WO1998050423A2 - Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic - Google Patents

Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic Download PDF

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WO1998050423A2
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Jean-Gérard Guillet
Gilles Guichard
Marina Ostankovitch
Francine Connan
Anne Quesnel
Jeannine Choppin
Jean-Paul Briand
Sylviane Muller
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Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Definitions

  • the present invention relates to peptide analogues and their uses, mainly in the field of the preparation of pharmaceutical compositions, in particular of vaccines, and for the in vitro or in vivo diagnosis of various pathologies.
  • Pseudopeptides represent a class of molecules of particular interest in the design of enzyme inhibitors. Cleavage by peptidases is involved in a variety of biological processes since it makes it possible to generate active protein or peptide fragments from inactive precursors. The idea that an isosteric link could be considered as a mime of the tetrahedral intermediate formed during the transition through the transition state, opened the way for pseudopeptide-type inhibitors. In the early 1980s, this approach was successfully used in the development of potent inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) and renin (Szelke et al, 1982; Boger et al., 1983 ) and HIV aspartic protease (Huff, 1991). More recently, several pseudopeptide selective inhibitors of Ras farnesyl transferase have been proposed. These molecules are of potential therapeutic interest in the treatment of cancers involving the mutated Ras oncogene (Buss &
  • Pseudopeptide analogues of peptide hormones have also been the subject of numerous studies with the primary objective of stabilizing the starting peptide and conserving activity. This strategy effectively allowed the discovery of powerful agonists (Chorev et al., 1979; Nagain et al., 1988;
  • the modifications carried out so far on the peptides for immunological use are essentially limited to the addition of sugars, to that of more or less long fatty acids to allow the emulsion of the resulting lipopeptides, to the cyclization by formation of disulfide or covalent bridges, as well as the addition of molecules such as biotin, to increase, for example, the sensitivity of immunochemical tests in solid phase.
  • pseudopeptides probably have very little or no immunogenicity, since they could not be transformed and presented to molecules of the major histocompatibility complex (MHC) to be recognized by helper T cells or by lymphocytes T cytotoxic.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the authors of this international application who are also the authors of the present application, had indeed, for the first time, demonstrated that the modification by replacement of a peptide bond -CO-NH- of the peptide chain of a peptide, by a -NH-CO- bond, and, if necessary by replacement of an amino acid of configuration L by an amino acid of configuration D, makes it possible to obtain peptide analogues (retro or retro-inverso respectively) likely to be used in the treatment of pathologies involving the humoral or cellular mediated immune response.
  • the abovementioned immunoretroids are compounds of the peptide type, namely compounds consisting of a chain of proteinogenic amino acids, at least one of the bonds -CO-NH-, and advantageously all the bonds
  • -CO-NH- of the peptide chain of the corresponding parent peptide, (not comprising an -NH-CO- bond in its peptide chain), is (are) replaced by one or more link (s) - NH-CO-, the chirality of each aminoacyl residue, whether or not involved in one or more -NH-CO- bonds mentioned above, being either conserved (retro peptide) or reversed (retro-inverso peptide) compared to corresponding aminoacyl residues constituting said parent peptide.
  • retro-inverso peptides any peptide and peptide analog corresponding to the definition given above of immunoretroids, said peptide more particularly consisting of a peptide chain in which at least one of the residues on the one hand is linked to at least one neighboring residue by a bond -NH-CO-, and on the other hand, is of opposite chirality to that of this same aminoacyl residue in the peptide chain of the parent peptide.
  • retro peptide any peptide meeting the definition given above of immunoretroids, said peptide more particularly consisting of a peptide chain in which at least one of the residues is linked to at least one neighboring residue by an -NH-CO- bond, the chirality of all the aminoacyl residues involved in at least one -NH-CO- bond being preserved relative to the corresponding residue of the peptide chain of the parent peptide.
  • proteinogenic amino acid is meant, in the above and what follows, any amino acid used in the constitution of a natural protein or peptide.
  • non-proteinogenic amino acid means, as opposed to the preceding definition, any amino acid not forming part of a natural protein or peptide.
  • non-proteinogenic amino acid is understood more particularly to mean any amino acid whose carbon carrying the side chain R, namely the group -CHR-, located between -CO- and -NH- in the natural peptide chain, is replaced by a motif which does not form part of a natural protein or peptide.
  • the object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions, and more particularly vaccines, comprising peptide analogues having a half-life clearly greater than that of natural peptides or natural proteins, or that of synthetic peptides whether or not derived from these.
  • natural proteins these natural proteins, or peptides whether or not derived from the latter, being further designated in the following by the expression "parent proteins or peptides"
  • parent proteins or peptides are analogues, while exhibiting biological activity, and more particularly immunological, comparable, or even superior, to that of the above-mentioned parent proteins or peptides, or else an activity different or opposite to that of said parent proteins or peptides.
  • Another object of the present invention is to provide methods of in vivo diagnosis or of in vivo evaluation of the capacity of the immune response of an individual in the context of pathologies in which natural peptides or natural proteins (exogenous or endogenous) are likely to intervene by binding to MHC molecules, the peptide-MHC complexes thus obtained occur at receptors located on T cells and recognizing said natural peptides or natural proteins in their form complexed with said MHC molecules.
  • the object of the invention is also to provide compositions and kits (or kits) for implementing the methods of diagnosis or in vivo evaluation of the immune response mentioned above.
  • the present invention also aims to provide methods of in vitro diagnosis of pathologies associated with the presence in the body of an individual of endogenous or exogenous proteins, these methods being carried out using peptide analogues as defined above. above, or using antibodies directed against the complexes between these antibodies and the MHC molecules, and having the advantage of being more efficient than current diagnostic methods carried out using parent peptides or proteins, or using antibodies directed against the latter.
  • the present invention also aims to provide new kits for the implementation of such in vitro diagnostic methods.
  • the present invention relates to the use of peptide analogs of parent peptides, these parent peptides being optionally derived from exogenous or endogenous proteins, said parent peptides interacting with MHC molecules in the context of pathologies involving an immune response to cell mediation, in humans or animals, said analogs being characterized in that they correspond to said parent peptides in which: at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain is modified, with the exception modifications of the retro type, or retro-inverso, or at least one amino acid of the peptide chain, is substituted by a non-proteinogenic amino acid, or - at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain, is modified , and at least one amino acid of said peptide chain is substituted by a non-proteinogenic amino acid, for the preparation of a medicament intended for the prevention or the treatment of the above-menti
  • the peptide analogues used in the context of the present invention correspond to said parent peptides in which at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain, is modified, with the exception of modifications of the retro type, or retro-inverso.
  • a peptide derived from a protein such as it exists in the natural state in the abovementioned organisms, in particular by fragmentation of said protein (in particular using appropriate proteases, then purification of the peptide in question), or by peptide synthesis (according to the methods conventionally used in this field)
  • a peptide derived from a protein such as it exists in the natural state but whose immunological activity has been modified, conserved or optimized by replacement of certain amino acids of the natural sequence by proteinogenic amino acids, for example following a screening of a library of analogous peptides obtained by peptide synthesis.
  • the subject of the invention is also the peptide analogues of parent peptides, these parent peptides being optionally derived from exogenous or endogenous proteins, said parent peptides being able to interact with MHC molecules in the context of pathologies in humans or animal, said analogs being characterized in that they correspond to said parent peptides in which: at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain is modified, with the exception of modifications of the retro type, or retro-inverso, or - at least one amino acid of the peptide chain, is substituted by a non-proteinogenic amino acid, or at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain, is modified, and at least one amino acid of the peptide chain , is substituted by a non-proteinogenic acid.
  • the abovementioned peptide analogs of the invention are characterized in that the number of amino-acyl proteinogenic residues or not, and linked by a modified or unmodified bond, is between approximately 5 and approximately 20, preferably between 8 and 12 for the peptide analogues binding to MHC class I molecules, and preferably between 8 and 16 for peptide analogues binding to MHC class II molecules.
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues as described above, characterized in that at least one of the peptide bonds -CO-NH- of the peptide chain of the parent peptide is replaced by a bond different from the -CO-NH- bond, said different bond being chosen in particular from the following:
  • a subject of the invention is also the peptide analogues as described above, and characterized in that at least one of the peptide bonds -CO-NH- of the peptide chain of the parent peptide is replaced by a bond of the retro type or retro-inverso as defined above, in the case where at least one of the amino acids of said peptide analog is a non-proteinogenic amino acid.
  • Preferred peptide analogues in the context of the present invention are characterized in that at least one of the peptide bonds -CO-NH- of the parent peptide chain or peptide is replaced by a methylene amino bond, or of the ⁇ -homologation type , or carba, or ketomethylene, or cyanomethylene amino, or hydroxyethylene amino.
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues of parent peptides involved in melanoma, in particular the MARTI 27-35 peptide, said parent peptide comprising, where appropriate, one or more mutations, such as the MARTI 27- mutated parent peptide.
  • Leu ⁇ 8 said peptide analogs corresponding to said parent peptides in which at least one of the peptide bonds -CO-NH- is modified, with the exception of modifications of the retro type, or retro-inverso.
  • the invention relates more particularly to the peptide analogues of the parent peptide Mart-1 27-35 of melanoma, comprising a methylene amino bond and corresponding to the following formulas: PI sequences P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
  • a subject of the invention is also the peptide analogues of the parent peptide Mart-127-35 of melanoma, comprising a bond of the ⁇ -approval 0 type and corresponding to the following formulas:
  • a subject of the invention is also the peptide analogues of the mutated parent peptide Mart-1 27-35 Leu-2, corresponding to the peptide Mart-1 27-35 in which the alanine in position 28 is replaced by leucine, and comprising a ⁇ -type binding between the same residues as in the case described above of the peptide analogs ⁇ 1 to ⁇ 9.
  • a subject of the invention is also the peptide analogues of MARTI 27-35 of which at least one of the -CO-NH- bonds is replaced by a -CH2- CH2- bond, such as the following analogs 1 to 8 (also designated carba pseudopeptides analogous to M ART):
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues of the parent peptides of the influenza virus, in particular of the parent peptide M58-66, said peptide analogs corresponding to said parent peptides in which at least one of the peptide bonds -CO-NH- is modified, with the exception of modifications of the retro type, or retro-inverso; advantageously, said analogs are chosen from those in which at least one of the -CO-NH- bonds is replaced by a -CH2-NH- bond, such as the following analogs:
  • the subject of the invention is also the peptide analogs of parent peptides of the AIDS virus, in particular peptides NEF 84-92, and GAG 77-85, said peptide analogs corresponding to said parent peptides in which at least one of the peptide bonds - CO-NH- is modified, with the exception of modifications of the retro type, or retro-inverso, said analogs being chosen in particular from:
  • NEF AVDLSHFLK NEFHEA1 A ⁇ (CHOH-NH) VDLSHFLK 98% 1046.50
  • NEFHEA2 AV ⁇ (CHOH-NH) DLSHFLK 95% 1046.56
  • NEFHEA3 AVD ⁇ (CHOH-NH) LSHFLK 83% + 15% 1029.00
  • NEFHEA4 AVDL ⁇ (CHOH-NH) )
  • SHFLK 98% 1047.97
  • NEFHEA5 AVDLS ⁇ (CHOH-NH) HFLK 99% 1047.08
  • Preferred peptide analogues in the context of the present invention are characterized in that at least one of the amino acids of the peptide chain of the parent peptide is substituted by a non-proteinogenic amino acid, as defined above.
  • non-proteinogenic amino acids used are chosen from the following amino acids:
  • R ⁇ , R2 and R3 represent independently of each other: a hydrogen atom, a hydroxyl, an alkyl radical of 1 to 25 carbon atoms, a radical containing an allyl group and having 3 to 25 carbon atoms , a radical containing one or more aromatic rings or not, in particular an aryl group, and having from 6 to 25 carbon atoms, and in particular the following groups: -CH3
  • one of the two groups R2 and R 3 may represent a side chain of natural amino acids when either Ri or the other of the two groups R2 and R 3 do not represent a hydrogen atom,
  • R, R2, Cet and N form a heterocycle of 4 to 8 carbon atoms, aromatic or not, optionally substituted, in particular a heterocycle of formula:
  • R ⁇ , R2 and R independently of each other, represent a side chain of a natural amino acid, or are as defined above, in particular:
  • R ⁇ , R 2 , R 3 and R4 independently of one another represent a side chain of a natural amino acid, or R ⁇ , R and R 3 , are such that defined above, and R4 has the same meaning as that given above for Ri.
  • R and R in particular the statin derivatives of formula:
  • non-proteinogenic amino acids used in the context of the present invention are chosen from;
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues of the parent peptides of the influenza virus, in particular of the parent peptide M58-66, said peptide analogs corresponding to said parent peptides in which at least one of the amino acids of the peptide chain, is substituted by a non-proteinogenic amino acid, such as the following analogs:
  • the abovementioned peptide analogues of the invention are selected from those capable of: on the one hand being recognized by the MHC molecules and of associating with the latter, in particular by implementing the following method:
  • J .1 labeled in particular by coupling to a radioactive, enzymatic or fluorescent marker, said labeled antibody specifically recognizing either the MHC molecules in their conformation dependent on their binding to the peptide analog, or a molecule which itself binds specifically to molecules of MHC in their abovementioned conformation, in particular ⁇ 2-microglobulin specifically recognizing MHC class I molecules,
  • the peptide analogues of the invention must be recognized by the MHC molecules and be associated with the latter, in particular in the context of the implementation of the recognition test described above. This association can be weak (detectable at concentrations of peptide analogs of the order of 10 ⁇ 4 to 10 " 5 M), intermediate (detectable at concentrations of peptide analogs of the order of 10 " ⁇ to 10 " ⁇ M ), or strong (detectable at concentrations of peptide analogues of the order of 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 9 M).
  • the peptide analogs recognized by the MHC molecules in the context of the present invention are preferably capable of binding for at least about 30 minutes to said MHC molecules.
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues as described above and characterized in that they are selected from those capable of: inducing in vitro the appearance and the growth of cytotoxic T lymphocytes from human cells or animal, in particular from mononuclear cells derived from peripheral blood (PBMC), in the presence of factors necessary for the growth and differentiation of cytotoxic T cells, to induce in vitro cytolysis by cytotoxic T lymphocytes, of target cells having on their surface the peptide analog associated with MHC molecules, said cytotoxic T lymphocytes being advantageously taken from a patient suffering from a pathology in which the parent peptide of the peptide analog studied is involved, and to induce in vitro the secretion of cytokines (or interleukins) by the aforementioned cytotoxic T lymphocytes, in particular IL-2, IL-4 or interferon y - said peptide analogs thus selected being:. either receptor agonists (TCR) recognizing the antigen
  • cytotoxic T cells cytotoxic T cells, and are derived from parent peptides which behave themselves as agonists or antagonists of said receptors,
  • partial agonists of said receptors and derived from parent peptides behaving themselves like agonists of said receptors, these partial agonists inducing in particular the secretion of one or more cytokines different from those whose secretion is induced by the parent peptides.
  • a more particular subject of the invention is the peptide analogues as described above and characterized in that they are selected from those: capable of inducing in vitro the appearance and growth of cytotoxic T lymphocytes from human cells or animal, in particular from mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), in the presence of factors necessary for the growth and differentiation of cytotoxic T cells, not inducing cytolysis by cytotoxic T lymphocytes, of target cells having on their surface the peptide analog associated with MHC molecules, said cytotoxic T lymphocytes being advantageously taken from a patient suffering from a pathology in which the parent peptide of the peptide analog studied is involved, not inducing in vitro the secretion of cytokines (or interleukins) by the aforementioned cytotoxic T lymphocytes, in particular IL-2, IL- 4 or the interferon ⁇ , said peptide analogs thus selected being antagonists of the cytotoxic T cell receptors.
  • PBMC peripheral blood
  • a subject of the invention is also the use of peptide analogues as defined above for the preparation of medicaments, in particular vaccines, intended for the prevention or the treatment of pathologies in which the parent peptides are agonists or antagonists of receptors recognizing the antigen of cytotoxic T cells, and more particularly of infectious neurodegenerative pathologies (of viral or bacterial origin), tumors, autoimmune and allergic.
  • the parent peptides are agonists or antagonists of receptors recognizing the antigen of cytotoxic T cells, and more particularly of infectious neurodegenerative pathologies (of viral or bacterial origin), tumors, autoimmune and allergic.
  • melanoma in particular using the peptide analogues of the MARTI 27-35 peptide described above.
  • herpes caused by the herpes simplex virus 6, - infections caused by human parvovirus B19, for example infectious gastroenteritis,
  • Table A Main autoimmune diseases (from top to bottom, from organ-specific autoimmune diseases to non-organ-specific autoimmune diseases).
  • the subject of the invention is also any pharmaceutical composition, characterized in that it comprises, as active principle, at least one peptide analog (agonist, if necessary partial, or antagonist) as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are in a form which can be administered orally, or parenterally, in particular at a rate of approximately 500 ⁇ g to 5 mg per dose, in particular at a rate of 3 doses per day.
  • the subject of the invention is more particularly the pharmaceutical compositions as described above, containing as active principle at least one antagonist according to the invention, and their use in the context of the treatment of autoimmune diseases.
  • a more particular subject of the invention is also the pharmaceutical compositions as described above, containing as active principle at least one partial agonist according to the invention, and their use in the context of the treatment of allergic diseases.
  • the subject of the invention is also any vaccine, characterized in that it comprises, as active principle, at least one peptide analogue, preferably an agonist, optionally partial, as defined above, in combination with a vehicle pharmaceutically acceptable.
  • the vaccines according to the invention are in a form which can be administered orally, or parenterally, in particular at the rate of approximately 500 ⁇ g to 5 mg per dose, in particular at the rate of 3 doses per day.
  • the subject of the invention is also any composition intended for the in vivo diagnosis of the abovementioned pathologies involving the cell-mediated immune response, in particular cytotoxic T lymphocytes, or for the in vivo evaluation of the immune response in the context of said pathologies, by implementation of a hypersensitivity skin reaction by intradermal injection of said diagnostic composition, characterized in that it comprises at least one peptide analogue, preferably an agonist, optionally partial, as defined above, in combination with a biologically acceptable vehicle.
  • a subject of the invention is also the use of peptide analogues as described above for the preparation of said compositions intended for the in vivo diagnosis of the abovementioned pathologies.
  • the invention also relates to the complexes between a peptide analog as defined above, and a molecule of the major histocompatibility complex.
  • the immune response involves the recognition of an endogenous or exogenous antigen by specialized cells.
  • the antigen must initially be adequately presented by antigen presenting cells (APC).
  • APC antigen presenting cells
  • B lymphocytes recognize epitopes carried by intact unmodified antigens
  • the presentation of the antigen to T lymphocytes is more complex since the antigen is first internalized by the presenting cell, proteolysed, then possibly re-expressed on its surface in the form of peptide fragments in association with the proteins of the major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • the T lymphocyte which does not recognize the native antigen, recognizes a peptide fragment associated with a MHC molecule.
  • MHC molecules essentially belong to two classes: I and IL Class I molecules are transmembrane glycoproteins consisting of a heavy polymorphic ⁇ chain associated in a non-covalent manner with a non-glycosylated light chain ⁇ 2m. Their crystallographic structure has been resolved (Bjorkman et al. (1987), Nature, 329: 506-512), and shows the presence of a groove forming the peptide presentation site, the bottom of which is composed of eight ⁇ sheets and the edges of two ⁇ propellers. These molecules are presented on the surface of almost all cells.
  • Class II molecules are also membrane glycoproteins made up of two polymorphic chains ⁇ and ⁇ linked non-covalently to form, as shown by the recently elucidated crystallographic structure (Brown et al. (1993), Nature, 364: 33-39 ), a pleated ⁇ platform supporting two ⁇ helices. The groove formed is the site of presentation of the peptide. These molecules are only expressed on the surface of certain cells, including macrophages and B cells.
  • Cytotoxic T lymphocytes (cells with CD8 markers) recognize proteolytic fragments of viral proteins associated with MHC class I molecules and cause the lysis of cells with the antigen.
  • Helper T lymphocytes (cells carrying CD4 markers) recognize fragments of exogenous proteins captured by endocytosis presented in association with MHC class II molecules and induce cellular stimulation of the immune response.
  • the subject of the invention is also the complexes between a peptide analog according to the invention, and a T cell receptor (also called T-peptide analog receptor complexes).
  • the invention also relates to the complexes between a molecule of the major histocompatibility complex, a peptide analog as defined above, and a T cell receptor (also designated ternary complex MHC-peptide analog-T receptor).
  • a subject of the invention is also the use of peptide analogues as defined above, for the implementation of a method of in vitro diagnosis of the pathologies mentioned above.
  • the subject of the invention is more particularly any method of in vitro diagnosis of pathologies involving the cell-mediated immune response, in particular cytotoxic T lymphocytes, namely pathologies associated with the presence in the organism of a patient, exogenous or endogenous peptides which can interact with MHC molecules, and which can be directly
  • ELIS A Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • kits or kits for implementing in vitro diagnostic methods as described above comprising:
  • the subject of the invention is also the antibodies directed against the MHC-peptide analog binary complexes as defined above, said antibodies being as obtained by immunization of an animal with at least one of the above-mentioned complexes, said antibodies being susceptible to form a complex with these binary complexes.
  • the antibodies according to the invention are polyclonal or monoclonal antibodies.
  • the aforementioned polyclonal antibodies are obtained by immunization of an animal with at least one MHC-peptide analog complex according to the invention, followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by sampling the serum of said animal, and separation of said antibodies from the others constituents of the serum, in particular by affinity chromatography on a column to which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, in particular a MHC-peptide analog complex according to the invention.
  • the monoclonal antibodies according to the invention can be obtained by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below.
  • an animal generally a mouse
  • a MHC-peptide analog complex according to the invention, the B lymphocytes of which are then capable of producing antibodies against said complex.
  • These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" (especially murine) myeloma cells to give rise to hybridomas. From the heterogeneous mixture of cells thus obtained, a selection is then made of cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely.
  • Each hybridoma is multiplied in the form of a clone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to the MHC-peptide analog complex of the invention can be tested for example by ELISA, by immunoblotting in one or two dimensions, in immunofluorescence, or using a biosensor.
  • the monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified in particular according to the affinity chromatography technique described above.
  • the antibodies according to the invention are more particularly characterized in that they are capable of forming a complex with MHC-peptide analog complexes, and / or with MHC-peptide complexes or parent proteins corresponding to said peptide analogs.
  • the anti-MHC-peptide analogues antibodies of the invention recognize the MHC-peptide complexes or parent proteins mentioned above with an affinity at least equal to that presented by the anti-MHC-peptide complexes or parent proteins vis-à-vis MHC-peptide complexes or parent proteins.
  • the affinity mentioned above can be measured by the equilibrium affinity constant Ka of the complexes involving one of the above antibodies with one of the above complexes.
  • the subject of the invention is also any pharmaceutical composition, characterized in that it comprises antibodies as defined above, in association with a physiologically acceptable vehicle, as well as their use in the context of the treatment of the abovementioned pathologies.
  • the invention also relates to the method for screening for peptide analogues as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
  • MHC in their abovementioned conformation, in particular ⁇ 2-microglobulin specifically recognizing MHC class I molecules,
  • the subject of the invention is also any kit or kit for the implementation of a method for screening for peptide analogues as defined above, comprising: - MHC molecules, and / or
  • - antibodies specifically recognizing MHC molecules in their conformation dependent on their binding to said peptide analog, advantageously fixed on a solid support, or supplied with the reagents necessary for their fixing on the solid support, and / or - labeled antibodies, in particular by coupling to a radioactive, enzymatic or fluorescent marker, specifically recognizing either the MHC molecules in their conformation dependent on their binding to the peptide analog, or a molecule which itself binds specifically to the MHC molecules in their abovementioned conformation, in particular ⁇ 2-microglobulin specifically recognizing MHC class I molecules, and / or
  • the method of synthesis in the liquid phase consists in successively condensing the aminoacyles two by two in the required order or in condensing aminoacyles and fragments previously formed and already containing several aminoacyles in the appropriate order, or alternatively several fragments previously thus prepared, it being understood that care will have been taken beforehand to protect all the reactive functions carried by these aminoacyls or fragments, with the exception of the amino functions of the one and carboxyls of the other or vice versa, which should normally be involved in the formation of peptide bonds, in particular after activation of the carboxyl function, according to methods well known in the synthesis of peptides.
  • protective groups of urethane type (Boc, Fmoc benzyloxycarbonyl or allyloxycarbonyl) to protect the N-terminal ends of amino acids and groups of ester type (methyl, ethyl, benzyl, tert-butyl, allyl or even benzhydrilglycolamide). ) to protect the C-terminal ends of amino acids.
  • Such a synthesis can be carried out by first condensing the aminoacyl residue AA1 whose COOH function is protected with the aminoacyl residue AA2 whose NH 2 function is protected. The amino function of the AA2 residue in the AA2-AA1 fragment thus obtained is then deprotected, in order to subsequently condense said fragment with the aminoacyl residue AA3, the amino function of which is protected. The preceding steps are repeated as many times as there are aminoacyl residues to be introduced into the chain of retro analogs to be synthesized. According to another preferred technique of the invention, use is made of that described by RD Merrifield in the article entitled “Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154).
  • a very porous polymer resin on which the first C-terminal amino acid (in this case AA1-OH) of the chain is fixed.
  • This amino acid is attached to the resin via its carboxylic group and its amino function is protected, for example by the t-butyloxycarbonyl group.
  • the protective group of the amino function is removed by washing the resin with an acid.
  • the protective groups of the various amino acids constituting the peptide chain are removed and the peptide is detached from the resin, for example using hydrofluoric acid.
  • One or more of the synthesis steps described above can be interrupted in order to insert a bond different from the -CO-NH- bond between certain aminoacyl residues, and / or one or more non-proteinogenic amino acids.
  • Diagram 1 Schematic representation of the peptide and reduced bonds.
  • the reduced bond or methylene amino has the particularity of being more flexible than the peptide bond due to a free rotation of the carbon-carbon bond (diagram 1).
  • the introduction of a reduced bond can locally modify the orientation of the side chains of amino acids.
  • the reduced bond can exist in its protonated form at physiological pH.
  • the modifications brought about by the presence of a reduced bond namely the modification of the structure and the modification of the hydrophilic character of the parent peptide, can have implications in the phenomena of fixation and recognition of the antigen.
  • each reduced peptide was carried out in solid phase and in conventional Fmoc chemistry.
  • the reduced bond is obtained by condensation of an N-protected ⁇ -amino aldehyde with the ⁇ -amino acid immobilized on the resin.
  • the imine formed is reduced in situ by sodium cyanoborohydride to lead to reduced binding according to the method described by Sasaki and Coy in 1987 (diagram 2).
  • Diagram 3 Synthesis of the N-protected ⁇ -amino aldehydes by the method of Fehrentz and Castro.
  • PG Fmoc protective group.
  • the following amino acids of the reduced peptide sequence are coupled in a conventional manner.
  • the reduced peptide is deprotected and detached from the resin by trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Each reduced peptide is purified by high pressure liquid chromatography with reverse phase polarity (RP-HPLC).
  • the mass of each peptide is controlled by laser desorption assisted by a matrix (MALDI) using the Bruker Protein TOF spectrometer.
  • MALDI matrix
  • the ⁇ analogs are obtained by coupling ⁇ -homo amino acids in place of natural amino acids.
  • Diagram 4 Schematic representation of an amino acid and a ⁇ -homo amino acid
  • the ⁇ -homo amino acid is an amino acid in which a methylene group has been inserted between the ⁇ carbon and the carboxyl.
  • the configuration of C ⁇ is unchanged (diagram 4).
  • the incorporation of a ⁇ -homo amino acid in place of an amino acid in a peptide sequence has the effect of lengthening the peptide chain of the resulting peptide analogs. These longer peptide analogs can be twisted, braced to enter the binding pocket of the MHC class I molecule. In this case, some side chains can be moved laterally or their orientation changed, which can lead to preferential interactions with the MHC class I molecule and / or TCR.
  • the ⁇ -homo amino acids are obtained by chemical synthesis in several stages from the corresponding N-protected amino acids according to the following diagram (Diagram 5).
  • the amino acid protected on its amino function by the Boc group is first activated by the mixed anhydride method.
  • the activated amino acid reacts with diazomethane to lead to diazomethylketone 2.
  • Wolff rearrangement of this diazomethylketone in methanol, in the presence of silver benzoate and triethylamine gives the ⁇ -homo methyl ester of the amino acid protected by the Boc group.
  • a saponification leads to compound 3.
  • the deprotection of the Boc, followed by the reprotection of the amino function by the Fmoc group are the last steps for obtaining the ⁇ -homo amino acid, protected by the Fmoc.
  • Compound 4 is introduced by conventional amino acid coupling methods during solid phase synthesis using the Fmoc strategy.
  • Diagram 6 Schematic representation of the peptide and carba bonds
  • the carba bond confers a certain flexibility on the pseudopeptide and this due to free rotations around the carbon-carbon bonds. These free rotations can cause changes in the orientation of the side chains (carried by the carbons C ⁇ and C ⁇ + 1, see diagram 6) of the two amino acids located on either side of the carba bond. These modifications in the orientation of the side chains can have numerous implications in the phenomena of fixation, recognition and induction of signals different from those generated with the parent peptide.
  • the synthon Fmoc-Ile ⁇ (CH 2 CH2) Gly-OH (4 in Figure 7) is necessary for the synthesis of the analogue [Ile 30 ⁇ (CH 2 CH2) Gly 3 1 ] Mart-1 27-35. This synthon is obtained by chemical synthesis in several stages (diagram 7).
  • Boc- ⁇ -homoIle-OH (1) dimethylhydroxamate (for the synthesis of ⁇ -homo amino acids, see previous paragraph) is reduced by lithium aluminum hydride at low temperature (-25 ° C) in tetrahydrofuran in order to obtain the corresponding aldehyde (2).
  • the hydrogenation of the double bond, the saponification of the ester, deprotection and reprotection of the amino function by the Fmoc group make it possible to obtain the Fmoc-Ile ⁇ (CH 2 CH 2 ) Gly-OH (4).
  • Diagram 7 Synthesis diagram of Fmoc-Ile 30 ⁇ (CH CH 2 ) Gly 1-OH (4)
  • This synthon (4) is incorporated in the solid phase in Fmoc chemistry.
  • the coupling of 5 equivalents of the mixture (synthon / BOP / HOBt) is carried out 2 times in succession (20 min each) in the DMF.
  • the Fmoc group is deprotected by piperidine at 50% in DMF.
  • the following amino acids are coupled with classic way.
  • the peptide is deprotected and detached from the resin in TFA, precipitated in ether and purified by RP-HPLC.
  • the pseudopeptide 1 carba Mart-1 27-35 is obtained with a purity of 90%.
  • the pseudopeptide 2 carba Mart-1 27-35 is obtained with a purity of 98%.
  • TFA is 13.07 (3a), 13.54 (3b) min.
  • Analysis of the mass of the pseudopeptide by MALDI using the Bruker Protein TOF spectrometer gives the expected mass M + H + 799.13.
  • the pseudopeptide 4 carba Mart-1 27-35 is obtained with a purity of 100%. Its retention time in the gradient from 5 to 65% of B (with as eluent:
  • Tetrahydroisoquinolene-3-carboxylic acid is a constrained analogue of
  • Phenylalanine It was introduced at position 62 in the sequence of the influenza matrix peptide in place of the natural phenylalanine in order to study the importance of the orientation of the phenyl group in the interaction with the molecule.
  • the synthesis of the analogous peptide was carried out in conventional Fmoc chemistry.
  • the Fmoc-L-Tic-OH derivative (sold by the company Néosystem) was introduced into the growing chain using a conventional coupling process (BOP / HOBt / Fmoc-L-Tic-OH) in excess of 5 during 20 min in DMF.
  • the deprotection of the Fmoc group was carried out in several stages in 50% piperidine in DMF (4 treatments of 30 min each separated by 3 washes of the resin in DMF).
  • the assembly of the following amino acids posed no particular problems.
  • the mass measured using the Bruker Protein TOF spectrometer was the expected mass M + H + 978.9.
  • analogs 3-Pya62 and 3-Pya64 of M58-66 were obtained by introducing the amino acid of formula in place of phenylalanine in positions 62 and 64 respectively;
  • analogues D-Phe62 and D-Phe64 of M58-66 were obtained by introducing D-phenylalanine in place of phenylalanine in positions 62 and 64 respectively;
  • the mutant cell used is the human T2 cell (DeMars et al., 1985; Ljunggren & Kàrre, 1985; Salter & Cresswell, 1986) which is a variant of the Tl line produced by fusion of CEM T lymphoma and B lymphoma 721.174 .
  • This cell which is devoid of peptide transporters contains heavy chains of class I molecules free of peptides which will be able to accept exogenous peptides.
  • the peptides tested are used at concentrations varying from 100 ⁇ M to 0.1 nM.
  • the lysis is carried out in the presence of the peptides to be tested for 30 min or 1 h at 37 ° C.
  • the supernatant is added with 140 ⁇ l of PBS containing 0.05% Tween 20, 3 mM sodium azide, 1 mM PMSF and 10 mg / ml bovine albumin.
  • PBS containing 0.05% Tween 20, 3 mM sodium azide, 1 mM PMSF and 10 mg / ml bovine albumin.
  • Each sample is incubated for 20 h at 4 ° C in 2 wells of a microtiter plate of the Nunc, Maxisorb type, previously coated with a monoclonal antibody (Parham & Brodsky, 1981) (10 ⁇ g / ml in PBS) which recognizes histocompatibility molecules having a conforming conformation (s) for the presentation of the peptides and similar to that (s) present on the surface of the cells.
  • the plate covered with antibodies is previously saturated with bovine albumin at 10 mg / ml in PBS-Tween before placing the sample.
  • the second antibody which allows the detection of the assembly of histocompatibility molecules is directed against beta2m. It is coupled either to biotin (NHS-LC biotin, Pierce) or to alkaline phosphatase (P-5521, Sigma) and is incubated at 2 ⁇ g / ml for 1 h at 37 ° C. In the case of the use of biotin, an incubation of 45 min at 20-25 ° C with extravidine coupled with alkaline phosphatase (E-2636, Sigma) is carried out.
  • the alkaline phosphatase activity is measured using as substrate 4-methyl-umbelliferyl phosphate (M-8883, Sigma) at 100 ⁇ M in 50 mM diethanolamine, pH 9.5 with 1 mM MgCl2. The reading is made at 340/460 nm using a 2300, Millipore cytofluorimeter.
  • the material used is either purified HLA or the lysate of the T2 cell. With the purified HLA it is necessary to eliminate the endogenous peptides as described in paragraph 1-1 and to bring it into the presence of the peptide to be tested in an Eppendorf tube at
  • This device measures the molecular interactions occurring in real time in a continuous buffer flow using a beam of reflected light.
  • the anti-HLA antibodies are diluted to 25 ⁇ g / ml in Na acetate buffer pH 7.4 and covalently fixed by their free amines on the carboxymethylated dextran matrix of the "Sensor Chip CM5" activated with 50 mM NHS and
  • PBMC peripheral blood
  • PBMC peripheral blood
  • TT tetanus toxin
  • T CD4 + and the peptide to be tested as a CTL inducer at 1 ⁇ g / ml.
  • IL-7 is added at 50 U / ml.
  • 10 replicates are treated independently.
  • the effector cells generated are restimulated by PBMCs preincubated with the peptide (50 ⁇ g / ml for 4 h for 10 ⁇ 10 ° " cells) then irradiated at 6000 rads.
  • the stimulator cells are diluted to 106 / ml and 1 ml is added per well.
  • the induced T lines are tested on their capacity to recognize the inducing peptide presented on the HLA on the surface of target cells, which are most frequently EBV lymphoblastoid cells.
  • the resulting cytolysis is determined by the standard test of 4 h of release of 51cr. On Day -3 or -4 before the test, the addition of interleukins is not done because the cells must be weaned to be in optimal activation condition. For primary induction, lysis cannot be detected before 3 weeks.
  • Target cells labeled for 1 h with 10 ⁇ Ci of 51cr are preincubated with the peptide
  • PBMCs or purified CD8 + cells (1 to 2 x 10 ° " ) are cultured in 24-well plates and stimulated with either anti-CD3 + monoclonal antibodies in the presence of 100 nM Phorbol Myristate Acetate (PMA) with autologous PBMCs irradiated and sensitized or not for 1 h 30 with a peptide whose recognition is restricted by MHC molecules.
  • PMA Phorbol Myristate Acetate
  • RNAzol technique Bioprobe, Montreuil, France
  • the RNA (1 to 2 mg) is retrotranscribed with superscript II (Gibco BRL).
  • the cDNAs synthesized are diluted 1/5 with water and their concentration quantified by competitive PCR with a plasmid (pQB.2) containing the B actin sequence (237 bp product felicitly provided by D. Shire).
  • the PCR reaction is carried out in the presence of 10 mM of Tris-HCl, 50 mM of KC1, 1.5 mM of MgC12, 0.2 mM of each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.4 mM of sensible and antisense primer, 2 U of Taq polymerase (Promega).
  • Amplification is carried out by starting with denaturation at 94 ° C, 5 min, then with 30 cycles at 94 ° C, 30 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s, and a last elongation at 72 ° C, 10 min, in a regulated thermostat (Perkin Elmers 9600).
  • the analysis of IL-2, IL-4 and IFN-g is done in the same conditions as for B-actin, except the number of cycles which varies between 30 and 40.
  • the relative quantification is carried out by competitive PCR.
  • the peptides were incubated at different concentrations at 4 ° C. for 18 h in the presence of denatured HLA-A2 molecules and of ⁇ 2 microglobulin.
  • the stable HLA-A2 / peptide complexes formed at 4 ° C. are captured with Ac BB7.2 adsorbed on a plate and revealed by a second anti ⁇ 2 microglobulin Ab coupled to alkaline phosphatase.
  • the amount of complexes formed HLA-A2 / peptide is
  • NP 383-391 is a negative control peptide. 0. peptide corresponds to the background noise in the absence of peptide. U.F. : arbitrary unit of fluorescence.
  • the T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for
  • Phg-62 and 64, DPhe-62 and 64, Cha62 and 64, Tic 62 and 64 affect the recognition of cytolytic T lymphocytes specific for the peptide M58-66.
  • FIG. 3 Figures 3 A and 3B.
  • the T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for 1 h with different concentrations of peptide. After washing, the targets (5000 per well) were incubated for 4 h with the CTL line at a 10E / 1C ratio. The specific lysis is expressed in% of lysis as a function of the concentration of peptide incubated with the targets.
  • the cytolytic T lymphocytes specific for the peptide M58-66 have a lower affinity for the modified peptides.
  • the different peptides are compared for their ability to bind to the purified HLA-A2J molecule.
  • NP is a peptide of the nucleoprotein of the influenza virus which does not bind to the HLA-A2 molecule (negative control).
  • the other homo ⁇ peptides have an intermediate to low affinity compared to the Mart-1 peptide.
  • T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for 2 h with 1 ⁇ g / ml of peptide. After washing, the targets (1500 per well) were incubated for 4 h with the different T clones (LT8, LT11, LT12) at a ratio
  • the T2 target cells incubated with the parent peptide Mart-1 are lysed at 90% by the three cytolytic clones (LT8, LT11 and LT12) specific for this peptide. In the absence of peptide (0), no lysis is detected. Only the homo ⁇ 4 peptide is capable of inducing a lysis activity similar to the parent peptide for a single clone (LT12). 2.3. Answer dose.
  • the T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for
  • the targets (1500 per well) were incubated for 4 h with the clone T LT12 at a 3E / 1C ratio.
  • the specific lysis is expressed in% of lysis as a function of the concentration of peptide incubated with the targets.
  • Clone T LT12 has a lower affinity for the ⁇ 4 peptide than vis-à-vis the Mart-1 peptide.
  • HLA-A2 / peptide were incubated at two different concentrations (10 "4 M and 10 -6 M) at 4 ° C 18 h in the presence of HLA-A2 denatured and ⁇ 2 microglobulin.
  • the stable HLA-A2 / peptide formed 4 ° C are captured with Ac BB7.2 (specific for this class I molecule and adsorbed at the bottom of the wells) and revealed by a second anti ⁇ 2 microglobulin Ab coupled to alkaline phosphatase.
  • the amount of complexes formed HLA-A2 / peptide is proportional to the intensity of fluorescence detected at the cytofluor (UF: arbitrary unit of fluorescence).
  • the v ⁇ peptides 1-2 to 4-5 have an intermediate to low affinity compared to the Mart-1 peptide.
  • the peptides v ⁇ 4-5 to 8-9 bind very weakly to the purified A2J molecule.
  • Lysis test T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for
  • the targets (1500 per well) were incubated for 4 h with the different T clones (LT8, LT11, LT12) at a ratio
  • T2 A2 target cells were chromated (Cr51), then incubated for
  • the targets (1500 per well) were incubated for 4 h with the different T clones (LT8, LT12) at a 3E / 1C ratio.
  • the specific lysis is expressed in% of lysis as a function of the concentration of peptide incubated with the targets.
  • the peptides v ⁇ 2-3 and v ⁇ 5-6 have a dose response comparable to that of the parent peptide whereas the peptide ⁇ 7-8 induces lysis only weakly even at high concentration of peptide. This result suggests that the modification introduced decreases the affinity of the TCR (T receptor) of the clone LT8 for this peptide.
  • Figure 10 Figure 10 ( Figures 10A and 10B).
  • the peptides were incubated at various concentrations at 4 ° C. for 18 h in the presence of denatured HLA-A2 molecules and of ⁇ 2 microglobulin.
  • the stable HLA-A2 / peptide complexes formed at 4 ° C are captured with BB7.2 Ab adsorbed on a plate and revealed by a second anti ⁇ 2 microglobulin Ab coupled to alkaline phosphatase.
  • the amount of complexes formed HLA-A2 / peptide is proportional to the intensity of fluorescence detected with cyto fluorine.
  • U.F. arbitrary unit of fluorescence.
  • the reduction-modified Mart-1 peptides have an intermediate affinity for the HLA-A2 molecule.
  • the reduction in positions 2-3 and 8-9 makes the link undetectable for the clone studied.
  • 4.2. Ability of reduced series peptides M58-66 to induce lysis of T2 target cells by a CTL line induced by M58-66 and restricted by the HLA-A2 molecule.
  • FIG. 1B Study of the binding of peptide analogues [3-Pya64] M58-66 (3-Pya64), [2-Tha64] M58-66 (2-Tha64), [D-Phe64] M58-66 (D-Phe64 ), [Cha62] M58-66 (Cha62), [N-MePhe62] M58-66 (N-MePhe62),.
  • FIG. 1C binding of the peptide analogues [pCl-Ph62] M58-66 (pCl-Phe62), [Phg62] M58-66 (Phg62), [Cha64] M58-66 (Cha64),
  • T2 by a cytotoxic T cell line specific for M58-66 the percentage of lysis is indicated on the ordinate and the E / T ratio (effector cells / target cells) is represented on the abscissa:
  • FIG. 2A Effect of the analogs Tic62 and Tic64 on the lysis of T2 cells
  • FIG. 2B effect of analogues D-Phe62, D-Phe64, Cha62, Cha64 on the lysis of T2 cells
  • FIG. 2C effect of the analogues 3-Pya62, 3-Pya64, 2-Tha62, 2-Tha64 on the lysis of T2 cells
  • Figure 2D Effect of analogs pCl-Phe64, Phg64, pCl-Phe62, Phg62 on the lysis of T2 cells, in comparison with the effects of peptide M58-66, and of a solution containing no peptide (0 peptide).
  • FIG. 3A study as a function of the concentration of pCl-Phe62 and pCl-Phe64,
  • Figure 7 A study of the binding of peptides ⁇ (l-2) Mart-l (represented by 1-2), ⁇ (2-3) Mart-l (2-3), ⁇ (3-4) Mart- l (3-4), ⁇ (4-5) Mart-l (4-5), .
  • Figure 7B study of the binding of peptides ⁇ (5-6) Mart-l (5-6), ⁇ (6-7) Mart-l (6-7), ⁇ (7-8) Mart-l (7 -8), ⁇ (8-9) Mart-l (8-9), in comparison with Mart-1.
  • Mart-1 the percentage of lysis is indicated on the ordinate, and the peptide analogs 1-2 to 8-9 are indicated on the abscissa, in comparison with Mart-1 and a solution without peptide (0).
  • Figure 9A study as a function of the concentration of analogs 2-3 and 7-8
  • Figure 9B Study as a function of the concentration of analog 5-6, in comparison with the concentration of Mart-1.
  • - Figure 10 study of the binding to MHC molecules (HLA-A2) of peptide analogues of peptide M58-66 comprising a -CH 2 -NH- bond (reduced analogs): the concentrations of peptides (10 " ⁇ to 10 " ⁇ M) are indicated on the abscissa, and the fluorescence units are indicated on the ordinate:.
  • Figure 10A study of the binding of T (l-2) peptides M58-66 (1-2), ⁇ (2-3) M58-66 (2-3), ⁇ (3-4) M58-66 (3 -4), ⁇ (4-5) M58-66 (4-5),
  • FIG. 10B study of the binding of F (5-6) peptides M58-66 (5-6), ⁇ (6-7) M58-66 (6-7), ⁇ (7-8) M58-66 (7 -8), ⁇ (8-9) M58-66 (8-9), in comparison with M58-66, and a mutated peptide (GIL) of M58-66 carrying the mutation GLL ⁇ GIL [M58-66 (GIL) ],
  • - Figure 11 study of the effect of the reduced analogs 1-2 to 8-9 of M58-66 on the lysis of T2 cells by a T cell clone specific of M58-66: the percentage of lysis is indicated in ordered, and the ratio effector cells / target cells (E / T) is indicated on the abscissa, in comparison with M58-66, mutated M58-66 (GLL) and a solution without peptide (0).

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide non protéinogénique, pour: la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées, ou la préparation d'une composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition, ou la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro desdites pathologies.

Description

ANALOGUES PEPTIDIQUES ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET POUR LE DIAGNOSTIC
La présente invention a pour objet des analogues peptidiques et leurs utilisations, principalement dans le domaine de la préparation de compositions pharmaceutiques, notamment de vaccins, et pour le diagnostic in vitro ou in vivo de diverses pathologies.
Le développement des neuropeptides, des hormones peptidiques et des antibiotiques à base de peptides, ou des vaccins synthétiques à base de peptides, est fortement perturbé par la grande sensibilité des peptides vis à vis de la protéolyse qui limite, entre autres, l'administration orale et parentérale.
Les pseudopeptides représentent une classe de molécules particulièrement intéressante dans la conception d'inhibiteurs d'enzymes. Le clivage par les peptidases est impliqué dans une variété de processus biologiques puisqu'il permet de générer à partir de précurseurs inactifs des fragments protéiques ou peptidiques actifs. L'idée qu'un lien isostère pouvait être considéré comme un mime de l'intermédiaire tétraédrique formé lors du passage par l'état de transition, a ouvert la voie des inhibiteurs de type pseudopeptidiques . Au début des années 80, cette approche a été utilisée avec succès dans le développement d'inhibiteurs puissants de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), de la rénine (Szelke et ai , 1982 ; Boger et al. , 1983) et de la protéase aspartique du VIH (Huff, 1991). Plus récemment, plusieurs inhibiteurs pseudopeptidiques sélectifs de la Ras farnesyl transférase ont été proposés. Ces molécules présentent un intérêt thérapeutique potentiel dans le traitement des cancers impliquant l'oncogène Ras muté (Buss &
Marsters, 1995).
Les analogues pseudopeptidiques d'hormones peptidiques ont également fait l'objet de nombreuses études avec pour objectif premier la stabilisation du peptide de départ et une conservation de l'activité. Cette stratégie a effectivement permis la découverte d'agonistes puissants (Chorev et al. , 1979 ; Nagain et al. , 1988 ;
Doulut et al. , 1992), mais aussi d'agonistes partiels et même d'antagonistes de l'hormone étudiée (Martinez et al. , 1985 ; Coy et al. , 1989 ; Leban et al. , 1993 ; Cai et al. , 1994). Des analogues plus sélectifs au niveau d'un récepteur ont aussi été obtenus dans certains cas (Mendre, 1988 ; Nagain et al. , 1988 ; Schiller et al. , 1993). Par ailleurs, la liaison pseudopeptidique permet d'explorer les caractéristiques conformationnelles du ligand au niveau du site modifié et, d'évaluer la contribution de la liaison amide et des liaisons hydrogènes inter- ou intramoléculaires dans l'interaction avec le ou les récepteurs. Toutefois, les modifications effectuées jusqu'à présent sur les peptides à usage immunologique se limitent essentiellement à l'adjonction de sucres, à celle d'acides gras plus ou moins longs pour permettre l'émulsion des lipopeptides résultants, à la cyclisation par formation de ponts disulfure ou covalents, ainsi qu'à l'adjonction de molécules telles que la biotine, pour augmenter, par exemple, la sensibilité des tests immunochimiques en phase solide.
Plusieurs auteurs ont affirmé que les pseudopeptides possèdent probablement très peu ou pas d'immunogénicité, puisqu'ils ne pouvaient pas être transformés et présentés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) pour être reconnus par les cellules T auxiliaires ou par les lymphocytes T cytotoxiques.
C'est ainsi que Dintzis et al. ont décrit que l'énantiomère L de la rubrexodine induit une forte réponse immunitaire par production d'immunoglobulines d' isotype G (IgG), tandis que la protéine correspondante constituée d'acides aminés tous de configuration D, n' induit pas de réponse immunitaire. C'est dans ce contexte que les immunorétroïdes décrits ci-après, ainsi que les anticorps dirigés contre ces derniers, ont été décrits dans la demande internationale WO 95/24916, comme étant utilisables dans le domaine de la vaccination contre des pathologies dans lesquelles les peptides dont ils dérivent (peptides parents) étaient impliqués, ainsi que pour le diagnostic de ces pathologies. Les auteurs de cette demande internationale, qui sont également les auteurs de la présente demande, avaient en effet, pour la première fois, mis en évidence que la modification par remplacement d'une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique d'un peptide, par une liaison -NH-CO-, et, le cas échéant par remplacement d'un acide aminé de configuration L par un acide aminé de configuration D, permet d'obtenir des analogues peptidiques (rétro ou rétro- inverso respectivement) susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire. Les immunorétroïdes susmentionnés sont des composés du type peptidique, à savoir des composés constitués d'une chaîne d'acides aminés protéinogéniques, dont l'une au moins des liaisons -CO-NH-, et avantageusement toutes les liaisons
-CO-NH-, de la chaîne peptidique du peptide parent correspondant, (ne comportant pas de liaison -NH-CO- dans sa chaîne peptidique), est (sont) remplacée(s) par une (des) liaison(s) -NH-CO-, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu' il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons -NH-CO- susmentionnées, étant soit conservée (peptide rétro), soit inversée (peptide rétro- inverso) par rapport aux résidus aminoacyles correspondants constituant ledit peptide parent.
Par peptides rétro-inverso, il faut entendre tout peptide et analogue peptidique répondant à la définition donnée ci-dessus des immunorétroïdes, ledit peptide étant plus particulièrement constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l 'un au moins des résidus d'une part est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, et d'autre part, est de chiralité opposée à celle de ce même résidu aminoacyle dans la chaîne peptidique du peptide parent. Par peptide rétro, il faut entendre tout peptide répondant à la définition donnée ci-dessus des immunorétroïdes, ledit peptide étant plus particulièrement constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus, est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, la chiralité de la totalité des résidus aminoacyles impliqués dans au moins une liaison -NH-CO- étant conservée par rapport au résidu correspondant de la chaîne peptidique du peptide parent.
Il va de soi que les liaisons -CO-NH- et -NH-CO- doivent être prises en compte dans ce qui précède et ce qui suit, dans le sens de la chaîne peptidique parente allant de l'extrémité aminoterminale (N-terminale) vers l'extrémité carboxy terminale (C-terminale). Compte tenu du contexte général d' incertitude sur l'efficacité des analogues peptidiques rappelé ci-dessus, les auteurs de cette demande internationale WO95/24916 avaient considéré que cette inversion du sens de la liaison amide entre les acides aminés protéinogéniques, et/ou la modification de la configuration des acides aminés protéinogéniques, représentaient les seules modifications possibles des peptides parents pour obtenir des analogues peptidiques présentant une demi-vie supérieure, et des propriétés biologiques, notamment immunologiques, comparables, voire supérieures, à celles des peptides parents susmentionnés.
Or, la présente invention découle de la découverte faite par les auteurs de la présente demande que, contrairement à ce qu' ils avaient cru bon de déduire dans le cadre de leur invention précédente en raison du contexte général rappelé ci-dessus, ces modifications du type rétro ou rétro-inverso de la chaîne peptidique des peptides parents, ne représentent pas les seules modifications possibles permettant d'obtenir des analogues peptidiques d' intérêt, du moins dans le cadre du diagnostic et/ou du traitement de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire.
En effet, les auteurs de la présente demande ont mis en évidence que la modification de peptides naturels impliqués dans des pathologies dans lesquelles intervient l' immunité à médiation cellulaire, et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, par remplacement des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique desdits peptides naturels par d'autres liaisons encore que la liaison -NH-CO-, et/ou par remplacement des acides aminés protéinogéniques du peptide naturel par des acides aminés non protéinogéniques, permet d'obtenir des analogues peptidiques desdits peptides naturels pouvant être utilisés avec les avantages susmentionnés dans le cadre du traitement ou du diagnostic desdites pathologies.
Par "acide aminé protéinogénique" , on entend, dans ce qui précède et ce qui suit, tout acide aminé entrant dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
Par "acide aminé non protéinogénique" , on entend par opposition à la définition précédente, tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. On entend plus particulièrement par "acide aminé non protéinogénique" , tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
La présente invention a pour but de fournir des compositions pharmaceutiques, et plus particulièrement des vaccins, comprenant des analogues peptidiques présentant une demi vie nettement supérieure à celle des peptides naturels ou des protéines naturelles, ou à celle des peptides de synthèse issus ou non de ces protéines naturelles (ces protéines naturelles, ou peptides issus ou non de ces dernières, étant encore désignés dans ce qui suit par l'expression "protéines ou peptides parents"), dont ils sont les analogues, tout en présentant une activité biologique, et plus particulièrement immunologique, comparable, voire même supérieure, à celle des protéines ou peptides parents susmentionnés, ou encore une activité différente ou opposée à celle desdites protéines ou peptides parents.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vivo ou encore d'évaluation in vivo de la capacité de la réponse immunitaire d'un individu dans le cadre de pathologies dans lesquelles des peptides naturels ou protéines naturelles (exogènes ou endogènes) sont susceptibles d' intervenir en se liant aux molécules du CMH, les complexes peptides-CMH ainsi obtenus se aux récepteurs situés sur les cellules T et reconnaissant lesdits peptides naturels ou protéines naturelles sous leur forme complexée avec lesdites molécules du CMH.
L' invention a également pour but de fournir des compositions et des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic ou d'évaluation in vivo de la réponse immunitaire susmentionnées.
La présente invention a également pour but de fournir des méthodes de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l 'organisme d'un individu de protéines endogènes ou exogènes, ces méthodes étant réalisées à l'aide des analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, ou à l'aide d'anticorps dirigés contre les complexes entre ces anticorps et les molécules de CMH, et présentant l'avantage d'être plus performantes que les méthodes de diagnostic actuelles réalisées à l'aide des peptides ou protéines parents, ou à l'aide d 'anticorps dirigés contre ces derniers.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux kits pour la mise en oeuvre de telles méthodes de diagnostic in vitro. La présente invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents interagissant avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies impliquant une réponse immunitaire à médiation cellulaire, chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels : au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide aminé non protéinogénique, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'analogues peptidiques issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, dans le cadre de pathologies impliquant les lymphocytes T cytotoxiques.
Avantageusement, les analogues peptidiques utilisés dans le cadre de la présente invention, et plus particulièrement ceux issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, correspondent auxdits peptides parents dans lesquels au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso. Comme nous l'avons déjà vu précédemment, il faut entendre par l'expression
"peptide parent" susmentionnée,
- soit un peptide existant tel quel à l'état naturel, notamment dans un microorganisme ou dans un organisme supérieur (notamment dans l'organisme humain),
- soit tout peptide d' intérêt immunologique obtenu par synthèse peptidique, à partir d'acides aminés protéinogéniques,
- soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel dans les organismes susmentionnés, notamment par fragmentation de ladite protéine (notamment à l'aide de protéases appropriées, puis purification du peptide en question), ou par synthèse peptidique (selon les méthodes classiquement utilisées dans ce domaine)
- soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel mais dont l 'activité immunologique a été modifiée, conservée ou optimisée par remplacement de certains amino acides de la séquence naturelle par des acides aminés protéinogéniques, par exemple à la suite d'un criblage d'une librairie de peptides analogues obtenue par synthèse peptidique.
L' invention a également pour objet les analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu' ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels : au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide non protéinogénique. Avantageusement, les analogues peptidiques susmentionnés de l ' invention sont caractérisés en ce que le nombre de résidus aminoacyles protéinogéniques ou non, et reliés par une liaison modifiée ou non, est compris entre environ 5 et environ 20, de préférence entre 8 et 12 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe I, et de préférence entre 8 et 16 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe II.
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes :
-CH2-NH- (méthylène amino) ;
-CH2-CH2- (carba) ;
-CO-CH2- (cétométhylène) ;
-CH2-O- (méthylène-oxy) ; -CHOH-CH2- (hydroxyéthylène) ;
-CHOH-CHOH- (di-hydroxyéthylène) ; -CH = CH- (E ou Z oléfine) ;
-CHCN-NH- (cyanométhylène amino) ; -S-CH2- (thiométhylène) ; -CH2-S- (méthylène thio) ;
-CS-NH- (thioamide) ;
-PO2-NH- (phosphonamide) ;
-CHOH- (hydroxyméthylène) ;
-NH-CO-NH- (urée) ;
-CH CH- (oxirane) ; x
-C N- (tétrazole) ;
// \
N N
-CH2-CO-NH- (β-homologation) ;
-CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino) ; -CO-NH-NH- (hydrazino).
L' invention a également pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, et caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison du type rétro ou rétro-inverso telle que définie ci-dessus, dans le cas où l'un au moins des acides aminés dudit analogue peptidique est un acide aminé non protéinogénique.
Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique ou peptide parent est remplacée par une liaison méthylène amino, ou du type β-homologation, ou carba, ou cétométhylène, ou cyanométhylène amino, ou hydroxyéthylène amino.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques de peptides parents impliqués dans le mélanome, notamment le peptide MARTI 27- 35, ledit peptide parent comportant, le cas échéant, une ou plusieurs mutations, tel que le peptide parent muté MARTI 27-35 Leu^8, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso.
A ce titre l'invention concerne plus particulièrement les analogues peptidiques du peptide parent Mart-1 27-35 du mélanome, comportant une liaison méthylène amino et répondant aux formules suivantes : Séquences PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
MARTI 27-35 H- A -A - G- I - G - I - L- T - V -OH
Ψ(l-2) H-AT(CH2NH)A-G - I - G - I - L- T - V -OH ψ(2-3) H- A- AT(CH2NH)G- I - G - I - L- T - V -OH
Ψ(3-4) H- A - A -GΉ(CH2NH)I- G - I - L- T - V -OH
Ψ(4-5) H- A - A - G - I (CH2NH)G- I - L - T - V -OH
Ψ(5-6) H- A - A - G - I - GΨ(CH2NH)I- L - T - V -OH
Ψ(6-7) H- A - A - G - I - G - L<(CH2NH)L- T - V -OH
Ψ(7-8) H- A - A - G - I - G - I - LV(CH2NH)T-V -OH
Ψ(8-9) H-A -A - G- 1 - G - I - L- T WH,V-OH
Ces analogues peptidiques vμ (1-2), ψ (2-3), ψ (3-4), ψ (4-5), ψ (5-6), vμ (6-7), vμ (7-8) et ψ (8-9), encore désignés peptides réduits analogues de Mart-1 5 27-35, correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus PI et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9 est remplacée respectivement par une liaison -CH2-NH-.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques du peptide parent Mart-127-35 du mélanome, comportant une liaison du type β-homologation 0 et répondant aux formules suivantes :
Séquences PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 5
MARTI 27-35 H- A -A - G- I - G - 1 - L- T - V -OH
H-p-ι,omoA-A- G- I - G - 1 - L- T - V -OH β2 H- A-p-homoA- G - I - G - 1 - L- T - V -OH β3 H- A - A-p-homoG-I- G - 1 - L- T - V -OH β4 H- A -A - G-p-homoI-G - 1 - L- T - V -OH β5 H- A - A - G - 1 -p.homoG-1 - L - T - V -OH β6 H- A -A - G- 1 - G -p-homoI-L- T - V -OH β H- A - A - G - I - G - 1 -p-homoL-T - V -OH β8 H- A -A - G- I - G - I - L -p-homoT-V -OH β9 H- A -A - G- I - G - I - L- T -p-homoV-OH .1 Ces analogues peptidiques βl à β9 de Mart-1 27-35 correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus PI et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9, est remplacée respectivement par une liaison -CH2-CO-NH-.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques du peptide parent muté Mart-1 27-35 Leu-2 , correspondant au peptide Mart-1 27-35 dans lequel l'alanine en position 28 est remplacée par la leucine, et comportant une liaison du type β-homologation entre les mêmes résidus que dans le cas décrit ci- dessus des analogues peptidiques βl à β9.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques de MARTI 27- 35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2- CH2-, tels que les analogues 1 à 8 suivants (encore désignés pseudopeptides carba analogues de M ART):
Figure imgf000011_0001
H-Ala
Figure imgf000011_0002
Ile-Gly-lie-Leu-Thr-Val-OH
Figure imgf000011_0003
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Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso ; avantageusement, lesdits analogues sont choisis parmi ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues suivants :
Séquences
PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
M58-66 H- G -L - L- G - F - V - F- T - L -OH
Ψ(l-2) H-GM'(CH2NH>L-L - G - F - V - F- T - L -OH
Ψ(2-3) H- G- LΨ(CH2NH)L- G - F - V - F- T - L -OH
Ψ(3-4) H- G - L -LΨ(CH2NH)G- F - V - F- T - L -OH
Ψ(4-5) H- G - L - L - GΨ(CH2NH)F- V - F- T - L -OH
Ψ(5-6) H- G -L - L- G - FΨ(CH2NH)V- - F- T - L -OH
Ψ(6-7) H- G - L - L - G - F - VT(CH2NH)F- T - L -OH
Ψ(7-8) H- G -L - L- G - F - V- FM-(CH2NH>T - L -OH
Ψ(8-9) H- G -L - L- G - F - V - F- TH*<CH2NH)L-OH Ces analogues peptidiques ψ (1-2), ψ (2-3), ψ (3-4), ψ (4-5), vμ (5-6), vμ (6-7), vμ (7-8) et vμ (8-9), encore désignés peptides réduits analogues de M58-66, correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus PI et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9 est remplacée respectivement par une liaison -CH2-NH-. l'ivention a également pour objet les analogues peptidiques de peptides parents du virus du SIDA, notamment des peptides NEF 84-92, et GAG 77-85, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi :
- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues NEFRD1-8 du peptide NEF, et GAGRD1-8 du peptide GAG suivants :
Pureté
NEF AVDLSHFLK 98%
NEFRD1 AΨ(CH2-NH)VDLSHFLK 99%
NEFRD2 AVΨ(CH2-NH)DLSHFLK 93 %
NEFRD3 AVDΨ(CH2-NH)LSHFLK 97%
NEFRD4 AVDLΨ(CH2-NH)SHFLK 98%
NEFRD5 AVDLSΨ(CH2-NH)HFLK 86%
NEFRD6 AVDLSHΨ(CH2-NH)FLK 98%
NEFRD7 AVDLSHFΨ(CH2-NH)LK 92%
NEFRD8 AVDLSHFLΨ(CH2-NH)K 91 %
Pureté
GAG SLYNTVATL 96%
GAGRD1 SΨ(CH2-NH)LYNTVATL 95 %
GAGRD2 SLΨ(CH2-NH)YNTVATL 95 %
GAGRD3 SLYΨ(CH2-NH)NTVATL 95 %
GAGRD4 SLYNΨ(CH2-NH)TVATL 95 %
GAGRD5 SLYNTΨ(CH2-NH)VATL 95 %
GAGRD6 SLYNTVΨ(CH2-NH)ATL 95 %
GAGRD7 SLYNTVAΨ(CH2-NH)TL 95 %
GAGRD8 SLYNTVATΨ(CH2-NH)L 95%
- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CHOH-NH-, tels que les analogues NEFHEA1-8 du peptide NEF suivants : Pureté Masse
NEF AVDLSHFLK NEFHEA1 AΨ(CHOH-NH)VDLSHFLK 98% 1046,50 NEFHEA2 AVΨ(CHOH-NH)DLSHFLK 95 % 1046,56 NEFHEA3 AVDΨ(CHOH-NH)LSHFLK 83 % + 15 % 1029,00 NEFHEA4 AVDLΨ(CHOH-NH)SHFLK 98% 1047,97 NEFHEA5 AVDLSΨ(CHOH-NH)HFLK 99% 1047,08 NEFHEA6 AVDLSHΨ(CHOH-NH)FLK NEFHEA7 AVDLSHFΨ(CHOH-NH)LK 97% 1047, 19 NEFHEA8 AVDLSHFLΨ(CHOH-NH)K 97% 1046,77
Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tel que défini ci-dessus.
Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés sont choisis parmi les acides aminés suivants:
- les acides aminés de configuration D,
- les acides α-aminés de formule générale :
£ Z
K L \ \ s
Λ, /
A 0 \
II
0
dans laquelle :
- R\ , R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres : un atome d' hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants : -CH3
(méthyl), -CH CH (éthyl), -(CH2)4-CH3 , -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -Φ (phényl), -CH2Φ (benzyl), -CH2ΦCI (para-chlorobenzyl), -CH2-CH2Φ (2-phényl-éthyl), -CH2CHCH2 (alkyl), méthylfluorényl, -CH2CONH2 (glycolamide), -CH2CONΦ2 (benzhydrylglycolamide), -CHOHΦ,
-CH2 1 yy -CH2- JJ , -CH2 ^ étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit Ri , soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne représentent pas un atome d'hydrogène,
- le cas échéant, R , R2, Cet et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule :
Figure imgf000015_0001
les acides β-aminés de formule générale :
Figure imgf000015_0002
dans laquelle Rγ , R2 et R , indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, notamment :
. les β-homo amino acides de formule :
Figure imgf000015_0003
H dans laquelle Rj et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou . les α-h e formule :
Figure imgf000015_0004
dans laquelle R\ et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides γ-aminés de formule générale :
Figure imgf000015_0005
dans laquelle R\ , R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou R^ , R et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R4 a la même signification que celle donnée ci-dessus pour Ri . R et R , notamment les dérivés de statine de formule :
Figure imgf000016_0001
dans laquelle Rγ, et R2 sont tels que définis ci-dessus. Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés dans le cadre de la présente invention sont choisis parmi ;
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0003
Figure imgf000016_0004
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L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tels que les analogues suivants :
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Avantageusement, les analogues peptidiques susmentionnés de 1 ' invention sont sélectionnés parmi ceux susceptibles : 5 d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante :
• incubation (notamment pendant environ 2 heures à 25 °C, puis environ 12 heures à 4°C) de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique,
• addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps
J .1 marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I,
• détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d' incubation de l'analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait (avantageusement à une température de 37 °C) pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours.
Les analogues peptidiques de l'invention doivent être reconnus par les molécules de CMH et s'associer à ces dernières, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre du test de reconnaissance décrit ci-dessus. Cette association peut être faible (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 10~4 à 10"5 M), intermédiaire (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 10"^ à 10"^ M), ou forte (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 10~8 à 10~9 M).
Les analogues peptidiques reconnus par les molécules du CMH dans le cadre de la présente invention sont de préférence susceptibles de se lier pendant au moins environ 30 minutes auxdites molécules du CMH.
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu' ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles : d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, d' induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, et d'induire in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron y- lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant : . soit des agonistes des récepteurs (TCR) reconnaissant l'antigène
(à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxiques, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs,
. soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonistes partiels induisant notamment la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les peptides parents.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux : susceptibles d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléees issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, n'induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, n' induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l' interféron γ, lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des récepteurs des cellules T cytotoxiques.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales, auto- immunes et allergiques. Parmi les pathologies tumorales susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer le mélanome, notamment à l'aide des analogues peptidiques du peptide MARTI 27-35 décrits ci-dessus.
Parmi les maladies d'origine virale susceptibles d'être prévenues ou traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer:
- le SIDA provoqué par le virus de l' immuno-déficience humaine HIV1 et HIV2, notamment à l'aide des analogues peptidiques des peptides NEF et GAG décrits ci-dessus,
- la paraplégie associée à HTVL-1, ou la leucémie à cellules T de l'adulte, provoquée par le virus de la leucémie humaine à cellules T (virus HTLV),
- infections provoquées par le virus respiratoire syncitial,
- infections provoquées par le virus coxsakie, par exemple méningites aiguës lymphocytaires,
- infections provoquées par le virus d'Epstein-Barr, par exemple la mononucléose infectieuse,
- infections provoquées par le cytomégalovirus, par exemple maladie des inclusions cytomégaliques,
- herpès provoqué par le virus de l'herpès humain,
- herpès provoqué par le virus 6 de l'herpès simplex, - infections provoquées par le parvovirus B19 humain, par exemple gastroentérites infectieuses,
- l'hépatite B provoquée par le virus de l'hépatite B,
- l'hépatite C provoquée par le virus de l'hépatite C,
- la grippe provoquée par le virus influenza, notamment à l'aide des analogues peptidiques du peptide M58-66 décrits ci-dessus,
- la rubéole provoquée par le virus de la rubéole,
- infections provoquées par le virus de la Dengue, par exemple arboviroses,
- rhumes, rhinites, coryza provoqués par les rhino virus
- la fièvre aphteuse provoquée par le virus de la fièvre aphteuse, - le cancer du col de l'utérus provoqué par le papillomavirus (HPV).
Parmi les principales maladies auto-immunes susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer celles rassemblées dans le Tableau A qui suit. Tableau A Principales maladies auto-immunes (en allant de haut en bas, des maladies auto-immunes spécifiques d'organes aux maladies auto-immunes non spécifiques d'organes).
Maladies Autoantigènes impliqués
Thyroïdite de Hashimoto Thyroglobuline, microsomes Maladie de Basedow Récepteur TSH Maladie d'Addison Corticosurrénale Insuffisance hypophysaire Hypophyse Gastrite de Biermer Cellule pariétale de l'estomac
Facteur intrinsèque
Certaines stérilités Spermatozoïdes, ovaires Diabète juvénile de type 1 Ilots Langerhans, insuline Syndrome de Goodpasture Membrane basale glomérulaire
Myasthénie Muscle strié, récepteur acétyl-choline
Rhumatisme articulaire aigu Myocarde (streptocoques)
Pemphigus Ponts intercellaires epiderme
Pemphigoïde bulleuse Membrane basale cutanée
Dermatite herpétiforme Gliadine, réticuline
Vitiligo Mélanocytes
Pelade Follicule pileux
Psoriasis
Ophtalmie sympathique Uvée
Uvéite Chambre antérieure de l'oeil
Syndrome de Guillain-Baré
Sclérose en plaques Myéline
Anémie hémolytique Hématies
Purpura thrombopénique idiopathique Plaquettes
Leucopénie idiopathique Granulocytes
Cirrhose biliaire primitive Mitochondries
Hépatite chronique active Muscle lisse, noyaux
Rectocolite hémorragique
Iléite de Crohn Côlon (E. coli) Syndrome de Gougerot-Sjogren Noyaux: SS-A, SS-B
Polyarthrite rhumatoïde IgG, noyaux
Dermatopolymyosite Noyaux: Jol , muscles
Sclérodermie Noyaux: Scl-70
Connectivité mixte Noyaux: RNP
Lupus érythémateux discoïde Noyaux:
Lupus érythémateux disséminé Noyaux: ADN, antigène Sm
Facteurs de coagulation
Cardiolipine, etc ..
L' invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, au moins un analogue peptidique (agoniste, le cas échéant partiel, ou antagoniste) tel que défini ci- dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parenterale, notamment à raison d'environ 500 μg à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par jour. L' invention a plus particulièrement pour objet les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un antagoniste selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du traitement des maladies auto-immunes.
L' invention a plus particulièrement pour objet encore, les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un agoniste partiel selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du traitement des maladies allergiques.
L' invention a également pour objet tout vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actif, au moins un analogue peptidique, de préférence agoniste, le cas échéant partiel, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les vaccins selon l' invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parenterale, notamment à raison d'environ 500 μg à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par jour. L' invention a également pour objet toute composition destinée au diagnostic in vivo de pathologies susmentionnées impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre desdites pathologies, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un analogue peptidique, de préférence agoniste, le cas échéant partiel, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule biologiquement acceptable.
L' invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus pour la préparation desdites compositions destinées au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées.
L' invention concerne également les complexes entre un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, et une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité
(encore désigné complexes binaires CMH-analogue peptidique). En effet, la réponse immunitaire met en jeu la reconnaissance d'un antigène endogène ou exogène par des cellules spécialisées. Pour être reconnu, l'antigène doit être initialement présenté de façon adéquate par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Alors que les lymphocytes B reconnaissent des épitopes portés par les antigènes intacts non modifiés, la présentation de l'antigène aux lymphocytes T est plus complexe dans la mesure où l'antigène est d'abord internalisé par la cellule présentatrice, protéolysé, puis éventuellement réexprimé à sa surface sous forme de fragments peptidiques en association avec les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Le lymphocyte T qui ne reconnaît pas l'antigène natif, reconnaît un fragment peptidique associé à une molécule CMH.
Ces molécules CMH appartiennent essentiellement à deux classes: I et IL Les molécules de classe I sont des glycoprotéines transmembranaires constituées d'une chaîne lourde α polymorphe associée de façon non covalente à une chaîne légère non glycosylée β2m. Leur structure cristallographique a été résolue (Bjorkman et al. (1987), Nature, 329: 506-512), et montre la présence d'un sillon formant le site de présentation du peptide dont le fond est composé de huit feuillets β et les bords de deux hélices α. Ces molécules sont présentées à la surface de la quasi totalité des cellules.
Les molécules de classe II sont également des glycoprotéines membranaires constituées de deux chaînes polymorphes α et β liées de façon non covalentes pour former, comme le montre la structure cristallographique récemment élucidée (Brown et al. (1993), Nature, 364: 33-39), une plateforme β plissée supportant deux hélices α. Le sillon formé est le site de présentation du peptide. Ces molécules ne sont exprimées qu'à la surface de certaines cellules parmi lesquelles les macrophages et les cellules B .
Les lymphocytes T cytotoxiques (cellules possédant des marqueurs CD8) reconnaissent des fragments protéolytiques de protéines virales associées aux molécules CMH de classe I et provoquent la lyse des cellules présentant l ' antigène. Les lymphocytes T auxiliaires (cellules portant des marqueurs CD4) reconnaissent des fragments de protéines exogènes capturées par endocytose présentés en association avec les molécules CMH de classe II et induisent la stimulation cellulaire de la réponse immunitaire.
5 L' invention a également pour objet les complexes entre un analogue peptidique selon l' invention, et un récepteur de cellules T (encore désignés complexes récepteur T-analogue peptidique).
L' invention vise également les complexes entre une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité, un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, et un i o récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire CMH-analogue peptidique-récepteur T).
L' invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro des pathologies mentionnées ci-dessus.
15 L' invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode de diagnostic in vitro de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, à savoir de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes pouvant interagir avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement
20 ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, notamment du sang ou tout échantillon biologique susceptible de contenir des lymphocytes, avec un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, dans des
"> 5 conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et le susdit complexe binaire formé entre ledit analogue peptidique et les molécules de CMH présentes dans ledit échantillon;
- la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique- 30 récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.
Les méthodes de diagnostic susmentionnées de l' invention sont avantageusement réalisées de la façon suivante:
- incubation dudit échantillon biologique avec des analogues peptidiques selon l' invention, lesdits analogues peptidiques étant fixés sur un support solide,
35 notamment à l'intérieur de puits de plaques de microtitration de type de celles habituellement utilisées pour la mise en oeuvre de techniques de détection ou dosage bien connues sous le nom d 'ELIS A (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay),
- rinçage du support solide, - incubation des éléments restés fixés sur le support solide après l'étape de rinçage précédente avec un milieu contenant des anticorps, notamment des anticorps anti-complexe ternaire selon l'invention, marqués (notamment de manière radioactive, enzymatique ou fluorescente), ou susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué,
- rinçage du support solide,
- détection des anticorps marqués restés respectivement liés aux complexes ternaires lors de l 'étape d'incubation précédente.
L' invention a également pour objet les nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro telles que décrites ci-dessus, comprenant:
- un analogue peptidique tel défini ci-dessus ;
- des réactifs pour rendre un milieu apte à la formation d'une réaction immunologique ; - des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon l'invention, qui a été produit à l' issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'analogue peptidique n'est pas marqué. L' invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les complexes binaires CMH-analogue peptidique tels que définis ci-dessus, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un des complexes susmentionnés, lesdits anticorps étant susceptibles de former un complexe avec ces complexes binaires. Les anticorps selon l'invention sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux susmentionnés sont obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention.
Les anticorps monoclonaux selon l' invention peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d' immunisations in vitro) avec un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit complexe. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (notamment murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis du complexe CMH-analogue peptidique de l'invention pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immuno fluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.
Les anticorps selon l'invention, sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles de former un complexe avec des complexes CMH-analogues peptidiques, et/ ou avec les complexes CMH-peptides ou protéines parents correspondant auxdits analogues peptidiques.
Avantageusement, les anticorps anti-complexes CMH-analogues peptidiques de l' invention reconnaissent les complexes CMH-peptides ou protéines parents susmentionnés avec une affinité au moins égale à celle présentée par les anticorps anti-complexes CMH-peptides ou protéines parents vis à vis des complexes CMH-peptides ou protéines parents .
L'affinité dont il est question ci-dessus peut se mesurer par la constante d'affinité à l'équilibre Ka des complexes impliquant l'un des susdits anticorps avec l 'un des susdits complexes.
L' invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, ainsi que leur utilisation dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées.
L' invention concerne également le procédé de criblage d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu' il comprend les étapes suivantes :
• incubation (notamment à une température de 37 °C) pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, • addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du
CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I,
- détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, • évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH.
L' invention a également pour objet toute trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage d'analogues peptidiques tel que défini ci-dessus, comprenant : - des molécules du CMH, et/ou
- des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou - des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou
- un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou
- un peptide de contrôle.
L' invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent d'obtention et d'étude des propriétés d'analogues peptidiques tels que décrits ci- dessus.
I- Synthèse des analogues peptidiques de l'invention :
A) Généralités :
A titre d' illustration, la méthode de synthèse en phase liquide consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles dans l'ordre requis ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions aminés de l'un et carboxyles de l'autre ou vice- versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.
On pourra par exemple utiliser des groupements protecteurs de type uréthane (Boc, Fmoc benzyloxycarbonyl ou allyloxycarbonyl) pour protéger les extrémités N-terminales des acides aminés et des groupements de type ester (méthylique, éthylique, benzylique, tertio-butylique, allylique ou encore benzhydrilglycolamidique) pour protéger les extrémités C-terminales des acides aminés.
Une telle synthèse peut être effectuée en condensant tout d'abord le résidu aminoacyle AA1 dont la fonction COOH est protégée avec le résidu aminoacyle AA2 dont la fonction NH2 est protégée. La fonction aminé du résidu AA2 dans le fragment AA2-AA1 ainsi obtenu, est alors déprotégée, pour condenser par la suite ledit fragment avec le résidu aminoacyle AA3 dont la fonction aminé est protégée. Les étapes précédentes sont répétées autant de fois qu'il y a de résidus aminoacyles à introduire dans la chaîne des rétro analogues à synthétiser. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. Merrifield dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal (en l'occurrence AA1-OH) de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction aminé est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction aminé en lavant la résine avec un acide. On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe aminé chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique.
B) Cas particulier des analogues peptidiques de l'invention :
Une ou plusieurs des étapes de synthèse décrites ci-dessus peuvent être interrompues afin d' insérer une liaison différente de la liaison -CO-NH- entre certains résidus aminoacyles, et/ou un ou plusieurs acides aminés non protéinogéniques.
B.l.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des liaisons peptidiques modifiées :
La notation Ψ (Spatola & Darlak, 1988) est généralement d'usage pour désigner le lien pseudopeptidique remplaçant la liaison amide (CONH). Parmi les modifications les plus fréquemment rencontrées, on peut citer par exemple les suivantes dont les synthèses sont détaillées dans les références bibliographiques indiquées : la liaison méthylèneamino (réduite) Ψ[CH2NH] (Szelke et al. , 1982 ; Martinez et ai , 1985 ; Sasaki & Coy, 1987) ; rétro-inverso Ψ[NHCO] (Shemyakin et al. , 1969 ; Goodman & Chorev, 1979 ; Chorev & Goodman, 1993); oléfine Ψ[CH=CH] (Hann et ai , 1982 ; Kempf et ai , 1991 ; Bohnstedt et ai , 1993) ; carba Ψ[CH2CH2] (Rodriguez et al. , 1990a, 1990b) ; méthylèneoxy (éther) Ψ[CH2O] (TenBrink, 1986 ; Breton et ai , 1990) ; cétométhylène Ψ[COCH2] (Harbeson & Rich, 1989 ; Gonzalez-Muniz et ai , 1995), hydroxy éthylène Ψ[CH(OH)CH2] (Evans ét al. , 1985 ; Wuts ét al. , 1992).
1) Synthèse des pseudopeptides réduits correspondant aux séquences de MART et du peptide matrice M58-66 :
La contribution de la fonction aminé de chaque liaison peptidique de l'antigène Mart-1 27-35 (AAGIGILTV) de la protéine Mart-1 du mélanome et de l'antigène M58-66 (GLLGFVFTL) de la protéine matrice du virus de la grippe a été évaluée au niveau des interactions de ces antigènes avec leurs récepteurs: la molécule de classe I du MHC HLA-A2 et le TCR.
Structure rigide plane
Figure imgf000031_0001
Liaison peptidique Liaison réduite
Schéma 1 : Représentation schématique des liaisons peptidique et réduite. La liaison réduite ou méthylène amino a la particularité d'être plus flexible que la liaison peptidique en raison d'une libre rotation de la liaison carbone- carbone (schéma 1). L'introduction d'une liaison réduite peut modifier localement l'orientation des chaînes latérales des acides aminés. La liaison réduite peut exister sous sa forme protonée à pH physiologique. Les modifications entraînées par la présence d'une liaison réduite, à savoir la modification de la structure et la modification du caractère hydrophile du peptide parent, peuvent avoir des implications dans les phénomènes de fixation et de reconnaissance de l'antigène.
La synthèse de chaque peptide réduit a été réalisée en phase solide et en chimie Fmoc classique. La liaison réduite est obtenue par condensation d'un α-amino aldéhyde N-protégé avec l'acide α-aminé immobilisé sur la résine. L'imine formée est réduite in situ par le cyanoborohydrure de sodium pour conduire à la liaison réduite selon la méthode décrite par Sasaki et Coy en 1987 (schéma 2).
- v/v" Peptide résine
Figure imgf000032_0001
Schéma 2: Incorporation en phase solide de la liaison réduite. PG: groupement protecteur Fmoc. L'α-amino aldéhyde est synthétisé par la méthode de Fehrentz et Castro,
1983. Cette méthode permet l'obtention rapide, sans racémisation, de l'α-amino aldéhyde N-protégé à partir du N,O-diméthylhydroxamate de l'acide aminé N- protégé correspondant (schéma 3).
Figure imgf000032_0002
Schéma 3 : Synthèse des α-amino aldéhydes N-protégés par la méthode de Fehrentz et Castro. PG: groupement protecteur Fmoc. Les acides aminés suivants de la séquence du peptide réduit sont couplés d'une manière classique. Après synthèse, le peptide réduit est déprotégé et décroché de la résine par l'acide trifluoroacétique (TFA). Chaque peptide réduit est purifié par chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée (RP-HPLC). La masse de chaque peptide est contrôlée par désorption laser assistée d'une matrice (MALDI) à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF.
Les temps de rétention (Tr) sur colonne RP-HPLC C18 dans un gradient de 5 à 65 % de B en 30 mn (avec A= eau à 0,1% de TFA et B= acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) ainsi que les masses des différents peptides sont reportés dans les tables 1 et 2.
Table 1: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues de Mart-127-35
Séquences
PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Tr masse
MARTI 27-35 H- A -A - G- I - G - I - L- T - V -O OHH 12.74 814.4
Ψ(l-2) H-AΨ(CH NH)A-G - I - G - I - L- T - V •OH 12.53 802J Ψ(2-3) H- A- AΨ(CH2NH)G- I - G - I - L - T - V OH 12.58 802.9
Ψ(3-4) H- A - A -GΨ(CH NH)I- G - I - L - T - V OH 11.85 801.6
Ψ(4-5) H- A -A - G - IΨ(CH2NH)G- I - L- T - V -OH 12.03 801.5
Ψ(5-6) H- A - A - G - I - GΨ(CH2NH)I- L - T - V -OH 11.29 801.4
Ψ(6-7) H- A -A - G- I - G - IΨ(CH2NH)L- T - V -OH 12.00 800.4 Ψ(7-8) H- A -A - G- I - G - I - LΨ(CH2NH)T-V -OH 12.77 801.5
Ψ(8-9) H- A -A - G- I - G - I - L- TΨ(CH?NH)V-OH 12.46 801.3
Table 2: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues de
M58-66 Séquences
PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Tr masse
M58-66 H- G -L - L- G - F - V - F- T - L -OH 12.35*968.0
Ψ(l-2) H-GΨ(CH2NH)L-L - G - F - V - F- T - L -OH 10.67*956.2 Ψ(2-3) H- G- LΨ(CH NH)L- G - F - V - F- T - L -OH 11.18*957.1
Ψ(3-4) H- G - L -LΨ(CH NH)G- F - V - F- T - L -OH 16.01 957.3
Ψ(4-5) H- G -L - L - GΨ(CH2NH)F- V - F- T - L -OH 15.61 954.3
Ψ(5-6) H- G -L - L- G -FΨ(CH2NH)V- F- T - L -OH 10.80*955.8
Ψ(6-7) H- G -L - L- G- F -VΨ(CH2NH)F- T - L -OH 11.85*953.2 θΨ(7-8) H- G -L - L- G - F - V- FΨ(CH2NH)T - L -OH 13.05*954.7
HJ8-9) H- G -L - L- G - F - V - F - TΨ(CH NH)L-OH 11.21*957.3
Temps de rétention dans le gradient 20 à 80% de B en 30 mn (avec A = eau à 0,1% de TFA et B*= ACN à 0,08% de TFA). 2) Synthèse des analogues β du peptide MART parent et du peptide MART muté (Leu28) :
Les analogues β sont obtenus par couplage de β-homo acides aminés à la place des acides aminés naturels.
Figure imgf000034_0001
Acide aminé β-homo acide aminé
Schéma 4: Représentation schématique d'un acide aminé et d'un β-homo acide aminé
Le β-homo acide aminé est un acide aminé dans lequel un groupe méthylène a été inséré entre le carbone α et le carboxyle. La configuration du Cα est inchangée (schéma 4). L'incorporation d'un β-homo acide aminé à la place d'un acide aminé dans une séquence peptidique a pour conséquence d'allonger la chaîne peptidique des analogues peptidiques résultants. Ces analogues peptidiques plus longs peuvent être amenés à se tordre, à s'arc-bouter pour pénétrer dans la poche de liaison de la molécule de classe I du CMH. Dans ce cas, certaines chaînes latérales peuvent être déplacées latéralement ou leur orientation modifiée, ce qui peut entraîner des interactions préférentielles avec la molécule de classe I du CMH et/ou le TCR.
Les β-homo acides aminés sont obtenus par synthèse chimique en plusieurs étapes à partir des acides aminés N-protégés correspondants d'après le schéma suivant (Schéma 5).
L'acide aminé protégé sur sa fonction aminé par le groupement Boc est dans un premier temps activé par la méthode aux anhydrides mixtes. L'acide aminé activé réagit avec le diazométhane pour conduire à la diazométhylcétone 2. Le réarrangement de Wolff de cette diazométhylcétone dans le méthanol, en présence du benzoate d'argent et de triéthy lamine donne le β-homo méthy lester de l'acide aminé protégé par le groupement Boc. Une saponification conduit au composé 3. La déprotection du Boc, suivie de la reprotection de la fonction aminé par le groupement Fmoc sont les dernières étapes pour l'obtention du β-homo acide aminé, protégé par le Fmoc. Le composé 4 est introduit par les méthodes conventionnelles de couplage des acides aminés au cours de la synthèse en phase solide en stratégie Fmoc. En pratique, 5 équivalents du mélange (4/BOP/HOBt) sont couplés pendant 20 mn dans le DMF. Le groupement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à 50% dans le DMF et la synthèse est poursuivie d'une manière classique. Pour le décrochage et la déprotection du peptide ainsi que la purification et la caractérisation des peptides, voir paragraphe précédent.
Figure imgf000035_0001
Schéma 5 : Schéma de synthèse des Fmoc-β-homo acides aminés Dans les tables 3 et 4 sont reportés les temps de rétention en RP-HPLC des peptides β sur une colonne C18 (gradient de 5 à 65 % de B en 30 mn avec A= eau à 0, 1 % de TFA et B= ACN à 0,08% de TFA) ainsi que l'analyse de leur masse par MALDI.
Table 3: Séquences et caractéristiques des peptides β, analogues de Mart-1
27-35
Séquences P I P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Rt masse
MARTI 27-35 H- A - A - G - I - G - L - T - V -OH 12.74 814.4 βl H- β-homo A- A- G - I - G - L - T - V -OH 12.62 868.9* β2 H- A-β-homoA- G - I - G - L - T - V -OH 12.50 829.9 β3 H- A - A -β-homoG-I - G - - L - T - V -OH 12.48 828.9 β4 H- A - A - G -β-homoI-G - - L - T - V -OH 12.50 829.5 β5 H- A - A - G - I -β-homoG- - L - T - V -OH 12.50 828.9 β6 H- A - A - G - I I -- GG --ββ--hhoo oI-L - T - V -OH 12.64 829.0 β7 H- A - A - G - II -- GG -- II --β-homoL-T - V -OH 12.10 828.9 β8 H- A - A - G - 11 -- GG -- II -- L -β-homoT-V -OH 1 1.92 829.1 β9 H- A I - G - I - L - T -β-homoV-OH 12.68 829.2 correspond à M+KJ Table 4: Séquences et caractéristiques des peptides β, analogues de Mart-1 27-35 muté Leu28
Séquences
P I P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Rt masse
Mart- 27-35 Leu28 H- A - L - G - I - G - 1 - L - T - V -OH 14.20 857.0 b l H-b-homoA-L- G - 1 - G - I - L - T - V -OH 14.47 871 .2 b2 H- A-b-homoL- G - I - G - I - L - T - V -OH 14.16 870.9 b3 H- A - L -b-homoG-I - G - 1 - L - T - V -OH 14.07 871.0 b4 H- A - L - G -b-homoI-G - I - L - T - V -OH 14.20 871 .4 b5 H- A - L - G - I -b-homoG-I - L - T - V -OH 14.14 871.3 b6 H- A - L - G - 1 - G -b-homoI-L - T - V -OH 14.05 871.7 b7 H- A - L - G - I - G - I -b-homoL-T - V -OH 13.78 871 .3 b8 H- A - L - G - 1 - G - I - L -b-homoT-V -OH 13.56 871.5 b9 H- A - L - G - I - G - I - L - T -b-homoV-OH 14.14 871.4
3) Synthèse du peptide [IIe30Ψ(CH2CH2)Gly31] Mart-1 27-35 Cet analogue correspond à l'introduction d'une liaison carba à la place de la liaison peptidique entre les résidus Ile3^ et Gly 1 de l'antigène Mart-1 27-35.
Figure imgf000036_0001
Liaison peptidique Liaison carba
Schéma 6: Représentation schématique des liaisons peptidique et carba La liaison carba confère une certaine flexibilité au pseudopeptide et ceci en raison de libres rotations autour des liaisons carbone-carbone. Ces libres rotations peuvent entraîner des changements dans l'orientation des chaînes latérales (portées par les carbones Cα et Cα + 1 , voir schéma 6) des deux acides aminés situés de part et d'autre de la liaison carba. Ces modifications dans l'orientation des chaînes latérales peuvent avoir de nombreuses implications dans les phénomènes de fixation, de reconnaissance et d' induction de signaux différents par rapport à ceux engendrés avec le peptide parent. Le synthon Fmoc-IleΨ(CH2CH2)Gly-OH (4 de la Figure 7) est nécessaire à la synthèse de l 'analogue [Ile30Ψ(CH2CH2)Gly3 1] Mart-1 27-35. Ce synthon est obtenu par synthèse chimique en plusieurs étapes (schéma 7).
Le diméthylhydroxamate du Boc-β-homoIle-OH (1) (pour la synthèse des β-homo acides aminés, voir paragraphe précédent) est réduit par l'hydrure d'aluminium lithium à basse température (-25 °C) dans le tetrahydrofurane afin d'obtenir l'aldéhyde correspondant (2). La réaction de Horner-Emmons en présence de triéthyl phosphonoacétate conduit au dipeptide éthylénique 3. L'hydrogénation de la double liaison, la saponification de l'ester, la déprotection et la reprotection de la fonction aminé par le groupe Fmoc permettent d'obtenir le Fmoc-IleΨ(CH2CH2)Gly-OH (4).
Figure imgf000037_0001
NaH
Figure imgf000037_0002
Schéma 7: Schéma de synthèse de Fmoc-Ile30Ψ(CH CH2)Gly 1-OH (4)
Ce synthon (4) est incorporé en phase solide en chimie Fmoc. Le couplage de 5 équivalents du mélange (synthon/BOP/HOBt) est réalisé 2 fois de suite (20 mn chaque) dans le DMF. Le groupement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à 50% dans le DMF. Les acides aminés suivants sont couplés de manière classique. Le peptide est déprotégé et décroché de la résine dans le TFA, précipité dans l'éther et purifié par RP-HPLC.
Le pseudopeptide [Ile30Ψ(CH2CH2)Gly31] Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 100% . Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec A-=eau à 0, 1 % de TFA et B=ACN à 0,08% de TFA) est de 13,49 mn.
L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre
Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 800.0.
4) Synthèse des pseudopeptides carba analogues 1 à 8 de MARTI 27-35
La synthèse de ces peptides est effectuée selon la procédure décrite dans Rodriguez et al., Tetrahedron letters, 1990, 31 , 7319-7322.
Le pseudopeptide 1 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 90% .
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A = eau à 0, 1 % de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de
12,98/13, 10 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M +H + 799, L
Le pseudopeptide 2 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 98% .
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A = eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 12,90 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre
Bruker Protein TOF donne la masse attendue M +H + 799, 16.
Le pseudopeptide 3 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 96% (3a), 95 % (3b). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A=eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08% de
TFA) est de 13,07 (3a), 13,54 (3b) mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 799,13.
Le pseudopeptide 4 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 100% . Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65% de B (avec comme éluant :
A ≈ eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 13,49 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre
Bruker Protein TOF donne la masse attendue M + H+ 800,03.
Le pseudopeptide 5 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 99,7% (5a), 96% (5b). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A=eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08 % de TFA) est de 12,72 (5a), 14, 16 (5b) mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M + H + 799, Le pseudopeptide 6 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 86% (6a), 90% (6b). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A=eau à 0, 1 % de TFA et B *= Acétonitrile (ACN) à 0,08 % de TFA) est de 13,25 (6a), 13,72 (6b) mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide 5 par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue
M + H + 799, 16.
Le pseudopeptide 7 carba Mart-1 27 a un temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A=eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08 % de TFA) est de 10,20 (7a), 13,61 (7b) mn. i () Le pseudopeptide 8 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 99% .
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant : A=eau à 0, 1 % de TFA et B = Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 15 ,24/15,29 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M +H + 798.
1 5
B.2.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des acides aminés non protéinogéniques :
Synthèse du peptide analogue [Tic62] M58-66
Le tétrahydroisoquinolène-3-carboxylique acide est un analogue contraint de
20 la phénylalanine. Il a été introduit en position 62 dans la séquence du peptide matrice de la grippe à la place de la phénylalanine naturelle afin d'étudier l ' importance de l'orientation du groupe phényl dans l' interaction avec la molécule
CMH et le TCR.
La synthèse du peptide analogue a été réalisée en chimie Fmoc classique. Le 25 dérivé Fmoc-L-Tic-OH (commercialisé par la société Néosystem) a été introduit dans la chaîne en croissance en utilisant un procédé classique de couplage (BOP/HOBt/Fmoc-L-Tic-OH) en excès de 5 durant 20 mn dans du DMF. La déprotection du groupement Fmoc a été réalisée en plusieurs étapes en 50% pipéridine dans du DMF (4 traitements de 30 mn chacun séparés de 3 lavages de la 30 résine en DMF). L'assemblage des acides aminés suivants n'a pas posé de problèmes particuliers. Après déprotection classique en TFA et purification HPLC, le peptide a été obtenu à 90% de pureté. La masse mesurée à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF était la masse attendue M +H + 978.9.
La synthèse du peptide analogue [Tic64]M58-66 est effectuée de la même 35 façon que précédemment en introduisant le tétrahydroisoquinolène-3-carboxylique acide en lieu et place de la phénylalanine en position 64. Toujours selon le même protocole :
. les analogues 3-Pya62 et 3-Pya64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule
Figure imgf000040_0001
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues 2-Tha62 et 2-Tha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant!' acide aminé de formule
Figure imgf000040_0002
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues D-Phe62 et D-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant la D-phénylalanine en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues Cha62 et Cha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule
Figure imgf000040_0003
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. l'analogue N-MePhe62 de M58-66 a été obtenu en introduisant l'acide aminé de formule
Figure imgf000040_0004
en lieu et place de la phénylalanine en position 62 ;
. les analogues pCl-Phe62 et pCl-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en
Figure imgf000040_0005
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues Phg62 et Phg64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l 'acide aminé de formule
Figure imgf000041_0001
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement.
II- Etude des propriétés biologiques des analogues peptidiques synthétisés: A) Méthodologie :
1) Détection de l'association entre les peptides et les molécules d ' histocompatibilité l . L Matériel
Sources de molécules d'histocompatibilité Elles sont actuellement de deux types principaux: les cellules mutantes et les molécules d'histocompatibilité purifiées.
- La cellule mutante utilisée est la cellule humaine T2 (DeMars et al. , 1985; Ljunggren & Kàrre, 1985 ; Salter & Cresswell, 1986) qui est un variant de la lignée Tl produite par fusion du lymphome T CEM et du lymphome B 721.174. Cette cellule qui est dépourvue de transporteurs de peptides contient des chaînes lourdes de molécules de classe I libres de peptides qui vont pouvoir accepter des peptides exogènes.
- Des molécules d'histocompatibilité de classe I purifiées par chromatographie d'affinité à partir de lignées de cellules B humaines transformées par l'EBV peuvent être également utilisées. Dans ce cas les peptides endogènes doivent être éliminés par un traitement avec de l'urée 1 ,5 M et de la soude 12,5 mM (pH 11.7) pendant 1 h à 4°C, suivi de leur élimination par une colonne de désalage (PDIO, Pharmacia). Les molécules d'histocompatibilité sont immédiatement remises en présence des peptides à tester dans un tampon PBS avec 0,05 % Tween 20, 2 mM EDTA, 0, 1 % NP40 et 6 mM CHAPS, en présence de
2 μg/ml B2m pour faciliter la réassociation (Gnjatic et al. , 1995). Peptides
Les peptides testés sont utilisés à des concentrations variant de 100 μM à 0, 1 nM.
1.2. Protocole de l'assemblage
Des aliquots de 8 x 10-5 cellules T2 dans un volume de 64 μl, répartis dans des tubes microfuge Eppendorf, sont mis en présence d'un tampon de lyse contenant 10 mM PBS, pH 7.5, 1 % NP40, des inhibiteurs de protéases (1 mM PMSF, 100 μM iodoacétamide, 2 μg/ml aprotinine, 10 μM leupeptine, 10 μM pepstatine et 10 μg/ml inhibiteur de trypsine). La lyse se fait en présence des peptides à tester pendant 30 mn ou 1 h à 37 °C. Après élimination du matériel non solubilisé par une centrifugation à 15 000 rpm à 4°C, le surnageant est additionné de 140 μl de PBS contenant 0,05 % de Tween 20, 3 mM d'azide de sodium, 1 mM PMSF et 10 mg/ml d'albumine bovine. Chaque échantillon est incubé pendant 20 h à 4°C dans 2 puits d'une plaque à microtitration de type Nunc, Maxisorb, préalablement recouverts d'un anticorps monoclonal (Parham & Brodsky, 1981) (10 μg/ml en PBS) qui reconnaît les molécules d'histocompatibilité ayant une(des) conformation(s) conforme(s) pour la présentation des peptides et semblable(s) à celle(s) présente(s) à la surface des cellules. La plaque recouverte d'anticorps est préalablement saturée par de l'albumine bovine à 10 mg/ml dans du PBS-Tween avant la mise de l'échantillon. Le second anticorps qui permet la détection de l'assemblage des molécules d'histocompatibilité est dirigé contre la béta2m. Il est couplé soit à la biotine (NHS-LC biotin, Pierce) soit à la phosphatase alcaline (P-5521 , Sigma) et est incubé à 2 μg/ml pendant 1 h à 37 °C. Dans le cas de l'emploi de la biotine, une incubation de 45 mn à 20-25°C avec de l'extravidine couplée à la phosphatase alcaline (E-2636, Sigma) est réalisée. L'activité de la phosphatase alcaline est mesurée en utilisant comme substrat du 4-méthyl-umbelliferyl phosphate(M-8883 , Sigma) à 100 μM dans de la diéthanolamine 50 mM, pH 9.5 avec du MgC12 1 mM. La lecture est faite à 340/460 nm à l'aide d'un cytofluorimètre 2300, Millipore.
1.3. Contrôle de la stabilité des complexes HLA/peptide Le matériel utilisé est soit du HLA purifié, soit le lysat de la cellule T2. Avec le HLA purifié il faut éliminer les peptides endogènes comme décrit dans le paragraphe 1-1 et le mettre en présence du peptide à tester en tube Eppendorf à
37 °C pendant des temps variables de quelques mn à plusieurs jours. La phase suivante d'incubation sur plaque 96 puits (voir paragraphe 1-2) avec l'anticorps anti-HLA (Parham & Brodsky, 1981) se fait pendant 1 h à 37 °C. La révélation est classique (Teillaud et al. , 1982). Avec le lysat de la cellule T2, toutes les incubations se font également à 37 °C après avoir ajouté tous les inhibiteurs de protéases.
1.4. Analyse de la conformation des complexes HLA/peptide par la résonance plasmonique de surface par le BIAcore
Cet appareil mesure à l'aide d'un faisceau de lumière réfléchie les interactions moléculaires se produisant en temps réel dans un flux de tampon continu. Les anticorps anti-HLA sont dilués à 25 μg/ml dans du tampon acétate de Na pH 7.4 et fixés de façon covalente par leurs aminés libres sur la matrice de dextran carboxyméthylée du "Sensor Chip CM5" activée avec 50 mM NHS et
200 mM EDC. L'injection se fait à 5 μl/mn pendant 6 mn puis les groupements réactifs résiduels sont bloqués avec 30 μl de chlorure d'éthanolamine pH 8.5. Les complexes HLA/peptide formés comme indiqué dans le paragraphe I-l sont injectés (30 μl) à 2 μl/mn et vont pouvoir se lier à l'anticorps immobilisé. Les résultats sont exprimés en unités de résonance (RU) qui correspondent à l'angle de déviation du faisceau lumineux, déviation proportionnelle à la concentration de protéines au contact de la matrice. Le système peut être réutilisé après régénération en injectant 1 M éthanolamine pendant 2 mn. Des mesures cinétiques et d'affinité peuvent être réalisées.
2) Induction de lymphocytes T cytolytiques in vitro
Les cellules mononucléees issues du sang périphérique (PBMC), non purifiées, sont cultivées en RPMI 1640 et 10% SAB avec des antibiotiques, à la concentration de 2x 10^ /ml à raison de 2 ml par puits (plaque Costar 24 puits). A ces cellules sont ajoutés la toxine tétanique (TT) à 1 μg/ml qui stimule les cellules
T CD4+ et le peptide à tester en tant qu'inducteur de CTL à 1 μg/ml. Au jour 3 ou 4, de l'IL-7 est ajoutée à 50 U/ml. Pour chaque culture, 10 réplicats sont traités de manière indépendante. Les cellules effectrices générées sont restimulées par des PBMC préincubées avec le peptide (50 μg/ml pendant 4 h pour lOx 10°" cellules) puis irradiées à 6000 rads. Les cellules stimulatrices sont diluées à 106/ml et 1 ml est ajouté par puits de culture après avoir enlevé 1 ml de surnageant. Le lendemain et 4 jours plus tard, de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (50 U/ml) sont ajoutées. Les effecteurs sont restimulés tous les 7 à 10 jours de la même façon. Quand l'activité cytolytique est apparue l'IL-2 est ajoutée à 50 U/ml. La cytotoxicité peut être testée après 2 stimulations puis chaque semaine. 3) Analyse des fonctions effectrices
3.1. Test de cytolyse direct.
Les lignées T induites sont testées sur leur capacité à reconnaître le peptide inducteur présenté sur le HLA à la surface de cellules cibles, qui sont le plus fréquemment des cellules lymphoblastoïdes EBV. La cytolyse qui en résulte est déterminée par le test standard de 4 h de relargage de 51cr. Au Jour -3 ou -4 avant le test, l'ajout d' interleukines n'est pas fait car les cellules doivent être sevrées pour être en condition d'activation optimale. Pour les inductions primaires, la lyse ne peut être détectée avant 3 semaines. Les cellules cibles marquées pendant 1 h avec 10 μCi de 51cr sont préincubées avec le peptide
(5 μg/ml classiquement ou concentration variable). Après 2 lavages ces cellules sont réparties dans les puits d'une plaque de microtitration 96 puits à raison de 5000 par puits et les cellules effectrices sont ajoutées à des rapports variant de 1 à 100. Le relargage de 51cr (R) obtenu pendant l'incubation de 4 h à 37° C est mesuré. Le pourcentage de lyse est déterminé par la formule suivante:
(R. expérimental - R. spontané / R. total - R. spontané) x 100
3.2. Analyse des interleukines
L'analyse de l'expression des gènes codant pour les interleukines est faite avec une technique de RT-PCR semi-quantitative. Des PBMC ou des cellules purifiées CD8 + (1 à 2 x 10°" ) sont mises en culture dans des plaques 24 puits et stimulées avec soit des anticorps monoclonaux anti-CD3 + en présence de 100 nM de Phorbol Myristate Acétate (PMA) avec des PBMC autologues irradiés et sensibilisés ou non pendant 1 h 30 avec un peptide dont la reconnaissance est restreinte par les molécules du CMH. Pour les différentes interleukines, au bout de
12 à 14 h de stimulation (ou de 3, 10 et 24 h pour l'analyse cinétique de l 'apparition des ARNm), les cellules sont récupérées et l'ARN total extrait par la technique au RNAzol (Bioprobe, Montreuil, France). L'ARN (1 à 2 mg) est rétrotranscrit avec la superscript II (Gibco BRL). Les cDNA synthétisés sont dilués au 1/5 avec de l'eau et leur concentration quantifiée par PCR compétitive avec un plasmide (pQB.2) contenant la séquence de la B actine (produit de 237 pb gracieusement fourni par D. Shire). La réaction de PCR est faite en présence de 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KC1, 1.5 mM de MgC12, 0.2 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.4 mM d'amorce sensé et antisense, 2 U de Taq polymérase (Promega). L'amplification est réalisée en commençant par une dénaturation à 94°C, 5 mn, puis par 30 cycles à 94°C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72°C, 30 s, et une dernière élongation à 72°C, 10 mn, dans un thermostat régulé (Perkin Elmers 9600). L'analyse de l'IL-2, de l'IL-4 et de l'IFN-g est faite dans les mêmes conditions que pour la B-actine, excepté le nombre de cycles qui varie entre 30 et 40. La quantification relative est réalisée par PCR compétitive.
B) Résultats : 5 1) Analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques :
1.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série M58-66 : Les résultats sont représentés sur la figure 1 (figures 1A à 1C).
K) Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de β2 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti β2 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est
15 proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. NP 383-391 est un peptide contrôle négatif. 0. peptide correspond au bruit de fond en absence de peptide. U.F. : unité arbitraire de fluorescence.
Seules deux modifications affectent la liaison de ces peptides modifiés sur la molécule HLA-A2 : modification par la D-Phényl en position 62
20 ([D-Phe62]M58-66) et en position 64 ([D-Phe64]M58-66).
1.2. Capacité de ces peptides à induire la lyse des cellules cibles T2 par une lignée de cellules T cytotoxiques (CTL) spécifique de M58-66 et restreinte par la molécule HLA-A2J .
25 Les résultats sont représentés sur la figure 2 (figures 2A à 2D).
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant
2 h avec 1 μg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10 cellules effectrices (E)/l cellule cible (C). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la
30 concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les modifications Phg-62 et 64, DPhe-62 et 64, Cha62 et 64, Tic 62 et 64 affectent la reconnaissance des lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66.
35 1.3. Dose réponse.
Les résultats sont représentés sur la figure 3 (figures 3 A et 3B). Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 1 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66 ont une affinité plus faible pour les peptides modifiés.
2) Analogues peptidiques de Mart-1 comportant une liaison du type β- homologation :
2. L Liaison sur la molécule A2. Les résultats sont représentés sur la figure 4 (figures 4A et 4B).
Les différents peptides sont comparés pour leur capacité à se lier à la molécule HLA-A2J purifiée.
Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de β2 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti β2 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. (U.F. : unité arbitraire de fluorescence). NP est un peptide de la nucléoprotéine du virus de l'influenza qui ne se lie pas à la molécule HLA-A2 (contrôle négatif).
A part le peptide β4 homo qui se lie mieux que le peptide parent, les autres peptides β homo ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1.
2.2. Capacité de ces peptides à induire la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones T spécifiques de Mart-1 restreints par la molécule HLA-A2. L
Les résultats sont représentés sur la figure 5.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec 1 μg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT11 , LT12) à un rapport
3 cellules effectrices/ 1 cellule cible (E/T). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse.
Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-1 sont lysées à 90% par les trois clones cytolytiques (LT8, LT11 et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seul le peptide β4 homo est capable d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un seul clone (LT12). 2.3. Dose réponse.
Les résultats sont représentés sur la figure 6.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant
2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec le clone T LT12 à un rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Le clone T LT12 a une affinité plus faible pour le peptide β4 que vis-à-vis du peptide Mart-1.
3) Analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison -CH2-NH-.
3.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série Mart-1 réduit. Les résultats sont représentés sur la figure 7 (figures 7 A et 7B).
Complexes formés peptides/HLA-A2 en fonction de la concentration en peptide :
Les peptides ont été incubés à deux concentrations différentes (10"4 M et 10~6 M) à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de β2 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l'Ac BB7.2 (spécifique de cette molécule de classe I et adsorbé au fond des puits) et révélés par un second Ac anti β2 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l' intensité de fluorescence détectée au cytofluor. (U.F. : unité arbitraire de fluorescence).
Les peptides vμ 1-2 à 4-5 ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1. Les peptides vμ 4-5 à 8-9 se lient très faiblement à la molécule A2J purifiée.
3.2. Capacité des peptides de la série Mart réduit à induire la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones T spécifiques de Mart restreints par la molécule HLA-A2.1 .
Les résultats sont représentés sur la figure 8. Test de lyse : Des cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant
2 h avec 1 μg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT11 , LT12) à un rapport
3 cellules effectrices/ 1 cellule cible (E/T). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction des différents clones testés. Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-1 sont lysées à 90% par les trois clones cytolytiques (LT8, LTl l et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seuls les peptides vμ 2-3, vμ 5-6 sont capables d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un seul clone (LT8 et LT12 respectivement), vμ 7-8 induit une activité de lyse plus faible détectée uniquement avec le clone LT12.
3.3. Dose réponse des différents peptides qui induisent une lyse avec les clones LT8 et LT12. Les résultats sont représentés sur la figure 9 (figures 9A et 9B).
Test de lyse :
Des cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant
2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT12) à un rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les peptides vμ 2-3 et vμ 5-6 ont une dose réponse comparable à celle du peptide parent alors que le peptide ψ 7-8 n'induit la lyse que faiblement même à concentration forte en peptide. Ce résultat suggère que la modification introduite diminue l'affinité du TCR (récepteur T) du clone LT8 pour ce peptide.
4) Analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant une liaison -CH2-NH-.
4.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série M58-66 réduit.
Les résultats sont représentés sur la figure 10 (figures 10A et 10B). Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de β2 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l 'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti β2 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cyto fluor. U.F. : unité arbitraire de fluorescence.
Les peptides Mart-1 modifiés par réduction ont une affinité intermédiaire pour la molécule HLA-A2. La réduction en position 2-3 et 8-9 rend la liaison indétectable pour le clone étudié. 4.2. Capacité des peptides de la série réduit M58-66 à induire la lyse des cellules cibles T2 par une lignée CTL induite par M58-66 et restreinte par la molécule HLA-A2. L
Les résultats sont représentés sur la figure 11. Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant
1 h avec 1 μg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse.
La réduction en position 2-3 et 5-6 n'affecte pas la reconnaissance du peptide par les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66.
LEGENDE DES FIGURES :
- Figure 1 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques : les concentrations des analogues peptidiques (10"4 à 10~10 M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée :
. Figure 1A : étude de la liaison des analogues peptidiques [Tic62]M58-66
(encore désigné M58-66 Tic62 ou Tic62), [3-Pya62]M58-66 (3-Pya62),
[2-Tha62]M58-66 (2-Tha62), [D-Phe62]M58-66 (D-Phe62), [Tic64]M58-66 (Tic64),
. Figure 1B : étude de la liaison des analogues peptidiques [3-Pya64]M58-66 (3-Pya64), [2-Tha64]M58-66 (2-Tha64), [D-Phe64]M58-66 (D-Phe64), [Cha62]M58-66 (Cha62), [N-MePhe62]M58-66 (N-MePhe62), . Figure 1C : liaison des analogues peptidiques [pCl-Ph62]M58-66 (pCl-Phe62), [Phg62]M58-66 (Phg62), [Cha64]M58-66 (Cha64),
[pCl-Phe64]M58-66 (pCl-Phe64), [Phg64]M58-66 (Phg64), en comparaison avec le peptide M58-66, le peptide de contrôle négatif NP383- 391 , et une solution ne contenant aucun peptide (0 peptide).
- Figure 2 : étude de l'effet d'analogues peptidiques de M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques sur la lyse d'une lignée de cellules cibles
T2 par une lignée de cellules T cytotoxiques spécifiques de M58-66 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée et le rapport E/T (cellules effectrices/cellules cibles) est représenté en abscisse :
. Figure 2A : effet des analogues Tic62 et Tic64 sur la lyse des cellules T2, . Figure 2B : effet des analogues D-Phe62, D-Phe64, Cha62, Cha64 sur la lyse des cellules T2,
. Figure 2C : effet des analogues 3-Pya62, 3-Pya64, 2-Tha62, 2-Tha64 sur la lyse des cellules T2, . Figure 2D : effet des analogues pCl-Phe64, Phg64, pCl-Phe62, Phg62 sur la lyse des cellules T2, en comparaison avec les effets du peptide M58-66, et d'une solution ne contenant pas de peptide (0 peptide). - Figure 3 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration d'analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse :
. Figure 3A : étude en fonction de la concentration de pCl-Phe62 et pCl- Phe64,
. Figure 3B : étude en fonction de la concentration de 2-Tha62 et de 2-
Tha64, en comparaison avec la concentration de M58-66.
- Figure 4 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptididiques du peptide Mart-1 comportant une liaison du type β-homologation ; les concentrations des analogues peptidiques (10~5 à 10"^ M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée :
. Figure 4 A : étude de la liaison des analogues βl homo (Bl), β2 homo
(B2), β3 homo (B3), β4 homo (B4), . Figure 4B : étude de la liaison des analogues β5 homo (B5), β6 homo (B6), β7 homo (B7), β8 homo (B8), β9 homo (B9), en comparaison avec le peptide Mart-1 (Mart), et un peptide de contrôle négatif (NP).
- Figure 5 : étude de l'effet d'analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison du type β-homologation sur la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones de cellules T cytotoxiques (LT8, TU et LT12) spécifiques de Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques Bl à B9 sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Mart-1 et une solution sans peptide (0). - Figure 6 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration de l'analogue β4 homo de Mart-1 , en comparaison avec Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration en peptide (μg/ml) en abscisse.
- Figure 7 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison -CH -NH-
(analogues réduits) : les peptides aux concentrations de ÎO-0" M ou de 10"4 M sont indiqués en abscisse, et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée :
. Figure 7 A : étude de la liaison des peptides Ψ(l-2)Mart-l (représenté par 1-2), Ψ(2-3)Mart-l (2-3), Ψ(3-4)Mart-l (3-4), Ψ(4-5)Mart-l (4-5), . Figure 7B : étude de la liaison des peptides Ψ(5-6)Mart-l (5-6), Ψ(6-7)Mart-l (6-7), Ψ(7-8)Mart-l (7-8), Ψ(8-9)Mart-l (8-9), en comparaison avec Mart-1.
- Figure 8 : étude de l'effet des analogues réduits 1-2 à 8-9 de Mart-1 sur la lyse de cellules T2 par 3 clones de cellules T (LT8, LTl l et LT12) spécifiques de
Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques 1-2 à 8-9 sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Mart-1 et une solution sans peptide (0).
- Figure 9 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration d'analogues réduits de Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse (μg/ml) :
. Figure 9A : étude en fonction de la concentration des analogues 2-3 et 7-8, . Figure 9B : étude en fonction de la concentration de l'analogue 5-6, en comparaison avec la concentration de Mart-1. - Figure 10 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant une liaison -CH2-NH- (analogues réduits) : les concentrations des peptides (10"^ à 10"^ M) sont indiquées en abscisse, et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée : . Figure 10A : étude de la liaison des peptides T(l-2)M58-66 (1-2), Ψ(2-3)M58-66 (2-3), Ψ(3-4)M58-66 (3-4), Ψ(4-5)M58-66 (4-5),
. Figure 10B : étude de la liaison des peptides F(5-6)M58-66 (5-6), Ψ(6-7)M58-66 (6-7), Ψ(7-8)M58-66 (7-8), Ψ(8-9)M58-66 (8-9), en comparaison avec M58-66, et un peptide muté (GIL) de M58-66 portant la mutation GLL → GIL [M58-66 (GIL)] , - Figure 11 : étude de l'effet des analogues réduits 1-2 à 8-9 de M58-66 sur la lyse de cellules T2 par un clone de cellules T spécifique de M58-66 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et le rapport cellules effectrices/cellules cibles (E/T) est indiqué en abscisse, en comparaison avec M58-66, M58-66 muté (GLL) et une solution sans peptide (0).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents interagissant avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies impliquant une réponse immunitaire à médiation cellulaire, chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels : au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide aminé non protéinogénique, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées.
2. Utilisation selon la revendication 1 , d'analogues peptidiques issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, dans le cadre de pathologies impliquant les lymphocytes T cytotoxiques.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'analogues peptidiques caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes :
-CH2-NH- (méthylène amino) ;
-CH2-CH2- (carba) ;
-CO-CH2- (cétométhylène) ;
-CH2-O- (méthylène-oxy) ;
-CHOH-CH2- (hydroxyéthylène) ;
-CHOH-CHOH - (di-hydroxyéthylène) ;
-CH = CH- (E ou Z oléfine) ;
-CHCN-NH- (cyanométhylène amino) ;
-S-CH2- (thiométhylène) ;
-CH2-S- (méthylène thio) ;
-CS-NH- (thioamide) ;
-PO2-NH- (phosphonamide) ; -CHOH- (hydroxyméthylène) ;
-NH-CO-NH- (urée) ;
-CH CH- (oxirane) ;
\ / o
-C N- (tétrazole) ;
// \
N N
\ #
-CH2-CO-NH- (β-homologation) ; -CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino) ; -CO-NH-NH- (hydrazino).
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'analogues peptidiques caractérisés en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ledit acide aminé non protéinogénique étant choisi notamment parmi les acides aminés suivants:
- les acides aminés de configuration D,
- les acides α-aminés de formule générale :
dans laquelle :
. Ri , R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres : un atome d'hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants : -CH3 (méthyl), -CH2CH3 (éthyl), -(CH2)4-CH3, -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -Φ (phényl), -CH2Φ (benzyl), -CH2ΦC1 (para-chlorobenzyl), -CH2-CH2Φ (2-phényl-éthyl), -CH2CHCH2
(alkyl), méthylfluorényl, -CH2CONH2 (glycolamide), -CH2CONΦ2 (benzhydrylglycolamide), -CHOHΦ,
Figure imgf000055_0001
étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit R\ , soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne représentent pas un atome d'hydrogène,
. le cas échéant, Ri , R2, Cα et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule :
Figure imgf000056_0001
U
les acides β-aminés de formule générale
Figure imgf000056_0002
dans laquelle R\ , R2 et R3, indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, notamment :
. les β-homo amino acides de formule :
Figure imgf000056_0003
dans laquelle R\ et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou . les α-hydroxy β-homo amino acides de formule :
Figure imgf000056_0004
dans laquelle Ri et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides γ-aminés de formule générale :
Figure imgf000056_0005
dans laquelle Ri , R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou Ri , R2 et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R4 a la même signification que celle donnée ci-dessus pour R! , R2 et R3, notamment les dérivés de statine de formule :
Figure imgf000057_0001
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'analogues peptidiques caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles : d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante :
- incubation, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique,
• addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I,
. détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d' incubation de l'analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, d'analogues peptidiques caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés :
* parmi ceux susceptibles : d' induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléees issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, d' induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, et d'induire in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron y. lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant :
. soit des agonistes des récepteurs (TCR) reconnaissant l'antigène (à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxiques, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs, . soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonistes partiels induisant notamment la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les peptides parents, * ou, parmi ceux : susceptibles d' induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléees issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, n' induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, n'induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l' interféron γ, lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des récepteurs des cellules T cytotoxiques.
7. Analogues peptidiques de peptides parents impliqués dans le mélanome, notamment le peptide MARTI 27-35, ledit peptide parent comportant, le cas échéant, une ou plusieurs mutations, tel que le peptide parent muté MARTI 27-35 Leu285 lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi les suivants :
- les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues Ψ(l-2) à Ψ(8-9) suivants :
Séquences PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
MARTI 27-35 H- A - A - G - I - G - I - L - T - V -OH Ψ(l-2) H-AΨ(CH2NH)A-G - I - G - I - L - T - V -OH
Ψ(2-3) H- A- AΨ(CH2NH)G- I - G - I - L - T - V -OH
Ψ(3-4) H- A - A -GΨ(CH2NH)I- G - I - L - T - V -OH
Ψ(4-5) H- A - A - G - IΫ(CU2NH)G- I - L - T - V -OH
Ψ(5-6) H- A - A - G - I - GΫ(CH2N»)I- L - T - V -OH ψ<6-7) H- A - A - G - I - G - I (CH2NH)L- T - V -OH
Ψ(7-8) H- A - A - G - I - G - I - Lncn2Nn>T-V -OH
Ψ(8-9) H- A - A - G - I - G - I - L - TΨCCH2NH,V-OH
- les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-CO-NH-, encore désignée ci-après β-homo, tels que les analogues βl à β9 suivants : Séquences PI P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
MARTI 27-35 H- A - A - G - I - G - I - L - T - V -OH
01 H-p-homoA-A- G - I - G - I - L - T - V -OH β2 H- A-p-ι.omoA- G - I - G - I - L - T - V -OH β3 H- A - A -p-homoG-I - G - I - L - T - V -OH β4 H- A - A - G -p-homoI-G - I - L - T - V -OH β5 H- A - A - G - I -p.homoG-1 - L - T - V -OH β6 H- A - A - G - I - G -p-homc ,I-L - T - V -OH β7 H- A - A - G - I - G - I - -β-homo L-T - V -OH β8 H- A - A - G - I - G - I - - L - P- omoT-V -OH β9 H- A - A - G - I - G - I - L - - T -β-homoV-OH
- les analogues peptidiques de MARTI 27-35 Leu28 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-CO-NH-, tels que les analogues βl à β9 susmentionnés dans lesquels l'alanine en P2 est remplacée par une leucine,
- les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-CH2-, tels que les analogues suivants :
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000060_0002
Ile-Gly-lle-Leu-Thr-Val-OH
Figure imgf000060_0003
Figure imgf000060_0004
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000061_0002
8. Analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels:
- l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues suivants :
Séquences P I P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
M58-66 H- G - L - L - G - F - V I-' T 1. -OH
Ψ(l -2) H-GΨ(CH2NH)L-L - G - F - V - 1; - T L -OH
Ψ(2-3) H- G- LΨ(CH2NH)L- G - F - V - L -OH
Ψ(3-4) H- G - L -LY(CH2NH)G- F - V - |- - •[ • L - OH
Ψ(4-5) H- G - L - L - GT(CH2NH)F- V - F - T L -OH
Ψ(5-6) H- G - L - L - G - FT(CH2NH»V - F - T - F -OH
H'(6-7) H- G - L - L - G - F - Vτ,πι -jNH)F- T - L -OH
Ψ(7-8) H- G - L - L - G - F - V Fl'(CH2NH)T - L -OH
Ψ(8-9) H- G - L - L - G - F - V - F - TY<CH2NH)L-OH - l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tels que les analogues suivants :
Figure imgf000062_0001
>
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000063_0002
Figure imgf000063_0003
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000064_0002
9. Analogues peptidiques de peptides parents du virus du SIDA, notamment des peptides NEF 84-92, et GAG 77-85, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi :
- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues NEFRD1-8 du peptide NEF, et GAGRD1-8 du peptide GAG suivants :
NEF AVDLSHFLK NEFRD1 AΨ(CH2-NH)VDLSHFLK NEFRD2 AVΨ(CH2-NH)DLSHFLK NEFRD3 AVDΨ(CH2-NH)LSHFLK NEFRD4 AVDLΨ(CH2-NH)SHFLK NEFRD5 AVDLSΨ(CH2-NH)HFLK NEFRD6 AVDLSHΨ(CH2-NH)FLK NEFRD7 AVDLSHFΨ(CH2-NH)LK NEFRD8 AVDLSHFLΨ(CH2-NH)K GAG SLYNTVATL
GAGRD1 SΨ(CH2-NH)LYNTVATL
GAGRD2 SLΨ(CH2-NH)YNTVATL
GAGRD3 SLYΨ(CH2-NH)NTVATL
GAGRD4 SLYNΨ(CH2-NH)TVATL
GAGRD5 SLYNTΨ(CH2-NH)VATL
GAGRD6 SLYNTVΨ(CH2-NH)ATL
GAGRD7 SLYNTVAΨ(CH2-NH)TL
GAGRD8 SLYNTVATΨ(CH2-NH)L
- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CHOH-NH-, tels que les analogues NEFHEA1-8 du peptide NEF suivants :
NEF AVDLSHFLK
NEFHEA1 A Ψ ( CHOH- NH)VDLSHFLK
NEFHEA2 AVΨ( CHOH- NH)DLSHFLK
NEFHEA3 A V D Ψ ( CHOH- NH)LSHFLK NEFHEA4 AVDLΨ( CHOH- N H ) S H F L K
NEFHEA5 A V D L S Ψ ( CHOH- N H ) H F L K
NEFHEA6 A V D L S H Ψ ( CHOH- N H ) F L K
NEFHEA7 AVDLSHFΨ( CHOH- N H ) L K
NEFHEA8 AVDLSHFLΨ( CHOH- N H ) K
10. Utilisation d'analogues peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales (notamment le mélanome), auto-immunes et allergiques.
11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un analogue peptidique agoniste, le cas échéant partiel, défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Composition de diagnostic pour le diagnostic in vivo de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, ou pour l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
14. Complexe entre un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, et un élément du complexe d'histocompatibilité majeur
(encore désigné complexe binaire MHC-analogue peptidique), et éventuellement un récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire MHC-analogue peptidique-récepteur T).
15. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, à savoir de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes interagissant avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, avec un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, dans des conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et le complexe binaire susceptible d'être formé entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH présentes dans ledit échantillon ;
- la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique peptidique-récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.
16. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro selon la revendication 15, comprenant:
- un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9; - des réactifs pour rendre un milieu apte à la formation d'une réaction immunologique;
- des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon la revendication 14, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où ledit analogue peptidique n'est pas marqué.
17. Anticorps dirigés contre les complexes binaires tels que définis dans la revendication 14, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe binaire susmentionné, lesdits anticorps étant susceptibles de former un complexe avec ces complexes binaires.
18. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon la revendication 17, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
19. Procédé de criblage d'analogues peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : • incubation pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique,
• addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I,
• détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide,
• évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH.
20. Trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon la revendication 19, comprenant :
- des molécules du CMH, et/ou
- des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans 5 leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou
- des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du
K) CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la β2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou
- un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou 15 - un peptide de contrôle.
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