースをそれそれ 1 %となるように添加した。 この培地に 表 1に示す菌休をそれそれ接極し、 30°Cで 2日間振とう培養した。 該培養液から遠 心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗^した。
それそれの培養菌体を 0.1M リン酸緩衝溶液 （pH 7.0)に湿重量で 5%(w/v)とな るように懸濁した。 ガラスビーズ （Biospec products社製、 直径 0.1匪）を菌体懸 濁液の約半分量加えて、 マルチビーズショッカー MB-200 (安井器械社製） を使用 して菌休を破砕した。 破砕は 3000rpmで 3分問行い、 ί' られた菌体懸濁液を粗酵素 液として以下の変換反応に使用した。
0.1M 卜リス塩酸緩衝溶液 （pH 8.0)に終濃度でそれそれ D-ァラビトール 5%(w /v)、 NAD lOmMとなるように溶解し、 試験管に 0.9mlずつ分注した。 この反応液に それそれの粗酵素液を 0.1ml添加し、 pH 8.0、 30°Cにて 22時間反応を行った。 反応 後、 遠心分離により沈殿を除いた後、 HPLCにて生成したキシリ トールを定量した。 この結果を表 1に示した。 表 1に示したようにいずれの菌体を用いた反応によつ ても D-ァラビトールよりキシリ トールが効率よく生成蓄積した。 表 1 反応により生成したキシリ トール濃度及び収率 生成キシリ トール (g/1 ) 反応収率 ）
Achromobacter viscosus ATCC 12448 0.1 0.2
Agrobacterium tumefaciens ATCC2778 0.3 0.6
Agrobacterium radiobacter ATCC4718 0.6 1.2
Arthrobacter paraffineus ATCC15590 2.6 5.2
Arthrobacter paraffineus ATCC15591 4.4 8.8
Arthrobacter paraffineus ATCC19064 3.7 7.4
Arthrobacter paraffineus ATCC19065 3.6 7.2 Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC15583 4.0 8.0
Azotobacter indicus ATCC9037 0.3 0.6
Brevibacterium ketoglutamicum ATCC15587 2.2 4.4
Brevibacterium ketoglutamicum ATCC15588 3.4 6.8
Corynebacterium fasciens IAM1079 1.6 3.2
Erwinia amylovora IF012687 4.3 8.6
Flavobacterium peregrinum CCM1080-A 0.3 0.6
Flavobacterium fucatum FER P-7053 1.2 2.4
Micrococcus sp. CCM825 0.2 0.4
Nocardia opaca NCIB9409 3.8 7.6
Planococcus eucinatus FERM P-9133 0.5 1.0
Pseudomonas synxantha ATCC796 0.2 0.4
Rhodococcus erythropol is ATCC11048 5.5 11.0
Morganella morgan ii AJ2771 1.7 3.4
実施例 2 酵母エキス （Yeast Extract) 0.2% (w/v)、 肉エキス （Meat Extract) 0.2%、 ペプトン （Peptone) 0.4%、 NaCl 0.5%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.2%を含む 培地 （pH 7.2) 50mlを 500ml容フラスコに分注し、 120。C、 20分間加熱滅菌した。 この培地に、 別滅菌した D-ァラビトール、 キシリ トール、 D-キシロースをそれそ れ 1 %となるように添加した。 この培地に表 2に示す菌体をそれそれ接種し、 30 °Cで 2日間振とう培養した。 該培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水 で 1回洗浄した。
それそれの培養菌体を 0.1M リン酸緩衝溶液 （pH 7.0)に湿重量で 5 %(w/v)とな るように懸濁した。 ガラスビーズ （Biospec products社製、 直径 0.1腿）を菌体懸 濁液の約半分量加えて、 マルチビーズショッカー MB- 200 (安井器械社製） を使用 して菌体を破砕した。 破砕は 3000rpmで 3分間行い、 得られた菌体懸濁液を粗酵素 液として以下の変換反応に使用した。
0.1M トリス塩酸緩衝溶液 （pH 8.0)に終濃度でそれぞれ D-ァラビトール 5% (w /v)、 NAD 10mMとなるように溶解し、 試験管に 0.9mlずつ分注した。 この反応液に それそれの粗酵素液を 0.1ml添加し、 pH 8.0、 30°Cにて 22時間反応を行った。 反応 後、 遠心分離により沈殿を除いた後、 HPLCにて生成したキシリ トールを定量した。 この結果を表 2に示した。 表 2に示したようにいずれの菌体を用いた反応によつ ても D-ァラビトールよりキシリ 卜ールが効率よく生成蓄積した。 表 2 反応により生成したキシリ トール濃度及び収率 菌株 生成キシリ トール (g ） 反応収率 (％)
Actmomadura madurae ATCC19425 O. o 1.0
Actinomyces violaceochromogenes IF013100 0.1 0.2
Streptomyces coelicolor ATCC10147 0.5 1.0
Streptomyces f lavelus AJ9012 0.3 0.6
Streptomyces griseolus NRRL B-1062 0.4 0.8
Streptomyces l ividans IF013385 0.4 0.8
Streptomyces olivaceus ATCC21379 0.3 0.6
Streptomyces tanashiensis ATCC15238 0.9 1.8
Streptomyces virginiae AJ9053 0.5 1.0
Streptomyces antibioticus NRRL3238 0.1 0.2
Streptomyces cacaoi ATCC19093 0.1 0.2
Streptomyces lavendulae ATCC8664 0.1 0.2 実施例 3 ポテトデキストロース（Difco社製品） 2.4% (w/v)、 酵母エキス（Difco)3% 、 バ クト . レバー . インフユ一ジョン （Bacto liver infusion ) (Difco)2.5%N 肉ェ キス（Difco)0.5%、 グリセロール 1.5%を含む培地 （pH 7.0) 50mlを 500ml坂ロフ ラスコに分注し、 120°C、 20分間加熱滅菌した。 この培地に、 別に滅菌した D-ァラ ビトール、 キシリ トール、 D-キシロースをそれそれ 0.5%となるように、 および炭 酸カルシウムを 2.5%となるように添加した。 この培地にグルコノバクタ一 ·ォキ シダンス ATCC621、 グルコノバクタ一 ·サブォキシダンス NRRLB-755およびァセト パクター · キシリナム ATCC14851をそれそれ接種し、 30°Cで 3日間振とう培養した。 該培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。
D-ァラビトール 5% (w/v)、 D-グルコース 1 %を 0.1M リン酸緩衝溶液 （pH 7. 5)に溶解し、 試験管に 10mlずつ分注した。 この反応液にそれそれの培養菌体を湿 重量で 5 % (w/v)となるように添加し、 pH 7.5、 30°Cにて 22時間振とう反応を行つ た。 反応後、 遠心分離により菌体を除いた後、 HPLCにて生成したキシリ トールを 定量した。 この結果を表 3に示した。 表 3に示したようにいずれの菌体を用いた 反応によっても D-ァラビトールよりキシリ トールが効率よく生成蓄積した。 表 3 反応により生成したキシリ トール濃度及び収率 菌株 生成キシリ トール濃度 (g/1 ) 反応収率（％)
Gluconobacter suboxydans 腿 LB - 755 5.8 12
Gluconobacter oxydans ATCC621 17 33
Acetobacter xylinum ATCC 14851 11 22
実施例 4 ポテトデキストロ一ス（Difco社製品） 2.4% /v)、 酵母エキス（Difco)3% 、 肉 エキス（Difco)0.5%、 グリセロール 1.5%を含む培地 （pH 7.0) 40mlを 500ml坂口 フラスコに分注し、 120°C、 15分間加熱滅菌した。 この培地に、 別滅菌した D-ァラ ビトール、 キシリ トール、 D-キシロースをそれそれ 1 %となるように、 および炭 酸カルシウムを 2.0%となるように添加した。 この培地にグルコノバクタ一 ·ォキ シダンス ATCC621を接種し、 30 で 3日間振とう培養した。 該培養液から遠心分離 により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。
D -ァラビトール 5% (w/v)、 D-グルコース 1 %を 0. 1M リン酸緩衝溶液 （pH 6. 0)に溶解し、 試験管に 10mlずつ分注した。 この反応液に菌体を湿重量で 10% (w/v)、 炭酸カルシウムを 2% (w/v )となるように添加し、 30°Cにて振とう反応を行った。 反応 6時間目にエタノールまたはグルコースを表 4に示すように加えた場合につ いても行った。 27時間反応後、 遠心分離により菌体を除いた後、 HPLCにて生成し たキシリ 卜一ルを定量した。 この結果を表 4に示した。 表 4に示したように炭素 源の添加により、 D-ァラビトールよりのキシリ トールの生成量が増大した。 表 4 反応により生成したキシリ トール濃度及び収率
(使用菌株： Gluconobacter oxydans ATCC621) 反応 6時間目の添加物 生成キシリ トール濃度（g ） 反応収率 ） なし 28 56 エタノール 5% 34 70 グルコース 0.5% 29 58 エタノール 5% 及び グルコース 0.5% 47 94
実施例 5 ポテトデキス卜ロース（Difco社製品） 2.4% (w/v), 酵母エキス（Difco)3% 、 肉 エキス（Difco)0.5%、 グリセロール 1.5%を含む培地 （pH 7.0) 40mlを 500ml坂口 フラスコに分注し、 120°C、 15分間加熱滅菌した。 この培地に、 別滅菌した D-ァラ ビトール、 キシリ トール、 D-キシロースをそれそれ 1 %となるように、 および炭 酸カルシウムを 2. 0%となるように添加した。 この培地にグルコノバクタ一 ·サブ ォキシダンス N皿 LB- 755およびァセトパク夕一 ·キシリナム ATCC14851をそれそ れ接種し、 30°Cで 3日間振とう培養した。 該培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。
D-ァラビトール 5% (w/v)、 D -グルコース 1 %を 0. 1M リン酸緩衝溶液 （pH 6. 0 )に溶解し、 試験管に 10mlずつ分注した。 この反応液に菌体を湿重量で 10% (w/v)、 炭酸カルシウムを 2% (w/v )となるように添加し、 30°Cにて振とう反応を行った。 反応 6時間目にェ夕ノ一ル 5¾およびグルコ一ス 0.5 を添加した。 27時間反応後、 遠心分離により菌体を除いた後、 HPLCにて生成したキシリ トールを定量した。 こ の結果を表 5に示した。 表 5に示したように D-ァラビトールよりキシリ トールが 効率よく生成蓄積した。 表 5 反応により 成したキシリ トール濃度及び収率 菌株 生成キシリ 卜- -ル濃度 (g/1 ) 反応収率（¾)
Gluconobacter suboxydans 賺 LB - 755 16 32
Acetobacter xylinum ATCC 14851 32 64
実施例 6 ポテトデキストロース （Difco社製品） 2.4¾(w/v )、 酵母エキス （Difco) 3%、 肉 エキス （Difco) 0.5%、 グリセロール 1.5 を含む培地 （pH 7.0) 50mlを 500ml坂口 フラスコに分注し、 120°C、 15分間加熱殺菌した。 D-ァラビトール溶液を 120°C、 15分間殺菌した後、 上記培地に 3.0 となるように添加した。 さらに炭酸カルシゥ ム lgを 200°C、 120分間乾熱滅菌して上記培地に添加した。 この培地にグルコノバ ク夕一 ·ォキシダンス ATCC621を接種し、 30°Cで 3日間振とう培養した。 該培養液 から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水で 1回洗浄した。
D-ァラビトールを 0. 1M リン酸緩衝溶液 （pH 6.0) に 5%(w/v)となる様に溶解し、 これに上記の洗浄菌体を湿重量で約 10% ( w/v )となるように添加した。 この反応液 10mlを試験管に入れ、 30°Cにて振とう反応を行った。 24時間反応後、 遠心分離に より菌体を除いた後、 HPLCにて生成したキシリ トールを定量した。 この結果を表 6に示した。 表 6に示したように D-ァラビトールよりキシリ トールが生成蓄積し た。 表 6 反応により生成したキシリ トール濃度及び収率 株 生成キシリ トール濃度 (g/1 ) 反応収率 (¾)
Gluconobacter oxydans ATCC621 7.8 16
産業上の利用可能性 本発明により、 D-ァラビトールを原料として、 単純なプロセスでキシリ トール を製造することができる。

Claims

請求の範囲
1 . グルコノバクター属またはァセトパク夕一属に属し、 D-ァラビトールを キシリ トールに変換する能力を持つ微生物を D-ァラビトールに作用させ、 生成す るキシリ トールを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法。
2 . グルコノバクタ一属またはァセトバク夕ー属に属する微生物がグルコノ パクター ·サブォキシダンス、 グルコノバクタ一 ·ォキシダンスまたはァセトバ クタ一 · キシリナムである請求項 1記載の製造法。
3 . ァクロモバク夕一属、 ァグロバクテリウム属、 ァルスロバクタ一属、 ァ ゾ卜バクター属、 ブレビバクテリウム属、 コリネバクテリウム属、 エルビニァ属、 フラボバクテリウム属、 ミクロコ ヅカス属、 ノカルディア属、 プラノコヅカス属、 シユードモナス属またはロ ドコッカス属に属し、 D-ァラビ卜一ルをキシリ トール に変換する能力を持つ微生物を!)-ァラビトールに作用させ、 生成するキシリ トー ルを採取することを特徴とするキシリ トールの製造法。
4 . ァクロモバク夕一属がァクロモバク夕一 ' ピスコ一サスであり、 ァグロ バクテリゥム属がァグロバクテリゥム · ッメファシエンスまたはァグロパクテリ ゥム · ラジオパクターであり、 ァルスロパクター属がァルスロバクタ一 ·パラフ ィネウスまたはァルスロバクタ一 · ヒドロ力一ボグル夕ミカスであり、 ァゾトバ クタ一属がァゾトバク夕一 · ィンディカスであり、 ブレビバクテリウム属がブレ ビバクテリウム ·ケトグルタミカムであり、 コリネバクテリゥム属がコリネバク テリゥム ' ファシエンスであり、 エルビニァ属がエルビニァ ·アミ口ボーラであ り、 フラボパクテリゥム属がフラボバクテリウム ·ペレグリナムまたはフラボバ クテリゥム . フカタムであり、 ミクロコッカス属がミクロコッカス · s p . C C M 8 2 5であり、 ノカルディア属がノカルディア ·ォパ力であり、 プラノコッ カス属がプラノコヅカス ·ュ一シナタスであり、 シユードモナス属がシュ一ドモ ナス · シンキサン夕であり、 口 ドコ ヅカス属がロ ドコ ヅカス ·エリス口ポリスで ある請求項 3記載の製造法。
5 . モルガネラ属、 ァクチノマドウラ属、 ァクチノマイセス属またはストレ プトマイセス属に属し、 D-ァラビトールをキシリ トールに変換する能力を持つ微 生物を D -ァラビトールに作用させ、 生成するキシリ トールを採取することを特徴 とするキシリ トールの製造法。
6 . モルガネラ属がモルガネラ 'モルガ二であり、 ァクチノマドウラ属がァ クチノマドウラ 'マドウラであり、 ァクチノマイセス属がァクチノマイセス · ビ オラセォクロモゲネスであり、 ストレプトマイセス属がス 卜レブトマイセス 'セ リカラー、 ストレプトマイセス ' フラベラス、 ス トレプトマイセス ' グリセオラ ス、 ストレプトマイセス ' リビダンス、 ストレプトマイセス ·オリバセウス、 ス トレプトマイセス '夕ナシェンシス、 ストレプトマイセス 'バ一ジニェ、 ストレ ブトマイセス ·アンチピオティカス、 ストレプトマイセス ' カカオィまたはスト レプトマイセス · ラベンデュレである請求項 5記載の製造法。
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