KR20010031104A

KR20010031104A - 크실리톨의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010031104A
Application number: KR1020007003980A
Authority: KR
Inventors: 스기야마마사카즈; 스즈키슈ㄴ이치; 미하라야스히로; 하시구치겐이치; 요코제키겐조
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2001-04-16
Also published as: WO1999020781A1; EP1026254A1; DE69836756D1; US6303353B1; BR9814822A; PE112499A1; EP1026254A4; CN1282376A; JP3855486B2; EP1026254B1; JPH11266889A

Abstract

본 발명은 글루코노박터속, 아세토박터속, 아크로모박터속, 아그로박테리움속, 아르트로박터속, 아조토박터속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 에르위니아속, 플라보박테리움속, 마이크로콕쿠스속, 노카르디아속, 플라노콕쿠스속, 슈도모나스속, 로도콕쿠스속, 모르가넬라속, 악티노마두라속, 악티노마이세스속 또는 스트렙토마이세스속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물을 D-아라비톨에 적용시키고 이렇게 생성된 크실리톨을 회수함을 특징으로 하는, 크실리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

크실리톨의 제조 방법{Process for preparing xylitol}

자연에 존재하는 당 알콜인 크실리톨에 대한 수요는 향후 증가할 것으로 예상된다. 크실리톨은 수크로즈보다 낮은 열량 값을 갖지만, 수크로즈와 비교하여 단맛이 있다. 따라서, 열량이 낮은 감미제로서 유망하다. 더욱이, 크실리톨은 우치예방성이며, 충치-예방 감미제일 수 있다. 크실리톨은 혈액 글루코즈 수준을 상승시키지 않기 때문에, 당뇨병을 치료하기 위해서는 주사액이 사용되어 왔다.

현재, 크실리톨은 미국 특허 제4,008,825호에 기재된 바와 같이 주로 D-크실로즈의 수소첨가에 의해 산업적 규모로 제조된다. 원료 D-크실로즈는 활엽수, 밀집, 옥수수의 열매 줄기, 귀리의 겉껍질, 또는 크실란내에 풍부한 다른 식물-유도된 물질과 같은 출발 물질을 가수분해하여 수득할 수 있다.

그러나, 식물 재료를 가수분해시켜 수득한 D-크실로즈는 높은 제조 비용으로 인해 비싸다는 단점이 있다. 예를 들면, 식물 재료-가수분해된 산물은 수율이 낮은데, 이는 생성된 D-크실리톨의 순도를 저하시킨다. 따라서, 가수분해 후에는 가수분해에 사용된 산 및 색소를 이온 교환 처리에 의해 제거하여야 한다. 추가로, D-크실리톨은 기타 헤미셀룰로즈를 제거하기 위해 결정화된다. 식품에 사용될 수 있는 D-크실로즈를 수득하기 위해서는 추가로 정제하여야 한다. 이온 교환 처리 및 결정화는 제조 비용을 증가시킨다.

상기한 과제를 해결하기 위해, 용이하게 입수가능한 출발 물질을 사용하고 감소된 양의 부산물을 생성하는 크실리톨의 제조 방법이 요구되어 왔다. 예를 들면, 출발 물질로서 펜티톨을 사용한 크실리톨의 제조 방법이 개발되었다. 용이하게 입수가능한 펜티톨중의 하나는 효모를 사용하여 제조할 수 있는 D-아라비톨이다[참조: Can. J. Microbiol. 31, 1985, 467-471, J. Gen. Microbiol. 139, 1993, 1047-1054].

출발 물질로서 D-아라비톨을 사용하여 크실리톨을 제조하는 몇가지 방법이 개발되었다. 문헌[참조: Applied Microbiology, 18, 1969, 1031-1035]에는 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii; ATCC20121)를 사용하여 발효에 의해 글루코즈로부터 D-아라비톨을 제조하는 단계, 아세토박터 수복시단스(Acetobacter suboxydans)를 사용하여 상기 수득된 D-아라비톨을 D-크실룰로즈로 전환시키는 단계, 칸디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii; 대두 품종)를 사용하여 D-크실룰로즈를 크실리톨로 전환시키는 단계를 포함하는 방법이 보고되어 있다.

제EP-A-403392호(출원인: Roquette Freres) 및 제EP-A-421882호(출원인: Roquette Freres)는 각각 삼투압 내성 효모를 사용하여 발효에 의해 D-아라비톨을 제조하는 단계, 아세토박터(Acetobacter)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속 또는 클레브시엘라(Klebsiella)속에 속하는 미생물을 사용하여 상기 제조된 D-아라비톨을 D-크실룰로즈로 전환시키는 단계, 상기 수득된 크실룰로즈를 글루코즈(크실로즈) 이소머라제와 반응시켜 크실로즈와 크실룰로즈의 혼합물을 제조하는 단계 및 상기 형성된 크실로즈/크실룰로즈를 수소첨가에 의해 크실리톨로 전환시키는 단계를 포함하는 방법을 기술한다. 이들 공보는 또한 크실로즈/크실룰로즈 혼합물중의 크실로즈를 미리 농축시키고 농축된 크실로즈를 수소첨가에 의해 크실리톨로 전환시키는 방법을 기술한다.

출발 물질로서 상기 D-아라비톨을 사용하여 크실리톨을 제조하는 상술된 방법은 크실리톨을 높은 수율로 제조할 수 있게 한다. 그러나, 복수의 반응 단계를 필요로 하여 공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 따라서, 상기 방법은 경제적으로 만족스럽지 않다.

본 발명은 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다. 크실리톨은 식품, 의약 등의 분야에 유용하다.

본 발명의 목적은 출발 물질로서 D-아라비톨을 사용하여 크실리톨을 제조하는 방법 및 간단한 공정에 의해 달성되는 방법을 제공하는 것이다.

집중적인 연구 결과, 본 발명자들은 D-아라비톨을 크실리톨로 직접 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 발견함으로써 본 발명을 완성하고 상기 과제를 해결하기에 이르렀다.

본 발명은 D-아라비톨을, 글루코노박터속 또는 아세토박터속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 D-아라비톨을, 글루코노박터 수복시단스, 글루코노박터 옥시단스 또는 아세토박터 크실리눔(xylinum)에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 D-아라비톨을, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 에르위니아(Erwinia)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속, 마이크로콕쿠스 (Micrococcus)속, 노카르디아(Nocardia)속, 플라노콕쿠스(Planococcus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 또는 로도콕쿠스(Rhodococcus)속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 D-아라비톨을, 아크로모박터 비스코수스(viscosus), 아그로박테리움 투메파시엔스(tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(radiobacter), 아르트로박터 파라피네우스(paraffineus), 아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스(hydrocarboglutamicus), 아조토박터 인디쿠스(indicus), 브레비박테리움 케토글루타미쿰(ketoglutamicum), 코리네박테리움 파스시엔스(fasciens), 에르위니아 아밀로보라(amylovora), 플라보박테리움 페레그리눔(peregrinum), 플라보박테리움 푸카툼(fucatum), 마이크로콕쿠스(Micrococcus)종 CCM825, 노카르디아 오파카(opaca), 플라노콕쿠스 에우시나투스(eucinatus), 슈도모나스 신산타(synxantha) 또는 로도콕쿠스 에리트로폴리스(erythropolis)에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 D-아라비톨을, 모르가넬라(Morganella)속, 악티노마두라 (Actinomadura)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 D-아라비톨을, 모르가넬라 모르가니(morganii), 악티노마두라 마두라에(madurae), 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스(violaceochromogenes), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(coelicolor), 스트렙토마이세스 플라벨루스(flavelus), 스트렙토마이세스 그리세올루스(griseolus), 스트렙토마이세스 리비단스(lividans), 스트렙토마이세스 올리바세우스(olivaceus), 스트렙토마이세스 타나시엔시스(tanashiensis), 스트렙토마이세스 비르기니아에(virginiae), 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(antibioticus), 스트렙토마이세스 카카오이(cacaoi) 또는 스트렙토마이세스 라벤둘라에(lavendulae)에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하기에 상세히 기술될 것이다.

본 발명에 사용되는 미생물은 글루코노박터속, 아세토박터속, 아크로모박터속, 아그로박테리움속, 아르트로박터속, 아조토박터속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 에르위니아속, 플라보박테리움속, 마이크로콕쿠스속, 노카르디아속, 플라노콕쿠스속, 슈도모나스속, 로도콕쿠스속, 모르가넬라속, 악티노마두라속, 악티노마이세스속 또는 스트렙토마이세스속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있다.

상술된 미생물의 예에는 글루코노박터 수복시단스, 글루코노박터 옥시단스, 아세토박터 크실리눔, 아크로모박터 비스코수스, 아그로박테리움 투메파시엔스, 아그로박테리움 라디오박터, 아르트로박터 파라피네우스, 아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 케토글루타미쿰, 코리네박테리움 파스시엔스, 에르위니아 아밀로보라, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 마이크로콕쿠스종 CCM825, 노카르디아 오파카, 플라노콕쿠스 에우시나투스, 슈도모나스 신산타, 로도콕쿠스 에리트로폴리스, 모르가넬라 모르가니, 악티노마두라 마두라에, 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르, 스트렙토마이세스 플라벨루스, 스트렙토마이세스 그리세올루스, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 타나시엔시스, 스트렙토마이세스 비르기니아에, 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이세스 카카오이 및 스트렙토마이세스 라벤둘라에가 포함된다.

본 발명에서 사용된 특정한 미생물 균주에는 하기 균주가 포함된다:

글루코노박터 수복시단스 NRRLB-755;

글루코노박터 옥시단스 ATCC621;

글루코노박터 옥시단스 IAM1842;

글루코노박터 옥시단스 IAM1839;

아세토박터 크실리눔 ATCC14851;

아크로모박터 비스코수스 ATCC12448;

아그로박테리움 투메파시엔스 ATCC2778;

아그로박테리움 라디오박터 ATCC4718;

아르트로박터 파라피네우스 ATCC15590;

아르트로박터 파라피네우스 ATCC15591;

아르트로박터 파라피네우스 ATCC19064;

아르트로박터 파라피네우스 ATCC19065;

아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스 ATCC15583;

아조토박터 인디쿠스 ATCC9037;

브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15587;

브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15588;

코리네박테리움 파스시엔스 IAM1079;

에르위니아 아밀로보라 IFO12687;

플라보박테리움 페레그리눔 CCM1080-A;

플라보박테리움 푸카툼 AJ2478;

마이크로콕쿠스종 CCM825;

노카르디아 오파카 NCIB9409;

플라노콕쿠스 에우시나투스 AJ1656;

슈도모나스 신산타 ATCC796;

로도콕쿠스 에리트로폴리스 ATCC11048;

모르가넬라 모르가니 AJ2771;

악티노마두라 마두라에 ATCC 19425;

악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 IFO13100;

스트렙토마이세스 코엘리콜로르 ATCC10147;

스트렙토마이세스 플라벨루스 AJ9012;

스트렙토마이세스 그리세올루스 NRRL B-1062;

스트렙토마이세스 리비단스 IFO13385;

스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC21379;

스트렙토마이세스 타나시엔시스 ATCC15238;

스트렙토마이세스 비르기니아에 AJ9053;

스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스 NRRL3238;

스트렙토마이세스 카카오이 ATCC19093; 및

스트렙토마이세스 라벤둘라에 ATCC8664.

플라보박테리움 페레그리눔 CCM1080-A 및 마이크로콕쿠스종 CCM825는 기탁 기관[참조: 체코슬로바크 콜렉션 오브 마이크로오르가니즘(Czechoslovak Collection of Microorganism); Tvrdeho 14, Brno CS-60200, Czechoslovakia]으로부터 입수가능하다.

플라보박테리움 푸카툼 AJ2478은 1983년 4월 25일자로 기탁 기관[참조: the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(현재명 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology))(주소: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki 305-8566, Japan)]에 수탁번호 제FERM P-7053호하에 기탁되었고, 1998년 9월 9일자로 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 제FERM BP-6492호하에 국제 기탁으로 이관되었다.

플라노콕쿠스 에우시나투스 AJ1656은 1987년 1월 19일자로 기탁 기관[참조: the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(현재명 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology))]에 수탁번호 제FERM P-9133호하에 기탁되었고, 1998년 9월 9일자로 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 제FERM BP-6493호하에 국제 기탁으로 이관되었다.

모르가넬라 모르가니 AJ2771은 1998년 1월 16일자로 기탁 기관[참조: the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(현재명 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology))]에 수탁번호 제FERM P-16594호하에 기탁되었고, 1998년 9월 9일자로 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 제FERM BP-6496호하에 국제 기탁으로 이관되었다.

스트렙토마이세스 플라벨루스 AJ9012는 1998년 1월 16일자로 기탁 기관[참조: the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(현재명 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology))]에 수탁번호 제FERM P-16585호하에 기탁되었고, 1998년 9월 9일자로 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 제FERM BP-6494호하에 국제 기탁으로 이관되었다.

스트렙토마이세스 비르기니아에 AJ9053은 1998년 1월 16일자로 기탁 기관[참조: the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(현재명 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology))]에 수탁번호 제FERM P-16587호하에 기탁되었고, 1998년 9월 9일자로 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 제FERM BP-6495호하에 국제 기탁으로 이관되었다.

노카르디아 오파카 NCIB9409는 기탁 기관[참조: 네셔널 콜렉션스 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아(National Collections of Industrial and Marine Bacteria), NCIMB Lts., Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom]으로부터 입수가능하다.

에르위니아 아밀로보라 IFO12687, 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 IFO13100 및 스트렙토마이세스 리비단스 IFO13385는 기탁 기관[참조: 인스티튜트 포 퍼멘테이션(Institute for Fermentation), Osaka; 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan]으로부터 입수가능하다.

코리네박테리움 파스시엔스 IAM1079, 글루코노박터 옥시단스 IAM1842 및 글루코노박터 옥시단스 IAM1839는 기탁 기관[참조: 인스티튜트 오브 몰큘러 앤드 셀룰러 바이오사이언시스(Institute of Molecular and Cellular Biosciences)(과거명 Institute of Applied Microbiology); The University of Tokyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan]으로부터 입수가능하다.

상기 미생물의 배양 배지는 특별히 제한되지는 않으며, 통상적으로 사용되는 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 이온 및 경우에 따라 유기 영양소를 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 탄소 공급원으로서는 탄수화물(예: 글루코즈), 알콜(예: 글리세롤), 유기 산 등이 적절하게 사용될 수 있다. 질소 공급원에는 암모니아 기체, 수성 암모니아, 암모늄 염, 니트레이트 등이 포함된다. 인 공급원에는 인산칼륨, 인산나트륨 등이 포함된다. 무기 이온으로서는 마그네슘 이온, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온, 황산 이온 등이 필요에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 적합한 유기 영양소에는 비타민, 아미노산, 및 비타민과 아미노산을 함유하는 간 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해 생성물 등이 포함된다.

D-아라비톨을 크실리톨로 전환시키는 활성은 종종 반응을 촉매하여 D-아라비톨(예: 탄수화물 또는 D-크실로즈, D-크실룰로즈, D-아라비톨, 크실리톨을 포함하는 당 알콜 등)로부터 크실리톨을 생성하는 효소의 유도인자를 배지에 첨가함으로써 증가시킬 수 있다.

또한, 배양 조건은 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들면, 배양은 pH 값을 pH 5 내지 8로 조절하면서 25 내지 40℃의 온도에서 호기성 조건하에 12 내지 72시간 동안 실시할 수 있다.

상술된 바와 같이 배양된 미생물은 D-아라비톨과 접촉하여 반응 혼합물에서 크실리톨을 생성한다. 본 발명의 방법에 있어서, 상술된 "미생물"은 미생물 세포 자체이거나, 생성물이 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물 세포의 제조 산물일 수 있다. 구체적으로, 이러한 제조 산물에는 배양물로부터 분리하여 회수한 미생물 세포를 함유하는 배양물; 아세톤으로 처리하거나 동결 건조시킨 미생물 세포의 고정화된 산물; 세포 분쇄된 용액, 세포 분쇄된 용액의 분획 또는 정제된 효소 분획; 및 이들 처리된 세포의 고정화된 산물이 포함된다.

반응을 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 40℃ 및 pH 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 7.5에서 수행함으로써 우수한 결과를 수득할 수 있다. 크실리톨의 수율은 종종 2%(w/v)의 농도를 제공하기 위해 예를 들어 반응 혼합물에 탄산칼슘을 가하여 반응중에 pH 값의 감소를 예방함으로써 증가시킬 수 있다. 정지 반응 및 교반 반응 모두를 사용할 수 있다. 반응 기간은 사용된 미생물의 활성 또는 D-아라비톨의 농도와 같은 조건에 따라 달라지지만 1 내지 100시간이 바람직하다.

크실리톨의 수율은 탄소 공급원을 반응중에 첨가하는 경우에 증가하는 경우가 있다. 특히, 탄소 공급원은 아세토박터 또는 글루코노박터에 속하는 세균을 사용하는 경우에 첨가하는 것이 바람직하다. 첨가되는 탄소 공급원의 예에는 탄수화물, 탄수화물 유도체, 알콜, 알데히드 및 유기 산이 포함된다. 탄수화물에는 글루코즈, 프럭토즈, 수크로즈 및 락토즈가 포함된다. 탄수화물 유도체에는 당 알콜(예: 솔비톨, 만니톨 또는 글리세롤), 알돈산(예: 글루콘산)이 포함된다. 알콜에는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로필 알콜, 1,4-부탄디올 및 2,3-부탄디올이 포함된다. 알데히드에는 포름알데히드, 아세토알데히드, 프로피온알데히드, 이소부틸알데히드 및 글리세르알데히드가 포함된다. 유기산에는 포름산, 시트르산, 푸마르산 및 말산이 포함된다. 이들 탄소 공급원은 단독으로 또는 이들의 2개 또는 3개 이상의 혼합물로서 사용할 수 있다. 탄소 공급원의 양은 사용된 미생물의 활성, D-아라비톨의 농도 등의 조건에 따라 달라진다. 탄소 공급원이 0.5 내지 30%(w/v), 바람직하게는 0.5 내지 10%(w/v)의 전체량으로 사용되는 경우에 우수한 결과를 수득할 수 있다.

미생물 세포의 제조 산물, 예를 들어 분쇄된 미생물 세포의 용액을 미생물로서 사용하는 경우, D-크실로즈의 환원 반응은 반응계에 NAD 또는 NADH를 직접 가하여 효율적으로 진행시킬 수 있다. 이 경우, 미생물로서 글루코노박터속 또는 아세토박터속에 속하는 세균을 사용하는 경우에는 NADH를 첨가하고, 반면 아크로모박터속, 아그로박테리움속, 아르트로박터속, 아조토박터속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 에르위니아속, 플라보박테리움속, 마이크로콕쿠스속, 노카르디아속, 플라노콕쿠스속, 슈도모나스속, 로도콕쿠스속, 모르가넬라속, 악티노마두라속, 악티노마이세스속 또는 스트렙토마이세스속에 속하는 세균을 사용하는 경우에는 NAD를 첨가하는 것이 바람직하다.

상술된 바와 같이 배양 배지에서 생성된 크실리톨은 통상의 방법으로 반응 혼합물로부터 회수하여 분리한다. 구체적으로, 고체 물질은 원심분리, 여과 등의 방법으로 제거하고, 생성되는 액체 분획은 활성탄 또는 이온-교환 수지를 사용하여 탈색 및 탈염시키며, 목적하는 생성물은 용액으로부터 결정화시킨다.

본 발명은 실시예를 참조로 하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 이들 실시예로 제한시키고자 하는 것은 아니다. 하기 실시예에서, 출발 물질, D-아라비톨 및 생성된 크실리톨은 하기 조건하에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한다:

컬럼: 소덱스(Shodex) SC1211(Showa Denko 제조원)

이동상: 50% 아세토니트릴/50% 50ppm Ca-EDTA 수용액

유동 속도: 0.8ml/분

온도: 60℃

검출: RI 검출기

실시예 1

1.8%(w/v)의 노르말 보일론(bouillon)(Eiken Chemical 제조원)을 함유하는 배지(pH 7.0) 4ml를 시험 튜브에 분산시키고 120℃에서 20분 가열함으로써 멸균시킨다. 별도로 멸균된 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로즈를 각각 배지에 가하여 1% 농도를 수득한다. 수득되는 배지에 표 1에 나타낸 각각의 미생물을 접종하여 30℃에서 2일간 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수거하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

각각의 배양된 미생물 세포를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)중에 현탁시켜 습윤 중량 5%(w/v)인 농도를 수득한다. 유리 비드(Biospec products 제조원, 직경: 0.1mm)를 미생물 세포 현탁액에 현탁액의 약 1/2의 양으로 가한다. 다음 미생물 세포를 멀티비드 쇽커(multibeads shocker) MB-200(Yasui Kikai 제조원)으로 파괴한다. 파괴는 3000rpm에서 3분간 수행하고 이렇게 수득된 미생물 세포 현탁액을 조 효소 용액으로서 다음 전환 반응에 적용시킨다.

D-아라비톨 및 NAD를 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 용해하여 각각 최종 농도가 5%(w/v) 및 10mM이 되도록 한다. 수득되는 용액을 시험 튜브에 각각 0.9ml 분획으로 분배한다. 각각의 조 효소 용액(0.1ml)을 이 반응 혼합물에 가하여 pH 8.0에서 30℃로 22시간 동안 반응시킨다. 반응이 완료한 후, 이렇게 형성된 침전물을 원심분리로 제거하고 형성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 크실리톨은 미생물을 사용한 반응에서 D-아라비톨로 부터 효율적으로 생산되어 축적된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율

균주	생성된 크실리톨(g/l)	수율(%)
아크로모박터 비스코수스 ATCC12448	0.1	0.2
아그로박테리움 투메파시엔스 ATCC2778	0.3	0.6
아그로박테리움 라디오박터 ATCC4718	0.6	1.2
아르트로박터 파라피네우스 ATCC15590	2.6	5.2
아르트로박터 파라피네우스 ATCC15591	4.4	8.8
아르트로박터 파라피네우스 ATCC19064	3.7	7.4
아르트로박터 파라피네우스 ATCC19065	3.6	7.2
아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스 ATCC15583	4.0	8.0
아조토박터 인디쿠스 ATCC9037	0.3	0.6
브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15587	2.2	4.4
브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15588	3.4	6.8
코리네박테리움 파스시엔스 IAM1079	1.6	3.2
에르위니아 아밀로보라 IFO12687	4.3	8.6
플라보박테리움 페레그리눔 CCM1080-A	0.3	0.6
플라보박테리움 푸카툼 FERM P-7053	1.2	2.4
마이크로콕쿠스 종 CCM825	0.2	0.4
노카르디아 오파카 NCIB9409	3.8	7.6
플라노콕쿠스 에우시나투스 FERM P-9133	0.5	1.0
슈도모나스 신산타 ATCC796	0.2	0.4
로도콕쿠스 에리트로폴리스 ATCC11048	5.5	11.0
모르가넬라 모르가니 AJ2771	1.7	3.4

실시예 2

0.2%(w/v) 효모 추출물, 0.2% 고기 추출물, 0.4% 펩톤, 0.5% NaCl 및 0.2% 황산마그네슘 육수화물을 함유하는 배지(pH 7.2) 50ml를 500ml 들이 플라스크에 넣고 120℃에서 20분 동안 가열함으로서 멸균시킨다. 별도로, 멸균된 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로즈를 각각 수득되는 배지에 가하여 각각 1%의 농도를 수득한다. 각각의 배지에 표 2에 나타낸 각각의 미생물을 접종하고 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수집하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

각각의 배양된 미생물 세포를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)중에 현탁시켜 습윤 중량 5%(w/v)의 농도를 수득한다. 유리 비드(Biospec products 제조원, 직경 0.1mm)를 미생물 세포 현탁액에 현탁액의 약 1/2의 양으로 가하고, 미생물 세포를 멀티비드 쇽커 MB-200(Yasui Kikai 제조원)을 사용하여 3000rpm에서 3분 동안 파괴한다. 수득되는 미생물 세포 현탁액을 다음 전환 반응에 조 효소 용액으로서 적용시킨다.

D-아라비톨 및 NAD를 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 용해시켜 각각 5%(w/v) 및 10mM의 최종 농도를 수득한다. 수득되는 혼합물의 0.9ml 분획을 시험 튜브내로 분산시킨다. 각각의 조 효소 용액(0.1ml)을 수득되는 반응 혼합물에 가하고 pH 8.0 및 30℃에서 22시간 동안 반응시킨다. 반응이 완료된 후, 침전물을 원심분리에 의해 제거하고 이렇게 형성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 크실리톨은 미생물을 사용한 반응에 의해 D-아라비톨로 부터 효율적으로 생산되어 축적된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율

균주	생성된 크실리톨(g/l)	수율(%)
악티노마두라 마두라에 ATCC19425	0.5	1.0
악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 IFO13100	0.1	0.2
스트렙토마이세스 코엘리콜로르 ATCC10147	0.5	1.0
스트렙토마이세스 플라벨루스 AJ9012	0.3	0.6
스트렙토마이세스 그리세올루스 NRRL B-1062	0.4	0.8
스트렙토마이세스 리비단스 IFO13385	0.4	0.8
스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC21379	0.3	0.6
스트렙토마이세스 타나시엔시스 ATCC15238	0.9	1.8
스트렙토마이세스 비르기니아에 AJ9053	0.5	1.0
스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스 NRRL3238	0.1	0.2
스트렙토마이세스 카카오이 ATCC19093	0.1	0.2
스트렙토마이세스 라벤둘라에 ATCC8664	0.1	0.2

실시예 3

2.4%(w/v) 감자 덱스트로즈(Difco 제조원), 3% 효모 추출물(Difco 제조원), 2.5% 박토 간 주입물(Difco 제조원), 0.5% 고기 추출물(Difco 제조원) 및 1.5% 글리세롤을 함유하는 배지(pH 7.0) 50ml를 500ml 들이 사카구치(Sakaguchi shouldered) 플라스크에 두고 120℃에서 20분 동안 가열함으로서 멸균시킨다. 별도로, 멸균된 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로즈를 각각 수득되는 배지에 가하여 0.5%의 농도를 수득하고 여기에 탄산칼슘을 가하여 2.5%의 농도를 수득한다. 이들 배지 각각에 글루코노박터 옥시단스 ATCC621, 글루코노박터 수복시단스 NRRLB-755 또는 아세토박터 크실리눔 ATCC14851을 접종하고 30℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수집하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

D-아라비톨 및 D-글루코즈를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.5)에 용해시켜 각각 5%(w/v) 및 1%의 농도를 수득한다. 수득되는 혼합물을 10ml 분획으로 시험 튜브내로 분산시키고, 습윤 중량 약 5%(w/v) 양의 배양된 미생물 세포 각각을 접종하고 pH 7.5 및 30℃에서 22시간 동안 진탕 배양시킨다.

반응이 완료된 후, 미생물 세포를 원심분리에 의해 제거하고 이렇게 생성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 크실리톨은 미생물을 사용한 반응에 의해 D-아라비톨로 부터 효율적으로 생산되어 축적된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율

균주	생성된 크실리톨의 농도(g/l)	수율(%)
글루코노박터 수복시단스 NRRL B-755	5.8	12
글루코노박터 옥시단스 ATCC621	17	33
아세토박터 크실리눔 ATCC14851	11	22

실시예 4

2.4%(w/v) 감자 덱스트로즈(Difco 제조원), 3% 효모 추출물(Difco 제조원), 0.5% 고기 추출물(Difco 제조원) 및 1.5% 글리세롤을 함유하는 배지(pH 7.0) 40ml를 500ml 들이 사카구치(shouldered) 플라스크에 두고 120℃에서 15분 동안 가열함으로서 멸균시킨다. 별도로, 멸균된 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로즈를 각각 수득되는 혼합물에 가하여 1.0%의 농도를 수득하고 여기에 탄산칼슘을 2.0%로 가한다. 이들 배지에 글루코노박터 옥시단스 ATCC621을 접종하고 30℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수거하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

D-아라비톨 및 D-글루코즈를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 각각 5%(w/v) 및 1%의 농도를 수득한다. 수득되는 혼합물을 각각 10ml 분획으로 시험 튜브내로 분산시키고, 습윤 중량 10%(w/v) 양의 미생물 세포를 접종한다. 추가로, 탄산칼슘을 여기에 2%(w/v)로 가한다. 수득되는 배지를 30℃에서 진탕 배양한다. 비교를 위해, 에탄올 또는 글루코즈를 배양 배지에 표 4에 나타낸 방식으로 배양 개시후 6시간 경과하여 가한다. 27시간 후, 미생물 세포를 원심분리에 의해 제거하고 이렇게 생성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타낸 바와 같이, D-아라비톨로 부터 생성된 크실리톨의 양은 탄소 공급원의 첨가에 의해 증가된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율(사용된 균주: 글루코노박터 옥시단스 ATCC621)

반응 개시 후 6시간 경과하여 가해진 화합물	생성된 크실리톨의 농도(g/l)	수율(%)
없음	28	56
에탄올 5%	34	70
글루코즈 0.5%	29	58
에탄올 5% 및 글루코즈 0.5%	47	94

실시예 5

2.4%(w/v) 감자 덱스트로즈(Difco 제조원), 3% 효모 추출물(Difco 제조원), 0.5% 고기 추출물(Difco 제조원) 및 1.5% 글리세롤(pH 7.0)을 함유하는 배지(pH 7.0) 40ml를 500ml 들이 사카구치(shouldered) 플라스크에 두고 120℃에서 15분 동안 가열함으로서 멸균시킨다. 별도로, 멸균된 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로즈를 각각 수득되는 배지에 가하여 1.0%의 농도를 수득하고 탄산칼슘을 여기에 2.0%로 가한다. 이들 배지에 글루코노박터 수복시단스 NRRLB-755 또는 아세토박터 크실리눔 ATCC14851을 접종하고 30℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수거하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

D-아라비톨 및 D-글루코즈를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 각각 5%(w/v) 및 1%의 농도를 수득한다. 수득되는 혼합물을 각각 10ml 분획으로 시험 튜브내로 분산시키고, 습윤 중량 약 10%(w/v) 양의 미생물 세포를 접종한다. 추가로, 탄산칼슘을 여기에 가하여 2%(w/v)의 농도를 수득한다. 수득되는 배지를 30℃에서 진탕 배양한다. 비교를 위해, 5% 에탄올 및 0.5% 글루코즈를 배양 배지에 배양 시작후 6시간 경과하여 가한다. 27시간 후, 미생물 세포를 원심분리에 의해 제거하고 이렇게 생성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 크실리톨은 D-아라비톨로 부터 효율적으로 생산되어 축적된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율

균주	생성된 크실리톨의 농도(g/l)	수율(%)
글루코노박터 수복시단스 NRRL B-755	16	32
아세토박터 크실리눔 ATCC14851	32	64

실시예 6

2.4%(w/v) 감자 덱스트로즈(Difco 제조원), 3% 효모 추출물(Difco 제조원), 0.5% 고기 추출물(Difco 제조원) 및 1.5% 글리세롤을 함유하는 배지(pH 7.0) 50ml를 500ml 들이 사카구치(shouldered) 플라스크에 두고 120℃에서 15분 동안 가열함으로서 멸균시킨다. D-아라비톨 용액을 120℃에서 15분 동안 멸균시키고 상술한 배지에 3.0%로 가한다. 또한, 1g의 탄산칼슘을 200℃에서 120분 동안 멸균하고 상기 배지에 가한다. 이 배지에 글루코노박터 옥시단스 ATCC621을 접종하고 30℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 미생물 세포를 배양 배지로 부터 원심분리에 의해 수거하고 생리학적 염수로 1회 세척한다.

D-아라비톨을 0.1M 포스페이트 완충액(pH 6.0)에 5%(w/v)의 농도로 용해시킨다. 상기 수득된 바와 같은 세척된 미생물 세포를 여기에 습윤 중량 약 10%(w/v) 양으로 접종한다. 이렇게 수득된 반응 혼합물 10ml 분획을 시험 튜브에 가하고 30℃에서 진탕하면서 반응시킨다. 24시간 후, 미생물 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 이렇게 생성된 크실리톨을 HPLC로 측정한다. 이 결과를 표 6에 나타낸다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 크실리톨은 D-아라비톨로 부터 생산되어 축적된다.

반응에 의해 생성된 크실리톨의 농도 및 수율

균주	생성된 크실리톨의 농도(g/l)	수율(%)
글루코노박터 옥시단스 ATCC621	7.8	16

본 발명은 출발 물질로서 D-아라비톨을 사용하는 간단한 방법에 의해 크실리톨을 생산가능하도록 한다.

Claims

D-아라비톨을, 글루코노박터(Gluconobacter)속 또는 아세토박터 (Acetobacter)속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계; 및

상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법.
제1항에 있어서, 글루코노박터속 또는 아세토박터속에 속하는 미생물이 글루코노박터 수복시단스(suboxydans), 글루코노박터 옥시단스(oxydans) 또는 아세토박터 크실리눔(xylinum)인 방법.
D-아라비톨을, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움 (Agrobacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 에르위니아(Erwinia)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속, 마이크로콕쿠스(Micrococcus)속, 노카르디아(Nocardia)속, 플라노콕쿠스(Planococcus)속, 슈도모나스 (Pseudomonas)속 또는 로도콕쿠스(Rhodococcus)속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계; 및

상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법.
제3항에 있어서, 아크로모박터속에 속하는 미생물이 아크로모박터 비스코수스(viscosus)이고, 아그로박테리움속에 속하는 미생물이 아그로박테리움 투메파시엔스(tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라디오박터(radiobacter)이며, 아르트로박터속에 속하는 미생물이 아르트로박터 파라피네우스 (paraffineus) 또는 아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스 (hydrocarboglutamicus)이고, 아조토박터속에 속하는 미생물이 아조토박터 인디쿠스(indicus)이며, 브레비박테리움속에 속하는 미생물이 브레비박테리움 케토글루타미쿰(ketoglutamicum)이고, 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 파스시엔스(fasciens)이며, 에르위니아속에 속하는 미생물이 에르위니아 아밀로보라(amylovora)이고, 플라보박테리움속에 속하는 미생물이 플라보박테리움 페레그리눔(peregrinum) 또는 플라보박테리움 푸카툼(fucatum)이며, 마이크로콕쿠스속에 속하는 미생물이 마이크로콕쿠스(Micrococcus)종 CCM825이고, 노카르디아속에 속하는 미생물이 노카르디아 오파카(opaca)이며, 플라노콕쿠스속에 속하는 미생물이 플라노콕쿠스 에우시나투스(eucinatus)이고, 슈도모나스속에 속하는 미생물이 슈도모나스 신산타(synxantha)이며, 로도콕쿠스속에 속하는 미생물이 로도콕쿠스 에리트로폴리스(erythropolis)인 방법.
D-아라비톨을, 모르가넬라(Morganella)속, 악티노마두라(Actinomadura)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하고 D-아라비톨을 크실리톨로 전환시킬 수 있는 미생물과 접촉시키는 단계; 및

상기 생성된 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 크실리톨의 제조 방법.
제5항에 있어서, 모르가넬라속에 속하는 미생물이 모르가넬라 모르가니(morganii)이고, 악티노마두라속에 속하는 미생물이 악티노마두라 마두라에(madurae)이며, 악티노마이세스속에 속하는 미생물이 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스(violaceochromogenes)이고, 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(coelicolor), 스트렙토마이세스 플라벨루스(flavelus), 스트렙토마이세스 그리세올루스(griseolus), 스트렙토마이세스 리비단스(lividans), 스트렙토마이세스 올리바세우스(olivaceus), 스트렙토마이세스 타나시엔시스(tanashiensis), 스트렙토마이세스 비르기니아에(virginiae), 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(antibioticus), 스트렙토마이세스 카카오이(cacaoi) 또는 스트렙토마이세스 라벤둘라에(lavendulae)인 방법.