WO1999007350A2 - Chemoprotektion - Google Patents

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WO1999007350A2
WO1999007350A2 PCT/EP1998/004679 EP9804679W WO9907350A2 WO 1999007350 A2 WO1999007350 A2 WO 1999007350A2 EP 9804679 W EP9804679 W EP 9804679W WO 9907350 A2 WO9907350 A2 WO 9907350A2
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cysteine
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malignant
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Inventor
Manfred Kubbies
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]

Definitions

  • the invention relates to the use of L-cysteine or / and derivatives thereof for the production of a pharmaceutical composition for the selective protection of non-malignant cells and an extracorporeal method for the selective protection of non-malignant cells during a therapy for inducing cell death of malignant cells.
  • Malignant tumors are serious diseases that are often not confined to one location. The formation of metastases can lead to an infection of various tissues and organs of a body. Malignant diseases not only significantly reduce a patient's quality of life, they very often have a fatal outcome. For this reason, great efforts have been made for many years to develop improved drugs and treatment methods that reduce the mortality rate or at least improve the quality of life and increase life expectancy.
  • Chemotherapy is a frequently used form of therapy for the treatment of malignant diseases.
  • the cytostatics known today include classes of substances such as alkylating agents, antimetabolites, natural products, antibiotics and hormones. Commonly used substances are alkylating agents, which are also referred to as clastogens and lead to DNA cross-linking, such as cis-platinum (CDDP) or carbo-platinum.
  • CDDP cis-platinum
  • carbo-platinum carbo-platinum
  • these therapeutic agents have a high cytotoxicity for tumor cells, they can often only be administered in a therapeutically suboptimal dosage due to the considerable side effects associated with their use. The side effects are due to the often insufficiently specific mode of action of these agents.
  • malignant cells are not only attacked and rendered harmless, but healthy cells are also damaged.
  • chronic therapy such as renal insufficiency, can occur after such therapy.
  • chemotherapy-induced malignancies such as leukemia, are observed.
  • complete confirmation of tumors is not successful in many cases.
  • the haematopoietic toxicity of many chemotherapeutic agents in chemotherapy is the dose-limiting factor (Civin, C. L, Csore, SD, J. Hematotherapy 2 (1993) 137-144).
  • the cells that are important for blood formation are the hematopoietic stem cells in the bone marrow. Only about every hundred thousandth cell in the bone marrow is an undifferentiated hematopoietic stem cell that is able to duplicate and generate daughter cells that differentiate into hematopoietic lines. Damage to these cells by chemotherapeutic agents is therefore particularly serious for the organism.
  • Cis-platinum is a cytostatic used for various malignant tumors and, like practically all chemotherapy drugs, has significant side effects. Kubbies, M., et al, Br. J. Cancer 64 (1991) 847-849, were able to show that the cytotoxic effect of the cis-platinum is due to the intervention in the Gi / S phase of the cell cycle. Studies on peripheral blood lymphocytes (PBL) have shown that this effect can be partially offset by the use of glutathione.
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • Tissue or cells containing malignant cells are removed from the body.
  • the removed preparation is then incubated with cytotoxic substances in a further process step in order to eliminate the malignant cells.
  • the healthy cells are separated and, if necessary, cultivated to obtain a larger number of healthy cells, which are then re-implanted in the body.
  • This method is used for example in bone marrow tumors and is referred to as "purging". Even with such methods, however, there are the above-mentioned side effects when administering cytotoxic substances and consequently damage to healthy cells.
  • L-cysteine or / and derivatives thereof for the production of a pharmaceutical composition for the selective protection of non-malignant cells during a therapy for inducing cell death of malignant cells.
  • L-cysteine or / and derivatives thereof reduces the negative side effects of agents for inducing cell death in malignant cells, but has no inhibitory effect on their effect in inducing cell death in malignant cells.
  • the use of L-cysteine and / or derivatives thereof according to the invention shows a strong reduction in the damage to non-malignant cells caused by chemotherapeutic agents.
  • the method according to the invention not only has the great advantage that the cytotoxic damage to non-malignant cells is reduced, at the same time there can be a synergistic effect with the agent used to induce cell death in malignant cells.
  • the agent used according to the invention preferably not only protects the non-malignant cells, but can even improve their proliferation. This can increase the number of non-malignant cells after the malignant cells have been killed.
  • the number of non-malignant cells that can be re-implanted in a patient can be significantly increased in an ex vivo treatment. Reimplanting a larger amount of healthy cells increases the likelihood of a successful course of treatment.
  • the therapy for inducing cell death of malignant cells comprises chemotherapy.
  • a cytostatic from the group of the alkylating agents such as, for example, cyclophosphamide, trofosfamide, ifosfamide, chlorambucil, melphalan, carmustine, lomustine, semustine, busulfan, cisplatin, in particular the DNA crosslinker.
  • the pharmaceutical composition used according to the invention preferably contains L-cysteine as the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition can contain physiologically active derivatives of L-cysteine, to which N-modified derivatives such as N-acyl compounds such as N-acetyl-L-cysteine, carboxyl-modified derivatives such as esters or amides or S- modified derivatives, such as S-alkylated compounds.
  • the SH group is preferably freely available.
  • Derivatives of L-cysteine also include precursor substances which are reacted in the organism or in the extracorporeal liquid containing cells to be treated and which form or release L-cysteine and / or a physiologically active derivative thereof.
  • L-cysteine is reabsorbed in the kidney and is available to the body again. Active substances are therefore preferred which behave similarly to L-cysteine with regard to their pharmacokinetic properties. It is therefore advantageous with corporeal treatment that the dose of the substances used according to the invention can be kept low due to this "natural recycling process". This is one way of reducing costs.
  • the pharmaceutical composition can be brought into various galenical forms, such as tablets, coated tablets, solutions for injection or infusions.
  • the administration is systemic or local depending on the requirements.
  • the dose of the compound used according to the invention is adjusted so that the chemotherapeutic agent has an optimal effect with the best possible chemoprotective protection by the agent according to the invention.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is preferably from 0.1 to 1000 mg L-cysteine or a physiologically active derivative thereof per kg body weight, particularly preferably from 1 to 400 mg / kg body weight.
  • the dosage of the cytostatic is adjusted in each case and generally depends on the cytostatic used, the area of application and the form of therapy used.
  • the use of L-cysteine or a physiologically active derivative thereof can reduce or largely avoid the side effects which occur at a customary dosage level of the cytostatic.
  • cytostatics With various cytostatics, their effectiveness decreases with prolonged use. To counteract a reduction in effectiveness, the dose used must therefore be increased as treatment progresses. This increase in dose is countered by the side effects mentioned. The dose used can therefore only be increased up to a certain maximum limit.
  • the use of the agent according to the invention can surprisingly increase the dose of the cytostatic. As a result, the malignant cells can be eliminated more effectively and the time-related loss of activity of the cytostatic agent can be counteracted.
  • the therapy comprises extracorporeal treatment of cells.
  • the cystostat used is used in suitable doses to achieve optimal induction of cell death in malignant cells.
  • Cis-platinum or / and carbo-platinum is preferably used in a concentration of 0.3 to 30 ⁇ g / ml in a suspension containing cells to be treated.
  • the active ingredient used according to the invention is used in a concentration of 0.01 mg / ml to 4 mg / ml in a suspension containing the cells to be treated.
  • the active ingredient used is preferably L-cysteine in a concentration of 0.01 mg / ml to 3 mg / ml, particularly preferably 0.1 mg / ml to 1.5 mg / ml and most preferably 0.2 mg / ml to 1 mg / ml used.
  • the N-acetyl-L-cysteine used as active ingredient is preferably in a concentration of 0.1 mg / ml to 4 mg / ml, particularly preferably 0.5 mg / ml to 2 mg / ml, most preferably 0.9 mg / ml to 1.5 mg / ml used.
  • the active ingredient can be added before, during or / and after the addition of the cell death inducing agent.
  • the extracorporeal treatment of the cells can be carried out at any suitable temperature when the selective-protective pharmaceutical composition is used according to the invention, preferably the treatment is carried out at a temperature of from 20 ° C. to 42 ° C., preferably at 37 ° C.
  • the active ingredient can be used in therapy methods for inducing the cell death of malignant cells of any known cell type.
  • the cells to be treated are preferably selected from peripheral blood lymphocytes, bone marrow cells, Subpopulations thereof and / or hematopoietic stem cells, preferably from bone marrow.
  • the cells to be treated preferably originate from a human patient with a malignant disease. After an extracorporeal treatment, the cells can be re-implanted in the patient.
  • the use of the active ingredient according to the invention is carried out in a treatment under sterile conditions in plastic vessels, in particular in one or more flexible plastic vessels such as blood bags.
  • the plastic containers are preferably closed and have at least one opening e.g. an extension for the connecting hoses.
  • these connecting hoses which preferably consist of weldable plastic material, the connection and disconnection of bags is possible with a suitable device in such a way that a closed system is always maintained. This means that the handling of biological substances such as cells, viruses or vectors is possible with a significantly reduced risk of contamination and the use of sterile workbenches can even be dispensed with.
  • the extracorporeal treatment can also include gene therapy process steps. These include, for example, transduction of the cells, for example using retroviral vectors, stimulation of the cells, cultivation of the cells and / or extraction of cell subpopulations.
  • the invention relates to a method for the selective protection of non-malignant cells in a therapy for inducing cell death of malignant cells in a living being, which is characterized in that the living being is given a pharmaceutical composition comprising L-cysteine and / or derivatives thereof in a effective amounts for the selective protection of non-malignant cells.
  • CDDP concentration 3 ⁇ g / ml.
  • the y-axis zero value represents the CDDP control.
  • the values for the relative proliferation are calculated from the quotients of proliferating cells to non-proliferating cells (BrdU / Hoechst cell cycle analysis).
  • the compounds are added in a concentration of 0.5 mg / ml and 1 mg / ml, respectively.
  • Fig. 3 Protective effect of the compounds GSH, NAC and L-CYS (1 mg / ml) after delayed addition to CDDP (3 ⁇ g / ml) treated KM cells.
  • the y-axis zero value represents the CDDP control.
  • the CD34 + KM cells were counted after 14 days of culture using digital image analysis and trypan staining. Starting cell count: 100 cells / well. Examples
  • test substances GSH, L-CYS or NAC in the concentrations 0.1, 0.5 and 1.0 mg / ml are added to the cell lines and incubated for 24 h.
  • the Brdü / Hoechst cell cycle analysis used for the proliferation analysis yielded the results shown in the following examples.
  • Human PBL's are obtained from fresh, heparinized whole blood from healthy, adult donors using standard Ficoll isolation.
  • the pellet obtained is in 1 ml of RPMI 1640 culture medium; 15% FCS; 1% autologous donation plasma; 2 raM glutamine; non-essential amino acids (each 0.1 mM); 1 mM sodium pyruvate; 2-10 "5 alpha-thioglycerol; activation with 5 ⁇ g / ml PHA for Brdü / Hoechst cell cycle analysis supplemented with 8-10 " 5 M deoxycytidine and 8-10 "5 M Brdü resuspended and the cell number determined by means of Ty ⁇ an blue vital staining.
  • Human bone marrow from sternal punctates from donors between the ages of 20 and 60 serves as the starting material. After working up, Ficoll isolation and resuspending, the bone marrow is placed in freezing medium Isove's DMEM; 10% FCS, 10% DMSO; 2 mM glutamine; 100 IU / ml penicillin; 1 mg / ml streptomycin stored at -196 ° C in liquid nitrogen. Cultivation of bone marrow cells
  • the CD34 + bone marrow populations are presented with a cell count of 50 or 100 cells in 96-well round-bottom plates with 100 ⁇ l of Iscove's culture medium (Iscove's DMEM; 20% human AB plasma or 20% FCS; 2 mM glutamine; 100 IU / ml penicillin; 1 mg / ml streptomycin) sorted using a cell sorter.
  • the medium of the KM cells is supplemented with a cytokine cocktail (IL3 250 U / ml; IL6 1000 U / ml; EPO 5 U / ml; GM-CSF 100 U / ml; SCF 10 U / ml).
  • a cytokine cocktail IL3 250 U / ml
  • GM-CSF 100 U / ml
  • SCF 10 U / ml SCF 10 U / ml
  • the DNA-specific fluorochromes and the fluorochromes of Table 1 coupled to monoclonal antibodies (MAK) are used.
  • MAK anti-human mouse antibody conjugated to fluorochrome and its main cell specificity
  • Differential cell cycle analyzes of up to three consecutive cell cycles are determined with the help of the BrdU / Hoechst technique.
  • the analysis is carried out according to the manufacturer's instructions and as in Kubbies, M. (1992), High-resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (ed.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, pp. 75-85.
  • Peripheral blood lymphocytes are proliferatively in a resting phase (Go phase).
  • the lymphocytes are stimulated with PHA (phytohemagglutinin) and begin to proliferate asynchronously after about 30-40 h in the S phase of the first cell cycle.
  • the lymphocytes are with a cell density of 3-10 5 cells per ml BrdU medium RPMI 1640, 15% FKS, 1% autologous donation plasma (whole blood centrifuged for 10 min at 400xg), 2-10 "5 M alpha-thioglyerol, 8- 10 "5 M BrdU, 8-10 " 5 M deoxycytidine are sown in 24-well plates with 2 ml medium per well.
  • the alpha-thioglycerol added to the medium serves to improve the proliferation of PBL (Kubbies, M. et al., Lymphokine Res. , 9 (1990), Improvement of human lymphocyte proliferation and alteration of IL-2 secretion kinetics by alpha-thioglycerol, 95-101), deoxycytidine prevents possible nucleotide metabolism disorders which can be caused by BrdU.
  • the cells After adding the chemotherapeutic agent and the substance according to the invention or the comparative substance GSH, the cells are stimulated with 5 ⁇ g / ml PHA. In the time delay tests, the test substances are added at a later time.
  • the cells treated in this way are incubated for 72 h, then centrifuged at 250 ⁇ g, 10 min and then stained.
  • the samples frozen at -20 ° C are thawed and centrifuged at 250xg for 10 min.
  • the pellet is resuspended in 10 ul RNAse A 1000 U / ml. This degrades the RNA, which would otherwise be stained by PI.
  • the resuspended cells are now in 1 ml DNA staining buffer 100 mM Tris 7.4, 154 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 , 0.2% BSA, 0.1% NP40 with 1 ⁇ g / ml HO33258 and incubated for 15 min at 4 ° C in the dark (approx. 0.5 - 1.0 - 10 6 cells / ml). Subsequently 2 ⁇ g / ml PI are added and incubated again at 4 ° C. for 15 min.
  • the samples colored in this way can be measured within 8 hours when stored in the dark at 4 ° C.
  • the degree of inhibition of proliferation is determined from the quotient of the number of proliferating cells by the number of non-proliferating cells (see formulas). Of each The result is that the value of the cis-platinum control is subtracted so that it represents the y-axis zero value.
  • the size of the nomination factor allows a statement about the prohferative state of the cells. The smaller the value, the more cells are in a prohferative stage after the end of the culture period. For the PBL, the value indicates the donor-dependent stimulability of the cells by PHA. The smaller the value, the higher the number of cells that can be stimulated by PHA.
  • Synchronous cell populations Asynchronous cell populations
  • RP relative proliferation
  • CP value determined for the cis-platinum control
  • NF normalization factor.
  • the bone marrow cells are pooled and the cell number of the mononuclear cells is determined by means of trypan blue vital staining. To determine the autofluorescence, 1-5-10 5 cells are removed and the remaining cells are stained. The cells are centrifuged at 250xg for 10 min.
  • the supernatant is then discarded and the cells in 100 ⁇ l sterile-filtered staining medium (washing medium with antibody, Iscove's DMEM; 10% FCS; 2 mM glutamine; 100 IU / ml penicillin; 1 mg / ml streptomycin) per 10 6 cells and resuspended and 20 min without direct light irradiation with the fluorescence-labeled MAK (antibodies: per 10 cells, 100 ul supplemented with 20 ul ⁇ CD34> -FITC, 20 ul ⁇ CD38> -PE and 5 ul ⁇ HLA-DR> -TC) are incubated at room temperature. The mixture is then centrifuged at 250xg for 10 min and washed the pellet with washing medium. The cells are taken up in a density of approx. 10 cells / ml in washing medium and sorted.
  • washing medium with antibody Iscove's DMEM; 10% FCS; 2 mM glutamine; 100 IU
  • the cells are sorted using a scattered light and antibody gate.
  • the first gate in the scattered light image is set so that only living cells are sorted.
  • the gates are set in the second step in the 2-dimensional fluorescence image of the FITC and PE fluorescences so that the ⁇ CD34 + > KM cells can be sorted into ⁇ CD38 + > or ⁇ CD38 populations.
  • the ⁇ CD34 + > cells are analyzed for their ⁇ HLA-DR> properties, but not sorted according to this.
  • the KM cells cultured in the 96-well plates with a round bottom are counted with an inverted microscope and the Quantimet 570 image analysis system (Cambridge Instruments, Leica) IM (Zeiss).
  • Human PBL is used as a model for normal, diploid, hematopoietic cells.
  • GSH, NAC and L-CYS have no proliferation-inhibiting effects at the doses of 0.1 mg / ml, 0 3 5 mg / ml and 1 mg / ml used.
  • the simultaneous use of CDDP as a cytostatic and 0.1 mg / ml GSH, L-CYS or NAC only leads to slight protection with GSH with a relative proliferation of approx. 25% of the control value.
  • L-Cys and NAC show significantly better CDDP protection than the comparison substance GSH.
  • the protective effect of L-Cys at 0.5 mg / ml is significantly higher than that of GSH.
  • CD34 + / CD38 + cell population represents hardly differentiated, very early KM progenitor cells / stem cells.
  • the CD34 + / CD38 + cell population mainly contains CFU cells (colony forming units) and among other things already myeloblasts, erythroblasts and lymphoblasts (Terstappen, WMM, et al ., Blood 77 (1991) 1218-1227).
  • the presence of the activation-correlated histocompatibility-antigen HLA-DR is additionally determined by flow cytometry.
  • the proportion of the CD38 + , HLA-DR + cells was on average 73% ( ⁇ 7.0), the CD38 + , HLA-DR " cells 4% ( ⁇ 1.1), the CD38 " , HLA-DR + cells 20% ( ⁇ 5.5) and the CD38 " , HLA-DR " cells 3% ( ⁇ 0.7).
  • a cell count of 50 or 100 KM cells is sorted into 96-well round-bottom plates and then L-CYS, NAC or the comparative compound GSH and CDDP are simultaneously added to the culture medium. With a cultivation period of 14-16 days, the cells are counted with the help of digital image analysis and additionally with trypan blue vital staining and counting chamber.
  • Fig. 2 shows the results of cell proliferation and chemoprotection of cells from a representative KM donor. A slight variation in proliferation can generally be seen in different donors.
  • the comparison substance GSH cannot protect the KM cells from the cytotoxic effects of CDDP neither at a concentration of 0.5 mg / ml nor at 1 mg / ml. Even the gift of GSH alone without CDDP leads to a reduction in the number of cells to approximately half (0.5 mg / ml GSH) or a cell number that almost corresponds to the negative control (CDDP).
  • L-CYS has a strong protective effect at a concentration of 1 mg / ml.
  • the cell number with simultaneous administration of CDDP and L-CYS (1 mg / ml) is approx. 70% of the control value.
  • L-Cys alone does not lead to a significant reduction in the number of cells compared to the control value.
  • NAC had no protective effect.
  • the comparative substance GSH shows little protective effect against CDDP.
  • CDDP and GSH are administered simultaneously, only approx. 15% (1 mg / ml GSH) or approx. 25% (0.5 mg / ml GSH) of the cell number are available compared to the control.
  • the administration of GSH alone without CDDP leads to a reduction in the number of cells to approximately half (0.5 mg / ml GSH) or a number of cells that almost corresponds to the negative control (CDDP).
  • L-CYS shows a good protective effect at 0 h, 1 h and 4 h (about 60% of the cell number of the control when added) after 4 h). Even with L-CYS administration after 14 h, approx. 25% of the cells can still be protected against the cytotoxic effects of CDDP.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen sowie ein extrakorporeales Verfahren zur selektiven Protection von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen.

Description

Chemoprotektion
Die Erfindung betrifft die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen sowie ein extrakorporeales Verfahren zur selektiven Protektion von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen.
Maligne Tumoren stellen ernsthafte Erkrankungen dar, die häufig nicht auf einen Ort beschränkt bleiben. Durch Metastasenbildung kann es zu einem Befall von verschiedenen Geweben und Organen eines Körpers kommen. Maligne Erkrankungen vermindern nicht nur in erheblicher Weise die Lebensqualität eines Patienten, sondern sie nehmen sehr häufig einen tödlichen Ausgang. Es werden deshalb seit vielen Jahren große Anstrengungen unternommen, um verbesserte Arzneimittel und Behandlungsmethoden zu entwickeln, die die Mortalitätsrate verringern oder zumindest die Lebensqualität verbessern und die Lebenserwartung erhöhen.
Die Chemotherapie ist eine häufig angewendete Therapieform zur Behandlung von malignen Erkrankungen. Die heute bekannten Zytostatika umfassen Substanzklassen wie beispielweise Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Naturstoffe, Antibiotika und Hormone. Häufig verwendete Substanzen sind Alkylierungsmittel, die auch als Klastogene bezeichnet werden und zu einer DNA-Quervernetzung fuhren, wie beispielsweise Cis-Platin (CDDP) oder Carbo-Platin.
Obwohl diese Therpeutika eine hohe Zytotoxizität für Tumorzellen aufweisen, können sie oftmals aufgrund der mit ihrer Anwendung verbundenen erheblichen Nebenwirkungen nur in einer therapeutisch suboptimalen Dosierung verabreicht werden. Die Nebenwirkungen sind auf die oft nicht ausreichend spezifische Wirkungsweise dieser Mittel zurückzuführen. So werden bei ihrer Anwendung nicht nur maligne Zellen angegriffen und unschädlich gemacht, sondern es werden auch gesunde Zellen geschädigt. Darüber hinaus kann es nach einer derartigen Therapie zu chronischen Folgeerkrankungen, wie z.B. Niereninsuffizienz, kommen. Selbst Chemotherapie-induzierte maligne Erkrankungen, wie beispielsweise Leukämien werden beobachtet. Dies hat zur Folge, daß eine vollständige Bestätigung von Tumoren in vielen Fällen nicht gelingt. Insbesondere stellt die hämatopoietische Toxizität vieler Chemotherapeutika bei der Chemotherapie den Dosis-limitierenden Faktor dar (Civin, C. L, Csore, S.D., J. Hematotherapy 2 (1993) 137-144).
Die für die Blutbildung wichtigen Zellen sind die hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark. Nur etwa jede hunderttausendste Zelle im Knochenmark ist eine undifferenzierte hämatopoietische Stammzelle, die in der Lage ist, sich zu duplizieren und Tochterzellen zu generieren, die sich in hämatopoietische Linien differenzieren. Eine Schädigung dieser Zellen durch Chemotherapeutika ist somit besonders gravierend für den Organismus.
Cis-Platin ist ein für verschiedene maligne Tumore verwendetes Zytostatikum, das wie praktisch alle Chemotherapeutika erhebliche Nebenwirkungen aufweist. Kubbies, M., et al, Br. J. Cancer 64 (1991) 847-849, konnten zeigen, daß die zytotoxische Wirkung des Cis-Platin auf das Eingreifen in die Gi/S-Phase des Zellzyklus zurückzuführen ist. Bei Studien an peripheren Blutlymphozyten (PBL) konnte gezeigt werden, daß diese Wirkung durch die Anwendung von Glutathion teilweise aufgehoben werden kann.
Neben der klassischen systemischen Behandlung eines Patienten mit Chemotherapeutika, verwendet man heute auch extrakorporeale Behandlungsmethoden. Dabei wird dem Körper maligne Zellen enthaltendes Gewebe bzw. Zellen entnommen. Das entnommene Präparat wird dann in einem weiteren Verfahrensschritt mit zytotoxischen Substanzen inkubiert, um die malignen Zellen zu eliminieren. Die gesunden Zellen werden abgetrennt und gegebenenfalls kultiviert, um eine größere Anzahl von gesunden Zellen zu erhalten, die dann in den Körper reimplantiert werden. Dieses Verfahren wird beispielsweise bei Knochenmarkstumoren angewendet und als "purging" bezeichnet. Auch bei derartigen Verfahren kommt es jedoch zu den oben genannten Nebenwirkungen bei der Verabreichung zytotoxischer Substanzen und folglich zu einer Schädigung gesunder Zellen.
Somit bestand das Bedürfnis, Mittel zu finden, die die Nebenwirkungen bekannter den Zelltod maligner Zellen induzierender Stoffe vermindern, ohne die Wirksamkeit dieser Mittel zu reduzieren. Es bestand des weiteren das Bedürfnis, Mittel bereitzustellen, die es ermöglichen, zytotoxische Substanzen in erhöhten Dosen anzuwenden, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Mittel zur selektiven Chemoprotektion von humanen Zellen, insbesondere von humanen Knochenmarksvorläuferzellen und Stammzellen bereitzustellen, mit dem es möglich wird, gesunde Zellen vor den schädigenden Nebenwirkungen zytotoxischer Mittel zu schützen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen.
Es war überraschend, daß die erfindungsgemäße Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon die negativen Nebenwirkungen von Mitteln zur Induktion des Zelltods maligner Zellen reduziert, jedoch keinen hemmenden Einfluß auf deren Wirkung bei der Induktion des Zelltods maligner Zellen hat. Insbesondere bei der Durchführung von ex vivo Behandlungen zeigt die erfindungsgemäße Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon eine starke Verminderung der durch chemotherapeutische Mittel verursachten Schädigungen nichtmaligner Zellen. Das erfmdungsgemäße Verfahren hat nicht nur den großen Vorteil, daß die zytotoxischen Schädigungen nichtmaligner Zellen vermindert werden, gleichzeitig kann es zu einem synergistischen Effekt mit dem verwendeten Mittel zur Induktion des Zelltods maligner Zellen kommen. Dabei schützt das erfindungsgemäß verwendete Mittel vorzugsweise nicht nur die nichtmalignen Zellen, sondern es kann sogar ihre Proliferation verbessern. Dadurch kann die Anzahl an nichtmalignen Zellen nach dem Abtöten der malignen Zellen gesteigert werden.
Insbesondere bei Zelltypen, die nur in geringem Anteil in einem Gewebe vorhanden sind, wie beispielweise Knochenmarksvorläufer-/Stammzellen, kann bei einer ex vivo Behandlung die Zahl an nichtmalignen Zellen signifikant erhöht werden, die in einen Patienten reimplantiert werden können. Durch das Reimplantieren einer größeren Menge an gesunden Zellen wird wiederum die Wahrscheinlichkeit für einen erfolgreichen Behandlungsverlauf erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen eine Chemotherapie. Es kommen jedoch auch andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in Betracht, wie beispielsweise intermittierende Chemotherapie, Stoßtherapie, niedrigdosierte Dauertherapie, Hypertheπnie, Strahlentherapie oder nuklearmedizinische Methoden. Besonders bevorzugt umfaßt die Therapie die Verabreichung eines Zytostatikums aus der Gruppe der Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Cyclophosphamid, Trofosfamid, Ifosfamid, Chlorambucil, Melphalan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Busulfan, Cisplatin, insbesondere der DNA-Crosslinker. Am meisten bevorzugt verwendet man als Zytostatikum Cis-Platin oder/und Carbo-Platin. Die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung enthält vorzugsweise L-Cystein als Wirkstoff. Des weiteren kann die pharmazeutische Zusammensetzung physiologisch wirksame Derivate von L-Cystein enthalten, zu denen N-modifizierte Derivate wie etwa N-Acylverbindungen, wie z.B. N-Acetyl-L-Cystein, Carboxyl-modifizierte Derivate, wie etwa Ester oder Amide oder S-modifizierte Derivate, wie etwa S-alkylierte Verbindungen gehören. Vorzugsweise liegt die SH-Gruppe frei vor. Zu Derivaten von L- Cystein gehören auch Precursorsubstanzen, die im Organismus bzw. in der extrakorporealen, zu behandelnden Zellen enthaltenden Flüssigkeit umgesetzt werden und L-Cystein oder/und ein physiologisch wirksames Derivat davon bilden oder freisetzen.
L-Cystein wird in der Niere reabsorbiert und steht dem Körper wieder zur Verfügung. Bevorzugt sind deshalb Wirkstoffe, die sich bezüglich ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften ähnlich wie L-Cystein verhalten. Vorteilhaft ist somit bei einer korporealen Behandlung, daß die Dosis der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen aufgrund dieses "natürlichen Rezyklisierungsprozesses" gering gehalten werden kann. Dies stellt eine Möglichkeit der Kostenreduzierung dar.
Zur korporealen Behandlung eines Organismus kann die pharmazeutische Zusammensetzung in verschiedene galenische Formen gebracht werden, wie beispielsweise Tabletten, Dragees, Lösungen zur Injektion oder Infusionen. Die Verabreichung erfolgt je nach den Erfordernissen systemisch oder lokal. Die Dosis der erfindungsgemäß verwendeten Verbindung wird so eingestellt, daß es zu einer optimalen Wirkung des Chemotherapeutikums bei bestmöglichem chemoprotektiven Schutz durch das erfindungsgemäße Mittel kommt.
Vorzugsweise beträgt die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung von 0,1 bis 1000 mg L-Cystein oder ein physiologisch wirksames Derivat davon pro kg Körpergewicht, besonders bevorzugt von 1 bis 400 mg/kg Körpergewicht.
Die Dosierung des Zytostatikums wird jeweils speziell eingestellt und richtet sich im allgemeinen nach dem verwendeten Zytostatikum, dem Anwendungsgebiet und der verwendeten Therapieform. Durch die Verwendung des L-Cysteins oder eines physiologisch wirksamen Derivats davon können die bei einer üblichen Dosierungshöhe des Zytostatikums auftretenden Nebenwirkungen vermindert oder weitestgehend vermieden werden. Überraschenderweise wird es darüber hinaus möglich, die Dosis des Zytostatikums und damit seine Wirksamkeit zu erhöhen, ohne eine gleichzeitige Erhöhung der Nebenwirkungen in Kauf nehmen zu müssen.
Bei verschiedenen Zytostatika vermindert sich ihre Wirksamkeit bei längerer Anwendung. Um einer Wirkungsreduzierung entgegenzuwirken, muß deshalb mit fortschreitender Behandlung die verwendete Dosis erhöht werden. Dieser Dosiserhöhung stehen jedoch die genannten Nebenwirkungen entgegen. Somit kann die verwendete Dosis nur bis zu einer bestimmten Höchstgrenze gesteigert werden. Durch die erfindungsgemäße Verwendung des Mittels kann überraschenderweise die Dosis des Zytostatikums erhöht werden. Dadurch können die malignen Zellen wirksamer eliminiert werden und dem zeitbedingten Wirkungsverlust des Zytostatikums kann entgegengewirkt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Therapie eine extrakorporeale Behandlung von Zellen. Das verwendete Zystostatikum wird in geeigneten Dosen verwendet, um eine optimale Induktion des Zelltods in malignen Zellen zu erreichen. Vorzugsweise wird Cis-Platin oder/und Carbo-Platin in einer Konzentration von 0,3 bis 30 μg/ml in eine zu behandelnde Zellen enthaltende Suspension eingesetzt.
Der erfindungsgemäß verwendete Wirkstoff wird in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 4 mg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt. Dabei wird als Wirkstoff vorzugsweise L-Cystein in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 3 mg/ml, besonders bevorzugt von 0,1 mg/ml bis 1,5 mg/ml und am meisten bevorzugt von 0,2 mg/ml bis 1 mg/ml eingesetzt. Das als Wirkstoff verwendete N-Acetyl-L-Cystein wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 4 mg/ml, besonders bevorzugt von 0,5 mg/ml bis 2 mg/ml am meisten bevorzugt von 0,9 mg/ml bis 1,5 mg/ml eingesetzt.
Die erfindungsgemäße Zugabe des Wirkstoffs kann vor, während oder/und nach der Zugabe des den Zelltod induzierenden Mittels stattfinden. Die extrakorporeale Behandlung der Zellen kann bei der erfindungsgemäßen Verwendung der selektiv-protektiven pharmazeutischen Zusammensetzung bei jeder geeigneten Temperatur erfolgen, vorzugsweise wird die Behandlung bei einer Temperatur von 20°C bis 42°C, vorzugsweise bei 37°C durchgeführt.
Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff bei Therapieverfahren zur Induktion des Zelltods maligner Zellen jeden bekannten Zelltyps verwendet werden, vorzugsweise werden die zu behandelnden Zellen ausgewählt aus peripheren Blutlymphozyten, Knochenmarkszellen, Subpopulationen davon oder/und hämatopoietischen Stammzellen, vorzugsweise aus Knochenmark. Vorzugsweise stammen die zu behandelnden Zellen aus einem humanen Patienten mit einer malignen Erkrankung. Nach einer extrakorporealen Behandlung können die Zellen dem Patienten reimplantiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Verwendung des Wirkstoffs bei einer Behandlung unter sterilen Bedingungen in Plastikgefäßen, insbesondere in einem oder mehreren flexiblen Plastikgefäßen wie etwa Blutbeuteln durchgeführt. Die Plastikgefäße sind vorzugsweise geschlossen und besitzen mindestens eine Öffnung z.B. ein Ansatzstück für die Verbindungsschläuche. Über diese Verbindungsschläuche, die vorzugsweise aus verschweißbarem Plastikmaterial bestehen, ist mit einem geeigneten Gerät das Verbinden und Trennen von Beuteln auf solche Weise möglich, daß immer ein geschlossenes System erhalten bleibt. Dies führt dazu, daß die Handhabung mit biologischen Substanzen wie beispielsweise Zellen, Viren oder Vektoren unter einem erheblich reduzierten Kontaminationsrisiko möglich ist und sogar auf die Verwendung steriler Werkbänke verzichtet werden kann.
Dadurch wird es möglich, daß einem Patienten über Schlauchverbindungen beispielsweise Blut unter sterilen Bedingungen entnommmen wird und alle extrakorporealen Behandlungsschritte der Zellen in diesem System stattfinden. Diese Behandlungsschritte umfassen Inkubieren, Kultivieren, Einbringen und Entnehmen von Flüssigkeiten oder Zellen aus dem Plastikgefäß sowie gentechnologische Verfahrensschritte. Gegebenenfalls kann das Plastikgefäß mit einem weiteren Lösungen, Zellen, Vektoren etc. enthaltenden Plastikgefäß gekoppelt werden und so die beiden Volumina vereinigt werden. In diesem vereinigtem Volumen können dann Reaktionen, wie beispielsweise eine Transduktion ablaufen. Nach Abschluß der extrakoφorealen Behandlung können die Zellen durch Zentrifugation konzentriert werden und in eine zur Reimplantation geeignete Lösung, die gegebenenfalls gepuffert sein kann, überführt werden. Die so erhaltende Zellsuspension kann wiederum über Schlauchverbindungen steril dem Patienten' zugeführt werden. Bezüglich der Plastikgefäße und ihrer Verwendung wird ausdrücklich auf die WO 98/07829 hingewiesen.
Darüber hinaus kann die extrakoφoreale Behandlung weiterhin gentherapeutische Verfahrensschritte umfassen. Dazu gehören z.B. eine Transduktion der Zellen, z.B. mit retro- viralen Vektoren, eine Stimulierung der Zellen, eine Kultivierung der Zellen oder/und eine Gewinnung von Zellsubpopulationen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen bei einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in einem Lebewesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Lebewesen eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend L-Cystein oder/und Derivate davon in einer für die selektive Protektion von nichtmalignen Zellen wirksamen Mengen verabreicht.
Die folgenden Beispiele, Publikationen und die Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Die Abbildungen stellen folgendes dar:
Abb. 1 Proliferationshemmende und chemoprotektive Wirkung der Verbindungen
Glutathion (GSH), L-Cystein (L-CYS) und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) auf PBL (periphere Blutlymphozyten) nach Aktivierung mit PHA (Phythämagglutinin) und 72 h Inkubation. CDDP Konzentration: 3μg/ml. Der y-Achsen Nullwert repräsentiert die CDDP -Kontrolle. Die Werte für die relative Proliferation errechnen sich aus den Quotienten von proliferie- renden Zellen zu nicht proliferierenden Zellen (BrdU/Hoechst Zell- zyklusanalyse).
Abb. 2 De novo Wirkung bzw. chemoprotektiver Effekt der Verbindungen GSH,
NAC und L-CYS auf CD34+ Knochenmarkszellen (KM)-Zellen sortiert nach CD38+ und CD38". Anfangszellzahl 100. Die Verbindungen werden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml bzw. 1 mg/ml zugegeben. CDDP Konzentration: 3 μg/ml.
Abb. 3 Schutzwirkung der Verbindungen GSH, NAC und L-CYS (1 mg/ml) nach zeitverzögerter Zugabe zu CDDP (3 μg/ml) behandelten KM-Zellen. Der y- Achsen Nullwert repräsentiert die CDDP-Kontrolle. Die CD34+ KM-Zellen wurden nach 14 Tagen Kultur mittels digitaler Bildanalyse und Trypan- blaufärbung ausgezählt. Ausgangszellzahl: 100 Zellen/Well. Beispiele
Zum Nachweis der Schutzwirkung von L-CYS und NAC wird ihre chemoprotektive und proliferationshemmende bzw. proliferationssteigernde Wirkung auf, auf periphere Blutlymphozyten (PBL) und auf Knochenmarkszellen (CD34+) und auf Subpopulationen davon (CD34+CD38+ und CD34+CD38") untersucht. GSH wird als Vergleichssubstanz verwendet.
Zu den Zellinien werden zum Zeitpunkt der Toxifϊzierung mit 3 μl/ml CDDP die Testsubstanzen GSH, L-CYS bzw. NAC in den Konzentrationen 0,1, 0,5 und 1,0 mg/ml zugegeben und 24 h inkubiert. Die für die Proliferationsanalytik verwendete Brdü/Hoechst-Zell- zyklusanalyse erbrachte die in den folgenden Beispielen dargestellten Ergebnisse.
1. Material und Methoden
1.1 Zellen
1.1.1 Humane periphere Blutlymphozyten
Humane PBL's werden aus frischem, heparinisiertem Vollblut gesunder, erwachsener Spender mittels gebräuchlicher Ficoll-Isolierung gewonnen. Das gewonnene Pellet wird in 1 ml Kulturmedium RPMI 1640; 15% FKS; 1% autologes Spendeφlasma; 2 raM Glutamin; nichtessentielle Aminosäuren (jede 0,1 mM); 1 mM Natriumpyruvat; 2-10"5 alpha-Thio- glycerol; Aktivierung mit 5 μg/ml PHA zur Brdü/Hoechst Zellzyklusanalyse supplementiert mit 8-10"5 M Desoxycytidin und 8-10"5 M Brdü resuspendiert und die Zellzahl mittels Tyφanblau- Vitalfärbung bestimmt.
1.1.2 Humane Knochenmarkszellen
Als Ausgangsmaterial dient humanes Knochenmark aus Sternalpunktaten von Spendern im Alter zwischen 20 und 60 Jahren. Das Knochenmark wird nach Aufarbeitung, Ficoll- Isolierung und Resuspendierung in Einfriermedium Isove's DMEM; 10% FKS, 10% DMSO; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin bei -196°C in flüssigem Stickstoffgelagert. Kultivierung der Knochenmarkzellen
Die CD34+ Knochenmarkpopulationen werden nach dem Auftauen mit einer Zellzahl von 50 bzw. 100 Zellen in 96-Well-Rundbodenplatten mit vorgelegten 100 μl Iscove's Kulturmedium (Iscove's DMEM; 20% humanes AB-Plasma oder 20% FKS; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin) mittels Cellsorter sortiert. Das Medium der KM- Zellen wird mit einem Zytokincocktail (IL3 250 U/ml; IL6 1000 U/ml; EPO 5 U/ml; GM- CSF 100 U/ml; SCF 10 U/ml) supplementiert. Nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C und 7% CO2 werden die Zellen mit 50 μl Iscove's Kulturmedium, supplementiert mit dem Zytokincocktail, gefüttert.
1.2 Reportermoleküle
Es werden die DNA-spezifische Fluorchrome und die an monoklonale Antiköφer (MAK) gekoppelten Fluorchrome der Tabelle 1 verwendet.
Tabelle 1
MAK (anti-humane Maus Antikörper) konjugiert mit Fluorochrom und deren hauptsächliche Zellspezifität
Figure imgf000011_0001
Tabelle 2
Geräte und Filterkombination für die verwendeten, durchflußzytometrischen Verfahren
Figure imgf000012_0001
Software zur Analyse der Ergebnisse: Lysis2 (Becton Dickinson) MPLUS (Phoenix Flox Systems) Excel 5.0 (Microsoft)
1.3 Nachweisverfahren
1.3.1 BrdU/Hoechst-Zellzyklus- Analyse
Differentielle Zellzyklusanalysen von bis zu drei aufeinanderfolgenden Zellzyklen werden mit Hilfe der BrdU/Hoechst Technik durchflußzytrometrisch bestimmt. Die Analyse wird gemäß den Herstellerangaben und wie in Kubbies, M. (1992), High-resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85 beschrieben, durchgeführt.
1.3.2 Proliferationsstudien humaner, peripherer Blutlymphozyten
Periphere Blutlymphozyten (PBL) befinden sich proliferativ in einer Ruhepase (Go-Phase). Die Lymphozyten werden mit PHA (Phytohämagglutinin) stimuliert und beginnen asynchron nach ca. 30-40 h in die S-Phase des ersten Zellzyklus zu proliferieren. Die Lymphozyten werden mit einer Zelldichte von 3-105 Zellen pro ml BrdU-Medium RPMI 1640, 15% FKS, 1% autologes Spendeφlasma (Vollblut 10 min. bei 400xg zentrifugiert), 2-10"5M alpha-Thioglyerol, 8-10"5 M BrdU, 8-10"5 M Desoxycytidin in 24- Well Platten mit 2 ml Medium pro Well eingesät. Das dem Medium zugesetzte alpha-Thioglycerol dient der Proliferationsverbesserung der PBL (Kubbies, M. et al., Lymphokine Res., 9 (1990), Improvement of human lymphocyte proliferation and alteration of IL-2 secretion kinetics by alpha-thioglycerol, 95-101). Desoxycytidin verhindert mögliche Störungen des Nukleotid- stoffwechsels, welche durch BrdU hervorgerufen werden können.
Nach Zugabe des Chemotherapeutikums und der erfindungsgemäßen Substanz bzw. der Vergleichssubstanz GSH werden die Zellen mit 5 μg/ml PHA stimuliert. Bei den Zeitverzögerungsversuchen werden die Testsubstanzen zu einem späteren Zeitpunkt zugegeben.
Die so behandelten Zellen werden 72 h inkubiert, dann bei 250xg, 10 min zentrifugiert und anschließend gefärbt.
1.3.3 Hoechst/PI (Propidiumiodid)-Färbung
Die bei -20°C tiefgefrorenen Proben werden aufgetaut und bei 250xg 10 min zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 μl RNAse A 1000 U/ml resuspendiert. Dies degradiert die RNA, welche sonst von PI mitgefärbt werden würde. Die resuspendierten Zellen werden nun in 1 ml DNA-Färbepuffer 100 mM Tris 7,4, 154 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,2% BSA, 0,1% NP40 mit 1 μg/ml HO33258 aufgenommen und für 15 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert (ca. 0,5 - 1,0- 106 Zellen/ml). Nachfolgend werden 2 μg/ml PI hinzugegeben und nochmals 15 min bei 4°C inkubiert. Die so gefärbten Proben können bei einer Lagerung im Dunkeln, bei 4°C innerhalb von 8 h gemessen werden.
1.3.4 Auswertung
Die Auswertung erfolgt mit Hilfe des Programms MPLUS, wie in Kubbies, M. (1992), High- resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85, beschrieben.
Der Grad der Proliferationshemmung wird aus dem Quotient der Anzahl von proliferieren- den, durch die Anzahl der nicht-proliferierenden Zellen ermittelt (siehe Formeln). Von jedem Ergebnis wird der Wert der Cis-Platin-Kontrolle subtrahiert, so daß diese den y- Achsen Null- Wert darstellt. Die Ergebnisse werden mit dem Normierungsfaktor (für PBL im Versuch "CDDP (Cis-Platin)-Protektion" = 5,5, im Versuch "Zeitverzögerung" = 1,35) so normiert, daß die Kontrolle den relativen Proliferationswert 10 erhält (> 10 = Stimulation; < 10 = Hemmung). Die Größe des Nominierungsfaktors läßt eine Aussage über den prohferativen Zustand der Zellen zu. Je kleiner der Wert, desto mehr Zellen befinden sich nach Ende der Kulturdauer in einem prohferativen Stadium. Bei den PBL zeigt der Wert die spenderabhängige Stimulierbarkeit der Zellen durch PHA an. Je kleiner der Wert desto höher die Anzahl der durch PHA stimulierbaren Zellen.
Formeln:
Synchrone Zellpopulationen Asynchrone Zellpopulationen
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RP: relative Proliferation; CP: für die Cis-Platin-Kontrolle ermittelter Wert; %Rx: Prozent der Zellen in dieser Region, alle Regionen zusammen => 100%. NF: Normierungsfaktor.
1.3.5 Färbung des Knochenmarks
Nach dem Auftauen und der Übernachtkultur in 24-Well-Platten werden die Knochenmarkszellen gepoolt und die Zellzahl der mononukleären Zellen mittels Trypanblau- Vitalfärbung bestimmt. Für die Bestimmung der Autofluoreszenz werden 1-5-105 Zellen abgenommen und die restlichen Zellen gefärbt. Dazu werden die Zellen bei 250xg, 10 min zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand verworfen und die Zellen in 100 μl sterilfiltriertem Färbemedium (Waschmedium mit Antiköφer, Iscove's DMEM; 10% FKS; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin) pro 106 Zellen resuspendiert und 20 min ohne direkte Lichteinstrahlung mit den fluoreszenzmarkierten MAK (Antiköφer: pro 10 Zellen werden 100 μl supplementiert mit 20 μl <CD34>-FITC, 20 μl <CD38>-PE und 5 μl <HLA- DR>-TC) bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wird 10 min bei 250xg zentrifugiert und das Pellet mit Waschmedium gewaschen. Die Zellen werden in einer Dichte von ca. 10 Zellen/ml in Waschmedium aufgenommen und sortiert.
1.3.6 Sortierung der Knochenmarkszellen
Die Sortierung der Zellen erfolgt mit einem Streulicht- und Antiköφer Gates. So wird das erste Gate im Streulichtbild so gesetzt, daß nur lebende Zellen sortiert werden. Mit einer logischen UND Verknüpfung werden im zweiten Schritt im 2-dimensionalen Fluoreszenzbild der FITC- und PE-Fluoreszenzen die Gates so gesetzt, daß die <CD34+> KM-Zellen in <CD38+> oder <CD38 Populationen sortiert werden können. In einem dritten Bild werden die <CD34+> Zellen auf ihre <HLA-DR> Eigenschaften hin analysiert, jedoch nicht nach diesem sortiert.
1.3.7 Digitale Bildanalyse
Die in den 96-Well-Platten mit Rundboden kultivierten KM-Zellen werden mit einem Inversmikroskop und dem Bildanalysesystem Quantimet 570 (Cam-bridge Instruments, Leica) IM (Zeiss) gezählt.
2. Ergebnisse
2.1. Chemoprotektion humaner peripherer Blutlymphozyten
Als Modell für normale, diploide, hämatopoietische Zellen werden humane PBL verwendet. GSH, NAC und L-CYS weisen als solche bei den verwendeten Dosen von 0,1 mg/ml, 035 mg/ml und 1 mg/ml keine proliferationsinhibierende Wirkungen auf. Die gleichzeitige Anwendung von CDDP als Zytostatikum und 0,1 mg/ml GSH, L-CYS bzw. NAC führt nur bei GSH zu einer leichten Protektion mit einer relativen Proliferation von ca. 25% des Kontroll wertes. Bei einer Dosis von 0,5 mg/ml bzw. 1 mg/ml zeigen L-Cys und NAC deutlich bessere CDDP-Protektion als die Vergleichssubstanz GSH. Die protektive Wirkung von L-Cys bei 0,5 mg/ml ist signifikant höher als die von GSH.
Bei einer Konzentration von 1 mg/ml liegen die Werte der relativen Proliferation zwischen 55% (NAC) und 82% (L-CYS) der Kontrollwerte (vgl. beispielhaft Abb. 1). 2.2. Chemoprotektion humaner CD 34+-KnochenmarksprogenitorzeIlen
Um den chemoprotektiven Schutz der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen auf die heterogene Population der CD34+-KM- Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden diese in zwei phänotypische Populationen nämlich in CD38+- und CD38"-KM-Zellen sortiert. Die CD34+/CD38"-Zellpopulation stellt dabei kaum differenzierte, sehr frühe KM- Vorläuferzellen/Stammzellen dar. Die CD34+/CD38+-Zellpopulation enthält hauptsächlich CFU-Zellen (colony forming units) und unter anderem schon Myeloblasten, Erythroblasten und Lympho- blasten (Terstappen, W. M. M., et al., Blood 77 (1991) 1218-1227).
Um eine weitere analytische Differenzierung der sortierten Zellen vornehmen zu können, wird zusätzlich noch das Vorhandensein des aktivierungskorrelierten Histokompatibilitäts- antigen HLA-DR durchflußzytometrisch bestimmt. Der Anteil der CD34+-Zellen an der Gesamtheit der mononukleären Zellen betrug durchschnittlich 1,2% (± 0,3, n=6). Hiervon betrug der Anteil der CD38+, HLA-DR+ Zellen durchschnittlich 73% (±7,0), der CD38+, HLA-DR" Zellen 4% (±1,1), der CD38", HLA-DR+ Zellen 20% (± 5,5) und der CD38", HLA- DR" Zellen 3% (± 0,7).
Es wird eine Zellzahl von 50 oder 100 KM-Zellen in 96- Well Rundbodenplatten sortiert und anschließend L-CYS, NAC bzw. die Vergleichsverbindung GSH und CDDP gleichzeitig ins Kulturmedium gegeben. Bei einer Kultivierungsdauer von 14-16 Tagen erfolgt die Zellzählung mit Hilfe digitaler Bildanalyse und zusätzlich mittels Trypanblau- Vitalfärbung und Zählkammer.
Abb. 2 zeigt die Ergebnisse der Zeilproliferation und Chemoprotektion von Zellen eines repräsentativen KM Spenders. Bei unterschiedlichen Spendern ist im allgemeinen eine leichte Variation der Proliferation zu erkennen.
Ein Vergleich der Zellzahlen am Tag 15 nach Beginn der Behandlung veranschaulicht die unterschiedliche Wirksamkeit der Testsubstanzen am deutlichsten.
KM CD34+ CD38+ Zellen:
Die Vergleichssubstanz GSH kann weder bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml noch bei 1 mg/ml die KM-Zellen vor der zytotoxischen Wirkung von CDDP schützen. Sogar die Gabe von GSH alleine ohne CDDP führt zu einer Reduzierung der Zellzahl auf ca. die Hälfte (0,5 mg/ml GSH) bzw. einer Zellzahl, die nahezu der Negativkontrolle (CDDP) entspricht.
L-CYS hat dagegen bei einer Konzentration von 1 mg/ml eine starke protektive Wirkung. Die Zellzahl bei gleichzeitiger Gabe von CDDP und L-CYS (1 mg/ml) beträgt ca. 70% des Kontrollwertes. L-Cys alleine führt zu keiner signifikanten Reduzierung der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollwert. NAC zeigte dagegen keine protektive Wirkung.
KM CD34+ CD38 Zellen:
Die Vergleichssubstanz GSH zeigt in diesem Fall geringe protektive Wirkung gegenüber CDDP. Bei einer gleichzeitigen Gabe von CDDP und GSH sind lediglich ca. 15% (1 mg/ml GSH) bzw. ca. 25% (0,5 mg/ml GSH) der Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle vorhanden. Die Gabe von GSH alleine ohne CDDP führt zu einer Reduzierung der Zellzahl auf ca. die Hälfte (0,5 mg/ml GSH) bzw. einer Zellzahl, die nahezu der Negativkontrolle (CDDP) entspricht.
Dagegen beträgt die Zellzahl bei einer Gabe von 0,5 mg/ml NAC, 1 mg/ml NAC bzw. 1 mg/ml L-CYS eine erhöhte Zellzahl um 50%o, die gleiche Zellzahl bzw. eine Erhöhung um ca. 100%) im Vergleich zur Kontrolle. Sowohl NAC als auch L-CYS zeigen bei gleichzeitiger Gabe mit CDDP in allen verwendeten Konzentrationen eine starke protektive Wirkung gegenüber CDDP. Bei den unterschiedlichen verwendeten Konzentrationen der Wirksubstanzen werden ca. 70 bis 55% der Zellen vor der zytotoxischen Wirkung des CDDP geschützt.
2.3. Chemoprotektion bei zeitverzögerter Zugabe der Schutzsubstanzen
Mit der zeitverzögerten Zugabe der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen L-CYS und NAC zu CDDP behandeten Zellen konnte gezeigt werden, daß die chemoprotektive Wirkung nicht auf einer direkten Reaktion mit CDDP im Kulturmedium beruht (vgl. Abb.3).
Bei den getesteten Knochenmarkszellen ist schon bei den Substanzkontrollen eine starke Wachstumsverbesserung durch L-CYS zu beobachten, während GSH und NAC auf die CD34+ KM-Progenitorzellen inhibierend wirken. Bei der Zugabe von GSH und NAC ist nur ein leichter Schutz der Zellen beim 0 h Wert erkennbar und bei 14 h ist kein signifikanter Schutz im Vergleich zu der CDDP Kontrolle erkennbar. L-CYS zeigt dagegen bei 0 h, 1 h und 4 h eine gute Schutzwirkung (noch ca. 60% der Zellzahl der Kontrolle bei einer Zugabe nach 4 h). Selbst bei einer L-CYS Gabe nach 14 h können noch ca. 25% der Zellen vor der zytotoxischen Wirkung von CDDP geschützt werden.
Tabelle 3 Zusammenfassung der chemoprotektiven Effekte der Testsubstanzen
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* kein Gegenstand der Erfindung ++ guter bis vollständiger Schutz + leichter Schutz — kein Schutz
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Untersuchungen nochmals zusammengefaßt. Daraus ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen NAC und L-CYS sowohl proliferationssteigemde als auch chemoprotektive Eigenschaften bei der Behandlung von KM-Zellen und peripheren Blutlymphozyten (PBL) zeigen.
Es zeigt sich weiterhin eine Überlegenheit in der proliferationssteigernden und chemoprotektiven Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen NAC und L-CYS im Vergleich zu der aus dem Stand der Technik bekannten Substanz GSH.
Referenzliste
Civin, C. L, Csore, S.D., J. Hematotherapy 2 (1993) 137-144
Kubbies, M. (1992), High-resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85
Kubbies, M. et al., Lymphokine Res., 9 (1990)
Kubbies, M., et al., Br. J. Cancer 64 (1991) 847-849
Terstappen, W. M. M., et al., Blood 77 (1991) 1218-1227
WO 98/07829

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie eine Chemotherapie umfaßt.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie die Verabreichung eines Zytostatikums aus der Gruppe der Alkylierungsmittel, insbesondere der DNA-Crosslinker umfasst.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zytostatikum Cis- Platin oder/und Carbo-Platin verwendet.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung L-Cystein oder/und N-Acetyl-L-Cystein als Wirkstoff enthält.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie eine extrakoφoreale Behandlung von Zellen umfaßt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Cis-Platin oder/und Carbo-Platin in einer Konzentration von 0,3 bis 30 μg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 4 mg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt wird.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff L-Cystein in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 3 mg/ml, vorzugsweise von 0,1 mg/ml bis 1,5 mg/ml, besonders bevorzugt 0,2 mg/ml bis 1 mg/ml eingesetzt wird.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff N-Acetyl-L- Cystein in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 4 mg/ml, vorzugsweise von 0,5 mg/ml bis 2 mg/ml am meisten bevorzugt von 0,9 mg/ml bis 1,5 mg/ml eingesetzt wird.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einer Temperatur von 20°C bis 42°C, vorzugsweise bei 37°C erfolgt.
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnden Zellen ausgewählt werden aus peripheren Blutlymphozyten, Rnochenmarkszellen, Subpopulationen davon oder/und hämatopoietischen Stammzellen, vorzugsweise aus Knochenmark.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnden Zellen aus einem humanen Patienten mit einer malignen Erkrankung stammen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen nach der Behandlung dem Patienten reimplantiert werden.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung unter sterilen Bedingungen in einem oder mehreren flexiblen Plastikgefäßen durchgeführt wird.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die extrakoφoreale Behandlung weiterhin gentherapeutische Verfahrensschritte umfaßt. .
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die gentherapeutischen Verfahrensschritte eine Transduktion der Zellen umfassen.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit viralen Vektoren transduziert werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die gentherapeutischen Verfahrensschritte eine Stimulierung oder/und Kultivierung der Zellen umfassen.
20. Extrakoφoreales Verfahren zur selektiven Protektion von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß vor, während oder/und nach der Therapie der Zellen L-Cystein oder/und ein Derivat davon zugegeben wird.
21. Verfahren zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in einem Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Lebewesen eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend L- Cystein oder/und Derivate davon in einer für die selektive Protektion nichtmaligner Zellen wirksamen Menge verabreicht.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366723A (en) * 1993-03-05 1994-11-22 Istvan Tulok Method of alleviating toxicity originating from treatment with anticancer platinum compounds
WO1996026643A1 (en) * 1995-02-28 1996-09-06 Purdue Research Foundation Thiol activation of cytoxic agents and root formation stimulation
WO1998036773A1 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Yale University Therapeutic uses for antioxidants

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366723A (en) * 1993-03-05 1994-11-22 Istvan Tulok Method of alleviating toxicity originating from treatment with anticancer platinum compounds
WO1996026643A1 (en) * 1995-02-28 1996-09-06 Purdue Research Foundation Thiol activation of cytoxic agents and root formation stimulation
WO1998036773A1 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Yale University Therapeutic uses for antioxidants

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JACOMINO M ET AL: "Use of amphotropic retroviral vectors for gene transfer in human colon carcinoma cells." HUMAN GENE THERAPY, (1997 MAY 1) 8 (7) 835-41. JOURNAL CODE: A12. ISSN: 1043-0342., XP002083103 United States *
LOEHRER P.J. ET AL: "Salvage therapy in recurrent germ cell cancer: Ifosfamide and cisplatin plus either vinblastine or etoposide." ANN. INTERN. MED., (1988) 109/7 (540-546). ISSN: 0003-4819 CODEN: AIMEAS, XP002083105 United States *
MARTINEZ ET AL.: "N-acetylcysteine as chemoprotectant in cancer chemotherapy" THE LANCET, Bd. 338, Nr. 8761, 1991, Seite 249 XP002083106 *
MAURER H R ET AL: "Cytoprotection by somatostatin of normal and malignant clonogenic cells against the in vitro cytotoxicity of bischloroethylnitrosourea (BCNU)." ARZNEIMITTEL-FORSCHUNG, (1984) 34 (9) 939-43. JOURNAL CODE: 91U. ISSN: 0004-4172., XP002083101 GERMANY, WEST: Germany, Federal Republic of *
MAYER, MARGOT ET AL: "N-acetyl-L-cysteine is a pluripotent protector against cell death and enhancer of trophic factor-mediated cell survival in vitro" PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A. (1994), 91(16), 7496-500 CODEN: PNASA6;ISSN: 0027-8424, XP002083107 *
MCLELLAN, LESLEY I. ET AL: "Uptake and distribution of N-acetylcysteine in mice: tissue-specific effects on glutathione concentrations" CARCINOGENESIS (1995), 16(9), 2099-106 CODEN: CRNGDP;ISSN: 0143-3334, XP002083100 *
MUNSHI N.C. ET AL: "Comparison of N-acetylcysteine and mesna as uroprotectors with ifosfamide combination chemotherapy in refractory germ cell tumors." INVEST. NEW DRUGS, (1992) 10/3 (159-163). ISSN: 0167-6997 CODEN: INNDDK, XP002083104 United States *
WEIJL N.I. ET AL: "Free radicals and antioxidants in chemotherapy-induced toxicity." CANCER TREATMENT REVIEWS, (1997) 23/4 (209-240). REFS: 264 ISSN: 0305-7372 CODEN: CTREDJ, XP002083102 United Kingdom *

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