JPH07508001A - 副甲状腺由来高血圧因子活性コンポーネント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 副甲状腺由来高血圧因子活性コンポーネント発明の分野 本発明は、グリセロリン脂質（リン脂質と呼称する場合もある）に結合したポリ ペプチドからなる副甲状腺由来高血圧因子活性コンポーネントの同定、特性、甘 酸に関する。このコンポーネントは、副甲状腺由来高血圧因子と実質的に同様の 活性を示す。すなわち、細胞外カルシウムの取り込みの調節に関与し、哺乳動物 における高血圧及びいくつかの他の疾患に関係する。このコンポーネントに対す る抗体を用いた患者の循環因子検出法を開示する。また、副甲状腺由来高血圧因 子活性コンポーネントの拮抗剤を開発し、細胞内カルシウムの上昇に起因する疾 患に罹患した患者の治療法における該拮抗剤の使用も開示する。

発明の背景 高血圧症とは通常、収縮期及び／又は拡張期の動脈圧が公称値である１　４０／ ９０ｍｍＨｇより上昇した状態と定義される。高血圧を伴う疾患には、動脈硬化 、高血圧性腎不全、脳卒中、欝血性心不全及び心筋梗塞が含まれる。動脈圧の降 下に有効な多くの治療法が発見されているにもかかわらず、本態性高血圧症の病 因は本質的に不明のままである。高血圧に対する遺伝的素因は一般に認められて いるか、多くの異なる薬剤が高血圧症の治療に有効であることが見出され、又こ れらの薬剤が異なる薬理学的機序により作用していると見なされる事実から、本 態性高血圧にはいくつかの要因が存在するであろうことが示唆される。

多くの研究は、１つまたはそれ以上の循環因子が高血圧症の発症及び経過に関与 しているであろうことを示している（Ｗｒｉｇｈｔ池、ｒＳＨＲ血液中に見出さ れた高血圧性物質」、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、３４．１５２１−１５２８　（１９８ ４）；Ｄａｈｌ他、　「高血圧の液性伝達：パラバイオシスによる証明Ｊ、Ｃ１ ｒｃ、Ｒｅｓ。

２４／２５　（ＳｕｐｐＩ、Ｉ）、２＋−２３（＋９６９）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒ ｇ他、ｒｓＨＲにおける静脈肥大の原因となる循環因子の証明Ｊ、Ａｍ、Ｊ、Ｐ ｈｙｓｉｏ１．２４１．Ｈ４２ｌ−Ｈ４３０（１９８１）；Ｔｏｂｉａｎ他、　 「食塩誘発高血圧を伴うＤａｈＩＳラットにおける循環液性昇圧物質Ｊ、Ｃｌ１ ｎ、Ｓｃｉ、５ヱ、３４５ｓ−３４７ｓ　（１９７９）；Ｚｉｄｅｋ他「原発性 高血圧症の発病における液性因子Ｊ　Ｉ　Ｋｌ　ｉｎ、Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ。

６３　（Ｓｕｐｐｌ、Ｉｔ）、Ｄ：９４−９６　（１９８５）；Ｈｉｒａｔａ他 ［高血圧の食塩感受性Ｄａｈｌラットの血清における高血圧誘導因子Ｊ＋　Ｈｙ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　Ｌ　７０９−７１６　（１９８４））。例えば、パラバ イオシスや交叉潅流試験では、正常血圧動物に高血圧動物の血液を交流させるこ とにより血圧を上昇させることかできた。ＳＨＲ（高血圧自然発症ラット）から 得られた赤血球関連因子を皮下注射することにより、正常血圧のＷＫＹ（Ｗｉｓ ｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ）ラットにおいて高血圧が誘発されることが観察されており 、かつ高血圧の食塩非感受性Ｄａｈｌラットの血清を注射することにより、正常 血圧の食塩感受性Ｄａｈｌラットの血圧上昇を誘発することができる。

高血圧ラット及び高血圧患者のいずれにも存在し、細胞内カルシウムを上昇させ る循環因子も報告されている（Ｂａｎｏｓ他、　「本悪性高血圧患者の血小板に おけるカルシウム取り込み増加に関連する２つの因子Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｈ ｙｐｅｒｔｅｎｓ、９．１５１５−１５３０　（１９８７）；Ｚｉｄｅｋ他、　 「高血圧患者血漿の透過性元通ヒト好中球内カルシウム移送に対する効果Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｓｃｉ、７４．５３−５６　（１９８８）；Ｌｉｎｄｅｒ他。

ｒ重態性高血圧患者循環因子の正常血小板細胞内遊離カルシウムに（＋９８７） ；Ｂｒｕｓｃｈｉ他、ｒＳＨＲ及び本態性高血圧患者の血小板において細胞質遊 離カルシウムは増加するｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｓｃｉ、６８，１７９−１８４　（１９８５）；Ｗｒｉｇｈｔ他。

「高血圧特性を有するＳＨＲ赤血球抽出物による大動脈のカルシウム取り込み刺 激Ｊ、Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６４．１５１５−１ ５２０　（１９８６））、脈管の収縮力は細胞内カルシウムレベルの影響を受け るため、血圧上昇因子と細胞内カルシウム上昇因子が関連しているであろうと推 測することは妥当であると考えられるが、まだ実験的証明はなされていない。い くつかのタイプの高血圧に、カルシウム調節ホルモンが関与することを示唆する 証拠が集まってきている（Ｌ、　Ｍ、　Ｒｅ５ｎ　ｉ　ｃｋ、　Ａｍ、Ｊ、Ｍｅ ｄ、８２　（Ｓｕｐｐｌ、ＩＢ）、１６　（１９８７））。

ＰＴＨ（副甲状腺ホルモンはカルシウム調節ホルモンである。本悪性高血圧患者 の３０％またはそれ以上は、１ｒ−ＰＴＨ（免疫反応性の副甲状腺ホルモン）の 上昇を特徴とするサブグループに分類される（Ｌａｒａｇｈ他、Ｋｉｄｎｅｙ　 Ｉｎｔ、３４．　（Ｓｕｐｐｌ、３５）、５Ｉ６２　（１９８Ｂ））。ＳＨＲラ ットにおけるＰＴＨレベルの上昇が報告されており、（ＭｃＣａｒｒｏｎ他、） ｌｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３　（Ｓｕｐｐｌ、ｌ）、１１６２　（１９８１） 〕、さらに、副甲状腺機能元進患者がしばしば高血圧を示し、多くの症例で副甲 状腺切除によりその症状が緩解されることが観察Ｒラットにおいても報告されて いる（Ｓｃｈｌｅｉｆｆｅｒ他、Ｊａｐ、Ｃ４ｒｃ、Ｊ、１旦、１２７２　（１ ９８１））、哺乳類及びその池のを髄動物においては、外因性ＰＴＨが血圧降下 をきたす（Ｐａｎｇ他、Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４１゜１３ ５（１９８０））にもかかわらず、いろいろな研究者は、ＰＴＨが本態性高血圧 の進展に関与していると提唱している。このＰＴＨの血管拡張作用もまた、高カ ルシウム血症を招来する活性部位とは分子上独立した特別な活性部位に関係して おり（Ｐａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏｌｏｇｙ　１１２，２８４（＋９８３） ）、ＰＴＨはさらにＬ−タイプのカルシウムチャンネルを通じて（Ｗａｎｇ他、 ＦＥＢＳ、Ｖｏｌ、２８２．Ｎｏ、２．　ｐ、３３１−３３４（１９９１））カ ルシウムが血管平滑筋に流入することを阻害することが示されている（Ｐ　ａ　 ｎ　ｇ他、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、４２．１３９５（１９８８））。従来、ＰＴＨが 上昇すれば、血清中のイオン化カルシウムレベルが上昇すると考えられてきたが 、高ＰＴＨレベルにある高血圧患者が血清中のイオン化カルシウムレベルの低下 を示すという事実によりこのパラドックスは、更に強調される（Ｒｅｓｎｉｃｋ 他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０９．８８８（＋９８３）；Ｈｖａｒｆ ｎｅｒ他、Ａｃｔａ　Ｍｅｄ、５ｃａｎｄ　、主±１，４６１　（１９８６）） 。

本態性高血圧症に副甲状腺が関与することは明白であるが、血管系に及ぼすＰＴ Ｈの作用に関して報告しているこれまでの文献からは、ＰＴＨか本態性高血圧の 原因因子であるとは考えられない。

ＳＨＲラットの血液中における循環因子の存在は、我々か報告した研究（Ａｍ、 Ｊ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、２．２６−３１　（１９８９）〕により確認されてい る。これらの研究において我々は、ＳＨＲラットからの血漿を正常血圧ラット（ ＷＫＹ及びＳＤラット）の静脈内に持続注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）あるいは単回 注入（ｂｏｌｕｓ　ｊｎｊｅｃｔｉｏｎ）した場合、血圧が上昇することを示し た。さらに生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）試験において、ラット尾動脈切片による ａ　Ｓ　Ｃａ取り込みが、ＳＨＨの血漿濃度を緩衝液の培地中で増加させたとき 、用量依存的に増大することを示した。これらの実験結果は、血圧の上昇及び細 胞内のカルシウム取り込みの増加かともにこの系内に存在し、かつ利用可能なＳ ＨＲの血漿量に依存していることを明らかにしている。興味深いことに、上記の 両事例の作用の立ち上がりは遅く、徐々に進行するが、ノルエピネフリン、アン ギオテンシン■及びパップレシンのような周知の内因性昇圧物質は投与後はとん ど直ちに又は極めて迅速に血圧を上昇させることが観察されている。副甲状腺由 来高血圧因子は血圧上昇や細胞内へのカルシウムの取り込み増加の開始に２０〜 ３０分かかるのに対して、周知の内因性昇圧物質は１〜２分で始まる。これらの 研究で観察されたもう一つの結果は、ＳＨＲの血漿の持続注入を中止し、正常血 圧ラットから得た血漿に置き換えると、血圧が極めて迅速に元の状態に低下した ことである。この血圧低下は、単なる循環液量の減少による影響ではない。関連 する実験では、高血圧患者の血漿を透析し、正常血圧ＳＤクラット注入すると血 圧を上昇させた。これらの患者の血漿はｉｎ　ｖｉｔｒｏでラット尾動脈におけ るカルシウムの取り込みも上昇させた。正常血圧の患者の透析血漿は血圧を有意 に上昇させなかった。

循環因子の由来は、未だ知られていない。しかし、ＰＴＨが高血圧ラットにおい て上昇するという逸話的な報告により、副甲状腺が研究の標的として示唆された 。ＳＨＲラットの副甲状腺を切除すると、血圧の低下が観られ、また副甲状腺を 切除したＳＨＲラットからの血漿は、正常血圧ラットの血圧上昇を引き起こさな かった。逆に、正常血圧ＳＤ　（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ　ｅｙ）ラットにＳ ＨＲラットからの副甲状腺を移植すると血圧の上昇が認められ、採取した血漿を 他の正常血圧ラットに注入することにより示されたように、血漿中に因子の出現 か認められた（ＰａｎｇとＬｅｗａｎｃｚｕｋ、Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｈｙｐｅｒｔｅ ｎｓ、、２．８９８　（１９８９）〕。

これらの研究に基づき、我々はこの循環因子が副甲状腺に由来していると結論し 、この物質を“副甲状腺由来高血圧因子”　（ＰＨＦ）と命名した。

ＳＨＲや多くの本態性高血圧患者において、従来報告されていなかった副甲状腺 に由来する循環因子の単離・精製が証明されており、またそれは関連する特許出 願（Ｎｏ、６０３．　７４５，１９９０年１１月２１日出願）の発明の要旨であ る。ただし、該出願は１９８９年３月２２日付の特許出願（Ｎｏ、３２７．４５ ０、現在放棄）の一部継続出願である。その関連出願の開示内容は副甲状腺由来 高血圧因子の精製技術を含む技術を引用する形で本願明細書に組み入れられてい る。

前述の関連出願において述べられた如く、この因子は細胞外カルシウムの取り込 みを調整することが示されており、また食事によって採取するカルシウムレベル の増加によって阻害し得るものである。

この因子は単離されており、この因子に対して産生された抗体を用いて同因子を スクリーニングする方法も開示されている。この因子は約２．７００ダルトンの 分子量を有し、更に正常血圧ラットに投与したとき遅発性の血圧上昇特性を育し ている。そしてその血圧上昇は、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取り込み 増加と時間的に関連している。バイオアッセイデータより、人間及びラットにお けるこの因子は実質的に類似していることが見出されている。

発明の概要 本発明は、グリセロリン脂質に結合したポリペプチドからなる副甲状腺由来高血 圧因子の活性コンポーネントの同定に関するものであり、それは正常血圧ラット に投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連 する遅発性の血圧上昇特性を有する。このコンポーネントに対する抗体は、副甲 状腺由来高血圧因子やその一部の存在を検出する免疫学的アッセイに用いられる 。そしてその存在は高血圧又はカルシウムレベルの上昇に関連する他の疾患を示 すものである。副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの拮抗剤は開発されてき ており、このような拮抗剤は細胞内カルシウムの上昇に起因する疾患に罹患した 患者の治療方法として用いられることも併せて述べる。

図面の簡単な説明 図１はラット尾動脈において、ＮＥ（ノルエピネフリン）によって誘発された血 管収縮に与える部分精製ＰＨＦの作用を示している。

部分精製ＰＨＦはＮＥの作用を増強させる。

図２はラット尾動脈において、ＮＥによって誘発された血管収縮に与えるＬＰＩ （リゾホスファチジルイノシトール）の作用を示している。ＬＰＩはＰＨＦと同 様にＮＥの作用を増強させる。

図３はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、塩化カリウム３０ｍ Ｍによって誘発される［Ｃａ”］　ｉの上昇に与える純粋なＰＨＦ　（ＳＨＲの 血［０，１ｍｌ相当量／ｍｌ培養液）の作用を示している。コントロール群にお けるカルシウム濃度の上昇は１２１．８３±３１．　１８　（ｎＭ）である。下 図は個体数８の実験を示し、ｐ＜Ｑ、０５でコントロール群との有意な差がある 。下図は１つの代表的な実験チャート原本の複写である。（ａ）は塩化カリウム ３０ｍＭ単独、（ｂ）は純粋なＰＨＦを含む場合、（Ｃ）は洗浄後の作用を示す 。塩化カリウムを加える前に細胞を純粋なＰＩＦと４５分間インキニーベートし た。これらの３実験は連続して同し細胞群で行った。

図４は血管平滑筋細胞において、ＬＰＧが塩化カリウムによって誘発される細胞 内の上昇を有意に促進させることを示している。

図５はＳＨＲの副甲状腺培養液がＰＤＥ活性を刺激することを示している。

図６はＷＫＹの副甲状腺培養液がＰＤＥ活性を刺激しないことを示している。

図７はＬＰＳがＰＤＥ活性を刺激することを示している。

図８は正常血圧ラットの血圧に与えるＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントの作用 のピークを示している。この結果は標準的なバイオアッセイ法においてみられる ような典型的な持続型血圧上昇のピークである。

図９はＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントがホスホリパーゼＤによって不活性化 される典型的なＰＨＦ様の血圧上昇を現すことを示している。

図１０は正常血圧ラットにおいて、ＬＰＳが遅発・持続型の血圧上昇を引き起こ すことを示している。

図１１は正常血圧ラットにおいて、ＬＰＩが遅発・持続型の血圧上昇を引き起こ すことを示している。

図１２はＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントがＮＥによって誘発されたラット尾 動脈切片の張力増加を促進することを示している。

図１３はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、塩化カリウム１５ ｍＭによって誘発される［Ｃａ”］　ｉの上昇に与えるＦＭＯＣ−ＰＨＦ　（０ ，Ｏｌμｇ／ｍｌ培養液）の作用を示している。上図は個体数５の実験を示し、 コントロール群に対する［Ｃａ！＊コ　ｉの上昇は２２．５２±４．８２　（ｎ Ｍ）、（＊）　ｐ＜０゜０５でコントロール群との有意な差がある。下図は１つ の代表的な実験チャート原本の複写である。（ａ）は塩化カリウム単独、（ｂ） はＦＭＯＣ−ＰＨＦを含む場合、（Ｃ）は洗浄後の作用を示す。

塩化カリウムを加える前に細胞をＦＭＯＣ−ＰＨＦと４５分間インキュベートし た。これらの３実験は連続して同じ細胞群で行った。

図１４はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、Ｌ盟カルシウムチ ャネルの活性化に与える純粋なＰＨＦ　（ＳＨＨの血漿０．１ｍｌ相当量／ｍｌ 培養液）の時間依存的作用を示している。

左図は３実験のパルス記録の原本である。右図はコントロールの電流（１）と電 圧（Ｖ）との関係（・）及び純粋なＰＩＦ　（ＳＨＲの血漿０．１ｍｌ相当量／ ｍｌ培養液）を加えた３５分後（■）と５０分後（マ）の関係を示す。保持電位 は一４０ｍＶであった。

図１５はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、純粋なＰＨＦ　（ ＳＨＲの血漿０．１ｍｌ相当量／ｍｌ培養液）によって活性化されたＬ型カルシ ウムチャンネルに与えるＩＢＭＸ（５Ｘ１０−’Ｍ）とニフェジピン（１０−＠ ）の作用を示している。純粋なＰＨＦ、ＩＢＭＸ、ニフェジピンを図に示した時 間に加えた後、１０５分間、時間依存的ピーク電流の変化を記録した。

図１６はカルシウムチャンネルの電流に与えるＦＭＯＣ−ＰＩＦの作用を示し、 ＦＭＯＣ−ＰＨＦは電流を増加させることを示す（下方向）。

図１７はカルシウムチャンネルの電流に与えるＰＨＦの作用を示し、これはＩ　 ＢＭＸによってもとに戻ることを示す。

発明の詳細な説明 本発明者らは、副甲状腺由来高血圧因子と同様の特性をもつ副甲状腺由来高血圧 因子活性コンポーネントの同定を行った。このコンポーネントは、グリセロリン 脂質に結合したポリペプチドからなり、正常血圧ラットに投与すると、血管平滑 筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連する遅発性の血圧上昇特 性を有する。

それは例えばコンポーネントをラットに投与した時、投与後約２０分〜３０分で 血圧上昇が見られ、約１時間でピークを示すということである。それと同じ時間 に血管平滑筋細胞による細胞外カルシウムの取込増加も見られ、約１時間でピー クを示す。

このコンポーネントのポリペプチドは好ましくは５〜２０、更に好ましくは５〜 １０のアミノ酸残基を含有している。このコンポーネントのポリペプチドを構成 するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）。

アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスノ（ラギン酸（Ａｓｐ） 、システィン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇ　１　ｎ）　、グルタミン酸（Ｇ　Ｉ 　ｕ）　、　グリシン（Ｇ　Ｉ　ｙ）　、ヒスチジン（Ｈｉｓ）。

イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）。

メチオニン（Ｍｅｔ）、　フェニルアラン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セ リン（Ｓｅｔ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、）リプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン （Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）よりなる塩基性アミノ酸のグループから選ぶこと ができる。上記コンポーネントは、副甲状腺由来高血圧因子と実質的に同様の特 性、例えば、正常血圧ラットに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウム の取込み増加と時間的に関連する遅発性の血圧上昇特性を保持している。コンポ ーネント中の塩基性アミノ酸を非塩基性アミノ酸に置き換えてもよい。このよう な非塩基性アミノ酸には、例えばオルニチン、サルコシン、ノルロイシン、Ｎ− メチル−フェニルアラニン等が含まれる。好ましくは、ポリペプチドの構造はＴ ｙｒ−３ｅｒ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒＨｉ　ｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇである。〔配列識別 番号：ｌ〕コンポーネントが副甲状腺由来高血圧因子と本質的に同様の特性を保 持する限り、コンポーネントのグリセロリン脂質はどこの部位に結合していても よい。なおその特性としては、正常血圧ラットに投与したとき、血管平滑筋によ る細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連する遅発性の血圧上昇特性が含 まれる。好ましくはセリン残基の一つに結合しているのがよく、特に（上記配列 に示されたような）４位のセリン残基に結合しているのが好ましい。グリセロリ ン脂質としてはりゾホスファチジン酸またはホスファチジン酸か好ましい。

副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントは質量分析法によっておよそＩ、０００ 〜２，７００ダルトンの分子量を存する。好ましくは分子量はＩ、０００〜２． ０００ダルトンの範囲にあり、より好ましくは約１，３５０ダルトンである。し かしコンポーネントの分子量が２７００以上になるようにペプチドの両端に付加 的な非干渉性アミノ酸か付いていてもよい。

副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントは生理活性物質の分子に結合することか でき、生理活性物質を細胞内や組織内、器官内等の特異的な位置に輸送するため のターゲツティングエイジエンドとして役立つ。生理活性物質の例としては、ホ ルモン、腎臓用薬、利尿剤、神経伝達物質のような化合物が挙げられる。生理活 性物質は、例えば、血管平滑筋、腎臓、心筋細胞等の細胞を標的とする。生理活 性物質や分子をコンポーネントに結合させる方法はこの技術分野においてはよく 知られた方法である。

あるいは、副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントは生物学的サンプル中のコン ポーネントの同定に役立つ検出マーカーやラベルと結合することができる。この ようなマーカーやラベルの例としては、フルオレスセイン、ＨＲＰ、ビオチン等 が挙げられる。マーカーやラベルをコンポーネントに結合させる方法はこの技術 分野においてはよく知られた方法である。

本発明のもう一つの面として、副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントは正常血 圧ラットに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間 的に関連する遅発性の血圧上昇特性を有し、副甲状腺由来高血圧因子とは異なる 構造であって、その構造は以下のように同定される。

［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ１は先に特定されたＲ８と同じ であり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０乃 至２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者か ら単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎはＩ乃至５を表わす〕 副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント構造におけるＸとＹは好ましくは酸素で ある。

脂肪酸Ｒ８はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキ ン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸 、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ（エイコツペンタエン酸 ）及びネルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのが望ましい。より好ましくは オレイン酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

脂肪酸Ｒ３はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキ ン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸 、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネルボン酸からなる 脂肪酸群から選択するのか望ましい。より好ましくはオレイン酸、ステアリン酸 、最も好ましくはオレイン酸である。

Ｒ１を構成する脂肪酸基は好ましくは１−１０個である。より好ましくは１〜５ 個、更には１個の脂肪酸基であるのが最も好ましい。

Ｒ２を構成する脂肪酸基は好ましくは１−１０個である。より好ましくは１〜５ 個、更には１個の脂肪酸基であるのが最も好ましい。

最も好ましくは、高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラッ トに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込みと時間的に関連す る遅発性の血圧上昇特性を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントであり 、その構造は以下のように同定できるものである。

［配列識別番号二ｌ〕 〔式中、Ｒ冒よ水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ３は先に特定されたＲ１と同様 である。〕 脂肪酸Ｒ１はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキ ン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸 、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネルボン酸からなる 脂肪酸群から選択するのか望ましい。より好ましくはオレイン酸、ステアリン酸 、最も好ましくはオレイン酸である。脂肪酸Ｒ１はラウリン酸、ミリスチン酸、 パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミ トレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキド ン酸、ＥＰＡ及びネルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのが望ましい。より 好ましくはオレイン酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。Ｒ， 又はＲ２を形成する脂肪酸基は１〜１０個である。望ましくは１〜５個、更には １個の脂肪酸基であるのが最も好ましい。

本発明は、高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投 与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連する 遅発性の血圧上昇特性を存し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造であって、 以下の構造を存する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法に関する ものである。

［配列識別番号＝１］ 〔式中、Ｒ＋は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし；Ｒ８は先に特定されたＲ１と同じ であり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし、ＡＳＢのそれぞれは０乃至 ２０の付加アミ人酸を表わし；ｎはｌ乃至５を表わす。〕すなわち、本発明の製 造方法はＡ　＝　［Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｖａｔ−Ｓｅｒ　−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａ ｒｇ］　、　−Ｂ　（式中Ａ、Ｂ及びｎは前記の定義と同じ）の構造を有するポ リペプチドとリン脂質からなる混合物をホスホリパーゼＤと共にインキュベート する工程及び前記工程で形成された副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを回 収する工程からなる。

リン脂質はりゾホスファチジン酸またはホスファチジン酸であるので好ましい。

副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法において、ポリペプチドは化 学合成によって製造するのが好ましい。ポリペプチドは、当該技術分野において 良く知られた従来のペプチド合成装置によって合成し得る。このようなペプチド 合成装置の代表的な例えは、アプライド　バイオシステムズ社製ペプチド合成装 置４３０Ａ型である。自動ペプチド合成装置を用いたペプチドを合成する方法は 、当該技術分野においてはよく知られている。

コンポーネントの回収は、当該技術分野において良く知られた標準的な精製及び 分離技術を用いて行われる。このような技術の代表的な例にはイオン交換クロマ トグラフィー及び／又は逆相高速液体クロマトグラフィー及びＴＬＣが含まれる 。

本発明はまた、副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの化学合成方法について も言及している。高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラッ トに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関 連する遅発性の血圧上昇特性を有し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造であ って下記構造を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法の例を 以下に示す。

［配列識別番号＝１］ 〔式中、Ｒ４は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数ｌ乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ７は先に特定されたＲ３と同じ であり：Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし、Ａ、Ｂのそれぞれは０乃至 ２０の付加アミノ酸を表わし；ｎは！乃至５を表わす〕コノ製造方法は、（ａ） 　Ａ−Ｔｙ　ｒ−３ｅ　ｒ　−Ｖａ　１−ＯＨ（式中Ａは前記の定義と同じ）構 造を存するポリペプチドを化学合成して積製し、（ｂ）該ポリペプチドのエステ ルを調製し、（Ｃ）該エステルにＬ−α−リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ） を加えて（式中Ａは前記定義と同じであり、ＬＰはＬ−α−リゾホスファチジル 基を表す）の構造を存する生成物を製造して精製し、（ｄ）工程（Ｃ）の該生成 物を酸性化し、該酸性化生成物を抽出して蒸発により回収することによって の構造を有する生成物を得て、（ｅ）工程（ｄ）の生成物のエステルを調製し、 （ｆ）ＮＨｓ　−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｂ−ＯＨの構造を存するポリペプチ ドを化学合成して精製し、（ｇ）ＮＨｓ　−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｂ−０− の構造を有する工程（ｆ）のポリペプチドのエステルを調製し、（ｈ）工程（ｅ ）のエステルと工程（ｇ）のエステルを結合させて副甲状腺由来高血圧因子コン ポーネントを製造する。

好ましくは、工程（ｂ）のポリペプチドのエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミ ドエステルで、これは該ポリペプチドをジシクロへキシルカルボジイミドとジオ キサンの混合物に加えることにより調製できる。更に、工程（Ｃ）においてエス テルに加えるＬＰＳを最初に炭酸水素塩緩衝液に溶解し、溶液をｐＨ７に調製す るのが好ましい。工程（ｄ）における酸性化は、好ましくはクエン酸ナトリウム の添加によってｐＨ２，８にて行う。又、工程（ｅ）のエステルはＮ−ヒドロキ シ琥珀酸イミドエステルであるのが望ましく、工程（ｄ）の生成物にジシクロへ キシルカルボジイミド、ジオキサン及びテトラヒドロフランの混合物を添加する ことにより調製される。

工程（ｈ）において、工程（ｇ）のエステルは、工程（ｅ）のエステルと混合さ れる前に最初に炭酸水素塩緩衝液に溶解しｐＨ７に調製しておくのが好ましい。

化学合成は当該技術分野において良く知られた従来のペプチド合成装置により行 われる。例えば、この合成はアプライド　バイオシステムズ社製のペプチド合成 装置４３０Ａ型を用いて行うことができる。ペプチドの製造方法は当該技術分野 においては良く知られている。

酵素的又は化学的に合成された副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを用いて 、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体をそのコンポーネントに対して産 生させ、ＰＨＦの様々なアッセイに使用することができる。ポリクローナル抗体 及びモノクローナル抗体の製造方法は、当該技術分野においては良く知られてい る。

例えば、雄性Ｂａ１ｂ／ＣｖウスはＶｉａｍｏｎｔｅｓらの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、９４．１３−１７　（１９８６）〕により、コンポーネント を結合したアミノフェノールチオールエーテルのディスクを移植することによっ て免役できる。マウスはフロイントの不完全アジュバントと抗原で２週問おきに 免疫を増強し、抗原として本発明の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを用 いてＥＬＩＳＡ（エンザイムリンクドイムノフルベントアツセイ）により抗体力 価を測定した。測定可能な量のポリクローナル抗体は、通常１ケ月以内に観察さ れ、その後抗体力価は増加した。

ＭＣＡ　（モノクローナル抗体）はポリクローナル抗体産生マウスの牌臓から調 製できる。

必要なハイプリドーマとＭＣＡはＬａｎｇｏｎｅとＶａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓの方 法（”Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、毘、１−９４７　（１９ ８６））又は当該技術分野の熟練した技術者において周知の変法を用いることに より得られる。

ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を用いた検出法は、特に限定され ず、ラジオイムノアッセイ、アンザイムイムノアツセイ、エンザイムリンクドイ ムノソルベントアツセイ及び免疫沈降反応に基づくアッセイ系を含む。好ましく は、副甲状腺由来高血圧因子又はその一部（活性成分を含む）の検出方法は、動 物の体内に本発明の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを含む溶液を注入す ることにより動物（＠乳類又は鳥類）においてポリクローナル抗体を産生させる 工程；副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対して産生させたポリクローナ ル抗体を含む血清を採取する工程；ポリクローナル抗体を用いたイムノアッセイ 法によって副甲状腺由来高血圧因子又はその抗原部位を含むサンプルをスクリー ニングする工程：そしてサンプル試料中のＰＨＦ又はその抗原部位の存在を検出 する工程からなる。

副甲状腺由来高血圧因子又はその一部を検出するためのイムノアッセイ法として は、エンザイムイムノアッセイ、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ 、免疫沈降法が好ましい。

サンプルは生物学的サンプルがよい。その例としては、血清、血漿、尿、組織、 細胞等が含まれる。

前記の方法においては、コンポーネントは次に示す構造を有することが好ましい 。

［配列識別番号＝ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ１は先に特定されたＲ１と同し てあり；ｘ、ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし、Ａ、ＢのそれぞれはＯ乃至 ２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧性個体か ら単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎはｌ乃至５を表わす〕 そしてさらに好ましくは： ［配列識別番号＝１］ 〔式中、Ｒ，は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし；Ｒ３は先に特定されたＲ３と同様 である。〕 Ｒ，とＲ２の　脂肪酸としてはラウリン酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、ステ アリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイ ン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネ ルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのが望ましい。より好ましくはオレイン 酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

さらにもう一つの好ましく具体例として、患者における副甲状腺由来高血圧因子 又はその一部の同定方法は、動物（哺乳類又は鳥類）に本発明の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネントを注入することにより該コンポーネントの抗体を産生さ せる工程；免疫した動物より抗体産生８９２８球を分離する工程；抗体産生８９ ２８球と骨髄腫細胞を融合して、ハイブリドーマを形成する工程：副甲状腺由来 高血圧因子コンポーネント抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、クローニン グする工程：抗体産生ハイブリドーマを増殖させる工程：ハイブリドーマからモ ノクローナル抗体を分離する工程；そしてそのモノクローナル抗体を用いて、イ ムノアッセイ法により副甲状腺由来高血圧因子又はその一部を含むサンプルをス クリーニングする工程からなる。

更には、イムノアッセイ法として、エンザイムイムノアッセイ、エンザイムリン クドイムノソルベントアッセイ又は免疫沈降法があげられる。

サンプルは生物学的サンプルが好ましい。例えばそのサンプルとして、血清、血 漿、尿、組織、細胞等が含まれる。患者は哺乳動物又は鳥であり、好ましくは人 間である。前記の方法においてコンポーネントは次に示す構造を有することが好 ましい。

［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少な（とも一つの脂肪酸基を表わし：Ｒ１は先に特定されたＲ５と同じ であり；ｘ、ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０乃 至２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者か ら単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）：ｎはｌ乃至５を表わす〕 そしてさらに好ましくは： ［配列識別番号＝１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ８は先に特定されたＲ１と同 様である。〕 Ｒ１とＲ７の　脂肪酸としてはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステ アリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイ ン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネ ルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのが好ましい。より好ましくはオレイン 酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

このようなアッセイ系の特に望ましい具体例としては、精巧な分析機器を持って いない医師の診療室又は診療所で使えるような診断キットの形態があげられる。

このような方法は体液中のホルモンや池の免疫反応物質の検出に使われてきた。

一つの例は、妊娠初期の検出用の市販キットである。それゆえＰＨＦ又はその分 画はこのような方法を利用することにより、定性的あるいは定量的な検出が可能 である。

それゆえ本発明は動物における副甲状腺由来高血圧因子又はその免疫学的活性部 位の検出キットも提供する。その検出キットは、単−容器中で固相と結合した副 甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対する抗体；抗開甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント抗体に対する酵素標識二次抗体；該二次抗体の標識酵素に対する 基質：及び副甲状腺由来高血圧因子、そのコンポーネントまはたその一部の標準 溶液からなる。

動物における副甲状腺由来高血圧因子又はその一部の更なる検出キットを提供す る。その検出キットは、単一容器中で副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに 対する抗体；該抗体が結合する固相；及び副甲状腺由来高血圧因子又はそのコン ポーネントの標準溶液からなる。

上記の両キットにおいて、好ましいコンポーネントは次の構造である： ［配列識別番号：ｌ］ Ｃ式中、Ｒ８は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一つの脂肪酸基を表わし：Ｒ１は先に特定されたＲ１と同じ であり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし、Ａ、Ｂのそれぞれは０乃至 ２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者から 単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）：ｎはｌ乃至５を表わそして さらに好ましくは： ［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ１は先に特定されたＲ１と同 様である。〕 Ｒ１とＲｔの脂肪酸としてはラウリン酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、ステア リン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン 酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネル ボン酸からなる脂肪酸群から選ばれるのが好ましい。より好ましくはオレイン酸 、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

本発明は副甲状腺由来高血圧因子拮抗剤に関するものである。いかなる理論にも 制限されないが、副甲状腺由来高血圧因子は活性値部位（リン脂質部分）と認識 又は結合部位（ペプチド部分）の２つの部分からなると考えられる。さらに、リ ン脂質はペプチドの結合する受容体部位まで細胞膜を通ってペプチドを輸送する 役割を担っている。４位のセリンの結合部位におけるリン脂質の結合位置を変え ることにより、副甲状腺由来高血圧因子拮抗剤は製造できる。拮抗剤は副甲状腺 由来高血圧因子サイトに結合するがＰＨＦ活性を発現することはなく、それゆえ 本物の副甲状腺由来高血圧因子の作用を妨げることができる。

本発明の拮抗剤は次の構造であることが好ましい。

［配列識別番号：３］ （式中、Ｘａａはセリン以外のアミノ酸、ＰＬはリン脂質である。） リン脂質として好ましくは、リゾホスファチジン酸又はホスファチジン酸である 。更に好ましくは、Ｘａａはリジン、チロシン又はロイノンからなるアミノ酸群 から選ばれる。

上記構造式に基づくように、他の拮抗剤としては標的組織の受容体や結合部位に 結合し、生物学的活性を引き出す類似物を含んでいる。リン脂質が生物学的作用 の活性価に関与するという仮説によれば、ペプチドと結合する位置が重要である と考えられる。４位のセリンへの結合が生物化成にとって必要であり、２位のセ リンへの結合か拮抗作用にとって必要であることを我々の実施例が示しているが 、そのためには２〜２０のアミノ酸のペプチドを別の位置に結合して拮抗剤を形 成することは可能である。ペプチドとリン脂質が生物活性を示すためには、ある ３次元の構造を保持しなければならないので、ペプチド配列の修飾は（受容体等 の）結合位置に影響しないでリン脂質の位置を空間的に移動させて３次元的な変 更をとり入れることができ、それによって類似物が拮抗剤になることができる。

さらに、もしリン脂質が分子の活性化部位と同様に重要ならば、その組成は生物 学的作用を生ずる能力に影響を与えているかもしれない。脂肪酸の組成を変えた り、グリセロール骨格の第２炭素に脂肪酸を付加することにより拮抗剤を製造で きる。要約すると、これらのアプローチに限定するわけではないが、副甲状腺由 来高血圧因子拮抗剤は（１）ブペチト上の様々な位置にリン脂質を結合させるこ と、（２）ペプチド配列を変換させること、（３）リン脂質組成を変えること、 （４）高血圧作用を導く生物学的反応経路を活性化せずに結合する分子をもたら す他の方法により設計し得る。

本発明の拮抗剤は、高血圧や細胞内カルシウムの上昇が関与する他の病気（例え ばインシュリン非依存性糖尿病、動脈硬化症、欝血性心不全、乳癌、結腸癌、腎 臓癌、白血病を含む癌、炎症性大腸疾患、喘思）の治療に利用できる。

本発明の拮抗剤は、必要に応じて温血哺乳動物、特に人間に、非経口、外用、経 口、経直腸そして吸入によって投与することができる。拮抗剤は１用量単位当り 約１〜２００ｍｇを従来の基剤（溶剤）、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定化剤、 着色剤或いは薬学的に許容される薬物等と共に調合した一般的な非経口、経口剤 の投与形態をとり得る。

注射で投与する方法としては静脈内、筋肉内、皮下にＩ−ｌ−１Ｏを１日１〜４ 回投与する。注射剤は、フェノールの様な防腐剤又はエチレンジアミンテトラ酢 酸（ＥＤＴＡ）の様な溶解剤を適宜用いて無菌等偏性水溶液又は懸濁液中に本発 明の拮抗剤を含む。許容される基剤や溶媒の中で水、リンゲル液、等強性塩化ナ トリウム溶液を用いることができる。更に無菌不揮発油は一般的に溶媒又は懸濁 剤として使われる。合成モノグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸（例えばオレイ ン酸）は注射剤の不揮発油として使われる。

直腸投与用として、本発明の拮抗剤はカカオ脂やポリエチレングリコールの様な 適当な無刺激の賦形剤と混合することによって坐剤を調製できる。

外用製剤として、本発明の拮抗剤は軟膏、ゼリー、溶液、懸濁液又はハップ剤と して調製できる。

パウダーエアゾールでは、マサチューセッツ州ベッドフォードのＦＩＳＯＮＳ社 製のスピンハラ−ターボ（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ　ｔｕｒｂｏ）吸入器を使うこと により本発明の拮抗剤は１カプセル当たり約０．１〜５０ｍｇの割合で、標準的 な人に１日に１〜８カプセル投与することができる。液体エアゾールでは、本発 明の化合物は「−噴霧」すなわち噴霧剤の標準的放出両当たり約１００〜１００ ０μｇの量を投与することができる。液体エアゾールは疾患の重症度、患者の体 重そしてエアゾールの粒子径の配分に応じて投与量を１日に１〜８「噴霧」の割 合で投与できる。フッ化炭化水素やイソブタンは液体エアゾールの噴霧剤として 使われる。

１日の投与量は体重のＩｋｇあたり約０．０１〜２００ｍｇの範囲で、特定化合 物の活性、治療すべき患者の年令、体重、性別、状態、病気の種類や病状、投与 頻度や方法に依存する。良（知られているように、単回投与のために担体と混合 させる活性成分の量は、治療する患者と、特殊な投与方法に依存して変化する。

本態性高血圧の識別に加え、活性ＰＨＦコンポーネントの存在とＰＨＦのアッセ イは主な症状として高血圧を合併するか、又は必ずしも合併しない他の疾患の研 究や治療に応用可能である。例えば、インシュリン非依存性糖尿病患者はしばし ば高血圧であり、逆に高血圧患者はしばしば耐ブドウ糖能の異常が見受けられる 。いずれの症状においても、細胞内遊離カルシウムの増加が観られた。ＰＨＦは 、肥満症で高血圧症であり、かつインシュリン非依存性の糖尿病を有するＯ　ｂ ｌｏ　ｂマウスの血漿中で検出されている。これらマウス由来のＰＨＦは、ＳＨ Ｒラット由来のＰＨＦと同じ画分中に血清より単離されている。ＰＨＦの検出は ＮＩＤＤＭ（インシュリン非依存性糖尿病）の診断に有用であり、かつＮＩＤＤ ＭにおけるＰＨＦの役割に対する新たな研究領域を開くものであＳｏある種の癌 は、細胞内遊離カルシウムの増加を特徴としている［０ｋａｚａｋｉ他、Ｃａｎ ｃ、Ｒｅｓ、、４６　（１２Ｐｔ１）、６０５９−６０６３　（１９８６）；Ｌ ｉｐｔｏｎとＭｏｒｒ（＋９８６）；及びＭｅｙｅｒ、Ｊ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ 、５　（ｓｕｐｐｌ　４）、Ｓ３−Ｓ４　（１９８７）］、又、副甲状腺の活性 化かある種の癌形成と関連している［Ｐａ１ｍｅｒ他、Ａｍ、Ｊ。

（３）、４２９−４３２　（＋９８７）］。ＰＨＦ又はその分画は副甲状腺に由 来しており、又予備検討の結果ではＰＨＦが細胞内カルシウムを増加させること を示しているので、ＰＨＦ又はその分画はこれら（の癌）及び他の種類の癌に関 係しているかもしれない。ＰＨＦのスクリーニングは、検出法や治療法の開発に 価値があると同時に、これら癌の原因を理解する上で価値がある。

以下の実施例は、本発明を明らかにするものであるが、それに限定されるもので はない。本発明から逸脱しない範囲での種々の変更・修正は当事者にとって自明 なことである。

ＳＨＲ系雄性ラットを断頭層殺し、瀉血して、集めた血液をヘパリン処理（１０ ０１Ｕ／ｍ１）Ｌ、４°Ｃで１０分間３ＫＸｇで遠心分離した。ＳＨＲラットか ら得られた血漿を一晩蒸留水にて透析（１，０００ｍｗｃ　Ｏ）Ｌ／、Ａｍ１ｃ ｏｎ　ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｃｅｌｌ　（５，０００ｍｗｃｏ） を用いて限外濾過した。

その後２０倍量のクロロホルム：メタノール（２：ｌ　ｖ／ｖ）で血漿をホモジ ナイズし、４℃で一晩放置した。有機相を集め、５倍量の０．１Ｍ塩化ナトリウ ム（水溶液）で洗浄した。さらに抽出物をロータリーエバポレーションにより４ ０〜５０℃で濃縮し、凍結乾燥した。ＢＣＡアッセイを実施してサンプルの蛋白 質含量を確認した。

ＳＤクラットベントパルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ。

ｉ、ｐ、　）で麻酔し、カテーテルを血漿と薬剤の注入用として頚静脈に、また 血圧測定用として頚動脈に挿入した。

ＳＨＲ血漿のクロロホルム／メタノール抽出物を生理食塩水に再溶解し、単回投 与して注入した。

血圧はＰＨＦの場合と同様にゆっくりと上昇した。１６，４±３゜５ｍｍＨＨの 血圧最大上昇が４５分から５０分後に生じた（ｎ＝５）。この実験はＰＨＦかク ロロホルム：メタノールにより抽出されることを示すものである。

甲状腺組織を伴う副甲状腺をＳＨＲラットから摘出し、ハンクス培養液（Ｇ　ｉ 　ｂ　ｃ　ｏ社製）を用いて毎日培養液を交換しながら７日間培養した。ＰＨＦ の産生は培養液からカルシウムを減らすことによって刺激できる。培養液を血漿 サンプルの処理と同様の方法で透析、限外濾過を行った後凍結乾燥した。

前記実施例のごとく透析、限外濾過、凍結乾燥した副甲状腺培養液を最初に２０ 倍量のエーテルで抽出し、次に１０倍量のクロロホルム／メタノール（４：　１ ）で抽出した。２種類の抽出物と残った水相を凍結乾燥し、実施例１に記載した ごとく血圧のバイオアッセイのために生理食塩水に再溶解した。結果を次に示す 。

サンプル　ＰＨＦ　（血圧上昇分ｍｍＨｇ）エーテル抽出物　２．４ クロロホルム：メタノール抽出物９．８＊水相　４．６ （＊ＰＨＦ活性を示す） 実施例３ Ｓｃｈｗａｒｚ、ＢｕｍｐｕｓとＰａｇｅ　１．Ｈ，の文献（Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｖｏｌ　７９．ｐ、５６９７　（１９５７〕の方法に 従って実施した。ＳＨＲラットから得られた血漿サンプル（元の血漿２０ｍ１に 相当）を前記実施例に従って透析、限外濾過、凍結乾燥し、Ｏ，１５Ｎ水酸化ナ トリウム１０ｍ１に溶解した。その後サンプルを室温で３時間インキュベートし 、さらに０゜１５Ｎ塩酸で中和した。インキュベージジンにおいて血漿サンプル を含まない以外は同じ方法でコントロールを調製した。実施例１で記載したごと くバイオアッセイを行った結果を次に示す。

コントロール　：ＢＰ（血圧）　＝−０，７５±２．２ａｎＨｇ　（ｎ！４）サ ンプルを含む血Ｈ：　ＢＰ　−０，５±５．７＋ｕｓｌ（ｇ　（ｎ−６）（ＰＨ Ｆなし） この実験はＰＨＦ活性がアルカリ加水分解によって抑制されることを証明してい る。このことはその分子内に生物活性に重要なエステル結合か存在することを示 している。

Ｂ、酸加水分解 ＳＨＲラットから得られた血漿サンプル（元の血漿２０ｍ１に相当）を実施例１ に従って透析、限外濾過、凍結乾燥した。サンプルを０．ＩＮ塩酸１０ｍ１に溶 解し、その後室温で３時間インキュベートした。さらにそのサンプルをＯ，ＩＮ 水酸化ナトリウムで中和した。インキュベーションにおいて血漿サンプルを含ま ない以外は同様の方法でコントロールを調製した。

実施例１で記載したごとくバイオアッセイを行った結果を次に示す。

コントロール　：　ＢＰ＝−４，２±１．５ａｍＨｇ　（ｎ＝６）サンプルを含 む血漿：　ＢＰ−＋２０．５±３．３ｍｍＨｇ　（ｎｌＩ４）＊ＰＨＦ この実験はＰＨＦ活性が弱酸加水分解に対して不安定でないことを証明している 。

Ｃ１二硫化物還元とアルキル化 Ｗａｘｄａｈｌ等の文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ。

７（１９５９））に記載された方法に従って実施した。５Ｍグアニジン塩酸塩、 ０．５Ｍトリス、２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ８，１の緩衝液を調製した。

ＳＨＲラットから得られた血漿サンプルを実施例１に従って透析、限外濾過、凍 結乾燥し、緩衝液１ｍｌに溶解した。試験管に窒素を充填し、５０℃で３０分間 インキュベートした。ＤＴＴ（４４，２ｍｇ）を加え、再びその試験管に窒素を 充填した。生成した溶液を５０°Ｃで４時間インキュベートし、ヨード酢酸臼１ ｍｇを加えた。

１Ｍ水酸化カリウムを適当に加えて溶液のｐＨを８．　１に調製し、室温で２０ 分間インキュベートした。モル比はＤＴＴ／血漿フラクション＝３００／１及び ＤＴＴ／ヨード酢酸＝Ｉ／２であった。

その後サンプルを氷冷水にて透析し、ｐＨを塩酸で７．　０１：１ｌｌｌ整し、 元の血漿の量まで稀釈した。血漿サンプルを含まない以外は同様の方法でコント ロールを調製した。

実施例１で記載したごとくバイオアッセイを行った結果を次に示す。

コントロール　：　ＢＰ＝＋３．５±２．５ｍｍＨｇ　（ｎ＝１４）サンプルを 含む血漿：　ＢＰ＝＋１８．０±５．５ｍｍＨｇ　（ｎ＝６）＊ＰＨＦ この実験はＰＨＦ活性が還元やアルキル化によって不活化されないことを示し、 そのことは生物活性に重要な構造中にジスルフィド結合かないことを示唆してい る。反応がサンプルの活性を増加させるのではなく、反応が分解に対して分子を 安定化することが示唆される。

Ｄ０分解アッセイ−ホスホリパーゼＣ １ｍＭ塩化亜鉛、５０ｍＭグリシンを含む緩衝液（ｐＨ８，０）を調製する。Ｓ ＨＲラットから得られた血漿サンプルを実施例１に従って透析、限外濾過、凍結 乾燥し、緩衝液に溶解した（６ｍｇ／ｍ１）ｏＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ 由来の酵素ホスホリパーゼＣ（ベーリンガーマンハイム社製）を緩衝液に溶解し く４．　０００ユニット／ｍｌ）、サンプル１ｍｌに酵素０．１ｍｌを加えて３ ７°Ｃで４時間インキュベートする。その後そのサンプルを９６℃で５分間加熱 する。

コントロールを次のように調製した。

コントロールＩ：　ｐｉ、ｃと緩衝液 コントロール２：　緩衝液 コントロール３．　血漿サンプルと緩衝液実施例１と同様にバイオアッセイを行 い、その結果を次に示す。

トータル反応　コントロール３　コントロールｌ　コントロール２−２．　８ｍ ｍＨｇ　９．　８ｍｍ）Ｉｇ　−２，０ｍｍＨｇ　−５，０＋ｕ＋Ｈｇ結果の９ ．８ｍｍＨｇは副甲状腺由来高血圧因子活性が陽性であることを示す。ＰＨＦ活 性はホスホリパーゼＣ（ＰＬＯ）により不活性化された。

Ｅ３分解アッセイ−ホスホリパーゼＡ。

２０ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリスを含む緩 衝液（ｐ　Ｈ７，４）を調製する。ＳＨＲラットから得られた血漿サンプルを実 施例１に従って透析、限外濾過、凍結乾燥し、緩衝液に溶解した（６ｍｇ／ｍ＋ ）、Ｎａｊａ　ｍＯｃａｍｂｉｑｕｅ　ｍｏｃａｍｂｉｑｕｅ由来の酵素ホスホ リパーゼＡ。

（シグマ化学社製）を緩衝液に溶解しく１．５００ユニット／ｍｌ）、サンプル １ｍｌに酵素０．１ｍｌを加えて３７℃で２時間インキュベートする。その後サ ンプルを９６℃で５分間加熱する。

コントロールを次のように調製した。

コントロール１：　血漿サンプルと緩衝液コントａ−ル２：　酵素と緩衝液 実施例１と同様にバイオアッセイを行い、その結果を次に示す。

トータル反応　コントロールｌ　コントロール２１４、　０ｍｍＨｇ　８．　８ ｍｍＨｇ　３．　３ｍｍＨｇ結果の８．８ｍｍＨｇは副甲状腺由来高血圧因子活 性が陽性であることを示す。ＰＨＦ活性はホスホリパーゼＡにより不活性化され なかった。

Ｆ１分解アッセイ−ホスホリパーゼＤ Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ ｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ監修）第３版Ｖｏ１．２　ｐ、２８８−２ ９１　（１９８３））に従って実施する。

酵素ホスホリパーゼＤはキャベツから得られ、それはベーリンガーマンハイム社 により市販品として入手できる。

５０ｍＭ）’ＪＣ／塩酸と０．　２％トリトンＸ−１００を含むｐＨ７，８の緩 衝液を調製する。ＳＩＲラットから得られた血漿サンプルを実施例１に従って透 析、限外濾過、凍結乾燥し、緩衝液２ｍｌに溶解した。１ｍｇ／ｍｌの割合でホ スホリパーゼＤをその溶液に加えて３７℃で２０分間インキュベートする。コン トロールは次のように調製した。

コントロール１：　ホスホリパーゼＤと緩衝液コントロール２：　緩衝液 コントロール３：　血漿サンプルと緩衝液実施例１と同様にバイオアッセイを行 い、その結果を次に示す。

結果の１１．５ｍｍＨｇは副甲状腺由来高血圧因子活性が陽性であることを示す 。ＰＨＦ活性はホスホリパーゼＤにより不活性化された。

Ｇ９分解アッセイ−トリプシン 文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ。

１８２、　ｐ、６０２−６１３　（１９９０）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｖｏ ｌ、２４０．１６１９　（１９６５））に記載された方法に従って実施する。

トリプシン（ウシ膵臓由来、ベーリンガーマンハイム社製、Ｍ。

ｎｔｒｅａｌ　ＰＱ）を最初ＴＰＣＫ　（Ｎ−）シル−フェニルアラニン　りロ ロメチル　ケトン）で処理し、その調整物中に混入しているかもしれないキモト リプシンを不活性化した。トリプシン（６０ｍｇ）を１ｍＭ塩化カルシウム２０ ｍ１に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＴＰＣＫ　（１ｍｇ）を エタノール０．　１ｍｌに溶解し、室温でトリプシン調製物に徐々に加えた。そ の溶液を５時間攪拌し、塩酸を加えてｐＨ３に調整した。その後その溶液を４° Ｃの水で２４時間透析した。さらに透析した溶液を凍結乾燥し、重量を測定した 。

ＳＨＲラットから得られた血漿サンプル（元の血漿２０ｍ１に相当）を実施例１ に従って透析、限外濾過、凍結乾燥し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで調整し た緩衝液（ｐＨ７，５）２ｍｌに溶解した。トリプシン−ＴＰＣＫ３６μｇを加 え、その溶液を３７°Ｃで１８時間インキュベートする。その後サンプルを９６ ℃で５分間加熱しｐＨを７．　０に調整した。

コントロールは前記の方法で次のように調整した。

コントロールｌ：　緩衝液のみ フントロール２：　緩衝液とトリプシン−ＴＰＣＫコントロール３：　緩衝液と 血漿サンプル実施例１で記載したごとくバイオアッセイを行った結果を次に示す 。

コントロールＩ　：　ＢＰ＝−８，４±５．３ａ＋ｍＨｇ　（ｎ＝５）コントロ ール２　：　ＢＰ＝＋６．１±２．９ｍｍＨｇ　（ｎ＝６）コントロール３　： 　ＢＰ＝＋９．０±５．３ｍｍ）Ｉｇ　（ｎ＝５）トータル反応　：ＢＰ＝　０ ±３．５ｍｍＨｇ　（ｎｌ１６）ＰＨＦ活性はトリプシンにより阻害されるが、 熱によって不活性化されることはないと推定された。このことはＰＨＦにペプチ ド様の構造が含まれることを示している。

びＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、２３７．　ｐ、１８５１−１８５５　（ １９６２））の方法に従って実施する。

０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ８，５）を調製する。ＳＨＲラ ットから得られた血漿サンプルを実施例１に従って透析、限外濾過、凍結乾燥し 、緩衝液２ｍｌに溶解した。カルボキシペプチダーゼＡ　（０，１ｍｇ）を加え る。（重量比二カルボキシペプチダーゼＡ／血漿＝１／７０）そのサンプルを３ ７℃で４時間インキュベートし、適量の酢酸を加えてｐＨを４に酸性化すること によって反応を停止させた。その後サンプルを９６℃で５分間加熱する。

コントロールはサンプルから酵素を取り除いて前記の方法で調製した。

実施例１で記載したごとくバイオアッセイを行った。その結果はトータル反応が −１，６ｍｍＨｈ、コントロールが１５．５ｍｍＨｇである。結果の１５．５ｍ ｍＨｇはＰＨＦ活性が陽性であることを示す。ＰＨＦ活性がカルボキシペプチダ ーゼＡにより阻害されると推定された。このことはＰＨＦにペプチド様の構造が 含まれることを示している。

■５分解アッセイーキモトリプシン 文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１８２ｐ、６１３−６ ２６　（１９９０））の方法に従って実施する。

５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、０．４Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシ ウムを含む緩衝液を調製する。ＳＨＲラットから得られた血漿サンプルを実施例 １に従って透析、限外濾過、凍結乾燥し、緩衝液２ｍｌに溶解した。キモトリプ シンＡ、を加える（重量比：キモトリプシン／血漿＝１１５０）。そのサンプル を０℃で１５分間インキニーベートし、９６°Ｃで５分間加熱する。

コントロールはサンプルから酵素を取り除いて前記の方法で調製した。

実施例１で記載したごとくバイオアッセイを行った結果を次に示す。

コントロール　：　ＢＰ＝＋Ｉ０．６±２．３ｍｍＨｇ　（ｎ＝６）トータル反 応　：　ＢＰ＝−２，０±１．２＋ａ＋＋＋Ｈｇ　（ｎ＝５）このアッセイはＰ ＨＦ活性がキモトリプシンによって不活化されること及び、ＰＨＦにペプチド様 の構造が含まれることを示している。

アミノ酸７つのペプチド４種（Ｙ−３−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｆ−Ｒ（７）構造を有する ＣＳ２１２９、Ｙ−Ｓ−Ｖ−に−Ｈ−Ｆ−Ｒ７）構造を有するＣ３２１３０．Ｙ −３−Ｖ−Ｙ−Ｈ−Ｆ−Ｒの構造を有するＣＳ２１３１％Ｙ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｈ− Ｆ−Ｒの構造を有するＣＳ２１３２＝アルバータ大学ペプチド研究所にて作製） ５ｍｇと表１の脂質（アバンチ　ポーラ−リビッズ製、０．５〜１．５ｍｇ）の 混合物にホスホリパーゼＤ（１ｍｇ）、５０ｍＭｈリス緩衝液中（ｐＨ７，８， 最終容量１ｍ１）でインキュベートした。同時に適当なコントロールもインキュ ベートした（コントロールのペプチドはＧ−Ｌ−Ｎ−Ｒ−に−Ｙ−Ｌ−Ｖの構造 を有する不特定なペプチドを用いた）。インキュベーションは３７℃で１時間行 った。サンプルを９５℃で５分間加熱することにより、反応を適当な時間で終了 させた。

そのサンプルは実施例１の方法に従ってバイオアッセイを行った。

血圧のバイオアッセイ結果を表１に示す。ＰＨＦ様（アゴニスト）作用のバイオ アッセイに於いて（表１）、オレイン酸又はバルミチン酸の結合したりゾホスフ ァチジン酸の生理活性が最も良（、ジオレイン酸の結合したホスファチジン酸も またある程度の活性があり、他の類似ペプチドには生理活性がなかった。

他で言及がない限り、薬品と溶媒は試薬用のものを使用した。ジイソプロピルエ チルアミン（ＤＩＥＡ）、ジクロロメタン、アニソール及びトリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）は使用する前に再蒸留した。

Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は使用する前に４Ａモレキユラーシ ーブを入れて保存した。上記溶媒は全てカナダのゼネラル　インターミディエイ ツ社から入手した。ＨＰＬＣ用の水、メタノール、アセトニトリルはＪ、Ｔ、ベ ーカー　ケミカル社にュージャージー州　フィリップスバーブ）より入手した。

ジシクロへキシルカルポジミド（ＤＣＣ）と１−ヒドロベンゾトリアゾール（Ｈ ＯＢＴ）はアプライド　バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスター市） より入手した。１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）とＮ−ヒドロキシ琥珀酸イ ミド（ＮＨＳ）はアルドリッチ　ケミカル社（ウィスコンシン州　ミルウォーキ ー）より購入し、無水酢酸はフィッシャー　サイエンティフィック社にュージャ ージー州　フェアローン）より入手した。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌバリン、Ｎ−α−Ｂｏ ｃ−Ｎ’−１）−）シルーＬ−アルギニンーＰＡＭ樹脂（１％ジヒニルベンゼン 、０．５ｍｍｏｌ／ｇｍ置換）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ） 及び９−フルオロニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）アミノ酸はバッケム 　ファイン　ケミカルズ社（カリフォルニア州　トランス）より購入した。Ｌ− α−リゾホスファチジルセリン（ｌ−ステアロイル−５ｎ−グリセロ−３−ホス ホ−０−セリン）ナトリウム塩はアバンチ　ポーラ−リピッズ社（アラバマ州　 アラバスタ−）より購入した。

ペプチド合成はアプライド　バイオシステムズ社製のペプチド合成値ｒＩｔ　４ ３０Ａ型により実施した。分析用ＨＰＬＣ装置は２５０ｍ１の自動試料採取器を 装備したヒユーレット　パラカード社製（ペンソニベニア州　エイボンゾール） の１０９０１０９Ｏ体クロマトグラフィーとＨＰ９０００シリーズ３００　コン ピューター、ＨＰ９１５３ディスクドライブ、ＨＰ２２２５Ａ　シンク　ジェッ トプリンター及びＨＰ７４４０Ａ　カラー　プロ　プロッターをつないだ蛍光検 出システムで構成されている。

租ペプチドの精製は２５．ＳＣ型ポンプヘッドをもつ３０３型計量ポンプが２つ 、８０３型圧力調節器、２３ｍ１の分取用容器をもつ８１１型攪拌器及びＨＭ型 可変波長検出器を装備したギルフン社製（ウィスコンシン州　ミドルトン）の分 取用ＨＰＬＣ装置により実施した。ペプチドはレオダイン社（カリフォルニア州 　コタチ）の７１２５堅サンプル注入器により注入した。ポンプの値はレイニン 　マツクラビット　コンピュータープログラム（レイニン　インスツルメント社 製、マサチューセッツ州　ウオバーン）を用いてアップル　マツキントラシュ　 ５１２に／８００型マイクロコンピューター（アップル　コンピュータ社製、カ リフォルニア州　カバーデン）により調節した。

粗ペプチドの最初の精製はシンクロバックＲＰ−４分取用逆相Ｃ４カラム（２５ ０ｘ２１．２ｍｍ　１．Ｄ、、孔径３００人　粒径５μｍ、ディオネックス　カ ナダ社製、オンタリオ州　ミシソーガ）により実施した。

ペプチドはここに記載したある一般的な固相ペプチド合成法を用いて合成した。

ＦＭＯＣ−Ｔｙｒを除く全てのアミノ基はα位をＢＯＣ基で保護し、次に示す側 鎖保護基、例えばベンジルエーテル（Ｓｅｒ）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｔｙｒ）、 ）ルエンスルホニル（Ａｒｇ、Ｈｉｓ）を用いた。全てのアミノ酸は最初ＤＭＦ 中で、その後ジクロロメタン中で先に合成した対称無水物（ＨＯＢＴ活性エステ ルとして結合したＦＭＯＣ−Ｔｙｒを除いて）のように二回結合させた。困難な 結合をニンヒドリンを用いてモニターし、結合能が９９％以下の場合はアミノ酸 を活性エステルとして手作業で３回結合させ、その後アセチル化を行った。

３３％ＴＦＡ／ジクロロメタン（Ｖ　／　Ｖ　）と８０秒間反応させ、次に５０ ％ＴＦＡ／ジクロロメタン（ｖ　／　ｖ　）と１８．５分間反応させてそれぞれ の反応でＢＯＣ基を取り除いた。２ｏ％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ　（ｖ／ｖ）で１分間 ２回洗浄して中和を行った。結合させた後、必要な時は未反応のアミノ基を２５ ％無水酢酸／ジクロロメタン（Ｖ／Ｖ）で１０分間アセチル化した。−４℃で１ 時間１０％アニソールと２％１．２−エタンジチオールを含むフッ化水素（１０ ｍｌ／ｇｍ脂）で処理することによりペプチドを樹脂支持体から分離した。

粗ペプチドは溶媒Ａが０．５％水性ＴＦＡで溶媒ｓ７！！＜ｏ、ｏｓ％ＴＦＡの 含まれたアセトニトリルであるＡＢ直線濃度勾配（１％Ｂ／ｍ１ｎ）を用い、流 速１０ｍ１／ｍｉｎでジンクローム分取用カラムにより最初に精製した。

全ての分析は０．２５ｍ１／ｍｉｎの流速を除いてはペプチドの精製と同一の条 件で実施した。

ＰＩ　：Ｆ＆１ＯＣ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨＰＩは上記の様に標準ＢＯ Ｃ化学法により調製した。ＰＩは逆相ＨＰＬＣにより精製した。

Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルはジオキサン飽和溶液中でＤＣＣを用いて 調製した。ＰＬＳ　Ｎａ塩をｐＨ７の炭酸水素塩緩衝液に溶解し、そのエステル に加えた。その後生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した。

上記構造の遊離酸化合物はクエン酸ナトリウムを加えてｐＨを２゜８に酸性化し 、酢酸エチルで抽出することにより調製した。

の化合物はロータリーエバポレーターで濃縮することにより得た。

Ｐ２：ＮＨｔ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−０−構造ＮＨ＊　−Ｈｉ　ｓ−Ｐｈｅ −Ａｒｇ−０−化合物は上記の様に標準ＢＯＣ化学法により調製した。生成物は 逆相ＨＰＬＣにより精製し、その後炭酸水素ナトリウムでｐＨ７に調整した。

Ｐ　１−　ＬＰＳ　−Ｐ２　：　ＰＭＯＣ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｓｅ 　ｒ−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−０−〔配列識別番号＝５〕 を有する生成物のＮＨＳエステルはジオキサン／ＴＨＦ混合飽和溶液中でＤＣＣ を用いて調製した。生成物ＮＨ，−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−０−をｐＨ７の炭 酸水素塩緩衝液に溶解し、そのエステルに加えた。

ソノ後Ｐ１−ＬＰＳとＰｌ−ＬＰＳ−Ｐ２（７）効果は実施例！で記載したごと く正常血圧ラットの血圧へのｉｎ　ｖｉｖｏ効果により確認した。図８にＰＩ− ＬＰＳ−Ｐ２　（Ｎｏ、ｌで示した）の結果を示す。この化合物は遅発性で持続 的な血圧上昇作用を呈し、ＰＩ−ＬＰＳは最少の血圧上昇を呈した。ＰＩ−ＬＰ Ｓ−Ｐ２のホスホリパーゼＤによる分解物は上記血漿ＰＨＦの分解物と同様に、 血圧上昇反応を不活性化した（図９）。

Ｎａ”　Ｋ”　ＡＴＰａｓｅ活性はＤｅｔｈ等の方法を用いて、ラット尾動脈へ のウワバイン感受性■Ｒｂの取り込みにより測定した。

３００〜４００ｇの雄性ＳＤラットをベンドパルビタール過剰投与により層殺し 、尾動脈を取り出し、切片に切開した。その切片を水冷クレブス液（組成：Ｎａ Ｃ１１１７ｍＭ；ＫＣＩ　５ｍＭ；ＮａＨｃＯｓ　２７ｍＭ；　ＮａＨ＊ＰＯａ 　１ｍＭ；Ｍｇ５Ｏａ１．２ｍＭ：ＣａＣ１章　１．２５ｍＭ；グルコース　１ １．ＯｍＭ）で洗浄し、酸素飽和（９５％Ｏｓ　、５℃％ＣＯ＊　）クレブス液 中３８℃で２時間インキュベートした。最後の３０分間はＫＣＩを含ますＮａＣ １１２２ｍＭを含むクレブス液を組織へのナトリウム負荷のために使用した。こ のインキュベートの後、切片をｌμＣｉのｌＲｂとクレブス液の入った管に移し 、Ｒｂ　Ｃ］　＊の最終濃度が５ｍＭになるようにした。３０％ＳＨＲ血漿（ル ビジウムの濃度は全て一定）と１ｍＭウアバインを加えた上記インキュベーショ ン、或いは、３０％血漿と１ｍＭウアバインを加えた培養液等様々な培養液を用 意した。切片をそれぞれの溶液中で１８分間インキュベージタンし、その後水冷 クレブス液で４回洗浄して、水分を取り、重態測定し、γ計数器で計測した。ｌ Ｒｂの取り込みにおける様々なインキュベージタンの効果を後の比較のためＳｔ ｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いてＡＮＯＶＡにより分析した 。全ての結果は平均値±ＳＤ（標準偏差）で表す。

Ｎａ／に−ＡＴＰａｓｅ活性を指標として、血管平滑筋への”Ｒｂの取り込みに 関するリゾリン脂質の効果を以下に示す。これらのリゾリン脂質もＰＨＦと同様 に遅発性で持続的な血圧上昇反応を示す（図１０と図１１）。

リゾホスファチジルセリン（３ｏａＭ）は４６％のｌＲｂ取り込み増加（ｐ＜− ０，０１）を示す。

リゾホスファチジルイノシトール（６００μＭ）は３１％のｌＲｂ取り込み増加 （ｐ＜０．０５）を示す。

Ｎａ／に−ＡＴＰａｓｅ活性におけるこの刺激は実際のＰＩＦの刺激と同様であ る。

この方法はＰａｎｇらが記載した方法（１９８０）と本質的に同様の方法である 。雄雌いずれかのＳＤラットをベンドパルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し 、尾動脈または大動脈を分離、取り出し、その後９５％０□　５％ＣＯ１で酸素 飽和にしたＫＨＳ緩衝液（１１５ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣｌ、２．１ｍＭ 　ＣａＣ１ｔ　、１．２ｍＭ　Ｍｇ５ｏａ　、１．２ｍＭ　ＮａＨｔ　ＰＯ４， ２５ｍＭ　ＮａＨＣＯｔ　、１１ｍＭグルコース）に入れた。血管をラセン状小 片に切り、約１．５ｃｍの切片をＫＨＳを含むＳａｗｙｅｒ−ＢａｒｔｌｅＳｔ Ｏｎｅ容器中で保存した。ラセン状切片の張力はグラスＦＴ、０３張力変位変換 器で測定し、グラス　モデル　７９Ｄポリグラフで記録した。分離した尾動脈ラ セン状切片は血管収縮剤を加える前に１時間平衡化した。その切片は０．７ｇの 静止張力をあらかじめ負荷しておき、３７℃でインキュベートした（Ｐａｎｇら 　１９８５）。全ての場合、切片の反応性は最初に６０ｍＭ塩化カリウムを加え て確認し、反応の高い組織だけを実験に使用した。２系統の実験を実施した。

張力の変化において２系統の連続したＮＥに対する用量反応性を１時間おきに比 較した。初期蓄積量のＮＥを加えた後、組織を洗浄し、標準ＫＨ３緩衝液中で２ ０分間インキュベートした。その後コントロール溶液や被験化合物（ＰＨＦやＬ Ｐ）を加え、更に４０分間インキュベートした。第２回目の蓄積量のＮＥを組織 にチャレンツした。

組織をＣａ’＋含まないＫＨ３緩衝液で５分間インキュベートした。

その後蓄積量のＣａ”＋を加える前に組織をコントロール溶液や被験化合物に２ ０分間さらした。

実験結果を図１と図２に示す。図１では特にノルエピネフリン（ＮＥ）低用量に おいて、精製したＰＨＦがノルエピネフリン誘発性の尾動脈張力を増強している ことが示されている。図２はりゾホスファチジルイノシトールによるノルエピネ フリン誘発性張力の増強作用を示している。ＰＩ−ＬＰＳ−Ｐ２もＰＨＦやリゾ ホスファチジルイノシトールと同様にノルエピネフリン誘発性張力を増強してい る（図１２）。

Ｗａｎｇらか記載した方法（Ｗａｎｇら　１９８９）を改良して、ＳＤクラット 尾動脈から分離した血管平滑筋細胞により全ての試験を実施した。雄性ＳＤクラ ット体重１０１００−２Ｏ０をベントパルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ 体重、腹腔内投与）で麻酔し、尾動脈を取り出し、カルシウムとマグネシウムを 含まないハンクス平衡食塩水（ＨＢＳＳ、ギブコ社製）に浸した。動脈から血液 を洗い落とし、その後結合組織を取り除いた。層流ドラフト内で解剖顕微鏡を用 いて、動脈を約１．５ｃｍ片に切り、カルシウムを含まない４°ＣのＨＢＳＳに ３０分間浸した。このインキュベーションの後、培養液をコラゲナーゼ／ディス パーザ（１，５ｍｇ／ｍｌ。

べ−リンガーマンハイム社製）、エラスターゼ（０，５ｍｇ／ｍｌ。

シグマ社Ｉ［−ａｍ）、トリプシン阻害剤（１ｍｇ／ｍ１．　シグマ社ｌ−５Ｗ ）及びウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍ１．脂肪酸を含まない、シグマ社製）か らなるＨＢＳＳ酵素溶液Ｉ　（０，２ｍＭ　Ｃａ）に交換した。切片をこの溶液 で６０分間インキュベートした。その後培養液をコラゲナーゼ（Ｉｍｇ／ｍ１． 　シグマ社■型）、トリプシン阻害剤（０，３ｍｇ／ｍｌ、　シグマ社１−ｓ型 ）、ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）からなるＨＢＳＳ酵素溶 液■に交換した。酵素溶液■によるインキュベージコンも６０分間続けた。酵素 溶液中でのインキュベージジンは全てＣＯｔインキュベーター中（３７°Ｃで５ ％ＣＯ１と９５％空気）で実施した。

通常２つの尾動脈と同時に５ｍｌの酵素溶液中で処理した。その後動脈を５ｍｌ の無血清ＤＭＥＭ　（ダルベツコ改良型イーグル培養液）に移し、ヒートシール したパスツールピペットを用いて培養液か濁るまで粉砕した。パッチクランプ試 験のため、細胞懸濁液をＤＭＥＭの入った３５ｍｍの培養容器に移した。４〜６ 時間後、１０９６ウシ胎児の血清を培養液に加えた。Ｆｕｒａ−２試験のため、 約ｌＸｌ０＠個の細胞を顕微鏡のカバーガラス（径２５ｍｍ）上にまき、無血清 ＤＭＥＭの入った３５ｍｍ培養容器に載せた。４〜６時間後、ｌＯ％ＦＣ３を培 養液に加えた。細胞はＣｏｔインキュヘーターにより３７°Ｃで培養した。これ らの細胞はノルエピネフリンに対する反応で収縮し、それらが目的とする血管平 滑筋細胞であることを示した（Ｗａｎｇら、１９８９）、９５％以上の細胞はト リフアンブル−色素排除法（Ｂａｇｂｙら、＋９７１ＨＩｖｅｓら。

１９７８）か示す様に生存していた。

実施例９ 初代培養血管平滑筋細胞を５μＭｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル（モン キュラ　プローブス社製）を含むＤＭＥＭ中で室温で４５分間インキュベートし た。インキュベーションの間、細胞　。

は暗室に保存した。細胞を５に緩衝液（１４５ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ 、ＩｍＭ　ＭｇＣ］＊、１０ｍＭ　グルコース、１ｍＭ　ＣａＣＬ、ｏ、５ｍＭ 　ＮａＨ＊　ＰＯ４，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，４）で５回丁寧に洗浄し 、同一の緩衝液中で保持した。５分後細胞が付着したカバーグラスを１ｍｌ量の サイクスムーア容器に入れ、倒立位相差顕微鏡の台上に載せ、Ｆｌｕｏｒ。

ｐｌｅｘｌ［スペクトル蛍光計（トレーカー　ノーザン社製）で蛍光度を測定し た。この方法はＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚらが記載した方法（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉ ｃｚら　＋９８５）と基本的に同じである。

Ｒは３４０と３８０ｍＭで励起した試料の細胞内遊離カルシウム濃度を示す蛍光 度率である。２系統の実験を実施した。

ＩｍＭのＣａ″″を含む５に緩衝液中で単一層細胞は被験化合物によって刺激さ れ、一定時間に於けるＲの変化を記録した。

実験はＩｍＭのＣａ”を含む５ＫＩ衝液中で実施した。細胞を５に緩衝液で丁寧 に洗浄し、同様の緩衝液に５分間保持した。さらに４５分間被験化合物を作用さ せ、Ｒを再び記録し、細胞をＮＥで再び刺激して、Ｒを記録した。細胞を５に緩 衝液で３回洗浄した後、ＮＥを再び作用させ、Ｒの変化を記録した。

実験の結果を図３と図４に示す。図３はＰＨＦによる細胞内カルシウム濃度の上 昇を示し、図４はＬＰＧ　（リゾホスファチジルコリン）による上昇を示す。図 １３は塩化カリウムによる細胞内カルシウム濃度上昇に与えるＦＭＯＣ−ＰＨＦ の作用を示し、ＦＭＯＣ−ＰＨＦか塩化カリウムの効果を増強したことを示す。

実施例１０ ｃＧＭＰ−ＰＤＥ活性の測定は［’　Ｈｌ　ｃＧＭＰから［”　ＨＩ　ＧＭＰへ の変換とその後のヘビ毒による［１Ｈ］グアノシンへの加水分解に基づいている （Ｗａｌｌａｃｅら、１９８３．Ｗｅｌｌｓら。

１９７５）　。６０ｍＭ　ＴＥＳ、３ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、０．ｓｍｇ／ｍｌ　 ＢＳＡ、２５℃Ｍ　ＥＧＴＡ、５０℃Ｍ　ＣａＣＬ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５μ Ｍ　ｃＧＭＰ、［’　Ｈｌ　ｃＧＭＰ　（１０〜１５ＸＩＯ’　ｃｐｍ）を含む 混合物（最終ｐＨ７，５、総容量２００μＩ）に被験物質を加えた。一定量のＣ ａＭ欠乏性ＰＤＥ　（シグマ化学社製、ミズーリ州　セントルイス）を加えるこ とにより反応を開始した。３０”Ｃで１５分間行ったインキュベージコンは５分 間の煮沸により終了させた。２０μＩ　（ｌｏｍｇ／ｍｌ）のヘビ毒（Ｃｒｏｔ ａｌｕｓ　Ａｔｒｏｘ）を加えることにより第二の反応を開始した。１０分後、 ０．１ｍＭグアノシンを含む第二の停止培養液７００μｍでインキュベージコン を終了した。その後形成されたラベルヌクレオシドからラベルヌクレオチドを分 離する為、全ての培養混合物をＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５，（蟻酸塩 型）カラムに付した。樹脂を２０ｍＭの蟻酸アンモニウム４ｍｌ　（ｐＨ６，５ ）で溶出し、［’　Ｈ］グアノシンを含む溶出液の放射活性を液体フンチレーシ タンカウンターで測定した。異なる濃度の精製ウシ心臓ＣａＭ（シグマ社製）（ ０，１１−２００ｎ／チユーブ）を加えることによって、ＣａＭによるＰＤＥ刺 激の標準曲線を得た。

ｌｏｎｇ／チューブのＣａＭの存在下で被験化合物もアッセイした。

１１００ｎ／チユーブのＣａＭの存在下でＰＤＥの最大刺激を得た。

結果を図５２図６１図７に示す。図５に於いて、ＳＨＲ副甲状腺培養液かホスホ ジェステラーゼ（ＰＤＥ）活性を上昇させた。ＰＨＦを含まないＷＫＹ副甲状腺 培養液はＰＤＥ活性を存意に上昇させない（図６）。リゾホスファチジルセリン （図７）もＰＤＥ活性を刺激した。

実施例１１ ＰＨＦの拮抗剤の酵素による製造と作用実施例４と同じペプチドをこの実験に於 いて用いた。各ペプチド（０，５ｍｇ）と表２の脂質混合物をホスホリパーゼＤ （１ｍｇ）の入ったトリス緩衝液５０ｍＭ　（ｐＨ７，８，最終容量１ｍ１）中 でインキュベートした。同時に適当なコントロールもインキュベートした。イン キュベーションは３７°Ｃで１時間である。サンプルを９５°Ｃで５分間加熱す ることにより反応を終了した。透析、限外濾過、凍結乾燥（ＤＦ）したＳＨＲ血 漿により誘発した正常血圧（ＳＤ）ラットの血圧上昇に対するサンプルの拮抗能 をアッセイした。

１．５ｍｌのＤＦＳＨＲ血漿を注入する直前に約１５０μｍの反応混合物を各ア ッセイ用ラットに注入した。９０分間血圧反応を観察し、その結果を表２に示す 。拮抗作用のバイオアッセイ（表２）に於いて、実際の血漿ＰＨＦの作用に与え る拮抗能は血圧アッセイによって測定した。この結果は４位のセリンの置換が拮 抗作用を与えることを示していた。この置換は２位のセリンへのＬＰの結合が影 響する。ミリスチン酸又はバルミチン酸の代わりにオレイン酸が置換すると拮抗 作用を与えることかわかった。

Ｃａ”チャネル活性はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞を用いて、ホー ルセルクランプ法により測定した（Ｈａｍｉ　１１等。

＋９８１）。全細胞Ｃａ　２４Ｎ流はアクソパッチーＩＢパッチクランプ増幅器 （アクフン　インスッルメンツ社製）を用いて測定した。

バッチマイクロピペットは２ステージマイクロピペツトブラー（ナリノゲ社製、 ＰＰ８３．　日本）を用いてポロケイ酸塩の薄いガラス毛細管（ＯＤｌ、２ｍｍ 、ＩＤ０．９ｍｍ、ＦＨ３，米国メイン州のブルンスウィック社製）から作製し た。マイクロピペットはマイクロピペット（ドイツ国ベツラーのライフ社製）を 用いて熱成形した。先端の直径は約１μｍで抵抗２〜８メガオームである。細胞 を１１０ｍＭトリス、５ｍＭ塩化セシウム、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ。

３０ｍＭグルコース、２０ｍＭ塩化バリウム、０．５μＭ　ＴＴＸを含む３ｃｍ のベトリ皿の底に付着させた。熱成形したピペットを７５ｍＭアスパラギン酸セ シウム、１０ｍＭ　ＥＧＲＡ、２ｍＭＡ、ＴＰ、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍ Ｍピルビン酸カリウム、５ｍＭ琥珀酸カリウム、２５ｍＭグルコース、１５ｍＭ 　ＨＥＰＥＳ。

５ｍＭクレアチンリン酸ナトリウム、５０ユニット／ｍｌのクレアチン酵素を含 む溶液で満たし、ナリシゲ水圧マイクロマニピュレーターを用いて細胞膜に装着 させた。軽い吸引はピペットホルダーに付いた管を通して行った。更に吸引を行 うことによりギガシールを形成し、ＴＬ極売先端部細胞膜を破壊した。保持電位 を一４０ｍＶにセットした。Ｃａ’＋チャネルを通るバリウム電流（２０ｍＭ　 Ｂａトを電荷担体として用いた）は５秒間隔で２００ｍｇ　ｅ　ｃの脱分極によ って誘発した。電流をデジタルオシロスコープ（米国ウィスコンンン州　マディ フンのニコレット　インスツルメント社製）を用いてモニターし、ローパスフィ ルター（米国カリフォルニア州フォスター市のアクフン　インスツルメンツ社製 ）を用いて３ＫＨｚでフィルターをかけた。Ｐクランプソフトウェア（バージョ ン５゜５）とラボマスターインターフェース（米国カリフォルニア州フォスター 市のアクフン　インスツルメンツ社製）を試験パルスの発生とデータの記録、分 析のため用いた。電流−電圧プロットはピーク電流値を用いた（漏洩電流は補正 した）。図１４〜図１７はこの試験を結果を示す。

表１ ＰＨＦ様の作用−アゴニストのバイオアッセイ処方番号　ペプチド　脂　質　Ｐ ＬＤ　血　液表２ 処方番号　ペプチド　脂　質　ＰＬＤ　血　液張力（ダラム） 張力（ダラム） 時間（秒） 細胞内カルシウム上昇分 ０．３　１　１０ 濃度（μｍ／チューブ） 濃度（μｍ／チューブ） ０．００３　０．０＋　０．１　１ １度（ｍＭ） 士 血圧上昇ピークの変化１ｍｍＨψ 時間（分） 張力（ダラム） 時間（秒） 時間（分） １＋ｐＡｌ 補正置の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　６年１２月１２日 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０５６２６ ２　発明の名称 副甲状腺由来高血圧因子活性コンポーネント３、特許出願人 住所（居所）〒１１２東京都文京区大塚五丁目六−十三氏名（名称）　全薬工業 株式会社 ４代理人 住　所　〒１５０東京都渋谷区恵比寿４丁目２０番３号５　補装置の提出年月日 １９９４年　１月１２日 ６、添付書類の目録 補装置翻訳文　１通 図面の簡単な説明 図１はラット尾動脈において、ＮＥ（ノルエピネフリン）によって誘発された血 管収縮に与える部分精製ＰＨＦの作用を示している。

部分精製ＰＨＦはＮＥの作用を増強させる。

図２はラット尾動脈において、ＮＥによって誘発された血管収縮に与えるＬＰｒ （リゾホスファチジルイノシトール）の作用を示している。ＬＰＩはＰＨＦと同 様にＮＥの作用を増強させる。

図３はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、塩化カリウム３０ｍ Ｍによって誘発される［Ｃａ”］　ｉの上昇に与える純粋なＰＨＦ　（ＳＨＲの 血漿０．　１μｌ相当量／ｍｌ培養液）の作用を示している。コントロール群に おけるカルシウム濃度の上昇は１２１．８３±３１．　ｌ　８　（ｎＭ）である 。上図は個体数８の実験を示し、＊＊においてｐ＜０．０１でフントロール群と の有意な差かある。下図は１つの代表的な実験チャート原本の複写である。

（ａ）は塩化カリウム３０ｍＭ単独、（ｂ）は純粋なＰＨＦを含む場合、（Ｃ） は洗浄後の作用を示す。塩化カリウムを加える前に細胞を純粋なＰＨＦと４５分 間インキニーベートした。これらの３実験は連続して同じ細胞群で行った。

図４は血管平滑筋細胞において、ＬＰＣが塩化カリウムによって誘発される細胞 内の上昇を有意に促進させることを示している。

図５はＳＨＲの副甲状腺培養液がＰＤＥ活性を刺激することを示している。

図６はＷＫＹの副甲状腺培養液かＰＤＥ活性を刺激しないことを示している。

図７はＬＰＳがＰＤＥ活性を刺激することを示している。

図８は正常血圧ラットの血圧に与えるＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントの作用 のピークを示している。この結果は標準的なバイオアッセイ法においてみられる ような典型的な持続型血圧上昇のピークである。

図９はＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントがホスホリパーゼＤ（＝よって不活性 化される典型的なＰＨＦ様の血圧上昇を現すことを示している。

図１Ｏは正常血圧ラットにおいて、ＬＰＳが遅発・持続型の血圧上昇を引き起こ すことを示している。

図１１は正常血圧ラットにおいて、ＬＰＩか遅発・持続型の血圧上昇を引き起こ すことを示している。

図１２はＦＭＯＣ合成ＰＨＦコンポーネントがＮＥによって誘発されたラット尾 動脈切片の張力増加を促進することを示している。

図１３はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、塩化カリウム１５ ｍＭによって誘発される［Ｃａ”］　ｉの上昇に与えるＦＭＯＣ−ＰＨＦ　（０ ，０１μｇ／ｍ！培養液）の作用を示している。上図は個体数５の実験を示し、 コントロール群に対する［Ｃａ”］　ｉの上昇は２２．５２±４．８２・（ｎＭ ）、（＊）　ｐ＜０゜０５コントロ一ル群との有意な差がある。下図は１つの代 表的な実験チャート原本の複写である。（ａ）は１５ｍＭの塩化カリウム単独、 （ｂ）はＦＭＯＣ−ＰＩＦを含む場合、（ｃ）は洗浄後の作用を示す。塩化カリ ウムを加える前に細胞をＦＭＯＣ−ＰＨＦと４５分間インキュベートした。これ らの３実験は連続して同じ細胞群で行った。

ＩＮ＋４はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、Ｌ型カルシウム チャネルの活性化に与える純粋なＰＨＦ　（ＳＨＲの血漿０．ＩｕｌＮｌｌ当量 ／ｍｌ培養液）の時間依存的作用を示している。

左図は３実験のパルス記録の原本である。右図はコントロールの電流（１）と電 圧（Ｖ）との関係（・）及び純粋なＰＨＦ　（ＳＨＨの血漿０．　１μｌ相当量 ／ｍｌ培養液）を加えた３５分後（■）と５０分（＆　（マ）の関係を示す。保 持電位は一４０ｍＶであった。

図１５はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞において、純粋なＰＨＦ　（ ＳＨＲの血漿０．１μｌ相当量／ｍｌ培養液）によって活性化されたＬ型カルシ ウムチヤンネルに与えるＩＢＭＸ（５Ｘ１０−’Ｍ）とニフェジピン（１０−’ Ｍ）の作用を示している。純粋なＰＨＦ、Ｔ　ＢＭＸ、ニフェジピンを図に示し た時間に加えた後、１０５分間、時間依存的ピーク電流の変化を記録した。

図１６はカルシウムチャンネルの電流に与えるＦＭＯＣ−ＰＨＦの作用を示し、 ＦＭＯＣ−ＰＨＦは電流を増加させることを示す（下方向）。

図１７はカルシウムチャンネルの電流に与えるＦＭＯＧ−ＰＨＦの作用を示し、 これはＩＢＭＸによってもとに戻ることを示す。

発明の詳細な説明 本発明者らは、副甲状腺由来高血圧因子と同様の特性をもつ副甲状腺由来高血圧 因子活性コンポーネントの同定を行った。このコンポーネントは、グリセロリン 脂質に結合したポリペプチドからなり、正常血圧ラットに投与すると、血管平滑 筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連する遅発性の血圧上昇特 性を有する。

それは例えばコンポーネントをラットに投与した時、投与後約２０分〜３０分で 血圧上昇が見られ、約１時間でピークを示すということである。それと同じ時間 に血管平滑筋細胞による細胞外カルシウムの取込増加も見られ、約１時間でピー クを示す。

このコンポーネントのポリペプチドは好ましくは５〜２０、更に好ましくは５〜 ｌＯのアミノ酸残基を含有している。このコンポーネントのポリペプチドを構成 するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、。

アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、 ニアスティン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇ　Ｉ　ｎ）　、グルタミン酸（Ｇ　Ｉ 　ｕ）　、グリシノ（Ｇ　Ｉ　ｙ）　、ヒスチジン（Ｈｉｓ）。

イソロイノン（ｌｉｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）。

メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラン（Ｐｈｅ）、　プロリン（Ｐｒｏ）、セ リン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロフン （Ｔｙｒ）、バリン（ｖａｌ）よりなる塩基性アミノ酸のグループから選ぶこと ができる。上記コンボーネン１−は、副甲状腺由来高血圧因子と実質的に同様の 特性、例えば、正常血圧ラットに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウ ムの取込み増加と時間的に関連する遅発性の血圧上昇特性を保持してい副甲状腺 由来高血圧因子コンポーネント構造におけるＸとＹは好ましくは酸素である。

脂肪酸Ｒ５はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキ ン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸 、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ　（エイコゲペンタエン 酸）及びネルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのが望ましい。より好ましく はオレイン酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

脂肪酸Ｒ１はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキ ン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸 、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネルボン酸からなる 脂肪酸群から選択するのか望ましい。より好ましくは、オレイン酸、ステアリン 酸、最も好ましくはオレイン酸である。

Ｒ１を構成する脂肪酸基は好ましくは１−１０個である。より好ましくは１〜５ 個、更には１個の脂肪酸基であるのが最も好ましい。

Ｒ１を構成する脂肪酸基は好ましくは１〜ｌＯ個である。より好ましくは１〜５ 個、更には１個の脂肪酸基であるのが最も好ましい。

最も好ましくは、高血圧性個体から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラ ットに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込みと時間的に関連 する遅発性の血圧上昇特性を育する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントであ り、その構造は以下のように同定てきるものである。

本発明は、高血圧性個体から精製した天然のＰＩＦと同様に、正常血圧ラットに 投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に関連す る遅発性の血圧上昇特性を有し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造であって 、以下の構造を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法に関す るものである。

［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ３は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ２は先に特定されたＲ２と同じ であり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０乃至 ２０の付加アミノ酸を表わし：ｎはｌ乃至５を表わす〕すなわち、本発明の製造 方法はＡ　−［Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ　−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇｌ 　、　−Ｂ　（式中Ａ、　Ｂ及びｎは前記の定義と同し）の構造を有するポリペ プチドとリン脂質からなる混合物をホスホリパーゼＤと共にインキュベートする 工程及び前記工程で形成された副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを回収す る工程からなる。

リン脂質はりゾホスファチジン酸またはホスファチジン酸であるので好ましい。

副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法において、ポリペプチドは化 学合成によって製造するのが好ましい。ポリペプチドは、当該技術分野において 良く知られた従来のペプチド合成装置によって合成し得る。このようなペプチド 合成装置の代表的な例え型である。自動ペプチド合成装置を用いたペプチドを合 成する方法は、当該技術分野においてはよく知られている。

コンポーネントの回収は、当該技術分野において良く知られた標準的な精製及び 分離技術を用いて行われる。このような技術の代表的な例にはイオン交換クロマ トグラフィー及び／又は逆相高速液体クロマトグラフィー及びＴＬＣが含まれる 。

本発明はまた、副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの化学合成方法について も言及している。高血圧性個体から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラ ットに投与すると、血管平滑筋による細胞外カルシウムの取込み増加と時間的に 関連する遅発性の血圧上シを特性を任し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造 であって下記構造を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法の 例を以下に示す。

［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニル又は少なくとも一個の脂肪酸基を表わし：Ｒ３は先に特定されたＲ１と同じ であり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素又は硫黄を表わし、Ａ、Ｂのそれぞれは０乃至 ２０の付加アミノ酸を表わし：ｎはｌ乃至５を表わす〕この製造方法は、（ａ） Ａ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｖａ　１−ＯＨ（式中Ａは前記の定義と同じ）構造を存す るポリペプチドを化学合成して精製し、（ｂ）該ポリペプチドのエステルを調製 し、（Ｃ）該エステルにＬ−α−リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）を加えて （式中Ａは前記定義と同じであり、ＬＰはＬ−α−リゾホスファチジル基を表す ）の構造を有する生成物を製造して精製し、（ｄ）工程（Ｃ）の該生成物を酸性 化し、該酸性化生成物を抽出して蒸発により回収することによって の構造を有する生成物を得て、（ｅ）工程（ｄ）の生成物のエステルを調製し、 （ｆ）ＮＨ，−Ｈｉ　ｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｂ−ＯＨの構造を存するポリペプチ ドを化学合成して精製し、（ｇ）ＮＨ＊　−Ｈｉ　５−Ｐｈ　ｅ−Ａｒ　ｇ−Ｂ −０−の構造を有する工程（ｆ）のポリペプチドのエステルを調製し、（ｈ）工 程（ｅ）のエステルと工程（ｇ）のエステルを結合させて副甲状腺由来高血圧因 子コンポーネントを製造する。

好ましくは、工程（ｂ）のポリペプチドのエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミ ドエステルて、これは該ポリペプチドをジシクロへキシルカルボジイミドとジオ キサンの混合物に加えることにより調製できる。更に、工程（Ｃ）においてエス テルに加えるＬＰＳを最初に炭酸水素塩緩衝液に溶解し、溶液をｐＨ７に調製す るのが好ましい。工程（ｄ）における酸性化は、好ましくはクエン酸ナトリウム の添加によってｐＨ２，８にて行う。又、工程（ｅ）のエステルはＮ−ヒドロキ シ琥珀酸イミドエステルであるのが望ましく、工程（ｄ）の生成物にジシクロへ キシルカルボジイミド、ジオキサン及びテトラヒドロフランの混合物を添加する ことにより調製される。

工程（ｈ）において、工程（ｇ）のエステルは、工程（ｅ）のエステルと混合さ れる前に最初に炭酸水素塩緩衝液に溶解しｐＨ７に調製しておくのが好ましい。

［配列識別番号＋１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数ｌ乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少な（とも−個の脂肪酸基を表わし；Ｒ１は先に特定されたＲ３と同 様である。〕　“ Ｒ３とＲ２の　脂肪酸としてはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステ アリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイ ン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ及びネ ルボン酸からなる脂肪酸群から選択するのか好ましい。より好ましくはオレイン 酸、ステアリン酸、最も好ましくはオレイン酸である。

このようなアッセイ系の特に望ましい具体例としては、精巧な分析機器を持って いない医師の診療室又は診療所で使えるような診療キットの形態かあげられる。

このような方法は体液中のホルモンや池の免疫反応物質の検出に使われてきた。

一つの例は、妊娠初期の検出用の市販キットである。それゆえＰＨＦ又はその一 部はこのような方法を利用することにより、定性的あるいは定量的な検出が可能 である。

それゆえ本発明は動物における副甲状腺由来高血圧因子又はその免疫学的活性部 位の検出キットも提供する。その検出キットは、単一容器中て固相と結合した副 甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対する抗体：抗開甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント抗体に対する酵素標識二次抗体：該二次抗体のｔ！ＩＡ識酵素に 対する基質；及び副甲状腺由来高血圧因子、そのコンポーネントまはたその一部 の標準溶液からなる。

動物における副甲状腺由来高血圧因子又はその一部の更なる検出キットを提供す る。その検出キットは、単一容器中で副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに 対する抗体；骸抗体が結合する固相；及び副甲状腺由来高血圧因子又はそのコン ポーネントの標準溶液からなる。

上記の両キットにおいて、好ましいコンポーネントは次の構造である。

［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ１は先に特定されたＲ１と同 じであり：Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし：ＡＳＢのそれぞれは０ 乃至２゜のけ加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者 から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）：ｎはｌ乃至５を表わす 〕 そしてさらに好ましくは。

インシュリン非依存性糖尿病患者はしばしば高血圧であり、逆に高血圧患者はし ばしば耐ブドウ糖能の異常が見受けられる。いずれの症状においても、細胞内遊 離カルシウムの増加が截られた。ＰＨＦは、肥満症で高血圧症であり、かつイン シュリン非依存性の糖尿病を有するＯ　ｂｌｏ　ｂマウスの血漿中で検出されて いる。これらマウス由来のＰＨＦは、ＳＨＲラット由来のＰＨＦと同じ画分中に 血清より単離されている。ＰＨＦの検出はＮＩＤＯＭ（インシュリン非依存性糖 尿病）の診断に有用であり、かつＮＩＤ０ＭにおけるＰＨＦの役割に対する新た な研究領域を開くものである。

ある種の癌は、細胞内１１１１１カルシウムの増加を特徴としている［０ｋａｚ ａｋｉ他、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、、４６　（１２Ｐｔ１）、６０５９−６０６３　 （１９８６）；ＬｔｐｔｏｎとＭｏｒｒｉｓ、Ｃａｎｃ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１ａｋａｗａ他、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、４６　（２）、６ ５８−６６１（１９８６）；及びＭｅｙｅｒ、Ｊ、！（ｙｐｅｒｔｅｎｓ、５　 （ｓｕｐｐｌ　４）、Ｓ３−３４　（１９８７）］、又、副甲状腺の活性化かあ る種の箱形成と関連している［Ｐａ　Ｉｍｅ　ｒ他、Ａｍ、Ｊ。

Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、上２７　（５）、＋０３１−１０４０　（１９８８）；及 びＦｅ１ｇとＧｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｃａｎｃｅｒ　６０（３）、４２９−４３２ 　（１９８７）］。ＰＨＦ又はその一部は副甲状腺に由来しており、又予備検討 の結果ではＰＩＦが細胞内カルシウムを増加させることを示しているので、ＰＨ Ｆ又はその一部はこれら（の癌）及び他のｆｉ類の癌に関係しているかもしれな い。ＰＨＦのスクリーニングは、検出法や治療法の開発に価値があると同時に、 これら癌の原因を理解する上で価値がある。

以下の実施例は、本発明を明らかにするものであるが、それに限定されるもので はない。本発明から逸脱しない範囲での種々の変更・修正は当事者にとって自明 なことである。

実施例１と同様にバイオアッセイを行い、その結果を次に示す。

トータル反応　コントロールｌ　コントロール２１４、ＯｍｍＨｇ　８．　８ｍ ｍＨｇ　３．　３＋ａｍ）１ｇ結果の８．８ｍｍＨｇは副甲状腺由来高血圧因子 活性が陽性であることを示す。ＰＨＦ活性はホスホリパーゼＡ、により不活性化 されなかった。

Ｆ１分解アッセイ−ホスホリパーゼＤ Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ ｎａｌｙｓｉｓ　（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ監修）第３版Ｖｏ１．２　ｐ、２８８− ２９１　（１９８３））に従って実施する。

酵素ホスホリパーゼＤはキャベツから得られ、それはベーリンガーマンハイム社 により市販品として入手できる。

５０ｍＭトリス／塩酸と０．２％トリトンＸ−１００を含むｐＨ７８の緩衝液を 調製する。ＳＨＲラットから得られた血漿サンプルを実施例１に従って透析、限 外濾過、凍結乾燥し、緩衝液２ｍｌに溶解した。Ｉｍｇ／ｍｌの割合でホスホリ パーゼＤをその溶液に加えて３７°Ｃで２０分間インキュベートする。コントロ ールは次のように調製した。

コントロールｌ：　ホスホリパーゼＤと緩衝液コントロール２：　緩衝液 コントロール３：　血漿サンプルと緩衝液実施例１と同様にバイオアッセイを行 い、その結果を次に示す。

トータル反応　コントロール３　コントロールｌ　コントロール２−４．　６ｍ ｍＨｇ　Ｉ　１．　５ｍｍ）Ｉｇ　２．　７ｍｍｌ（ｇ　０．　６ｍＩＩＩ）１ ｇ結果のＩ　１．５ｍｍＨｇは副甲状腺由来高血圧因子活性が陽性であることを 示す。ＰＨＦ活性はホスホリパーゼＤにより不活性化された。

上記構造の遊離酸化合物はクエン酸ナトリウムを加えてｐＨを２゜８に酸性化し 、酢酸エチルで抽出することにより調製した。

の化合物はロータリーエバポレーターで濃縮することにより得た。

Ｐ２：Ｎｔ（Ｏｔ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−０−構造ＮＨ２−Ｈｉ　ｓ−Ｐｈ ｅ−Ａｒｇ−０−化合物は上記の様に標準ＢＯＣ化学法により調製した。生成物 は逆相ＨＰＬＣにより精製し、その後炭酸水素ナトリウムでｐＨ７に調整した。

（配列識別番号、５〕 を有する生成物のＮＨＳエステルはジオキサン／ＴＨＦ混合飽和溶液中てＤＣＣ を用いて調製した。生成物ＮＨｔ　Ｈｉｓ　ＰｈζＡｒｇ−０−をｐＨ７の炭酸 水素塩緩衝液に溶解し、そのニス）に加えた。

その後ＰＩ−ＬＰＳとＰＩ−ＬＰＳ−Ｐ２の効果は実施例１で記載したごとく正 常血圧ラットの血圧へのｉｎ　ｖｉｖｏ効果により確認した。図８にＰＩ−ＬＰ Ｓ−Ｐ２　（Ｎｏ、Ｉで示した）の結果を示す。この化合物は遅発性で持続的な 血圧上昇作用を呈し、Ｐｌ−ＬＰＳは最少の血圧上昇を呈した。ホスホリパーゼ ＤでインキュベートしたＦＭＯＧ　（Ｎｏ、３で示した）の結果を図９に示す。

Ｐｌ−ＬＰＳ−Ｐ２のホスホリパーゼＤによる分解物は上記血漿ＰＨＦの分解物 と同様に、血圧上昇反応を不活性化した（図９）。

度を測定した。この方法はＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃＺらが記載した方法（Ｇｒｙｎ ｋｉｅｗｉｃｚら　＋９８５）と基本的に同じである。

Ｒは３４０と３８０ｍＭで励起した試料の細胞内遊離カルシウム濃度を示す蛍光 度率である。２系統の実験を実施した。

１ｍＭのＣａ”を含む５に緩衝液中で単一層細胞は被験化合物によって刺激され 、一定時間に於けるＲの変化を記録した。

実験は１ｍＭのＣａ”を含む５Ｋｌｉ衝液中で実施した。細胞を５Ｉく緩衝液で 丁寧に洗浄し、同様の緩衝液に５分間保持した。さらに４５分間披駐止合物を作 用させ、Ｒを再び記録し、細胞をＮＥで再び刺激して、Ｒを記録した。細胞を５ に緩衝液で３回洗浄した後、ＮＥを再び作用させ、Ｒの変化を記録した。

実験の結果を図３と図４に示す。図３はＰＨＦによる細胞内カルシウム濃度の上 昇を示し、図４はＬＰＧ　（リゾホスファチジルコリン）による上昇を示す。図 １３は塩化カリウムによる細胞内カルシウム濃度上昇に与えるＦＭＯＣ−ＰＩＦ の作用を示し、ＦＭＯＣ−ＰＨＦか塩化カリウムの効果を増強したことを示す。

ｃＧＭＰ−ＰＤＥ活性の測定は［Ｈ］　ｃＧＭＰから［Ｈ１０ＭＰへの変換とそ の後のヘビ毒による［２Ｈ］グアノシンへの加水分解に基づいている（Ｗａｌｌ ａｃｅら、＋９８３．Ｗｅｌｌｓら。

１９７５）。６０ｍＭ　ＴＥＳ、３ｍＭ　ＭｇＣＬ、０．８ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ 、２５ＩＭ　ＥＧＴＡ、５０ＩＭ　ＣａＣＩｔ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ＩＭ　 ｃＧＭＰ、［’　Ｈ］　ｃＧＭＰ　（１０〜１５ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｐｍ）を含む 混合物（最終ｐＨ７，５、総容量２００μｌ）に被験物質を加えた。一定量のＣ ａＭ欠乏性ＰＤＥ　（シグ９５“Ｃで５分間加熱することにより反応を終了した 。透析、限外濾過、凍結乾燥（ＤＦ）したＳＨＲ血漿により誘発した正常血圧（ ＳＤ）ラットの血圧上昇に対するサンプルの拮抗能をアッセイした。

１．５ｍｌのＤＦＳＨＲ血晴を注入する直前に約１５０μｍの反応混合物を各ア ッセイ用ラットに注入した。９０分間血圧反応を観察し、その結果を表２に示す 。拮抗作用のバイオアッセイ（表２）に於いて、実際の血漿ＰＨＦの作用に与え る拮抗能は血圧アッセイによって測定した。この結果は４位のセリンの置換が拮 抗作用を与えることを示していた。この置換は２位のセリンへのＬＰの結合が影 響する。

Ｃａ”チャネル活性はラット尾動脈から単離した血管平滑筋細胞を用いて、ホー ルセルクランプ法により測定した（Ｈａｍｉｌｌ等。

＋９８１）。全細胞Ｃａ　”を流はアクソバッチーＩＢパッチクランプ増幅器（ アクフン　インスツルメンツ社製）を用いて測定した。

パッチマイクロピペットは２ステージマイクロピペツトブラー（ナリシゲ社製、 ＰＰ８３．　日本）を用いてポロケイ酸塩の薄いガラス毛細管（ＯＤｌ、２ｍｍ 、ＩＤ０．９ｍｍ、ＦＨ３米国メイン州のブルンスウィック社製）から作製した 。マイクロピペットはマイクロッす−ジ（ドイツ国ベツラーのライフ社製）を用 いて熱成形した。先端の直径は約１μｍで抵抗２〜８メガオームである。細胞を １１０ｍＭ）リス、５ｍＭ塩化セシウム、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ。

３０ｍＭグルコース、２０ｍＭ塩化バリウム、０．５μＭ　ＴＴＸ表１ 処方番号　ペプチド　脂　質　ＰＬＤ　血　液表２ 処方番号　ペプチド　脂　質　ＰＬＤ　血　液７　リン脂質はポリペプチドとそ の４位のセリン残基で結合している請求項６記載の副甲状腺由来高血圧因子コン ポーネント。

８　約１，０００乃至約２，７００ダルトンの分子量を有する請求項１記載の副 甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。

９　生物学的に活性な化合物を特徴とする請求項ｌ記載の副甲状腺由来高血圧因 子コンポーネント。

１０、検出可能なマーカーを特徴とする請求項１記載の副甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント。

Ｉｌ、高血圧性個体から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧う、ｌトに投 与したとき遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は＋ｈｔ管平滑筋による細 胞外カルシウムの取り込み増加と時間的に関連し、構造的に副甲状腺由来高血圧 因子と異なる以下の構造［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、ＲＩは水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ７は先に特定されたＲ１と同 してあり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし、Ａ、Ｂのそれぞれは０ 乃至２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧性個 体から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎはｌ乃至５を表わ す〕 １２、Ｘは酸素である請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント 。

＋３．Ｙは酸素である請求項ＩＩ記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント 。

＋４．Ｘ及びＹはそれぞれ酸素である請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント。

１５　Ｒ１は少なくとも一つの脂肪酸基である請求項１１記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。

＋６．該少なくとも一つの脂肪酸基は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン 酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸 、オレイン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰ Ａ及びネルボン酸よりなる群から選ばれる請求項１５記載の副甲状腺由来高血圧 因子コンポーネント。

＋７．Ｒ，は少な（とも一つの脂肪酸基である請求項１１記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。

１８、該少なくとも一つの脂肪酸基は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン 酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸 、オレイン酸、リノール酸、α−リルン酸、γ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰ Ａ及びネルボン酸よりなる群から選ばれる請求項１７記載の副甲状腺由来高血圧 因子コンポーネント。

１９、構造 ［配列識別番号：ｌ］ を有する請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。

２０、高血圧性個体から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投与 したとき遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カ ルシウムの取り込み増加と時間的に関連し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構 造である以下の構造［配列識別番号、１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし：Ｒ１は先に特定されたＲ１と同 じであり：Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれ１１ ０乃至２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患 者から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）、ｎはｌ乃至５を表わ す〕 を存する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法であって、 （ａ）構造Ａ　−［Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ ］　ｍ−Ｂ［配列識別番号：ｌ］　（式中、Ａ、Ｂ及びｎは上記と同様に特定さ れる）を有するポリペプチド及びリン脂質からなる混合物をホスホリパーゼＤと インキュベートし、 （ｂ）工程（ａ）で形成された副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを回収す る 工程よりなる方法。

２３、該リン脂質はホスファチジン酸である請求項２０記載の副甲状腺由来高血 圧因子コンポーネントの製造方法。

２４　高血圧性個体から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投与 したとき遅発性の血圧上昇特性を育し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カ ルシウムの取り込み増加と時間的に関連し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構 造である以下の構造［配列識別番号：ｌ］ 〔式中、Ｒ３は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし：Ｒ３は先に特定されたＲ１と同 じてあり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０ 乃至２０の付加アミノ酸を表わしく但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧性個 体から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）：ｎは１乃至５を表わ す〕 を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法であって、 （ａ）構造Ａ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ（Ａは上記と同様に特定される） を有するポリペプチドを化学合成して精製し、（ｂ）該ポリペプチドのエステル を調製し、（Ｃ）該エステルにＬ−α−リゾホスファチジルセリン（Ｌ　Ｐ　Ｓ ）を加えて構造 （式中、Ａは上記と同様に定義され、ＬＰはＬ−α−リゾホスファチジル基であ る） を有する化合物を製造し、該生成物を精製し、（ｄ）工程（Ｃ）の該生成物を酸 性化し、この生成物を抽出して蒸発により回収することによって、構造 を有する生成物を得、 （ｅ）工程（ｄ）の該生成物のエステルを調製し、（ｆ）構造ＮＨｚ−ｆ（ｉ　 ｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＯＨを存するボリベブｆ　Ｆ　ヲ（１＝　学合成Ｌ／て精 製し、 （ｇ）構造間ｔ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−０−を存する工程（ｆ）の該ポリペ プチドのエステルを調製し、 （ｈ）工程（ｅ）のエステルと工程（ｇ）のエステルを結合させて、該副甲状腺 由来高血圧因子コンポーネントを製造する工程よりなる方法。

２５、上記工程（ｂ）のポリペプチドのエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミド エステルであり、ジシクロへキシルカルボジイミドとジオキサンを含む混合物に 該ポリペプチドを加えることによって調製される請求項２４記載の方法。

２６　上記工程（Ｃ）において該エステルに加えられたＬＰＳは、ｐＨ７を有す る溶液を形成するため初めに炭酸水素塩緩衝液に溶解される請求項２４記載の方 法。

２７、上記工程（ｄ）において、酸性化はクエン酸ナトリウムを加えることによ って生じる請求項２４記載の方法。

２８、上記工程（ｅ）のエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルであり 、ジシクロへキシルカルボジイミド、ジオキサン及びテトラヒドロフランを含む 混合物を上記工程（ｄ）の該生成物に加えることによって調製される請求項２４ 記載の方法。

２９　上記工程（ｈ）において、ｐＨ７の溶液を形成するため上記工程（ｅ）の エステルに上記溶液を結合する前に上記工程（ｇ）のエステルは炭酸水素塩緩衝 液に初めに溶解される請求項２４記載の方法。

３０、請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを含む溶 液を哺乳動物に注射することによって、哺乳動物または鳥にポリクローナル抗体 を産生させ、（ｂ）該副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対して産生され たポリクローナル抗体を含む血清を採取し、（Ｃ）該ポリクローナル抗体を用い てイムノアッセイ法により、副甲状腺由来高血圧因子又はその一部を含むサンプ ルをスクリーニングし、 （ｄ）該サンプル中の副甲状腺由来高血圧因子又はその一部の存在を検出する 工程からなる副甲状腺由来高血圧因子又はそのコンポーネントの存在検出方法。

３１、上記イムノアッセイ法はエンザイムリンクドイムノアッセイである請求項 ３０記載の方法。

３８　単一容器中で、 ａ）固相と結合した請求項１又は】１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネ ントに対する抗体と、 ｂ）抗開甲状腺由来高血圧因子コンポーネント抗体に対する酵素標識二次抗体と 、 Ｃ）該二次抗体の該酵素標識に対する基質と、ｄ）副甲状腺由来高血圧因子又は その一部の標準溶液とからなる、哺乳動物の副甲状腺由来高血圧因子またはその 一部の検出キット。

３９　単−容器中で、 ａ）請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対する抗 体と、 ｂ）該抗体か結合する固相と、 Ｃ）副甲状腺由来高血圧因子又はその一部の標準溶液とからなる、哺乳動物の副 甲状腺由来高血圧因子又はその一部の検出キット。

４０、副甲状腺由来高血圧因子またはその一部の拮抗剤。

４１　構造 （式中、ＰＬはリン脂質を表わし、Ｘａａはセリン以外のアミノ酸を表わす） を有する請求項４０記載の拮抗剤。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５７７ 　Ｂ　７０５５−２Ｊ３３／７８　７０５５−２Ｊ ／／Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ 、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ 、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　ジエ、シャン カナダ国　ティー６３２イー３．アルベルタ、エドモントン、アベニュー　１０ ６１５−８３、１０５ （７２）発明者　レワンチュク、リチャード　ゼットカナダ国　ティー６シー　 ０エツクス７゜アルベルタ、エドモントン、アベニュー

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．リン脂質に結合したポリペプチドからなり、正常血圧ラットに投与すると、 遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カルシウム の取り込み増加と時間的に関連し、天然に存在する副甲状腺由来高血圧因子と異 なる分子量を有する単離・精製した副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
2. ２．ポリペプチドは５乃至２０のアミノ酸残基である請求項１記載の副甲状腺由 来高血圧因子コンポーネント。
3. ３．ポリペプチドは構造Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−ＶａＩ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａ ｒｇ〔配列識別番号：１］またはその官能アミノ酸類似体である請求項２記載の 副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
4. ４．リン脂質はリゾホスファチジン酸である請求項３記載の副甲状腺由来高血圧 因子コンポーネント。
5. ５．リン脂質はホスファチジン酸である請求項３記載の副甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント。
6. ６．リン脂質はポリペプチドとその一つのセリン残基で結合している請求項３記 載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
7. ７．リン脂質はポリペプチドとその４位のセリン残基で結合している請求項６記 載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
8. ８．約１，０００乃至約２，７００ダルトンの分子量を有する請求項１記載の副 甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
9. ９．生物学的に活性な化合物を更に有する請求項１記載の副甲状腺由来高血圧因 子コンポーネント。
10. １０．検出可能なマーカーを更に有する請求項１記載の副甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント。
11. １１．高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投与し たとき遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カル シウムの取り込み増加と時間的に関連し、構造的に副甲状腺由来高血圧因子と異 なる以下の構造▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列識別番号：１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ２は先に特定されたＲ１と同 じであり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０ 乃至２０の付加アミノ酸を表わし（但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者 から単蔵したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎは１乃至５を表わす 〕 を有する単離・精製した副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
12. １２．Ｘは酸素である請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント 。
13. １３．Ｙは酸素である請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント 。
14. １４．Ｘ及びＹはそれぞれ酸素である請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子 コンポーネント。
15. １５．Ｒ１は少なくとも一つの脂肪酸基である請求項１１記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。
16. １６．該少なくとも一つの脂肪酸基は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン 酸、ステアリン酸、アラキン酸、べヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸 、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、 ＥＰＡ及びネルボン酸よりなる群から選ばれる請求項１５記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。
17. １７．Ｒ２は少なくとも一つの脂肪酸基である請求項１１記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。
18. １８．該少なくとも一つの脂肪酸基は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン 酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸 、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、 ＥＰＡ及びネルボン酸よりなる群から選ばれる請求項１７記載の副甲状腺由来高 血圧因子コンポーネント。
19. １９．構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列識別番号：１］ を有する請求項１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント。
20. ２０．高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投与し たとき遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カル シウムの取り込み増加と時間的に関連し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造 である以下の構造▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列識別番号：１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ２は先に特定されたＲ１と同 じであり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０ 乃至２０の付加アミノ酸を表わし（但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者 から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎは１乃至５を表わす 〕 を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法であって、 （ａ）構造Ａ−［Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ］ −Ｂ［配列識別番号：１］（式中、Ａ、Ｂ及びｎは上記と同様に特定される）を 有するポリペプチド及びリン脂質からなる混合物をホスホリパーゼＤとインキュ ベートし、 （ｂ）工程（ａ）で形成された副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを回収す る工程よりなる方法。
21. ２１．該ポリペプチドが化学合成によって製造される請求項２０記載の副甲状腺 由来高血圧因子コンポーネントの製造方法。
22. ２２．該リン脂質はリゾホスファチジン酸である請求項２０記載の副甲状腺由来 高血圧因子コンポーネントの製造方法。
23. ２３．該リン脂質はホスファチジン酸である請求項２０記載の副甲状腺由来高血 圧因子コンポーネントの製造方法。
24. ２４．高血圧患者から精製した天然のＰＨＦと同様に、正常血圧ラットに投与し たとき遅発性の血圧上昇特性を有し、該血圧上昇は血管平滑筋による細胞外カル シウムの取り込み増加と時間的に関連し、副甲状腺由来高血圧因子と異なる構造 である以下の構造▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列識別番号：１］ 〔式中、Ｒ１は水素、炭素数１乃至２２のアルキル、炭素数１乃至２２のアルケ ニルまたは少なくとも一つの脂肪酸基を表わし；Ｒ２は先に特定されたＲ１と同 じであり；Ｘ、Ｙのそれぞれは酸素または硫黄を表わし；Ａ、Ｂのそれぞれは０ 乃至２０の付加アミノ酸を表わし（但し、ＡとＢの少なくとも一つは高血圧患者 から単離したＰＨＦに対応するアミノ酸配列ではない）；ｎは１乃至５を表わす 〕 を有する副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの製造方法であって、 （ａ）構造Ａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ（Ａは上記と同様に特定される） を有するポリペプチドを化学合成して精製し、（ｂ）該ポリペプチドのエステル を調製し、（ｃ）該エステルにＬ−α−リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）を 加えて構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列議別番号：２］ （式中、Ａは上記と同様に定義され、ＬＰはし−α−リゾホスファチジル基であ る） を有する化合物を製造し、該生成物を精製し、（ｄ）工程（ｃ）の該生成物を酸 性化し、この生成物を抽出して蒸発により回収することによって、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列識別番号：２］ を有する生成物を得、 （ｅ）工程（ｄ）の該生成物のエステルを該製し、（ｆ）構造ＮＨ２−Ｈｉｓ− Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＯＨを有するポリペプチドを化学合成して精製し、 （ｇ）構造ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｏ−を有する工程（ｆ）の該ポリ ペプチドのエステルを調製し、 （ｈ）工程（ｅ）のエステルと工程（ｇ）のエステルを結合させて、該副甲状腺 由来高血圧因子コンポーネントを製造する工程よりなる方法。
25. ２５．上記工程（ｂ）のポリペプチドのエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミド エステルであり、ジシクロヘキシルカルボジイミドとジオキサンを含む混合物に 該ポリペプチドを加えることによって調製される請求項２４記載の方法。
26. ２６．上記工程（ｃ）において該エステルに加えられたＬＰＳは、ｐＨ７を有す る溶液を形成するため初めに炭酸水素塩緩衝液に溶解される請求項２４記載の方 法。
27. ２７．上記工程（ｄ）において、酸性化はクエン酸ナトリウムを加えることによ って生じる請求項２４記載の方法。
28. ２８．上記工程（ｃ）のエステルはＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルであり 、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジオキサン及びテトラヒドロフランを含む 混合物を上記工程（ｄ）の該生成物に加えることによって調製される請求項２４ 記載の方法。
29. ２９．上記工程（ｈ）において、ｐＨ７の溶液を形成するため上記工程（ｅ）の エステルに上記溶液を結合する前に上記工程（ｇ）のエステルは炭酸水素塩緩衝 液に初めに溶解される請求項２４記載の方法。
30. ３０．（ａ）請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを 含む溶液を哺乳動物に注射することによって、哺乳動物または鳥にポリクローナ ル抗体を産生させ、（ｂ）該副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対して産 生されたポリクローナル抗体を含む血清を採取し、（ｃ）該ポリクローナル抗体 を用いてイムノアッセイ法により、副甲状腺由来高血圧因子又はその分画を含む サンプルをスクリーニングし、 （ｄ）該サンプル中の副甲状腺由来高血圧因子又はその分画の存在を検出する工 程からなる副甲状腺由来高血圧因子又はそのコンポーネントの存在検出方法。
31. ３１．上記イムノアッセイ法はエンザイムリンクドイムノアッセイである請求項 ３０記載の方法。
32. ３２．上記イムノアッセイ法は、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ である請求項３０記載の方法。
33. ３３．上記イムノアッセイ法は免疫沈降法である請求項３０記載の方法。
34. ３４．ａ）請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントを哺 乳動物に注入することによって、該コンポーネントに対する抗体を産生させ、 ｂ）免疫哺乳動物より抗体産生Ｂリンパ球を採取し、ｃ）ハイブリドーマを形成 するため該抗体産生Ｂリンパ球と骨髄腫細胞を融合し、 ｄ）副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントの抗体を産生する該ハイプリドーマ を選択し、クローニングし、ｅ）該抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、ｆ）該 ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を分離し、ｇ）該モノクローナル抗体を 用いて、イムノアッセイ法により副甲状腺由来高血圧因子又はその一部を含むサ ンプルをスクリーニングする工程からなる患者の副甲状腺由来高血圧因子又はそ の一部の同定方法。
35. ３５．上記イムノアッセイ法はエンザイムリンクドイムノアッセイである請求項 ３４記載の方法。
36. ３６．上記イムノアッセイ法はエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイで ある請求項３４記載の方法。
37. ３７．上記イムノアッセイ法は免疫沈降法である請求項３４記載の方法。
38. ３８．単一容器中で、 ａ）固相と結合した請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネ ントに対する抗体と、 ｂ）抗副甲状腺由来高血圧因子コンポーネント抗体に対する酵素標識二次抗体と 、 ｃ）該二次抗体の該酵素標識に対する基質と、ｄ）副甲状腺由来高血圧因子又は その分画の標準溶液とからなる、哺乳動物の副甲状腺由来高血圧因子またはその 分画の検出キット。
39. ３９．単一容器中で、 ａ）請求項１又は１１記載の副甲状腺由来高血圧因子コンポーネントに対する抗 体と、 ｂ）該抗体が結合する固相と、 ｃ）副甲状腺由来高血圧因子又はその一部の標準溶液とからなる、哺乳動物の副 甲状腺由来高血圧因子又はその一部の検出キット。
40. ４０．副甲状腺由来高血圧因子またはその断片の拮抗剤。
41. ４１．構造 ▲数式、化学式、表等があります▼［配列識別番号：２］（式中、ＰＬはリン脂 質を表わし、Ｘａａはセリン以外のアミノ酸を表わす） を有する請求項４０記載の拮抗剤。
42. ４２．上記リン脂質はリゾホスファチジン酸とホスファチジン酸からなる群より 選択される請求項４１記載の拮抗剤。
43. ４３．Ｘａａは、リジン、チロジンまたはロイシンである請求項４１記載の拮抗 剤。
44. ４４．抗高血圧有効量の請求項４０記載の拮抗剤と、薬学的に許容しうる坦体又 は稀釈剤とからなる医薬組成物。
45. ４５．抗高血圧有効量の請求項４０記載の拮抗剤を投与する工程からなる要治療 哺乳動物の高血圧治療法。