WO1999013087A1 - Nouvelle protoporphyrinogene oxydase tolerante vis-a-vis des herbicides necessitant de la lumiere - Google Patents
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Classifications
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- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
Definitions
- the present invention relates to protoporphyrinogenogenoxidases derived from plants, in particular tobacco, which are resistant to light-requiring herbicides, the tano.
- the present invention relates to a gene encoding a protein, a recombinant vector containing the gene, and a transformant using the vector.
- Protoporphyrinogenoxidase is a tetrapyrrolyl synthesis system ubiquitous in all organisms.
- V is an enzyme that converts protoporphyrinogen ⁇ to protoporphyrin ⁇ .
- E. coli hemG was first isolated as a protoporphyrinogenoxidase gene (Sasarman, A. et al. (1993) Can.J. Microbiol. 39: 1156-1161.) Bacterial hemY was isolated as the protoponolefilinogenoxidase gene (Dailey, TA et al. (1994) J. Biol. Chem.
- a light-requiring herbicide-tolerant protoporphyrininogenoxidase gene derived from a higher plant is a promising candidate gene to be used.
- Protoponolefilinogenoxidase from other organisms such as E. coli protoporphyrinogenoxidase, has structurally greatly different molecular weights compared to those of other organisms.
- Bacterial protovorphyrinogen oxidase differs significantly from protoporphyrin monogenoxidase in other membrane-bound organisms in that it is soluble.
- animal protoponoleurinogenoxidase has a special property in that it has no transit peptide, but is still capable of being transported to mitochondria. Due to such differences in the properties of protoporphyrinogen oxidase derived from various organisms, when a light-demanding herbicide-tolerant plant is produced by genetic recombination, a plant derived from a higher plant is desirable.
- an object of the present invention is to provide a protoporphyrino-genoxidase derived from a higher plant that is highly resistant to a light-requiring herbicide, a gene encoding the enzyme, a recombinant vector containing the gene, and a vector comprising the vector. And to provide a transformant.
- the present inventors have conducted intensive studies on protoporphyrinogenoxidase of higher plants that solve the above problems, and as a result, selected plant cells in the presence of herbicides, After confirming that the resistant gene in the plant has sufficient biological activity and high light-requiring herbicide resistance in the plant cell, the gene is identified by a specific method. We took the measure of isolation. Specifically, as a result of intensive studies on protoporphyrinogen oxidase of higher plants that solve the above-mentioned problems, particularly tobacco, protoporphyte that is resistant to light-requiring herbicides derived from tobacco. The gene for linogen oxidase was successfully cloned and expressed.
- the gene of the present invention is novel, and the degree of resistance of the gene product to light-requiring herbicides was compared with that of protoporphyrin monogenoxidase derived from Arabidopsis thaliana, which has been reported previously. Despite the high similarity of the structure, it became clear that the resistance of this gene product was greatly superior. Therefore, the task is to It can be solved by using
- the present invention relates to an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and deletion or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence, substitution or the like is recognized and substantially equivalent.
- a mutant peptide having photoenzyme-resistant herbicide resistance, a protoponolefilinogenogenoxidase, and a derivative or mutant thereof, which have a strong enzyme activity, are eliminated.
- the transit peptide lacks the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and has an amino acid sequence that exhibits the resistance to a light-requiring herbicide having substantially the same enzymatic activity. Provide oxidase.
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the protoponolefilinogenoxidase of the present invention has substantially the same enzymatic activity and resistance to light-requiring herbicides as long as Mutated peptides in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence, ie, mutated peptides found in nature or artificially modified mutated peptides.
- the polypeptides of the present invention are believed to be enzymes present in chloroplasts.
- most of the proteins present in organelles such as chloroplasts are encoded in the nuclear genome, and after being translated in the cytoplasm, act by a transport signal called a transit peptide at the N-terminus. It is transported to these organelles. After transport, the transit peptide is excised to a mature protein. Therefore, it is considered that a transit peptide also exists at the N-terminus of the polypeptide of the present invention.
- the essence of expressing biological activity lies in the portion excluding the transit peptide (mature protein portion), and transit peptides are not involved in the activity. Accordingly, the present invention includes the mature protein portion lacking the transit peptide.
- the present invention relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or the nucleotide sequence, wherein one or more nucleotides are attached, deleted or substituted, and substantially
- the present invention provides a protoporphyrinogen oxidase gene having an enzyme activity equivalent to that of protoporphyrinogen oxidase and exhibiting ft resistance to a light-requiring herbicide.
- a cDNA encoding the desired protoporphyrinogen oxidase, a chromosomal DNA containing introns and exons, and an intron of the same chromosomal DNA are removed from the DNA sequence according to the present invention encoding the polypeptide, and exons are ligated.
- DNAs, and synthetic DNAs obtained by linking oligonucleotides artificially produced by the synthetic DNA method are obtained by linking oligonucleotides artificially produced by the synthetic DNA method.
- the base sequence IJ of the gene is changed without changing the amino acid sequence due to the degeneracy of the genetic code. By doing so, the desired recombinant DNA can be prepared. Therefore, the DNA of the present invention also includes all nucleotide sequences based on the degeneracy of the gene encoding the polypeptide of interest.
- the present invention also provides a recombinant vector containing the above-mentioned gene and a transformant using the above-mentioned vector.
- Fig. 1 is a schematic diagram of pBNtPX-1
- Figure 2 is a schematic diagram of pCR-HC and pCR-RC
- the amino acid at position 231 changes from alanine to valine
- Figure 3 is a schematic diagram of pBAtPX-C and pBAtPX-RC
- Fig. 4 is a schematic diagram of pBI-NtPX-HC and pBI-NtPX-RC.
- Figure 5 is a schematic diagram of pBI-AtPX-HC and pBI-AtPX-RC
- the light-requiring herbicide used in the present invention is a herbicide that requires light for herbicidal activity expression.
- a light-requiring herbicide When a light-requiring herbicide is applied to a plant, first, the membrane system in the cell is peroxidized. Are destroyed, then the above-ground parts are whitened and eventually die.
- Protoporphyrin IX was found to accumulate in cells treated with light-requiring herbicides (Matringe, M. and Scalla,. (1988) Plant Physiol. 86: 619-622.).
- the target enzyme of the herbicide was found to be protoporphyrinogen oxidase, which converts protoponoleurinogen to protoporphyrin in the tetravirol synthesis system (Matringe, M. et al.
- This protoporphyrin IX causes a photosensitization reaction in the presence of light, generating a large amount of reactive oxygen, which peroxidatively destroys the membrane system and causes the plant to die (Scal la, R. and Matringe, M. (1994) Rev. Weed Sci. 6: 103-132.): Due to this mode of action, light-requiring herbicides are protoporphyrinogenogenoxidase (Protox) inhibitors and porphyrin-accumulating herbicides. It is also called an agent.
- Protox protoporphyrinogenogenoxidase
- porphyrin-accumulating herbicides It is also called an agent.
- Light demanding herbicides include compounds of various structures. Representative examples include difuunyl ethers, oxaziazoles, pyridines, pyrimidines, cyclic imides, triazoles, and birazinoles (Scalla, R. and Matringe, M. (1994) Rev. Weed Sci. 6: 103-132 ⁇ ).
- the light-requiring herbicide of the present invention is preferably a triazole-based or pyrazole-based compound, and most preferably, for example, a pyrazole-based compound shown below.
- Plants can re-differentiate from a single cell, protoplast, through a callus, a cell mass, to a complete plant again, and this property of the plant is called totipotency. .
- those cells can be mentioned that the rich very mutations, such mutations are called somatic mutations (somac l ona l variation). Therefore, any such cultured cells
- a herbicide a herbicide-resistant cell can be obtained, and the obtained herbicide-resistant cell can be regenerated to a plant using the totipotency.
- Examples of such plants are dali phosphate-resistant plants (Singer, SR and Mcdaniel, CN (1985) Plant Physiol.
- herbicide-tolerant gene can be isolated from the herbicide-tolerant cells, the obtained gene can be introduced into various useful crops by a known method, for example, the agrobacterium method.
- Such herbicide resistance genes include genes that degrade the herbicide itself, such as the promoxinil degradation gene (Stalker, D.. Et al.
- the bialaphos degradation gene (De Block, M. et al. (1987) EMBO J. 6: 2513-2518), genes that degrade any toxic substances produced by herbicides, such as the superoxide dismutase gene (Furusawa, I. et al. (1987) Plant Cell Physiol. 25: 1247-1252.), a herbicide-resistant target enzyme gene, for example, a snorefonylperarea-resistant acetate-butyrate synthase (ALS) gene (Lee, KY et al. (1988) EMBO, J.
- ALS snorefonylperarea-resistant acetate-butyrate synthase
- EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
- the mechanisms of resistance in herbicide-resistant cultured cells may include the acquisition of detoxification mechanisms, changes in drug permeability into cells, overproduction of target enzymes, and mutation of target enzymes into herbicide-resistant forms. . Elucidation of the power of resistance by any mechanism The elucidation of the presence or absence of the precursor of the reaction inhibited by the herbicide, the comparison of resistance to various structures of herbicides showing the same or different mechanisms of action, It can be estimated by extracting the target enzyme from susceptible cells and comparing the enzyme activities, and examining in vitro the sensitivity of the target enzyme to the herbicide used for selection. As a result, if it becomes clear that a useful herbicide-tolerant gene is retained, it will be a useful gene source for isolating the herbicide-tolerant gene.
- Methods for clawing a gene include a method using information on proteins, a method using information on nucleic acids, and a genetic method.
- Methods using protein information include methods for purifying a target protein, using an antibody against the target protein, screening an expression type library, and amino acid sequences of the target protein. There is a method of elucidating even a part of the sequence and synthesizing the information nucleic acid probe or PCR primer. However, generally, it is relatively difficult to purify proteins.
- the method using nucleic acid information uses the homology of genes between organisms, uses genes of other organisms as probes, and uses hybridization or the like to identify the gene of interest. It is a method of catching.
- the homology of genes between organisms varies depending on the type of organism, the organism, the gene, and the conditions of hybridization are experimentally determined after experimenting with various conditions. In some cases, optimal conditions may not be obtained. In these methods, it is necessary to confirm the biological activity of the obtained gene product by any means.
- the genetic method means that the same protein gene derived from a heterologous organism is expressed in a mutant microorganism strain in which the gene of interest is genetically deficient, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, etc. It is a method that is introduced in a suitable form and complements the growth. This method is also called genetic complementation, and when the gene is isolated, the biological activity of the gene product has already been confirmed.
- a gene derived from a higher organism is expressed in a microorganism, a vector-derived protein or transit peptide that cannot exert enzymatic activity without post-translational modification such as addition of a sugar chain is attached to the N-terminus.
- Glutamate-1-semialdehyde is synthesized from Glu-tRNA Glu-tR ⁇ 'A Reductase
- Glutamate- 1 semialdehyde is synthesized 5-Aminolevul inic acid is synthesized.
- Semialdehyde aminotransferase has been cloned by genetic complementation using hemA gene deficient mutants and hem mutants of E. coli (Ilag, Shi L et al., (1994) Plant Cell 6: 265-275) .).
- a gene-deficient mutant of Escherichia coli is also effective when cloning plant protoporphyrinogenoxidase by a genetic method.
- Mutants of E. coli lacking protoporphyrinogenoxidase include hemG gene-deficient mutants SASX38 (Sasarman, A. et al. (1979) J. Gen. Microbiol. 113: 297-303 VSR751 (Nishimura, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 8076-8080.) Is known!
- the total RNA of the plant can be extracted using known methods such as the RNA extraction method, for example, the guanidine method, the guanidine phenol method, the SDS phenol method, and the like.
- total RNA force conventional method extracted, c which can be purified mRNA by, for example, oligo-dT cellulose method
- Preparation of cDNA can be performed according to a conventional method such as the method described in the above-mentioned experimental book.
- double-stranded cDNA can be synthesized by the Okayama-Berg method, Gubler-Hoffman method, or the like.
- the cDNA can be ligated to a plasmid, ⁇ phage, or the like according to a conventional method to prepare a cDNA library.
- a vector for use a vector having a promoter such as lacZ or tac upstream of MCS (for example, a pUC-based plasmid or an Agtl-based phage) should be selected to prepare an expression-type cDNA library. And hope ,.
- a unidirectional library can be prepared by using a primer adapter or the like as a primer.
- the protoporphyrin-genoxidase gene was isolated by introducing the expressed cDNA library into a hemG (protoponoleylinogenoxidase gene) -deficient mutant strain of Escherichia coli and isolating a cDNA clone that complemented the growth. Can be cloned.
- the entire sequence of the cleaved gene can be determined by the Maxam's Guinolevate method or the Sanga method.
- Nucleotide sequence analysis software for example, Genetyx (SDC) and DNASIS (Hitachi Software Engineering), search for protein-encoding parts, and base sequence homology with known genes. Analysis can be performed.
- tobacco callus having a light-requiring herbicide-resistant mechanism is not necessarily a cDNA library when the protoporphyrinogen oxidase gene is cloned. Can be cloned relatively easily by PCR without the necessity of constructing and performing the genetic complementation method. From the nucleotide sequence information of the tobacco chloroplast protovorphyrinogen oxidase gene identified in the present invention, a PCR primer capable of amplifying the entire open reading frame encoding protoporphyrinogen oxidase was designed.
- a light-requiring herbicide-tolerant plant By using the light-requiring herbicide-resistant protoporphyrinogenogenoxidase gene shown in the present invention, a light-requiring herbicide-tolerant plant can be produced. That is, a promoter that functions in a plant cell, a light-requiring herbicide-resistant protoponolefilinogenogenoxidase gene, and an expression cassette that functions in a plant cell as a terminator are incorporated into a suitable plasmid vector and For example, a gene transfer method such as agrobacterium terminus, electroporation to protoplasts, and particle gun method to plant tissue may be used, and an expression cassette may be introduced into plant cells to transform cells. Can be created. The resulting plants have an agriculturally useful trait of light demanding herbicide resistance. If expression cassettes having different genes are also used at the same time, the resistance to light-requiring herbicides expressed by the present gene and the traits thereof can be used as a key to the selection of transformed products. .
- Suitable plasmid vectors include the pBI plasmid and the pMO plasmid when the Agrobacterium method is used, and pUC plasmid and pBluescript plasmid when other methods are used. Plasmids and the like can be mentioned. Promoters that function in plants include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the like, and promoters that function in plants include the CaMV terminator. These are described in detail in the above-mentioned experiment book, for example, Plant Molecular Biology anua], Gelvin, S.A. et al. Kluwer Academic Publishers, 1991, 1995 (Second edition). Example
- Xanthi NC tobacco (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC) grown to a total height of about 40 cm in a greenhouse was cut out, cut into 5 cm pieces using a scalpel, and then 70 ° /.
- the surface was sterilized by immersing in ethanol for 30 seconds in an aqueous solution of sodium hypochlorite (effective chlorine concentration 1%) for 30 minutes. After washing three times with sterile water, the epithelial cells are removed, and the enzyme solution (1% cellulase onozuka R-10 and 0.05% macerozyme R-10 (Yakunoreto)) 0.6 M mannitol (pH 5. 8) The suspension was carried out at 26 ° C for 3 hours.
- the amount of protoporphyrin IX in the obtained lower layer was measured from the value of Ex 405 nm-Em 631.5 nm with a fluorescence spectrophotometer. All extraction operations were performed under safe light.
- the amount of protoporphyrin IX was 1.3 g / g fresh weight after 24 hours for the sensitive strain and 48 hours after 1.9 ⁇ g / g fresh weight, 1.7 ⁇ g / g fresh weight after 24 hours and 4.6 ⁇ g / g fresh weight after 48 hours for ETR-056 strain Ponorefillin IX accumulation was observed.
- ETR-245 and ETR-253 strains accumulation of protoporphyrin IX was hardly recognized.
- Fomesafen (trade name: Flex) and oxadiazone (trade name: Lonsta-1), which accumulate protoporphyrin IX as a light demanding herbicide
- birazoxifene (trade name: Noisa-1), which causes bleaching with chlorophyll synthesis inhibitor
- DPX-84 Bialaphos (trade name: Pasta), Dalifosate (trade name: Roundup), Butachlor (trade name: Mashette), a protein synthesis inhibitor
- Propanil (trade name, an inhibitor of photosynthetic photosystem I) Stam) and paraquat (trade name: Pregrottas), which generates active oxygen with an inhibitor of photosynthetic photosystem II.
- each resistant strain was transplanted to an MS liquid medium containing each drug, and the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured.
- MIC minimum inhibitory concentration
- both resistant strains showed strong resistance to fomesafen and oxaziazone, which accumulate protoporphyrin IX with the protoporphyrin monogenoxidase inhibitor.
- the ETR-056 strain also showed resistance to paraquat, and the ETR-253 strain also showed resistance to vilazoxifene, DPX-84 and dalifosate.
- the ETR-056 strain is resistant to reactive oxygen species due to overproduction of superoxide dismutase
- the ETR-253 strain is multidrug resistant due to decreased membrane permeability
- the ETR-245 strain is the target enzyme.
- the mutant strain was considered to be resistant due to overproduction of the target enzyme.
- the MIC of Compound A was measured for the susceptible strain and the ETR-056 ETR-245 and ETR-253 strains. As a result, the MIC for the susceptible strain was 5 nM, but the MIC for the resistant strain was 2400 nM or more, indicating that all the resistant strains showed strong resistance to Compound A. It became. Therefore, in the following examples, compound A was used as a light demanding herbicide, and ETR-245 strain was used as a resistant strain.
- the resulting supernatant was centrifuged at 4 000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and the precipitate was dissolved in 2 nil of 20% glycerin.
- the tank mass of the obtained crude enzyme solution was measured with a protein measurement kit (Bio-Rad).
- reaction buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.6) ImM EDTA 5 mM DTT 0.03% Tween80
- the crude enzyme solution was added to a final concentration of 0.1 mg protein / ml. And heated slowly to room temperature. After heating, add protoporphyrinogen IX to a final concentration of 2 ⁇ M and add nitrogen.
- the reaction was started by replacing the gas phase with the gas. After 10 minutes from the reaction, the fluorescence for 30 minutes was monitored with a fluorescence spectrophotometer, and the enzyme activity was measured (Ex: 405 nm, Em: 631.5 nm).
- RNA fraction was obtained by Distilled water was added to the dried precipitate to dilute it to lmg / ml, 10M lithium chloride was added to a final concentration of 2M, and the mixture was allowed to stand on ice for 2 days. After standing, the precipitate was collected by centrifugation at 2,000 xg for 30 minutes at 4 ° C to obtain a total RNA fraction.
- RNA fraction Purification of mRNA of the total RNA fraction was performed using an oligo dT span column (Pharmacia) according to the attached instructions.
- the cDNA library was prepared using Superscript Lamda System (GIBC0 BRL). This kit can use a primer adapter during the first strand synthesis, and insert the resulting cDNA into the lacZ promoter of gt22A in the forward direction.
- GIBC0 BRL Superscript Lamda System
- ⁇ g of the mRNA obtained by the above method was used as type II, and subjected to cDNA first strand synthesis, cDNA second strand synthesis, adapter binding, restriction enzyme treatment, and column chromatography according to the instructions attached to the kit.
- phage particles were reconstituted using Gigapack Gold (Stratagene) according to the attached instructions.
- Primary library containing approximately 1.9 million independent clones -Was stained with Escherichia coli Y1090 (r-) strain, propagated, and stored as an amplification library.
- the form was added to a 4% closate, stirred well, allowed to stand at room temperature for at least 30 minutes, and centrifuged to obtain phage particles as a supernatant.
- the obtained phage particles were again stained with Escherichia coli Y1090 (r-) strain ⁇ 3 ⁇ 4g, and a single plaque was suspended in SM medium containing 4% black form.
- the recovered recombinant phage particles were reinfected with the SASX38 strain, and only those showing growth recovery ability were reselected.
- Amplification of the cDNA insert was performed by PCR. That is, the DNA contained in the collected recombinant phage particles was designated as type III, and Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq, Takara Shuzo), and a forward primer for gt22A (5'-ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AG-3 ', SEQ ID NO: 4) and reverse primer (5'-CCA GAC C CTG GTA ATG GTA GCG-3', SEQ ID NO: 5) for 1.5 minutes at 94 ° C and 1.5 minutes at 69 ° C.
- One cycle consisting of 2 minutes of reaction at 72 ° C. for 30 minutes was performed for 30 cycles.
- pBluescript SK (-) (Stratagene), as described in the aforementioned protocol (eg, Current Protocols in Molecular Biology, Jhon Wiley & Sons, Ausubel, M. et al.), In a positive orientation to the lacZ promoter. That is, pBluescript SK (-) was recovered after digestion with EcoRV, and Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq, Takara Shuzo) was added thereto. The mixture was reacted with C for 2 hours, and T was added to the 3 'end of the plasmid.
- TAKARA EX Taq Takara Shuzo
- a competent cell of Escherichia coli XL-1 Blue 3 ⁇ 4 (Stratagene) prepared by the CaCl 2 method was transformed, and spread on a LB solid medium containing IPTG.Xgal and ampicillin at 37 ° C. Cultured overnight at C. After the culture, the white colonies with the inserts were selected and selected, and were subjected to shake culture in an LB liquid medium containing ampicillin, followed by preparation of a plasmid DNA by the alkaline lysis method.
- the obtained plasmid DNA was cleaved with a restriction enzyme, and a host Escherichia coli having a plasmid into which cDNA was inserted in a forward direction was selected.
- the resulting plasmid was named pBNtPX-1 (FIG. 1), and the selected host E. coli was supplemented with dalyserin to 15% and stored at -80 ° C.
- E. coli harboring pBNtPX-1 was cultured in LB liquid medium containing ampicillin, the plasmid was purified in large quantities by the cesium chloride method.
- the competent cell of Escherichia coli SASX38 strain prepared by the CaCl 2 method was transformed using the obtained plasmid.
- the transformed SASX38 strain was spread on an LB medium and cultured at 28 ° C. As a result, when pBNtPX-1 was used, a large number of large colonies in which growth had recovered was found in small colonies. As described above, the expression of protoponolefilinogenogenoxidase activity in Escherichia coli by pBNtPX-1 was confirmed.
- a dilution clone was prepared using a Deletion kit for Kilo-Sequence (Takara Shuzo) according to the attached instructions, and a Cycle Sequencing kit Ampl iTaq FS ( The nucleotide sequence was elucidated using Perkin-Elmer Co., Ltd.) and Photo-Quencher (ABI PRISM 310, Pakin-Elma Co., Ltd.) according to the attached instructions.
- this polypeptide is a dinucleotide binding domain (GXGXXG) conserved at the end of protoporphyrinogen oxidase in many organisms (Nishimura, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 8076-8080)), which confirmed that it was protoporphyrinogen oxidase.
- Bacillus subtilis and animal protoporphyrinogen oxidase are also located upstream of this domain. While only ⁇ 11 amino acids are found, 77 amino acids are found in chloroplast protoporphyrinogen oxidase of tobacco, and in tobacco this is a transit peptide for chloroplasts. it was thought.
- Table 5 Comparison of amino acid sequences of chloroplast protoporphyrinogenogenoxidase in tobacco (upper) and Arabidopsis (lower) Homology: 75.9%
- Protoporphyrinogenoxidase gene is amplified by PCR using the obtained cDNA form. Tried that.
- the primers for PCR include forward primer (5′-GCG GTC TAC AAG TCA GGC ACT CAT-3 ′, SEQ ID NO: 6) and reverse primer (5′-CAT GCC AAT TTT CCC AAG GCA TGA TCG TAT T -3 ', SEQ ID NO: 7), 1 cycle of 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 20 seconds and 61 ° in a thin wall tube with Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq, Takara Shuzo) C was performed for 30 cycles at 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, and 1 cycle at 72 ° C for 5 minutes.
- TAKARA EX Taq Takara Shuzo
- Plasmids into which the chloroplast-type protoporphyrin genoxidase gene from the susceptible strain or ETR-245 strain was inserted were named pCR-HC or pCR-RC ( Figure 2). % And glycerin was added thereto, and stored at -80C.
- the plasmids were purified in large amounts by the cesium chloride method.
- competent cells of Escherichia coli SASX38 strain prepared by the CaCl method were transformed.
- the transformed SASX38 strain was spread on an LB medium and cultured at 28 ° C. As a result, when any of the plasmids was used, a large number of recovered and large forces were observed in a small colony.
- pCR-HC and pCR-RC were used to express protoponolerefrininogen oxidase activity in Escherichia coli.
- the Escherichia coli SASX38 strain containing the above two plasmids was cultured with shaking at 28 ° C overnight in LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. After measuring the OD 600, 50 ⁇ g / ml ampicillin and 0 1 10 100 1, 000 2 000 5 000 is Les, the compound-free LB liquid medium 10, OOOnM, the same 0D 6 ⁇ value And shaking culture at 28 ° C. Over time some collected, microplate one tri one loaders (MTP - 120, corona electric Co.) to measure the 0D 530 with, made the growth of E. coli in the control group (Compound A onm) 50% Hinder The concentration (IC 50 ) was calculated.
- pCR-HC is les, in the pCR-RC-free E. coli, the IC 50 respectively about 2. 5 nM some les, becomes 10, OOOnM above, R / S ratio (resistance-type IC 5Q Z wild type IC 5 )) was 4,000 or more. Incidentally, 10, medium cloudy in OOOnM above, it was impossible to measure the OD 530. Based on the above results, the mechanism of compound A resistance in the ETR-245 strain indicates that the chloroplast-type protoporphyrinogenogenoxidase gene is mutated to a light-requiring herbicide-resistant type due to some mutation in the gene. It was thought to be.
- the light-required herbicide-resistant protoporphyrin monogenoxidase gene (pAraC-) described in WO 95/34659, described in WO95 / 34659, is a mutation of alanine, which is the 220th amino acid, to a phosphorus. lVal).
- the cDNA in the resulting plasmid was subcloned again into pBluescript SK (-), and the entire nucleotide sequence of the cDNA was elucidated. It was confirmed that the target nucleotide sequence was obtained.
- the resulting light-required herbicide-resistant plasmid was named pBAtPX-RC (FIG. 3).
- Escherichia coli SASX38 strain carrying pCR-HC containing wild-type tobacco protoporphyrinogenogenoxidase gene of tobacco, and tobacco-resistant protoporphyrinogenoxidase gene of tobacco are included PCR-RC-bearing Escherichia coli SASX38 strain, Arabidopsis wild-type protovorphyrin monogenoxidase gene-containing pBAtPX-C-bearing E. coli SASX38 strain and Arabidopsis thaliana Using SASX38 strain E.
- pCR-H which carries the tobacco wild-type protoporphyrinogenoxidase gene
- pCR-RC which carries the tobacco resistant protoporphyrinogenoxidase gene and Arabidopsis wild-type protoporphyrinogenoxidase Retain genes
- pBAtPX-C and pBAtPX-RC carrying Arabidopsis resistant protoporphyrinogen oxidase gene was cleaved with Xhol, and blunt-ended with a Klenow fragment of DNA polymerase I (Takara Shuzo).
- the fragment was separated into a protoponolefilinogenogenoxidase gene fragment and a plasmid fragment by agarose gel electrophoresis, and a protoporphyrinogenoxidase gene fragment was recovered.
- Plasmid fragments derived from the obtained pBI121 and the proto port Honoré Philippines Roh one Geno Kishida Ichize gene fragment was Raige one Chillon with DNA Ligation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), Competent of E. coli HB101 strain was produced by the CaCl 2 method The senor was transformed, spread on an LB solid medium containing kanamycin, and cultured at 37 ° C for a whole time.
- plasmid DNA was prepared by the alkaline lysis method.
- the obtained plasmid DNA was digested with restriction enzymes, and Escherichia coli having a plasmid into which each protoporphyrinogen oxidase gene was inserted was selected.
- the wild type of tobacco is a binary vector containing the resistant protoporphyrinogenoxidase-zetase gene inserted into the pBI-NtPX-HC, respectively, the pBI-NtPX-RC (Fig.
- the binary vector into which the resistant or resistant protoponolehuirinogen oxidase gene was inserted was named pBI-AtPX-HC or pBI-AtPX-RC (Fig. 5), respectively. Glycerin was added thereto and stored at -80 ° C.
- the four kinds of the above-mentioned nocturnal inarii vectors were introduced into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Clontech) by the triparental mating method. That is, E. coli HB101 strain carrying a binary vector, E. coli strain HB101 which holds the helper phage P RK2013 (Clontech, Inc.) and A. tumefaciens LBA4404 strain NB agar medium (0. 8% Nutrient broth, 1. 5% bacterial medium After culturing for 2 days at 28 on agar (Wako Pure Chemical Industries), the three were mixed well and cultured at 28 ° C for another 2 days.
- the leaf disk was allowed to stand on a 0.6% agar-containing MS solid medium supplemented with 2 ppm of NM and 0.2 ppm of BA with the leaves upside down, and cultured at 25 ° C. for 48 hours.
- the leaf disk was transferred to an MS liquid medium supplemented with 500 ppm of carbenicillin and 200 ppm of claforan ⁇ r ⁇ , 2 ppm of NM and 0.2 ppm of BA, and cultured with shaking at 27 ° C for 48 to 72 hours. tumefaciens was removed.
- genomic DNA was extracted and purified from the leaves of the transformed plant by the CTAB method.
- Taq DNA polymerase TAKARA EX Taq, Takara Shuzo
- forward primer for Ca V 35S promoter 5′-CAC AGA TGG TTA GAG AGG CTT ACG CAG-3 ′, SEQ ID NO: 9
- N0S terminator reverse primer 5'-TCA TCG CM GAC CGG CM CAG GAT TCA-3, SEQ ID NO: 10
- N0S terminator reverse primer 5'-TCA TCG CM GAC CGG CM CAG GAT TCA-3, SEQ ID NO: 10 in a thin wall tube at 94 ° C for 3 minutes, 1 cycle, 94 ° C 30 cycles of 20 seconds, 62 ° C, 30 seconds and 72 ° C, 3 minutes.
- Leaves of approximately the same leaf position were collected from the transformed, non-transformed body and the non-transformed body after the confirmation of the transgene, and leaf disks having a diameter of 9 mm were prepared. 0, 125, 250, 500, 1 , 250, 2, 500, 5,000, 12,500 nM floating on a Petri dish containing Compound A aqueous solution. After culturing at 27 ° C under continuous strong light for one week, the whitening degree of the leaf disk was observed, and the allowable concentration of Compound A was calculated.
- Tobacco wild type (pBI—NtPX-HC) 500n X 4 Tobacco t-type (pB to NtPX-RC)> 12,500n, VI> X 100
- protoporphyrinogen oxidase which is resistant to a light-requiring herbicide derived from tobacco.
- protoporphyrinogen oxidase which is resistant to a light-requiring herbicide derived from tobacco.
- a plant highly resistant to light-requiring herbicides is expressed by expressing the enzyme in a host plant. It is possible to create
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Description
明細書 光要求型除草剤耐性新規プロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ 技術分野
本発明は、植物、特にタバコ由来の、光要求型除草剤に耐性なプロトポルフィリノ一ゲンォキシダ —ゼ、該タンノ、。ク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えべクタ一並ぴに該ベクターによる 形質転換体に関する。 背景技術
プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼは全生物に普遍的に存在するテトラピロ一ル合成系にお
V、て、プロトポルフィリノ一ゲン κをプロトポルフィリン κに変換する酵素である。
本合成系により、微生物、動物においてはヘムが合成され、一方、植物ではヘムの他にクロロフ ィルが合成される。本酵素は光要求型除草剤の標的酵素と考えられてレ、るが、酵素の同定及び遺 伝子の単離は最近まで全くなされていな力つた。 1993年に大腸菌の hemGがプロトポルフィリノ一 ゲンォキシダーゼ遺伝子として初めて単離され (Sasarman, A. et al. (1993) Can. J. Microbiol. 39: 1156-1161. )、 1994年には枯草菌の hemYがプロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子として 単離された (Dailey, T. A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 : 813 - 815. )。真核生物では 1995 年にヒトのプロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子力;クローユングされ (Nishimura, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 : 8076 - 8080. )、同年にはマウスのプロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一 ゼ遺伝子もクローニングされた (Taketani, S. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 230: 760-765· )。 植物においてはシロイヌナズナ及ぴトウモロコシのプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子が クローニングされた (WO 95/34659)。
また、シロイヌナズナ及びトウモロコシの光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ—ゲンォキシダ— ゼ遺伝子も、大腸菌を用 、たスクリーニング系によって、既に得られて 、る。
シロイヌナズナ及びトウモロコシ由来の光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ— ゼ遺伝子 (WO 95/34659)は大腸菌を用レ、て選抜されており、このような遺伝子が植物細胞中で充 分な活性を発揮しうるの力 又耐性の は充分であるのかは明らかではなレ、。
発明の開示
光要求型除草剤耐性植物を遺伝子組換えで作出する場合、用レヽる遺伝子としては、高等植物 由来の光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子が有力な候補となる。他 の生物由来のプロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ、例えば大腸菌のプロトポルフィリノ一ゲンォキ シダ一ゼは他生物のものに比べて分子量が明らかに小さレ、等、構造的に大きく異なり、枯草菌のプ ロトボルフイリノーゲンォキシダ一ゼは可溶性である点が膜結合性の他の生物のプロトポルフィリノ 一ゲンォキシダーゼとは大きく異なる。また動物のプロトポノレフイリノーゲンォキシダーゼはトランジ ットペプチドを持たなレ、にも力、かわらずミトコンドリアに輸送されるとレ、う特殊な性質を持つ。このよう な各種生物由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの性質の違レ、から、光要求型除草剤耐性 植物を遺伝子組換えで作出する場合、高等植物由来のものが望ましい。
一方、単細胞生物である Chlamydomonas由来の抵抗性遺伝子 (WO 97/04088)はプロ卜ポルフ イリノーゲンォキシダ一ゼ遺伝子である力、どうかは不明であり、高等植物に耐性を付与できる力どう かは明らかではなレ、。
望ましい遺伝子としては従って、植物細胞あるいは植物体を除草剤存在下で選抜し、該植物細 胞ぁるレ、は植物体中の耐性型遺伝子が植物細胞中で充分な生物活性及び高度な光要求型除草 剤耐性を保持して！/、ることを確認した後、該遺伝子を何らかの方法で単離したものと考えられる。 従って、本発明の課題は、高等植物由来の、光要求型除草剤に高度に耐性なプロトポルフィリノ —ゲンォキシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子 む組換えべクタ一並びに該ベクタ 一による形質転換体を提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決すベぐ高等植物のプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼにつレヽ て鋭意研究を行った結果、植物細胞あるレ、は植物体を除草剤存在下で選択し、該植物細胞あるレ、 は植物体中の耐性型遺伝子が植物細胞中で充分な生物活性及び高度な光要求型除草剤耐性を 有していることを確認した後、該遺伝子を特定の方法で単離するという手段を取った。具体的には 前記課題を解決すベぐ高等植物特にタバコのプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼにつレ、て鋭 意研究を行った結果、タバコ由来の、光要求型除草剤に耐性を示すプロトポルフィリノ一ゲンォキシ ダーゼの遺伝子のクローニング及ぴ発現に成功した。本発明の遺伝子は新規であって、本遺伝子 産物の光要求型除草剤に対する耐性度を、既に報告されてレ、るシロイヌナズナ由来のプロトポルフ ィリノ一ゲンォキシダーゼの耐性度と比較したところ、両者の構造の高い類似性にも力かわらず、本 遺伝子産物の耐性度が大いに勝ってレ、ることが明らかとなった。従って、前記課題は、本遺伝子を
用レ、ることによって解決することができる。
本発明は、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列、該アミノ酸配列にぉレ、て 1個または複数 個のアミノ酸の欠失、付加あるレ、は置換等が認められ且つ実質的に同等の酵素活性を有する光要 求型除草剤耐性を示す変異ペプチド、力もなるプロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ、その誘導体 又は変異体を撤する。さらに、配列番号 2に記載のアミノ酸配列にぉレ、て、トランジットペプチドが 欠失し且つ実質的に同等の酵素活性を有する光要求型除草剤耐 を示すアミノ酸配列力もなるプ ロトボルフイリノーゲンォキシダーゼを提供する。
配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 なる本発明のプロトポノレフィリノ一ゲンォキシダ一ゼは、実 質的に同等の酵素活性及び光要求型除草剤に対する耐性を損なうことがなレ、かぎり、前記のァミノ 酸配列において 1個または複数個のアミノ酸の欠如、付加あるいは置換等が認められる変異ぺプ チド、すなわち、自然界に発見される変異ペプチドまたは人為的に改変した変異ペプチドが含まれ る。
本発明のポリペプチドは、葉緑体に存在する酵素と考えられている。一般に、葉緑体等の細胞内 小器官に存在するタンパク質のほとんどは核のゲノムにコードされており、細胞質で翻訳された後、 N末端に存在する卜ランジットペプチドと呼ばれる輸送シグナルの働きによって、これら細胞内小器 官に輸送される。輸送された後、トランジットペプチドは切除され、成熟したタンパク質となる。従って、 本発明のポリペプチドの N末端にもトランジットペプチドが存在すると考えられる。また、生物活性を 発現する本質はトランジットペプチドを除いた部分 (成熟タンパク質部分)にあり、トランジットべプチ ドは活性に関与しなレ、。従って、本発明にはトランジットペプチドを欠失した成熟タンパク質部分を 包含する。
またより詳しくは、本発明は配列番号 3に記載の塩基配歹リ、又は該塩基配列にぉレ、て 1個若しく は複数個の塩基が付カロ、欠失若しくは置換されており且つ実質的にプロトポルフィリノ一ゲンォキシ ダーゼと同等の酵素活性を有する光要求型除草剤耐 ftを示すプロトポルフイリノーゲンォキシダー ゼ遺伝子を提供する。
また前記ポリペプチドをコードする本発明による DNA配列には、目的のプロトポルフイリノーゲン ォキシダ一ゼをコードする cDNA、イントロン及びェクソン^む染色体 DNA、同染色体 DNAのィ ントロンを除去してェクソンを連結した DNA、さらには合成 DNA法によって人為的に作製したオリ ゴヌクレオチドを連結して得た合成 DNA等が含まれる。合成 DNA法を用いて合成 DNAを調製す る際には、遺伝子コードの縮重により、アミノ酸配列を変化させることなく遺伝子の塩基配歹 IJを変化
させることによって、 目的の組み換え DNAを調製することができる。したがって本発明の DNAは、 目的のポリペプチドをコードする遺伝子の縮重に基づく全ての塩基配列をも包含する。
さらに、本発明は、前記の遺伝子^^む組換えベクター、前記のベクターによる形質転換体をも 提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は pBNtPX-1の模式図
第 2図は pCR-HC及び pCR- RCの模式図
▼ :pC -RCにおける変異
(配列番号 1の 717番目の塩基が Cから Tに変異し、
231番目のアミノ酸がァラニンからバリンに変異）
第 3図は pBAtPX- C及び pBAtPX- RCの模式図
T :pBAtPX-RCにおける変異
(WO 95/34659の pAraC- lValと同一の変異）
第 4図は pBI-NtPX- HC及び pBI- NtPX- RCの模式図
T : pBI-NtPX-RCにおける変異
(配列番号 1の 717番目の塩基力 力も Tに変異し、 231番目のアミノ酸が
ァラニンからパリンに変異）
第 5図は pBI- AtPX- HC及び pBI- AtPX- RCの模式図
T :pBI- AtPX- RCにおける変異
(WO 95/34659の pAraC- lValと同一の変異） 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
植物細胞及ぴ組織培養の一般的操作、あるレ、は mRNAの精製、 cDNA、 cDNAライブラリ一、 組換え DNAの作製、 DNAの塩基配列の決定等の一連の分子生物学的な操作、あるいは植物の 形質転換等の植物分子生物学的操作は、公知の実験書、それぞれ Plant Cel l and Tissue Culture, Vasi l, I. K. and Thorpe, T. A. Kluwer Academic Publ ishers, 1994等、め。い は Molecular Cloning 2nd Edition, CSH Laboratory Press, Sambrook, J. et al.， 1989、
r
o
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ausubel, M. et al.等、あ るレ、は Plant Molecular Biology Manual, Gelvin, S. A. et al. Kluwer Academic Publ ishers, 1991, 1995 (Second edition)等に従って実施することができる。
1.光要求型除草剤
本発明で用いられる光要求型除草剤とは、除草活性発現のために光を必要とする除草剤であり、 光要求型除草剤を植物に処理すると、まず、細胞中の膜系が過酸化的に破壊され、次いで、地上 部が白化し、ついには枯死する。光要求型除草剤処理細胞ではプロトポルフィリン IXが蓄積するこ とが見いだされ (Matringe, M. and Scalla, . (1988) Plant Physiol. 86 : 619- 622. )、その後 の研究で、光要求型除草剤の標的酵素は、テトラビロール合成系においてプロトポノレフイリノーゲン をプロトポルフィリン に変換するプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることが明らかとなった (Matringe, M. et al . (1989) Biochem, J. 260 : 231 - 235. )。現在では、光要求型除草剤の作 用機作は以下のように考えられている。光要求型除草剤によって植物細胞中のプロトポルフイリノー ゲンォキシダーゼが阻害されると、まず、基質のプロトポルフィリノ一ゲン IXが蓄積し、このプロトポ ルフィリノ一ゲン Π力 、非酵素的に、あるいは細胞質中の光要求型除草剤非感受性の非特異的 酸化酵素によってプロトポノレフィリン IXが大量に生成される。このプロトポルフィリン IXが光存在下 で光増感反応を引き起こし、大量の活性酸素が発生し、これが膜系を過酸化的に破壊し、植物を 枯死に至らせる（Scal la, R. and Matringe, M. (1994) Rev. Weed Sci . 6 : 103- 132. ) :このよう な作用機作から、光要求型除草剤は、プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ (Protox)阻害剤、ポ ルフィリン蓄積型除草剤とも呼ばれてレ、る。
光要求型除草剤には多様な構造の化合物が属してレ、る。代表的なものとしては、ジフユニルエー テル系、ォキサジァゾール系、ピリジン系、ピリミジン系、環状イミド系、トリァゾ一ル系、ビラゾ一ノレ 系等がある（Scalla, R. and Matringe, M. (1994) Rev. Weed Sci. 6 : 103—132· )。
本発明の光要求型除草剤として望ましくは、トリァゾール系、ピラゾール系であり、最も望ましくは 例えば、下記に示すピラゾ一ル系化合物である。
化合物名
英名 ： ethyl 2 - chloro - 5 - (4 - chloro - 5 - dif luoromethoxy- 1 - methyl - 1 H - pyrazol- 3 - yl) - 4- f luorophenoxyacetate
和名： 2-クロロ- 5 -（4-クロロ- 5-ジフルォロメトキシ- 1 -メチル- 1H-ピラゾ一ル- 3ィノレ） - 4-フルオロフ エノキシ酢酸ェチル (以下，化合物 Aという。特開平 3- 163063に記載）
R
o 央 名 ： ethyl 2 - [5 - (4 - chloro- 5 - dif luoromethoxy- 1 - methyl - ΙΗ-pyrazol - 3 yl) - 2, 4 - dichloro-phenylamino] propionate
和名： 2- [5- (4 -クロ口- 5 -ジフルォロメトキシ- 1 -メチル -IH-ピラゾ一ル- 3 -ィル） - 2， 4-ジクロロ-フエ -ルァミノ] プロピオン酸ェチル (以下,化合物 Bと言う。特開平 3-163063に記載）
央名：4 - chloro- ύ - - ch丄 oro-2- f luoro - 5 - methoxyphenyl) - 5 - cnf luoromethoxy - i- methyト 1H - pyrazole
和名： 4-クロ口- 3- (4-クロ口- 2-フノレオロ- 5-メトキシフエニル） -5-ジフルォロメ卜キシ- 1-メチル -1H-ピ ラゾール (以下,化合物 Cとレ、う。特開平 4-225937に記載）
英名： 4 - chloro 3- [4- chloro- 2 - fluoro- 5 - (2 - propynyl) oxyphenyl ] - 5 - dif luoromethoxy - 1 - methyl - 1H - pyrazole
和名： 4-クロ口- 3- [4-クロ口- 2 -フルォロ- 5- (2 -プロピニノレ）ォキシフエ二ノレ]- 5- ジフルォロメトキシ - 1 -メチル - 1H-ピラゾ一ル (以下,化合物 Dという。特開平 3-163063に記載）
英名： ethyl 2- [2 - ch丄 oro - ΰ - (4 - chloro - 5 - dif luoromethoxy- 1- methyl - 1H - pyrazol- 3-yl) -4 - f luorophenoxyj propionate
和名： 2- [2 -クロ口- 5- (4-クロ口- 5-ジフルォロメトキシ- 1 -メチル -1H -ピラゾ一ル- 3 -ィル） -4-フルォ ロフエノキシ]プロピオン酸ェチル (以下,化合物 Eとレ、う。特開平 3-163063に記載）
名 ： l-methylethyl 5 - 1_4- bromo - 1 - methyl - 5- (trif luoromethyl) - 1H - pyrazol - 3- yl」-2 - chl oro - 4— f 1 uorobenzoate
和名： 5 - [4 -ブロモ -卜メチル- 5- (トリフルォロメチノレ） -1H -ピラゾール- 3 -ィル] -2 -クロ口- 4-フルォロ -安息香酸 1-メチルェチル (以下,化合物 Fとレ、う。特表平 10 - 502926に記載）
名：4 - chioro- 3 - (4 - chloro-2- fluorophenyl) - 5 - difluoromethoxy-l-methyl-lH-pyrazole 和名： 4-クロ口- 3- (4-クロ口- 2-フルオロフェニル） - 5-ジフルォロメトキシ -1 -メチル -1H-ピラゾール (以下，化合物 Gとレ、う。特開平 3-72460に記載） 2.光要求型除草剤耐性タバコカルスの選抜
植物は、一細胞であるプロトプラストから細胞塊であるカルスを経て、再度完全な植物体に分化 することができ、植物の持つこのような性質は分化全能性（totipotency)と呼ばれてレ、る。また、植 物の培養細胞の特徴として、それらの細胞が変異に非常に富んでいることが挙げられ、このような 変異は体細胞変異（somaclonal variation)と呼ばれている。従って、このような培養細胞を何らか
の薬剤、例えば除草剤で選抜すれば、除草剤耐性細胞を得ることができ、さらに、得られた除草剤 耐性細胞は、分化全能性を利用して植物体まで再生させることができる。このような例としては、ダリ ホセ—ト耐性植物（Singer, S. R. and Mcdaniel , C. N. (1985) Plant Physiol. 78 :411 - 416)、 スルフォニルウレァ耐性植物（Chaleff, R. S. and Ray, T. Β. (1984) Science 223： 1148-1151. ) など、多くの例が知られている。しかし、培養細胞は培養を続けてレ、るうちには何らかの原因で、分 化全能性を失ってレ、ることが多ぐ又、このような方法では除草剤耐性を異種の植物に導入するの は困難である。そこで、除草剤耐性細胞から除草剤耐性遺伝子を単離できれば、得られた遺伝子 を既知の方法、例えばァグロパクテリゥム法等で、様々な有用作物に導入することができる。そのよ うな除草剤耐性遺伝子には、除草剤自体を分解する遺伝子、例えばプロモキシニル分解遺伝子 (Stalker, D. . et al. (1988) Science 242 : 419- 423. )、ビアラフォス分解遺伝子（De Block, M. et al. (1987) EMBO J. 6 : 2513 - 2518)、除草剤によって生成される何らかの毒性物質を分解 する遺伝子、例えばスーパ一オキサイドデイスムターゼ遺伝子 (Furusawa, I. et al. (1987) Plant Cell Physiol. 25 : 1247 - 1252. )、除草剤耐性型標的酵素遺伝子、例えばスノレフォニルゥレア耐性 型ァセト酪酸合成酵素 (ALS)遺伝子 (Lee， K. Y. et al. (1988) EMBO, J. 7 : 1241- 1248. )、ダリ フォセート耐性型 5-エノ一ルピルビルシキミ酸- 3-リン酸合成酵素 (EPSPS)遺伝子 (Comai, L. et aュ. (1985) Nature 317 : 741- 744)等が知られている。
3.培養細胞における除草剤耐性機構
前述した、除草剤耐性培養細胞における耐性機構としては、解毒機構の獲得、細胞内への薬剤 の透過性の変化、標的酵素の過剰生産及び標的酵素の除草剤耐性型への変異等が考えられる。 耐性がいずれの機構による力 解明することは、除草剤が阻害する反応の前駆体の蓄積の有無、 同じあるレ、は異なった作用機構を示す様々な構造の除草剤に対する耐性の比較、耐性細胞及び 感受性細胞から標的酵素を抽出し酵素活性を比較すること及び選抜に用いた除草剤に対する標 的酵素の感受性を試験管内で検討すること等によって推定できる。その結果、有用な除草剤耐性 遺伝子を保有してレ、ることが明らかとなれば、除草剤耐性遺伝子の単離のための有用な遺伝子源 となる。
4.遺伝子のクローニング法
遺伝子のクローユング法には、タンパク質の情報を利用する方法、核酸の情報を利用する方法 及び遺伝学的方法がある。タンパク質の情報を利用する方法には、標的タンパク質を精製し、これ に対する抗体を用レ、て発現型ライブラリーをスクリーニングする方法、標的タンパク質のアミノ酸配
列を部分的にでも解明し、その情報力 核酸プローブあるいは PCR用プライマーを合成する方法 等がある。しかし、一般的に、タンパク質を精製することは、比較的困難である。一方、核酸の情報 を利用する方法は、生物間における遺伝子の相同性を利用して、他の生物の遺伝子をプロ一ブと して用い、ハイブリダィゼーシヨン等によって、 目的とする遺伝子を釣り上げるという方法である。生 物間における遺伝子の相同性は、用レ、た生物、用レ、た遺伝子によって異なり、ノ、イブリダィゼ一ショ ンの条件は、様々な条件で試みた後、経験的に求められるものであり、又、場合によっては、最適 条件が求められない場合もある。又、これらの方法では、得られた遺伝子の産物の生物活性を何ら 力の方法で確認する必要がある。
一方、遺伝学的方法とは、目的とする遺伝子が遺伝的に欠損した突然変異微生物株例えば大 腸菌、枯草菌、酵母等に、異種生物由来の同一タンパク質遺伝子をその生物中で発現するような 形で導入し、生育を相補させるという方法である。この方法は遺伝的相補法とも呼ばれ、遺伝子を 単離した時点で、遺伝子の産物の生物活性は、既に、確認済みである。しかし、高等生物由来の遺 伝子を、微生物で発現させた場合、翻訳後の修飾例えば糖鎖の付加等がなされずに酵素活性を 発揮できない、ベクタ一由来のタンパク質あるいはトランジットペプチドが N端に付加されてレ、るため 酵素活性を発揮できなレ、、等が原因で、生育が相補されなレ、可能性力 Sある。それにもかかわらず、 植物のテトラピロール合成系において Glu- tRNA から Glutamate- 1 - semialdehyde を合成する Glu-tR\'A Reductase Glutamate— 1一 semialdehyde 力ら 5— Aminolevul inic acid を合成 tる Glutamate -ト semialdehyde aminotransferaseがそれぞれ、大腸菌の hemA遺伝子欠損変 ¾¾、 hemし遺伝子欠損変異株を用いて遺伝的相補法によってクローニングされている（Ilag, し L et al.， (1994) Plant Cell 6: 265 - 275. )。従って、本発明においては植物のプロトポルフイリノーゲ ンォキシダ一ゼを遺伝的方法でクローニングする場合にも、大腸菌の遺伝子欠損変異株を利用す ることが有効であると考えられる。プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼを欠失した大腸菌の変異株 としては、 hemG 遺伝子欠損変異株の SASX38 ( Sasarman, A. et al. (1979) J. Gen. Microbiol. 113 : 297-303· )及び VSR751 (Nishimura, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270： 8076-8080. )が知られて!/、る。
5. cDNAライブラリ一の作製法
植物の全 RNAは、 RNA抽出法として知られてレ、る公知の方法、例えばグァニジン法、グァニジ ン.フエノール法、 SDSフエノール法等を用レ、、植物体力 抽出することができる。さらに、抽出され た全 RNA力 常法、例えばオリゴ dTセルロース法等によって mRNAを精製することができる c
cDNAの作製は、前記実験書の方法等、常法に従って行うことができる。精製された mRNAを 铸型とし、 Okayama-Berg法、 Gubler- Hoffman法等によって二本鎖 cDNAを合成することができる。 cDNAを、常法に従って、プラスミド、あるいは λファージ等に結合し、 cDNAライブラリ一を作 製することができる。用レ、るベクターとしては、 MCSの上流に lacZ、 tac等のプロモータ一を持つも の (例えば pUC系プラスミド、 A gtl l系ファ一ジ)を選択し、発現型 cDNAライブラリ一を作製するこ とが望ましレ、。さらに、プライマーとしてプライマーアダプタ一等を用レ、ることによって一方向性のラ イブラリーを作製することもできる。
6.プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ cDNAのクローニング及び解析
発現型 cDNAライブラリーを大腸菌の hemG (プロ卜ポノレフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子)欠損 突然変異株中に導入し、生育を相補する cDNAクローンを単離することによってプロトポルフィリノ —ゲンォキシダ一ゼ遺伝子をクローニングすることができる。クローユングした遺伝子はマキサム 'ギ ノレバート法や、サンガ一法によって全塩基配列を解明することができる。さらに市販の塩基配列解 析ソフトウェア、例えば Genetyx (SDC社）、 DNASIS (日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用レ、てタ ンパク質をコードする部分の検索、既知の遺伝子との塩基配列の相同性等の解析を行うことができ る。
7.光要求型除草剤耐性カルスからの光要求型除草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ 遺伝子のクローニング
プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼの光要求型除草剤耐性型への変換に起因する光要求型 除草剤耐性機構を有するタバコカルス力もプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子をクロー- ングする場合、必ずしも cDNAライブラリーの構築及び遺伝的相補法を行う必要はなぐ PCRによ つて比較的容易にクロ一ニングすることができる。本発明で明らかにされたタバコの葉緑体型プロト ボルフイリノーゲンォキシダ一ゼ遺伝子の塩基配列情報から、プロトポルフイリノーゲンォキシダー ゼをコードするオープンリーディングフレーム全体を増幅しうる PCRプライマーをデザインし、これら を用いて RT—PCR(mRNAを逆転写酵素によって cDNAに変換し、これを PCRにかける）を行え ば、比較的容易に生物活性を持ったプロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子のクロ一ニング及 ぴプラスミドベクターへのサブクローニングを行うことができる。光要求型除草剤耐性カルス力 得ら れた各遺伝子の光要求型除草剤に対する耐性の程度は、得られたプラスミドを大腸菌の hemG欠損 変異株に導入し、得られた大腸菌の生育に対する光要求型除草剤の阻害の程度を比較することに よって、比較的容易に検討することができる。
^
8.光要求型除草剤耐性植物の作出
本発明で示された光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子を用いれば、 光要求型除草剤耐性植物を作出することができる。すなわち、植物細胞中で機能するプロモータ ―、光要求型除草剤耐性プロトポノレフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子、植物細胞中で機能するタ —ミネーター力 なる発現カセットを適当なプラスミドベクターに組み込み、公知の遺伝子導入法、 例えば、ァグロバタテリゥム法、プロトプラストへのエレクトロボレ一シヨン法、植物組織へのパーティ クルガン法等を用レヽ、発現カセットを植物細胞中に導入し、形質転^ ¾S物を作出することができる。 得られた植物は光要求型除草剤耐性という農業上有用な形質を持つ。又、異なった遺伝子を持つ 発現カセットも同時に利用すれば、本遺伝子によって発現される光要求型除草剤耐性とレ、う性質を、 形質転 «物の選択マ一力一として利用することもできる。
適当なプラスミドベクターとしてはァグロバクテリウム法を用いる場合には、 pBI 系プラスミドあるい は pMO 系プラスミド等を挙げることができ、その他の方法を用レ、る場合には pUC 系プラスミド、 pBluescript 系プラスミド等を挙げることができる。又、植物で機能するプロモ一タ一としては、カリ フラワーモザイクウィルス（CaMV) 35Sプロモーター等、植物で機能するタ一ミネ一ターとしては C aMVターミネータ一等が挙げられる。これらに関しては、前述の実験書、例えば Plant Mol ecular Biology anua] , Gelvin, S. A. et al. Kluwer Academic Publ ishers, 1991, 1995 (Second edition)等に、詳細な説明が記載されている。 実施例
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるもの ではない。
実施例 1.光要求型除草剤耐性タバコカルスの選抜
A.タバコプロトプラストの調製、カルスの再生及び光要求型除草剤に対する感受性の検討
温室内で全高 40cm程に生育させたタバコ（Nicotiana tabacum var. Xanthi NC)の葉を切り取 り、メスで 5cm画の大きさに切った後、 70°/。エタノールに 30秒間、次亜塩素酸ナトリウム水溶液 (有効 塩素濃度 1%)に 分間浸漬し、表面殺菌した。滅菌水で 3回洗浄した後、上皮細胞を除去し、酵 素液（1% cellulase onozuka R- 10及ぴ 0. 05% macerozyme R- 10 (ャクノレト社） ¾r ^む 0. 6Mマンニ トール（pH 5. 8) )に 26°Cで 3時間浮遊させた。酵素処理後、 Murasige- Skoog (MS)培地で 3回遠心 洗浄し、得られたプロトプラストを lppmの NM及び BAを添加した 0. 6%寒天^む MS固体培地に
細胞数が lOVmlとなるように包埋し、シャーレに 1 の厚さにまいた。暗黒下、 27°Cで培養し、プロ トプラストからカルスを再生させた。培養 4週間後、 1 程になるまで生育したカルス^^む寒天培 地を 1cm幅の短冊状に切り、様々な濃度の化合物 H (化合物名：4-クロ口- 3- [2 4-シ"クロ ci- 5- (2 -フ。口 へ ルォキシ）フ ニル]一 5-シ"フルォロメトキシー 1—メチルー 1 H—ヒ。ラソ"ール, 英文名： 4 - chloro- 3- [2, 4- dichloro-5-(2-propenyloxy) phenyl] -5-difluoromethoxy-l-methyl-l H -pyrazole、特開平 3-163063に記載)を添加した MS固体培地上にのせ、タバコカルスの光要求型除草剤に対する感受 性を検討した。その結果、表 1に示すように、 ΙΟηΜで完全に枯死することが明らかとなった。 表 1 化合物 Hに対するタバコカルスの感受性 濃度 (nM) 生存率 (%)
0 100
2. 5 30
5 10
10 0
20 0
40 0
80 0
B.光要求型除草剤に対して高度な耐 を示すカルスの選抜
タバコカルスが完全に枯死する濃度の 2倍の濃度 (20nM)の化合物 む培地を用レ、、光要求 型除草剤耐性カルスの選抜を開始した。供試した lxlO10のプロトプラストからの再生過程で lxlO5 の耐性カルスが得られた (表 2)。得られた耐性カルスを順次化合物 Hの濃度を上げた培地に移植 し、最終的に 2 400n の濃度でも生育可能な 36株が得られ、特に生育が旺盛な 3株 (ETR- 056 ETR-245及び ETR-253株）を選抜した。
表 2 光要求型除草剤耐性株の選抜過程 濃度 (nM) 耐性株数
20 100， 000
30 50, 000
50 40, 000
0
150 254
300 120
600 66
1, 200 46
2, 400 36
5, 000 0
供試プロトプラスト数：1X10"
実施例 2.光要求型除草剤耐性カルスにおける耐性機構の解析
A.光要求型除草剤耐性株におけるプロトポルフィリン IXの蓄積
選抜した 3株の光要求型除草剤に対する耐性機構 祈することを試みた。光要求型除草剤処 理植物体中では、プロトポノレフィリン IXの蓄積が報告されてレ、るため、光要求型除草剤処理した耐 性カルスにおけるプロトポルフィリン IX の蓄積を経時的に、測定することを試みた。化合物 H 1， 200nM む MS液体培地で明条件下で継代培養してレ、る it性カルスを化合物 Hを含まなレヽ MS 液体培地で 24時間暗条件下で培養した後、化合物 H 1， 200nMを含む MS液体培地に移植し、暗 条件下で 6、 12、 18、 24、 32及ぴ 48時間培養後にカルスを採取し、プロトポルフィリン IX量を測定し た。カルス力1らのプロトポルフィリン IXの抽出及ぴ定量は、以下の様に行った (Matringe, \t. et al. (1989) Biochem, J. 260: 231- 235, )。カルス 500mg (生重）を乳鉢で破砕し、アセトン： IX NH40H (9: 1) 7. 5mlで抽出した。抽出液を 3, 000xg、 10分間遠心分離し、上清を採取した。得られた上清 にへキサンを 2. 5ml加え、充分に振とうした後、下層を回収した。さらに 2回へキサンで洗浄した後、 得られた下層中のプロトポルフィリン IXの量を、蛍光分光光度計で Ex 405nm-Em 631. 5nmの値か ら測定した。なお、抽出操作は全て安全光下で行った。
その結果、プロトポルフィリン IX量は、感受性株では 24時間後で 1. 3 g/g生重、 48時間後で
1. 9 μ g/g生重、 ETR-056株では 24時間後で 1. 7 μ g/g生重、 48時間後で 4. 6 μ g/g生重であり、 時間の経過と共にプロトポノレフィリン IXの蓄積が認められた。一方、 ETR - 245及び ETR - 253株では プロトポルフィリン IXの蓄積はほとんど認められな力 た。
B.光要求型除草剤耐性株の各種除草剤に対する耐性
さらに、様々な作用点を有する薬剤に対する各耐性株の耐性を検討した。光要求型除草剤でプ ロトポルフィリン IXを蓄積させるフオメサフェン（商品名フレックス)及びォキサジァゾン（商品名ロン スタ一）、クロロフィル合成阻害剤でブリーチングを引き起こすビラゾキシフェン（商品名ノィサ一）、 アミノ酸合成阻害剤である DPX- 84、ビアラフォス（商品名パスタ）、ダリホセート（商品名ラウンドアツ プ)、タンパク質合成阻害剤であるブタクロール (商品名マ一シェット）、光合成光化学系 Iの阻害剤 であるプロパニル (商品名スタム）、光合成光化学系 IIの阻害剤で活性酸素を生成させるパラコート (商品名プリグロッタス)に対する感受性を比較した。各薬剤 む MS液体培地に各耐性株を移植 し、最小阻害濃度 (MIC)を測定した。その結果 (表 3)、プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ阻害剤 でプロトポルフィリン IXを蓄積させるフオメサフェン、ォキサジァゾンに対し、いずれの耐性株も強い 抵抗性を示した。また、 ETR- 056株は、パラコートに対し、 ETR-253株はビラゾキシフェン、 DPX- 84及 びダリホセートに対しても抵抗性を示した。以上の結果から、 ETR-056株はスーパーオキサイドディ スムタ一ゼの過剰生産等による活性酸素に対する耐性、 ETR-253株は膜の透過性の低下による多 剤耐性、 ETR-245株は標的酵素の変異あるレヽは標的酵素の過剰生産による耐性と考えられた。 表 3 各種除草剤に対する光要求型除草剤耐性株の感受性
薬剤 感受性株 ETR-056株 ETR-245株 ETR-253株 フオメサフェン 0. 4 4 4 4
才キサジァゾン 1 1000 1000 1000
ブタクローノレ 100 100 100 100
ピラゾキシフェン 100 100 100 200
プロノ ニノレ 100 100 100 100
ビアラフォス 10 1 1 10
DPX-84 0. 01 0. 01 0. 01 0. 1
ダリホセート 230 230 230 1000
《ラコート 10 100 10 10
C .光要求型除草剤耐性株の他の ET系除草剤に対する感受性
感受性株及び ETR- 056 ETR-245及び ETR- 253株に対する化合物 Aの MICを測定した。その結 果、感受性株に対する MICは 5nMであったが、レ、ずれの耐性株に対する MICも 2 400nM以上であ り、いずれの耐性株も化合物 Aに対して強い耐性を示すことが明ら力となった。そこで、以下の実施 例では光要求型除草剤として化合物 Aを、耐性株として ETR-245株を用レ、た。
D.感受性及び ETR - 245株力ものプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ粗酵素液の抽出
Nicolaus, B. et al. (1993) in "Target Assays for Modern Herbicide and Related Phytotoxic Compound" Lewis Publishers, pp. 35-41.に従って、 MS固体培地で 1力月間培養し たカルスに 5倍量の抽出バッファー (50mM Tris-HCl ( H 7. 5) 0. 5M sucrose, 0. 2% BSA ImM EDTA) を加え、ジューサーで破砕した。ガーゼで濾過した後、 10 000xg 5 分間、 4°Cで遠心分離した。得 られた沈殿を再度 25mlの抽出バッファーに懸濁し、 150xg 2分間、 4°Cで遠心分離した。得られた 上清を 4 000xg, 15分間、 4°C遠心分離し、沈殿を 2nilの 20%グリセリンに溶解した。得られた粗酵 素液のタン ク質量をタンパク質測定キット (Bio— Rad社)で測定した。
E.プロトポノレフィリノ一ゲン IXの調製
13gの水銀及び 0. 5gの薄層金属ナトリウムを 500ml容の丸底フラスコに入れ、窒素ガスで 5分間 平衡化した後、約 5分間振とうすることによって、ナトリウムアマノレガムのパウダ一を作製した。
8. 4ragのプロトポノレフィリン IXを 15mlの 20% エタノール ¾r ^む lOmM K0Hに溶解し、 4°Cで保存 した。プロトポルフィリン IXの保存液 4mlに等量の反応液（0. 1M MES, 50mMァスコルビン酸）を加え、 調製直後の 16mg のナトリウムアマルガムを添加し、窒素ガス下、喑所で激しく振とうした。この反応 液を暗所で 3重のグラスフィルタ一で濾過し、 0. 1M MES (pH4. 5)で 2. 5倍に希釈し、 200 プロト ボルフイリノーゲン IXとして 1mlずつ遮光した試験管に分注し、 - 80°Cで保存した。
F.プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ活性の測定
反応バッファー（lOOmM Tris-HCl (pH 7. 6) ImM EDTA 5mM DTT 0. 03% Tween80) 3mlを蛍光分 光光度計のセルに分注後、粗酵素液を終濃度が 0. lmgタンパク質/ mlになるように添加し、室温ま でゆっくり加熱した。加熱後、プロトポルフイリノーゲン IXを終濃度が 2 μ Mとなるように添加し、窒素
ガスで気相を置換して反応を開始した。反応 10分後からの 30分間の蛍光を蛍光分光光度計でモ 二ターし、酵素活性を測定した (Ex : 405nm、 Em :631. 5nm)。
G. ETR-245株力 抽出したプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼに対する化合物 Aの阻害活性 感受性タバコカルス及び ETR - 245株力 抽出した粗酵素液におけるプロトポノレフイリノーゲンォキ シダ一ゼ活性及び及び化合物 Aによる阻害の程度を比較した (表 4)。その結果、感受性株由来の 粗酵素液の活性は 2. 39unit、 ETR-245株由来の粗酵素の活性は 2. 85unitであり、両者の活性に 大きな違レ、は認められな力 た。一方、感受性株由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ活性 に対する化合物 Aの 50%阻害濃度（IC5。)は 48nMであるのに対し、 ETR-245株由来の酵素活性に対 する化合物 Aの IC∞は 5, OOOnM以上であり、酵素レベルでは 100倍以上の耐性を示した。なお、 5, OOOa 以上では反応液が白濁し、蛍光の測定が不可能であった。以上の結果から、 ETR- 245 株 における光要求型除草剤耐性の作用機作は、光要求型除草剤の標的酵素であるプロトポルフィリノ —ゲンォキシダーゼの過剰生産に起因するのではなぐ酵素の構造に何らかの変異が生じたことに 起因すると考えられた。 表 4 感受性株及び ETR- 245株のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ活性に及ぼす化合物 Aの
酵素活性 (unit)
化合物 A濃度 (nM) 感受性株 ETR- 245株
0 2. 39 2. 85
10 4. 32 3. 59
20 3. 62
40 1. 84 4. 41
100 0. 00 2. 21
500 0. 00 3. 49
1, 000 0. 00 2. 85
2, 400 0. 00 2. 48
5， 000 0. 00 1. 56
IC 値 (nM) 48 〉5000 lunit=lnMプロトポルフィリノ一ゲン IXZmin/mg タンパク質
実施例 3.タバコプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ cDNAのクロ一ニング
A. mRNAの調製
タバコ（Ni cot i ana tabacum var. SRI)の緑葉を 9g切り取り、液体窒素中で磨砕した。磨砕した 緑葉に 40ml の RNA抽出用緩衝液（200mM Tris- HC1 (PH9. 0) , lOOmM NaCl, lOmM EDTA, 0. 5% SDS, 0. 1% 2- E)及び 40mlのトリス飽和フエノールを加え、 10分間激しく振とう後、 2, 000xg, 10分間 遠心分離して上清を回収した。この上清に卜リス飽和フエノールを等 *¾Πえ、 10分間の振とう及ぴ 10 分間の遠心分離を繰り返した。得られた上清に、等量のフエノール：クロ口ホルム:イソアミルアルコ ール (25 : 24: 1)を加え、 10分間の振とう、 5分間の遠心分離を 2回行った。得られた上清に等量の クロ口ホルム:イソアミルアルコール (24 : 1)を加え 10分間の振とう、 3分間の遠心分離を 2回行った。 得られた上清に 10分の 1量の 3Μ酢酸ナトリウム (ΡΗ5. 2)及び 2. 5倍量のエタノールを加え、 - 80。C に 30分間静置した。静置後、 2， 000xg-20分間 '4°Cで遠心分離し、得られた沈殿を 70%エタノール で洗浄した。乾燥した沈殿に蒸留水を加え lmg/mlに希釈し、終濃度が 2Mとなるように 10M塩化リ チウムを加え、氷上で 2日き間静置した。静置後、 2， 000xg- 30分間 '4°Cの遠心分離によって沈殿を 回収し、全 RNA画分を得た。
全 RNA画分力 の mRNAの精製はオリゴ dTスパンカラム（フアルマシア社製）を用 、、付属の 説明書に従って行った。
B. cDNAライブラリ一の作製
cDNAライブラリ一の作製は Superscript Lamda System (GIBC0 BRL社）を用いた。このキットは 第 1鎖合成時にプライマーアダプターを用レ、、得られた cDNAをえ gt22Aの lacZプロモータ一に 対して正方向にそう入することが可能である。
上記の方法で得た 4 μ gの mRNAを铸型とし、キット添付の説明書に従って cDNA第 1鎖合成、 cDNA第 2鎖合成、アダプターの結合、制限酵素処理及びカラムクロマトグラフィーを行った：得ら れた cDNAをえ gt22Aアームと結合させた後、 Gigapack Gold (ストラタジーン社)を用レ、、添付の説 明書に従ってファージ粒子を再構成させた。約 190万の独立クローンを含むプライマリーライブラリ
—を大腸菌 Y1090 (r- )株 染、増殖させ、増幅ライブラリ一として保存した。
C.遺伝的相補法
大腸菌の hemG (プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ)遺伝子欠損変異株である SASX38株を用 レ、、 Nishimura らの方法（Nishimura, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:8076-8080. )に 従って、遺伝的相補法を行った。 10mM gS04及び 0. 2%マルトースを含む LB液体培地中で前培養 した SASX38株に上記の増幅 cDNAライブラリ一を感染させ、遺伝子発現を誘導した後、 LB固体培 地上にまいた。 37°Cで 2日間培養後、多数の小さなコロユー中にいくつ力 生育の回復した大きな コロニーが認められた。大きなコロニーを LB液体培地中でー晚培養後、 4%になるようにクロ口ホルム を加え、よく攪拌し、 30分間以上室温に放置後、遠心分離し、上清としてファージ粒子を得た。得ら れたファージ粒子を、再び大腸菌 Y1090(r -)株〖¾g染させ、単一プラークを 4%クロ口ホルム む SM培地に懸濁した。回収した組換えファージ粒子は、 SASX38株に再感染させ、生育回復能を示 すものだけを再選抜した。以上のような方法によって、これら組換えファ一ジベクターによる、大腸 菌におけるプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ活性の発現が確認された。
D. cDNAインサートの分析
cDNAインサートの増幅は PCRによって行った。すなわち、回収した組換えファージ粒子に含ま れる DNAを铸型とし、 Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq、宝酒造社）、え gt22A用フォワードプ ライマ一（5' -ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AG - 3 '、配列番号 4)及びリバースプライマ一（5 ' -CCA GAC C CTG GTA ATG GTA GCG-3'、配列番号 5)を用いて、 94°Cで 1. 5分間、 69°Cで 1. 5分間、 72°Cで 2分間の反応からなる 1サイクルを、 30サイクル行った。反応産物の一部をァガロースゲル 電気泳動によって分析したところ、レ、ずれのサンプルにも 2. Okbp前後の cDNAが増幅されてレ、るこ とが明ら力 なった。増幅された cDNAをクロ口ホルム処理およびエタノール沈殿によって回収した 後、制限酵素切瞎析によって比較したところ、いずれの cDNAにも EcoRV部位力;認められた。
E. cDNAインサートのサブクロ一ユング及び生物活性の確認
PCRによって增幅された cDNAインサート中で最大のものを、 pBluescript SK (-) (ストラタジ一 ン社）の EcoRV部位に、前述の実験書 (例えば、 Current Protocols in Molecular Biology, Jhon Wiley & Sons, Ausubel, M. et al. )に記載の TAクロ一ニング法によって、 lacZプロモーターに 対し正方向にそう入した。すなわち、 pBluescript SK (-）を EcoRV 切断後回収し、 Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq,宝酒造社)を加え、 cHTPの存在下で、 75。Cで 2時間反応させ、プラス ミドの 3'端に Tを付加した。 Tを付加後回収したプラスミドと、 PCR後回収した最大の cDNAインサ
ートとを、 DNA Ligation Kit (宝酒造社)を用いて、添付の説明書に従って、結合させた。得られた 結合反応液を用いて、 CaCl2法によって作製した大腸菌 XL- 1 Blue ¾ (Stratagene社)のコンペテ ントセルを形質転換し、 IPTG.Xgal 及ぴアンピシリンを含む LB固体培地にまき、 37°Cで一晩培養し た。培養後、インサートの挿入された白色のコロニーをレ、くつか選択し、アンピシリン む LB液体 培地中でー晚振とう培養した後、アルカリライシス法によってプラスミド DNAを調製した。得られた プラスミド DNAを制限酵素切断し、 cDNAが正方向に挿入されたプラスミドを持つ宿主大腸菌を選 抜した。得られたプラスミドを pBNtPX- 1 (図 1)と名付け、選抜した宿主大腸菌は 15%になるようにダリ セリンを加え、 - 80°Cで保存した。
pBNtPX-1 を持つ大腸菌をアンピシリンを含む LB液体培地中でー晚培養後、塩化セシウム法に よって、プラスミドを大量に精製した。得られたプラスミドを用いて、 CaCl2法によって作製した大腸菌 SASX38株のコンペテントセルを形質転換した。形質転換した SASX38株を LB培地にまき、 28°Cで一 晚培養した。その結果、 pBNtPX-1 を用いた場合には、小さなコロニー中に多数の生育の回復した 大きなコロニーが認められた。以上のように、 pBNtPX-1 による、大腸菌におけるプロトポノレフィリノ一 ゲンォキシダーゼ活性の発現が確認された。
F. DNA塩基配列の解明
上述の大腸菌 SASX38株の生育を回復させた pBNtPX- 1から、 Ki lo-Sequence用 Delet ion kit (宝酒造社)を用いて添付の説明書に従ってディリシヨンクローンを作製し、 Cycle Sequencing kit Ampl iTaq FS (パーキンエルマ一社)及びォ一トシ一クェンサー（ABI PRISM 310、パ一キンエルマ一 社)を用いて添付の説明書に従って塩基配列を解明した。得られた全塩基配列及びオープンリー デイングフレームにおけるアミノ酸配列を、配列表の配列番号 1に示した c遺伝子解析ソフト Genetyx (SDC社)を用いて、塩基配列及ぴアミノ酸配列を、既知の (WO 95/34659)シロイヌナズナ のプロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼのそれらと比較し、相同性を検討した cその結果、 pB tPX- 1はシロイヌナズナの葉緑 プロトポノレフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子と核酸レベルで 69%、ァ ミノ酸レベルで 76% (表 5)の高 、相同性を示し、タバコの葉緑体型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ ーゼ遺伝子であると考えられた。
また、本ポリペプチドは多くの生物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼの Ν端に保存されて いるジヌクレオチドバインディングドメイン (GXGXXG) (Nishimura， K. et al . (1995) J. Biol . Chem. 270 : 8076 - 8080. )を有してレ、ることからもプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼであることが確認さ れた。また、枯草菌及び動物のプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼでは、このドメインの上流に 8
〜11 アミノ酸しか認められないのに対して、タバコの葉緑体型プロトポルフイリノーゲンォキシダー ゼでは 77アミノ酸が認められ、タバコにおいては、この部分が葉緑体用のトランジットペプチドであ ると考えられた。 表 5 タバコ（上段)及びシロイヌナズナ（下段）の葉緑体型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼの アミノ酸配列の比較 相同性： 75. 9%
1' TnPIANHPNIFTHQSSSSPLAFLNRTSFIPFSSISKR -SV -CNGWRTRCSVAKDYT
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1 " MELSLLRPTTQSLLPSFSKPNLRLNVYKPLRLRCSVAGGPT
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42" VGSSKIEGGGGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGG IIT
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173' LPFFDLMSIPGKLRAGFGAIGLRPSPPGHEESVEQFVRRNLGGEVFERLIEPFCSGVYAG
162" LPFFDL SIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV RNLGDEVFERLIEPFCSGVYAG
233' DPSKLSM AAFGKVWKLEETGGSIIGGTFKAIKE SSTPKAPRDPRLPKPKGQTVGSFRK
222" DPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGGTFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRK
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533' EVASEVTGFLSRYAYK 548 522" ETAIEV NFMSRYAYK 537 実施例 5.光要求型除草剤耐性タバコカルスのプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ遺伝子
A. PCRによるクローニング
光要求型除草剤耐性カルス ETR-245株及び感受性カルスカゝらそれぞれ SDSZフエノール法に よって全 RNAを抽出後、 mRNA purification kit (フアルマシア社）によって mRNAを精製した。精 製した mRNA の 1 を顯とし、 01 igo (dT) 12 - 18 (ライフテックオリエンタル社)をプライマ一とし、 SuperscriptTM RNaseH- Reverse Transcriptase (ライフテックオリエンタル社）によって添付の 説明書に従って、 37°C 1時間の逆転写反応を行った後、フエノール/クロ口ホルム抽出及びエタノ ール沈殿によって cDNAを精製した。
得られた cDNA 型とし、 PCRによってプロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子を增幅する
ことを試みた。 PCR用のプライマ一としては、フォワードプライマ一（5 ' -GCG GTC TAC AAG TCA GGC ACT CAT- 3'、配列番号 6)及びリバースプライマ一（5 ' -CAT GCC AAT TTT CCC AAG GCA TGA TCG TAT T- 3'、配列番号 7)を用レ、、 Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq、宝酒造社）によって、 thin wal l tube中で 94°C 3分間を 1サイクル、 94°C 20秒間及ぴ 61°C 30秒間、 72°C 1分 30秒間を 30 サイクル、 72°C5分間を 1サイクル行った。得られた PCR反応産物の一部をァガロースゲル電気泳 動によって分析したところ、いずれにも 1. 7kbp前後の DNA断片が認められ、これらがプロトポルフ イリノーゲンォキシダーゼ遺伝子断片であると考えられた。そこで、これら DNAを Original TA Cloning KIT(Invitrogene社）によって、添付の説明書に従って、 Tオーバーハングを持ったプラ スミドベクタ一 pCRTM2. 1とライゲーシヨンした。ライゲーシヨン産物を用いて、 CaCl2法によって作製し た大腸菌 XL-1 Blue株（Stratagene社）のコンペテントセルを形質転換し、 IPTG Xgal及びアンピ シリンを含む LB固体培地にまき、 37 Cでー晚培養した。培養後、インサートの挿入された白色のコ 口- をレ、くつ力選択し、アンピシリン ¾ ^む LB液体培地中でー晚振とう培養した後、アルカリライ シス法によってプラスミド DNAを調製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素切断し、各 cDNA が正方向に挿入されたプラスミドを持つ宿主大腸菌を選抜した。感受性株あるいは ETR - 245株由来 の葉緑体型プロトポ フィリノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子が挿入されたプラスミドを各々 pCR-HCある いは pCR- RC (図 2)と名付け、プラスミドを持つ宿主大腸菌は、 15%になるようにグリセリンを加え、 - 80 Cで保存した。
これら 2種のプラスミドを持つ大腸菌をアンピシリンを含む LB液体培地中で一晩培養後、塩化セ シゥム法によって、プラスミドを大量に精製した。得られたプラスミドを用いて、 CaCl 法によって作製 した大腸菌 SASX38株のコンペテントセルを形質転換した。形質転換した SASX38株を LB培地にまき, 28°Cでー晚培養した。その結果、いずれのプラスミドを用いた場合にも、小さなコロニ一中に多数の 生育の回復した大きな 力'認められた。以上のように、 pCR-HC及び pCR - RCによる、大腸菌に おけるプロトポノレフイリノーゲンォキシダーゼ活性の発現が された。
B.各遺伝子産物の化合物 A耐性度の比較
上述の 2種のプラスミドを含む大腸菌 SASX38株を、 50 μ g/mlのアンピシリンを含む LB液体培地 で 28°Cで終夜振とう培養した。 OD600を測定した後、 50 μ g/ml のアンピシリン及び 0 1 10 100 1, 000 2 000 5 000あるレ、は 10, OOOnMの化合物 む LB液体培地に、同一の 0D6∞値となるよ うに加え、 28°Cで振とう培養した。経時的に一部を採取し、マイクロプレ一トリ一ダー (MTP - 120、コロ ナ電気 (株)）で 0D530を測定し、対照区 (化合物 A OnM)の大腸菌の生育を 50%になるように阻害する
濃度 (IC50)を算出した。その結果、 pCR-HCあるレ、は pCR-RC む大腸菌では、それぞれ IC50は約 2. 5nMあるレ、は 10, OOOnM以上となり、 R/S比（耐性型の IC5QZ野生型の IC5。）は、 4， 000以上となつ た。なお、 10， OOOnM以上では培地が白濁し、 OD530の測定が不可能であった。以上の結果から、 ETR-245株における化合物 A耐性機構は、葉緑体型のプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝 子に何らかの変異が生じることによって該酵素が光要求型除草剤耐性型に変異したことであると考 えられた。
C.感受性株及び CTR- 245株由来の葉緑体型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子の塩基 配列の比較
pCR-HCあるレ、は pCR-RCに含まれる感受性株あるレ、は ETR-245株由来の葉緑体型プロトポノレフィ リノ一ゲンォキシダ一ゼ遺伝子の全塩基配列をそれぞれ、比較することを試みた。タバコ葉由来の 遺伝子の塩基配列情報から、プライマ一ウォーキング用のプライマーを合成し、両遺伝子の全塩基 配列を解明した。その結果、 pCR-HCの塩基配列はタバコ葉由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダ ーゼ遺伝子と全く同一の配列であった力;、 pCR- RCでは 1力所にのみ変異が認められた。すなわち、 配列番号 1の 717番目の塩基力 ¾力も Tへと変異し、その結果、配列番号 1の 231番目のアミノ酸が、 ァラニンからバリンへと変異してレ、た。 PCR- RCにコードされる光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ —ゲンォキシダーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号 2に、遺伝子の塩基配列を配列表の配列 番号 3に示した。タバコとシロイヌナズナのプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼのアミノ酸配列の 相同性は高く（表 5)、この変異は WO 95/34659に記載されたシロイヌナズナのプロトポルフイリノー ゲンォキシダーゼにおける 220番目のアミノ酸であるァラニンのバリンへの変異に伴う光要求型除 草剤耐性型への変異 (pAraC - lVal)とほぼ同等のものであった。 実施 6.シロイヌナズナの光要求型除草剤耐性型遺伝子
A.シロイヌナズナの葉緑体型プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ遺伝子のクローニング及び光 要求型除草剤耐性型への変換
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana var. Columbia)の葉緑体型プロトポノレフィリノ一ゲンォ キシダ一ゼ遺伝子のクロ一ユングはタバコの場合と同様に、 cDNAライブラリ一の作製、大腸菌の hemG欠損変異株 SASX38を用いた遺伝的相補法によって行った。得られた遺伝子は pBluescript SK (-）の EcoRV部位に TAクローニング法によってサブクローニングした。プロトポルフイリノーゲンォ キシダ一ゼ遺伝子が正方向に挿入され、生物活性を示すプラスミドを pBAtPX - C (図 3)と名付けた。
このプラスミドの全塩基配列も既知の塩基配列 (WO 95/34659)力 デザインしたプライマ一を用レ、、 プライマーウォーキングによって既知の配列と同一であることを確認した。
このプラスミドを用レ、、 WO 95/34659に記載された、上述の 220番目のアミノ酸であるァラニンの ノ《リンへの変異による光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子（pAraC - lVal)を作出することを試みた。 pBAtPX-C む大腸菌 XL- 1 Blue力 ヘルパーファ一ジ VCS - M13 (Stratagene社)を用いて 1本鎖 DNAを調製した後、 kunkel法を利用した部位特異的突然変異用 キット (Mutan- K、宝酒造社)を用レ、、変異導入用オリゴヌクレオチド 5' - GGT GTT TAT GTT GGT GAT CC-3' (配列番号 8)によって、光要求型除草剤耐性型に変換した。部位特異的突然変異操作中に おける非特異的な変異の可能性を排除するために、得られたプラスミド中の cDNAを再度 pBluescript SK (-）にサブクローニングし、さらに、 cDNAの全塩基配列を解明し、目的とする塩基 配列であることを確認した。得られた光要求型除草剤耐性型プラスミドを pBAtPX - RC (図 3)と名付け た。
B.シロイヌナズナの野性型及ぴ光要求型除草剤耐性プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼの化 合物 A耐性度の比較
pBAtPX-C 中のシロイヌナズナの野性型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子の産物と、 pBAtPX- C 中の光要求型除草剤耐性型遺伝子の産物との、化合物 A耐性度を比較することを試み た。実施例 5Bの各遺伝子産物の化合物 A耐性度の比較に記載された方法を用レ、、それぞれプロト ポノレフィリノ一ゲンォキシダーゼの化合物 Aに対する IC5()を測定した。その結果、野性型では IC50 は約 5nMであったが、光要求型除草剤耐性型では 1， 500nMとなり、 R/S比 (耐性型の IC50 /野生型 の IC5。）は約 300であった。タバコの場合の R/S比は 4, 000以上であったため、シロイヌナズナと比 較してタバコの方が R/S比が 10倍以上高レ、ことがわかった。この違レ、は、この両者のブロトボルフィ リノ一ゲンォキシダーゼのアミノ酸配列の高レ、相同性を考えた場合、予期せぬ結果であった =
実施例 7.様々な化合物に対する耐性
実施例 5B及び実施例 6Bと同様に、タバコの野生型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝 子 む pCR-HCを保持する大腸菌 SASX38株、タバコの耐性型プロトポルフイリノーゲンォキシダー ゼ遺伝子を含む PCR - RCを保持する大腸菌 SASX38株、シロイヌナズナの野生型プロトボルフィリノ 一ゲンォキシダーゼ遺伝子を含む pBAtPX- Cを保持する大腸菌 SASX38株及びシロイヌナズナの耐
性型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子 む pBAtPX- RCを保持する大腸菌 SASX38株を 用いて、様々なピラゾール系化合物 (化合物 B、 C、 D、 E、 F及び G)の各大腸菌の生育に対する IC50 を測定し、シロイヌナズナの遺伝子における R/S比 (耐性型の IC5。/野生型の IC50)とタバコの遺伝 子における R/S比を比較した。その結果 (表 6)、いずれのピラゾール系化合物に対してもタバコの 遺伝子の R/S比は、シロイヌナズナの遺伝子の RZS比と比べて、 10倍以上高レ、ことが明らかとなつ た。この違レ、は、この両者のプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼのアミノ酸配列の高い相同性を 考えた場合、予期せぬ結果であった。
表 6 化合物 A類縁体に対する耐性度 (大腸菌液体振とう培養法）
150 (nM)
薬剤 シロイヌナズナ タバコ 優¼性 ' 野生型 耐性型 b
R/S比 a 野生型 耐性型 R/S比
化合物 B 21 18, 000 860 2. 2 >20, 000 >9, 100 >10. 6 化合 3. 0 1 , 800 600 0. 25 2, 200 8， 800 14. 7 化合物 D 0. 14 280 2, 000 0. 027 670 25, 000 12. 5 化合物 £ 4. 2 4, 000 950 0. 52 6, 300 12, 000 12. 6 化合^ 23 6, 400 280 3. 2 15, 000 4, 700 16. 8 化合物。 19 8, 700 460 3. 1 17, 000 5, 500 12. 0
'耐性型 Z野生型
b/a 実施例 8.形質転換植物体における化合物 A耐性度
A.植物形質転換用べクタ一の構築
GUS遺伝子導入用バイナリーベクター pBI121 (Clontech社）における T-DNAに、タバコ及びシロイ ヌナズナの野生型及び耐性型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子を挿入することを試み た。まず、 PBI 121 を Sacl で切断後、 T4DNAポリメラーゼ (宝酒造社)で平滑末端化した。得られた DNA断片を BamHIで切断した後、ァガロースゲル電気泳動によって GL1S遺伝子断片とプラスミド断片 に分離し、プラスミド断片を回収した。一方、タバコの野生型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ一ゼ 遺伝子を保持する pCR-H タバコの耐性型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を保持す る pCR- RC、シロイヌナズナの野生型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子を保持する
pBAtPX-C及びシロイヌナズナの耐性型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を保持する pBAtPX-RCをそれぞれ Xholで切断後、 DNAポリメラーゼ Iの Klenow断片（宝酒造社)で平滑末端 化した。得られた DNA断片を BamHIで切断した後、ァガロースゲル電気泳動によってプロトポノレフィ リノ一ゲンォキシダーゼ遺伝子断片とプラスミド断片に分離し、プロトポルフイリノーゲンォキシダー ゼ遺伝子断片を回収した。得られた pBI121由来のプラスミド断片及び各プロトポノレフィリノ一ゲンォ キシダ一ゼ遺伝子断片を DNA Ligation Kit (宝酒造社)でライゲ一シヨンし、 CaCl2法で作製した大 腸菌 HB101株のコンペテントセノレを形質転換し、カナマイシンを含む LB固体培地にまき、 37°Cで一 晚培養した。培養後、カナマイシン耐性を示すコロニーをいくつか選択し、カナマイシン む LB 液体培地中でー晚振とう培養した後、アルカリライシス法によってプラスミド DNAを調製した。得られ たプラスミド DNAを制限酵素切断し、各プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が挿入されたプ ラスミドを持つ大腸菌を選抜した。タバコの野生型あるレ、は耐性型プロトポルフィリノ一ゲンォキシダ —ゼ遺伝子が挿入されたバイナリ一ベクタ一をそれぞれ pBI - NtPX - HCあるレ、は pBI - NtPX - RC (図 4)、 シロイヌナズナの野生型あるいは耐性型プロトポノレフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子が挿入された バイナリ一ベクタ一をそれぞれ pBI - AtPX- HCあるいは pBI - AtPX- RC (図 5)と名付け、プラスミドを持 つ大腸菌は 15°/。になるようにグリセリンを加え、 - 80°Cで保存した。
B. Agrobacterium t匿 faciensへの植物开$質転換用べクタ一の導入
上述の 4 種のノくイナリーベクターを Triparental mating 法によって Agrobacterium tumefaciens LBA4404株 (Clontech社）に導入した。すなわち、バイナリーベクターを保持する大腸 菌 HB101 株、ヘルパーファージ PRK2013 を保持する大腸菌 HB101 株（Clontech 社）及び A. tumefaciens LBA4404株を NB寒天培地（0. 8% Nutrient broth, 1. 5%細菌培地用寒天（和光純 薬社)）で 28で、 2日間培養した後、 3者をよく混和し、 28°Cでさらに 2 日間培養した。混和した菌体 をカナマイシンとストレプトマイシン^"む AB寒天培地 (0. 3% K2HP04、 0. 1% NaH2P04、 0. 1% C1、 0. 03% MgS04'7H20、 0. 015% KC1、 0. 015% CaCl2、 0. 00025% FeS04'7H20、 0. 5%グルコース、 1 , 5%細 菌培地用寒天）にストリークした。 28°Cで、 4 日間培養後、シングルコロニーをかきとり、カナマイシン とストレプトマイシン ^む AB液体培地で 28°C、 2 日間培養し、アルカリライシス法によってプラスミ ドの確認を行った。バイナリーベクターを保持する A. tumefaciens LBA4404株は、 15%になるように グリセリンを加え、 -80。Cで保存した。
C. A. tumefaciensによる形質転換植物の作出
- 80°Cで保存してレ、るバイナリ一ベクターを保持する A. tumefaciensを、カナマイシン^^む 523
液体培地（1%シュクロース、 0. 8% Bacto-tryptone, 0. 4% Bacto - yeast extract, 0. 2% K2HP04、 0. 03% MgS04'7H20)で 27°C、 24時間振とう培養した。表面殺菌したタバコ (λ'. tabacum var. SRI) のリーフディスク (直径 9删)を A. tumefaciensの振とう培養液に 1分間浸漬後、滅菌ペーパータ オルで付着した培養液を拭き取った。リーフディスクを 2ppmの NM及び 0. 2ppmの BAを添加した 0. 6%寒天 む MS固体培地に葉の裏を上にして静置し、 25°Cで 48時間培養した。リーフディスク を 500ppmのカルべニシリンと 200ppmのクラフォラン ¾r ^む、 2ppmの NM及び 0. 2ppmの BAを添カロ した MS液体培地に移し、 27°Cで 48〜72時間振とう培養し、 A. tumefaciensを除去した。リ一フディ スクを lOOppmのカルべニシリン、 200ppmのクラフォラン及び 150ppmのカナマイシン む、 0. lppm の NM及び 4ppmの BAを添加した 0. 6%寒天を含む MS固体培地に移し、 27°Cで 2〜3週間培養し、 シュートの形成を誘導した。シュートは発根培地（1/2 MS、 0. 02ppm IBA、 1. 5%シュクロ一ス、 0. 2%ジ エランガム）に移植し、発根を誘導した。得られた幼植物は培養土に移植し、温室内で生育させた。
D.形質転換植物における導入遺伝子の確認
PCR法によって形質転■物中の導入遺伝子を確認することを試みた。すなわち、形質転^ ί 物の葉から CTAB法によってゲノム DNAを抽出、精製した。得られたゲノム DNAを铸型として、 Taq DNA polymerase (TAKARA EX Taq、宝酒造社）、 Ca V 35S プロモーター用フォワードプライマ一（5'-CAC AGA TGG TTA GAG AGG CTT ACG CAG- 3'、配列番号 9)、 N0Sターミネータ一用リバースプライマー (5' - TCA TCG CM GAC CGG CM CAG GAT TCA- 3，、配列番号 10)を用い、 thin wall tube中で 94°C、 3分間を 1サイクル、 94°C、 20秒間、 62°C、 30秒間及び 72°C、 3分間を 30サイクル行った。得られ た反応産物の一部をァガロース電気泳動によって分析したところ、 80%以上の植物体に 2. 7kb前後 の DNA断片が認められた。
E.化合物 Αϊ 生度の検定
導入遺伝子の確認を終了した形質転,物体及び対照の非形質転^ t物体から、ほぼ同じ葉 位の葉を採取し、直径 9mm のリーフディスクを調製し、 0、 125、 250、 500、 1, 250、 2, 500、 5， 000、 12， 500nMの化合物 A水溶液を含むシャーレに浮かべた。 27°C、連続強光下で一週間培養後、リー フディスクの白化度を観察し、化合物 A許容濃度を算出した。その結果 (表 7)、 pBI-NtPX-RCによつ てタバコの耐性型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝子を導入した場合は、対照の非形質 転 物と比較して、 100倍以上の耐性度を示した力';、 pBI-AtPX-RC によってシロイヌナズナの耐 性型遺伝子を導入した場合には、対照と比較して 4倍の耐性を示し、感受性型遺伝子を導入した 場合には、いずれもそれほど強い耐性は認められな力 た。したがって、植物体で光要求型除草
剤耐性を発現させるためには、本発明のタバコの耐性型プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ遺伝 子が有用であることが明らかとなった。 表 7 形質転換タバコ植物体レべノレにおける化合物 Aに対する耐性度 (リ一フディスク法）
導入遺伝子 (ベクター） 化合物 A許容濃度 耐性度 なし 125n X I
シロイヌナス'ナ野生型 (pBト AtPX- HC) 250nM X 2
シロイヌナス'ナ耐性型 (pBト AtPX-RC) 500n X 4
タバコ野生型 (pBI— NtPX-HC) 500n X 4 タバコ t性型 (pBト NtPX- RC) >12,500n,VI > X 100
本発明者は、前記課題を解決すベぐ高等植物のプロトポルフイリノーゲンォキシダーゼについ て鋭意研究を行った結果、タバコ由来の、光要求型除草剤に耐性を示すプロトポルフィリノ一ゲン ォキシダ一ゼの遺伝子のクロ一ニング及ぴ発現に成功した。本遺伝子産物の光要求型除草剤に 対する耐性度を、既に報告されてレ、るシロイヌナズナ由来のプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ の耐性度と比較したところ、両者の構造の高い類似性にも力かわらず、本遺伝子産物の耐性度が 大レ、に勝ってレ、ることが明ら力となった。 産業上の利用可能性
植物由来の新規且つ光要求型除草剤に高度に耐性なプロトポルフィリノ一ゲンォキシダーゼを 得た結果、該酵素を宿主植物中で発現させることによって、光要求型除草剤に高度に耐性な植物 を作出することが可能である。
Claims
1. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は該アミノ酸配列にお I、て 1個ま たは複数個のアミノ酸の欠失、付加あるいは置換等が認められるアミノ酸配列を有し且つ実質的に プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼと同等の酵素活性を有する変異ペプチドからなる光要求型除 草剤耐性プロトポノレフイリノーゲンォキシダーゼ、その誘導体。
2. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個または複数個のアミノ酸が欠失し且つ実質的 に同等の酵素活性を有する光要求型除草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ、その誘導 体。
3. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は該アミノ酸配列にお t、て、トラン ジットペプチドが欠失し、さらに 1個または複数個のアミノ酸の欠失、付加あるいは置換等が認めら れるアミノ酸配列を有し且つ実質的に同等の酵素活性を有する変異ペプチドからなる光要求型除 草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ、その誘導体。
4. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、トランジットペプチドが欠失し且つ実質的に同等 の酵素活性を有する光要求型除草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ。
5. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるプロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ。
6. 光要求型除草剤力ピラゾール系化合物である請求項 1乃至 5のレ、ずれかに記載の光要求 型除草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダーゼ。
7. 光要求型除草剤が 2 -クロ口- 5 - (4 -クロ口- 5 -ジフルォロメ卜キシ-卜メチル- 1H-ピラゾール- 3 -ィ ノレ）- 4 -フルオロフエノキシ酢酸ェチル、 2- [5- (4 -クロ口- 5-ジフルォロメトキシ-卜メチル -1H-ピラゾ ール- 3-ィル） -2, 4-ジクロロ-フエニノレアミノ] プロピオン酸ェチノレ、 4 -クロ口- 3 -（4-クロ口- 2 -フノレオ ロ- 5 -メトキシフエ二ル） - 5-ジフルォロメトキシ- 1-メチル -1H -ピラゾーノレ、 4-クロ口- 3 - [4 -クロ口- 2-フ ルォ口- 5- (2 -プロピニル）ォキシフエニル] - 5- ジフルォロメトキシ- 1-メチル- 1H-ピラゾール、 2 - [2- クロロ- 5 -（4 -クロ口- 5 -ジフルォロメトキシ-卜メチル- 1H -ピラゾール- 3-ィル） -4-フルオロフエノキシ] プロピオン酸ェチル、 5- [4 -ブロモ -1-メチル -5 -（トリフルォロメチル） - 1H -ピラゾール- 3 -ィル] - 2-ク ロロ- 4-フルォロ-安息香酸 1-メチルェチル及び 4-クロ口- 3 -（4-クロ口- 2 -フルオロフェニル）-5 ジ フルォロメトキシ -1 -メチル -1H -ピラゾールカ なる群力 選ばれたピラゾール系化合物である請求 項 1乃至 5のいずれかに記載の光要求型除草剤耐性プロトポルフイリノーゲンォキシダ一ゼ。
8. 光要求型除草剤が 2 -クロロ- 5- (4-クロ口- 5-ジフルォロメトキシ- 1-メチル- 1H-ピラゾ一ル- 3 - ィル) -4-フルオロフエノキシ酢酸ェチルである請求項 1乃至 5のいずれかに記載の光要求型除 草剤耐性プロ卜ボルフイリノーゲンォキシダ一ゼ。
9. 請求項 1に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
10. 請求項 2に記載のアミノ酸配列 むタンパク質をコードする遺伝子。
11. 請求項 3に記載のアミノ酸配列 むタンパク質をコードする遺伝子。
12. 請求項 4に記載のアミノ酸配列^^むタンパク質をコードする遺伝子。
13. 請求項 5に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
14. 配列番号 3に記載の塩基配列を有する遺伝子。
15. 請求項 9に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
16. 請求項 10に記載の遺伝子^む組換えベクター。
17. 請求項 11に記載の遺伝子 む組換えベクター。
18. 請求項 12に記載の遺伝子 む組換えべクタ一。
19. 請求項 13に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
20. 請求項 14に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
21. 請求項 15に記載のベクターによる形質転換体。
22. 請求項 16に記載のベクターによる形質転換体。
23. 請求項 17に記載のベクターによる形質転換体。
24. 請求項 18に記載のベクタ一による形質転換体。
25. 請求項 19に記載のベクターによる形質転換体。
26. 請求項 20に記載のベクターによる形質転換体。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036606A2 (de) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | Basf Plant Science Gmbh | Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995034659A1 (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-21 | Ciba-Geigy Ag | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
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|---|---|---|---|---|
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| KR970021314A (ko) * | 1995-10-11 | 1997-05-28 | 김선중 | 제초제 지항성 식물체의 제조방법 |
| WO1997032011A1 (en) * | 1996-02-28 | 1997-09-04 | Novartis Ag | Dna molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| LERMONTOVA I, ET AL.: "CLONING AND CHARACTERIZATION OF A PLASTIDAL AND A MITOCHONDRIAL ISOFORM OF TOBACCO PROTOPORPHYRINOGEN IX OXIDASE", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 94, no. 16, 1 August 1997 (1997-08-01), US, pages 8895 - 8900, XP002917378, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.94.16.8895 * |
| MATRINGE M, ET AL.: "PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE AS A MOLECULAR TARGET FOR DIPHENYL ETHERHERBICIDES", BIOCHEMICAL JOURNAL, PORTLAND PRESS LTD., GB, vol. 260, 1 January 1989 (1989-01-01), GB, pages 231 - 235, XP002917381, ISSN: 0264-6021 * |
| NARITA S, ET AL.: "MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF A CDNA THAT ENCODES PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE OF ARABIDOPSIS THALIANA", GENE., ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 182, 1 January 1996 (1996-01-01), NL, pages 169 - 175, XP002917380, ISSN: 0378-1119, DOI: 10.1016/S0378-1119(96)00545-8 * |
| NISHIMURA K, TAKETANI S, INOKUCHI H: "CLONING OF A HUMAN CDNA FOR PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE BY COMPLEMENTATION IN VIVO OF A HEMG MUTANT OF ESCHERICHIA COLI", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 270, no. 14, 1 January 1995 (1995-01-01), US, pages 8076 - 8080, XP002917379, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.270.14.8076 * |
| SASARMAN A, ET AL.: "MAPPING OF A NEW HEM GENE IN ESCHERICHIA COLI K12", JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY, SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, READING, GB, vol. 113, 1 January 1979 (1979-01-01), GB, pages 297 - 303, XP002917382, ISSN: 0022-1287 * |
| See also references of EP1020525A4 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036606A2 (de) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | Basf Plant Science Gmbh | Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung |
| WO2001036606A3 (de) * | 1999-11-16 | 2001-11-15 | Basf Plant Science Gmbh | Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung |
| JP2015519913A (ja) * | 2012-06-19 | 2015-07-16 | ビーエーエスエフ アグロ ベー．ブイ． | 除草剤に対する増加した耐性を有する植物 |
| JP2018186826A (ja) * | 2012-06-19 | 2018-11-29 | ビーエーエスエフ アグロ ベー．ブイ． | 除草剤に対する増加した耐性を有する植物 |
| JP2021168691A (ja) * | 2015-08-03 | 2021-10-28 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物における除草剤耐容性のための方法及び組成物 |
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