WO1999004777A1

WO1999004777A1 - Carcinostatiques

Info

Publication number: WO1999004777A1
Application number: PCT/JP1998/003223
Authority: WO
Inventors: Eiji Kobayashi; Nobuto Koyama; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 1999-02-04
Also published as: EP1018336A4; CN1261272A; EA200000163A1; EA002290B1; KR20010022050A; US6326405B1; EP1018336A1; CN1126538C; CA2291781A1

Description

明細書

制がん剤 - 発明の属する技術分野

本発明は、制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する特定の化合物を有効成分とする医薬用製剤に関する。

従来の技術

従来、臨床上の療法に用いられている薬物はアルキル化剤、代謝阻害剤、植物アルカロイド等の制がん剤、抗生物質、免疫促進剤、免疫調節剤など多岐にわたつているが、これらの薬物療法はいまだ完成したとは言いがたい。

これらのうち、天然物由来であるプロスタグランジンの中で、シクロペンテノン環を有するプロスタグランジン A及び J類が D N A合成を抑制することにより、安全性の高い制がん剤としての可能性が報告され、それらの各種誘導体が合成されている（特開昭 6 2— 9 6 4 3 8号公報参照）。

また近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosi s 、ァポプトーシスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。

このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死であると考えられている。すなわち何らかの外部的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化されることによりプログラム死タンパク質が生合成され、またある場合には不活性型として細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。こうして生成したプログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることができれば、不要若しくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。

発明が解決しようとする課題

本発明の目的は、 5員環に α， |3—不飽和カルボ二ル基を有する化合物を有効成分とする制がん剤及びアポトーシス誘発剤を提供することにある。

課題を解決するための手段本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討した結果、制がん作用、アポト一シス誘発作用等を有する化合物を見出し、本発明を完成させた。

本発明の第 1の発明は下記式〔 I〕で表される 4—シク口ペンテン（ c y c 1 o p e n t e n e) — 1 , 3—ジオン（ d i o n e ) 、及ぴノ又は下記式〔II〕で表される 4ーヒドロキシ（h y d r o x y) — 2—シク口ペンテノン（ c y c 1 o p e n t e n o n e) を有効成分とする制がん剤に関する。

〔 I〕

〔Π〕

O H

本発明の第 2の発明は上記式〔 I〕で表される 4—シクロペンテン— 1 , 3— ジオン、及ぴ又は下記式〔II〕で表される 4ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノンを有効成分とするアポトーシス誘発剤に関する。

発明の実施の形態

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明において使用する式〔 I〕で表される 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、式〔II〕で表される 4ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノンはそれぞれ公知の化合物であり、公知の方法で製造することができ、また市販の化合物を使用することができる。

4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオンはドピユイ（de Puy, G. H. )らの方法〔ジャーナルォブアメリカンケミカルソサイエティ（J. Am. Chem. Soc -)、第 82卷、第 6 3 1頁、第 2909頁（1 960) 〕、ミリノフ（Mirinov, V. A.) らの方法〔ケミカルアブストラクッ（Chemical Abstracts) 、第 73 - 卷、 1 8 1 78 e (1 973) 〕、又はキルシュケ（Kirschke) らの方法〔ジェルナ一ノレフューノレプラクティッシェへミー（J. Prakt. Chem.)、第 3 1 7 卷、第 807頁（1 9 75) 〕によって合成してもよいし、市販品、例えばアルドリツチ社製品（1 6, 1 68 - 3) を使用してもよレヽ。

4ーヒドロキシ一 2—シク口ペンテノンは 4ーシク口ペンテン一 1， 3—ジォンを塩化セリゥム（III)又は水素化ホウ素ナトリゥムで還元することによって得られる。公知の合成法として、タナカ（Tanaka, T. ) らの方法〔テトラへドロン (Tetrahedron)、第 32卷、第 1 7 1 3頁（1 9 76) 〕、ナラ（Nara, . ) らの方法〔テトラへドロン、第 36卷、第 3 1 6 1頁（ 1 9 80) 〕、及びジル（ Gill, . ) らの方法〔オーストラリアンジャーナルォブケミストリー（Au st. J. Chem. ) 、第 34卷、第 2587頁（1 98 1) 〕が挙げられる。 4ーヒドロキシ— 2—シクロペンテノンは（R) —体、（S) —体、及ぴそれらの混合物のいずれを使用してもよい。

4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4—ヒドロキシー 2—シクロペンテノンは例えばヒト前骨髄性白血病細胞 HL— 60、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞 MO L T— 3、肺がん細胞 A— 549、 S V 40形質転換肺細胞 W I— 38 V A 1 3、肝がん細胞 H e p G 2、結腸がん細胞 H CT 1 1 6、ヒト結腸がん細胞 SW480、ヒト結腸がん細胞 W i D r、胃がん細胞 AGS、ミエローマ細胞等のがん細胞に細胞増殖抑制作用、制がん活性を有し、これらの化合物は制がん剤の有効成分として使用することができる。また、これらの化合物はこれらのがん細胞に対するアポトーシス誘発作用を有する。本発明に使用する化合物のがん細胞増殖抑制作用機作は本発明をなんら制限するものではないが、例えばがん細胞に対するアポトーシス誘発作用、トポイソメラーゼ阻害作用もその作用機作に包含される。

本発明の制がん剤は、制がん作用を有する 4—シクロペンテン一 1 , 3—ジォン、及び Z又は 4ーヒドロキシー 2—シクロペンテノンを有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば製造することができる。制がん剤の製造は一般的には、これらの化合物の少なくとも一つを薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。

医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。

一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分である 4ーシクロペンテン一 1 ， 3—ジオン、及び/又は 4ーヒドロキシー 2—シクロペンテノンを希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコーノレ、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。

本発明の制がん剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される 4ーシクロペンテン— 1 ， 3—ジオン、及び又は 4—ヒドロキシ一 2—シク口ペンテノンの量が成人 1 日当り 0 . l ju g 〜 5 m g / k g である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

本発明のアポトーシス誘発剤は、アポトーシス誘発性を有する 4—シク口ペン- テン一 1， 3—ジオン、及び Z又は 4—ヒドロキシー 2—シクロペンテノンを有効成分とし、これを上記制がん剤に準じ、製剤化すれば製造することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。

アポトーシス誘発剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及ぴこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される 4ーシクロペンテン一 1 , 3—ジオン、及ぴ Z 又は 4—ヒドロキシ一 2—シク口ペンテノンの量が成人 1 日当り 0 . l g〜2 m g Z k gである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

本発明のアポトーシス誘発剤は、プログラム死タンパク質によるアポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることができ、不要若しくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて有用なものである。

即ち本発明のアポトーシス誘発剤は、自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、がん細胞、ウィルス感染細胞等を排除するのに有効であり、アポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることにより、不要又は有害な細胞を自然の形で生体から排除することができる。本発明のアポト一シス誘発剤が有効な疾患としては、例えば全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病等の自己免疫疾患、リウマチ等である。

本発明のアポトーシス誘発剤はアポトーシス誘発方法に使用することができる。すなわち 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、及び/又は 4ーヒドロキシ— 2—シク口ペンテノンを有効成分として使用することによりアポトーシスを誘発させることができ、該方法はアポトーシス誘発機構の解明、アポトーシス誘発剤、アポトーシス誘発阻害剤のスクリ一ユング等に有用である。

また 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノンはトポイソメラーゼ阻害作用を有する。これらの化合物はいずれも α , β 一不飽和カルボ二ル基を有する化合物である。本発明者らはこのひ， —不飽和カルボ二ル基を有する化合物のトポイソメラーゼ阻害作用を更に究明し、ひ， β 一不飽和カルボ二ル基を有する化合物はトポイソメラーゼに対して強い阻害作用を有することを見出した。すなわち本発明により α， jS—不飽和カルボ二ル基を有する化合物を有効成分として含有するトポイソメラーゼ阻害剤も提供される。該トポイソメラーゼ阻害剤に使用する α， β一不飽和カルボ二ル基を有する化合物としては特に限定は無く、 4—シクロペンテン一 1 , 3—ジオン、 4—ヒドロキシー 2—シクロペンテノンの他、マレイミド、 4 ， 5—ジヒドロキシー 2—シクロペンテン一 1 一オン、下記式〔I I I〕で表される 4一 t —ブチルシクロペンテノンエーテル等が例示される。

〔I II〕

上記トポイソメラーゼ阻害剤は、ひ， /3—不飽和カルボ二ル基を有する化合物を有効成分とし、これを上記制がん剤に準じ、製剤化することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。上記トポイソメラーゼ阻害剤は正常細胞では分裂期のみに一過性に発現するが、細胞のがん化により全細胞周期を通じて高発現となるトポィソメラーゼ Πを特異的に阻害し、トポィソメラーゼ Πに対する選択性の高い阻害剤として有用である。またトポイソメラーゼ Πの特異的阻害作用を介した制がん剤として有用である。また該トポイソメラーゼ阻害剤を使用するトポィソメラーゼ阻害方法は生化学研究や制がん剤のスクリーニング等に有用である。本発明で使用する 4—シクロペンテン一 1 , 3—ジオン、 4—ヒドロキシー 2 ーシクロペンテノンは制がん作用、がん細胞増殖抑制作用、異常細胞の増殖抑制 - 作用、アポトーシス誘発作用、トポイソメラーゼ阻害作用、滑膜細胞抑制作用等の多様な生理活性を有する化合物であり、これらの化合物を有効成分とする医薬用製剤としては、制がん剤、アポト一シス誘発剤、トポィソメラーゼ阻害剤のほか、がん細胞増殖抑制剤、異常細胞の増殖抑制剤、滑膜細胞抑制剤等を提供することができる。

本発明で使用する 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4—ヒドロキシ一 2 —シク口ペンテノンはがん細胞増殖抑制作用、アポトーシス誘発作用等を有し、これらの化合物から選択される少なくとも一つの化合物を含有、希釈又は添加してなる食品又は飲料は制がん性、アポト一シス誘発性の食品又は飲料として有用である。

本発明の食品又は飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に制がん作用、アポトーシス誘発作用を有する 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、及び/又は 4一ヒドロキシー 2—シク口ペンテノンが含有されていれば良い。

本発明に使用する 4—シクロペンテン— 1， 3—ジオンは 1 O m g Z k gでマウスに単回経口投与しても死亡例は認められない。また 4ーヒドロキシー 2ーシク口ペンテノンは 1 0 O m g Z k gでマウスに単回経口投与しても死亡例は認められない。更に 4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1 一オン.、 4 - t —ブチシク口ペンテノンエーテノレはそれぞれ 1 0 0 m g / k gでマウスに単回経口投与しても死亡例は認められない。

実施例

以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1

( 1 ) 4ーシクロペンテン一 1 , 3—ジオン又は 4ーヒドロキシー 2—シクロペンテノンの 2 5 0 mM、 1 2 5 mM、 6 2. 5 mM、 3 1. 3 mM、 1 5. 6 mM、 7. 8 1 mM、 3. 9 1 mM、 1. 9 5 mM、 9 7 7 /i M、 4 8 8 μ M、 - 2 4 4 ί M_s 1 2 2 μΜ、 6 1. 0 / M、 3 0. 5 μ Μ、又は 1 5. 3 μ Μ溶液 ( 7 0 %エタノール水溶液中）、あるいは対照として 7 0 %エタノール水溶液を 1 0 μ 1ずつ 9 6穴マイクロタイタープレートの各ゥエルに添加し、風乾した。前骨髄性白血病細胞株 H L— 6 0 (AT C C C C L一 2 4 0) を 5 6°C、 3 0 分間処理した牛胎児血清（ J RH社製）を 1 0 %含むR PM 1 1 6 4 0培地（バィォウイタカ一社製）に 1 X 1 0⁵ 個 Zm 1 となるように懸濁し、 1 0 0 μ 1ずつ上記マイクロタイタ一プレートの各ゥエルに分注し、 5 %C0₂ 存在下 3 7°C で 4 8時間培養した。 5 mgZm lの 3— (4， 5—ジメチルチアゾール— 2— ィル）一 2， 5—ジフエニルテトラゾリゥムブロミド（MT T ; シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液 1 0 μ 1 を加えて更に 4時間培養を続けた後、顕微鏡で細胞の生育状態を観察した。また、 0. 0 4 Ν H C 1含有 2—プロパノール 1 0 0 μ 1を加えてよくかくはんし、 5 9 0 nmにおける吸光度を測定した。

その結果、 3 0. 5 μ Μ 4ーシクロペンテン一 1 , 3—ジオン添加区分（終濃度 3. 0 5 μ Μ) 、 1 2 2 μ Μ 4ーヒドロキシー 2—シクロペンテノン添加区分（終濃度 1 2. 2 μ Μ) において H L— 6 0細胞の増殖が完全に抑制され、またアポトーシス小体の形成が見られた。これらよりも高濃度を添加した区分では細胞増殖が見られず、低濃度で添加した区分では対照の 7 0 %ェタノ一ル水溶液添加区分と同等の細胞増殖が見られた。

( 2) 1 0 %ゥシ胎児血清を含む R Ρ Μ I 1 6 4 0培地にて 3 7 °Cで培養した HL - 6 0 (AT C C C C L— 2 4 0) を R PM I 1 6 4 0培地にて 2. 5 X 1 0⁵ 個 Zm 1 となるように懸濁した。

この懸濁液 5 m lに対し、 0. 0 5mM、 0. 5m、 5mM、 5 0mMの 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、 0. 0 5mM、 0. 5 mM、 5 mM、 5 0mMの 4ーヒドロキシ一 2—シク口ペンテノンのそれぞれ 7 0 %エタノール溶液を 1 0 μ 1ずつ添加し、 3 7°C、 5 %二酸化炭素存在下で、 2 4時間培養した。

培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、最終濃度 1 以上の 4ーシクロペンテン一 1 , 3—ジオン、最終濃度 1 0 以上の 4―ヒドロキシー 2—シクロペンテノン添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお対照の 70%エタノール溶液 1 0 μ 1添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。

次いで、上記と同様の方法で 24時間と 48時間培養した細胞を用い、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール（秀潤社） 1 29— 1 30ページ記載の方法で F AC S c a nを用いたアポト一シス細胞の測定、ィォマニュアル UPシリーズ最新アポトーシス実験法（羊土社） 6 1— 6 3ぺージ記載の方法で DNAの断片化の解析を行った。その結果、最終濃度 Ι μΜ以上の 4—シク口ペンテン一 1 , 3—ジオン、最終濃度 ΙΟμΜ以上の 4―ヒドロキシ一 2—シクロペンテノン添加培養細胞にアポトーシス細胞を、 1 の 4—シク口ペンテン一 1 , 3—ジオン、 10μ Μの 4ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノン添加培養細胞に DN Αの断片化を確認した。なお対照の 70%エタノール溶液 1 0 μ 1添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。

(3) 実施例 1一（2) と同様の方法で 24時間培養した細胞を一部サンプリングし、 0. 4% トリパンブルーで染色後、光学顕微鏡で観察し、染色されていない生細胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、生残率が 50%になる 4ーシク口ペンテン一 1， 3—ジオン及び 4―ヒドロキシー 2—シク口ペンテノンの濃度（生残率 ₅。/ζΜ) を求め、表 1に示した。

表 1

以上より、 4ーシクロペンテン一 1 , 3—ジオン及び 4—ヒドロキシ一 2—シクロペンテノンは上記濃度でがん細胞増殖抑制作用及びアポトーシス誘発作用を示すことが明らかとなった。 - 実施例 2

( 1 ) 1 0 gの D—グルクロン酸（シグマ社製 G 5 2 6 9) を 1 リットルの水に溶解し、 1 2 1°Cで 4時間加熟した後約 1 Om 1になるまで減圧下濃縮した。これに酢酸ブチル：酢酸：水 == 3 : 2 : 2混合液の上層 4 0 m 1 を加えて混合後、遠心によって得た上清を減圧下約 1 Om lまで濃縮した。

上記抽出液をカラムクロマトグラフィー用シリ力ゲル BW— 3 0 0 S P (2 X 2 8 c m, 富士シリシァ化学社製）にアプライし、酢酸ブチル：酢酸：水 = 3 ： 2 ： 2の上層を溶離液としてコンプレッサーで 0. 2 k gZc m² に加圧し、毎分 5m 1の流速で分離を行った。 1画分当り 1 Om 1になるようにフラクシヨネーションを行い、各画分の一部をとつて薄層クロマトグラフィ一で分析したところ 6 1番から 8 0番までの画分に高純度の 4 , 5—ジヒドロキシ一 2ーシクロぺンテノン一 1—オンが含まれていた。これらの画分を集めて減圧下濃縮した後 4 Om 1 のクロ口ホルムで抽出し、抽出液を減圧下濃縮することによって 1 0 0m gの 4, 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテノン一 1—オンを得た。

(2) 44m gの 4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテノン一 1 一オンと 2 8 7 m gの t一ブチル（t- butyl ) 2, 2 , 2— トリクロロアセトイミデート

(trichloroacetimidate) (ァノレ.ドリツチ社製、 3 6, 4 7 8 - 9) をァノレゴン気流下 2. 5 m 1のジクロロメタンに溶解した。これに 2 8 1 111 1 三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体ジクロロメタン溶液 l m 1をかくはんしながら徐々に添加した。室温で 8時間かくはん後、減圧下濃縮し、展開溶媒としてクロ口ホノレム：メタノ一ノレ = 1 9 : 1を用いたシリカゲノレ薄層クロマトグラフィ一により 4一 t—ブチノレシク口ペンテノンエーテノレを精製した。 4— tーブチルシク口ペンテノンエーテルの R f 値は 0. 3 5であり、収率は 9. 2%であった。

(3) ひ， i3—不飽和カルボ二ル基を有する化合物として、 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4—ヒドロキシー 2ーシク口ペンテノン、マレイミド（ァノレドリツチ社製品： 1 2 , 9 5 8— 5) 、 4 , 5—ジヒドロキシ一 2—シクロべンテン一 1 —オン、 4— tーブチノレシクロペンテノンエーテノレを用レ、、トポイソメラーゼ阻害活性を下記のように測定した。 - ( i ) トポイソメラーゼ Π [トポジヱン（T o p o G E N) 社製、 2単位

1 ] 2 μ 1 、 1 0倍濃度緩衝液 [0. 5Μ T r i s — HC 1 (p H 8. 0) 、 1. 2M KC 1 、 0. 1 M M g C 1 2 , 5 mM アデノシン三リン酸、 5 mM ジチオスレィトール] 2 1 、 0. 1 % ゥシ血清アルブミン（宝酒造社製） 2 μ 1、蒸留水 1 1 μ 1及び対照の蒸留水又は水で様々な濃度に調製した 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4—ヒドロキシー 2シクロペンテノン、マレイミド、 4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1 —オン、 4— tーブチルシクロペンテノンエーテル 2 μ 1 をそれぞれ混合したものに、 0.

2 5 μ g/ μ 1 p B R 3 2 2 DN Α (宝酒造社製） 1 1 を添加して 3 7 °Cで反応させた。 3 0分間反応後、 1 % ドデシル硫酸ナトリウム、 5 0 % グリセロール、 0. 0 2 % ブロモフエノールブルー水溶液を添加して反応を停止した。

ァガロース L 0 3 (宝酒造社製）と ΤΑΕ緩衝液 [4 0 mM T r i s , 5 m M 酢酸ナトリウム、 1 mM エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（E DTA ) 、酢酸で p H 7. 8に調整] を用いて作製した 1 % ァガロースゲルに上記反応液 2 0 μ 1をアプライし、 T A Ε緩衝液中で電気泳動を行った。泳動後、ゲルを 1 μ g/m l ェチジゥムブロミド水溶液に浸漬し、紫外線を照射して DN A電気泳動パターンを観察した。なお、水添加の対照では DN Aが超らせん型から弛緩型に完全に変化するが、トポィソメラーゼ Π活性が阻害されると超らせん型から弛緩型への変化が一部又は完全に阻害される。

その結果、水添加の対照では D N Aが超らせん型から弛緩型に完全に変化した力 5 0 /ζΜ以上の 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、 Ι Ο Ο μ Μ以上の 4 ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノン、 1 Μ以上のマレイミド、 5 0 μ Μ以上の 4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1 —オン、 5 0 0 ju M以上の 4 - t一プチルシク口ペンテノンエーテルによって DN Aの超らせん型から弛緩型への変化が一部又は完全に阻害され、 a , j3—不飽和カルボ二ル基を有する化合物のトポィソメラーゼ Π阻害活性が確認された。

( i i ) 実施例 2— (3) ― ( i ) と同様の方法で各化合物のトポイソメラー— ゼ I阻害活性を測定した。但し、トポイソメラーゼ Πの代わりにトポイソメラーゼ I [トポジェン社製、 0. 0 1単位 Z μ 1 ] 、 1 0倍濃度緩衝液として 1 00 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 9) 、 1 0 m EDT A、 1 mM スペルミジン、 50% グリセロールを用いた。

その結果、水添加の対照では D N Aが超らせん型から弛緩型に完全に変化した、 1 000 μΜ以上の 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 1 000 μ Μ以上の 4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1一オン、 Ι Ο Ο Ο μΜ以上のマレイミドによって DNAの超らせん型から弛緩型への変化が一部阻害され、そのトポイソメラーゼ I阻害活性が確認された。

以上、正常細胞では分裂期のみに一過的に発現しているが、がん化により全細胞周期を通じて高発現するようになるトポイソメラーゼ Πに対し、《， i3—不飽和カルボ二ル基を有する化合物は特異的な阻害活性を示した。

実施例 3

マウス固形がん Me t hA (2 X 1 0⁶ 細胞 Zマウス）を 8週齢の雌性 B A L BZcマウス（体重約 20 g) の背部皮下に移植した。その後、引き続いて同じ箇所に 5日間連続して 4—ヒドロキシー 2—シクロペンテノン（0. 3mgZk g / d a y, lmg/k g/d a y) 、 4ーシクロペンテン一 1 , 3—シオン ( 0. 03mgZk gZd a y、 0. l mg/k g/d a y) をそれぞれ皮下注射した。一方対照群には生理的食塩水を同様に皮下注射した。がん細胞移植後 7日目にマウス背部に形成されたがん組織の長径及び短径を計測し、腫瘍サイズ（m m³) を長径 X (短径） ²ノ2より算出した。なお試験は一群 8匹で行った。

結果を表 2に示す。表 2に示すように 4—ヒドロキシ一 2—シクロペンテノン及ぴ 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオンは制がん活性を示した。表 2

3 \

群投与量腫瘍サイズ（ mm 抑制率（％) mg/kg/aay 平均土 S E 対照群 306 土 3 7

4ーヒドロキシー 1 1 6 1 土 6 7 47

2—シク口ペンテノン

投与群 0. 3 1 65 土 6 1 46

4ーシク口ペンテン 0. 1 1 5 1 土 6 9 5 1

— 1 , 3—ジオン

投与群 0. 03 1 50 士 6 2 5 1

実施例 4

注射剤

( 1 ) 生理食塩水（日本薬局方収蔵品）に 4ーシクロペンテノン— 1， 3—ジオンを 0. 1 %濃度で加え、注射剤を作製した。

(2) 生理食塩水（前記と同じ）に 4—ヒドロキシ _ 2—シクロペンテノン及びグリシルリチン酸をそれぞれ 0. 2%及ぴ 0. 5%濃度で加え、注射剤を作製した。

実施例 5

(1) 4—ヒドロキシ一 2—シクロペンテノン 1 m gと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。

(2) 4—シクロペンテノン一 1， 3—ジオン 0. l mg、グリシルリチン酸ジカリゥム 1 Omg及び微結晶性セルロースの適量を含有する錠剤を調製し

Claims

、糖衣を施して、錠剤を作製した。発明の効果本発明により 4—シクロペンテン一 1， 3—ジオン、 4ーヒドロキシー 2—シクロペンテノンより選択される制がん作用、アポトーシス誘発作用を有する薬剤が提供される。またこれらの化合物を含有、添加及び又は希釈してなる食品又は飲料は制がん性、アポトーシス誘発性の食品又は飲料として有用である。更に当該化合物を含有するアポトーシス誘発剤を使用することにより、アポト一シス誘発解明の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発が可能となる。本発明の薬剤はアポトーシス誘発方法に使用することができ、この用途においても有用である。更に本発明により α， β一不飽和カルボ二ル基を有する化合物を有効成分として含有するトポイソメラーゼ Π特異的阻害剤が提供され、該阻害剤は制がん剤としも有用であり、また本発明により提供される a , jS—不飽和カルボ二ル基を有する化合物を有効成分として使用するトポイソメラーゼ阻害方法は生化学研究や制がん剤のスクリ一二ング等にも有用である。請求の範囲

1. 下記式〔 I〕で表される 4ーシクロペンテン _ 1， 3—ジオン、及び Z又は下記式〔II〕で表される 4—ヒドロキシー 2—シクロペンテノンを有効成分とする制がん剤。

〔 I〕

〔II〕

O H

2. 下記式〔 I〕で表される 4ーシクロペンテン一 1， 3—ジオン、及び又は下記式〔II〕で表される 4ーヒドロキシ一 2—シクロペンテノンを有効成分とするアポト一シス誘発剤。

〔 I〕

〔II〕

O H