WO1998059052A1 - Adn recombinante que codifica para epitopos del alergeno profilina util para el diagnostico y tratamiento de alergias - Google Patents

Adn recombinante que codifica para epitopos del alergeno profilina util para el diagnostico y tratamiento de alergias Download PDF

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WO1998059052A1
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Ricardo Palacios Pelaez
Jorge Martinez Quesada
Alberto Martinez Garate
Juan Andrés ASTURIAS ORTEGA
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Industrial Farmaceutica Y De Especialidades, S.A.
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    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Definitions

  • the present invention falls within the field of diagnosis and treatment of allergies, particularly pollen allergies. Specifically, it deals with the profilin honeycomb, present in a large number of plant pollens, and causing numerous cross reactions between pollens and with respect to plant-based foods.
  • recombinant DNA molecules are obtained encoding a polypeptide having at least one epitope of the profilin allergen, from a series of plants belonging to the groups of herbs, weeds and non-phage trees. In particular to Cynodon dactylon plants.
  • Phleum pratense Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea, and Mercurialis annua. All of them are plants with wide distribution in the Iberian Peninsula and the pollens produced by them are among the etiological agents of the most important allergic diseases in this geographical area. Production methods of these recombinant polypeptides in heterologous expression systems are also described. Efficient methods for the purification of profilin are also described, whether produced as a soluble protein or as an unstable protein. STATE OF THE PRIOR ART OF THE INVENTION
  • Type I allergies are a major health problem in industrialized countries. These types of allergies are caused by the formation of IgE antibodies against airborne antigens. These IgE antibodies interact with mast cells and basophils, releasing biological mediators such as histamine, producing allergic rhinitis, conjunctivitis and bronchial asthma. quial in 20% of the population [(1) Miyamoto, T. (1991). Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, and F. Michel, eds. (New Jersey, USA: The Part enon Publishing Group-Carnforth), pp. 343-347].
  • immunotherapy This method basically consists of modulating the immune response in the patient through regular administration and in increasing concentrations of the proteins that produce the allergy (allergenic extracts).
  • the methods of diagnosis of allergic diseases depend on the availability of pure allergens. Allergenic extracts isolated from natural sources are complex mixtures of proteins and other molecules. Its composition, and therefore allergenicity, depends on the material used, which varies according to environmental conditions, in the case of pollens, the maturation phase, in the case of fungi, mite growth conditions, etc. .
  • Some extracts may even contain an insufficient concentration of major allergens, may be contaminated with unwanted components, against which the patient is not allergic, or both.
  • important allergens can be lost during extraction due to proteases, and the biochemical processes of allergen purification are laborious and expensive.
  • great attention has been given to recombinant DNA technology as a viable alternative for the production of recombinant allergens, thus facilitating its characterization at the molecular level, and its use in diagnosis and therapy [(2) Scheiner, 0. and Kraft, D. (1995). Basic and practical aspects or recombinant allergens. Allergy 50, 384-391].
  • Recombinant allergens can be produced on a large scale in fermentation tanks, using microbial expression systems.
  • Profilins constitute a ubiquitous family of proteins involved in actin binding, and are found in the cytoskeleton of eukaryotic organisms [(4) Haarer, B. and Brown, S. (1990). Structure and function of profilin. Cell Motility and the Cytoskeleton 17, 71-74; and (5) Theriot, J.A. and Mitchison, T.J. (1993). The three faces of profilin. Cell 75, 835-838]. Other additional functions of profilin have been previously reviewed in the literature [(6) Machesky, L. and Pollard, T. (1993). Profilin as a potential mediator of membrane- cytoskeleton communication. TIBS 3, 381-385; and (7) Aderen, A. (1992). Signal transduction and the actin cytoskeleton.
  • Profilins are prominent allergens that can be isolated from tree pollens, herbs and weeds, as well as from some foods [(8) Valenta, R., Duchéne,., Ebner, C, Valent, P., Sillaber, C, Deviller , P., Ferreira, F., Tejkl, M., Edelmann, EL, Kraft, D., and
  • Valenta R., Ebner, H., Kraft, D., and Scheiner, O. (1995). Allergens, IgE, ediators, inflammatory mechanisms. J. Allergy Clin. Immunol 95, 962-969; (10) Valenta, R., Duchéne, M., Pettenburger, K., Sillaber, C, Valent, P., Bettelheim, P., Boothnbach, M., Rumpold, H., Kraft, D., and Scheiner, O. (1991). Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuáis.
  • the SWISS-Prot database contains a large number of sequences coding for profilins, of which only 10 belong to 6 plant species related to allergic processes. These cloned profilins come from Betula verrucosa (birch), called Bet v 2 [(10)], - Triticu aestivum (wheat), cloned three isoforms [(14) Rihs, H., Rozynek, P., May-Taube, K ., Welticke, B., and Baur, X. (1994). Polymerase chain reaction based cDNA cloning of wheat profilin: a potential plant allergen. Int. Arch. Allergy Immunol.
  • the profilin multigene family of maize differential expression of three isoforms. Plant J. 4, 631-641]; Pi ⁇ aseolus vulgaris (bean) [(17) Vidali, L., Pérez, HE, Valdés, V., Noguez, R., Zamudio, F., and Sánchez, F. (1995). Purification, characterization, and cDNA cloning of profilin from Phaseolus vulgaris. Plant Physiol 108, 115-123], and Hordeum vulgare (barley) (EMBL Data Bank accession number: U49505).
  • profilins of the following species: Cynodon dactylon, Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea and Mercurialis annua. These sequences code for polypeptides of about 14 kDa, identified as profilins based on: i) Great similarity with other profilins studied, ii) Reactivity against sera obtained from rabbits immunized with purified profilin to Helianthus annuus homogeneity. iii) Ability to bind poly-L-proline. iv) Reactivity with IgE of sera from patients allergic to profilins. Likewise, results on the cross-reactivity of profilin with common related and non-phylogenetically related allergens are presented. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the invention refers to recombinant DNA molecules encoding epitopes of the prophylactic allergen of Cynodon dactylon, Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea and Mercurial i s annua; and its application for the diagnosis and treatment of allergies. Description of the plants used as raw material
  • the cloning of profilin has been carried out from the pollen of plants such as herbs, weeds or trees.
  • the quality of pollens has been controlled so that they do not contain more than 0.1% of polluting pollens or other parts of the plant or plant fragments.
  • the plants from which pollens come are the following: * The grasses (herbs), belonging to the Gramineae Family, specifically: -Cynodon dactylon, called in English "Bermuda grass", and which belongs to the subfamily Panicoideae and Chlorideae tribe. -Phleum pratense, called "timothy grass” in English, and belongs to the Pooideae subfamily, Festuci formes group and Festuceae tribe.
  • Gene cloning can be performed using various methods [(18) Sa brook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory]: libraries of genomic DNA or complementary DNA, using as vectors: plasmids, plasmids, bacteriophages or cosmids.
  • the PCR technique DNA polymerase chain amplification
  • the detection of the clones that carry the gene of interest can be performed using different techniques: complementation of auxotrophic mutants, immunodetection or enzymatic activity of the expressed protein, radiodetection with radiolabeled oligonucleotide probes, or direct sequencing.
  • the two most direct methods of both stages have been conjugated: cloning by PCR amplification of complementary DNA and direct sequencing of the cloned inserts.
  • enriched messenger RNA was isolated in transcripts with poly (A +) using affinity columns.
  • the first complementary DNA strand was synthesized from the isolated messenger RNA, using reverse transcriptase.
  • the DNA-RNA hybrid obtained was used as a template for the amplification of the corresponding profilin genes.
  • degenerate oligo-nucleotide primers obtained by comparison of the amino acid sequence of all plant profilins described in the "prior art" section, were used as primers.
  • recognition sequences of various restriction endonucleases were added at their ends.
  • the PCR amplification was performed at hybridization temperatures between 42-56 ° C and for 30-35 cycles.
  • the reaction was subjected to electrophoresis in agarose gels (2%) and a band of about 400 base pairs (bp) was isolated from the gel and purified.
  • the purified DNA was digested with the restriction endonucleases BcoRI and HindlII, and ligated to the pBluescript vector (Stratagene, La Jolla, CA), cut with the same enzymes. Competent E. coli DH5a cells were transformed with the ligation mixture and the transformants were selected on LB solid medium plates with ampicillin, X-gal and IPTG. Plasmid DNA from ampicillin-resistant clones, which were white in color, was isolated, and characterized by restriction endonuclease digestion.
  • the inserted DNA whose size corresponded to the expected one, was sequenced by the method of Sanger [(19) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nati Acad. Sci. USA 74, 5463-5467] using fluorescent dideoxynucleotides. Computer analysis of the sequences showed that all sequences encoded for profilin, and that there was a great homology with other described profilins. Expression of cloned genes
  • the profilin gene has been overexpressed to form an unbound protein using the expression vector pKN172 [(20) ay, M., Pope, B., Gooch, J., Hawkins, M., and Weeds , AG (1990). Identification of a region in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9, 4103-4109].
  • the expression in this plasmid is based on the interaction of phage T7 RNA polymerase with a specific phage promoter (flO gene promoter), which is placed in front of the fragment we want to express. he.
  • the expression of T7 RNA polymerase in the E.
  • profilin is based on its ability to bind L-propine chains. Purification was performed in a single step by Sepharose-poly-L-proline column affinity chromatography, as described by Lindberg [(22 Lindberg, U., Schutt, C, Hellsten, E., Tj der, A., and Hult, T. (1988) . The use of poly (L-proline) -Sepharose in the isolation of profilin and profilactin complexes. Biochim. Biophys.
  • Sunflower profilin Helianthus annuus was purified by developmental chromatography developed in two phases.
  • the protein thus purified was identified as profilin by physiological tests (binding with poly-L-proline), biochemical (molecular parameters and amino acid sequence) and immunochemical (SDS-PAGE Immunoblotting).
  • Molecular weights of 15.7 kDa were obtained in SDS-PAGE and 19.1 kDa in SMARTTM chromatography (indicating its monomeric nature), as well as a pl of 4.5-4.4 (three isoforms).
  • the amino acid composition and partial sequence of the purified protein was determined.
  • this invention provides recombinant DNA coding for profilin from a large number of plants, both herbs, weeds and trees. It also provides a microbial expression system (E. coli) for obtaining large amounts of profilin. This expression can be performed in other microbial systems
  • the profilin produced can be processed by three different methods, to finally be purified by a single step of affinity chromatography in Sepharose-polyproline.
  • the profilin purified by this method does not differ in its IgE binding properties from natural profilins. The purification is also described. tion and complete characterization of sunflower profilin (Helianthus annuus).
  • the diagnostic methods both in vitro and in vivo, that are currently used are based on the use of allergen extracts. Due to the difficulty of obtaining reproducible lots of allergenic extracts, since some minor allergens, such as profilin are underrepresented or partially degraded [(23) Susani, M., Jertschin, P., Dolecek, C., Sperr,., Valent, P., Ebner, C, Kraft, D., Valenta, R., and Scheiner, O. (1995). High level expression of birch pollen profilin (Bet v 2) in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant allergen. Biochem Biophys Res. Commun.
  • Recombinant DNAs encoding the prophylactic allergens object of the present invention can serve not only to obtain recombinant allergens useful for the diagnosis and conventional treatment of allergies, but also for two potential uses: a) Production of peptides from said allergens, which constitute T cell epitopes, and therefore, they can be vaccines with energizing activity (Th2 response suppressor). b) Obtaining mutant recombinant isoforms that do not give rise to IgE binding, and therefore constitute treatments with reduced capacity to produce adverse effects. DEPOSIT OF THE CEPAS
  • Figure 1 SDS-PAGE stained with Coomassie blue from the purification process of CdPROl profilin from Cynodon dactylon.
  • Lanes 1 and 2 used of E. coli BL21 (DE3) containing pKN172 without insert and with the CdPROl insert, respectively; lanes 3 and 4, insoluble and soluble fractions of the lane 2 sample, respectively; lane 5, fraction not retained in the Sepharose-PLP column; lane 6, purified recombinant profilin as elution of 6M urea from the Sepharose-PLP column; lane 7, purified natural profilin.
  • Figure 2 PAGE stained with Coomassie blue from the purification process of the OePROl profilin from Olea europaea.
  • Lanes 1 and 2 lysate of E. coli BL21 (DE3) containing pKN172 without insert and with the OePROl insert, respectively; lanes 3 and 4, insoluble and soluble fractions of the lane 2 sample, respectively; rail 5, fraction not retained in the Sepharose-PLP column; rail
  • Figure 3 SDS-PAGE stained with purified CdPROl purified profilin from Cy ⁇ odo- ⁇ dactylon. Lanes 1 and 4, recombinant profilin purified by Sepharose-PLP, 3 and 0.5 mg, respectively; lane 2, purified natural profilin, - lane 3, lysate of E. coli BL21 (DE3) containing pKN172 with the CdPROl insert.
  • Figure 4 Cynodon dactylon recombinant profilin immunodetection using polyclonal anti-profilin antibodies. The description of the gel is identical to that described in Figure 1.
  • Figure 5 Olea Europaea recombinant profilin immunodetection using polyclonal anti-profilin antibodies. The description of the gel is identical to that described in Figure 2.
  • Figure 6 Comparison by immunodetection of IgE ractivity from serum of patients allergic to Cynodon dactylon or grasses. Proteins of the Cynodon dactylon (E) extract and purified recombinant profilins (R and P) were transferred and incubated with sera from patients (1-8) allergic to Cynodon dactylon, pool of grass-allergic sera (G) and individuals healthy (C).
  • E Cynodon dactylon
  • R and P purified recombinant profilins
  • FIG. 7 Immunodetection inhibition.
  • Protein extracts (E), purified natural profilin (P) and purified recombinant (R) of Cynodon dactylon were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes. These membranes were incubated with a pool of sera from Cynodon dactylon allergic patients inhibited with 10 mg of recombinant profilin (c) or BSA (b) per ml of serum, or without inhibiting (a).
  • a pool of sera from healthy individuals (c) was used as a control.
  • Figure 8 Simulation of the three-dimensional structure of the PpPR03 profilin of Phleum pratense and location of the different regions in which the proposed antigenic peptides are framed.
  • Figure 9 Structure of the three peptides with greater possibilities of antigenicity. The numbering corresponds to the amino acid sequence in PpPR03 of Phleum pratense.
  • Figure 10 SDS-PAGE of the profilin fraction eluted after affinity chromatography (lane 2), complete sunflower pollen extract (lane 3) and the same extract devoid of the profilin fraction (lane 1).
  • Figure 11 SMART chromatography performed by gel filtration in Superdex 75 PC3.2 / 30 column corresponding to the profilin fraction of Helianthus annuus obtained by affinity chromatography.
  • Figure 12 IEF (pH 3-10) of profilin obtained after gel filtration chromatography.
  • Figure 13 Deduced amino acid sequence (HaPROl, HaPR02, HaPR03, HaPR04, HaPR05 and HaPR06) from Helianthus annuus. The dashes indicate that the sequence is identical to the one shown at the top. The results of partial sequencing of the purified profilin of H. annuus are indicated in bold; the asterisks indicate that the sequence is identical to the one shown at the top.
  • FIG 14 Immunodetection of purified sunflower profilin incubated with a mixture of sera from patients allergic to grass pollen (lane 1), sunflower (lane 2) and Rosacea fruits (lane 3).
  • FIG 15 Immunodetection of birch pollen extract (lane 1) and extracts of apple peel (lane 2), peach (lane 3) and pear (lane 4), incubated with sunflower anti-profilin antiserum.
  • Figure 16 Immunodetection of sunflower pollen extract (lane 1), Phleuw pratense (lane 2), dog dander (lane 3), Judaic parietaria (lane 4), Dermatop- Haceides pteronyssinus (lane 5), Olea europaea (lane) 6), Mercurialis annua (lane 7), When finished at terna ta (lane 8), Aspergillus fumigatus (lane 9), Penicillium notatum (lane 10), and saffron stamens (lane 11), incubated with anti-profilin antiserum from sunflower.
  • MODES OF EMBODIMENT OF THE INVENTION The invention can be understood from the following examples, which should not be considered as limiting it at all.
  • a reaction typically contains between 50-500 mg / ml of DNA in the reaction buffer recommended by the manufacturers (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden; Boehringer-Mannhein, Mannhein, Germany, - Promega). 2 to 5 units of the restriction endonuclease are added for each mg of DNA and the reaction is incubated for 3 hours at the temperatures recommended by the manufacturer. The reaction is stopped by heating at 85 ° C for 10 min, or by phenol extraction followed by precipitation of DNA with ethanol. This technique is also described on pages 5.28 to 5.32 of the reference [(18)].
  • Electrophoresis in agarose gels was performed in a horizontal apparatus, using as a Tris-borate buffer, as described on pages 6.3 to 6.15 of the reference
  • the DNA fragments were stained using 0.5 mg / ml ethidium bromide that was added to the gel.
  • the DNA was visualized by ultraviolet illumination between 300 and 310 nm.
  • E. coli strains DH5a or BL21 (DE3) were used in most of the experiments.
  • the DNA was introduced by the calcium chloride protocol, as described in [(18)], pages 1.76 to 1.84, or by the rubidium chloride method, as described by Hanahan
  • the membrane is then incubated with the antibodies of interest for several hours (these antibodies may come from patients or from immunized animals). Subsequently, the membrane is washed several times with milk / PBS, and incubated with a second commercial antibody, to which an enzyme (for example peroxidase) is coupled.
  • This commercial antibody will be anti-IgG, in case we have used an immunized animal, or anti-IgE, if the serum comes from humans.
  • the membrane is again washed in PBS, and stained with 0.06% 4-chloro-1-naphthol in PBS with 0.01% H 2 0 2 , at room temperature for 30 min. The reaction is stopped with distilled water.
  • the first step in the purification of profilin was performed by affinity chromatography on the Sepharose column activated with CNBr and coupled to PLP, according to Lindberg et al. [(22)].
  • This method in summary, consists of moistening 2 g of Sepharose 4B activated with CNBr (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) in 100 ml of HC1 lmM for 15 minutes. Then, the resin was washed through a filter funnel (porosity G3) to which 100 ml of HC1 lmM was added four consecutive times.
  • the resulting gel (about 7 ml) was resuspended in the buffer (KHC0 3 , 0.1 M, pH 8.3, KC1 0.5 M); then, 30 mg of Poly-L-proline (PLP, Mr 5000, INC Biochemicals, Aurora, OH, USA) was dissolved in 2 ml of distilled water for 12 h. The non-soluble material was removed and the supernatant added to the resin suspended in the coupling buffer. The mixture was left at room temperature for 2 h. The blocking of the active groups was performed by filtering the resin and resuspending it in 10 ml of 0.5 M Glycine, pH 8.5.
  • PRP Poly-L-proline
  • RNA of 100 mg of pollen was isolated following the protocol described in the Quick Prep Micro mRNA Purification Test (Pharmacia Biotech). The purified RNA was resuspended in 400 ml of distilled water treated with diethylpyrocarbon- to, and its concentration was determined at 260 nm. From 100 mg of pollen about 8 mg of RNA were obtained, which were stored at -20 ° C precipitated with ethanol. This poly (A +) RNA was used to perform the synthesis of the first complementary DNA strand, as set forth in the following section. Synthesis of the first complementary DNA strand
  • poly (A +) RNA obtained according to the following section was sedimented by centrifugation at 4 ° C at 14000 xg for 30 min. The supernatant was washed with 70% ethanol, dried and resuspended in 20 ml of distilled water treated with diethyl pyrcarbonate. The solution was heated at 60 ° C for 10 min and then cooled on ice. Subsequently, the protocol described in First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech) was followed, except that incubation with the reverse transcriptase was performed for 70 minutes. The primer used was the random mixture of hexadeoxynucleotides, called pd (N6) primer (Pharmacia Biotech).
  • AGAAAGCTT C / T) TACA (G / T) GCC (C / T) TGTTC (G / A / T) A (G / T / C) (G / A / C) AGGTA
  • the primers are composed of the hybridization zone (underlined), of several cutting sites for restriction endonucleases, EcoRI, Hi- ⁇ dlII and N el, (in bold), and of anchor nucleotides. All nucleotides in parentheses are in equimolecular proportions in that particular position.
  • the PCR amplification reaction of the profilin gene had the following components in a reaction volume of 50 ml: 5 ml amplification buffer, 5 ml; 200 mM dNTPs; 100 pmoles of each degenerate primer oligonucleotide; 2.5 units of Taq polymerase (Bioline, London,, UK); 5 my complementary DNA reaction obtained according to example II and sterile distilled water up to 50 ml.
  • the amplification reaction was carried out in a RoboCycler thermocycler (Stratagene) under the following conditions: 4 min at 94 ° C, followed by 5 compound cycles of 1 min at 94 ° C, 2 min at 42 ° C and 2 min at 72 ° C Subsequently, another 30 cycles of 1 min at 94 ° C, 2 min at 56 ° C and 2 min at 72 ° C amplification were performed. It was concluded with an extension of 6 minutes at 72 ° C.
  • the reaction product was subjected to electrophoresis in agarose gels (2%).
  • the 400 bp band corresponding to profilin was isolated from the gel by Geneclean (BiolOl, La Jolla, CA), using the protocol described by the manufacturer. Cloning of profilin gene in pBluescript
  • the isolated fragment was digested with Hi-ndIII, and subsequently with EcoRI, and the restriction endonucleases were heat inactivated. These fragments were ligated to the pBluescript vector digested with the same enzymes.
  • the ligation mixture was used to transform transform competent E. coli DH5a cells. The selection was made in LB medium with ampicillin, X-Gal and IPTG, as described in Sambrook et al [(18)]. The resulting colonies, which in this medium presented a white color, were grown to isolate their plasmid DNA, which was digested simultaneously with EcoRI-HindlII, and Ndel-HindlII. Clones that, in both cases, released a 400 bp fragment were selected for further analysis. Sequencing of the profilin gene
  • the sequencing of the DNA inserted in the pBluescript was performed based on the Sanger method [(19)] modified for use with fluorescent dideoxynucleotides and thermocycler amplification.
  • the DNA to be sequenced was prepared as follows: cultures of E. coli DH5a, containing the plasmids of interest were grown in 15 ml of LB supplemented with 100 mg / ml of ampicillin, during
  • Cynodon dactylon insert plasmid pPC19, had 396 bp encoding a 131 amino acid polypeptide that was called CdPROl.
  • Plasmid pPA18 had a 399 bp insert, which encoded a 132 amino acid polypeptide.
  • Plasmid pPA112 had a 396 bp insert, which encoded a polypeptide of 131 amino acids.
  • the polypeptides were called PjPROl and PJPR02, respectively. The two sequences had an identity of 96%.
  • the CdPROl profilin of Cynodon dactylon had a 46% identity with Castilian Acanthamoeba (EMBL Data Bank M38038); 42% with Physar ⁇ m polycephalum (M38038) and 32% with human profilin I
  • Recombinant vectors (2 mg) derived from pBluescript were digested with restriction endonucleases Hi-ndlII and Ndel.
  • the 400 bp fragment, which contained the profilin gene, was separated by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel. This fragment was ligated to the expression vector pK ⁇ 172, digested with the same enzymes.
  • the ligation mixture was used to transform competent E. coli DH5a cells.
  • the communities carrying the recombinant plasmids were read by analytical PCR, in which a tiny amount of the colony was used as a template. Plasmid AD ⁇ of the positive clones was analyzed by restriction endonucleases, selecting a clone that had the desired fragment.
  • This plasmid was used to transform the strain used in E. coli expression BL21 (DE3) [(21)].
  • This strain has a phage lysogen on its chromosome containing the T7 phage RNA polymerase gene under the control of the cUV promoter. The selection and growth of this strain was routinely performed on LB plates containing 200 mg / ml ampicillin. Expression of profilin in E. coli
  • the extract obtained was clarified by centrifugation at 14000 rpm for 30 minutes.
  • the supernatant, containing the expressed profilin, was distributed in aliquots containing 15 mg of protein, which were applied to a 1 x 7 cm column of Sepharose-poly (L) -proline.
  • the column was washed with 7 volumes of PBS buffer, 3 volumes of 2 M urea in PBS, and finally the retained protein was eluted with 6 M urea in PBS. Fractions containing protein were mixed and dialyzed for 16 hours against distilled water.
  • the dialyzed sample was lyophilized, and resuspended in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  • An example of the purification process of the CdPROl profilin of Cynodon dactylon is presented in Figure 1, and of the OePROl profilin of Olea europaea in Figure 2. It can be seen how 95% of the expressed protein is in soluble form.
  • the migration of recombinant profilins was similar to that of the natural profilin used as a control.
  • the preparations thus obtained contained> 99% profilin, as determined by SDS-PAGE followed by silver staining
  • the lysate was clarified by centrifugation, and 2% Triton X-100 was added to the supernatant, and stirred another 5 s.
  • the lysate containing profilin was applied to the poly-L-proline column as will be indicated below. Purification of recombinant profilin (Alternative method II)
  • the band that appears at 32 kDa in the natural profilin sample could be the major allergen of Cynodon dactylon [(29) Matthiesen, F., Schumacher, MJ, and Lowenstein, H. (1991). Characterization of the major allergen of Cynodon dactylon (Bermuda grass) pollen, Cyn d IJ Allergy Clin. Immunol 88, 763-774], which in very small quantities would co-purify with profilin after a single pass through Sepharosa-PLP.
  • Acanthamoeba are homologous enough, about 40%, to be able to make a model by homology of a plant profilin, it has been chosen as the basis of
  • the structure selected was the profilin II of the Castilian Acanthamoeba, and was carried out according to the Whatlf program, visualized by means of the INSIGHT II program, version 2.3.5 (Molecular Modeling System). This deduced three-dimensional model is presented in Figure 8. The prediction of structures with immunogenic possibility was made taking into account the following parameters: - Accessibility.
  • the 6 M fraction eluted from the Sepharose-PLP column containing profilin was subsequently purified, in order to remove minor contaminants and to subsequently carry out amino acid sequencing and immunization assays. It was performed by ion exchange chromatography in the SMARTTM high resolution micropreparative system (Pharmacia LKB, Sweden). An anion exchange column (MonoQ PC 1.6 / 5) was used. 40 mg of profilin fraction was applied by injection of 1 ml of sample dissolved in 40 mM Tris-HCl, pH 8.0. Elution was carried out by a linear gradient generated by the addition of 1M NaCl to the initial buffer. Thanks to this technique, we obtained a sample of pure profilin, which eluted as a symmetrical peak at a concentration of 0.25 M NaCl.
  • profilin samples were also characterized by isoelectric focusing on agarose gels (Aga-rose-IEF). Here, the presence of three isoforms (Fig. 12) with pls 4.41, 4.46 and 4.50 respectively was detected.
  • Amino acid composition of Helianthus annuus profilin The amino acid composition of purified profilin was determined by the SMART system. For this, 20 ml of the purified profilin sample was dissolved in 200 ml of distilled water; of this solution, 4 ml were used for the analysis of amino acids in a Beckman Analyzer model 6300 ion exchanger, after hydrolysis at 115 ° C for 16 h.
  • the resulting peptides were reduced / carboxylated, extracted with 0.1% TFA, CH 3 CN and then subjected to reverse phase HPLC using a Hewlett Packard 1090 equipment equipped with an Iseo model fraction collector 2150 and a 25 cm Vydac C-18 column, equilibrated with 98% buffer A (0.06% TFA) and 2% buffer B (0.052% TFA, 80% acetonitrile.
  • Peptides were eluted with the following gradient program: 0-60 min (2-37% B), 60-90 min (37-75% B) and 90-105 min (75-98% B) and were detected by their absorbance at 210 nm
  • the digested amounts generally in the range of 25-250 pmol, were fractionated into 2.1 mm ID columns, eluted at 0.15 mi / min, while the larger quantities were fractionated at 4.6 mm columns eluted at 0.15 mi / min. of the load, the sample tubes were rinsed with 50 ml of trifluoroacetic acid which was then overlaid on the sequencing filter.
  • the molecular weight of the peptides was studied by laser desorption mass spectrometry using a VG / Fisons TofSpec mass spectrometer equipped with a nitrogen laser (337 nm) and a 0.65 m linear direction tube.
  • the pure profilin sample (after performing SMART chromatography) was used to obtain a polyclonal antiserum, in order to investigate possible antigenic cross reactions with different allergenic extracts, using SDS-PAGE Immunoblotting.
  • Some extracts in whose composition the existence of profilins was known were incubated with sunflower anti-profilin serum (Fig. 15). As can be seen, the four extracts analyzed showed IgG binding in the doublet band located between 14.4 and 20.1 kDa corresponding to profilin.
  • the present invention covers the use of profilin from the described plants or synthetic peptides derived from it for desensitization treatments in mammals.
  • the desensitization method involves repeated administration by parenteral (subcutaneous, intravenous or intramuscular), oral, nasal or rectal administration of the allergen in question.
  • parenteral subcutaneous, intravenous or intramuscular
  • Both the protein and its peptides can be administered both alone and in combination with other diluents, in accordance with current legislation and galenic procedures to use.
  • the present invention also covers the use of recombinant profilins for any "in vivo" diagnostic use, such as: Prick test, intradermo-reaction or Provocation tests, using a range from 1 picogram to 10 milligrams per application. It also covers the use of recombinant profilins for "in vitro" diagnosis using techniques of: immunoassay, histamine release and lymphoblastic transformation test.
  • NAME Industrial Farma Farmaica y de Especialidades, S.A.
  • SOFTWARE Microsoft Word for Windows 95 INFORMATION ABOUT THE REPRESENTATIVE / AGENT:
  • CTGTTTGGGC TCAGAGCGCT ACCTTCCCTC AGTTCAAGCC AGAGGAGATG 150 AATGGAATTA TGACAGATTT CAATGAACCT GGTCATCTGG CACCAACAGG 200 CCTACATCTT GGAGGAACAA AGTATATGGT GATTCAAGGA GAGGCTGGAG 250 CCGTCATCCG TGGAAAGAAG GGATCTGGTG GTATTACCAT TAAGAAGACT 300 GGCCAAGCAC TAGTTTTTGG TATCTACGAG GAGCCTGTAA CTCCAGGTGTGGGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
  • CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350

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Abstract

Las moléculas de ADN recombinante codifican para un polipéptido que tiene al menos un epítopo del alérgeno profilina de plantas seleccionadas del grupo formado por Cynodon dactilon, Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea y Mercuriales annua. El polipéptido se obtiene cultivando un organismo hospedador conteniendo el vehículo de expresión microbiano correspondiente. Aplicación en el tratamiento y diagnóstico de determinadas alergias.

Description

ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA PARA EPITOPOS DEL ALÉRGENO PROFILINA ÚTIL PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ALERGIAS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuadra en el campo del diagnóstico y tratamiento de alergias, particularmente alergias polínicas . Concretamente, trata del panalérgeno profilina, presente en un gran número de pólenes de plantas, y causante de numerosas reacciones cruzadas entre pólenes y con respecto a alimentos de origen vegetal. En la presente invención se obtienen moléculas de ADN recom- binante que codifican para un polipéptido que tiene al menos un epitopo del alérgeno profilina, de una serie de plantas pertenecientes a los grupos de hierbas, malezas y árboles no fágales. En particular a las plantas Cynodon dactylon. Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea, y Mercurialis annua . Todas ellas son plantas con amplia distribución en la Península Ibérica y los pólenes producidos por ellas se encuentran entre los agentes etiológicos de enfermedades alérgicas más importantes en dicho ámbito geográfico. Se describen también métodos de producción de estos polipéptidos recombinantes en sistemas de expresión heterólogos . También se describen eficientes métodos para la purificación de la profilina, tanto si es producida como proteína soluble o como inso- l ble. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN
Las alergias de tipo I son un problema sanitario importante en los países industrializados. Este tipo de alergias están causadas por la formación de anticuerpos IgE contra antígenos transportados por el aire. Estos anticuerpos IgE interaccionan con los mastocitos y basófilos, liberando mediadores biológicos como histamina, produciendo rinitis alérgica, conjuntivitis y asma bron- quial en un 20% de la población [(1) Miyamoto, T. (1991). Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, and F. Michel, eds. (New Jersey, USA: The Part enon Publishing Group-Carnforth) , pp. 343-347] . Uno de los métodos actuales para remediar las manifestaciones alérgicas es la inmunoterapia. Este método consiste básicamente en modular la respuesta inmune en el paciente mediante la administración regular y en concentraciones crecientes de las proteínas que producen la alergia (ex- tractos alergénicos) .
Los métodos de diagnóstico de las enfermedades alérgicas, tales como RÍA (immuno-radiometric asssay) , RAST (radio-allergosorbent test) , ELISA (enzyme- lin ed itnmunosorbent assay) , inmunotransferencia, ensayos de liberación de histamina, entre otros, dependen de la disponibilidad de alérgenos puros . Los extractos alergénicos aislados de fuentes naturales son complejas mezclas de proteínas y otras moléculas. Su composición, y por lo tanto alergenicidad, depende del material usado, el cual varía según las condiciones ambientales, en el caso de los pólenes, la fase de maduración, en el caso de los hongos, las condiciones de crecimiento de los ácaros, etc. Incluso, algunos extractos pueden contener una concentración insuficiente de alérgenos mayores, pueden estar contaminados con componentes no deseados, frente a los cuales el paciente no es alérgico, o ambos. Además, alérgenos importantes pueden perderse durante la extracción debido a proteasas, y los procesos bioquímicos de purificación de alérgenos son laboriosos y costosos. Por estas razones, se ha prestado gran atención a la tecnología del ADN recombinante como una alternativa viable para la producción de alérgenos recombinantes, facilitando así su caracterización a nivel molecular, y su uso en diagnóstico y terapia [(2) Scheiner, 0. and Kraft, D. (1995). Basic and practical aspects or recombinant allergens. Allergy 50, 384-391] . Los alérgenos recombinantes pueden ser producidos a gran escala en tanques de fermentación, utilizando sistemas de expresión microbianos . Su purificación es más eficiente y barata, ya que se parte de una mayor proporción de la proteína de interés. Además, mediante estas técnicas se pueden obtener fácilmente fragmentos específicos de estas proteínas. La aplicación de las técnicas del ADN recombinante ha llevado al aislamiento de un gran número de proteínas con características alergénicas [(3) Stewart, G. (1995) . The molecular biology of allergens. In Astha and Rhinitis. W. Busse and S. Holgate, eds. (Boston: Backwell Scientifics Publications) , pp. 898-932] .
Las profilinas constituyen una ubicua familia de proteínas implicadas en la unión a actina, y que se encuentran en el citoesqueleto de organismos eucariótas [(4) Haarer, B. and Brown, S. (1990). Structure and function of profilin. Cell Motility and the Cytoskeleton 17, 71-74; y (5) Theriot, J.A. and Mitchison, T.J. (1993) . The three faces of profilin. Cell 75, 835-838] . Otras funciones adicionales de la profilina han sido reseñadas con anterioridad en la literatura [(6) Machesky, L. and Pollard, T. (1993) . Profilin as a potencial mediator of membrane- cytoskeleton communication. TIBS 3, 381-385; y (7) Aderen, A. (1992) . Signal transduction and the actin cytoskeleton. TIBS 17, 438-443] . Las profilinas son prominentes alérgenos que pueden ser aislados de pólenes de árboles, hierbas y malezas, así como de algunos alimentos [(8) Valenta, R. , Duchéne, ., Ebner, C, Valent, P., Sillaber, C, Deviller, P., Ferreira, F., Tejkl, M. , Edelmann, EL, Kraft, D., and
Scheiner, O. (1992) . Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens . J. Exp. ed. 175, 377-385;
(9) Ebner, C, Hirschwehr, R. , Bauer, L., Breiteneder, H. ,
Valenta, R., Ebner, H. , Kraft, D., and Scheiner, O. (1995). Allergens, IgE, ediators, inflammatory mechanisms. J. Allergy Clin. Immunol. 95, 962-969; (10) Valenta, R. , Duchéne, M., Pettenburger, K. , Sillaber, C, Valent, P., Bettelheim, P., Breitenbach, M. , Rumpold, H. , Kraft, D., and Scheiner, O. (1991) . Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuáis. Science 253, 557-560; (11) van Ree, R. , Fernández-Rivas, M., Cuevas, M., van ijingaarden, M. , and Aalberse, R. (1995) . Pollen-related allergy to peach and apple: An important role for profilin. J. Allergy Clin. Immunol. 95, 726-734; y (12) Vieths, S., Jankiewicz, A., Wütrich, B., and Baltes, . (1995). I munoblot study of IgE binding allergens in celery roots. Ann. Allergy Asthma Immunol. 75, 48-55] . Se ha encontrado que pacientes alérgicos a profilina constituyen el 20% de individuos alérgicos a polen [(8)]. Estudios posteriores detectaron reactividad de la profilina de polen de girasol en el 28% de los sueros de pacientes alérgicos a esta planta compuesta [(13) Jiménez, A., Moreno, C, Martínez, J. , Martínez, A., Bartolomé, B., Guerra, F., and Palacios, R. (1994). Sensitization to sunflower pollen: only an occupational allergy? Int. Arch. Allergy Immunol. 105, 297-307] . La disponibilidad de este panalérgeno como una proteína recombinante permitiría la caracterización a nivel molecu- lar las regiones implicadas en las reacciones antigénicas, y su uso en diagnóstico y tratamiento de pacientes alérgicos.
El banco de datos SWISS-Prot contiene un gran número de secuencias que codifican para profilinas, de las cuales sólo 10 pertenecen a 6 especies de plantas relacionadas con procesos alérgicos . Estas profilinas clonadas proceden de Betula verrucosa (abedul) , llamada Bet v 2 [(10)],- Triticu aestivum (trigo), clonadas tres isoformas [(14) Rihs, H., Rozynek, P., May-Taube, K. , Welticke, B., and Baur, X. (1994) . Polymerase chain reaction based cDNA cloning of wheat profilin: a potential plant allergen. Int. Arch. Allergy Immunol . 105, 190-194]; Plileu pratense [(15) Valenta, R. , Ball, T., Vrtala, S., Duchéne, M., Kraft, D. , and Scheiner, O. (1994) . cDNA cloning and expression of timothy grass (Phleum pratense) pollen profilin in Escherichia coli : comparison with birch pollen profilin. Biochem. Biophys . Res. Commun. 199, 106-118]; Zea mays (maíz), clonadas tres isoformas [(16) Staiger, C. , Goodbody, K. , Hussey, P., Valenta, R. , Drobak, B., and Lloyd, C. (1993) . The profilin multigene family of maize: differential expression of three isoforms. Plant J. 4, 631- 641]; Piíaseolus vulgaris (alubia) [(17) Vidali, L., Pérez, H.E., Valdés, V., Noguez, R. , Zamudio, F., and Sánchez, F. (1995) . Purification, characterization, and cDNA cloning of profilin from Phaseolus vulgaris. Plant Physiol. 108, 115- 123] , y Hordeum vulgare (cebada) (número de acceso a EMBL Data Bank: U49505) .
En el presente estudio se han clonado por primera vez distintas secuencias, que codifican para profilinas de las siguientes especies: Cynodon dactylon, Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea y Mercurialis annua . Estas secuencias codifican para unos polipéptidos de unos 14 kDa, identifi- cados como profilinas en base a: i) Gran similaridad con otras profilinas estudiadas, ii) Reactividad frente a sueros obtenidos de conejos inmunizados con profilina purificada a homogeneidad de Helianthus annuus. iii) Capacidad de unirse a poli-L-prolina. iv) Reactividad con IgE de sueros de pacientes alérgicos a profilinas. Igualmente se presentan resultados sobre la reactividad cruzada de la profilina con alérgenos comunes relacionados y no relacionados filogenéticamente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención, tal y como se indica en su enunciado se refiere a moléculas de ADN recombinante que codifican para epítopos del alérgeno profilina de Cynodon dactylon, Phleum pratense, Parietaria judaica, Helianthus annuus, Olea europaea y Mercurial i s annua; y a su aplicación para el diagnóstico y tratamiento de alergias. Descripción de las plantas utilizadas como materia prima
La clonación de la profilina se ha realizado del polen de plantas del tipo hierbas, malezas o árboles. La calidad de los pólenes ha sido controlada para que no contuvieran más del 0.1% de pólenes contaminantes u otras partes de la planta o fragmentos vegetales. Las plantas de las cuales proceden los pólenes son las siguientes: * Las gramíneas (hierbas) , pertenecientes a la Familia Gramineae, concretamente: -Cynodon dactylon, llamada en inglés "Bermuda grass", y que pertenece a la subfamilia Panicoideae y tribu Chlorideae . -Phleum pratense, llamada en inglés "timothy grass", y que pertenece a la subfamilia Pooideae, grupo Festuci formes y tribu Festuceae.
* Las malezas:
-Parietaria judaica, llamada en inglés "wall pelli- tory", y que pertenece a la familia ürticacea.
-Helianthus annuus, llamada en inglés "sunflower", y que pertenece a la familia Composi tae, subfamilia Tubiliflorae, y tribu Heliantheae. -Mercurialis annua , que pertenece a la familia Euphor- biaceae
* El árbol, Olea europaea, llamado en inglés "olive tree", perteneciente a la familia Oleaceae. Clonación y secuenciación de genes que codifican para profilinas
La clonación de genes puede realizarse utilizando diversos métodos [(18) Sa brook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) . Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Labora- toy] : bibliotecas de ADN genómico o ADN complementario, utilizando como vectores: plás idos, fásmidos, bacteriófagos o cósmidos. También se puede utilizar la técnica de PCR (amplificación en cadena de la ADN polimerasa) para clonar un gen del cual se conoce parte de su secuencia. De igual manera la detección de los clones que portan el gen de interés puede realizarse utilizando diferentes técnicas: complementación de mutantes auxótrofos, inmunodetección o actividad enzimática de la proteína expresada, radiodetec- ción con sondas de oligonucleótidos marcadas radiactivamente, o secuenciación directa. En la presente invención se han conjugado los dos métodos más directos de ambas etapas: la clonación mediante la amplificación por PCR de ADN complementario y la secuenciación directa de los insertos clonados .
A partir de 100 mg de polen de diversas fuentes, se aisló el ARN mensajero enriquecido en transcritos con poli(A+) utilizando columnas de afinidad. Se sintetizó la primera cadena de ADN complementario a partir del ARN mensajero aislado, utilizando transcriptasa reversa. El híbrido de ADN-ARN obtenido se utilizó como molde para la amplificación de los correspondientes genes de la profilina. En este proceso se utilizaron como cebadores oligo- nucleótidos degenerados, obtenidos por comparación de la secuencia de aminoácidos de todas las profilinas vegetales descritas en el apartado de "estado de la técnica" . A estos cebadores se les añadió en sus extremos secuencias de reconocimiento de diversas endonucleasas de restricción. La amplificación por PCR se realizó a temperaturas de hibridación de entre 42-56°C y durante 30-35 ciclos. La reacción se sometió a electroforesis en geles de agarosa (2%) y una banda de unos 400 pares de bases (pb) fue aislada del gel y purificada. El ADN purificado se digirió con las endonucleasas de restricción BcoRI y HindlII, y se ligó al vector pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) , cortado con los mismos enzimas. Células competentes de E. coli DH5a se transformaron con la mezcla de ligación y los transformantes se seleccionaron en placas de medio sólido LB con ampicilina, X-gal e IPTG. El ADN plasmídico de los clones resistentes a ampicilina, y que tenían color blanco fue aislado, y caracterizado mediante digestión con endonucleasas de restricción. El ADN insertado, cuyo tamaño correspondía con el esperado, fue secuenciado mediante el método de Sanger [(19) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) . DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467] utilizando dideoxinucleótidos fluorescentes. El análisis informático de las secuencias demostró que todas las secuencias codificaban para la profilina, y que existía una gran homología con otras profilinas descritas. Expresión de los genes clonados
Existe una gran diversidad de sistemas de expresión de proteínas heterólogas. En la presente invención se ha sobreexpresado el gen de la profilina para formar una proteína no fusionada utilizando el vector de expresión pKN172 [(20) ay, M. , Pope, B. , Gooch, J. , Hawkins, M. , and Weeds, A.G. (1990) . Identification of a región in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9, 4103- 4109] . La expresión en este plásmido se basa en la interacción de la ARN polimerasa del fago T7 con un promotor específico del mismo fago (promotor del gen flO) , que es colocado delante del fragmento que queremos expre- sar. La expresión de la ARN polimerasa de T7, en la cepa de E. coli BL21 (DE3) [(21) Studier, F.M. and Moffatt, B.A. (1986) . Use of bacteriophage T7 polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113-130] , se induce con IPTG, lo cual desencadena la expresión final del gen de interés. El IPTG se añadió, a concentraciones entre 0.6-1 M, a un cultivo crecido en medio nutritivo (LB ó TB) con ampicilina (100- 200 mg/ml) , a una densidad óptica a 600 nm de entre 0.6 -1. Esta adición provoca la expresión del gen de la profilina clonado detrás del promotor del gen fio. El cultivo se recogió entre 3-6 horas después de la inducción. Purificación de la profilina recombinante
El método de purificación de la profilina se basa en la capacidad que ésta tiene para unirse a cadenas de L-pro- lina. La purificación se realizó en un sólo paso mediante cromatografía de afinidad en columna de Sepharose-poli-L- prolina, según describe Lindberg [(22 Lindberg, U. , Schutt, C, Hellsten, E., Tj der, A., and Hult, T. (1988). The use of poly (L-proline) -Sepharose in the isolation of profilin and profilactin complexes . Biochim. Biophys . Acta 967, 391- 400] . Esta resina es una agarosa comercial (Pharmacia Biotech) activada con bromuro de cianógeno (CNBr) a la cual se unen covalentemente péptidos de prolina (Poli-L-prolina) de al menos 5 kDa. Cuando la proteína recombinante no está en forma soluble se debe tratar con 8 M de urea o una mezcla de los detergentes sarcosil/triton X-100, para que pueda ser aplicada a la columna de Sepharose-poli-L- prolina. La profilina pegada específicamente a esta resina, es eluída de la columna mediante 6 M urea, y dializada extensivamente. De esta forma se obtiene una profilina recombinante de gran pureza (>95%) y en grandes cantidades (10-50 mg/litro de cultivo) . Aislamiento de la profilina de girasol (Helianthus annuus) y su secuenciación proteica
Se purificó la profilina de girasol (Helianthus annuus) mediante cromatografía resolutiva desarrollada en dos fases . La proteína así purificada fue identificada como profilina mediante ensayos fisiológicos (unión con poly-L- prolina) , bioquímicos (parámetros moleculares y secuencia de aminoácidos) e inmunoquímicos (SDS-PAGE Immunoblot- tings) . Se obtuvieron pesos moleculares de 15.7 kDa en SDS- PAGE y de 19.1 kDa en cromatografía SMARTTM (lo que indica su naturaleza monomérica) , así como un pl de 4.5-4.4 (tres isoformas) . Se determinó la composición de aminoácidos y la secuencia parcial de la proteína purificada. Seis péptidos internos que fueron secuenciados confirman su identidad profilínica y muestran el mayor grado de similitud con los péptidos de polen de Zea mays y semilla de Phaseolus vulgaris. Con el fin de evaluar la presencia de proteínas de naturaleza profilínica en un grupo de aeroalérgenos y alérgenos alimentarios, se obtuvo y empleó un antisuero policlonal anti-profilina. Estos resultados se discuten de modo preliminar.
En resumen, esta invención proporciona ADN recombinante que codifica para profilina de un gran número de plantas, tanto hierbas, malezas y árboles. Igualmente proporciona un sistema de expresión microbiano (E. coli) para la obtención de grandes cantidades de profilina. Esta expresión puede realizarse en otros sistemas microbianos
(Pseudomonas, Bacillus) o eucarióticos (levaduras o células de insectos) . La profilina producida puede ser procesada por tres métodos diferentes, para finalmente ser purificada mediante un sólo paso de cromatografía de afinidad en Sepharose-poli- -prolina. La profilina purificada por este método no difiere en sus propiedades de unión a IgE de las profilinas naturales. Igualmente se describe la purifica- ción y caracterización completa de la profilina de girasol (Helianthus annuus) . Aplicaciones
Los métodos de diagnóstico, tanto in vitro como in vivo, que actualmente se utilizan se basan en el uso de extractos de alérgenos . Debido a la dificultad de obtener lotes reproducibles de extractos alergénicos, y a que algunos alérgenos menores, como la profilina están poco representados o parcialmente degradados [(23) Susani, M. , Jertschin, P., Dolecek, C. , Sperr, ., Valent, P., Ebner, C, Kraft, D., Valenta, R. , and Scheiner, O. (1995). High level expression of birch pollen profilin (Bet v 2) in Escherichia coli : purification and characterization of the recombinant allergen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 250-263] , es interesante el uso de preparaciones reproducibles de alérgenos puros obtenidos mediante la tecnología de ADN recombinante [(2)]. Actualmente se pueden realizar diagnósticos precisos de ciertos tipos de alergias utili¬ zando un número definido de alérgenos recombinantes. La caracterización del patrón de reactividad de cada paciente puede conducir en un futuro próximo, al desarrollo de un tipo de inmunoterapia más individualizada, y por ello eficiente. Los alérgenos recombinantes, profilinas, descritos en esta invención, permiten el diagnóstico de alergias polínicas en las cuales se encuentra implicada la profilina, que son aproximadamente un 20% del total de alergias a polen [(8)] .
Los ADN recombinantes que codifican para los alérgenos profilínicos objeto de la presente invención pueden servir no sólo para la obtención de alérgenos recombinantes útiles para el diagnóstico y tratamiento convencional de alergias, sino también para dos potenciales usos: a) Producción de péptidos a partir de dichos alérgenos, que constituyan epítopos de células T, y que por tanto puedan ser vacunas con actividad anergizante (supresora de respuesta Th2) . b) Obtención de isoformas recombinantes mutantes que no den lugar a fijación de IgE, y que por tanto constituyan tratamientos con reducida capacidad de producción de efectos adversos. DEPOSITO DE LAS CEPAS
Las cepas más importantes que se mencionan en la presente solicitud han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, 46100 Burja- sot, Valencia) correspondiéndoles los siguientes nos. de orden:
Escherichia coli CdPROl CECT 4872
Escherichia coli PjPROl CECT 4873
Escherichia coli OePROl CECT 4874 Escherichia coli MaPROl CECT 4875
Escherichia coli HaPR02 CECT 4876
Escherichia coli PpPR03 CECT 4877
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie del proceso de purificación de la profilina CdPROl de Cynodon dactylon. Carriles 1 y 2, usado de E. coli BL21 (DE3) conteniendo pKN172 sin inserto y con el inserto CdPROl, respectivamente; carriles 3 y 4, fracciones insoluble y soluble de la muestra del carril 2, respectivamente; carril 5, fracción no retenida en la columna Sepharose-PLP; carril 6, profilina recombinante purificada como elución de urea 6M de la columna de Sepharose-PLP; carril 7, profilina natural purificada.
Figura 2 : PAGE teñida con azul de Coomassie del proceso de purificación de la profilina OePROl de Olea europaea . Carriles 1 y 2, lisado de E. coli BL21 (DE3) conteniendo pKN172 sin inserto y con el inserto OePROl, respectivamente; carriles 3 y 4, fracciones insoluble y soluble de la muestra del carril 2, respectivamente; carril 5, fracción no retenida en la columna Sepharose-PLP; carril
6, lavado de la columna con 2 M de urea; carril 7, profilina recombinante purificada como elución de urea 6M de la columna de Sepharose-PLP; carril 8, profilina natural purificada.
Figura 3 : SDS-PAGE teñida con plata de la profilina purificada CdPROl de Cyπodo-π dactylon. Carriles 1 y 4, profilina recombinante purificada por Sepharose-PLP, 3 y 0.5 mg, respectivamente; carril 2, profilina natural purifi- cada,- carril 3, lisado de E. coli BL21 (DE3) conteniendo pKN172 con el inserto CdPROl.
Figura 4 : Inmunodetección de profilina recombinante de Cynodon dactylon utilizando anticuerpos policlonales anti- profilina. La descripción del gel es idéntica a la descrita en la figura 1.
Figura 5 : Inmunodetección de profilina recombinante de Olea europaea utilizando anticuerpos policlonales anti- profilina. La descripción del gel es idéntica a la descrita en la figura 2. Figura 6 : Comparación por inmunodetección de la ractividad de IgE procedente de suero de pacientes alérgicos a Cynodon dactylon o gramíneas . Se transfirieron proteínas del extracto de Cynodon dactylon (E) y profilinas recombinantes purificadas (R y P) y se incubaron con sueros de pacientes (1-8) alérgicos a Cynodon dactylon, pool de sueros de alérgicos a gramíneas (G) y de individuos sanos (C) .
Figura 7: Inhibición de inmunodetección. Extractos proteicos (E) , profilina natural purificada (P) y recombi- nante purificada (R) de Cynodon dactylon se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Estas membranas se incubaron con un pool de sueros de pacientes alérgicos a Cynodon dactylon inhibidos con 10 mg de profilina recombinante (c) o BSA (b) por mi de suero, o sin inhibir (a) . Como control se utilizó un pool de sueros de individuos sanos (c) .
Figura 8 : Simulación de la estructura tridimensional de la profilina PpPR03 de Phleum pratense y localización de las diferentes regiones en las que se enmarcan los péptidos antigénicos propuestos .
Figura 9 : Estructura de los tres péptidos con mayor posibilidades de antigenicidad. La numeración corresponde a la secuencia de aminoácidos en PpPR03 de Phleum pratense. Figura 10 : SDS-PAGE de la fracción de profilina eluída tras la cromatografía de afinidad (carril 2) , extracto completo de polen de girasol (carril 3) y el mismo extracto desprovisto de la fracción de profilina (carril 1) .
Figura 11 : Cromatografía de SMART realizado mediante gel filtración en columna Superdex 75 PC3.2/30 correspondiente a la fracción de profilina de Helianthus annuus obtenida por cromatografía de afinidad.
Figura 12 : IEF (pH 3-10) de profilina obtenida tras cromatografía de filtración en gel. Figura 13 : Secuencia de aminoácidos deducida (HaPROl, HaPR02, HaPR03, HaPR04, HaPR05 y HaPR06) de Helianthus annuus. Los guiones indican que la secuencia es idéntica a la mostrada en la parte superior. En negrita se indican los resultados de la secuenciación parcial de la profilina purificada de H. annuus; los asteriscos indican que la secuencia es idéntica a la mostrada en la parte superior.
Figura 14 : Inmunodetección de profilina purificada de girasol incubada con una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a polen de gramíneas (carril 1) , de girasol (carril 2) y frutos de Rosaceas (carril 3) .
Figura 15 : Inmunodetección de extracto de polen de abedul (carril 1) y extractos de piel de manzana (carril 2) , de melocotón (carril 3) y pera (carril 4) , incubados con antisuero anti-profilina de girasol. Figura 16 : Inmunodetección de extracto de polen de girasol (carril 1) , Phleuw pratense (carril 2) , caspa de perro (carril 3) , Parietaria judaica (carril 4) , Dermatop- hagoides pteronyssinus (carril 5) , Olea europaea (carril 6) , Mercurialis annua (carril 7) , Al ternarla al terna ta (carril 8) , Aspergillus fumigatus (carril 9) , Penicillium notatum (carril 10) , y estambres de azafrán (carril 11) , incubados con antisuero anti-profilina de girasol. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención puede ser entendida a partir de los siguientes ejemplos, que no deben considerarse en absoluto limitativos de la misma.
Técnicas básicas de la tecnología del ADN recombinante y bioquímica Como muchas de las técnicas de ADN recombinante empleadas en esta invención son utilizadas rutinariamente por personal cualificado en el tema, es mejor introducir una corta descripción de estas técnicas más que describirlas cada vez que se utilicen. Excepto donde existe una indicación específica, todos estos protocolos están descritos en la referencia [(18)]. Aislamiento de plásmidos para su secuenciación
Protocolo modificado del descrito en Sambrook et al, páginas 1.21 a 1.41. Un cultivo de 15 mi de E. coli , cre- cido en LB con ampicilina (100 mg/ml) durante 16 horas a 37°C, se recogió por centrifugación. Las células se re- suspendieron en 1 mi TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) , y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 2 mi de solución de lisis (0.2 N NaOH, 1% SDS) , manteniéndose en hielo 5 min. Se añadieron 1.5 mi de acetato potásico 3 M pH 4.8, agitándose por inversión, y se incubó en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó durante 30 minutos a 4000 xg y 4°C. El sobrenadante se pasó a otro tubo al que se añadieron 9 mi de estanol, incubándose durante 20 minutos. Se centrifugo en las mismas condiciones, y el precipitado se lavó con etanol al 70%, y se secó. Este ADN se resuspendió en 200 mi de 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) , 10 mM EDTA y 100 mg/ml de ARNasa y se siguió purificando según el protocolo Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI) . El ADN así obtenido se resuspendió en 50-80 mi de agua destilada estéril, y se guardó a -20°C. Corte con endonucleasas de restricción Una reacción contiene típicamente entre 50-500 mg/ml de ADN en el tampón de reacción recomendado por los fabricantes (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia; Boehringer- Mannhein, Mannhein, Alemania,- Promega) . Se añaden de 2 a 5 unidades de la endonucleasa de restricción por cada mg de ADN y la reacción se incuba de l a 3 horas a las temperaturas recomendadas por el fabricante. La reacción se para calentando a 85°C durante 10 min, o por extracción con fenol seguida de precipitación de ADN con etanol. Esta técnica está descrita también en las páginas de 5.28 a 5.32 de la referencia [(18)] .
Electroforesis en geles de agarosa y purificación de fragmentos de ADN de geles
La electroforesis en geles de agarosa se realizó en un aparato horizontal, utilizando como tampón Tris-borato, como se describe en las páginas 6.3 a 6.15 de la referencia
[(18)]. Los fragmentos de ADN se tiñeron utilizando 0.5 mg/ml de bromuro de etidio que se añadió al gel. El ADN se visualizó por iluminación ultravioleta entre 300 y 310 nm.
Para purificar fragmentos de ADN de la agarosa se utilizó el kit de Geneclean (BiolOl Inc., La Jolla, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ligación de fragmentos de ADN
Para la ligación de fragmentos de ADN con extremos cohesivos complementarios, 100 ng de cada uno de los fra- gmentos se incubaron en un volumen de reacción de 10 a 20 mi conteniendo unas 0.5 unidades de T4 ADN ligasa (BioLine, London, UK) en el tampón recomendado por el fabricante. La incubación se llevó a cabo durante 15 horas a 12-15°C, o 7 horas a 20°C.
Transformación de E. coli con ADN
Las cepas de E. coli DH5a o BL21 (DE3) fueron utilizadas en la mayoría de los experimentos . El ADN fue introducido mediante el protocolo del cloruro calcico, como se describe en [(18)], páginas de 1.76 a 1.84, o mediante el método del cloruro de rubidio, como describe Hanahan
[(24) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of
Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-
580] . La selección se realizó en LB sólido con ampicilina (100 mg/ml) y cuando fue necesario se añadieron a cada placa de Petri: 40 mi de X-gal (20 mg/ml en dimetilforma- mida) , y 4 mi de IPTG (200 mg/ml) . Muestreo de plásmi os en E. coli
Después de la transformación, las colonias resultantes de E. coli fueron estudiadas para detectar la presencia de los plásmidos deseados mediante un protocolo rápido de aislamiento de plásmidos. Este protocolo esta descrito en las páginas 1.25 a 1.28 de la referencia de Sambrook
[(18)] . Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS- PAGE)
Se siguió básicamente la técnica descrita por Laemmli
[(25) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685] , utilizando un aparato de electroforesis MINI-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA) . Los geles, de 10 x 10 cm y con una concentración de poliacrilamida del 12.5 o 15%, se sometieron a una corriente de 200 voltios durante 45 minutos en tampón Tris-Glicina. Las proteínas utilizadas - 1 !
como patrones fueron las del kit Bio-Rad para bajos pesos moleculares . El cálculo de los pesos moleculares y los análisis densitométricos de los geles se realizó utilizando un analizador de image (Bio-Image, Millipore Corp, Bedford, MA) .
Análisis por inmunotransferencia
Se realizó por el método de Shen y cois, con modificaciones [(26) Shen, H. , Choo, K. , Lee, H. , Hsieh, J., Lin, W. , Lee, ., and Han, S. (1991). The 40-kilodalton allergen of Candida albicans is an alcohol dehydrogenase: molecular cloning and immunological analysis using monoclonal antibodies. Clin. Exp. Allergy 21, 675-681] . Las proteínas separadas en SDS-PAGE fueron electro-transferidas a membranas de nylon. La membrana es incubada con un agente bloqueante (como puede ser leche desnatada al 5% en PBS: al cual llamaremos a partir de ahora leche/PBS) . La membrana es entonces incubado con los anticuerpos de interés durante varias horas (estos anticuerpos podrán provenir de pacientes o de animales inmunizados) . Posteriormente, la membrana se lava varias veces con leche/PBS, y se incuba con un segundo anticuerpo comercial, al cual esta acoplada una enzima (por ejemplo peroxidasa) . Este anticuerpo comercial será anti-IgG, en el caso que hayamos utiizado un animal inmunizado, o anti-IgE, si el suero proviene de humanos. La membrana es nuevamente lavado en PBS, y teñido con 4-cloro- 1-naftol al 0,06% en PBS con H202 al 0.01%, a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción es parada con agua destilada. Preparación de la columna de Sepharosa poli-L-prolina El primer paso en la purificación de la profilina se realizó mediante cromatografía de afinidad en la columna de Sepharosa activada con CNBr y acoplada a PLP, de acuerdo con Lindberg et al. [(22)]. Este método, en resumen, consiste en humedecer 2 g de Sepharose 4B activada con CNBr (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) en 100 mi de HC1 lmM durante 15 minutos. A continuación, la resina fue lavada a través de un embudo filtrante (porosidad G3) al que se añadió cuatro veces consecutivas 100 mi de HC1 lmM. El gel resultante (unos 7 mi) fue resuspendido en el tampón (KHC03, 0.1 M, pH 8.3, KC1 0.5 M) ; después, se disolvieron 30 mg de Poly-L-proline (PLP, Mr 5000, INC Biochemicals, Aurora, OH, USA) en 2 mi de agua destilada durante 12 h. El material no soluble fue eliminado y el sobrenadante añadido a la resina suspendida en el tampón de acoplamiento. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 2 h. El bloqueo de los grupos activos se realizó filtrando la resina y resuspendiéndola en 10 mi de Glicina 0.5 M, pH 8.5. Seguidamente se procedió al lavado del exceso de ligando con tampón de acetato 0.1 M, pH 4.0 y PBS pH 8.3 ambos conteniendo NaCl 0.5 M. El exceso de agente bloqueante se eliminó por lavado con PBS. Con el conjugado de PLP- Sepharose obtenido se montó una columna de lx 24 cm equilibrada con PBS. Agarosa-isoelectroenfoque (IEF)
Esta técnica se realizó utilizando placas de Agarosa Isogel (FMC Bio Products, Rockland, Maine) , en el intervalo de pH 3 - 10. Se aplicaron 20 mg de proteína por calle. El punto isoeléctrico (pl) de las moléculas en cuestión fue determinado comparando su migración con la de un conjunto de proteínas de pl conocido. El esquema electroforético obtenido se evaluó por análisis de imagen en el sistema BIO-IMAGE (Millipore, Bedford, Mass. USA). Ejemplos relacionados específicamente con la invención Aislamiento de ADN poli (A+) de polen
Se aisló el ARN poli (A+) de 100 mg de polen siguiendo el protocolo descrito en Quick Prep Micro mRNA Purification Test (Pharmacia Biotech) . El ARN purificado se resuspendió en 400 mi de agua destilada tratada con dietilpirocarbona- to, y se determinó su concentración a 260 nm. A partir de 100 mg de polen se obtuvieron unos 8 mg de ARN, que se guardaron a -20°C precipitados con etanol. Este ARN poli (A+) fue utilizado para realizar la síntesis de la primera cadena de ADN complementario, como se expone en apartado siguiente. Síntesis de la primera cadena de ADN complementario
Un mg de ARN poli (A+) obtenido según el apartado siguiente, fue sedimentado por centrifugación a 4°C a 14000 xg durante 30 min. El sobrenadante se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 20 mi de agua destilada tratada con dietilpirocarbonato. La solución se calentó a 60°C durante 10 min y luego se enfrió en hielo. Posteriormente, se siguió el protocolo descrito en First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech) , salvo que la incubación con la transcriptasa reversa se realizó durante 70 minutos. El cebador utilizado fue la mezcla al azar de hexadeoxinu- cleótidos, llamado pd(N6) primer (Pharmacia Biotech) . Una vez acabada la reacción, la mezcla se calentó a 90°C durante 5 minutos y se enfrió en hielo, almacenándose posteriormente a -20°C hasta que fue utilizada para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se explica en el apartado siguiente. Amplificación del gen de profilina por PCR Los cebadores utilizados de la PCR fueron obtenidos de comparar diversas secuencias de profilinas de plantas, y teniendo en cuenta la degeneración del código genético: * PROEXF (extremo 5' del gen) :
AGAGAATTCCATATGTCGTGGCA(A/G) (A/G) CGTACGT * PROEXR (extremo 3' del gen) :
AGAAAGCTT (C/T) TACA(G/T) GCC (C/T) TGTTC (G/A/T)A (G/T/C) (G/A/C)AGGTA
Los cebadores se componen de la zona de hibridación (subrayada) , de varios sitios de corte para las endonucleasas de restricción, EcoRI, Hi-πdlII y N el , (en negrita) , y de unos nucleótidos de anclaje. Todos los nucleótidos entre paréntesis están en proporciones equimoleculares en esa determinanda posición.
La reacción de amplificación por PCR del gen de la profilina tenía los siguientes componentes en un volumen de reacción de 50 mi: tampón de amplificación xlO, 5 mi; 200 mM de dNTPs; 100 pmoles de cada oligonucleótido cebador degenerado; 2,5 unidades de Taq polimerasa (Bioline, London, ,UK) ; 5 mi reacción de ADN complementario obtenido según el ejemplo II y agua destilada estéril hasta 50 mi. La reacción de amplificación se llevó a cabo en un termociclador RoboCycler (Stratagene) en las siguientes condiciones: 4 min a 94°C, seguido de 5 ciclos compuestos de 1 min a 94°C, 2 min a 42 °C y 2 min a 72 °C. Posterior- mente, se realizaron otros 30 ciclos de 1 min a 94°C, 2 min a 56°C y 2 min a 72°C de amplificación. Se concluyó con una extensión de 6 minutos a 72°C. El producto de la reacción fue sometido a electroforesis en geles de agarosa (2%) . La banda de 400 pb que correspondía a la profilina fue aislada del gel por Geneclean (BiolOl, La Jolla, CA) , utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Clonación del gen de profilina en pBluescript
El fragmento aislado fue digerido con Hi-ndIII, y posteriormente con EcoRI, y las endonucleasas de restric- ción se inactivaron por calor. Estos fragmentos se ligaron al vector pBluescript digerido con las mismas enzimas . La mezcla de ligación se utilizó para transformar transformar células competentes de E. coli DH5a. La selección se realizó realizó en medio LB con ampicilina, X-Gal e IPTG, como se describe en Sambrook y col [(18)]. Las colonias resultantes, que en este medio presentaban un color blanco, fueron crecidas para aislar su ADN plasmídico, el cual fue digerido simultáneamente con EcoRI-HíndlII, y Ndel-HindlII . Los clones que, en ambos casos, liberaban un fragmento de 400 pb fueron seleccionados para su posterior análisis. Secuenciación del gen de profilina
La secuenciación del ADN insertado el pBluescript se realizó basándose en el método de Sanger [ (19) ] modificado para ser utilizado con dideoxinucleótidos fluorescentes y amplificación en termociclador. El ADN a secuenciar se preparó de la siguiente forma: cultivos de E. coli DH5a, conteniendo los plásmidos de interés fueron crecidos en 15 mi de LB suplementado con 100 mg/ml de ampicilina, durante
16 horas, a 37°C y con agitación. El ADN se aisló por el método descrito en el apartado A) . Las reacciones de secuenciación se realizaron mezclando 700-1000 ng de molde,
25 pmoles del cebador y los reactivos indicados en el kit de secuenciación (PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Termination
Cycle Sequencing Kit, Perkin Elmer) siguiéndose las instrucciones del fabricante. Todos los fragmentos fueron secuenciados en las dos direcciones, utilizando cebadores comerciales (M13 -20 primer o reverse primer) o cebadores específicos.
Se secuenciaron 16 clones, obteniéndose en algunos casos secuencias representadas por varios clones. Todos los insertos secuenciados estaban flanqueados por un codón de inicio (ATG) y un codón de terminación (TAA o TAG) , con los siguientes resultados:
-Inserto de Cynodon dactylon, plásmido pPC19, tenía 396 pb que codificaba para un polipéptido de 131 aminoácidos que fue llamado CdPROl.
-Los insertos de Olea europaea, plásmidos pPOll, pP013 y pPOlll, tenían 405 pb y codificaban para polipéptidos de 134 aminoácidos que fueron llamados OePROl, OePR02 y OePR03 , respectivamente. Las tres secuencias tenían una identidad del 97%. -Los insertos de Phleum pratense, plásmidos pPP19 y pPP112, tenían 396 pb y codificaban para polipéptidos de 131 aminoácidos que fueron llamados PpPR02 y PpPR03 , respectivamente . Las dos secuencias tenían una identidad del 98%.
-Los insertos de Parietaria judaica eran de diferente tamaño. El plásmido pPA18 tenía un inserto de 399 pb, que codificaba para un polipéptido de 132 aminoácidos. El plásmido pPA112 tenía un inserto de 396 pb, que codificaba para un polipéptido de 131 aminoácidos. Los polipéptidos fueron llamados PjPROl y PJPR02, respectivamente. Las dos secuencias tenían una identidad del 96%.
-Inserto de Mercurialis annua, tenía 399 pb que codificaba para un polipéptido de 132 aminoácidos que fue llamado MaPROl.
-Se secuenciaron seis insertos procedentes de Helianthus annuus. Dos de ellos, pPG221 y pPG216, correspondían al gen completo, tenía un inserto de 402 pb y codificaban para un polipéptido de 133 aminoácidos. Los cuatro plásmidos restantes, pPG12, pPG14, pPG16, y pPG18, eran secuencias parciales del gen, con su extremos 3' truncados. Los polipéptidos fueron llamados HaPROl, HaPR02, HaPR03 , HaPR04, HaPR05, y HaPR06, respectivamente. Las seis secuencias tenían una identidad media del 98%. Análisis de las secuencias
Las secuencias obtenidas fueron comparadas con otras profilinas existentes en el banco de datos (EMBL Data Bank y SWISS-Prot) utilizando el paquete informático GCG
(Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group) . Cuando se compararon con otras profilinas vegetales (maíz, cebada, alubia, hierba timotea, abedul, y tabaco) [(10), (14),
(15), (16), (17) y (27) Mitter ann, I., Swoboda, I., Pierson, E., Eller, N., Kraft, D., Valenta, R. , and Heberle-Bors, E. (1995) . Molecular cloning and charac- terization of profilin from tobáceo (Nicotiana tabacum) : increased profilin expression during pollen maturation. Plant. Mol. Biol. 27, 137-146] se encontró una gran homología entre ellas, con más del 70% de residuos idénticos. Por el contrario, cuando se comparó un grupo de profilinas vegetales con otras profilinas eucariótas de animales (hombre, toro) , levaduras o protistas se encontró una menor homología. Así por ejemplo, la profilina CdPROl de Cynodon dactylon tenía una identidad del 46% con Acanthamoeba castellana (EMBL Data Bank M38038) ; del 42% con Physarυm polycephalum (M38038) y del 32% con la profilina I humana
(J03191) . Cuando se compararon profilinas de diferentes orígenes se observó que, aunque presentan diferencias notables, debido a que comparten una función similar, existen unas regiones donde se encuentran un gran número de residuos conservados que serían fundamentales para su función fisiológica. Subclonación del gen de profilina en el vector de expresión pKN172
Los vectores recombinantes (2 mg) derivados del pBluescript fueron digeridos con las endonucleasas de restricción Hi-ndlII y Ndel . El fragmento de 400 pb, que con- tenía el gen de profilina, fue separado por electroforesis en gel de agarosa y aislado del gel. Este fragmento fue ligado al vector de expresión pKΝ172, digerido con las mismas enzimas . La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5a. Las co- lonias que portaban los plásmidos recombinantes fueron se leccionadas mediante una PCR analítica, en la cual se utilizó como molde una cantidad minúscula de la colonia. El ADΝ plasmídico de los clones positivos se analizó mediante endonucleasas de restricción, seleccionándose un clon que tuviera el fragmento deseado. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa utilizada en la expresión E. coli BL21 (DE3) [(21)]. Esta cepa tiene en su cromosoma un lisógeno del fago 1 conteniendo el gen de la ARN polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor la cUV. La selección y crecimiento de esta cepa se realizó rutinariamente en placas de LB conteniendo 200 mg/ml de ampicilina. Expresión de la profilina en E. coli
E. coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido pPC19, que codificaba para la profilina CdPROl de Cynodon dactylon, se creció en LB con 200 mg/ml de ampicilina a 37°C con agitación. A las 16 horas, se diluyó el cultivo hasta una densidad óptica de 0.3-0.4. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0.6, se añadió 0.6 mM de IPTG. A las 3 horas de inducción, el cultivo se recogió por centrifugación a 4000 xg durante 5 minutos, y el sedimento, después de pesado, se congeló a -20°C. Las células se resuspendie- ron en 1/10 del volumen original, utilizando 50 mM Tris- HC1, pH 7.5 y NaCl 100 mM. Alícuotas de las muestras, conteniendo aproximadamente 20 mg de proteína, se analizaron en SDS-PAGE 12.5%. se detectó una banda, por tinción de Coomassie, de unos 14 kDa, que estaba mucho más intensa que en el control de pKN172 sin inserto. La banda, cuantificada por densitometría, constituía un 20-30% de proteína total. Purificación de la profilina recombinante
Las células, procedentes de la expresión descrita en el apartado anterior se sonicaron en hielo durante 2 minutos, en intervalos de 20 segundos. El extracto obtenido se clarificó por centrifugación a 14000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante, conteniendo la profilina expresada, se distribuyó en alícuotas conteniendo 15 mg de proteína, que se aplicaron a una columna de 1 x 7 cm de Sepharose-poli (L) -prolina. La columna fue lavada con 7 volúmenes de tampón PBS, 3 volúmenes de 2 M urea en PBS, y finalmente la proteína retenida fue eluída con 6 M urea en PBS. Las fracciones que contenían proteína fueron mezcladas y dializadas durante 16 horas frente a agua destilada. La muestra dializada fue liofilizada, y resuspendida en 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. Un ejemplo del proceso de purificación de la profilina CdPROl de Cynodon dactylon se presenta en la figura 1, y de la profilina OePROl de Olea europaea en la figura 2. Se puede apreciar como el 95% de la proteína expresada se encuentra en forma soluble. La migración de las profilinas recombinantes era similar a la de la profilina natural utilizada como control . Las preparaciones así obtenidas contenían >99% de profilina, como se determinó mediante SDS-PAGE seguida de tinción con plata
(Fig. 3) . Purificación de la profilina recombinante (Método alternativo I)
En los casos en los cuales la profilina expresada en E. coli no era soluble, y quedaba en el sedimento después de la lisis bacteriana, se diseño un procedimiento alter- nativo. Las células eran resuspendidas en tampón STE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA) suplementado con 100 mg/ml de lisozima, e incubadas durante 15 min en hielo. Posteriormente se añadieron 5 mM ditiotreitol (DTT) y 1.5% N-lauril sarcosina (sarcosil) , y se agitó 5 s. Las lisis se completaba con una sonicación de 20 s. El lisado se clarificaba por centrifugación, y al sobrenadante se le añadía 2% de Tritón X-100, y se agitaba otros 5 s. El lisado conteniendo la profilina era aplicado a la columna de poli-L-prolina como se indicará más adelante. Purificación de la profilina recombinante (Método alternativo II)
Otro método utilizado para la solubilización de la profilina recombinante insoluble es el siguiente: La lisis se realiza en idénticas condiciones que en el ejemplo IX (incubación en tampón STE con lisozima y sonicación de 20 s) , pero se clarificaba por centrifugación. El sedimento, conteniendo la profilina insoluble, era solubilizado con 8 M urea en 100 mM glicina-NaOH pH 9.0 y pasado a través de una columna de Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) equilibrada en 100 mM glicina-NaOH pH 9.0. A la proteína eluida se añadió 5 mM DTT y se dejo incubar a 4°C durante 16 h. La muestra se sometió a cromatografía de afinidad en Sepharosa-poli-L-prolina como se indicará más adelante. Detección de la profilina recombinante con antisueros de conejo frente a profilina de Helianthus annuus
Se corrieron en SDS-PAGE 12.5%, diferentes muestras procedentes de los distintos pasos de la expresión y purificación de profilina, y se transfirieron a membrans de PVDF o nitrocelulosa. Las tiras de membrana, conteniendo las proteínas transferidas, se incubaron con diluciones 1:3000 de suero de conejos inmunizados con profilina purificada de polen de girasol. Después de los lavados, se incubaron con diluciones 1:2000 del anticuerpo conjugado a la enzima peroxidasa. Como se muestra en las figuras 4 y 5, se detectó una banda de reacción mayoritaria a 14 kDa, y otra bandas de menor intensidad en torno a 30 kDa, que podría ser debida a la formación de dímeros de profilina, como describe Babich et al. [(28) Babich, M. , Foti, L.R.P., Sykaluk, L.L., and Clark, C.R. (1996). Profilin forms tetramers that bind to G-actin. Bioche . Biophys. Res. Commun. 218, 125-131] . Otras bandas de menor intensidad, que se aprecian sólo en los extractos de E. coli , podrían deberse a reacciones inexpecíficas ya que también se observan en el control sin inserto. Las figuras 4 y 5, muestran la gran efectividad de la columna de Sepharosa- poli-L-prolina, ya que solo un 5% de la profilina aparece en la fracción no retenida, tanto en la purificación CdPROl de Cynodon dactylon que se muestra en la figura 4, como la de OePROl de Olea europaea que se muestra en la figura 5. Detección de la profilina recombinante con anticuerpos IgE procedentes de pacientes atópicos Se separaron por SDS-PAGE las proteínas del extracto alergénico de Cynodon dactylon y la profilina CdPROl recombinante, y después de ser transferidas a membranas se incubaron con sueros de pacientes alérgicos a Cynodon dactylon. Las profilinas recombinantes mostraron una re- actividad similar a las proteínas del extracto natural por las IgE del suero de los pacientes, como se puede observar en la figura 6. Igualmente en pacientes alérgicos a gramíneas, donde la proporción de Cynodon dactylon es menor (siendo predominantes las plantas Poa pratensis, Phleum pratense, Lolium perenne..) , también se aprecia reactividad cruzada.
Identidad de epítopos entre la profilina natural y recombinante CdPROl de Cynodon dactylon
Para estudiar si CdPROl de Cynodon dactylon era idé- ntica a la profilina natural, se realizaron experimentos de inhibición. Una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a C-πodon dactylon se incubó con 10 mg de CdPROl por mi de suero, o BSA como control. La adsorción se realizó durante toda la noche a 4°C con agitación moderada. Estos sueros se utilizaron para detectar reactividad con extractos proteicos de Cynodon dactylon, profilinas purificadas naturales o recombinantes transferidos a PVDF. La figura 7 muestra que las IgE antiprofilina presentes en los sueros de los pacientes eran adsorbidas por la profilina recombinante, ya que no eran capaces de detectar ninguna banda de 14 kDa correspondiente a la profilina. La banda que aparece a 32 kDa en la muestra de profilina natural, pudiera ser el alérgeno mayor de Cynodon dactylon [(29) Matthiesen, F., Schumacher, M.J., and Lowenstein, H. (1991) . Characterization of the major allergen of Cynodon dactylon (Bermuda grass) pollen, Cyn d I. J. Allergy Clin. Immunol. 88, 763-774] , que en pequeñísimas cantidades copurificaría con la profilina después de un sólo paso por Sepharosa-PLP.
Simulación de la estructura tridimensional de la profilina y predicción de péptidos antigénicos
Las profilinas de plantas y del eucariota inferior
Acanthamoeba son lo suficiente homologas, alrededor del 40%, como para poder realizar un modelo por homología de una profilina de plantas, se ha elegido como base la de
Phleum pratense PpPR03.
La estructura seleccionada fue la profilina II de Acanthamoeba castellana , y se realizo según el programa Whatlf, visualizándose mediante el programa INSIGHT II, versión 2.3.5 (Molecular Modeling System) . Este modelo tridimensional deducido se presenta en la figura 8. La predicción de las estructuras con posibilidad inmunogénica se realizó teniendo en cuenta los siguientes parámetros : - Accesibilidad.
Factor de temperatura (en estrucutras cristalográficas) .
Predicción de la estructura secundaria, teniendo en cuenta que las estructuras en bucle, son las más favorecidas .
Características de loa aminoácidos de la zona. Regiones que presenten secuencias diferentes entre mamíferos y plantas.
Este último requisito permite que los péptidos ele- gidos no sean inmunogénicos en mamíferos, concretamente el hombre. Los péptidos seleccionados según estos criterios aparecen en la figura 9, con todos los péptidos correspondientes a las profilinas secuenciadas . Purificación y caracterización de la profilina natural de
Helianthus annuus
Purificación cromatográfica de la profilina de Helianthus annuus El aislamiento de profilinas de polen de girasol mediante cromatografía de afinidad en columna de Sepharosa- PLP resultó altamente efectivo, según se pudo evaluar mediante SDS-PAGE (Fig. 10) , ya que tan sólo se obervaron unas tenues bandas de contaminantes. El peso molecular de la banda de proteína determinada por análisis de imagen en el sistema BIO-IMAGE fue de 15.7 kDa.
La fracción 6 M eluída de la columna de Sepharose-PLP que contenía profilina fue purificada posteriormente, con el fin de eliminar los contaminantes menores y para poder llevar a cabo posteriormente la secuenciación de aminoácidos y los ensayos de inmunización. Se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico en el sistema micropre- parativo de alta resolución SMARTTM (Pharmacia LKB, Sweden) . Se empleó una columna de intercambio aniónico (MonoQ PC 1.6/5) . Se aplicaron 40 mg de fracción de profilina mediante inyección de 1 mi de muestra disuelta en Tris-HCl 40 mM, pH 8.0. La elución se llevó a cabo mediante un gradiente lineal generado por la adición de NaCl 1M al tampón inicial . Gracias a esta técnica obtuvimos una muestra de profilina pura, que eluyó como un pico simétrico a una concentración de 0.25 M NaCl .
Para la estimación del peso molecular se empleó también en el sistema SMART con una columna de tamizado molecular Superdex 75 PC 3.2/30. La muestras se aplicaron a una concentración de 20 mg/ml en tampón fosfato 0.05 M, NaCl 0.15 M pH 7.0 (PBS) mediante inyección de 20 mi. Se mantuvo un flujo de 40 mi/min durante todo el proceso cromatográfico y a 8°C. En el calibrado de la columna se emplearon grupos de proteínas de peso molecular conocido. Utilizando esta técnica se estimó el peso molecular nativo que fue de 19.1 kDa. El perfil cromatográfico obtenido se muestra en la figura 11.
Las muestras de profilina pura fueron también carac- terizadas por isoeléctroenfoque en geles de agarosa (Aga- rose-IEF) . Aquí, se detectó la presencia de tres isoformas (Fig. 12) con pls 4.41, 4.46 y 4.50 respectivamente. Composición de aminoácidos de la profilina de Helianthus annuus Se determinó la composición en aminoácidos de la profilina purificada por el sistema SMART. Para ello se disolvieron 20 mi de la muestra de profilina purificada en 200 mi de agua destilada; de esta disolución, se emplearon 4 mi para el análisis de aminoácidos en un Beckman Analyser modelo 6300 intercambiador iónico, tras hidrólisis a 115°C durante 16 h. , en 100 mi de HC1 6 N, fenol 0.2% conteniendo también norleucina 2 nmol. Después de la hidrólisis, el ácido fue eliminado en Speedvac y los aminoácidos resultantes se disolvieron en 100 mi de tampón de muestra Beckman conteniendo 2 nmol de homoserina. El instrumento se utilizó siguiendo los programas del fabricante con el uso de sus tampones. El análisis de los datos se efectuó en un ordenador externo utilizando el software de adquisición de datos Perkin Elmer/Nelson. Secuenciación proteica de la profilina de Helianthus annuus Tras observar que el extremo N-terminal de la profilina estaba bloqueada, se decidió llevar a cabo la secuenciación de péptidos internos, para ello se digirió enzimáticamente la muestra con tripsina modificada (Pro- mega) , o bien, lisil endopeptidasa (Wako) durante 24 h a 37°C. Los péptidos resultantes fueron reducidos/carboxim- utilados, extraídos con TFA 0.1%, CH3CN y después sometidos a HPLC de fase reversa utilizando un equipo Hewlett Packard 1090 equipado con un colector de fracciones Iseo modelo 2150 y una columna de 25 cm Vydac C-18, equilibrada con un 98% de tampón A (TFA al 0,06%) y un 2% de tampón B (TFA al 0.052%, acetonitrilo 80%. Los péptidos fueron eluídos con el siguiente programa de gradiente: 0-60 min (2-37% B) , 60- 90 min (37-75% B) y 90-105 min ( 75-98% B) y fueron detectados por su absorbancia a 210 nm. Las cantidades digeridas, generalmente en el rango de 25-250 pmol fueron fraccionadas en columnas ID de 2.1 mm, eluídas a 0.15 mi/min, mientras que las cantidades mayores lo fueron en columnas de 4.6 mm eluídas a 0.15 mi/min. Después de la carga, los tubos de muestra se aclararon con 50 mi de ácido trifluoroacético el cual fue entonces sobre añadido en capa sobre el filtro de secuenciación.
El peso molecular de los péptidos se estudió por espectrometría de masas de desorpción por láser utilizando un espectrómetro de masas VG/Fisons TofSpec equipado con un láser de nitrógeno (337 nm) y un tubo de dirección linear de 0.65 m.
La secuenciación de los péptidos resultantes se rea- lizó con secuenciadores Applied Biosystems modelos 470A ó 477. Las secuencias resultantes aparecen en la figura 13 comparándolas con las secuencias obtenidas por la secuenciación de ADNc. Las secuencias peptídicas parciales coinciden en algunos casos con alguna de las secuencias de- ducidas de los genes clonados. En otros casos, las secuencias no coinciden con las obtenidas por clonación lo que indicaría que la existencia de otras isoformas o variantes no clonadas . Reactividad cruzada de la profilina de Helianthus annuus La naturaleza alergénica de la profilina purificada fue confirmada mediante SDS-PAGE Immunoblotting. Para ello, se transfirieron a membranas PVDF tres calles de profilina sometida a electroforesis y se revelaron con una mezcla de sueros humanos positivos a girasol, hierbas y frutos de Rosaceas (manzana, pera y melocotón) . En los dos últimos casos (hierbas y frutos) , la participación de la profilina como alérgeno, ha sido apuntada y definida como causante de la reactividad cruzada. La fijación de IgE a partir de los 3 sueros de grupo en la banda de profilina se puede observar en la figura 14.
La muestra de profilina pura (tras realizar la cromatografía SMART) se empleó para obtener un antisuero policlonal, con el fin de investigar las posibles reacciones cruzadas antigénicas con diferentes extractos alergénicos, mediante SDS-PAGE Immunoblotting. Primeramente, algunos extractos en cuya composición se conocía la existencia de las profilinas se incubaron con suero anti-profilina de girasol (Fig. 15) . Como se puede observar, los cuatro extractos analizados mostraron unión de IgG en la banda doblete localizada entre 14.4 y 20.1 kDa correspondiente a la profilina.
Finalmente, se evaluó la posible naturaleza profilínica de las proteínas de diferentes extractos alergénicos comunes. Los resultados se muestran en la figura 16. Se encontraron proteínas fijadoras de IgG (lo que es indicativo de su naturaleza profilínica o de un alto grado de homología) en extractos de polen (Phleum, Olea, Parietaria y Mercurialis) , así como en estambres de la flor del azafrán y del hongo Aspergillus fυmigatus. Por otro lado, no se observó ninguna fijación en principio en extractos de epitelio de perro, ácaros u hongos. USOS Y ADMINISTRACIÓN
La presente invención cubre el uso de la profilina de las plantas descritas o péptidos sintéticos derivados de ella para tratamientos de insensibilización en mamíferos. El método de desensibilización implica la administración repetida por vias parenteral (subcutánea, intravenosa o intramuscular) , oral, nasal o rectal del alérgeno en cuestión. Tanto la proteína como sus péptidos pueden administrarse tanto solos como en combinación con otros diluyentes, de acuerdo con la legislación vigente y los procedimientos galénicos al uso. Un rango desde 1 picogramo a 10 miligramos por aplicación puede ser usado.
La presente invención también cubre la utilización de profilinas recombinantes para cualquier uso diagnóstico "in vivo", tales como: Prick test, intradermo-reacción o pruebas de Provocación, utilizando un rango desde 1 picogramo a 10 miligramos por aplicación. También cubre la utilización de profilinas recombinantes para diagnóstico "in vitro" mediante técnicas de: inmunoensayo, liberación de histamina y test de transformación linfoblástica.
LISTA DE SECUENCIAS
1. INFORMACIÓN GENERAL:
SOLICITANTE:
NOMBRE: Industrial Farmacéutica y de Especialidades, S.A.
CALLE: Alameda de Urquijo 27
CIUDAD: Bilbao
PROVINCIA: Vizcaya
PAÍS: España CÓDIGO POSTAL: 48008
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA PARA EPÍTOPOS DEL ALÉRGENO PROFILINA ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE ALERGIAS NÚMERO DE SECUENCIAS: 30 FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
TIPO DE SOPORTE: disco de 3 k "
ORDENADOR: compatible
SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
SOFTWARE: Microsoft Word para Windows 95 INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE :
NOMBRE: Javier Ungría López
NÚMERO DE REGISTRO: 392/1 INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
TELÉFONO: 914136062 FAX: 914136417
2. Información de SEQ ID NO: 1 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 396
(b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Cynodon dactylon
(b) Tejido: polen (iv) Características: 1-396 región codificante de CdPROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 1:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT GGACGACCAC CTCATGTGCG AGATCGAGGG 50 ACATCACCTC ACCTCCGCCG CCATCATCGG CCATGACGGC ACCGTCTGGG 100 CTCAGAGCGC CGCCTTCCCG GCGTTCAAGC CTGAGGAGAT GCCAACATCG 150 ATGAAGGACT TCGACGAGCC CGGGTTTCTT GCACCCACCG GCCTCTTCCT 200 CGGCCCCACC AAGTACATGG TCATCCAGGG CGAGCCCGGC GCCGTCATCC 250 GCGGAAAGAA GGGATCAGGT GGTGTCACTG TGAAGAAGAC TGGTCAGGCT 300 CTTGTGATCG GCATCTACGA CGAGCCAATG ACCCCCGGAC AGTGCAACAT 350 GGTGATCGAG AAGCTCGGCG ATTACCTCAT TGAACAAGGC ATGTAA 396 3. Información de SEQ ID NO: 2 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 131
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal (ü) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Cynodon dactylon
(b) Tejido: polen
(iv) Características: péptido CdPROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 2:
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Glu lie 5 10 15
Glu Gly His His Leu Thr Ser Ala Ala lie lie Gly His Asp Gly 20 25 30
Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Ala Phe Pro Ala Phe Lys Pro Glu 35 40 45
Glu Met Ala Asn lie Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly Phe Leu
50 55 60
Ala Pro Thr Gly Leu Phe Leu Gly Pro Thr Lys Tyr Met Val lie 65 70 75 Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val lie Arg Gly Lys Lys Gly Ser Gly
80 85 90
Gly Val Thr Val Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val lie Gly lie 95 100 105
Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val lie Glu
110 115 120
Lys Leu Gly Asp Tyr Leu lie Glu Gln Gly Met
125 130
4. Información de SEQ ID NO: 3 : (i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 396
(b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iü) Origen:
(a) Organismo: Phleum pratense
(b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-396 región codificante de PpPR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 3: ATGTCGTGGC AGACGTACGT GGACGAGCAC CTGATGTGCG AGATCGAGGG 50 CCACCACCTC GCCTCCGCGG CCATCCTCGG CCACGACGGC ACCGTCTGGG 100 CCCAGAGCGC CGACTTCCCC CAGTTCAAGC CTGAGGAGAT CACCGGCATC 150 ATGAAGGATT TCGACGAGCC GGGGCACCTC GCCCCCACCG GCATGTTCGT 200 CGCAGGTGCC AAGTACATGG TCATCCAGGG TGAACCCGGC GCGGTCATCC 250 GTGGCAAGAA GGGAGCAGGA GGCATCACCA TAAAGAAGAC CGGGCAGGCG 300 CTGGTCGTCG GCATCTACGA CGAGCCCATG ACCCCTGGGC AGTGCAACAT 350 GGTGGTGGAG AGGCTTGGCG ACTACCTCGT TGAACAAGGC ATGTAG 396
5. Información de SEQ ID NO: 4 :
(i) Características de la secuencia: (a) Longitud: 131 (b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen: (a) Organismo: Phleum pratense (b) Tejido: polen
(iv) Características: péptido PpPR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 4:
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Glu He 5 10 15
Glu Gly His His Leu Ala Ser Ala Ala He Leu Gly His Asp Gly 20 25 30
Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Asp Phe Pro Gln Phe Lys Pro Glu
35 40 45
Glu He Thr Gly He Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly His Leu 50 55 60
Ala Pro Thr Gly Met Phe Val Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val He 65 70 75
Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly 80 85 90
Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Val Gly He 95 100 105
Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu
110 115 120
Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Val Glu Gln Gly Met 125 130 6. Información de SEQ ID NO: 5 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 396
(b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Phleum pratense
(b) Tejido: polen (iv) Características: 1-396 región codificante de PpPR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 5:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT GGACGAGCAC CTGATGTGCG AGATCGAGGG 50 CCACCACCTC GCCTCCGCGG CCATCCTCGG CCACGACGGC ACCGTCTGGG 100 CCCAGAGCGC CGACTTCCCC CAGTTCAAGC CTGAGGAGAT CACCGGCATC 150 ATGAAGGATT TCGACGAGCC GGGGCACCTC GCCCCCACCG GCATGTTCGT 200 CGCAGGTGCC AAGTACATGG TCATCCAGGG TGAACCCGGC GCGGTCATCC 250 GTGGCAAGAA GGGAGCAGGA GGCATCACCA TAAAGAAGAC CGGGCAGGCG 300 CTGGTCGTCG GCATCTATGA CGAGCCCATG ACCCCTGGGC AGTGCAACAT 350 GGTGGTGGAG AGGCTTGGCG ACTACCTCGT TGAACAAGGC ATGTAG 396
7. Información de SEQ ID NO: 6 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 131
(b) Tipo: aminoácido (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Phleum pratense
(b) Tejido: polen ( iv ) Características : péptido PpPR02 ( v ) Descripción : SEQ ID NO : 6 :
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Glu He 5 10 15 Glu Gly His His Leu Ala Ser Ala Ala He Leu Gly His Asp Gly 20 25 30
Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Asp Phe Pro Gln Phe Lys Pro Glu 35 40 45
Glu He Thr Gly He Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly His Leu 50 55 60
Ala Pro Thr Gly Met Phe Val Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val He
65 70 75
Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly
80 85 90
Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Val Gly He
95 100 105
Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu 110 115 120
Arg Leu Gly Aεp Tyr Leu Val Glu Gln Gly Met 125 130
8 . Información de SEQ ID NO : 7 :
( i ) Características de la secuencia :
(a) Longitud: 396
(b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal (ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm
(iii) Origen:
(a) Organismo: Parietaria judaica
(b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-396 región codificante de PJPR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 7: ATGTCGTGGC AGGCGTACGT CGATGACCAC CTTATGTGCG ACGTCGGCGA 50 CGGCAATACA CTCGCTTCCG CCGCCATCAT CGGCCACGAT GGCAGCGTTT 100 GGGCTCAGAG CGCTAACTTC CCTCAGTTGA AGCCAGAAGA GGTTACTGGA 150 ATCATGAATG ATTTTAATGA GGGTGGATTT CTTGCCCCAA CCGGGTTGTT 200 CCTTGGAGGT ACAAAGTATA TGGTGATCCA AGGGGAGTCT GGAGCCGTGA 250 TCGGGAAGAA GGGTTCTGGA GGTGCCACTT TGAAGAAAAC TGGGCAAGCA 300 ATTGTTATTG GCATTTACGA CGAACCAATG ACCCCAGGAC AATGCAATTT 350 GGTAGTAGAG AGGTTGGGCG ATTACCTCCT AGAACAAGGC ATGTAG 396
9. Información de SEQ ID NO: 8 : (i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 131
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iü) Origen:
(a) Organismo: Parietaria judaica
(b) Tejido: polen
(iv) Características: péptido PJPR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 8: Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp Val
5 10 15
Gly Asp Gly Asn Thr Leu Ala Ser Ala Ala He He Gly His Asp 20 25 30
Gly Ser Val Trp Ala Gln Ser Ala Asn Phe Pro Gln Leu Lys Pro 35 40 45
Glu Glu Val Thr Gly He Met Asn Asp Phe Asn Glu Gly Gly Phe
50 55 60
Leu Ala Pro Thr Gly Leu Phe Leu Gly Gly Thr Lys Tyr Met Val 65 70 75 Ile Gln Gly Glu Ser Gly Ala Val He Gly Lys Lys Gly Ser Gly 80 85 90
Gly Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln Ala He Val He Gly He 95 100 105
Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Leu Val Val Glu 110 115 120
Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Met
125 130
10. Información de SEQ ID NO: 9 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 399 (b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARN
(iii) Origen:
(a) Organismo: Parietaria judaica (b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-399 región codificante de PjPROl
(v) Descripción: SEQ ID NO: 9:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT TGATGACCAC CTTATGTGCG ACGTCGGCGA 50 CGGCAATACA CCCGCTTCCG CCGCTATCAT CGGCCATGAT GGCAGCGTTT 100 GGGCTCAGAG CGCTAACTTC CCTCAGTTGA AGCCAGAAGA GGTTACTGGA 150 ATCATGAATG ATTTTAATGA AGCTGGATTT CTTGCCCCAA CCGGGTTGTT 200 CCTTGGAGGT ACAAAGTATA TGGTGATCCA AGGGGAGTCT GGAGCCGTGA 250 TTCGTGGGAA GAAGGGTTCT GGAGGTGCCA CTTTGAAGAA AACTGGGCAA 300 GCAATTGTTA TTGGCATTTA CGACGAGCCA ATGACCCCAG GACAATGCAA 350 TTTGGTAGTA.GAGAGGTTGG GCGATTACCT TCTCGAACAG GGCCTGTAG 399
11. Información de SEQ ID NO: 10 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 132
(b) Tipo: aminoácido (c) Topología: lineal (ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Parietaria judaica
(b) Tejido: polen ( iv) Características : péptido PjPROl ( v ) Descripción : SEQ ID NO : 10 :
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp Val 5 10 15
Gly Asp Gly Asn Thr Pro Ala Ser Ala Ala He He Gly His Asp
20 25 30
Gly Ser Val Trp Ala Gln Ser Ala Asn Phe Pro Gln Leu Lys Pro 35 40 45
Glu Glu Val Thr Gly He Met Asn Asp Phe Asn Glu Ala Gly Phe 50 55 60
Leu Ala Pro Thr Gly Leu Phe Leu Gly Gly Thr Lys Tyr Met Val 65 70 75
He Gln Gly Glu Ser Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly Ser 80 85 90
Gly Gly Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln Ala He Val He Gly
95 100 105
He Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gln Cys Asn Leu Val Val 110 115 120
Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Leu 125 130
12. Información de SEQ ID NO: 11 :
(i) Características de la secuencia: (a) Longitud: 405 (b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen: (a) Organismo: Olea europaea (b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-405 región codificante de OePROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 11:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT TGATGATCAT TTGATGTGTG ACATTGAGGG 50 CCATGAAGAC CACCGCCTCA CCGCAGCTGC CATCGTCGGC CATGACGGTT 100 CTGTTTGGGC TCAGAGCGCT ACCTTCCCTC AGTTCAAGCC AGAGGAGATG 150 AATGGAATTA TGACAGATTT CAATGAACCT GGTCATCTGG CACCAACAGG 200 CCTACATCTT GGAGGAACAA AGTATATGGT GATTCAAGGA GAGGCTGGAG 250 CTGTCATCCG TGGAAAGAAG GGATCTGGTG GTATTACCAT TAAGAAGACT 300 GGCCAAGCAC TAGTTTTTGG TATCTACGAG GAGCCTGTAA CTCCAGGACA 350 ATGCAACATG GTTGTCGAGA GGTTGGGAGA CTACCTGGTC GAACAAGGCA 400 TGTAA 405
13. Información de SEQ ID NO: 12 :
(i) Características de la secuencia: (a) Longitud: 134
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen: (a) Organismo: Olea europaea (b) Tejido: polen
(iv) Características: péptido OePROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 12:
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly His Glu Asp His Arg Leu Thr Ala Ala Ala He Val Gly 20 25 30 His Asp Gly Ser Val Trp Ala Gln Ser Ala Thr Phe Pro Gln Phe 35 40 45
Lys Pro Glu Glu Met Asn Gly He Met Thr Asp Phe Asn Glu Pro 50 55 60
Gly His Leu Ala Pro Thr Gly Leu His Leu Gly Gly Thr Lys Tyr 65 70 75
Met Val He Gln Gly Glu Ala Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys
80 85 90
Gly Ser Gly Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val
95 100 105
Phe Gly He Tyr Glu Glu Pro Val Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met
110 115 120
Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Val Glu Gln Gly Met 125 130
14. Información de SEQ ID NO: 13 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 405
(b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Olea europaea
(b) Tejido: polen (iv) Características: 1-405 región codificante de OePR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 13:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT TGATGATCAT TTGATGTGTG ACATTGAGGG 50
CCATGAAGGC CACCGCCTCA CCGCAGCTGC CATCGTCGGC CATGACGGTT 100
CTGTTTGGGC TCAGAGCGCT ACCTTCCCTC AGTTCAAGCC AGAGGAGATG 150 AATGGAATTA TGACAGATTT CAATGAACCT GGTCATCTGG CACCAACAGG 200 CCTACATCTT GGAGGAACAA AGTATATGGT GATTCAAGGA GAGGCTGGAG 250 CCGTCATCCG TGGAAAGAAG GGATCTGGTG GTATTACCAT TAAGAAGACT 300 GGCCAAGCAC TAGTTTTTGG TATCTACGAG GAGCCTGTAA CTCCAGGACA 350 ATGCAACATG GTTGTCGAGA GGTTGGGAGA CTACCTGCTT GAACAAGGCC 400 TGTAA 405
15. Información de SEQ ID NO: 14 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 134
(b) Tipo: aminoácido (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Olea europaea
(b) Tejido: polen (iv) Características: péptido 0ePR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 14:
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly His Glu Gly His Arg Leu Thr Ala Ala Ala He Val Gly
20 25 30
His Asp Gly Ser Val Trp Ala Gln Ser Ala Thr Phe Pro Gln Phe 35 40 45
Lys Pro Glu Glu Met Asn Gly He Met Thr Asp Phe Asn Glu Pro 50 55 60
Gly His Leu Ala Pro Thr Gly Leu His Leu Gly Gly Thr Lys Tyr 65 70 75
Met Val He Gln Gly Glu Ala Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys 80 85 90 Gly Ser Gly Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val 95 100 105
Phe Gly He Tyr Glu Glu Pro Val Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met 110 115 120
Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Leu 125 130
16 . Información de SEQ ID NO : 15 : ( i ) Características de la secuencia :
(a) Longitud: 405
(b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Olea europaea
(b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-405 región codificante de OePR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 15: ATGTCGTGGC AGGCGTACGT TGATGATCAT TTGATGTGTG ACATTGAGGG 50
CCATGAAGGC CACCGCCTCA CCGCAGCTGC CATCGTCGGC CATGACGGTT 100
CTGTTTGGGC TCAGAGCGCT ACCTTCCCTC AGTTCAAGCC AGAGGAGATG 150
AATGGAATTA TGACAGATTT CAATGAACCT GGTCATCTGG CACCAACAGG 200
CCTACATCTT GGAGGAACAA AGTATATGGT GATTCAAGGA GAGGCTGGAG 250 CTGTCATCCG TGGAAAGAAG GGATCTGGTG GTATTACCAT TAAGAAGACT 300
GGCCAAGCAC TAGTTTTTGG TATCTACGAG GAGCCTGTAA CTCCAGGACA 350
ATGCAACATG GTTGCCGAGA GGTTGGGAGA CTACCTGCTA GAACAAGGCC 400
TGTAG 405
17. Información de SEQ ID NO: 16 : (i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 134
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen: (a) Organismo: Olea europaea
(b) Tejido: polen
(iv) Características: péptido 0ePR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 16: Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp He
5 10 15
Glu Gly His Glu Gly His Arg Leu Thr Ala Ala Ala He Val Gly 20 25 30
His Asp Gly Ser Val Trp Ala Gln Ser Ala Thr Phe Pro Gln Phe 35 40 45
Lys Pro Glu Glu Met Asn Gly He Met Thr Asp Phe Asn Glu Pro 50 55 60
Gly His Leu Ala Pro Thr Gly Leu His Leu Gly Gly Thr Lys Tyr 65 70 75
Met Val He Gln Gly Glu Ala Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys
80 85 90
Gly Ser Gly Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val
95 100 105
Phe Gly He Tyr Glu Glu Pro Val Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met
110 115 120
Val Ala Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Leu 125 130
18. Información de SEQ ID NO: 17 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 402 (b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm
(iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus (b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-402 región codificante de HaPROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 17:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50 TACTGGCCAG CATCTCACAT CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100 TTTGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TTAAACCTGA GGAGATGAAA 150 GGCATCATTA AGGAATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200 GTTCATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCTGGAGCTG 250 TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300 CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350 CAACATGGTT GTTGAGAGGC TTGGCGATTA CCTCCTCGAA CAAGGCATGT 400 AA 402
19. Información de SEQ ID NO: 18 :
(i) Características de la secuencia: (a) Longitud: 133
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
( ii ) Tipo de molécula : péptido
( iii ) Origen : ( a ) Organismo : Helianthus annuus
( b ) Tej ido : polen
( iv ) Características : péptido HaPROl
(v ) Descripción : SEQ ID NO : 18 :
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Ser Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30 Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Glu Phe Asp Glu Ala Gly 50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met 65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly
80 85 90
Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met 95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Met 125 130
20 . Información de SEQ ID NO : 19 :
( i ) Características de la secuencia :
(a) Longitud: 402
(b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen (iv) Características: 1-402 región codificante de HaPR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 19:
ATGTCGTGGC AGGCGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50
TACTGGCCAG CATCTCACAT CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100
TTTGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TCAAACCCGA GGAGATGAAA 150 GGCATCATTA AGGAATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200 GTTCATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCCGGAGCTG 250
TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300
CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350
CAACATGGTT GTTGAGAGGC TTGGCGATTA CCTGCTCGAA CAAGGCATGT 400 AA 402
21. Información de SEQ ID NO: 20 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 133
(b) Tipo: aminoácido (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen (iv) Características: péptido HaPR02 (v) Descripción: SEQ ID NO: 20:
Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He
5 10 15
Glu Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Ser Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30
Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Glu Phe Asp Glu Ala Gly 50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met
65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly 80 85 90 Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met 95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Leu Glu Gln Gly Met 125 130
22 . Información de SEQ ID NO : 21 : ( i ) Características de la secuencia :
(a) Longitud: 390
(b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARN (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-390 parte de la región codifican¬ te de HaPR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 21:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50 TACTGGCCAG CATCTCACAT CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100 TTTGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TTAAACCTGA GGAGATGAAA 150 GGCATCATTA AGGGATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200 GTTTATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCTGGAGCTG 250 TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300 CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350 CAACATGGTT GTTGAGAGGC TCGGTGACTA CCTCTAATGA 390
23. Información de SEQ ID NO: 22 : (i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 128
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen: (a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen
(iv) Características: secuencia parcial del péptido Ha- PR03 (v) Descripción: SEQ ID NO: 22:
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Ser Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30
Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Gly Phe Asp Glu Ala Gly
50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met 65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly 80 85 90
Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met 95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu
125
24. Información de SEQ ID NO: 23 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 390 (b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus (b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-390 parte de la región codifican¬ te de HaPR04 (v) Descripción: SEQ ID NO: 23:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50 TACTGGCCAC CATCTCACAT CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100
TTTGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TTAAACCTGA GGAGATGAAA 150
GGCATCATTA AGGAATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200
GTTCATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCTGGAGCTG 250
TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300 CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350 CAACATGGTT GTTGAGAGGC TCGGTGACTA CCTCTAATGA 390
25. Información de SEQ ID NO: 24 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 128 (b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
( ii ) Tipo de molécula: péptido
(iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus (b) Tejido: polen
(iv) Características: secuencia parcial del péptido Ha-
PR04
(v) Descripción: SEQ ID NO: 24:
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly Thr Gly His His Leu Thr Ser Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30 Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Glu Phe Asp Glu Ala Gly 50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met 65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly
80 85 90
Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met
95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Val
110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu 125
26. Información de SEQ ID NO: 25 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 390
(b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARN (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen (iv) Características: 1-390 parte de la región codifican¬ te de HaPR05 (v) Descripción: SEQ ID NO: 25:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50 TACTGGCCAG CATCTCACAC CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100 TATGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TTAAACCTGA GGAGATGAAA 150 GGCATCATTA AGGAATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200
GTTCATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCTGGAGCTG 250
TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300
CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350 CAACATGGTT GTTGAGAGGC TCGGTGACTA CCTCTAATGA 390
27. Información de SEQ ID NO: 26 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 128
(b) Tipo: aminoácido (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen ( iv ) Características : secuencia parcial del péptido Ha- PR05
( v ) Descripción : SEQ ID NO : 26 :
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Pro Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30
Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Glu Phe Asp Glu Ala Gly 50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met
65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly 80 85 90 Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met 95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu 125
28 . Información de SEQ ID NO : 27 : ( i ) Características de la secuencia :
(a) Longitud: 390
(b) Tipo: ácido nucleico
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-390 parte de la región codifican¬ te de HaPR06 (v) Descripción: SEQ ID NO: 27:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT CGATGAACAC TTGATGTGCG ACATTGAAGG 50 TACTGGCCAG CATCTCACAT CTGCCGCTAT TCTCGGTCTC GACGGTACTG 100 TTTGGGCTCA GAGCGCTAAG TTTCCACAGT TTAAACCTGA GGAGATGAAA 150 GGCATCATTA AGGAATTCGA CGAAGCTGGT ACTCTTGCTC CAACAGGTAT 200 GTTCATCGCG GGTGCAAAAT ATATGGTACT CCAAGGAGAG CCTGGAGCTG 250 TTATCCGTGG AAAGAAGGGA GCTGGAGGAA TATGCATCAA GAAAACGGGC 300 CAAGCTATGA TTATGGGAAT TTACGACGAG CCCGTTGCTC CTGGACAATG 350 CAACATTGTT GTTGAGAGGC TCGGTGACTA CCTCTAATGA 390
29. Información de SEQ ID NO: 28 : (i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 128
(b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido (iü) Origen: (a) Organismo: Helianthus annuus
(b) Tejido: polen
(iv) Características: secuencia parcial del péptido Ha- PR06 (v) Descripción: SEQ ID NO: 28:
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Glu Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Ser Ala Ala He Leu Gly Leu 20 25 30
Asp Gly Thr Val Trp Ala Gln Ser Ala Lys Phe Pro Gln Phe Lys 35 40 45
Pro Glu Glu Met Lys Gly He He Lys Glu Phe Asp Glu Ala Gly
50 55 60
Thr Leu Ala Pro Thr Gly Met Phe He Ala Gly Ala Lys Tyr Met
65 70 75
Val Leu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly
80 85 90
Ala Gly Gly He Cys He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met He Met 95 100 105
Gly He Tyr Asp Glu Pro Val Ala Pro Gly Gln Cys Asn He Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu
125
30. Información de SEQ ID NO: 29 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 420 (b) Tipo: ácido nucleico (c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: ADNc a partir de ARNm (iii) Origen:
(a) Organismo: Mercurialis annua (b) Tejido: polen
(iv) Características: 1-420 región codificante de MaPROl (v) Descripción: SEQ ID NO: 29:
ATGTCGTGGC AGACGTACGT CGACGACCAT TTGATGTGCG ACATTGATGG 50
ACAAGGCCAG CATCTCGCCG CTGCTTCCAT TGTTGGCCAC GACGGTAGCA 100 TTTGGGCTCA GAGCGCCTCT TTTCCTCAGT TGAAACCAGA GGAGATCACC 150
GGCATTATGA AGGATTTTGA TGAGCCAGGT CATCTTGCTC CTACAGGCTT 200
GTACATTGCA GGCACAAAAT ATATGGTTAT CCAGGGCGAA AGTGGCGCTG 250
TAATCCGTGG AAAGAAGGGA TCGGGAGGGA TCACTATAAA GAAAACTGGC 300
CAAGCTCTTG TGTTCGGAAT CTACGAGGAG CCGGTAACTC CGGGACAGTG 350 CAACATGGTG GTTGAGAGGC TCGGTGACTA CCTCATAGAA CAAGGCATGT 400 AA 402
31. Información de SEQ ID NO: 30 :
(i) Características de la secuencia:
(a) Longitud: 133 (b) Tipo: aminoácido
(c) Topología: lineal
(ii) Tipo de molécula: péptido
(iii) Origen:
( a ) Organismo : Mercurialis annua ( b ) Tej ido : polen
( iv ) Características : secuencia parcial del péptido Ma¬ PROl
( v ) Descripción : SEQ ID NO : 30 :
Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp He 5 10 15
Asp Gly Gln Gly Gln His Leu Ala Ala Ala Ser He Val Gly His 20 25 30 Asp Gly Ser He Trp Ala Gln Ser Ala Ser Phe Pro Gln Leu Lys 35 40 45
Pro Glu Glu He Thr Gly He Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly 50 55 60
His Leu Ala Pro Thr Gly Leu Tyr He Ala Gly Thr Lys Tyr Met 65 70 75
Val He Gln Gly Glu Ser Gly Ala Val He Arg Gly Lys Lys Gly
80 85 90
Ser Gly Gly He Thr He Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Phe 95 100 105
Gly He Tyr Glu Glu Pro Val Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val 110 115 120
Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu He Glu Gln Gly Met 125 130

Claims

REIVINDICACIONES
1. Moléculas de ADN recombinante caracterizadas porque codifican para un polipéptido que tiene al menos un epi- topo del alérgeno profilina, de plantas seleccionadas del grupo formado por Cynodon dactylon , Phleum pratense , Parietaria j udaica , Helianthus annuus , Olea europaea y Mercurialis annua .
2 . Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada por ser un fragmento de 396 nucleótidos de ADNc proveniente de ARNm de Cynodon dactylon con la SEQ ID N0:1.
3. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada por ser un fragmento de 396 nucleótidos de ADNc PpPR03 proveniente de ARNm de Phleum pratense con la SEQ ID NO: 3.
4. Molécula de ADN recombinante según la reivindación 1, caracterizada por ser un fragmento de 399 nucleótidos de ADNc PjPROl proveniente de ARNm de Parietaria j udaica con la SEQ ID NO: 9.
5. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación
1 , caracterizada por ser un fragmento de 405 nucleótidos de ADNc OePROl proveniente de ARNm de Olea europaea con la SEQ ID NO: 11.
6. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada por ser un fragmento de 402 nucleótidos de ADNc HaPR02 proveniente de ARNm de Helianthus annuus con la SEQ ID NO: 19.
7. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada por ser un fragmento de 402 nucleótidos de ADNc MaPROl proveniente de ARNm de Mercurialis annua con la SEQ ID NO: 29.
8. Moléculas polipeptídicas de alérgenos profilínicos re- combinantes útiles para el diagnóstico y tratamiento convencional de alergias polínicas, caracterizadas porque contienen al menos un epitopo del alérgeno profilina de plantas seleccionadas del grupo formado por Cynodon dactylon , Phleum pratense, Parietaria j udaica , Helianthus annuus, Olea europaea y Mercuralis annua .
9 . Molécula polipeptídica recombinante, según la reivin- dicación 16, caracterizada por ser unfragmento de 132 aminoácidos proveniente de la SEQ ID NO: 1 de Cynodon dactylon , correspondiente a la SEQ ID NO: 2.
10. Molécula polipeptídica recombinante, según la reivindicación 16, caracterizada por ser un fragmento de 131 aminoácidos proveniente de la traducción de la SEQ ID NO: 3 (ADNc PpPR03) de Phleum pratense, correspondiente a la SEQ ID NO: 4.
11. Molécula polipeptídica recombinante, según la reivindicación 16, caracterizada por ser un fragmento de 132 aminoácidos proveniente de la traducción de la SEQ ID NO: 9 (ADNc PjPROl) de Parietaria j udaica , correspondiente a la SEQ ID NO: 10.
12. Molécula polilpeptídica recombinante, según la reivindicación 16, caracterizada por ser un fragmento de 134 aminoácidos proveniente de la traducción de la SEQ ID NO: 11 (ADNc OePROl) de Olea europaea , correspondiente a la SEQ ID NO: 12.
13. Molécula polipeptídica recombinante, según la reivindicación 16, caracterizada por ser un fragmento de 133 aminoácidos proveniente de la traducción de la SEQ ID NO: 19 (ADNc HaPR02 ) de Helianthus annuus , correspondiente a la SEQ ID NO: 20.
14. Molécula polipeptídica recombinante, según la reivindicación 16, caracterizada por ser un fragmento de 134 aminoácidos proveniente de la traducción de la SEQ ID NO: 29 (ADNc MaPROl) de Mercurialis annua , correspondiente a la SEQ ID NO: 30.
15. Un vehículo microbiano de expresión en un organismo hospedador transformado que sea autorreplicable y sirva para expresar el ADN de las reivindicaciones 1 a 7 para producir los polipéptidos indicados en las reivindicaciones 8 a 14.
16. Un organismo hospedador, tanto eucariota como procariota, transformado con el vehículo de expresión capaz, en dicho organismo, de autorreplicable y sirva para expresar el ADN de las reivindicaciones 1 a 7 para producir los polipéptidos indicados en la reivindicaciones 8 a 14.
17. Un organismo hospedador según la reivindicación 16, que puede ser Escherichia coli .
18. Un método para producir un polipéptido que contenga al menos un epítopo de los alérgenos profilínicos, que implique el cultivo del organismo hospedador conteniendo el vehículo de expresión microbiano, que en el organismo mencionado se autorreplique y sirva para expresar el ADN de las reivindicaciones 1 a 7.
19. Un preparado que contenga un polipéptido con al menos un epitopo de los alérgenos profilínicos mencionados y producido por el método según la reivindicación 18.
20. Un preparado que contenga un polipéptido con al menos un epítopo de los alérgenos profilínicos mencionados y producido por síntesis química según las secuencias SEQ ID Nos: 2, 4, 10, 12, 20 y 30.
21. Aplicación de las moléculas recombinantes de las rei¬ vindicaciones 1 a 14 para el diagnóstico in vitro de alergias.
22. Aplicación de las moléculas recombinantes de las rei¬ vindicaciones 1 a 14 para la producción de vacunas desti¬ nadas al tratamiento convencional de alergias .
23. Aplicación de las moléculas recombinantes de las rei- vindicaciones 1 a 14, para la producción de péptidos que constituyen epítopos de células T capaces de actuar como vacunas con actividad anergizante (supresora de la res¬ puesta Th2) .
24. Aplicación de las moléculas recombinantes de las rei- vindicaciones 1 a 14, para la producción de isoformas re- combinantes mutantes que no den lugar a fijación de IgE para el tratamiento de alergias con reducida capacidad de producción de efectos adversos.
PCT/ES1998/000175 1997-06-24 1998-06-18 Adn recombinante que codifica para epitopos del alergeno profilina util para el diagnostico y tratamiento de alergias WO1998059052A1 (es)

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WO1992003551A1 (en) * 1990-08-13 1992-03-05 Biomay Biotechnik Produktions- Und Handelsgesellschaft M.B.H. Birch pollen allergen p14 for diagnosis and therapy of allergic diseases

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